ES2256274T3 - Procedimiento para la deteccion cualitativa y/o cuantitativa de interacciones moleculares en matrices de sondas. - Google Patents
Procedimiento para la deteccion cualitativa y/o cuantitativa de interacciones moleculares en matrices de sondas.Info
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Abstract
Procedimiento para la detección cualitativa y/o cuantitativa de dianas de una muestra mediante interacciones moleculares entre sondas y dianas en matrices de sondas, que comprende las siguientes etapas: a) preparación de una matriz de sondas con sondas inmovilizadas en sitios definidos; b) interacción de las dianas con las sondas dispuestas en la matriz de sondas; c) realización de una reacción que conduce a un precipitado en los elementos de matriz en los que ha tenido lugar una interacción; d) detección del transcurso temporal de la formación de precipitado en los elementos de matriz en forma de intensidades de señal; e) determinación de una intensidad de señal virtual para un elemento de matriz mediante una función curva que describe la formación de precipitado en función del tiempo.
Description
Procedimiento para la detección cualitativa y/o
cuantitativa de interacciones moleculares en matrices de sondas.
La invención se refiere a un dispositivo así como
a un procedimiento para la detección cualitativa y/o cuantitativa de
determinadas dianas moleculares con ayuda de matrices de sondas.
Las pruebas biomédicas se basan frecuentemente en
comprobar la interacción entre una molécula que está presente en
cantidad y posición conocida (la sonda molecular) y la molécula que
va a detectarse y/o las moléculas que van a detectarse (la diana
molecular). Las pruebas modernas se realizan generalmente con una
muestra paralelamente en algunas sondas (D. J. Lockhart, E. A.
Winzeler; Genomics, gene expression and DNA arrays; Nature 2000,
405, 827-836). En este sentido, las sondas se
inmovilizan normalmente de modo fijo sobre una matriz adecuada,
descrita por ejemplo en WO 00/12575 (véanse por ejemplo US
5.412.087, WO 98/36827) y/o se producen sintéticamente (véanse por
ejemplo US 5.143.854, US 5.658.734, WO 90/03382).
La detección de una interacción de este tipo
tiene lugar normalmente de la siguiente manera: la sonda y/o las
sondas se fijan de modo fijo a una matriz determinada. Las dianas se
ponen en contacto en una disolución con las sondas y se incuban en
condiciones definidas. Como consecuencia de la incubación tiene
lugar una interacción específica entre la sonda y la diana. El
enlace formado es claramente más estable que el enlace de las
moléculas para las que la sonda es no específica. A continuación se
lava el sistema con disoluciones correspondientes, de modo que se
eliminan las moléculas que no están unidas específicamente.
En la actualidad se utiliza una pluralidad de
procedimientos para detectar la interacción entre la diana y la
sonda, algunos de los cuales se describen a continuación:
E. Lidell e I. Weeks, Antibody Technology, BIOS
Scientific Publishers Limited, 1995, describen el marcaje de una
diana con un colorante y/o un colorante fluorescente y su detección
con ayuda de un fotómetro y/o un detector de fluorescencia. En F.
Lottspeich, H. Zorbas, Bioanalytik, editorial Spektrum Akademischer,
Heidelberg, Berlín, 1998, también se describe la detección óptica
de fluorescencia de dianas provistas de un marcador
fluorescente.
En Nature Biotechnology 1998, 16,
725-727 se describe la detección del complejo de
diana y sonda por espectrometría de masas. Además, se utilizan
procedimientos sensibles de masa, como resonancia de plasmón
superficial (J. M. Brockman y otros, A multistep chemical
modification procedure to create DNA Arrays on Gold surfaces for
the study of Protein-DNA Interactions with surface
plasmon resonance imaging, J. Am. Chem. Soc. 1999, 121,
8044-8051). La patente US 5.605.662 da a conocer un
procedimiento para la detección eléctrica directa de la
interacción. En DE 19543232 se describe el marcaje de la diana con
bolitas de detección, cuya presencia se detecta ópticamente después
de la interacción de la diana con las sondas.
De EP 0 063 810 se conoce un procedimiento en el
que sobre un sustrato poroso sólido se inmovilizan dianas en forma
de antígenos o inmunoglobulinas y se prueban para determinar su
identidad y cantidad mediante aplicación de técnicas conocidas de
la inmunología, especialmente ELISA.
Se han descrito diferentes principios técnicos
para la detección de interacciones moleculares con ayuda de
matrices de sondas sobre superficies sólidas. Los sistemas clásicos
se basan en la comparación de las intensidades de fluorescencia de
moléculas diana excitadas espectralmente de manera selectiva,
marcadas con fluoróforos. Además, se conocen diferentes soluciones
técnicas que se diferencian en cuanto a su estructura óptica y los
componentes usados. Los problemas y las limitaciones de las
superestructuras de este tipo resultan del ruido de las señales (el
ruido de fondo) que se determina esencialmente en la estructura
óptica mediante efectos como decoloración y extinción de los
colorantes usados, autofluorescencia de los medios, elementos de
ensamblaje y componentes ópticos, así como dispersiones, reflexiones
y luz extraña.
De esto resulta un alto gasto técnico para
estructurar detectores de fluorescencia altamente sensibles para la
comparación cualitativa y cuantitativa de matrices de sondas.
Especialmente para la detección con rendimientos medios y altos se
necesitan sistemas de detección especialmente adaptados que posean
un cierto grado de automatización.
Se conocen detectores basados en CCD para la
optimización de superestructuras de epifluorescencia estándar para
la selección de matrices moleculares que realizan la excitación de
fluoróforos en el campo oscuro mediante luz reflejada o luz
transmitida para la discriminación de efectos ópticos como la
dispersión y reflexiones (véase por ejemplo, C. E. Hooper y otros,
"Quantitative Photon Imaging in the Life Sciences Using
Intensified CCD Cameras", Journal of Bioluminescence and
Chemiluminescence (1990), 337-344.). En este
sentido, la proyección de los ensayos tiene lugar o bien en una
exposición o mediante una retícula con uso de sistemas ópticos de
resolución más alta. El uso de fuentes de exposición
multiespectrales hace posible un acceso relativamente sencillo a
los diferentes fluoróforos mediante el uso de diferentes
(combinaciones de) filtros de excitación. No obstante, es
desventajoso que la autofluorescencia y los efectos ópticos
condicionados por el sistema, como la homogeneidad de iluminación,
requieran sistemas ópticos de iluminación y sistemas de filtros
complicados en el ensayo.
Por ejemplo, los sistemas de barrido colifocales
descritos en US 5.304.810 se basan en la selección de señales de
fluorescencia a lo largo del eje óptico por medio de dos aberturas.
De esto resulta un alto coste de ajuste de las muestras y/o el
establecimiento de un potente sistema de enfoque automático. Los
sistemas de este tipo son altamente complejos en solución técnica.
Los componentes necesarios, como láser, aberturas, dado el caso
detectores refrigerados, como por ejemplo PMT, diodos de avalancha o
CCD, elementos de traducción y sistemas ópticos mecánicos
complejos, de alta precisión, deben optimizarse e integrarse entre
sí con un gasto considerable (véanse, por ejemplo US 5.459.325; US
5.192.980; US 5.834.758). El grado de miniaturización y el precio
está limitado por la pluralidad y funcionalidad de los
componentes.
Por tanto, en el momento actual, los análisis que
se basan en matrices de sondas se leen generalmente mediante óptica
de fluorescencia (véase A. Marshall y J. Hodgson, DNA Chips: An
array of possibilities, Nature Biotechnology, 16, 1998,
27-31; G. Ramsay, DNA Chips: State of the Art,
Nature Biotechnology, 16 de enero de 1988, 40-44).
Sin embargo, en el procedimiento de detección anteriormente descrito
es desventajoso el alto ruido de fondo de la señal que conduce a
una exactitud limitada, el gasto técnico parcialmente considerable,
así como los altos costes que están unidos con los procedimientos de
detección.
Por tanto, existe la necesidad de matrices
altamente integradas con las que pueda detectarse cualitativa y/o
cuantitativamente con alta exactitud las interacciones entre las
sondas y las dianas, con gasto técnico relativamente bajo.
El aumento de la selectividad y el acceso a
componentes alternativos motiva el establecimiento de tecnologías
de obtención de imágenes alternativas, como la polarización de
fluorescencia y la fluorescencia resuelta en el tiempo para ensayos
unidos a sólidos. Sin embargo, en la actualidad las soluciones de
este tipo sólo existen conceptualmente, especialmente para matrices
altamente integradas. El efecto de torsión del eje de polarización
mediante fluoróforos polarizadamente excitados se aplica para la
cuantificación en tamaño de microtítulos. Además, hay mezclas
básicas para estructurar sistemas rentables con alto rendimiento
(sistemas HTS) mediante el uso de láminas poliméricas
correspondientemente modificadas como filtros de polarización
(véase I. Gryczcynski y otros, Polarisation sensing with visual
detection'', Anal. Chem. 1999, 71, 1241-1251). No
obstante, las cantidades de luz y los detectores que están a
disposición en la actualidad dificultan una conversión en
micromatrices. Una estructura de este tipo requeriría la integración
de fuentes de luz (por ejemplo láser, LED, lámparas de alta
presión), filtros de polarización (entre otros, láminas poliméricas
recubiertas) y detectores (cámara de CCD, CMOS), hasta la fecha no
se conoce una solución correspondiente.
Los desarrollos más recientes utilizan la
fluorescencia de materiales inorgánicos, como por ejemplo de
lantánidos (M. Kwiatowski y otros, Solid-phase
synthesis of chelate-labelled oligonucleotides:
application in triple-color
ligase-mediated gene analysis, Nucleic Acids
Research, 1994, 22, 13) y puntos cuánticos (M. P. Bruchez y otros,
Semiconductor Nanocrystals as Fluorescent Biological Labels, Science
1998, 281, 2013). El aprovechamiento de los tiempos de vida de
fluorescencia específicos de fluoróforos en el intervalo de ns para
su cuantificación selectiva es muy costoso y, a pesar de la
especificidad, no se usa comercialmente en esta aplicación
localmente resuelta. Los colorantes con larga duración de emisión en
el intervalo de \mus, como los gelatos de lantánidos, requieren
una transformación de los colorantes en una fase móvil de modo que
no sea posible una detección localmente resuelta.
El uso de micropartículas, que se conocen de su
uso en tubos de imagen (véase F. van de Rijke y otros,
Up-Converting Phosphors: A New Reporter Technology
for Nucleic Acid Microarrays, European EC Meeting on Cytogenetics
(2000), Bari, Italia), como marcadores biológicos tiene un gran
potencial respecto a la sensibilidad y a la capacidad de
miniaturización de la estructura de la técnica de detección, sobre
todo se usan fuentes de luz de excitación de la transmisión de
datos (láser de diodo de 980 nm). Sin embargo, esta tecnología no
está disponible comercialmente en la actualidad para la detección
de interacciones diana/sondas en matrices. Un detector contendría
componentes para la emisión de luz (por ejemplo láser, LED, lámparas
de alta presión), un sistema para modular la luz de excitación y
detección (por ejemplo discos recortadores, dispositivos de
seguridad electrónicos) y detección de la señal retrasada en el
tiempo (por ejemplo cámara CCD, CMOS). Sin embargo, generalmente
demuestra ser fundamentalmente problemática la baja compatibilidad
de las partículas con muestras biológicas.
A diferencia de la utilización de matrices de
sondas, la utilización de matrices con dianas inmovilizadas sobre
un sustrato poroso tiene la desventaja fundamental de que en cada
análisis que va a tener lugar debe producirse al principio una
matriz con el material que va a investigarse, ya que luego se une
con un conjunto de sondas conocidas. Por tanto, la utilización
diagnóstica está fuertemente limitada ya que las matrices deben
prepararse nuevas frecuentemente. Debido a que el material tiene
generalmente origen biológico, las diferencias entre cargas son
inevitables. La utilización de sustratos porosos limita la
resolución máxima alcanzable de las matrices producidas ya que el
líquido aplicado puede extenderse lateralmente, entonces con la
técnica de deposición actualmente conocida apenas pueden realizarse
tamaños de elementos individuales sobre materiales porosos por
debajo de 200 \mum.
Por tanto, el objetivo de la presente invención
es superar los problemas anteriormente mencionados del estado de la
técnica que surgen especialmente por la compleja estructura del
sistema de detección, el alto ruido de fondo de la señal, entre
otros, por la decoloración de la señal y la escasa compatibilidad
del ensayo con el sistema de prueba.
Especialmente es un objetivo de la presente
invención poner a disposición un procedimiento y/o un dispositivo
con el que puedan detectarse cualitativa y/o cuantitativamente
interacciones moleculares entre sondas y dianas en matrices de
sondas con alta exactitud y de manera sencilla y rentable.
\newpage
Otro objetivo de la presente invención es que se
alcance una alta resolución dinámica en la detección, es decir, que
además de señales intensas se asegure la detección de interacciones
sondas/diana débiles.
Estos y otros objetivos de la presente invención
se alcanzan proporcionando las formas de realización caracterizadas
en las reivindicaciones.
De manera sorprendente se ha encontrado ahora que
las interacciones moleculares entre las moléculas de sonda (en lo
sucesivo denominadas sondas) y las moléculas diana (en lo sucesivo
denominadas dianas) pueden detectarse en matrices de sondas con
alta exactitud mediante un procedimiento sencillo y rentable. La
detección tiene lugar en el procedimiento según la invención
mediante una reacción que produce un producto con un determinado
producto de solubilidad que tiene como consecuencia una
precipitación y/o una formación de precipitado del producto sobre
un elemento de matriz de la matriz de sondas en el que ha tenido
lugar una interacción entre la sonda y la diana.
Las dianas unidas están provistas preferiblemente
con un marcaje que cataliza la reacción de un sustrato soluble para
dar un precipitado difícilmente soluble en el elemento de matriz en
el que ha tenido lugar una interacción sondas/diana, y/o el marcaje
actúa como germen de cristalización para la transformación de un
sustrato soluble para dar un precipitado difícilmente soluble en el
elemento de matriz en el que ha tenido lugar una interacción
sondas/diana.
La utilización de matrices de sondas sobre
soportes no porosos permite de esta manera el análisis cualitativo
y cuantitativo simultáneo de una pluralidad de interacciones
sondas/diana, en los que pueden realizarse elementos de sondas
individuales con un tamaño de \leq 1000 \mum, preferiblemente de
\leq 100 \mum y con especial preferencia \leq 50 \mum.
En la inmunocitoquímica y en las pruebas basadas
en placas de microtitulación inmunológicas se conoce la utilización
de marcajes enzimáticos (véase E. Lidell e I. Weeks, Antibody
Technology, BIOS Scientific Publishers Limited, 1995). Así, las
enzimas catalizan por ejemplo la conversión de un sustrato en un
producto difícilmente soluble, por norma general coloreado. Otra
posibilidad de la detección de interacciones moleculares en matrices
consiste en la utilización de marcajes metálicos. En este sentido
se acoplan oro coloidal o clústeres de oro definidos con las
dianas, dado el caso mediante determinadas moléculas mediadoras como
estreptavidina, y se intensifica mediante posterior reacción con
metales comunes como por ejemplo plata.
La cuantificación relativa de la concentración de
las dianas unidas en una matriz de sondas mediante detección de un
precipitado y/o un sedimento tiene lugar en el procedimiento según
la invención mediante la concentración de los marcajes acoplados
con las dianas, que catalizan la reacción de un sustrato soluble
para dar un precipitado difícilmente soluble en el elemento de
matriz en el que ha tenido lugar una interacción sondas/diana, y/o
actúan como germen de cristalización para reacciones de este tipo.
Por ejemplo, en el caso de sondas de oligonucleótidos purificadas
por HPLC marcadas con Nanogold, la relación de diana unida con
respecto a partículas de oro asciende a 1:1. En otras formas de
realización de la presente invención puede ascender a múltiplos o
también a una fracción de la misma.
La concentración de los marcajes acoplados con
las dianas (c(M)) está relacionado de la siguiente manera
con la concentración de precipitado depositado (c(N)) en el
elemento de matriz:
c(M) = [F*c(N)]/t; en la que F es
una función curva que caracteriza el transcurso temporal de la
reacción de precipitación y t es el tiempo.
F puede determinarse a partir del transcurso
temporal de la reacción. Si el transcurso temporal de la formación
de precipitado puede describirse como función lineal (F =
constante), es posible una clara correlación de la cantidad de
precipitado formado con la concentración de moléculas diana unidas,
ya que entonces c(N)/t es una medida de c(M) y por lo
tanto también de la concentración de las dianas acopladas con los
marcajes. En consecuencia, sólo en el caso del conocimiento del
transcurso temporal de la reacción de precipitación es claramente
posible una determinación relativa de las concentraciones de diana
unidas a los elementos de matriz correspondientes.
Habitualmente, se toma una imagen después de un
tiempo determinado después de la interacción de las dianas con la
sonda dispuesta en la matriz de sonda, así como después del comienzo
de la reacción que conduce a un precipitado en los elementos de
matriz en los que ha tenido lugar una interacción, y a las
concentraciones medidas se asocian valores acromáticos en función
del grado de formación de precipitado. No obstante, este modo de
proceder conduce a valores satisfactorios para el elemento de matriz
correspondiente sólo en un intervalo de concentración muy estrecho,
y por tanto también es muy problemático para la interpretación de la
especificidad de interacciones, ya que la formación de precipitado
tiene lugar en gran medida de manera no lineal. El transcurso
temporal de la formación de precipitado comprende especialmente un
crecimiento exponencial de la formación de precipitado con el
tiempo, así como un nivel de saturación subsiguiente. Sólo los
valores acromáticos del intervalo de crecimiento exponencial de la
formación de precipitado con el tiempo permiten una correlación con
la cantidad de dianas unidas, mientras que el nivel de saturación
alcanzado en la formación de precipitado en un elemento de matriz
después de un determinado tiempo, dependiente de la interacción
sondas/diana respectiva y, por tanto, distinto para cada elemento
de matriz, impide una cuantificación después de la finalización de
la reacción de formación de precipitado. No es posible configurar
los parámetros experimentales de modo que se asegure indudablemente
que el nivel de saturación no se ha alcanzado en ninguno de los
elementos de matriz, ya que la velocidad de reacción depende en
gran medida de la temperatura, la luz, la concentración de sales,
pH y otros factores.
En consecuencia, en el caso de sólo tomarse una
imagen no puede garantizarse que las reacciones de formación de
precipitados en todos los elementos de matriz se encuentren en el
intervalo exponencial de dependencia de la formación de precipitado
con el tiempo. Por tanto, se representan falseadas intensidades de
señal, por ejemplo valores acromáticos, que se obtienen de
elementos de matriz en los que la reacción de precipitación ya se
encuentra en el intervalo de saturación, en comparación con
intensidades de señal de elementos de matriz que todavía se
encuentran en el intervalo exponencial de la formación de
precipitado.
Para superar las desventajas anteriormente
descritas, mediante la presente invención se proporciona un
procedimiento para la detección cualitativa y/o cuantitativa de
dianas en una muestra mediante interacciones moleculares entre
sondas y dianas en matrices de sondas que comprende las siguientes
etapas:
- a)
- preparación de una matriz de sondas con sondas inmovilizadas en sitios definidos;
- b)
- interacción de las dianas con las sondas dispuestas en la matriz de sondas;
- c)
- realización de una reacción que conduce a un precipitado en los elementos de matriz en los que ha tenido lugar una interacción;
- d)
- detección del transcurso temporal de la formación de precipitado en los elementos de matriz en forma de intensidades de señal;
- e)
- determinación de una intensidad de señal virtual para un elemento de matriz mediante una función curva que describe la formación de precipitado en función del tiempo.
Para describir la presente invención se usan las
siguientes definiciones:
En el marco de la presente invención, por una
sonda molecular se entiende una molécula que se usa para detectar
otras moléculas mediante un comportamiento de enlace determinado,
característico, y/o una reactividad determinada.
En el marco de la presente invención, por matriz
de sondas se entiende una disposición de sondas moleculares sobre
una superficie en la que la posición de una sonda cualquiera se
determina por separado.
En el marco de la presente invención, por
elemento de matriz se entiende un área determinada para la
deposición de una sonda molecular en una superficie, la suma de
todos los elementos de matriz ocupados es la matriz de sondas.
En el marco de la presente invención, por una
placa de microtitulación se entiende una disposición de recipientes
de reacción en una determinada rejilla que permite la realización
automatizada de una pluralidad de pruebas biológicas, químicas y
médicas de laboratorio.
En el marco de la presente invención, por una
diana se entiende la molécula que va a detectarse con una sonda
molecular.
En el marco de la presente invención, por HTS
(inglés: high throughput screening) se entiende una búsqueda de
sustancias activas sistemática con alto rendimiento.
En el marco de la presente invención, por un
sustrato se entiende una molécula presente de manera disuelta en el
medio de reacción y/o una combinación de moléculas que se depositan
localmente con ayuda de un catalizador y/o un germen de
cristalización y un agente reductor.
En el marco de la presente invención, por un
soporte se entiende un sólido sobre el que está estructurado la
matriz de sondas.
En el marco de la presente invención, por un
marcaje se entiende un grupo acoplado con la diana que cataliza la
reacción de un sustrato soluble para dar un precipitado difícilmente
soluble y/o actúa como germen de cristalización para la
transformación de un sustrato soluble en un precipitado difícilmente
soluble.
En el marco de la presente invención, por una
intensidad de señal virtual se entiende un valor que cuantifica la
interacción entre la sonda y la diana en un elemento de matriz y con
ello la cantidad de dianas unidas y se determina mediante una
función curva que describe la formación de precipitado en función
del tiempo.
Una característica esencial del procedimiento
según la invención es la determinación de una intensidad de señal
virtual para un elemento de matriz en función del transcurso
temporal de la formación de precipitado. La formación de
precipitado en función del tiempo en un elemento de matriz se
describe según la invención preferiblemente mediante una función
curva, mediante la cual se determina una intensidad de señal
virtual. Esta intensidad de señal virtual es una medida auténtica
de la cantidad de dianas unidas debido a la consideración del
transcurso temporal de la formación de precipitado.
Según la invención, como recta de regresión
pueden describirse especialmente los intervalos parciales o también
el intervalo en total del transcurso temporal de la formación de
precipitado. La intensidad de señal virtual se determina en esta
forma de realización en función de la pendiente de la recta de
regresión. Esta pendiente es una medida directa de la concentración
de dianas unidas, es decir, cuanto mayor sea la pendiente de la
recta de regresión, más dianas están unidas. Si se consideran todos
los elementos de matriz en las mismas condiciones, el crecimiento
de la formación de precipitado resultante con el tiempo en cada
elemento de matriz individual es característico para la
concentración y para el experimento respectivo normalizado a las
condiciones previamente reinantes. Por tanto, se garantiza una
determinación exacta de la cantidad relativa cuantitativa de dianas
unidas.
En una forma de realización especialmente
preferida de la presente invención, la recta de regresión se
calcula en un elemento de matriz en el intervalo de crecimiento
exponencial de la formación de precipitado con el tiempo.
En una forma de realización de la presente
invención, la recta de regresión corresponde a una tangente de la
función curva con la que puede describirse la formación de
precipitado en función del tiempo por el punto de inflexión de la
función curva. El punto de inflexión de la función curva se calcula
mediante la determinación del máximo de la primera derivada de la
función curva.
En una forma de realización alternativa de la
presente invención, la recta de regresión se calcula uniendo con
una recta los vértices de la función curva con la que puede
describirse la formación de precipitado en función del tiempo. Los
vértices de la función curva se calculan mediante la determinación
de los máximos de la segunda derivada de la función curva.
Además, mediante la determinación de una
intensidad de señal virtual para cada elemento de matriz en función
del transcurso temporal de la formación de precipitado y
transformación posterior de estas intensidades de señal virtuales
en una imagen analógica puede multiplicarse el intervalo de medición
dinámico, es decir, el contorno del intervalo de detección. Una
ampliación de la dinámica de la medición hace posible que no vuelva
a aparecer la intensidad de color del sistema detector como elemento
que va a determinarse, sino el transcurso de la adición de
precipitado medido con el tiempo en la superficie del elemento de
matriz de sondas respectivo. Mediante la interpretación del
crecimiento de la reacción de precipitación es posible determinar
una distribución de intensidad de señal virtual y/o de valores
acromáticos, y finalmente alcanzar con esto una dinámica
ampliada.
El procedimiento según la invención ofrece la
ventaja adicional de que puedan utilizarse sistemas de detección
que no son costosos y, adicionalmente, baratos. Por ejemplo, puede
usarse una cámara con sólo 8 bits de intensidad de color
acromático, es decir, 256 valores acromáticos, que después de la
interpretación y elaboración de una figura virtual produce una
profundidad de campo real de 24 bits (16777216 valores acromáticos)
o 48 bits (33554432 valores acromáticos) y con ello ofrece una
posibilidad claramente mejorada de la detección simultánea de
interacciones pequeñas e intensas de dianas con sondas en una matriz
de sondas.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, en la muestra que va a investigarse está
presente una diana de referencia con concentración conocida que
interacciona con al menos una sonda de la matriz de sondas. La
intensidad de señal virtual correspondiente a esta interacción
sondas/diana de referencia, determinada en función del crecimiento
de la formación de precipitado en función del tiempo, sirve como
referencia para la cuantificación de las restantes concentraciones
de diana correspondientes a las intensidades de señal virtuales
respectivas que se provocan por las interacciones sondas/diana, con
respecto a la concentración de la concentración de diana de
referencia.
Las dianas que van a investigarse pueden estar
presentes en cualquier tipo de muestra, preferiblemente en una
muestra biológica. Preferiblemente, las dianas se aíslan, purifican,
copian y/o amplifican antes de su detección y cuantificación
mediante el procedimiento según la invención.
La matriz de sondas utilizada en el marco de la
presente invención con sondas inmovilizadas en sitios definidos se
prepara según procedimientos tradicionalmente conocidos. Una matriz
de sondas según la presente invención comprende un soporte que
permite la formación de matrices con sondas en su superficie. Un
soporte de este tipo puede prepararse a partir de materiales
seleccionados del grupo que está compuesto por vidrio, filtros,
dispositivos electrónicos, polímeros, materiales metálicos y
similares, así como combinaciones de estos materiales.
La matriz comprende preferiblemente sitios
definidos, denominados elementos de matriz, que están dispuestos
con especial preferencia en un modelo determinado, conteniendo
normalmente cada elemento de matriz sólo una variedad de
sondas.
En otra forma de realización preferida de la
presente invención, para la detección del transcurso temporal de la
formación de precipitado en los elementos de matriz se registran las
intensidades de señal al menos cada minuto, preferiblemente cada 30
segundos, con especial preferencia cada 10 segundos. Además,
también son posibles otros intervalos de tiempo para la toma de
intensidades de señal, con la condición de que la dependencia
temporal de la formación de precipitado pueda determinarse
claramente y con ello pueda derivarse, por ejemplo la pendiente de
la recta de regresión en el intervalo exponencial como medida de la
concentración respectiva de dianas unidas.
La intensidad de señal virtual para un elemento
de matriz se determina por ejemplo mediante multiplicación de la
intensidad de señal detectada respecto a un instante de tiempo
determinado, preferiblemente la intensidad de señal de la última
medición, con la pendiente de la recta de regresión calculada para
el elemento de matriz, así como con la duración de medición
respecto al instante de tiempo determinado. Evidentemente, en esta
forma de realización también es necesaria para una cuantificación
relativa que el instante de tiempo para la detección de la
intensidad de señal sea idéntico para todos los elementos de
matriz.
Requisito para una cuantificación relativa de la
concentración de dianas unidas a una matriz de sondas mediante
detección de un precipitado según el procedimiento de la invención
es además que las dianas estén provistas con marcajes que catalicen
la reacción de un sustrato soluble para dar un precipitado
difícilmente soluble en el elemento de matriz en el que ha tenido
lugar una interacción sondas/diana, y/o actúa como germen de
cristalización para reacciones de este tipo.
En este sentido, en una forma de realización de
la presente invención las dianas pueden estar provistas
directamente con marcajes de este tipo.
Alternativamente se renuncia a un marcaje directo
de las dianas y el marcaje tiene lugar mediante hibridación
sándwich o reacciones sándwich con la sonda que va a interaccionar
con la diana y un compuesto marcado. Ejemplos de una manera de
proceder de este tipo son:
- -
- Hibridación sándwich con un oligonucleótido marcado complementario a una secuencia diana.
- -
- Hibridación sándwich de oligonucleótidos marcados en forma de cadena que van a hibridarse con la secuencia diana: en el marco de la presente invención, por oligonucleótidos marcados en forma de cadena que van a hibridarse con la secuencia diana se entiende un conjunto de oligonucleótidos marcados de los que al menos uno presenta complementariedad tanto a la secuencia diana como también a otro oligonucleótido. Los otros oligonucleótidos son autocomplementarios y/o recíprocamente complementarios entre sí, de modo que durante la hibridación se forma una cadena de oligonucleótidos marcados unidos a la secuencia diana.
- -
- Hibridación sándwich con un oligonucleótido complementario a la secuencia diana que está acoplado con una estructura marcada reiteradamente, por ejemplo un dendrímero, descrito por ejemplo en el documento WO 99/10362.
La adición sintética o enzimática de una zona
homopolimérica, por ejemplo una secuencia poli A, a las dianas con
formación de una secuencia continua, como se describe por ejemplo en
el documento US 6.103.474, representa otra posibilidad preferida de
acoplamiento de dianas con un marcaje. En esta forma de realización
tiene lugar el marcaje preferiblemente mediante hibridación sándwich
con un oligonucleótido marcado complementario a la secuencia
homopolimérica con las variaciones descritas anteriormente.
En otra forma de realización preferida de la
presente invención tiene lugar una amplificación de señal mediante
amplificación de partes de la secuencia homopolimérica añadidas a
las dianas a incorporación simultánea de bases marcadas, con
especial preferencia mediante un mecanismo RCA mediante uso de un
molde de hebra sencilla circular que presenta complementariedad a
la secuencia homopolimérica.
La siguiente tabla 1 muestra, sin pretender que
sea completa, una visión general de una serie de reacciones
consideradas que son adecuadas para llegar a un precipitado en
elementos de matriz en los que ha tenido lugar una interacción entre
la diana y la sonda:
| Catalizador o germen de cristalización | Sustrato |
| Peroxidasa de rábano | DAB (3,3'-diaminobenzidina) |
| 4-CN (4-cloro-1-naftol) | |
| AEC (3-amino-9-etilcarbazol) | |
| HYR (p-fenilendiamina-HCl y pirocatecol) | |
| TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) | |
| Naftol/pironina | |
| Fosfatasa alcalina | Fosfato de bromocloroindoílo (BCIP) |
| y azul de nitrotetrazolio (NBT) | |
| Glucosa oxidasa | t-NBT y m-PMS |
| (cloruro de azul de nitrotetrazolio | |
| y metosulfato de fenazina) | |
| Partículas de oro | Nitrato de plata |
| Tartrato de plata |
Se ha descrito suficientemente el marcaje de
muestras biológicas con enzimas y/u oro, especialmente oro
nanocristalino (véase, entre otros, F. Lottspeich y H. Zorbas,
Bioanalytik, editorial Spektrum Akademischer, Heidelberg, Berlín,
1998; E. Lidell e I. Weeks, Antibody Technology, BIOS Scientific
Publishers Limited, 1995).
Otras posibilidades para la detección de las
interacciones sonda/diana mediante precipitados insolubles en el
procedimiento según la invención se describen en:
Immunogold-Silver Staining, Principles, Methods and
Applications, Hrsg.: M.A.Hayat, 1995, CRC Press; Eur J Immunogenet
1991
Feb-Apr;18(1-2):33-55
HLA-DR, DQ and DP typing using PCR amplification
and immobilized probes. Erlich H, Bugawan T, Begovich AB, Scharf S,
Griffith R, Saiki R, Higuchi R, Walsh PS. Departament of Human
Genetics, Cetus Corp., Emeryville, California 94608; Mol Cell
Probes 1993 Jun;7(3):199-207 A combined
modified reverse dot-blot and nested PCR assay for
the specific non-radioactive detection of Listeria
monocytogenes. Bsat N, Batt CA Departament of Food Science, Cornell
University, Ithaca, NY 14853. Immunogenetics
1990;32(4):231-41 errata en: Immunogenetics
1991;34(6):413 Rapid HLA-DPB typing using
enzymatically amplified DNA and nonradioactive
sequence-specific oligonucleotide probes. Bugawan
TL, Begovich AB, Erlich HA. Departament of Human Genetics, Cetus
Corporation, Emeryville, CA 94608. Hum Immunol 1992 Dec;
35(4):215-22 Generic HLA-DRB1
gene oligotyping by a nonradioactive reverse
dot-blot methodology. Eliaou JF, Palmade F, Avinens
O, Edouard E, Ballaguer P, Nicolas JC, Clot J. Laboratory of
Immunology, Saint Eloi Hospital, CHU Montpellier, Francia. J
Immunol Methods 1984 Nov 30;74(2):353-60
Sensitive visualization of antigen-antibody
reactions in dot and blot immune overlay assays with immunogold and
immunogold/silver staining. Moeremans M, Daneels G, Van Dijck A,
Langanger G, De Mey J. Histochemistry
1987;86(6):609-15
Non-radioactive in situ hybridization. A comparison
of several immunocytochemical detection systems using
reflection-contrast and electron microscopy.
Cremers AF, Jansen in de Wal N, Wiegant J, Dirks RW, Weisbeek P, van
der Ploeg M,
Landegent JE.
Landegent JE.
En el marco de la presente invención son
posibles, entre otras, las siguientes variantes para la detección
de las interacciones sonda/diana mediante precipitados
insolubles.
En una forma de realización de la presente
invención, las dianas se proveen con un catalizador sobre una
enzima que cataliza la transformación de un sustrato soluble en un
producto insoluble. En este caso, la reacción que conduce a la
formación de un precipitado en los elementos de matriz es la
transformación de un sustrato soluble en un producto insoluble en
presencia de un catalizador acoplado con las dianas, preferiblemente
una enzima. La enzima se selecciona preferiblemente del grupo
compuesto por peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y glucosa
oxidasa. El sustrato soluble se selecciona preferiblemente del grupo
compuesto por 3,3'-diaminobenzidina,
4-cloro-1-naftol,
3-amino-9-etilcarbazol,
p-fenilendiamina-HCl/pirocatecol,
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, naftol/pironina,
fosfato de bromocloroindoílo, azul de nitrotetrazolio y metosulfato
de fenazina. Por ejemplo, un donante de hidrógeno soluble,
incoloro, por ejemplo 3,3'-diaminobenzidina, se
transforma en presencia de peróxido de hidrógeno en un producto
coloreado insoluble. La enzima peroxidasa de rábano transfiere iones
hidrógeno de los donantes al peróxido de hidrógeno con formación de
agua.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, la reacción que conduce a la formación de un
precipitado en los elementos de matriz es la formación de un
precipitado metálico. Con especial preferencia, la reacción que
conduce a la formación de un precipitado en los elementos de matriz
es la reducción química de un compuesto de plata, preferiblemente
nitrato de plata, lactato de plata, acetato de plata o tartrato de
plata para dar plata elemental. Como agente reductor se utiliza
preferiblemente formaldehído y/o hidroquinona.
La precipitación del compuesto metálico tiene
lugar con especial preferencia en presencia de clústeres metálicos
y/o partículas metálicas coloidales acoplados con las dianas,
especialmente clústeres de oro o partículas de oro coloidal. Es
decir, los clústeres metálicos y/o las partículas metálicas
coloidales representan en este caso los marcajes acoplados con las
dianas. Por ejemplo, se convierte nitrato de plata en plata
elemental añadiéndose iones plata de la disolución de oro como
germen de cristalización y en una segunda etapa se reducen con
ayuda de un agente reductor, como por ejemplo formaldehído. En este
sentido se forma un precipitado insoluble de plata elemental.
En una forma de realización alternativa tiene
lugar la precipitación del compuesto metálico en presencia de
polianiones acoplados con las dianas. Si en el caso de la propia
diana no se trata de un polianión, entonces existe la posibilidad
se utilizar uno de este tipo para la formación del germen. La diana
marcada con un polianión se suspende, por ejemplo en una disolución
de nitrato de plata. En este sentido, los cationes de plata se
adsorben selectivamente al polianión. Después se transforman los
iones de plata en plata elemental con un agente reductor.
El acoplamiento de las enzimas y/o catalizadores
y/o clústeres metálicos y/o partículas metálicas coloidales y/o
polianiones a las dianas puede tener lugar directamente o mediante
moléculas de anclaje acopladas a las dianas. Básicamente no existe
la necesidad de proveer la diana directamente con los marcajes
anteriormente descritos. También existe la posibilidad de conseguir
un acoplamiento posterior del marcaje mediante moléculas de anclaje
adecuadas que se acoplan a la diana, por ejemplo estreptavidina.
Un conjugado compuesto por el catalizador
respectivo y/o el germen de cristalización y un ligando específico
para la molécula de anclaje también permite la realización de los
procedimientos anteriormente descritos. Entonces, la reacción que
conduce a la formación de un precipitado en los elementos de matriz
representa el enlace de un ligando específico a una molécula de
anclaje acoplada a la diana.
Los pares ligando/molécula de anclaje de este
tipo se seleccionan preferiblemente del grupo compuesto por
biotina/avidina y/o estreptavidina y/o anticuerpo
anti-biotina, digoxigenina/inmunoglobulina
anti-digoxigenina, FITC/
inmunoglobulina anti-FITC y DNP/inmunoglobulina anti-DNP.
inmunoglobulina anti-FITC y DNP/inmunoglobulina anti-DNP.
En cada una de las formas de realización
anteriormente descritas se convierte catalíticamente un sustrato
soluble en un producto precipitado e insoluble. Debido a la
proximidad a la superficie, el producto se deposita inmediatamente
en la superficie y forma un precipitado sólido, insensible a
diversos lavados.
Además, en el marco de la presente invención es
posible que los marcajes, especialmente las enzimas y/o los
clústeres metálicos y/o las partículas metálicas coloidales y/o los
polianiones, se acoplen a las dianas antes, durante o después de la
interacción con las sondas.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, la interacción entre la diana y la sonda es una
hibridación entre dos secuencias de nucleótidos. La hibridación de
las dianas con las sondas dispuestas en una matriz de sondas tiene
lugar según un protocolo estándar conocido (véase, entre otros,
Lottspeich y Zorbas, 1998). Los híbridos formados pueden
estabilizarse mediante enlace covalente, por ejemplo mediante
intercalación de Psoralen y posterior "reticulación" o como se
describe en el documento US 4.599.303, mediante enlace no
covalente, por ejemplo mediante enlace de intercaladores.
A continuación de la hibridación de las dianas
con las sondas dispuestas en una matriz de sondas y/o el marcaje de
las dianas hibridadas tiene lugar normalmente una etapa de lavado
con la que se eliminan componentes unidos de manera no específica
y, por tanto, más débiles.
Alternativamente, la interacción entre la diana y
la sonda es una reacción entre una estructura antigénica y el
anticuerpo correspondiente o una región hipervariable del mismo o es
una reacción entre un receptor y un ligando correspondiente.
El enlace o reconocimiento de las dianas mediante
sondas específicas es normalmente una reacción no covalente
espontánea en condiciones óptimas. En estos también están
comprendidos enlaces químicos no covalentes. La composición del
medio, así como otros factores químicos y físicos, influyen la
velocidad y la intensidad del enlace. Así por ejemplo, en el caso
del reconocimiento de ácidos nucleicos, una astringencia más baja y
temperaturas más altas disminuyen la velocidad y la intensidad del
enlace entre dos hebras no perfectamente complementarias. La
optimización de las condiciones de enlace también es necesaria para
las interacciones antígeno/anticuerpo o ligando/receptor, pero
normalmente las condiciones de enlace son menos específicas.
En una forma de realización de la presente
invención, la detección de la presencia de un precipitado en un
elemento de matriz tiene lugar mediante reflexión, absorción o
difusión de un rayo de luz, preferiblemente de un rayo láser o de
un diodo emisor de luz, por el precipitado. Debido a su forma
granular, el precipitado modifica la reflexión de un rayo de luz.
Además, el precipitado conduce a una difusión de la luz más intensa
de la que puede registrarse mediante dispositivos de detección
habituales. Si el precipitado, como por ejemplo el precipitado de
plata, aparece como superficie oscura, también puede detectarse y
registrarse la absorción de luz. Entonces, la resolución de la
detección depende del número de píxeles de la cámara.
Por ejemplo, la detección de las zonas
intensificadas por la reacción específica puede tener lugar
mediante una estructura óptica muy sencilla en la luz transmitida
(contraste por oscurecimiento de los ángulos) y/o luz reflejada
(contraste por reflexión). La intensidad detectada de la zona
oscurecida en los ángulos es directamente proporcional a la
densidad de ocupación con marcajes, como por ejemplo partículas de
oro, y al estado de formación de gérmenes de la partícula.
En caso de uso de un precipitado que es
eléctricamente conductor o su constante dieléctrica se diferencie
del entorno, también es posible eléctricamente la detección de la
reacción en una forma de realización alternativa de la presente
invención.
Las mediciones eléctricas pueden tener lugar
mediante mediciones de conductividad por medio de disposiciones de
matrices de microelectrodos o mediante una disposición de sensores
de microcapacidad o mediante mediciones de potencial por medio de
matrices de transistores de efecto campo (matrices de FET). En el
caso de las mediciones de conductividad, por medio de
microelectrodos se sigue el cambio de la resistencia eléctrica entre
dos electrodos en una reacción de deposición (E. Braun, Y. Eichen,
U. Sivan, G. Ben-Yoseph, Nature, 775, vol. 391,
1998). En el caso de mediciones dieléctricas con sensores de
microcapacidad se mide el cambio de la capacidad de dos electrodos
dispuestos juntos (M. Madou, Fundamentals of Microfabrication, CRC
Press, Boca Raton, 1997). En el caso de mediciones de potencial por
medio de matrices de FET se mide el cambio de potencial en las
superficies del sensor (M. Madou, Fundamentals of Microfabrication,
CRC Press, Boca Raton, 1997).
En caso de uso de un sustrato que es radiactivo o
que está marcado radiactivamente, la detección de la presencia de
un precipitado en un elemento de matriz puede tener lugar mediante
autorradiografía, fluorografía y/o autorradiografía indirecta.
Entonces, en el caso de la autorradiografía se pone directamente en
contacto una superficie cubierta con precipitado radiante con una
película radiográfica. En el caso de la fluorografía, una
superficie cubierta con precipitado radiante se recubre con
productos químicos fluorescentes, como por ejemplo silicilato de
sodio, que transforman la energía de radiación radiactiva en
fluorescencia. En el caso de la autorradiografía indirecta con
láminas intensificadoras (pantallas intensificadoras) se coloca una
superficie cubierta con un precipitado radiante \beta sobre una
lámina intensificadora que transforma la radiación en luz azul
(véase F. Lottspeich, H. Zorbas, véase anteriormente). Sin embargo,
frecuentemente no se desean los procedimientos de detección que se
basan en la radiactividad debido a los riesgos para el estado de
salud y a las normas de seguridad que por ello deben cumplirse.
En otras formas de realización alternativas de la
presente invención, la detección de la presencia de un precipitado
en un elemento de matriz tiene lugar mediante microscopía
electrónica de barrido, microanálisis por sonda electrónica (EPMA),
microscopía de Kerr magneto-óptica, microscopía de fuerza magnética
(MFM), microscopía de fuerza atómica (MFA), medición del efecto
espejismo, microscopía de barrido de efecto túnel (STM) y/o
tomografía de reflexión ultrasónica.
La detección de la reacción por medio de SEM y/o
EPMA es casi independiente del tipo de sustrato. En el caso de la
microscopía electrónica de barrido ("scanning electron
microscopy" (SEM)), un rayo de electrones enfocado explora la
muestra (J. Goldstein y otros Scanning Electron Microscopy and
X-Ray Microanalysis, Plenum, Nueva York, 1981). En
el caso del microanálisis por sonda electrónica (EPMA) se aprovechan
los procesos secundarios que se resuelven mediante un rayo de
electrones enfocado para el análisis localmente resuelto (J.
Goldstein y otros Scanning Electron Microscopy and
X-Ray Microanalysis, Plenum, Nueva York, 1981).
En caso de uso de un sustrato que es magnético o
está marcado con partículas magnéticas, la detección de la reacción
puede tener lugar mediante microscopía de Kerr magneto-óptica o MFM.
En el caso de la microscopía de Kerr magneto-óptica se aprovecha la
rotación del plano de polarización de la luz mediante campos
magnéticos (efecto Kerr y Faraday) (A.Hubert, R.Schäfer, Magnetic
Domains, Springer, 1998).
El cambio de la densidad óptica a través del
sustrato sobre la superficie debido a la reacción puede detectarse
por medio del efecto espejismo. En el efecto espejismo se mide el
calentamiento local de una superficie mediante absorción de un rayo
láser en haz por el cambio del índice de refracción asociado a él.
Mediante el entramado de la superficie se obtiene una imagen de las
propiedades de absorción superficiales locales (A. Mandelis,
Progress in Photothermal and Photoacoustic Science and Technology,
volumen 1, Elsevier, Nueva York 1992). Otro procedimiento térmico
localmente resuelto para la detección de la reacción de interacción
a través del sustrato es una disposición de matrices de
microtermófilos que miden las entalpías de cristalización y/o
deposición de las deposiciones de sustrato (J.M. Köhler, M. Zieren,
Thermochimica acta, 25, vol. 310, 1998).
También son adecuadas STM y MFA para la detección
de la reacción por medio de sustrato. En el caso del microscopio de
fuerza atómica (MFA), una micro o nanopunta explora las superficies,
mediante lo que se mide la topografía superficial (E. Braun, Y.
Eichen, U. Sivan, G. Ben-Yoseph, Nature, 775, vol.
391, 1998). La microscopía de fuerza magnética MFM detecta
diferencias de susceptibilidad magnética locales mediante una
nanopunta (A.Hubert, R.Schäfer, Magnetic Domains, Springer, 1998).
En el caso del microscopio de barrido de efecto túnel STM se mide
la corriente túnel mediante una nanopunta para calcular la
topografía nanosuperficial (O. Marti, M. Amrein, STM and SFM in
biology, Academic Press Inc., San Diego, 1993)
También pueden aplicarse procedimientos más
exóticos como la tomografía de reflexión ultrasónica. En el caso de
las tomografías se trata de procedimientos en los que se compila una
imagen tridimensional en forma de discos (F. Natterer,
Mathematische Methoden der Computer-Tomographie,
Westdt. Vlg., Wiesbaden, 1997). En el caso de la tomografía de
reflexión ultrasónica se aprovecha la medición de la reflexión
ultrasónica para producir el tomograma (V. Fleischer, F. Bergner,
DGZfP NDT Conference Dresden 1997).
En una forma de realización especial de la
presente invención se pone a disposición un procedimiento que
comprende las siguientes etapas:
- -
- detección del transcurso temporal de la formación de precipitado en los elementos de matriz mediante toma de imágenes con una cámara;
- -
- transformación de la información analógica contenida en las imágenes en forma digital;
- -
- cálculo de una intensidad de señal virtual para cada elemento de matriz mediante una función curva que describe la formación de precipitado en función del tiempo;
- -
- transformación de las intensidades de señal virtuales en una imagen artificial que representa las intensidades de señal virtuales de todos los elementos de matriz.
En el marco de la presente invención, por una
imagen se entiende un grupo de píxeles que representa una
ilustración de las intensidades de señal medidas para una matriz de
sondas y que puede transmitirse directamente, por ejemplo a una
pantalla o a una impresora para imprimirse.
En el marco de la presente invención, por una
imagen artificial se entiende un grupo de píxeles que representa
una ilustración de las intensidades de señal virtuales determinadas
según la invención para una matriz de sondas y que también puede
representarse, por ejemplo en una pantalla o una impresora.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un dispositivo para realizar el procedimiento anteriormente
descrito según la invención, que comprende:
- a)
- un sustrato de matriz con matriz de sondas,
- b)
- una cámara de reacción,
- c)
- un dispositivo para detectar un precipitado en un elemento de matriz en el que ha tenido lugar una interacción entre dianas y sondas, y
- d)
- un ordenador que está programado para:
- -
- recopilar las intensidades de señal grabadas por el dispositivo de detección;
- -
- garantizar el tratamiento de las intensidades de señal grabadas sucesivamente de modo que se determine el transcurso temporal de la formación de precipitado con el tiempo en un elemento de matriz y se determine una intensidad de señal virtual mediante una función curva que describe la formación de precipitado en función del tiempo; y
- -
- dado el caso, garantizar la transformación de las intensidades de señal virtuales en una imagen analógica.
El dispositivo de detección es preferiblemente
una cámara, especialmente una cámara CCD o CMOS o cámaras similares
que normalmente registran el intervalo total de la matriz de
sondas.
Como ya se menciona anteriormente, mediante
detección resuelta en el tiempo puede aumentarse extremadamente la
resolución dinámica de los propios datos de medición en el caso de
uso de una técnica de detección de 8 bits durante el proceso de
intensificación mediante la sedimentación de un precipitado, como
por ejemplo plata elemental sobre partículas de oro que actúan como
gérmenes de cristalización, y el cálculo de las densidades de
ocupación relativas a partir del comportamiento temporal según el
procedimiento de la invención. La estructura de un dispositivo
necesario para esto se diferencia por el registro mecánico de una
cámara de reacción y un software de adquisición modificado. El
software está caracterizado porque permite el tratamiento de las
tomas grabadas sucesivamente. Para esto de calculan para cada
instante de tiempo los valores acromáticos calculados mediante los
elementos de matriz de sondas individuales. Para todos los elementos
de matriz se calcula la intensidad de señal virtual en función de
la formación de precipitado con el tiempo. Partiendo de este valor
se relacionan, por ejemplo los valores acromáticos de la última
medición con el producto de la velocidad y la duración de medición,
y con esto se consigue una separación de imágenes del intervalo de
medición. Por tanto, con el propio uso de cámaras rentables de 8
bits se garantiza una excelente resolución de interacciones
sondas/diana débiles, además de intensas, así como una exacta
cuantificación de las dianas unidas.
En una forma de realización preferida, el
dispositivo según la invención comprende adicionalmente una fuente
de luz que se selecciona con especial preferencia del grupo
compuesto por un láser, un diodo emisor de luz (LED) y una lámpara
de alta presión.
Los componentes de una estructura a modo de
ejemplo de un dispositivo según la invención para la detección
óptica de una formación de precipitado están compuestos por una
fuente de luz de poca intensidad (500 mcd), por ejemplo un LED para
iluminación homogénea, y un detector, por ejemplo una cámara CCD.
Debido al efecto intensificador por la deposición catalítica del
sustrato, especialmente en el caso de uso de un sistema de
oro/plata, los cambios de las propiedades ópticas de la superficie
están marcados de tal manera que para detectar el precipitado es
suficiente un sencillo escáner plano de mesa, un escáner de
diapositivas o un aparato comparable.
Los tiempos de detección típicos están claramente
por debajo de 1 s, mientras que los sistemas de CCD sensibles
comparables para la detección de fluorescencia necesitan
aproximadamente de 10 s a 80 s, de modo que pueden usarse cámaras
de consumidor baratas cuya transmisión de señal se corresponda con
el estándar de vídeo.
El potencial de miniaturización de una estructura
de este tipo es muy alto, el sistema total puede diseñarse como un
aparato portátil autónomo para utilización en campo. Además, el
dispositivo según la invención puede realizarse en una forma de
realización especialmente preferida como unidad autónoma altamente
integrada. Con éste pueden realizarse rápidamente por legos
aplicaciones altamente sensibles de micromatrices, como por ejemplo
diagnóstico médico, ciencia forense, detección bacteriana, etc. y
también independientemente de laboratorios médicos y/o
biológicos.
A continuación se describe una aplicación
potencial del procedimiento según la invención en la tipificación
de tejidos en la medicina de trasplantes. Es de especial interés
para los trasplantes y la autoinmunidad el análisis de la
estructura, expresión y herencia de genes inmunológicamente
relevantes ya que existen sistemas polimórficos de alta calidad
tanto para el reconocimiento de antígenos específicos (antígenos de
histocompatibilidad, receptor de linfocito T) como también para los
mecanismos efectores (anticuerpos, receptores Fc) y estos están
sujetos a complejos mecanismos de regulación genética. Además de los
antígenos de trasplante débiles, especialmente los fuertes
contribuyen a, por ejemplo un rechazo del trasplante. Estos
antígenos fuertes se denominan antígenos principales de
histocompatibilidad y están codificados genéticamente dentro del
complejo principal de histocompatibilidad (MHC). El MHC, que hasta
la fecha se detectó exclusivamente en vertebrados, se denomina en el
ser humano ALH (antígeno leucocitario humano). El complejo de HLA
está localizado en el brazo corto del cromosoma 6 humano (6p21.1 -
6p21.3) y comprende un intervalo de aproximadamente 3500 kilobases.
A grandes rasgos, las moléculas de HLA pueden subdividirse en dos
clases (clase I y clase II), que entonces se dividen en otros
subgrupos. Los loci respectivos para los productos de HLA, que en
suma son responsables de las propiedades inmunológicas
correspondientes del organismo, aparecen mediante los procesos de la
herencia en variaciones alélicas muy numerosas, cuyo número
conocido aumenta continuamente. El número de posibles tipificaciones
alélicas del sistema de HLA que pueden proyectarse exactamente en
un organismo mediante análisis serológico y
molecular-biológico hace posible una gravedad
cualquiera, dependiendo de la relevancia médica de las especies
celulares que van a trasplantarse. Cuanto más grave sea la
tipificación y mayor sea la subsiguiente coincidencia entre donante
y receptor, menos problemas se esperarán, como incompatibilidades de
tejidos y rechazo de trasplante. Además de los diferentes
trasplantes, las transfusiones, asociaciones de enfermedades y el
área forense también desempeñan un papel en la identificación
inequívoca de personas.
En los ejemplos de realización se representa una
detección principal para el límite de detección y ejemplos de
monitorización de expresión. Sin embargo, los principios usados
patentados también pueden utilizarse para otras aplicaciones.
Además de los análisis cuantitativos, como por ejemplo la
monitorización de expresión de organismos, también pueden
realizarse numerosos análisis cualitativos.
Por ejemplo, los loci respectivos para los
productos de HLA, que en suma son responsables de las propiedades
inmunológicas correspondientes del organismo, aparecen mediante los
procesos de la herencia en variaciones alélicas muy numerosas, cuyo
número conocido aumenta continuamente. El número de posibles
tipificaciones alélicas del sistema de HLA que pueden proyectarse
exactamente en un organismo mediante análisis serológico y
molecular-biológico hace posible una gravedad
cualquiera, dependiendo de la relevancia médica de las especies
celulares que van a trasplantarse. Cuanto más grave sea la
tipificación y mayor sea la subsiguiente coincidencia entre donante
y receptor, menos problemas se esperarán, como incompatibilidades de
tejidos y rechazo de trasplante. Desde el descubrimiento de las
moléculas de CPH se han desarrollado y utilizado numerosos
procedimientos para caracterizar el polimorfismo de estas moléculas
y sus genes. Existe una diferencia fundamental, por un lado, entre
las técnicas bioquímicas, celulares y serológicas y, por otro lado,
las molecular-biológicas. Las primeras analizan
exclusivamente los productos de expresión, por ejemplo mediante la
utilización de anticuerpos específicos, mientras que el segundo
grupo detecta, por ejemplo mediante las técnicas de hibridación y
amplificación de ácidos nucleicos, diferencias de secuencias en el
intervalo de secuencias codificantes y no codificantes (Bidwell J.,
1994 Advances in DNA-based
HLA-typing methods. Immunol Today,
15(7):303-7). Mediante la invención descrita
se produciría que, después de un aislamiento, marcaje
correspondiente y, dado el caso, amplificación para destacar
estructuras alélicas diagnósticamente relevantes para dar un ruido
de fondo de la secuencia de ADN genómico de un individuo, tuviera
lugar una hibridación paralela masiva sobre una matriz de sondas
(chip de ADN) de todas las variantes alélicas conocidas con el fin
de la tipificación de HLA más profunda posible. En este sentido,
mediante la detección de hibridación y la intensificación de señal
descrita, en combinación con un detector sencillo comparado con
otros procedimientos, se pone al alcance en un tiempo mínimo de
diagnóstico una tipificación genómica máxima con uso de sondas
conocidas específicas para alelos en un marco económico
extraordinariamente favorable.
Otro campo de aplicación posible está en el
terreno farmacéutico y diagnóstico. En la metabolización de
sustancias propias del cuerpo y ajenas al cuerpo (por ejemplo
fármacos) en el organismo desempeñan un papel esencial una serie de
polimorfismos, mutaciones, deleciones genéticas, etc. con efectos
funcionales correspondientes en el plano de las proteínas. Las
distribuciones genotípicas individuales en estas secuencias de ADN
conducen fenotípicamente a, por ejemplo correlaciones con
determinados cuadros de enfermedades (así por ejemplo, en el caso
del gen para p53 y el cáncer de mama, así como variaciones genéticas
mitocondriales de los genes lazo D,
16-S-rRNA, ND3-5,
CytB, trNATTrp, trNALeu y el cáncer de pulmón y vejiga (Fliss MS y
otros (2000) Facile detection of mitochondrial DNA mutations in
tumors and bodily fluids. Science.
17;287(5460):2017-9.) o distinto efecto de
xenobióticos en el organismo. Lo último se demostró de manera
detallada por ejemplo en genes de citocromo P 450 (CYP2D6, CYP2C19,
CYP2A6, CYP2C9, CYP2E1), genes de
glutatión-S-transferasa (GSTM1,
GSTT1), el gen de la N-acetiltransferasa (NAT2), el
gen de la apolipoproteína E (ApoE) y muchos otros más. Los
resultados de todas estas investigaciones resumidas permiten la
elaboración de una matriz con sondas de ADN que detectan
paralelamente las diferencias de secuencias. En relación con la
detección de hibridación e intensificación descrita y una
estructura óptica sencilla, entonces pueden realizarse de manera
rápida y rentable genotipificaciones cualitativas. Éstas son
relevantes como modelo tanto en caso de utilización específica de
fármacos por individuos como también como marcador para la
identificación de personas y en el diagnóstico.
Los siguientes ejemplos y figuras sirven para
explicar la invención y no deben interpretarse de manera
limitante.
\newpage
Ejemplo
1
Sobre una superficie de vidrio epoxidada de
tamaño 3 x 3 mm ("matriz de sondas") se inmovilizó
covalentemente en un sitio definido ("elemento de matriz") un
oligonucleótido modificado con amino con una longitud de 20
nucleótidos de la secuencia
5'-NH_{2}-CCTCTGCAGACTACTATTAC-3'.
Además, en la superficie de vidrio se depositaron 0,1 \mul de una
disolución 5 \muM de oligonucleótido en tampón fosfato 0,5 M y
finalmente se secaron a 37ºC. La asociación covalente de los
oligonucleótidos depositados con los grupos epóxido sobre la
superficie de vidrio tuvo lugar mediante un horneado de 30 minutos
de la matriz de sondas a 60ºC. A continuación se aclararon
vigorosamente las matrices de sondas con agua destilada y después
se lavaron 30 min en KCl 100 mM. Después de otro corto aclarado en
KCl 100 mM y a continuación agua destilada, las matrices de sondas
se secaron 10 min a 37ºC.
Para la hibridación se utilizó un oligonucleótido
complementario de longitud 20 bp marcado con biotina de la
secuencia
5'-Bio-GTAATAGTAGTCTGCAGAGG-3'.
La reacción se absorbió en los siguientes escalones de concentración
en un tampón (NaPO_{4} 0,25 M, 4,5% SDS, EDTA 1 mM en 1 x SSC) en
un volumen total de 50 \mul cada uno: 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM,
1 pM, 100 fM, 10 fM, 1 fM.
Cada etapa de concentración dio una matriz de
sondas preparada en la disolución de hibridación. La mezcla básica
de hibridación así obtenida se incubó 5 min a 95ºC y después 60 min
a 50ºC. A continuación se lavaron las matrices de sondas cada una
10 min en 2 x SSC + 0,2% SDS, 2 x SSC y 0,2 x SSC con agitación
(Maniatis y otros, 1989) y se secaron por insuflado con aire a
presión.
Se añadió un conjugado de
estreptavidina-oro en una dilución 1:50 en 6 x SSPE
(52,5 g de NaCl, 26,4 g de NaH_{2}PO_{4} x H_{2}O, 2,22 g de
NaOH relleno con H_{2}O hasta 1 volumen total) + disolución de
Triton al 0,005% sobre la matriz de sondas y se incubó 15 min a
30ºC. A continuación se lavaron las matrices de sondas cada una 10
min en 2 x SSC (17,5 g de NaCl, 8,8 g de citrato de Na en 1 l de
H_{2}O, ajustado con NaOH 10 N a pH 7,0) + 0,2% SDS
(dodecilsulfato de sodio), 2 x SSC y 0,2 x SSC con agitación y se
secaron por insuflado con aire a presión. Alternativamente al
conjugado de oro de estreptavidina también se utilizaron
directamente dianas modificadas con partículas de oro.
La posterior intensificación de las partículas de
oro inmovilizadas a partir de ahora sobre la matriz de sondas tuvo
lugar con disolución de nitrato de plata al 0,1% en carbonato sódico
al 3% y disolución de formaldehído al 0,02%. La mezcla se preparó
nueva poco antes de la reacción. En el plazo de incubación de 15
minutos se observó a 22ºC y luz roja la reacción y continuamente se
registró con el dispositivo representado en la figura 1.
El límite de detección se encontró con < 10
pM.
En la figura 3 se representan los resultados de
la hibridación:
A - Hibridación de la diana presente en una
concentración de 10 nM,
B - Hibridación de la diana presente en una
concentración de 1 nM,
C - Hibridación de la diana presente en una
concentración de 100 pM y
D - Hibridación de la diana presente en una
concentración de 10 pM.
Ejemplo
2
Las matrices de ADN también se usan
frecuentemente para medir el estado fisiológico global de células
(perfil de expresión). Para ello se aísla ARN de las células
correspondientes, se marcan con un procedimiento adecuado y se
hibridan sobre una matriz de sondas con sondas complementarias. En
el siguiente ejemplo de aplicación se utilizó el procedimiento
según la invención para la detección de ARNm celular de
Corynebacterium glutamicum.
Sobre un portaobjetos microscópico epoxidado y
estandarizado de la empresa CLONDIAG Chip Technologies (Jena,
Alemania) que sirve como sustrato de matriz se produjo una matriz de
sondas de 356 oligonucleótidos diferentes modificados con amino de
25 y/o 30 bases de longitud y ADNc de distinta longitud. Todos los
oligonucleótidos eran complementarios a las secuencias parciales de
los genes aceA e icd. Las matrices de sondas se
produjeron según indicaciones del fabricante mediante colocación
con el robot MicroGrid I de la empresa Biorobotics Ltd. (Gran
Bretaña), mediante la aplicación de los ADN modificados con amino en
una concentración final de 5 \muM en tampón fosfato 0,5 M sobre
el portaobjetos y finalmente secado. La asociación covalente de los
oligonucleótidos depositados con los grupos epóxido sobre la
superficie de vidrio tuvo lugar mediante un horneado de 30 minutos
del portaobjetos a 60ºC. A continuación se aclararon vigorosamente
los portaobjetos con agua destilada y después se lavaron 30 min en
KCl 100 mM. Después de otro corto aclarado en primer lugar en KCl
100 mM y a continuación en agua destilada, las matrices de sondas
se secaron 10 min a 37ºC.
Se obtuvo ARN total de Corynebacterium
glutamicum por medio del kit Fast RNA (empresa Bio 101) según
indicaciones del fabricante. Se biotinizaron 50 \mug de ARN por
medio de Biotin Chem Link (Boehringer Mannheim, Alemania) según
indicaciones del fabricante a 85ºC durante 30 minutos. El ARN se
concentró a continuación mediante 30 columnas Microcon (empresa
Millipore) según indicaciones del fabricante y a continuación se
lavó varias veces con agua sin ribonucleasa, desionizada. El eluato
se concentró a vacío hasta 5 \mul.
El ARN biotinizado se absorbió en 100 \mul de
tampón de hibridación (NaPO_{4} 0,25 M, 4,5% SDS, EDTA 1 mM en
1xSSC) y se desnaturalizó durante 3 minutos a 65ºC. La superficie
del portaobjetos cubierta con ADN se tapó con una cámara de
hibridación (Hybrislip, Sigma, Deisenhofen, Alemania). El
portaobjetos se acondicionó previamente de manera térmica a 50ºC en
un termoagitador con una pieza adicional de placa de microtitulación
(Eppendorf, Hamburgo, Alemania). A continuación se alimentó la
disolución de hibridación desnaturalizada y se cerró la cámara de
hibridación según indicaciones del fabricante. La incubación
continuó durante 60 min a 50ºC. A continuación se sacó la
disolución de hibridación, se retiró la cámara de hibridación y los
portaobjetos se lavaron 10 min a 30ºC en 2 x SSC + 0,2% SDS con
agitación y respectivamente 10 minutos a temperatura ambiente en 2
x SSC y 0,2 x SSC (Maniatis y otros, 1989) y se secaron por
insuflado con aire a presión.
Se añadió un conjugado de
estreptavidina-oro (EM.STP5, empresa British BioCell
International) en una dilución 1:50 en 6 x SSPE + Triton al 0,005%
(Maniatis y col., 1989) sobre el portaobjetos y se incubó 15 min a
30ºC. A continuación se lavaron las matrices de sondas cada una 10
min en 2 x SSC + 0,2% SDS, 2 x SSC y 0,2 x SSC con agitación y se
secaron con aire a presión. La posterior intensificación de las
partículas de oro inmovilizadas a partir de ahora sobre la matriz
de sondas tuvo lugar con el kit LM/EM Silver Enhancing (SEKL15,
British BioCell International). Según las indicaciones del
fabricante, se mezclaron 2 gotas de cada disolución de iniciador y
potenciador y de ellas se pipetearon cada vez 15 \mul sobre la
superficie de las matrices de sondas. En el plazo de incubación de
15 minutos se observó a 22ºC y luz roja la reacción y continuamente
se registró con el dispositivo representado en la figura 1. El
modelo resultante también puede considerarse definitivo después de
incubación de 15 minutos (véase figura 4).
Ejemplo
3
Sobre una superficie de vidrio (empresa Elipsa)
de portaobjetos 3D epoxidado (75 mm x 25 mm) se depositaron en
sitios definidos con un robot MicroGrid II (empresa BioRobotics) 16
oligonucleótidos modificados con amino (sondas) con una longitud de
respectivamente 16 nucleótidos y se inmovilizaron covalentemente
(elementos de matriz). Las secuencias de los oligonucleótidos eran
las siguientes (respectivamente con una modificación de NH_{2} de
3'):
Una matriz de sondas completa (cuadrática)
individual sobre la superficie del portaobjetos estaba compuesta en
total por 10 x 10 = 100 sondas depositadas. En este sentido, cada
una de las 16 sondas de oligonucleótidos se depositó en al menos
una repetición de 5 veces sobre la matriz de sondas (estructura de
la matriz: véase figura 5). Las sondas tenían una distancia de 0,2
mm, toda la matriz de sondas cubría una superficie de 2 mm x 2 mm.
En total pudieron producirse de esta manera más de 100 matrices de
sondas idénticas por portaobjetos.
La deposición de las sondas tuvo lugar
respectivamente a partir de una disolución 10 \muM de
oligonucleótidos en tampón fosfato 0,1 M/sulfato de sodio al 5%.
Después de la deposición y el secado, las sondas se asociaron
covalentemente con los grupos epóxido sobre la superficie de vidrio
mediante un horneado de 30 minutos a 60ºC. A continuación tuvo
lugar un proceso de lavado y bloqueo del portaobjetos en el
siguiente orden:
\vskip1.000000\baselineskip
- 5 min en 600 ml de H_{2}O bidestilada + 600 \mul de Triton x 100
- 2 x 2 min en 600 ml de H_{2}O bidestilada + 60 \mul de HCl (conc.)
30 min en disolución de KCl 100
mM
aclarar 1 min en H_{2}O
bidestilada
incubar 15 min a 50ºC en cápsula de
vidrio en 75 ml de H_{2}O bidestilada + 25 ml de etilenglicol + 20
\mul de HCl
(conc.)
aclarar 1 min en H_{2}O
bidestilada
secar con aire a
presión.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de finalizar la etapa de lavado y secado
del portaobjetos, éstos se cortaron en trozos de vidrio de tamaño
3,25 mm x 3,25 mm (a continuación denominados "chips"). Sobre
cada uno de los chips se encontraba exactamente una matriz de
sondas de tamaño 2 mm x 2 mm.
Para la hibridación de las matrices de sondas
estaban a disposición como dianas para las 16 sondas de
oligonucleótidos los oligonucleótidos complementarios de longitud 16
bp marcados con biotina. En el presente documento solamente se cita
como ejemplo la diana "9b" complementaria a la sonda 9 de
oligonucleótidos con la siguiente secuencia:
- 5'-Biotina TCC CGA AAA TCG TGG T -3'
La reacción de hibridación se realizó en 6 x
tampón SSPE (52,59 g de NaCl, 8,28 g de NaH_{2}PO_{4} x
H_{2}O, 2,22 g de EDTA x 2H_{2}O en 1 l de H_{2}O bidestilada,
ajustado a pH 7,4 con NaOH)/0,1% SDS en un volumen total de 70
\mul con las etapas de concentración de diana 100 nM, 10 nM, 1nM,
100 pM, 10 pM, 1 pM. En cada etapa de concentración se añadió en la
disolución de hibridación un chip con la matriz de sondas, se
calentó 5 min a 95ºC, entonces se incubó 60 min a 30ºC con
agitación. Después se transfirió el chip a un nuevo recipiente de
reacción con 500 ml de tampón de hibridación (sin diana) y se lavó
10 min a 55ºC y/o 60ºC con agitación. A continuación se lavaron
entonces los chips otra vez cada uno 10 min en 2 x SSC/0,2% SDS (500
\mul a 30ºC), 2 x SSC (500 \mul a 20ºC) y 0,2 x SSC (500 \mul
a 20ºC) con agitación y entonces se secaron (concentrador de
Eppendorf).
Los chips hibridados y secados se transfirieron a
un nuevo recipiente de reacción con \mul de una disolución de
conjugado de estreptavidina-oro en 6 x SSPE/tampón
SDS al 0,1% y allí se incubaron 15 min a 30ºC. Como conjugado de
estreptavidina-oro se usaron partículas de oro de
tamaño 5 nm (British Biocell International, EM.STP5). El conjugado
estaba presente en el experimento en una concentración de 500 pg de
estreptavidina/\mul.
Después de la conjugación se lavaron los chips
cada uno 10 min en 2 x SSC/0,2% SDS (500 \mul a 30ºC), 2 x SSC
(500 \mul a 20ºC) y 0,2 x SSC (500 \mul a 20ºC) con agitación y
entonces se secaron (concentrador de Eppendorf).
Alternativamente a esta manera de proceder, el
acoplamiento de conjugado de estreptavidina-oro
también se realizó directamente en la disolución de hibridación.
Para esto, después de la hibridación de 60 minutos se añadió el
conjugado de estreptavidina-oro directamente en la
disolución de hibridación y entonces se incubó otros 15 min a 30ºC.
Después se transfirió el chip a un nuevo recipiente de reacción con
500 ml de tampón de hibridación (sin diana) y se lavó 10 min a 55ºC
y/o 60ºC con agitación. A continuación se lavaron entonces los
chips otra vez cada uno 10 min en 2 x SSC/0,2% SDS (500 \mul a
30ºC), 2 x SSC (500 \mul a 20ºC) y 0,2 x SSC (500 \mul a 20ºC)
con agitación y entonces se secaron (concentrador de Eppendorf).
Para intensificar la plata, los chips se
transfirieron a un nuevo recipiente de reacción y se incubaron con
agitación durante 10 min a 25ºC en aproximadamente 100 \mul de una
disolución reveladora de plata (British Biocell International,
SEKL15). La disolución de incubación se preparó mediante mezclado de
una gota de cada disolución de iniciador y potenciador. A
continuación, el chip se lavó 2 min en 500 \mul de 0,2 x SSC y se
secó (concentrador de Eppendorf).
Los resultados de dos hibridaciones
-seleccionadas a modo de ejemplo- y su detección están representados
en la figura 6a y 6b (tomas de luz transmitida).
Ejemplo
4
En la bibliografía se describen más de 800
mutaciones para el gen CFTR que pueden conducir al cuadro de
enfermedades de la fibrosis quística. En el gen CFTR aparecen tres
tipos de mutaciones:
- Intercambio de bases (en el presente documento:
mutaciones puntuales)
- Inserciones
- Deleciones
Para las tres formas de mutación debería probarse
si el tipo salvaje (pm) respectivo puede diferenciarse de la
mutación (mm) por medio de la detección de intensificación de plata.
Las sondas y las dianas fueron proporcionadas por la empresa Ogham
(Münster, Alemania).
Sobre una superficie de vidrio (empresa Elipsa)
de portaobjetos 3D epoxidado (75 mm x 25 mm) se depositaron en
sitios definidos con un robot MicroGrid II (empresa BioRobotics) 10
oligonucleótidos modificados con amino (sondas) con una longitud de
16 a 22 nucleótidos y se inmovilizaron covalentemente (elementos de
matriz). Las 10 sondas se dividen en 5 pares, en los que los
primeros representan respectivamente el tipo salvaje y los segundos
la mutación. El par de sondas 1 y 2 representa una mutación puntual,
el par 3 y 4 una deleción y los pares 5/6, 7/8, 9/10 inserciones.
Las secuencias de los oligonucleótidos fueron las siguientes:
\newpage
Secuencia en dirección 5' - 3' con modificación
de 3'-NH_{2}:
El par de sondas 3 (tipo salvaje) y 4 (deleción)
contiene la mutación más frecuente (70% de todos los casos) que
codifica para la fibrosis quística.
Una matriz de sondas completa (cuadrática)
individual sobre la superficie del portaobjetos estaba compuesta en
total por 10 x 10 = 100 sondas depositadas. En este sentido, cada
una de las 10 sondas de oligonucleótidos se depositó en una
repetición de 8 a 10 veces sobre la matriz de sondas (estructura de
la matriz: véase figura 7). Las sondas tenían una distancia de 0,2
mm, toda la matriz de sondas cubría una superficie de 2 mm x 2 mm.
En total pudieron producirse de esta manera más de 100 matrices de
sondas idénticas por portaobjetos.
La deposición de las sondas tuvo lugar
respectivamente a partir de una disolución 10 \muM de
oligonucleótidos en tampón fosfato 0,1 M/sulfato de sodio al 5%.
Después de la deposición y el secado, las sondas se asociaron
covalentemente con los grupos epóxido sobre la superficie de vidrio
mediante un horneado de 30 minutos a 60ºC. A continuación tuvo
lugar un proceso de lavado y bloqueo del portaobjetos en el
siguiente orden:
\vskip1.000000\baselineskip
- 5 min en 600 ml de H_{2}O bidestilada + 600 \mul de Triton x 100
- 2 x 2 min en 600 ml de H_{2}O bidestilada + 60 \mul de HCl (conc.)
30 min en disolución de KCl 100
mM
aclarar 1 min en H_{2}O
bidestilada
incubar 15 min a 50ºC en cápsula de
vidrio en 75 ml de H_{2}O bidestilada + 25 ml de etilenglicol + 20
\mul de HCl
(conc.)
aclarar 1 min en H_{2}O
bidestilada
secar con aire a
presión.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de finalizar la etapa de lavado y secado
del portaobjetos, éstos se cortaron en trozos de vidrio de tamaño
3,25 mm x 3,25 mm (a continuación denominados "chips"). Sobre
cada uno de los chips se encontraba exactamente una matriz de
sondas de tamaño 2 mm x 2 mm.
Para la hibridación de las matrices de sondas
estaban a disposición para las 10 sondas 3 de oligonucleótidos
dianas marcadas con biotina complementarias a las sondas de
apareamiento perfecto (pm). En este sentido, la diana 1 tapaba el
par de sondas 1 y 2, la diana 2 el par 3 y 4 y la diana 3 los pares
de sondas 5/6, 7/8 y 9/10. Las secuencias de las dianas eran:
- Diana 1:
- 5'-Biotina-CTCAGTAAGGCGAAGATCTT-3'
- Diana 2:
- 5'-Biotina-AATATCATCTTTGGTGTTTCCT-3'
- Diana 3:
- 5'-Biotina-GAACATACCAAATAATTAGAAGAACTCTAAAACA-3'
\newpage
La reacción de hibridación se realizó en 6 x
tampón SSPE (52,59 g NaCl, 8,28 g NaH_{2}PO_{4} x H_{2}O, 2,22
g EDTA x 2H_{2}O en 1 l de H_{2}O bidestilada, ajustado a pH 7,4
con NaOH)/0,1% SDS en un volumen total de 70 \mul con diferentes
etapas de concentración de diana. En este sentido, se añadió en la
disolución de hibridación un chip con la matriz de sondas, se
calentó 5 min a 95ºC, entonces se incubó con agitación 60 min a
30ºC.
Después de la hibridación de 60 minutos se añadió
un conjugado de estreptavidina-oro directamente en
la disolución de hibridación y entonces se incubó otros 15 min a
30ºC. Como conjugado de estreptavidina-oro se
usaron partículas de oro de tamaño 5 nm (British Biocell
International, EM.STP5). El conjugado estaba presente en el
experimento en una concentración de 500 pg de
estreptavidina/\mul.
Después de la hibridación y conjugación se
transfirió el chip a un nuevo recipiente de reacción con 500 \mul
de tampón de hibridación (sin diana) y se lavó 10 min a 55ºC con
agitación. A continuación se lavaron entonces los chips otra vez
cada uno 10 min en 2 x SSC/0,2% SDS (500 \mul a 30ºC), 2 x SSC
(500 \mul a 20ºC) y 0,2 x SSC (500 \mul a 20ºC) con agitación y
entonces se secaron (concentrador de Eppendorf).
Para la intensificación de la plata se
transfirieron los chips a un nuevo recipiente de reacción y se
incubaron con agitación durante 10 min a 25ºC en aproximadamente 100
\mul de una disolución reveladora de plata (British Biocell
International, SEKL15). La disolución de incubación se preparó
mediante mezclado de una gota de cada disolución de iniciador y
potenciador. A continuación, el chip se lavó 2 min en 500 \mul de
0,2 x SSC y se secó (concentrador de Eppendorf).
Los resultados de tres hibridaciones y su
detección están representados en las figuras 8, 9 y 10 (tomas de
luz transmitida). Aunque en la mutación puntual (figura 8) y la
deleción (figura 9) también se reconoce claramente una
discriminación entre el tipo salvaje (pm) y la mutación (mm), esto
no es válido para la inserción (figura 10). En el caso del par de
sondas 9/10 de mm (sonda 10) aquí se muestra incluso una señal más
intensa que la del tipo salvaje (sonda 9). El límite de detección
de la hibridación en este modelo de experimento era a una
concentración de diana de 10 pM.
Ejemplo
5
Sobre una superficie de vidrio (empresa Elipsa)
de portaobjetos 3D epoxidado (75 mm x 25 mm) se depositaron en
sitios definidos con un robot MicroGrid II (empresa BioRobotics) 16
oligonucleótidos modificados con amino (sondas) con una longitud de
respectivamente 16 nucleótidos y se inmovilizaron covalentemente
(elementos de matriz). Las secuencias de los oligonucleótidos
(respectivamente con modificación de 3'-NH_{2})
fueron del siguiente modo:
Una matriz de sondas completa (cuadrática)
individual sobre la superficie del portaobjetos estaba compuesta en
total por 10 x 10 = 100 sondas depositadas. En este sentido, cada
una de las 16 sondas de oligonucleótidos se depositó en al menos
una repetición de 5 veces sobre la matriz de sondas (estructura de
la matriz: véase figura 11). Las sondas tenían una distancia de 0,2
mm, toda la matriz de sondas cubría una superficie de 2 mm x 2 mm.
En total pudieron producirse de esta manera más de 100 matrices de
sondas idénticas por portaobjetos.
La deposición de las sondas tuvo lugar
respectivamente a partir de una disolución 10 \muM de
oligonucleótidos en tampón fosfato 0,1 M/sulfato de sodio al 5%.
Después de la deposición y el secado, las sondas se asociaron
covalentemente con los grupos epóxido sobre la superficie de vidrio
mediante un horneado de 30 minutos a 60ºC. A continuación tuvo lugar
un proceso de lavado y bloqueo del portaobjetos en el siguiente
orden:
\vskip1.000000\baselineskip
- 5 min en 600 ml H_{2}O bidestilada + 600 \mul Triton x 100
- 2 x 2 min en 600 ml H_{2}O bidestilada + 60 \mul HCl (conc.)
30 min en disolución de KCl 100
mM
aclarar 1 min en H_{2}O
bidestilada
incubar 15 min a 50ºC en cápsula de
vidrio en 75 ml H_{2}O bidestilada + 25 ml etilenglicol + 20
\mul HCl
(conc.)
aclarar 1 min en H_{2}O
bidestilada
secar con aire a
presión.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de finalizar la etapa de lavado y secado
del portaobjetos, éstos se cortaron en trozos de vidrio de tamaño
3,25 mm x 3,25 mm (a continuación denominados "chips"). Sobre
cada uno de los chips se encontraba exactamente una matriz de
sondas de tamaño 2 mm x 2 mm.
Para la preparación de un conjugado
oligonucleótido-oro se mezclaron 5,4 nmol de un
oligonucleótido modificado (disuelto en 80 \mul H_{2}O
bidestilada) con la secuencia
5'-tiol-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'("T20-tiol")
con 6 nmol Monomaleimido Nanogold (empresa Nanoprobes) y se incubó
24 h a 4ºC. El Nanogold se disolvió en 20 \mul de isopropanol y
180 \mul H_{2}O bidestilada.
Para la hibridación de las matrices de sondas
estaban a disposición como dianas para las 16 sondas de
oligonucleótidos los oligonucleótidos complementarios de longitud 36
bp, que presentaban como modificación en el extremo 3' una cola de
poli A. En el presente documento solamente se cita como ejemplo la
diana "9c" complementaria a la sonda 9 de oligonucleótidos con
la siguiente secuencia:
- 5'-TCCCGAAAATCGTGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'
La reacción de hibridación se realizó en 6 x
tampón SSPE (52,59 g NaCl, 8,28 g NaH_{2}PO_{4} x H_{2}O,
2,22 g de EDTA x 2H_{2}O en 1 l H_{2}O bidestilada, ajustado a
pH 7,4 con NaOH)/0,1% SDS en un volumen total de 70 \mul con
diferentes etapas de concentración de diana. En cada etapa de
concentración se añadió en la disolución de hibridación un chip con
la matriz de sondas, se calentó 5 min a 95ºC, entonces se incubó
con agitación 60 min a 30ºC. Después se añadió el conjugado de
T20-Nanogold en diferentes etapas de dilución en la
disolución de hibridación y se incubó otros 30 min a 30ºC.
A continuación se transfirió el chip a un nuevo
recipiente de reacción con 500 \mul de tampón de hibridación (sin
diana y T20-Nanogold) y se lavó 10 min a 55ºC y/o
60ºC con agitación. Finalmente los chips se lavaron entonces otra
vez cada uno 10 min en 2 x SSC/0,2% SDS (500 \mul a 30ºC), 2 x SSC
(500 \mul a 20ºC) y 0,2 x SSC (500 \mul a 20ºC) con agitación y
entonces se secaron (concentrador de Eppendorf).
Para la intensificación de la plata se
transfirieron los chips a un nuevo recipiente de reacción y se
incubaron con agitación durante 10 min a 25ºC en aproximadamente 100
\mul de una disolución reveladora de plata (British Biocell
International, SEKL15). La disolución de incubación se preparó
mediante mezclado de una gota de cada disolución de iniciador y
potenciador. A continuación, el chip se lavó 2 min en 500 \mul de
0,2 x SSC y se secó (concentrador de Eppendorf).
En la bibliografía se describen más de 800
mutaciones para el gen CFTR que pueden conducir al cuadro de
enfermedades de la fibrosis quística. En el gen CFTR aparecen tres
tipos de mutaciones:
- Intercambio de bases (en el presente documento:
mutaciones puntuales)
- Inserciones
- Deleciones
Para las 3 formas de mutación debería probarse si
el tipo salvaje (pm) respectivo puede diferenciarse de la mutación
(mm) por medio de la detección de intensificación de plata.
Las sondas y las dianas fueron proporcionadas por
la empresa Ogham.
Sobre una superficie de vidrio (empresa Elipsa)
de portaobjetos 3D epoxidado (75 mm x 25 mm) se depositaron en
sitios definidos con un robot MicroGrid II (empresa BioRobotics) 10
oligonucleótidos modificados con amino (sondas) con una longitud de
16 a 22 nucleótidos y se inmovilizaron covalentemente (elementos de
matriz). Las 10 sondas se dividen en 5 pares, en los que los
primeros representan respectivamente el tipo salvaje y los segundos
la mutación. El par de sondas 1 y 2 representa una mutación puntual,
el par 3 y 4 una deleción y los pares 5/6, 7/8, 9/10 inserciones.
Las secuencias de los oligonucleótidos fueron las siguientes:
Secuencia en dirección 5' - 3' con modificación
3'-NH_{2}:
\vskip1.000000\baselineskip
El par de sondas 3 (tipo salvaje) y 4 (deleción)
contiene la mutación más frecuente (70% de todos los casos) que
codifica para la fibrosis quística.
Una matriz de sondas completa (cuadrática)
individual sobre la superficie del portaobjetos estaba compuesta en
total por 10 x 10 = 100 sondas depositadas. En este sentido, cada
una de las 10 sondas de oligonucleótidos se depositó en una
repetición de 8 a 10 veces sobre la matriz de sondas (estructura de
la matriz: véase figura 13). Las sondas tenían una distancia de 0,2
mm, toda la matriz de sondas cubría una superficie de 2 mm x 2 mm.
En total pudieron producirse de esta manera más de 100 matrices de
sondas idénticas por portaobjetos.
La deposición de las sondas tuvo lugar
respectivamente a partir de una disolución 10 \muM de
oligonucleótidos en tampón fosfato 0,1 M/sulfato de sodio al 5%.
Después de la deposición y el secado, las sondas se asociaron
covalentemente con los grupos epóxido sobre la superficie de vidrio
mediante un horneado de 30 minutos a 60ºC. A continuación tuvo lugar
un proceso de lavado y bloqueo del portaobjetos en el siguiente
orden:
\newpage
- 5 min en 600 ml H_{2}O bidestilada + 600 \mul Triton x 100
- 2 x 2 min en 600 ml H_{2}O bidestilada + 60 \mul HCl (conc.)
30 min en disolución KCl 100
mM
aclarar 1 min en H_{2}O
bidestilada
incubar 15 min a 50ºC en cápsula de
vidrio en 75 ml H_{2}O bidestilada + 25 ml etilenglicol + 20
\mul HCl
(conc.)
aclarar 1 min en H_{2}O
bidestilada
secar con aire a
presión.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de finalizar la etapa de lavado y secado
del portaobjetos, éstos se cortaron en trozos de vidrio de tamaño
3,25 mm x 3,25 mm (a continuación denominados "chips"). Sobre
cada uno de los chips se encontraba exactamente una matriz de
sondas de tamaño 2 mm x 2 mm.
Para la hibridación de las matrices de sondas
estaban a disposición para las 10 sondas 3 de oligonucleótidos
dianas marcadas con biotina complementarias a las sondas de
apareamiento perfecto (pm). En este sentido, la diana 1 tapaba el
par de sondas 1 y 2, la diana 2 el par 3 y 4 y la diana 3 los pares
de sondas 5/6, 7/8 y 9/10. Las secuencias de las dianas eran:
- Diana 1:
- 5'-Biotina-CTCmAGTAAGGCGAAGATCTT-3'
- Diana 2:
- 5'-Biotina-AATATCATCTTTGGTGTTTCCT-3'
- Diana 3:
- 5'-Biotina-GAACATACCAAATAATTAGAAGAACTCTAAAACA-3'
La reacción de hibridación se realizó en 6 x
tampón SSPE (52,59 g NaCl, 8,28 g NaH_{2}PO_{4} x H_{2}O,
2,22 g EDTA x 2H_{2}O en 1 l H_{2}O bidestilada, ajustado a pH
7,4 con NaOH)/0,1% SDS en un volumen total de 70 \mul con las
tres dianas en una concentración de 100 pM. En este sentido, se
añadió en la disolución de hibridación un chip con la matriz de
sondas, se calentó 5 min a 95ºC, entonces se incubó con agitación
60 min a 30ºC. Después de la hibridación de 60 minutos se añadió un
conjugado de estreptavidina-oro directamente en la
disolución de hibridación y entonces se incubó otros 15 min a 30ºC.
Como conjugado de estreptavidina-oro se usaron
partículas de oro de tamaño 5 nm (British Biocell International,
EM.STP5). El conjugado estaba presente en el experimento en una
concentración de 500 pg de estreptavidina/\mul.
Después de la hibridación y conjugación se
transfirió el chip a un nuevo recipiente de reacción con 500 \mul
de tampón de hibridación (sin diana) y se lavó 10 min a 55ºC con
agitación. A continuación se lavaron entonces los chips otra vez
cada uno 10 min en 2 x SSC/0,2% SDS (500 \mul a 30ºC), 2 x SSC
(500 \mul a 20ºC) y 0,2 x SSC (500 \mul a 20ºC) con agitación y
entonces se secaron (concentrador de Eppendorf).
Para la intensificación de la plata se fijaron
los chips en una cámara de reacción cerrada (véase figura 1) y se
recubrieron con una disolución reveladora de plata (British Biocell
International, SEKL15). La disolución de incubación se preparó
mediante mezclado de una gota de cada disolución de iniciador y
potenciador. Durante la incubación de 30 minutos a 21ºC se
documentó el transcurso temporal de la intensificación de la plata
mediante una foto por minuto (como fuente de luz sirvió un LED
rojo).
Las imágenes se interpretaron a continuación con
el software de interpretación de imágenes IconoClust (empresa
Clondiag).
Como ejemplo se representan en las figuras 14a y
14b las fotos de chips 5 y/o 10 min después del comienzo de la
intensificación de la plata (se hibridó con la diana 2). La figura
15 muestra el transcurso temporal de esta reac-
ción.
ción.
Ejemplo
7
En la bibliografía se describen más de 800
mutaciones para el gen CFTR que pueden conducir al cuadro de
enfermedades de la fibrosis quística. En el gen CFTR aparecen tres
tipos de mutaciones:
- Intercambio de bases (en el presente documento:
mutaciones puntuales)
- Inserciones
- Deleciones
Para las 3 formas de mutación debería probarse si
el tipo salvaje (pm) respectivo puede diferenciarse de la mutación
(mm) por medio de la detección de intensificación de plata. Las
sondas y las dianas fueron proporcionadas por la empresa Ogham
(Münster).
Sobre una superficie de vidrio (empresa Elipsa)
de portaobjetos 3D epoxidado (75 mm x 25 mm) se depositaron en
sitios definidos con un robot MicroGrid II (empresa BioRobotics) 10
oligonucleótidos modificados con amino (sondas) con una longitud de
16 a 22 nucleótidos y se inmovilizaron covalentemente (elementos de
matriz). Las 10 sondas se dividen en 5 pares, en los que los
primeros representan respectivamente el tipo salvaje y los segundos
la mutación. El par de sondas 1 y 2 representa una mutación puntual,
el par 3 y 4 una deleción y los pares 5/6, 7/8, 9/10 inserciones.
Las secuencias de los oligonucleótidos fueron las siguientes:
Secuencia en dirección 5' - 3' con modificación
3'-NH_{2} :
El par de sondas 3 (tipo salvaje) y 4 (deleción)
contiene la mutación más frecuente (70% de todos los casos) que
codifica para la fibrosis quística.
Una matriz de sondas completa (cuadrática)
individual sobre la superficie del portaobjetos estaba compuesta en
total por 10 x 10 = 100 sondas depositadas. En este sentido, cada
una de las 10 sondas de oligonucleótidos se depositó en una
repetición de 8 a 10 veces sobre la matriz de sondas (estructura de
la matriz: véase figura 16). Las sondas tenían una distancia de 0,2
mm, toda la matriz de sondas cubría una superficie de 2 mm x 2 mm.
En total pudieron producirse de esta manera más de 100 matrices de
sondas idénticas por portaobjetos.
La deposición de las sondas tuvo lugar
respectivamente a partir de una disolución 10 \muM de
oligonucleótidos en tampón fosfato 0,1 M/sulfato de sodio al 5%.
Después de la deposición y el secado, las sondas se asociaron
covalentemente con los grupos epóxido sobre la superficie de vidrio
mediante un horneado de 30 minutos a 60ºC. A continuación tuvo lugar
un proceso de lavado y bloqueo del portaobjetos en el siguiente
orden:
\vskip1.000000\baselineskip
- 5 min en 600 ml H_{2}O bidestilada + 600 \mul Triton x 100
- 2 x 2 min en 600 ml H_{2}O bidestilada + 60 \mul HCl (conc.)
30 min en disolución de KCl 100
mM
aclarar 1 min en H_{2}O
bidestilada
incubar 15 min a 50ºC en cápsula de
vidrio en 75 ml H_{2}O bidestilada + 25 ml etilenglicol + 20
\mul HCl
(conc.)
aclarar 1 min en H_{2}O
bidestilada
secar con aire a
presión.
Después de finalizar la etapa de lavado y secado
del portaobjetos, éstos se cortaron en trozos de vidrio de tamaño
3,25 mm x 3,25 mm (a continuación denominados "chips"). Sobre
cada uno de los chips se encontraba exactamente una matriz de
sondas de tamaño 2 mm x 2 mm.
Para la hibridación de las matrices de sondas
estaban a disposición para las 10 sondas 3 de oligonucleótidos
dianas marcadas con biotina complementarias a las sondas de
apareamiento perfecto (pm). En este sentido, la diana 1 tapaba el
par de sondas 1 y 2, la diana 2 el par 3 y 4 y la diana 3 los pares
de sondas 5/6, 7/8 y 9/10. Las secuencias de las dianas eran:
- Diana 1:
- 5'-Biotina-CTCAGTAAGGCGAAGATCTT-3'
- Diana 2:
- 5'-Biotina-AATATCATCTTTGGTGTTTCCT-3'
- Diana 3:
- 5'-Biotina-GAACATACCAAATAATTAGAAGAACTCTAAAACA-3'
La reacción de hibridación se realizó en 6 x
tampón SSPE (52,59 g NaCl, 8,28 g NaH_{2}PO_{4} x H_{2}O,
2,22 g EDTA x 2H_{2}O in 1 l H_{2}O bidestilada, ajustado a pH
7,4 con NaOH)/0,1% SDS en un volumen total de 70 \mul con la
diana 3 en un concentración de 100 nM y 1 nM. En este sentido, se
añadió en la disolución de hibridación un chip con la matriz de
sondas, se calentó 5 min a 95ºC, entonces se incubó con agitación
60 min a 55ºC.
A continuación se lavaron los chips hibridados
cada uno 10 min en 2 x SSC/0,2% SDS (500 \mul a 30ºC), 2 x SSC
(500 \mul a 20ºC) y 0,2 x SSC (500 \mul a 20ºC) con agitación.
En un nuevo recipiente de reacción se conectó una incubación de 15
minutos (a 30ºC) con un conjugado de
estreptavidina-oro. Como conjugado de
estreptavidina-oro se usaron partículas de oro de
tamaño 5 nm (British Biocell International, EM.STP5). El conjugado
estaba presente en el experimento en una concentración de 125 pg de
estreptavidina/\mul.
Después de la conjugación se transfirió el chip a
un nuevo recipiente de reacción y se lavó cada uno 10 min en 2 x
SSC/0,2% SDS (500 \mul a 30ºC), 2 x SSC (500 \mul a 20ºC) y 0,2
x SSC (500 \mul a 20ºC) con agitación y entonces se secó
(concentrador de Eppendorf).
Para la intensificación de la plata se fijaron
los chips en una cámara de reacción cerrada (véase para esto la
figura 1) y se recubrieron con una disolución reveladora de plata
(British Biocell International, SEKL15). La disolución de incubación
se preparó mediante mezclado de una gota de cada disolución de
iniciador y potenciador. Durante la incubación de 20 minutos a 27ºC
se documentó el transcurso temporal de la intensificación de la
plata mediante una serie de fotos (una imagen cada 10 s) (como
fuente de luz sirvió un LED rojo). Las imágenes se interpretaron a
continuación con el software de interpretación de imágenes
IconoClust (empresa Clondiag).
Los resultados se representan en las figuras 17 a
20, así como en la tabla 2. De la comparación de las rectas de
regresión lineales típicas para la sonda respectiva en el caso de
una diana de concentración determinada, que se calculan en el
intervalo de crecimiento exponencial de la curva, puede estimarse
una concentración de diana desconocida. El requisito previo para
esto son mismas cantidades de conjugados utilizados, misma
concentración de sondas inmovilizadas, así como misma temperatura de
experimento.
| Ecuaciones de regresiones lineales para sondas seleccionadas (elementos de matriz), así como el ruido de fondo | |||||
| del chip. El crecimiento de las rectas de regresión respectivas está en negrita (x: tiempo en minutos después del | |||||
| comienzo de la intensificación de la plata, y: intensidad de señal en el intervalo de minutos válidos, hibridación | |||||
| con diana 3 en las concentraciones 100 nM y 1 nM). | |||||
| Elemento de matriz | Concentración de | Intervalo | Ecuación f(x) | R^{2} | Error |
| de sondas | diana | minutos | estándar | ||
| Ruido de fondo | 100 nM | 1-20 | y= 0,0551+ (0,013 * x) | 0,971 | 0,014 |
| Ruido de fondo | 1 nM | 1-20 | y= 0,0161+ (0,013 * x) | 0,984 | 0,01 |
| Sonda 5 pm | 100 nM | 4-13 | y= -0,263+ (0,0740 * x) | 0,993 | 0,021 |
| Sonda 5 pm | 1 nM | 4-13 | y= -0,259+ (0,0677 * x) | 0,989 | 0,023 |
| Sonda 6 pm | 100 nM | 4-13 | y= -0,246+ (0,0647 * x) | 0,991 | 0,02 |
| Sonda 6 pm | 1 nM | 4-13 | y= -0,153+ (0,0417 * x) | 0,969 | 0,024 |
Figura 1: Dispositivo para la detección
cualitativa y/o cuantitativa de interacciones entre sondas y
dianas.
Figura 2: Reproducción del transcurso temporal de
los resultados de hibridación representados en la figura 3.
Figura 3: Representación de los resultados de
hibridación.
A - Hibridación de la diana presente en una
concentración de 10 nM,
B - Hibridación de la diana presente en una
concentración de 1 nM,
C - Hibridación de la diana presente en una
concentración de 100 pM y
D - Hibridación de la diana presente en una
concentración de 10 pM.
Figura 4: Detección de la hibridación de RNA
genómico de Corynebacterium glutamicum sobre una matriz de
sondas de 356 sondas - modelo resultante después de incubación de 15
minutos.
Figura 5: Estructura de una matriz de tamaño 2 mm
x 2 mm en una matriz de sondas 10 x 10 = 100.
Los números 1-16 representan
respectivamente una sonda de oligonucleótidos que está depositada
sobre la matriz en una repetición de 5 y/o 6 veces; "M"
representa una mezcla de marcas (contiene, entre otros, un
oligonucleótido inmovilizado marcado con biotina); no está cubierta
1 posición sobre la matriz.
Figura 6: Matriz de sondas después de realizada
la hibridación, conjugación e intensificación de la plata (para la
estructura de la matriz compárese la figura 5).
a) Imagen de la izquierda: Hibridación de la
diana 9b (100 nM) a 30ºC; 1. etapa de lavado a 60ºC; conjugado de
estreptavidina-oro (500 pg/\mul); intensificación
de la plata: 10 min a 25ºC
Aparte de la sonda 9 específica (y las marcas)
todavía puede reconocerse una débil señal inespecífica de la sonda
13.
b) Imagen de la derecha: Hibridación de la diana
9b (100 pM) a 30ºC con adición directamente a continuación de
conjugado de estreptavidina-oro (500 pg/\mul); 1.
etapa de lavado a 60ºC, intensificación de la plata: 10 min a
25ºC.
Figura 7: Estructura de una matriz de tamaño 2 mm
x 2 mm en una matriz de sondas 10 x 10 = 100.
Los números 1-10 representan
respectivamente una sonda de oligonucleótidos que está depositada
sobre la matriz en una repetición de 8 a 10 veces; "M"
representa una mezcla de marcas (contiene, entre otros, un
oligonucleótido inmovilizado marcado con biotina).
Figura 8: Matriz de sondas después de realizada
la hibridación, conjugación e intensificación de la plata (para la
estructura de la matriz compárese la figura 7).
Hibridación de la diana 1 (100 pM) a 30ºC con
adición directamente a continuación de conjugado de
estreptavidina-oro (500 pg/\mul); 1. etapa de
lavado a 55ºC, intensificación de la plata: 10 min a 25ºC.
Figura 9: Matriz de sondas después de realizada
la hibridación, conjugación e intensificación de la plata (para la
estructura de la matriz compárese la figura 1).
Hibridación de la diana 2 (100 pM) a 30ºC con
adición directamente a continuación de conjugado de
estreptavidina-oro (500 pg/\mul); 1. etapa de
lavado a 55ºC, intensificación de la plata: 10 min a 25ºC.
Figura 10: Matriz de sondas después de realizada
la hibridación, conjugación e intensificación de la plata (para la
estructura de la matriz compárese la figura 1).
Hibridación de la diana 3 (100 pM) a 30ºC con
adición directamente a continuación de conjugado de
estreptavidina-oro (500 pg/\mul); 1. etapa de
lavado a 55ºC, intensificación de la plata: 10 min a 25ºC.
Figura 11: Estructura de una matriz de tamaño 2
mm x 2 mm en una matriz de sondas 10 x 10 = 100.
Los números 1-16 representan
respectivamente una sonda de oligonucleótidos que está depositada
sobre la matriz en una repetición de 5 y/o 6 veces; "M"
representa una mezcla de marcas (contiene, entre otros, un
oligonucleótido inmovilizado marcado con biotina); no está cubierta
1 posición sobre la matriz.
\newpage
Figura 12: Matriz de sondas después de realizada
la hibridación, conjugación e intensificación de la plata del
ejemplo 5 (para la estructura de la matriz compárese la figura
11).
Hibridación de 60 minutos de la diana 9c (1 nM) a
30ºC; entonces adición de T20-Nanogold (dilución
1:100) e incubación adicional durante 30 min a 30ºC, 1. etapa de
lavado a 55ºC; intensificación de la plata: 10 min a 25ºC.
Aparte de la fuerte señal específica de la sonda
9 (y las marcas), las sondas restantes también producen una señal
débil; los puntos parcialmente dispersos y no homogéneos se
realizaron en la deposición de la sondas por impurezas de la aguja
del robot.
Figura 13: Estructura de una matriz de tamaño 2
mm x 2 mm en una matriz de sondas 10 x 10 = 100.
Los números 1-10 representan
respectivamente una sonda de oligonucleótidos que está depositada
sobre la matriz en una repetición de 8 a 10 veces; "M"
representa una mezcla de marcas (contiene, entre otros, un
oligonucleótido inmovilizado marcado con biotina).
Figura 14: Matriz de sondas después de realizada
la hibridación y conjugación (para la estructura de la matriz
compárese la figura 1).
Hibridación de la diana 2 (100 pM) a 30ºC con
adición directamente a continuación de conjugado de
estreptavidina-oro (500 pg/\mul); 1. etapa de
lavado a 55ºC
a) Imagen de la izquierda: 5 min después del
comienzo de la intensificación de la plata
b) Imagen de la derecha: 10 min después del
comienzo de la intensificación de la plata
Figura 15: Transcurso temporal de la
intensificación de la plata (compárese para esto las figuras 13 y
14).
Medición minuto a minuto, cada punto de medición
es un valor medio de 10 repeticiones de manchas.
pm: sonda de apareamiento perfecto (sonda No.
3)
mm: sonda de desapareamiento (sonda No. 4)
Hibridación de la diana 2 (100 pM) a 30ºC con
adición directamente a continuación de conjugado de
estreptavidina-oro (500 pg/\mul)
Figura 16: Estructura de una matriz de tamaño 2
mm x 2 mm en una matriz de sondas 10 x 10 = 100
Los números 1-10 representan
respectivamente una sonda de oligonucleótidos que está depositada
sobre la matriz en una repetición de 8 a 10 veces; "M"
representa una mezcla de marcas (contiene, entre otros, un
oligonucleótido inmovilizado marcado con biotina en la concentración
10 \muM).
La diana 3 hibridada era complementaria a las
sondas 5, 7, 9 (respectivamente de apareamiento perfecto) y las
sondas 6, 8, 10 (respectivamente de desapareamiento con una
inserción).
Figura 17: Matriz de sondas después de realizada
la hibridación y conjugación (para la estructura de la matriz
compárese la figura 16)
Las imágenes están tomadas de izquierda a derecha
respectivamente 5 min, 10 min y 20 min después del comienzo de la
intensificación de la plata
arriba: hibridación de la diana 3 (1 nM)
abajo: hibridación de la diana 3 (100 nM)
Figura 18: Intensidades de señal después de
intensificación de la plata de distinta duración a 2 concentraciones
de diana diferentes (compárese con las imágenes de la figura 17)
Figura 19 a (arriba) y b (abajo): Transcurso
temporal de la intensificación de la plata en el ejemplo de las
sondas 5 y 6 (compárese para esto la figura 16 a 18)
Cada punto de medición de las sondas es un valor
medio de 7 a 10 repeticiones de puntos.
pm: sonda de apareamiento perfecto (sonda No.
5)
mm: sonda de desapareamiento (sonda No. 6)
a: diana 3 (1 nM): hibridación a 55ºC; conjugado
de estreptavidina-oro (125 pg/\mul)
b: diana 3 (100 nM): hibridación a 55ºC;
conjugado de estreptavidina-oro (125 pg/\mul)
Figura 20: Rectas de regresión lineales
calculadas después de la hibridación con la diana 3 (100 nM y 1 nM)
para dos sondas seleccionadas de la matriz de sondas, válidas para
el intervalo de 4 a 13 minutos después del comienzo de la
intensificación de la plata.
Claims (39)
1. Procedimiento para la detección cualitativa
y/o cuantitativa de dianas de una muestra mediante interacciones
moleculares entre sondas y dianas en matrices de sondas, que
comprende las siguientes etapas:
- a)
- preparación de una matriz de sondas con sondas inmovilizadas en sitios definidos;
- b)
- interacción de las dianas con las sondas dispuestas en la matriz de sondas;
- c)
- realización de una reacción que conduce a un precipitado en los elementos de matriz en los que ha tenido lugar una interacción;
- d)
- detección del transcurso temporal de la formación de precipitado en los elementos de matriz en forma de intensidades de señal;
- e)
- determinación de una intensidad de señal virtual para un elemento de matriz mediante una función curva que describe la formación de precipitado en función del tiempo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la intensidad de señal virtual para un
elemento de matriz se determina en función de la pendiente de una
recta de regresión que describe la formación de precipitado en
función del tiempo.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque la recta de regresión se calcula en el
intervalo de crecimiento exponencial de la formación de precipitado
con el tiempo en el elemento de matriz.
4. Procedimiento según las reivindicaciones 2 ó
3, caracterizado porque la intensidad de señal virtual para
un elemento de matriz se determina mediante multiplicación de la
intensidad de señal detectada respecto a un instante de tiempo
determinado, preferiblemente la intensidad de señal de la última
medición, con la pendiente de la recta de regresión calculada para
el elemento de matriz, así como con la duración de medición respecto
al instante de tiempo determinado.
5. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en la
muestra está presente una diana de referencia con concentración
conocida que interacciona con al menos una sonda de la matriz de
sondas.
6. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque para la
detección del transcurso temporal de la formación de precipitado en
los elementos de matriz se registran las intensidades de señal al
menos cada minuto, preferiblemente cada 30 segundos, con especial
preferencia cada 10 segundos.
7. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
reacción que conduce a la formación de un precipitado en los
elementos de matriz es la transformación de un sustrato soluble en
un producto insoluble en presencia de un catalizador acoplado con
las dianas.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque el catalizador es una enzima.
9. Procedimiento según las reivindicaciones 7 u
8, caracterizado porque la enzima se selecciona del grupo
compuesto por peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y glucosa
oxidasa.
10. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque el sustrato
soluble se selecciona del grupo compuesto por
3,3'-diaminobenzidina,
4-cloro-1-naftol,
3-amino-9-etilcarbazol,
p-fenilendiamina-HCl/pirocatecol,
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, naftol/pironina,
fosfato de bromocloroindoílo, azul de nitrotetrazolio y metosulfato
de fenazina.
11. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la reacción que
conduce a la formación de un precipitado en los elementos de matriz
es la transformación de un sustrato soluble en un precipitado
metálico.
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque la reacción que conduce a la formación
de un precipitado en los elementos de matriz es la reducción química
de un compuesto de plata, preferiblemente nitrato de plata, lactato
de plata, acetato de plata o tartrato de plata para dar plata
elemental.
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque el agente reductor se selecciona del
grupo compuesto por formaldehído e hidroquinona.
14. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque la
transformación de un sustrato soluble en un precipitado metálico
tiene lugar en presencia de clústeres metálicos o partículas
metálicas coloidales acoplados con las dianas.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque la transformación de un sustrato soluble
en un precipitado metálico tiene lugar en presencia de clústeres de
oro o partículas de oro coloidal.
16. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque la
transformación de un sustrato soluble en un precipitado metálico
tiene lugar en presencia de polianiones acoplados con las
dianas.
17. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 16, caracterizado porque los
catalizadores o los clústeres metálicos o las partículas metálicas
coloidales o los polianiones se acoplan a las dianas antes, durante
o después de la interacción con las sondas.
18. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 17, caracterizado porque el acoplamiento
de las enzimas o los clústeres metálicos o las partículas metálicas
coloidales o los polianiones a las dianas tiene lugar directamente o
por moléculas de anclaje acopladas a las dianas.
19. Procedimiento según la reivindicación 18,
caracterizado porque la molécula de anclaje se selecciona del
grupo compuesto por estreptavidina o un anticuerpo.
20. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la reacción que
conduce a la formación de un precipitado en los elementos de matriz
representa el enlace de un ligando específico a una molécula de
anclaje acoplada a la diana.
21. Procedimiento según la reivindicación 20,
caracterizado porque los pares ligando/molécula de anclaje se
seleccionan del grupo compuesto por biotina/avidina y/o
estreptavidina y/o anticuerpo anti-biotina,
digoxigenina/inmuno-
globulina anti-digoxigenina, FITC/inmunoglobulina anti-FITC y DNP/inmunoglobulina anti-DNP.
globulina anti-digoxigenina, FITC/inmunoglobulina anti-FITC y DNP/inmunoglobulina anti-DNP.
22. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las dianas
se proveen directamente con un marcaje.
23. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque tiene lugar un
marcaje de las dianas mediante hibridación sándwich y/o
hibridaciones sándwich con las sondas que interaccionan con las
dianas y un compuesto marcado.
24. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque tiene lugar un
marcaje de las dianas mediante adición de una secuencia
homopolimérica de nucleótidos a las dianas, con formación de una
secuencia continua y una hibridación sándwich posterior con un
oligonucleótido marcado complementario a la secuencia homopolimérica
de nucleótidos.
25. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
interacción entre la diana y la sonda es una hibridación entre dos
secuencias de nucleótidos.
26. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque la interacción
entre la diana y la sonda es una reacción entre una estructura
antigénica y el anticuerpo correspondientes o una región
hipervariable del mismo.
27. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
interacción entre la diana y la sonda es una reacción entre un
receptor y un ligando correspondiente.
28. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
detección de la presencia de un precipitado en un elemento de matriz
tiene lugar mediante reflexión, absorción o difusión de un rayo de
luz, preferiblemente de un rayo láser o de un diodo emisor de luz,
por el precipitado.
29. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 27, caracterizado porque la detección de
la presencia de un precipitado en un elemento de matriz tiene lugar
eléctricamente.
30. Procedimiento según la reivindicación 29,
caracterizado porque la detección eléctrica tiene lugar
mediante mediciones de conductividad, mediciones de capacidad o
mediciones de potencial.
31. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27, caracterizado porque la detección de
la presencia de un precipitado en un elemento de matriz tiene lugar
mediante autorradiografía, fluorografía y/o autorradiografía
indirecta.
32. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27, caracterizado porque la detección de
la presencia de un precipitado en un elemento de matriz tiene lugar
mediante microscopía electrónica de barrido, microanálisis por sonda
electrónica (EPMA), microscopía de Kerr magneto-óptica, microscopía
de fuerza magnética (MFM), microscopía de fuerza atómica (AFM),
medición del efecto espejismo, microscopía de barrido de efecto
túnel (STM) y/o tomografía de reflexión ultrasónica.
\newpage
33. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que comprende las siguientes
etapas:
- -
- detección del transcurso temporal de la formación de precipitado en los elementos de matriz mediante toma de imágenes con una cámara;
- -
- transformación de la información analógica contenida en las imágenes en forma digital;
- -
- cálculo de una intensidad de señal virtual para cada elemento de matriz mediante una función curva que describe la formación de precipitado en función del tiempo;
- -
- transformación de las intensidades de señal virtuales en una imagen artificial que representa las intensidades de señal virtuales de todos los elementos de matriz.
34. Dispositivo para la realización del
procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33,
que comprende:
- a)
- un sustrato de matriz con matriz de sondas,
- b)
- una cámara de reacción,
- c)
- un dispositivo para detectar un precipitado en un elemento de matriz en el que ha tenido lugar una interacción entre dianas y sondas, y
- d)
- un ordenador que está programado para:
- -
- recopilar las intensidades de señal grabadas por el dispositivo de detección;
- -
- garantizar el tratamiento de las intensidades de señal grabadas sucesivamente de modo que se determine el transcurso temporal de la formación de precipitado con el tiempo en un elemento de matriz y se determine una intensidad de señal virtual mediante una función curva que describe la formación de precipitado en función del tiempo; y
- -
- dado el caso, proporcionar la transformación de las intensidades de señal virtuales en una imagen analógica.
35. Dispositivo según la reivindicación 34,
caracterizado porque el dispositivo de detección es una
cámara.
36. Dispositivo según la reivindicación 35,
caracterizado porque la cámara es una cámara CCD o CMOS.
37. Dispositivo según una de las reivindicaciones
34 a 36, caracterizado porque el dispositivo comprende
adicionalmente una fuente de luz.
38. Dispositivo según la reivindicación 37,
caracterizado porque la fuente de luz se selecciona del grupo
compuesto por un láser, un diodo emisor de luz (LED) y una lámpara
de alta presión.
39. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 38, caracterizado porque el dispositivo
como unidad autónoma altamente integrada.
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