DE60025277T2

DE60025277T2 - Durch anwendung von mikrowellen beschleunigter elisa-test

Info

Publication number: DE60025277T2
Application number: DE60025277T
Authority: DE
Inventors: Pradeep Delhi 110 007 NAHAR; Utpal Delhi 110 007 BORA; Gainda Lal Delhi 110 007 SHARMA
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2000-08-16
Filing date: 2000-08-16
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2020-08-17
Also published as: JP2004517301A; AU1883001A; CA2420011A1; CN100338466C; AU2001218830B2; IS6718A; IS2558B; DE60025277D1; JP4056875B2; WO2002014868A1; CA2420011C; US6498016B1; CN1502042A; DK1309864T3; EP1309864A1; EP1309864B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein schnelles Verfahren für einen durch Mikrowellen vermittelten ELISA-Test (MELISA). Die Erfindung betrifft insbesondere ein schnelles und effizientes Verfahren für einen durch Mikrowellen vermittelten ELISA-Test (MELISA), bei dem alle wichtigsten Stufen des ELISA-Tests unter Mikrowellen-Bestrahlung in kurzer Zeit durchgeführt werden können. Dieses Verfahren ist für die klinische Diagnostik, die Molekularbiologie, die Landwirtschaft, die Herstellung von Nahrungsmitteln, die Umweltwissenschaften usw. geeignet.
Das erfindungsgemäße ELISA-Verfahren ist einfach, zeitsparend und kommt ohne zeitraubende, umständliche Arbeitsgänge aus. Dieses Verfahren kann auch automatisiert werden.
Das vorliegende Verfahren hat den Vorteil gegenüber den bereits bestehenden ELISA-Verfahren, die gewöhnlich mehrere Stunden bis 2 Tagen in Anspruch nehmen, dass es innerhalb von weniger als 10 Minuten durchgeführt werden kann. Es ist besonders geeignet für die Diagnose von Krankheiten, bei denen rasche Ergebnisse erforderlich sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der enzymgebundene Immunosorbenstest (ELISA) stellt eine hochempfindliche Technik dar, die bei der halbquantitativen oder quantitativen Bestimmung der Konzentration bestimmter Antigene und Antikörper zum Einsatz gelangt. ELISA stellt heute ein geeignetes Mittel bei der Diagnose von tierischen und pflanzlichen Erkrankungen dar. Außerdem dient dieser Test auch dem Screening monoklonaler Antikörper im Verlauf ihrer Produktion (Douillard, J.Y. und Hoffman, T., 1983), dem Nachweis von Pestizidrückständen bei Feldfrüchten (Van Emon, J.M. und Lopez-Avila, V., 1992) und der Bestimmung von Rückständen in Umweltproben wie in Boden- und Wasserproben (Linde, D.G. und Goh, K.S., 1995), dem Nachweis von Apoptose in Gewebekulturen usw. (Salgame, P. et al., 1996). Zur Durchführung des ELISA-Tests werden Polystyrol-Mikrotiterplatten ganz allgemein verwendet, da sie transparent, billig und leicht erhältlich sind, durch Formen jede erwünschte Form annehmen können und durch Adsorption Proteine zu binden vermögen. Die traditionellen ELISA-Verfahren beruhen auf der Immobilisierung von Antigenen oder Antikörpern auf der Oberfläche der Mulden einer Polystyrol-Mikrotiterplatte durch Adsorption. Dies beruht auf der nichtkovalenten Wechselwirkung zwischen dem Biomolekül und der Oberfläche des Polystyrols.
Das Adsorptionsverfahren ist jedoch ein zu unwirksames Verfahren, um hohe Ausbeuten erzielen zu lassen und lässt sich nicht immer dosisabhängig durchführen. Um dieses Problem der traditionellen Verfahren zu beseitigen, haben viele Autoren (Satoh, A. et al., 1999) die kovalente Immobilisierung von Biomolekülen auf Mikrotiter-Platten vorgeschlagen. Auch die kovalente Bindung von Immunogenen auf gepfropften Kunststoffoberflächen wurde beschrieben (Larsson, P.H. et al., 1987). Dennoch erfordert das traditionelle ELISA-Verfahren eine Durchführungsdauer von mehreren Stunden bis 2 Tagen. Das ist der Hauptnachteil der einzelnen ELISA-Verfahren, beruhen sie nun auf der Adsorption oder der kovalenten Bindung. Bei medizinischen Notfällen geht auf diese Weise bei der Diagnose wertvolle Zeit verloren, bevor der Patient behandelt werden kann. In der Landwirtschaft ist ELISA geeignet für den Nachweis von Pestizidrückständen bei Feldfrüchten und in Umweltproben. Aufgrund des oben beschriebenen Nachteils des ELISA-Verfahrens verzögern sich Export und Vermarktung von Feldfrüchten, was einen starken Verlust für den Export bedeutet.
Die Anmelder der vorliegenden Erfindung haben nun ein neues und einzigartiges Verfahren entwickelt, bei dem ELISA unter Einsatz von Mikrowellen rasch durchgeführt werden kann. Seit ca. einem Jahrzehnt sind Mikrowellen dafür bekannt, dass sie die Immunhistochemie beschleunigen (Boon, M.E. und Kok, L.P., 1992; Boon, M.E. et al., 1989; Boon, M.E. et al., PCT-Patentanmeldung WO 89/03038; Chiu K.Y. und Chan, K.W., 1987; Hjerpe, A. et al., 1988).
Die kovalente Immobilisierung von Antigen oder Antikörper auf einer Polystyrol-Oberfläche durch Bestrahlung mit Mikrowellen war bisher nicht bekannt. Nicht bekannt aus dem Stand der Technik ist nämlich die Tatsache, dass alle Hauptstufen des ELISA-Tests durch Mikrowellenbestrahlung in so kurzer Zeit durchgeführt werden können, dass auch geringste Mengen an Antigenen oder Antikörpern durch Messen der optischen Dichte nachgewiesen werden können.
Bekannt sind jedoch bereits Versuche zur Durchführung einer der Stufen des ELISA-Tests durch Mikrowellenbestrahlung (Hjerpe, A. et al., 1988), bei dem Polystyrol-ELISA-Platten zuerst mit von Kaninchen-Anti-karzinoembryonalem Antigen durch Inkubation über Nacht bei 4°C unter nachfolgender Inkubation des Antigens (CEA) beschichtet wurden. Auf der nachfolgenden Stufe, d.h. nach der Zugabe der enzymverknüpften Antikörper untersuchten die Autoren die Wirkung der Mikrowellenbestrahlung auf die Reaktionen zwischen Antigen und Antikörper.
Bei einem anderen Versuch derselben Autoren wurden ELISA-Platten zuerst mit einem normalen Mausserum durch Inkubation über Nacht bei 4°C unter nachfolgender Inkubation mit nichtmarkiertem Kaninchen-anti-Maus-Ig über Nacht beschichtet. Auf der darauf folgenden Stufe wurden die PAP (Peroxidase-Antiperoxidase)-Komplexe der Maus zugesetzt, wonach man die Wirkung der Mikrowellenbestrahlung auf das die Reaktionsfähigkeitskonstanten der Reaktionen auf dieser letzten Stufe ermittelte.
In einem dritten Versuch beschichteten Hjerpe et al. zuerst die Platten mit nichtspezifischem Mäuseserum unter nachfolger Inkubation mit biotinyliertem Pferde-Anti-Maus-IgG. Die Platten wurden dann verwendet, um die Wirkung der Mikrowellen bei der nachfolgenden Bindung der Biotin-Avidin-Komplexe zu untersuchen.
Die Reaktionsausbeuten waren bei all den obigen Versuchen bei Proben geringer, die der Mikrowellenbestrahlung unterworfen wurden, verglichen mit solchen, die nicht durch Mikrowelleneinwirkung stimuliert wurden. Die Versuche haben ergeben, dass die Mikrowellen einen starken Verlust an Reaktionsvermögen bewirken und dass die Gesamtausbeuten ca. 10–15 % betrugen, verglichen mit dem traditionellen Verfahren, das außerhalb eines Mikrowellenherdes durchgeführt wurden. Entsprechend diesen Autoren beruht der verminderte Wert bei der Mikrowellentechnik auf den zu hohen Temperaturen in den Mulden, obwohl ein Becher Wasser verwendet wurde, um die überschüssige Mikrowellenenergie aufzunehmen und als Vorsichtsmaßnahme die untere Platte gekühlt wurde.
Bei einem weiteren ELISA-Versuch verwendeten die Autoren (Koh und Boon, 1992) ein faseroptisches Thermometer, um die Temperatur unter 40°C zu halten. Auch hier wurde mit 200 ml Leitungswasser gearbeitet. Außerdem wurde die Flüssigkeit in den Mulden gerührt, indem man durch die Lösung mit Hilfe von dünnen Kunststoffröhrchen, die in die Mulden getaucht wurden, Luft bläst. Bei einem Versuch führten die Autoren nur zwei Stufen durch, und zwar die Stufe der Bindung von Antikörper und Konjugat durch Mikrowellenbestrahlung jeweils während 6 Minuten bei 150 Watt.
Bei einem anderen Versuch wurden die Stufen der Bindung des Antikörpers, des Antigens und des Konjugats im Verlaufe von 15, 30 bzw. 30 Minuten unter Verwendung einer Mikrowellenleistung auf jeder Stufe von 45–50% durchgeführt.
Die restlichen Stufen wurden bei beiden Versuchen wie nach dem üblichen Verfahren durchgeführt.
Bei den obigen Versuchen erwiesen sich die ELISA-Werte als weit geringer als beim traditionellen Verfahren.
Entsprechend den Autoren ergab die längere Einwirkdauer einen höheren Extinktionswert (ELISA-Wert), der Zeitgewinn war jedoch nicht bemerkenswert. Bei einer Einwirkdauer von 30 Minuten oder darüber ergab sich kein zusätzlicher Vorteil. Zu kurze Einwirkzeiten führten zu Extinktionswerten, die eher niedrig waren und nicht verwendet werden konnten.
Die beschriebenen ELISA-Verfahren durch Einwirkung von Mikrowellen haben mehrere Nachteile:

1. Die Ergebnisse (ELISA-Wert) waren weit schlechter als beim traditionellen Verfahren.
2. Der Zeitgewinn war nicht besonders bemerkenswert. Es war möglich, vergleichbare Ergebnisse (ELISA-Wert) zu erzielen, indem man den ELISA-Test außerhalb des Mikrowellenherdes in derselben Zeit durchführte.
3. Es war Wasserkühlung erforderlich.
4. Es war ein Kühlsystem bzw. eine gekühlte Bodenplatte erforderlich.
5. Erforderlich war ein Rührsystem in der Mulde der Mikrotiterplatte.
6. Nicht alle Stufen wurden durch Mikrowellenenergie durchgeführt und das beschriebene ELISA-Verfahren lässt sich nur beschränkt oder überhaupt nicht automatisieren.

Die nachfolgenden Druckschriften offenbaren den ELISA-Test und andere immunologische Reaktionen, die durch die Verwendung von Mikrowellen verbessert werden:
BUDDE ET AL: "DRASTISCHE VERKUERZUNGEN VON INKUBATIONSZEITEN BEI IMMUNHAEMATOLOGISCHEN UNTERSUCHUNGEN DURCH EINSATZ VON MIKROWELLENGERAETEN" INFUSIONSTHERAPIE UND TRANSFUSIONSMEDIZIN, BASEL, CH, Bd. 22, Nr. SUPPL. 01, 1995, Seiten 92–94, XP000985251, SSN: 1019-8466.
ZHANG L-Z ET AL: "USE OF MICROWAVES IN IMMUNOENZYME TECHNIQUES" CLINICAL CHEMISTRY, AMERICAN ASSOCIATION FOR CLINICAL CHEMISTRY: WINSTON, US, Bd. 39, Nr. 9, September 1993 (1993-09), Seite 2021, XP000985131, ISSN: 0009-9147.
MARANI ENRICO: "Microwave applications in neuromorphology and neurochemistry: Safety precautions and techniques." ME-THODS (ORLANDO), Bd. 15, Nr. 2, Juni 1998 (1998-06), Seiten 87–99, XP002166951, ISSN: 1046-2023.
DORP VAN R ET AL: "ELISA INCUBATION TIMES CAN BE REDUCED BY 2.45-GHZ MICROWAVES" JOURNAL OF CLINICAL AND LABORATORY IMMUNOLOGY; TREVIOT-KIMPTON PUBLICATIONS, LONDON, GB, Bd. 34, Nr. 2, Februar 1991 (1991-02), Seiten 87–96, XP000985204, ISSN: 0141-2760.
DORPVAN R ET AL: "A RAPID ELISA FOR MEASSUREMENT OF ANTIGLOMERULAR BASEMENT MEMBRANE ANTIBODIES USING MIKROWAVES" JOURNAL OF CLINICAL AND LABORATORY IMMUNOLOGY, TREVIOT-KIMPTON PUBLICATIONS, LONDON, GB, Bd. 40, Nr. 3, 1993, Seiten 135–147, XP000985202, ISSN: 0141-2760.
Die Anmelder haben in der vorliegenden Erfindung sämtliche oben angeführten Nachteile beseitigt. Die thermische Energie von Mikrowellen kann nämlich Biomoleküle sowohl aktivieren als auch inaktivieren. Ohne entsprechende Bedingungen können die Mikrowellen einen teilweisen oder totalen Abbau des Biomoleküls verursachen, was zu einem niedrigen oder uner wünschten ELISA-Wert führt. Für das nun gefundene Verfahren sind entsprechende Bedingungen festgestellt worden, von denen die meisten den beschriebenen Verfahren entgegengesetzt oder aus dem Stand der Technik überhaupt nicht bekannt sind. Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden sämtliche Stufen mit Ausnahme der Farbentwicklung durch Mikrowellenstimulierung durchgeführt. Beim veröffentlichten Verfahren wurde die Blockierungsstufe nicht durch Mikrowellenbestrahlung durchgeführt, da diese eine unspezifische Bindung ergab, wohingegen die Anmelder in der vorliegenden Erfindung ein Verfahren gefunden haben, bei dem die Blockierungsstufe in kurzer Zeit durch Mikrowellenbestrahlung durchgeführt wird. Eine längere Einwirkdauer bei der Mikrowellenbestrahlung ergab für das beschriebene Verfahren einen höheren ELISA-Wert, wohingegen beim erfindungsgemäßen Verfahren dies zu einem Abbau des Stoffes bzw. zu einer unspezifischen Bindung führte. Dies kann darauf beruhen, dass die beim beschriebenen Verfahren verwendete Wasserkühlung bzw. das Kühlsystem den Hauptanteil der Mikrowellenenergie absorbierte, was eine minimale Mikrowellenwirkung ergab und eine signifikante Wirkung der Zeit wie beim traditionellen Verfahren. Andererseits bedarf das erfindungsgemäße Verfahren keiner Wasserkühlung bzw. eines Kühl- oder Rührsystems. Außerdem ist für den ELISA-Test erfindungsgemäß etwa nur ein 200stel (die Farbentwicklungsstufe ausgeschlossen) an Zeit erforderlich verglichen mit dem traditionellen Verfahren, das ca. 18 Stunden in Anspruch nimmt, bei vergleichbarem oder sogar besserem ELISA-Wert. Es besteht daher auch eine große Möglichkeit, das Verfahren zu automatisieren.
Der bekannte ELISA-Test wurde in einer Mikrotiterplatte durchgeführt, bei der das Biomolekül nicht durch kovalente Bindung gebunden wird. Es ist nämlich bekannt, dass die Mikrowellen leicht die Gesamtheit nichtkovalenter sekundärer Bindung wie Wasserstoffbindungen, hydrophobe Wechselwirkungen und Van der Waal's-Wechselwirkung beeinflussen.
AUFGABEN DER ERFINDUNG
Die Hauptaufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines raschen und wirksamen Verfahrens zur Durchführung eines enzymverknüpften Immunosorbenstests zum Nachweis minimaler Mengen an Antigenen oder Antikörpern durch Spektrofotometrie für die rasche Diagnose von Erkrankungen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer Technik, die einfach und reproduzierbar ist und keine zusätzlichen Untersuchungen oder eine teure Ausrüstung erforderlich macht.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer raschen Technik, die automatisiert werden kann und menschliche Irrtümer, die gewöhnlich von Mensch zu Mensch variieren, auf ein Minimum herabzusetzen vermag.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Im Hinblick auf die Lösung der obigen Aufgaben und die Beseitigung des Nachteils des bekannten ELISA-Verfahrens wird ein rasches und wirksames Verfahren für den durch Mikrowellen vermittelten ELISA-(MELISA-)Test bereitgestellt, das folgende Stufen umfasst:

(i) die kovalente Immmobilisierung eines Antigens oder Antikörpers auf der aktivierten festen Oberfläche durch Mikrowellenbestrahlung,
(ii) Blockierung der freien Oberfläche mit einem Blockierungsmittel durch kurze Mikrowellenbestrahlung,
(iii) Bindung des Antikörpers oder Antigens durch gesteuerte Mikrowellenbestrahlung,
(iv) Bindung des Konjugats durch gesteuerte Mikrowellenbe strahlung,
(v) Zugabe eines Farbstoffsubstrats zu den Mulden und
(vi) Ermittlung des Absorptionswertes.

Das durch Mikrowellen vermittelte ELISA-(MELISA-)-Verfahren wird auf einer aktivierten Oberfläche in sehr kurzer Zeit (ca. 10 Minuten) und bei derselben Wirksamkeit wie beim traditionellen ELISA-Verfahren bei 37°C in 16–18 Stunden durchgeführt.
Die Erfindung bietet die Möglichkeit der Voll- oder Halbautomatisierung des ELISA-Verfahrens.
Mikrowellen sind dafür bekannt, dass sie leicht die Gesamtheit nichtkovalenter sekundärer Bindung wie Wasserstoffbindungen, hydrophobe Wechselwirkungen und Van der Waal's-Wechselwirkung beeinflussen.
Zur Beseitigung dieses Problems aktivieren die Anmelder die Oberfläche der Mikrotitermulden, bevor diese zum Einsatz gelangen. Die aktivierte Oberfläche immobilisiert dann das Antigen durch eine kovalente Bindung infolge einer kurzzeitigen Mikrowelleneinwirkung. Dieses kovalent immobilisierte Antigen ist dann beständig genug, um einer wiederholten, jedoch kurzzeitigen Mikrowelleneinwirkung, die für die Durchführung der nachfolgenden Stufen des ELISA-Verfahrens erforderlich sind, zu widerstehen. Die nachfolgenden Stufen der Bindung des Biomoleküls beim ELISA-Verfahren erfolgen durch nichtkovalente Bindung, die für Mikrowellenenergie empfänglich sind. Diese Probleme werden durch Steuerung der Zeit und der Energie der Mikrowellenbestrahlung auf jeder Stufe beseitigt.
Die Neuheit der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass das ELISA-Verfahren an einer aktivierten Oberfläche durch geführt wird, die zur Bildung einer kovalenten Bindung an den Proteinliganden befähigt ist.
Eine weitere Neuheit der vorliegenden Erfindung ist die durch Mikrowellen vermittelte kovalente Immobilisierung eines Biomoleküls, insbesondere eines Antigens oder eines Antikörpers auf der aktivierten Oberfläche.
Eine weitere Neuheit ist die gesteuerte Mikrowellenbestrahlung auf jeder Stufe des ELISA-Verfahrens.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden alle Stufen von ELISA wie die Antigenbindung, die Blockierung, die Bindung des Antikörpers und die Bindung des Konjugats durch Mikrowellenbestrahlung durchgeführt und nur die Enzym-Substrat-Reaktion wird außerhalb des Mikrowellenherdes bei Raumtemperatur durchgeführt. Das erfindungsgemäße ELISA-Verfahren ist sehr schnell mit einem vergleichbaren oder sogar besseren ELISA-Wert als beim traditionellen Verfahren.
Eine weitere Neuheit der Erfindung besteht darin, dass das erfindungsgemäße ELISA-Verfahren keiner Beschickung mit Wasser bzw. eines Rührsystems bedarf.
Eine weitere Neuheit der Erfindung besteht darin, dass das ELISA-Verfahren vollständig oder teilweise unter Verwendung einer speziell konstruierten Vorrichtung automatisiert werden kann.
Eine weitere Neuheit der Erfindung besteht darin, dass das Verfahren auch für andere Immuntests wie Radioimmun-, Radioimmunsorbens-, Radioallergosorbens-, Biotin-Avidin/Streptavidin-Immuntests, für Immunblotting, Immunanfärbung, verschiedenen Typen von ELISA wie Direkt-ELISA, Indirekt-ELISA und Sandwich-ELISA verwendet werden kann.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren der enzymverknüpften Immunsorbens-Test-Technik auf einer aktivierten Mikrotiterplatte, auf einem Modul oder in einer Mulde durch Einwirkung von Mikrowellen bereit. Die aktivierte Oberfläche immobilisiert das Antigen durch kovalente Bindung durch Mikrowellenbestrahlung. Dieses kovalente immobilisierte Antigen ist beständig genug, um der wiederholten, jedoch kurzen Einwirkung von Mikrowellen, was für die Durchführung der nachfolgenden Stufen des ELISA-Verfahrens erforderlich ist, zu widerstehen. ELISA ist ein mehrstufiges heikles Verfahren, bei dem ungeeignete Bedingungen auf jeder Stufe die Gesamtergebnisse beeinträchtigen können.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die inerte feste Oberfläche wie Polystyrol durch photochemische Reaktion unter trockenen Bedingungen und unter Verwendung einer photoaktivierbaren Verbindung aktiviert. Die Aktivierung des festen Trägers erfolgt dadurch, dass man den mit der photoaktivierbaren Verbindung beschichteten Träger der UV-Strahlung oder hellem Sonnenlicht aussetzt. Dieser aktivierte Träger wird dann für mit Mikrowellen vermitteltes ELISA (MELISA) und zur Steuerung von ELISA zum Nachweis von Antikörpern, z.B. von E. histolytica und Aspergillus fumigatus, verwendet. Wird ein unbehandelter Träger verwendet, kommt es zu keiner Bindung des Biomoleküls durch Mikrowellenbestrahlung in so kurzer Zeit.
Die Mikrowellenbestrahlung erfolgt in einem für Haushaltszwecke verwendeten Mikrowellenherd (BPL-Sanyo, Indien), der bei einer Frequenz von ca. 2450 MHz arbeitet.
Das Amöbenantigen wird aus der Kultur von E. hystolytica nach dem veröffentlichten Verfahren (Sawhney, S. et al., 1980, Sharma, G.L. et al., 1984) erhalten. Die Proteinkonzentration der Antigene betrug 1,54 mg/ml entsprechend der Methode von Lowry et al. (Lowry, O.H. et al., 1951). Das Antigen wurde vor der Durchführung von ELISA verdünnt und zur Beschichtung der Mulden wurde eine Konzentration von 1,0 μg pro Mulde verwendet.
Als Beschichtungspuffer wird eine Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2, 0,01 M, verwendet.
Als Waschpuffer wird eine Phosphapuffer-Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2, 0,01 M, zusammen mit 0,1 % Tween 20 verwendet.
Die Blockierlösung stellt man durch Lösen von 2 % BSA in 0,01 M PBs, pH 7,2, her.
Die Substratlösung stellt man durch Zugabe von 0,067 o-Phenylendiamin und 0,043 % H₂O₂ in 0,1 M Phosphatcitratpuffer, pH 4,5, her.
Hyperimmunsera gegenüber E. histolytica erhält man aus Kaninchen der Rasse Newzealand White nach den Methoden von Sawhney et al. (Sawhney et al., 1980). Die Antikörpertiter in den Sera werden durch Geldiffusionstest geprüft.
Der Antikörper (+ve-Sera) von ELISA wird vor der Durchführung von ELISA in PBS verdünnt, wobei für die Versuche eine Verdünnung von 1:300 verwendet wird.
Dem Kaninchen entnimmt man über die Ohrvene Blut, bevor man die Immunisierungsdosis des Antigens von E. histolytica zusetzt, um negative Kontrollsera (-ve-Sera) zu erhalten. Pro Mulde werden 100 μl verdünnte (1:300) -ve-Sera verwendet.
Mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG wird von der Firma Sigma in Form eines lyophilisierten Pulvers vertrieben.
Nach der Wiederherstellung wird die optimale Verdünnung durch Schachbrett-Titration ermittelt. Sie beträgt 1:4000. Diese Verdünnung wird für die Versuche verwendet.
ELISA ist ein 5-stufiges Verfahren, und zwar umfasst es die Antigenbindung, die Blockierung, die Antikörperbindung, die Konjugatbindung und die Farbentwicklung. Jede Stufe von MELISA wird optimiert, indem man die nachfolgenden Stufen nach dem traditionellen ELISA-Verfahren durchführt. Dieses wird so durchgeführt, dass man die aktivierten Mulden über Nacht mit dem Antigen bei 4°C beschichtet, die Mulden innerhalb von 2 Stunden bei 37°C blockiert, die Antikörper- und Konjugatbindung jeweils bei 37°C während 2 Stunden durchführt und die Farbentwicklung, d.h. die Enzym-Substrat-Reaktion bei Raumtemperatur während 5 Minuten durchführt, wonach man die Absorption abliest.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die erste Stufe von ELISA durch kovalente Immobilisierung des Amöbenantigens auf der aktivierten Polystyrol-Mikromuldenplatte durch Mikrowellenbestrahlung bei 700 Watt bei unterschiedlicher Zeitdauer. Die Bindung ist bereits nach 10 Sekunden nachweisbar und nimmt dann mit zunehmender Bestrahlungsdauer zu (Tabelle 1). Bei 90 Sekunden ist die Antigenbindung mehr oder weniger dieselbe wie bei einer Mikrowellenbestrahlung während 70 Sekunden. Die optimale Zeitdauer für die Antigenimmobilisierung beträgt daher 70 Sekunden. Bei Kontrollversuchen während derselben Zeitdauer, d.h. bei 70 Sekunden bei 37°C, wurde keine Bindung des Antigens an der aktivierten Polystyroloberfläche festgestellt.
Auf der zweiten Stufe von MELISA wird die Blockierung mit 2 % BSA innerhalb von 10 Sekunden im Mikrowellenherd bei einem Leistungsoutput von mindestens 700 W zur Blockierung der freien Oberfläche der aktivierten Oberfläche durchgeführt. Ein weiterer Anstieg der Bestrahlungsdauer führte zu einer unspezifischen Bindung (Tabelle 2).
Auf der dritten Stufe von MELISA erfolgt die Antikörperbindung an das immobilisierte Antigen bei 150 W während 100 Sekunden. Dies ist eine entscheidende Stufe, bei der strenge Bedingungen wie eine zu lange Zeitdauer oder ein höherer Leistungsoutput zu einer unspezifischen Bindung führt (s. Tabelle 3). Bei 155 W innerhalb von 50 Sekunden bzw. 100 Sekunden kommt es zu keiner unspezifischen Bindung. Obwohl die optische Dichte bei 50 Sekunden sehr niedrig ist, gelten 100 Sekunden als ausgezeichneter Wert, der zu einem hohen Verhältnis von -ve- zu +ve-Sera führt.
Auf der vierten Stufe von MELISA erfolgt die Konjugatbindung durch Mikrowellenbestrahlung bei 155 W bei unterschiedlicher Zeitdauer. Ausgezeichnete Ergebnisse erzielt man bei 100 Sekunden (Tabelle 6). Strenge Bedingungen wie zu hohe Zeitdauer bzw. zu hoher Energiemenge wie 700 W führen zu einer unspezifischen Bindung (Tabelle 5).
Auf jeder Stufe wird außerhalb des Mikrowellenherdes während derselben Zeitdauer ein Kontrollversuch unter denselben Versuchsbedingungen durchgeführt. Bei all diesen Versuchen wird ein vernachlässigbarer bzw. unerwünschter ELISA-Wert (unspezifische Bindung) erzielt.
Nach der Optimierung jeder MELISA-Stufe führten die Anmelder alle Stufen unter optimierten Bedingungen der Mikrowellenbestrahlung ohne Schädigung der Biomoleküle durch. Zu diesem Zweck immobilisierten die Anmelder das Antigen auf der aktivierten Mulde innerhalb von 70 Sekunden und führten die Blockierung innerhalb von 10 Sekunden und Antikörperbindung innerhalb von 100 Sekunden sowie die Konjugatbindung innerhalb von 100 Sekunden Bestrahlung durch. Die für alle diese Stufen erforderliche Gesamtzeit betrug lediglich beim erfindungsgemäßen Verfahren 280 Sekunden, während sie beim herkömmlichen ELISA-Verfahren ca. 18 Stunden betrug.
Unter ähnlichen Versuchsbedingungen wurden unter mehrmaliger Wiederholung MELISA und ELISA durchgeführt, um E. hystolytica-Antikörper nachzuweisen. Die dabei erzielten Ergebnisse waren in hohem Maße reproduzierbar, wie dies Tabelle 7 zeigt.
Das MELISA-Verfahren wurde ferner durch Nachweis von Aspergillus fumigatus-Antikörpern aus Patientenseren überprüft. Das A. fumigatus-Antigen wird aus einer statischen Kultur entsprechend dem veröffentlichen Verfahren (Banerjee, B. et al., 1990) erhalten.
Die Proteinkonzentration der Antigene beträgt 12,5 mg/ml entsprechend der Methode von Lowry et al. (Lowry et al., 1951). Die Immunreaktivität des Antigens wird durch Verwendung von hyperimmunem Serum, erhalten aus Kaninchen der Rasse Newzealand White, geprüft.
Aus 10 Patienten mit allergischer bronchopulmonaler Aspergillose (ABPA) werden Serenproben gewonnen. Alle diese Patienten erfüllten die klinischen Kriterien der ABPA, wie seinerzeit beschrieben (Rosenberg, M. et al., 1997).
Aus 10 Freiwilligen, die offensichtlich gesund waren und keine respiratorischen oder andere Erkrankungen aufwiesen, wurden negative Kontrollserenproben gezogen.
Als Kontrollproben für ELISA wurden gesammelte positive und negative Seren verwendet. Diese Proben waren sowohl im Hinblick auf MELISA als auch hinsichtlich des traditionellen ELISA vergleichbar.
Mit antimenschlicher IgG konjugierte Meerrettich-Peroxidase wird von der Firma Sigma als lyophilisiertes Pulver vertrieben. Nach der Wiederherstellung lag die optimale Verdünnung des Konjugats bei 1:4000, ermittelt durch Schachbrett-Titration.
Der erfindungsgemäße Nachweis von A. fumigaturs-Antikörpern (in Patientenseren) stimmt mit den konventionellen ELISA-Verfahren überein (Tabelle 8).
Die bei den einzelnen Versuchen erzielten Ergebnisse lassen sich nach der nachfolgenden Werteskala miteinander vergleichen:
Ausgezeichnet = ++++
sehr gut = +++
gut = ++
gering = +
unerwünschte Ergebnisse oder keine Ergebnisse = –
Die Gesamtdauer für die Durchführung von MELISA beträgt weniger als 10 min. Die für die Durchführung jeder Stufe erforderliche Zeitdauer kann jedoch je nach der Art der Biomoleküle unterschiedlich sein, wobei durch geringere Modifizierung der Reaktionsbedingungen, d.h. geringere Veränderung der Zeitdauer und der Strahlungsenergie, ausgezeichnete Ergebnisse erzielt werden.
Die vorliegende Erfindung gewährleistet somit ein schnelles Verfahren für einen durch Mikrowellen vermittelten enzymgebundenen Immunsorbenstest, gekennzeichnet durch die Verwendung eines aktivierten Feststoffträgers, das folgende Stufen umfasst:

(a) Bereitstellung eines aktivierten Feststoffträgers,
(b) Aufbringen eines Biomoleküls, ausgewählt unter einem Antigen oder einem Antikörper, durch Lösen des Biomoleküls in einem Beschichtungspuffer in der aktivierten Mulde des Feststoffträgers und Einbringen der Mulde in einen Mikrowellenherd unter nachfolgender Bestrahlung der Mulde mit Mikrowellen bei einer Frequenz im Bereich von 2300–2500 MHz bei einem Leistungsoutput im Bereich von 600 bis 900 Watt während 50–100 Sekunden unter nachfolgenden sorgfältigem Waschen mit einem geeigneten Waschpuffer,
(c) Blockierung der freien Stellen der Mulde mit einem auf Stufe (b) erhaltenen immobilisierten Biomolekül, wie oben angegeben, durch Aufbringen einer Blockierlösung auf die Mulde und Bestrahlung im Innern des Mikrowellenherdes bei einer Frequenz im Bereich von 2300–2500 MHz bei einem Leistungsoutput im Bereich von 600–800 Watt während 5–20 Sekunden unter nachfolgendem Waschen mit einem geeigneten Waschpuffer,
(d) Aufbringen des entsprechenden in einem Puffer gelösten Antikörpers oder Antigens auf die mit dem auf Stufe (c) erhaltenen Antigen oder Antikörper immobilisierte Mulde durch Bestrahlung der Mulde im Innern des Mikrowellenherdes bei einer Frequenz im Bereich von 2300–2500 MHz mit einem Leistungsoutput im Bereich von 50–200 Watt während 90–200 Sekunden unter nachfolgendem Waschen mit einem Waschpuffer,
(e) Aufbringen eines geeigneten, in einem geeigneten Puffer gelösten Enzymkonjugats auf die auf Stufe (d) erhaltene Mulde und Bestrahlung der Mulde in einem Mikrowellenherd bei einer Frequenz im Bereich von 2300–2500 MHz mit einem Leistungssoutput in Bereich von 100–300 Watt während 50–150 Sekunden unter nachfolgendem Waschen mit einem Waschpuffer und
(f) Zugabe eines Substrat-Farbstoff-Puffers zu der auf Stufe (e) erhaltenen Mulde und Halten während 4–10 Minuten in der Dunkelheit unter nachfolgender Zugabe einer Stopplösung und Messen der optischen Dichte der Lösung mit Hilfe eines Spektrophotometers bei einer geeigneten Wellenlänge.

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der feste Träger ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Stoffen wie Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Glas, Cellulose, Nitrocellulose, Silicagel, Polyvinchlorid und Polyanilin.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der bevorzugte Feststoffträger Polystyrol.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird der Feststoffträger ausgewählt unter beliebigen Formen und Größen wie Bahnen, Platten, Testteilchen wie Perlen und Mikrokügelchen, Proberöhrchen, Probestäbchen, Probestreifen, Mulden, einer ELISA-Platte, einer Mikromuldenplatte oder eines Moduls.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der für die Immobilisierung der Biomoleküle verwendete Feststoffträger ausgewählt unter beliebigen Trägern mit wenigstens einer aktiven funktionellen Gruppe, welche zur Bindung von Ligandenmolekülen durch kovalente Bindung befähigt sind.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die funktionelle Gruppe ausgewählt unter Halogenid, Aldehyd, Acetyl, Epoxid, Succinamid, Isothiocyanat, Acylazid u.a.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die funktionelle Gruppe bereits im Träger vorliegen oder sie kann durch übliche aus dem Stand der Technik bekannte chemische oder photochemische oder andere Methoden eingearbeitet werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die funktionelle Gruppe in den Feststoffträger durch photochemische Reaktion unter trockenen Bedingungen unter Verwendung einer photoaktivierbaren Verbindung, ausgewählt unter 4-Fluor-3-nitroazidobenzol, N-Hydroxysulfosuccinimidyl-4-azidobenzoat und N-Hydroxysulfo-succinimidyl-4-azidosalicylsäure, eingearbeitet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Polystyroloberfläche durch Beschichten mit 1-Fluor-2-nitroazidobenzol und Bestrahlen des beschichteten Trägers unter trockenen Bedingungen mit UV-Strahlung bei 365 nm aktiviert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Lichtquelle für die photochemische Reaktion ausgewählt unter einer UV-Lampe, einem Laserstrahl und hellem Sonnenlicht.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Zeitdauer für die Photoreaktion für die Aktivierung des Feststoffträgers unter einem Bereich von 10 Sekunden bis 10 Stunden ausgewählt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Mikrowellenbestrahlung in einer Mikrowellenapparatur durchgeführt, ausgewählt unter einem Mikrowellenherd für Haushaltszwecke, einem speziell konstruierten Mikrowellenherd oder einer Apparatur oder Kammer, in der Mikrowellen erzeugt werden.
Die erste Stufe des ELISA-Verfahrens wird erfindungsgemäß durch kovalente Bindung eines Antigens oder eines Antikörpers auf der aktivierten Platte durch Mikrowellenbestrahlung bei einer Frequenz von 2300–2500 MHz mit einem Leistungsoutput im Bereich von 600–900 W während einer kurzen Zeitdauer im Bereich von 50–100 Sekunden durchgeführt.
Die zweite Stufe des ELISA-Verfahrens, d.h. die Blockierstufe, wird erfindungsgemäß durch Mikrowellenbestrahlung bei einer Frequenz von 2300–2500 MHz mit einem Leistungsoutput im Bereich von 600–800 W während einer kurzen Zeitdauer im Bereich von 5–20 Sekunden durchgeführt.
Die dritte Stufe des ELISA-Verfahrens, die der Bindunmg des Antikörpers bzw. Antigens entspricht, wird erfindungsgemäß durch Mikrowellenbestrahlung bei einer Frequenz von 2300–2500 MHz mit einem Leistungsoutput im Bereich von 50–200 W während einer kurzen Zeitdauer im Bereich von 90–200 Sekunden durchgeführt.
Die vierte Stufe des ELISA-Verfahrens, d.h. die Enzym-Konjugat-Bindung, wird erfindungsgemäß durch Mikrowellenbe strahlung bei einer Frequenz von 2300–2500 MHz mit einem Leistungsoutput im Bereich von 100–300 W während einer Zeitdauer im Bereich von 50–150 Sekunden durchgeführt.
Die Gesamtdauer der Antigenbindung, Blockierung, Antikörperbindung und Konjugatbindung liegt erfindungsgemä in einem Bereich von 195 bis 470 Sekunden, während die Gesamtdauer beim traditionellen Verfahren gewöhnlich in einem Bereich von 10–24 Stunden liegt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das Antigen in einem Beschichtungspuffer von geeigneter Zusammensetzung mit einem pH im Bereich von 6,5 bis 11 bei einem Molaritätsbereich von 0,005–0,1 M, der mit dem Antigen sowie mit dem Carbonatpuffer und dem Phosphatpuffer verträglich ist, gelöst werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der verwendete Waschpuffer ein Gemisch aus Phosphatpuffer mit einem pH im Bereich von 6,5–11 bei einem Molaritätsbereich von 0,005–0,1 M und Tween 20 in einem Bereich von 0,05–3 %.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Blockiermittel ausgewählt unter Rinderserumalbumin, Magermilchpulver und Gelatine.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Biomolekül unter einem Antigen oder einem Antikörper ausgewählt. Das Antigen kann ein beliebiges Biomolekül, ein beliebiger Mikroorganismus oder eine beliebige Substanz usw. sein, die eine Immunantwort auslösen oder eine solche auslösen können.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Antikörper ausgewählt unter Biomolekülen, die vom Wirt in Reaktion auf die Beimpfung mit dem spezifischen Antigen erzeugt werden und die Fähigkeit zur spezifischen Bindung an das Antigen aufweisen.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Konjugat ein spezifisches Biomolekül mit einem Antikörper bzw. Antigen, der bzw. das mit einem Enzym, ausgewählt unter Peroxidase oder Alkaliphosphatase, konjugiert ist.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das Enzym durch einen Marker, ausgewählt unter Chrtomophoren, Fluorophoren u.ä., was seinen Nachweis erleichtert, ersetzt sein.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das erfindungsgemäße Verfahren für weitere Immunoassays wie Radioimmunoassay, Radioimmunosorbens-Test, Radioallergosorbens-Test, Biotin-Avidin/Streptavidin-Immunoassay, Immunoblotting, Immunoanfärbung, verschiedene Arten von ELISA wie Direkt-ELISA, Indirekt-ELISA und Sandwich-ELISA verwendet werden.
Die Erfindung wird durch die Patentansprüche definiert und mit Hilfe der nachfolgenden Beispiele näher erläutert.
BEISPIEL 1
Aktivierung des Feststoffträgers
Mulden eines Moduls (12 Mulden-Polystyrolmodul, Fa. Dynatech, USA) werden mit 1,82 mg 1-Fluor-2-nitro-azidobenzol (FNAB), gelöst in 100 μl Methanol pro Mulde und in der Dunkelheit entsprechend getrocknet. Die mit FNAB beschichteten Mulden werden dann 10 min lang mit UV-Licht bei 365 nm in einem UV-Stratalinker 2400 (Stratagene^®, USA) bestrahlt bzw. unter hellem Sonnenlicht während 1 Stunde gehalten. Danach werden die Mulden mehrmals mit Methanol gewaschen, um den nichtabgebundenen Linker zu entfernen, und dann bei Raumtem peratur getrocknet. Die aktivierten Mulden des Moduls werden dann zur Immobilisierung der Antigene oder Antikörper nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet.
VERGLEICHSBEISPIEL 2
Immobilisierung des Entamoeba histolytica-Antigens durch Mikrowellenbestrahlung
In 100 μl PBS verdünntes E. hystolytica-Antigen wird auf eine aktivierte Mulde eines Moduls aufgebracht und 10 Sekunden der Mikrowellenbestrahlung (BPL-Sanyo, Indien) ausgesetzt, und zwar bei einer Frequenz von ca. 2450 MHz mit einem maximalen Leistungsoutput von ca. 700 W. Die Bestrahlung erfolgt im Mikrowellenherd bei der höchsten Leistung (Wert 10), d.h. bei einem Magnetron-Leistungszyklus von 100 % einer Outputleistung von 700 W.
Die Mulde wird dann sorgfältig mit Waschpuffer gewaschen, um das nicht abgebundene Antigen zu entfernen. Die nachfolgenden Stufen werden wie üblich durchgeführt, d.h. die Blockierung mit Blockierlösung (200 μl), die Bindung des Antikörpers (100 μl) und die Bindung des Anti-Kaninchen-IgG-Meerrettich-Peroxidase-Konjugats (100 μl) werden jeweils durch Inkubation vbei 37°C während 2 Stunden durchgeführt. Die Mulde wird nach jeder Stufe sorgfältig mit Waschpuffer gewaschen. Die Farbentwicklung erfolgt dann unter Verwendung von 100 μl Substratlösung. Die Mulde wird dann bei 490 nm in einem ELISA-Ablesegerät abgelesen (Spectramax 190 Mikroplattenspektrophotometer, Molecular Devices Corporation, Kalifornien 94089) und es werden die Absorptionswerte festgehalten. Alle Versuche werden in dreifachen Mulden durchgeführt. Ähnliche Versuche werden auch mit -ve-Sera durchgeführt.
Unter Mikrowellenbestrahlung wird auch ein Kontrollversuch auf ähnliche Weise, jedoch unter Verwendung unbehandelter Mulden durchgeführt. Ein weiterer Kontrollversuch wird mit den aktivierten Mulden durch Inkubation des Antigens bei 37°C in derselben Zeit mit Mikrowellen durchgeführt. Bei beiden Kontrollreaktionen kommt es zu keiner Immobilisierung des Antigens.
Der gesamte Versuch wird getrennt davon durch Abänderung der Zeitdauer für die Antigenbindung bei jeweils 30, 50, 70 bzw. 90 Sekunden wiederholt.
Die Ergebnisse für die Optimierung der Zeitdauer der Antigenbindung durch Mikrowellenbestrahlung sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
VERGLEICHSBEISPIEL 3
Blockierung der freien Oberfläche mit einem Blockierungsmittel durch Mikrowellenbestrahlung.
Das E. histolytica-Antigen wird durch Mikrowellen in einer aktivierten Mulde eines Moduls in 70 Sekunden, wie oben angegeben, immobilisiert. Nach sorgfältigem Waschen mit einem Waschpuffer werden 200 μl Blockierlösung der Mulde zugegeben und mit Mikrowellen bei 700 W während 10 Sekunden bestrahlt. Die nachfolgenden Stufen der Antikörper- und Konjugatbindung erfolgen außerhalb des Mikrowellenherdes, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Farbentwicklung und das Ablesen der Absorption erfolgen wie in Beispiel 2.
Ähnliche Versuche werden auch mit -ve-Sera durchgeführt.
Um die optimale Zeit für die Blockierung zu überprüfen, werden zwei verschiedene Versuche auf ähnliche Weise durchgeführt, nur dass man die Zeit für die Mikrowellenbestrahlung auf 40 bzw. 60 Sekunden anhebt. Alle Versuche werden in dreifachen Mulden durchgeführt.
Die Ergebnisse der Optimierung der Blockierdauer unter Mikrowellenbestrahlung sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
VERGLEICHSBEISPIEL 4
Antikörperbindung durch Mikrowellenbestrahlung bei hohem Energieniveau.
E. histolytica-Antigen wird auf der aktivierten Mulde eines Moduls durch Mikrowellen bei 700 W während 70 Sekunden unter nachfolgender Blockierung der freien Oberfläche mit einem Blockiermittel durch Mikrowellenbestrahlung bei 700 W während 10 Sekunden wie in Beispiel 3 immobilisiert. Danach wird auf die Mulde der Antiamöben-Antikörper (100 μl) aufgegeben. Die Mulde wird dann mit Mikrowellen während 10 Sekunden bei 700 W bestrahlt. Nach sorgfältigem Waschen der Mulden mit Waschpuffer werden die Konjugatbindung und die nachfolgende Farbentwicklung wie in Beispiel 3 durchgeführt. Ähnliche Versuche werden auch mit -ve-Sera durchgeführt. Der Versuch wird unter Abänderung der Zeit der Mikrowellenbestrahlung (30, 50, 70 bzw. 90 Sekunden) für die Bindung der Antikörper, wobei die übrigen Bindungen ähnlich wie oben aufrechterhalten werden, wiederholt. Alle Versuche werden in dreifachen Mulden durchgeführt.
Die Ergebnisse für die Antikörperbindung durch Mikrowellenbestrahlung bei hohem Energieniveau sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
BEISPIEL 5
Antikörperbindung durch Mikrowellenbestrahlung bei niedrigem Energieniveau.
Die Versuche werden für die Antikörperbindung unter ähnlichen Bedingungen wie in Beispiel 4 durchgeführt, nur wird die Stufe der Antikörperbindung bei niedrigem Energieniveau (155 W) durchgeführt. Die Zeitdauer für die Mikrowellenbestrahlung beträgt für vier unterschiedliche Versuchsserien 10, 50, 100 bzw. 150 Sekunden.
Die Ergebnisse für die Antikörperbindung durch Mikrowellen bestrahlung bei niedrigem Energieniveau sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
VERGLEICHSBEISPIEL 6
Konjugatbindung durch Mikrowellenbestrahlung bei hohem Energieniveau.
Das E. histolytica-Antigen wird auf einer aktivierten Mulde durch Mikrowellen bei 700 W während 70 Sekunden unter nachfolgender Blockierung durch Mikrowellen bei 700 W während 10 Sekunden und Antikörperbindung bei 155 W in 100 Sekunden wie im Beispiel 5 immobilisiert.
Dann werden auf die Mulde 100 μl Anti-Kaninchen-IgG-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat aufgegeben und mit Mikrowellen bei 700 W bestrahlt. Die Dauer der Mikrowellenbestrahlung für vier unterschiedliche Versuchsserien beträgt 5, 10, 15 bzw. 20 Sekunden, wobei die übrigen Bedingungen Beispiel 5 entsprechen. Alle Versuche werden in dreifachen Mulden durchgeführt.
Die Ergebnisse für die Konjugatbindung durch Mikrowellenbestrahlung bei hohem Energieniveau sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
BEISPIEL 7
Konjugatbindung durch Mikrowellenbestrahlung bei niedrigem Energieniveau.
Die Versuche werden hier für die zweite Antikörper-Konjugat-Bindung unter ähnlichen Bedingungen wie im Beispiel 6 durchgeführt, nur dass die zweite Antikörper-Konjugat-Bindungsstufe bei niedrigem Energieniveau (155 W) durchgeführt wird. Die Dauer der Mikrowellenbestrahlung für vier unterschiedliche Versuchsserien beträgt 50, 100 bzw. 120 Sekunden.
Die Ergebnisse für die Konjugatbindung durch Mikrowellenbe strahlung bei niedrigem Energieniveau sind in Tabelle 6 zusammengefasst.
BEISPIEL 8
Nachweis von E. histolytica-Antikörpern durch den mikrowellenvermittelten, enzymverknüpften Immunosorbens-Test (MELISA) und den enzymverknüpften Immunosorbens-Test (ELISA)
Das E. histolytica-Antigen wird auf der aktivierten Mulde durch Mikrowellen bei 700 W während 70 sec immobilisiert und mit einer Blockierlösung durch Mikrowellen bei 700 während 10 sec blockiert, wonach, wie in den obigen Beispielen beschrieben, die Antikörper-Bindung bei 155 W während 100 sec und die Antikörper-Konjugat-Bindung bei 155 W während 100 sec erfolgen. Ähnliche Versuche werden auch mit -ve-Sera durchgeführt. Alle Versuche werden in doppelten Mulden durchgeführt und 5 mal wiederholt. Nach jeder Stufe erfolgt eine sorgfältige Wäsche mit Hilfe eines Waschpuffers.
Der traditionelle ELISA-Test erfolgt mit denselben Reagenzien, demselben Substrat und demselben Puffer, nur dass alle Stufen ohne Mikrowellenstimulierung durchgeführt werden. ELISA wird somit durch Beschichten der aktivierten Mulden mit Antigen über Nacht bei 4°C unter nachfolgender Blockierung, Antikörper- und Konjugat-Bindung bei 37°C jeweils während 2 h durchgeführt. Die Farbentwicklung ist für das erfindungsgemäße Verfahren und das traditionelle Verfahren dieselbe.
Die Ergebnisse bezüglich des Nachweises von E. hystolytic-Antikörpern durch mikrowellenvermittelten enzymverknüpften Immunosorbens-Test (MELISA) und enzymnverknüpften Immunosorbens-Test (ELISA) sind in Tabelle 7 zusammengefasst.
BEISPIEL 9
Nachweis von A. fumigatus-Antikörpern durch mikrowellenvermittelten enzymverknüpften Immunosorbens-Test (MELISA) und enzymverknüpften Immunosorbens-Test (ELISA)
Der Nachweis von A. fumigatus-Antikörpern in Patientenseren durch mikrowellenvermittelten enzymverknüpften Immunosorbens-Test und enzymverknüpften Immunosorbens-Test (ELISA) erfolgt unter ähnlichen Bedingungen wie in Beispiel 8, nur dass das Antigen A. fumigatus ist, der Antikörper aus 10 verschiedenen Patientenseren und die Kontrollsera mit unspezifischen Antikörpern aus gesunden Probanden stammen und das Konjugat anti-menschliche IgG-Peroxidase ist. Alle Versuche werden in doppelten Mulden durchgeführt.
Die Ergebnisse bezüglich des Nachweises von A. fumigatus-Antikörpern durch mikrowellenvermittelten enzymverknüpften Immunosorbens-Test (MELISA) und enzymnverknüpften Immunosorbens-Test (ELISA) sind in Tabelle 8 zusammengefasst.
Tabelle 1.
Nachweis von E. hystolytica-Antikörpern durch Durchführung der ersten Stufe nach dem MELISA-Verfahren und der restlichen Stufen nach dem ELISA-Verfahren.

MELISA: Stufe 1. Immobilisierung des Antigens durch Mikrowellenbestrahlung bei 700 W auf aktivierten Mulden zu unterschiedlichen Zeitpunkten, wie in der Tabelle angegeben. Kontrolle: 37°C, 70 sec.
ELISA: (Stufe 2–5) traditionelles Verfahren.

Tabelle 2:
Nachweis von E. hystolytica-Antikörpern durch Durchführung der ersten beiden Stufen nach dem MELISA-Verfahren und der restlichen Stufen nach dem ELISA-Verfahren.

MELISA: Stufe 1: Antigenbindung 70 sec, 700 W, Stufe 2: Blockierung, unterschiedliche Zeitdauer, wie in der Tabelle angegeben, 700 W.
ELISA: (Stufe 3–5), traditionelles Verfahren.

Tabelle 3:
Nachweis von E. hystolytica-Antikörpern durch Durchführung der ersten drei Stufen nach dem MELISA-Verfahren und der restlichen Stufen nach dem ELISA-Verfahren.

MELISA: Stufe 1: Antigenbindung 70 sec, 700 W,
Stufe 2: Blockierung, 10 sec, 700 W.
Stufe 3: Antikörper-Bindung, unterschiedliche Zeitdauer, wie in der Tabelle angegeben, 700 W.
ELISA: (Stufe 4 und 5), traditionelles Verfahren.

Tabelle 4:
Nachweis von E. hystolytica-Antikörpern durch Durchführung der ersten drei Stufen nach dem MELISA-Verfahren und der restlichen Stufen nach dem ELISA-Verfahren.

MELISA: Stufe 1: Antigenbindung 70 sec, 700 W,
Stufe 2: Blockierung, 10 sec, 700 W.
Stufe 3: Antikörper-Bindung, unterschiedliche Zeitdauer, wie in der Tabelle angegeben, 155 W.
ELISA: (Stufe 4–5), traditionelles Verfahren.

Tabelle 5:
Nachweis von E. hystolytica-Antikörpern durch Durchführung der ersten vier Stufen nach dem MELISA-Verfahren und der letzten Stufe nach dem traditionellen Verfahren.

MELISA: Stufe 1: Antigenbindung 70 sec, 700 W,
Stufe 2: Blockierung, 10 sec, 700 W.
Stufe 3: Antikörper-Bindung, 100 sec, 155 W.
Stufe 4: Konjugatbindeung, unterschiedliche Zeiten, wie in der Tabelle angegeben, 700 W.
Stufe 5: Farbentwicklung, 5 min bei Raumtemperatur

Tabelle 6:
Nachweis von E. hystolytica-Antikörpern durch Durchführung der ersten vier Stufen nach dem MELISA-Verfahren und der letzten Stufe nach dem traditionellen Verfahren.

MELISA: Stufe 1: Antigenbindung 70 sec, 700 W,
Stufe 2: Blockierung, 10 sec, 700 W.
Stufe 3: Antikörper-Bindung, 100 sec, 155 W.
Stufe 4: Konjugatbindung, unterschiedliche Zeiten, wie in der Tabelle angegeben, 155 W.
Stufe 5: Farbentwicklung, 5 min bei Raumtemperatur

Tabelle 7:
Nachweis von E. hystolytica-Antikörpern: Vergleich des MELISA-Verfahrens mit dem ELISA-Verfahren.

MELISA: Stufe 1: Antigenbindung 70 sec, 700 W,
Stufe 2: Blockierung, 10 sec, 700 W.
Stufe 3: Antikörper-Bindung, 100 sec, 155 W.
Stufe 4: Konjugatbindeung, 100 sec, 155 W.
Stufe 5: Farbentwicklung, 5 min bei Raumtemperatur.
ELISA: Stufe 1, Antigenbindung über Nacht bei 4°C.
Stufe 2: Blockierung, 2 h bei 37°C.
Stufe 3: Antikörperbindung, 2 h bei 37°C.
Stufe 4: Konjugatbindung, 1 h bei 37°C.
Stufe 5: Farbentwicklung, 5 min bei Raumtemperatur.

Tabelle 8
Nachweis von Aspergillus fumigatus-Antikörpern: Vergleich des MELISA-Verfahrens mit dem ELISA-Verfahren. Es werden dieselben Verfahren verwendet wie in Tabelle 7 beschrieben.
Vorrichtung für die Durchführung des MELISA-Verfahrens Die Vorrichtung für die Durchführung des MELISA-Verfahrens kann aus folgenden Bauteilen bestehen:

a) Beschickungskammer: Die Beschickungskammer dient der au tomatischen Beschickung mit den Proben oder Reagenzien aus einer vorgegebenen Flasche über ein dünnes Rohr und eine geeignete Pumpe auf die Platte bzw. den Modul aus aktiviertem Polystyrol.
b) Reaktionskammer: Die Reaktionskammer besteht aus Magnetron, Absauggebläse und einer Lichtfokussierung für die Durchführung der Stufen der Bindung des Antigens, der Blockierung, der Antikörper-Bindung und der Antikörper-Enzym-Konjugat-Bindung durch Mikrowellenbestrahlung und der Enzym-Substrat-Reaktion bei Raumtemperatur in einer vorprogrammierten Zeit wie in Anspruch 1 angegeben;
c) Wasch- und Trockenkammer: In dieser Kammer erfolgt das automatische Waschen und Trocknen der ELISA-Platte bzw. des ELISA-Moduls nach einem vorprogrammierten Befehl nach jeder Stufe des MELISA-Verfahrens;
d) Nachweiskammer: Diese Kammer dient dem kolorimetrischen Nachweis mit Hilfe eines Spektrophotometers;
e) Transportplattform: Diese dient dem Transport der ELISA-Platte bzw. des ELISA-Moduls von einer Kammer zur anderen;
f) Steuerungseinheit: Computer auf Mikroprozessorbasis zur Steuerung des MELISA-Verfahrens nach Anspruch 1 über eine geeignete Hardware und Software.

Vorteile der Erfindung
Die traditionallen ELISA-Verfahren nehmen gewöhnlich mehrere Stunden bis 2 Tagen in Anspruch, was der Hauptnachteil des Verfahrens ist, das weltweit nicht nur in der klinischen Diagnostik sondern auch auf anderen Gebieten verwendet wird.
Auf diese Weise geht in medizinischen Notfällen wertvolle Zeit verloren für die Diagnose, bevor der Patient behandelt werden kann. Ein rasches ELISA-Verfahren, wie es hier erfun den wurde (MELISA) ist vorteilhat und günstig für die Diagnose von Erkrankungen, für medizinische Untersuchungen und auf anderen Gebieten. Die Hauptvorteile des erfindungsgemäßen ELISA-Verfahrens sind:

1. Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich viel rascher durchführen als die bereits bekannten ELISA-Verfahren.
2. Die Gesamtdauer, die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlich ist, beträgt weniger als 10 Minuten. Ein zeitraubendes und umständliches Prozedere wird auf diese Weise umgangen.
3. Das erfindungsgemäße Verfahren ist sehr empfindlich und bedarf nur minimaler Mengen an wertvollem Antigen bzw. Antikörper.
4. Das erfindungsgemäße Verfahren ist sehr genau, da die Enzym-Substrat-Reaktion in Lösung durchgeführt wird und spektrophotometrisch quantifiziert wird.
5. Das Verfahren ist einfach und bedarf keiner zusätzlichen Untersuchung bzw. eines zusätzlichen Reagens.
6. Das erfindungsgemäße Verfahren ist kostengünstig und bedarf keiner zusätzlichen Ausrüstung, abgesehen von einem Mikrowellenherd für Haushaltszwecke, wie er in den meissten Laboratorien heute üblich ist.
7. Das erfindungsgemäße Verfahren ist reproduzierbar, was ein wichtiges Kriterium für das ELISA-Verfahren ist.
8. Das Verfahren bewirkt nur eine minimale bzw. vernachlässigbare unspezifische Bindung.
9. Das Verfahren ist automatisierbar, wodurch menschliche Irrtümer, wie sie gewöhnlich von Person zu Person unter schiedlich auftreten können, auf ein Minimum herabgesetzt werden können.
10. Das erfindungsgemäße Verfahren kommt für viele andere Immunotests in Frage, wie z.B. für den Radioimmuno-, den Radioimmunosorbens-, den Radioallergosorbens-, den Biotin-Avidin/Streptavidin-Immun-Test, Immunblotting, die Immunanfärbung, verschieden Arten von ELISA wie Direkt-ELISA; Indirekt-ELISA, und Sandwich-ELISA usw.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist somit ein rasches, wirtschaftliches, reproduzierbares und einfaches Verfahren, das automatisiert werden kann. Es ist vorteilhaft für den Menschen, da seine Bedeutung für die klinische Diagnostik, die Mikrobiologie, Landwirtschaft, Nahrungsmittelherstellung, Umweltwissenschaft, für die biomedizinischen Forschung und auf anderen verwandten Gebieten zunimmt.
Fachliteratur

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Patentliteratur

Apr. 1989 Boon et al. PCT-Patentanmeldung WO 89/03038

Claims

Schnelles Verfahren für einen durch Mikrowellen vermittelten enzymgebundenen Immunsorbenstest, gekennzeichnet durch die Verwendung eines aktivierten Feststoffträgers, das folgende Stufen umfasst: a) Bereitstellung eines Feststoffträgers, b) Lösen eines Biomoleküls, ausgewählt unter einem Antigen oder einem Antikörper in einem Beschichtungspuffer und Aufbringen des Biomoleküls auf den aktivierten Feststoffträger und Bindung der Biomoleküle an den Feststoffträger durch Bestrahlung mit Mikrowellen bei einer Frequenz im Bereich von 2300 bis 2500 MHz bei einem Leistungsoutput im Bereich von 600 bis 900 Watt während 50 bis 100 Sek. unter nachfolgendem Waschen mit einem Waschpuffer zur Immobilisierung des Biomoleküls, c) Blockierung der freien Stellen des Feststoffträgers durch Aufbringen einer Blockierlösung und Bestrahlung mit Mikrowellen bei einer Frequenz im Bereich von 2300 bis 2500 MHz bei einem Leistungsoutput im Bereich von 600 bis 800 Watt während 5 bis 20 Sek. unter nachfolgendem Waschen mit einem Waschpuffer, d) Lösen des entsprechenden Antikörpers oder Antigens in einem Puffer und Bindung des entsprechenden Antikörpers oder Antigens an das immobilisierte Biomolekül durch Bestrahlung mit Mikrowellen bei einer Frequenz vom 2300 bis 2500 MHz mit einem Leistungsoutput im Bereich von 50 bis 200 Watt während 90 bis 200 Sek. unter nachfolgendem Waschen mit einem Waschpuffer, e) Bindung eines in einem geeigneten Puffer gelösten Enzym-Konjugats an das immobilisierte Biomolekül, das einen entsprechenden Antikörper oder ein Antigen gebunden auf weist, durch Bestrahlung mit Mikrowellen bei einer Frequenz von 2300 bis 2500 MHz mit einem Leistungsaoutput im Bereich von 100 bis 300 Watt während 50 bis 150 Sek. unter nachfolgendem Waschen mit einem Waschpuffer zur Bildung eines Produktes und f) Zugabe eines Substrat-Farbstoff-Puffers zum Produkt vor der Lagerung während 4 bis 10 Minuten in der Dunkelheit unter nachfolgender Zugabe einer Stopplösung vor dem Messen der optischen Dichte des Produktes mit Hilfe eines Spektrophotometers bei geeigneter Wellenlänge.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Feststoffträger ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Polystyrol-, Polypropylen-, Polyethylen-, Glas-, Cellulose-, Nitrocellulose-, Silicagel-, Polyvinylchlorid- und Polyanilinträgern.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der Feststoffträger Polystyrol ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Feststoffträger in Form von Bahnen, Platten, Testteilchen, Proberöhrchen, Probestäbchen, Probestreifen, Vertiefungen, einer ELISA-Platte, Mikrovertiefungsplatte oder eines -moduls vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Feststoffteilchen ausgewählt werden unter Perlen und Mikrokügelchen.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Feststoffträger wenigstens eine aktive funktionelle Gruppe, ausgewählt unter Halogenid, Aldehyd, Acetyl, Epoxid, Succinamid, Isothiocyanat und Acylazid aufweist.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die zumindest allein vorliegende aktive funktionelle Gruppe Teil des Feststoffträgers selbst ist oder durch übliche chemische oder photochemische Verfahren eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Antigen entweder selbst die Immunreaktion auslöst oder das Potential zur Auslösung einer solchen besitzt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Mikrowellenbestrahlung in einer Vorrichtung oder Kammer erfolgt, in der Mikrowellen erzeugt werden und die ausgewählt wird unter einem im Haushalt üblichen Mikrowellenherd, einem speziell konstruierten Mikrowellenherd oder einer beliebigen Vorrichtung oder Kammer, in der Mikrowellen erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Gesamtdauer für die Bindung und Blockierung des Antigens, die Bindung des Antikörpers und die Bindung des Konjugats in einem Bereich von 195 bis 4670 Sek. liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Blockiermittel ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Rinderserumalbumin, Magermilchpulver und Gelatine.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Beschichtungspuffer ausgewählt wird unter Carbonat- und Phosphatpuffern bei einem pH im Bereich von 6,5 bis 11 und einer Molarität im Bereich von 0,005 M bis 0,1 M.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Waschpuffer ein Gemisch aus Phosphatpuffer und Tween 20 ist, wobei der Phosphatpuffer einen pH im Bereich von 6,5 bis 11 und eine Molarität im Bereich von 0,005 bis 0,1 M aufweist, und das Tween 20 in einem Bereich von 0,05 bis 3 % vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Enzymkonjugat ein Enzym aufweist, ausgewählt unter Peroxidase oder Alkaliphosphatase und das Konjugat ausgewählt wird unter einem Biomolekül, das einen Antikörper oder ein Antigen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Verfahren geeignet ist für die Durchführung von Tests, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Radioimmun-, Radioimmunsorbens-, Ratioallergosorbenstest, Biotin-Avidin/Strepavidin-Immuntest, Immunoblotting, Immunanfärbung und anderen Arten von ELISA.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die einzelnen ELISA-Typen ausgewählt werden unter direktem ELISA, indirektem ELISA und Sandwich-ELISA.