DK160336B - Poroest baerelegeme og saet til immunologisk analyse samt deres anvendelse - Google Patents

Description

DK 160336 B

Opfindelsen angår et porøst bærelegeme og et sæt til immunologisk analyse samt deres anvendelse.

Undersøgelser, som direkte eller indirekte afhænger af målinger af antistoffer i serum i patienters blod, udføres i 5 vid udstrækning i klinisk diagnose. Afhængigt af det individuelle antistof, som det drejer sig om i hvert enkelt tilfælde, udføres der rutinemæssigt undersøgelser, der afhænger af veletablerede principper, såsom dannelse af immun-precipitat alene eller i kombination med diffusion og/el-10 ler elektrophorese, fiksering af komplement ved hjælp af antistofantigenkomplekser, agglutinering af erythrocyter ved hjælp af antistoffer, eller direkte måling af antistoffets binding til antigenet. Alle disse principper bruges på en eller anden måde i analysesæt, der er tilgængelige 15 på markedet, og er bestemt til diagnose af tidligere eller nuværende sygdomme. Således fremstilles der specifikke analysesæt til påvisning eller måling af antistoffer, der optræder som følge af virus-, bakterie-, svampe- eller parasit-infektioner. Hvert analysesæt er "skræddersyet" for 20 et specifikt antistof.

En iboende vanskelighed ved de ovennævnte, kendte diagnostiske analysesæt er, at falske positive reaktioner, der ikke har noget med sygdommen at gøre, kan fremkomme som følge af de anvendte metoders høje følsomhed. Positive 25 resultater er normalt kun af betydning, når ændringer i antistoftiteren kan påvises under sygdommens udvikling.

Dette gør det umuligt at drage hurtige slutninger. Når de kendte analysesæt anvendes, foreligger der for den pågældende patient aldrig noget basisniveau for antistoffet 30 for tiden inden sygdommen optrådte.

Dette kunne kun blive muligt, dersom der fandtes en metode, som var tilstrækkelig enkel til,at en læge kunne udføre den i sin privatpraksis eller i et sundhedscenter som en del af rutinemæssige sundhedsundersøgelser, og som 35 samtidigt udviste en tilstrækkelig tilpasningsevne til at gøre det muligt at etablere basisniveauer for et hvilket

DK 160336B

2 som helst antistof, som enten vides at være af klinisk interesse i øjeblikket, eller som kunne tænkes at have klinisk interesse i fremtiden. Ved en sådan undersøgelse ville der fremkomme data vedrørende antistoffer, som ikke på 5 indlysende måde udviser umiddelbar klinisk relevans. Eftersom antistoffer imidlertid er overordentligt specifikke, men ikke absolut specifikke, vil sjældne, tilfældige krydsreaktioner optræde. Dette kan tænkes at skyldes, at antigener udviser tilfældig krydsaktivitet, eller at sygdommen 10 af ukendte årsager fremkalder en fejlfunktion i immun- systemet og fremstilling af et irrelevant antistof. Der foreligger således en mistanke om, at antistoffer imod den inficerende bakterie i rheumatisk feber udviser en krydsreaktion med hjertemuskelvæv, og ved smitsom mononucleose 15 anvendes der i et diagnostisk analyseudstyr heterofile antistoffer, der krydsreagerer med og forårsager agglutination af erythrocyter fra aiidre arter, såsom fra heste.

Opfindelsen, som er nærmere defineret i det følgende, har til formål at undgå alle disse ulemper ved de hidtil kend-20 te analytiske undersøgelser af antigener baseret på påvisning af antistoffer. Opfindelsen sigter på at bidrage til opdagelsen af de nævnte tilfældige krydsreaktiviteter og dannelse af irrelevante antistoffer.

Opfindelsens formål opnås med det porøse bærelegeme ifølge 25 opfindelsen, der er ejendommeligtved, a) at det indeholder et forud valgt mønster af et eller flere afgrænsede adsorptionsområder af antigener eller immunoglobuliner eller begge, som hæfter fast og ikke breder sig ud på overfladen, hvilket mønster kan 30 opnås ved at påføre alikvoter af opløsninger eller suspensioner af et eller flere antigener af immunoglobuliner eller begge ved direkte berøring med bærelegemet ved mekanisk påføring, og

DK 160336 B

3 b) hvor resterende adsorptions-områder uden for eller inden for antigen- eller immunoglobulin-områderne kan være mættet ved tilstedeværelsen af proteiner, der er ikke-speci-fikke med hensyn til deres evne til at reagere med de nævn-5 te antigner eller immunoglobuliner, og analysesættet til immunologisk analyse ifølge opfindelsen, der er ejendommeligtved, at det omfatter et porøst bærelegeme som defineret ovenfor, der er præpareret med antigener eller immunoglobuliner og eventuelt blokerings-proteiner eller 10 kombinationer heraf, bakker eller andet mekanisk udstyr til udførelse af de immunologiske reaktioner, samt reagenser for et indikatorsystem i form af forud præparerede alikvoter eller i dehydreret form.

Opfindelsen sigter således på at anvise et analysesæt, der 15 er særdeles enkelt og er særdeles programmerbart, og som f.eks. gør det muligt at etablere en detaljeret "antistofprofil", hvor der ved sygdomsdiagnoser er gjort maksimal brug af information fra legemets eget sygdomsovervågningssystem.

Det er et uundværligt træk ved analysesættene ifølge opfindel-20 sen, at de omfatter et porøst bærelegeme for antigener eller immunoglobuliner, der er egnet til den immunologiske analyse eller til påvisning af både antistoffer og antigener af en hvilken som helst art, f.eks. medikamenter eller hormoner.

Med betegnelsen "antistof" menes her en specifik klasse af 25 proteinmolekyler, der udmærker sig ved at tilhøre blodets immunglobulinfraktion eller er udskilt af cellekulturer, der er afledt fra immunsystemet, og som udviser en specifik reaktion med en modsvarende ligand, som i nærværende beskrivelse med krav omtales under betegnelsen "antigen".

30 Opfindelsen angår først og fremmest et porøst bærelegeme, som bærer et på forhånd udvalgt mønster af afgrænsede ab- ' sorptionsområder af antigener, og/eller immunoglobuliner, der kan frembringes ved at påføre alikvoter af opløsninger eller suspensioner af et eller flere antigener eller de nævnte | 35 immunoglobuliner ved direkte berøring med bærelegemet.

4 DK 160336 B

De absorberede områder af antigener eller immunoglobuliner på de nævnte bærelegemer kan opretholdes i en tilstand, hvori de er egnet til at reagere med henholdsvis antistoffer eller antigener, der er'indeholdt i en væske, f.eks. et serum, der 5 skal analyseres, også efter at bærelegemet er blevet tørret og har været under opbevaring. Opfindelsen er således navnlig rettet på denne tørrede form af det nævnte organ. Imidlertid er det, inden de ønskede immunologiske undersøgelser udføres, nødvendigt, at alle absorptionsevner for proteiner på*det po-10 røse bærelegemes overflade i de zoner, der ikke dækkes af de påførte antigener eller immunoglobuliner, og også inden for disse zoner, mættes ved at behandle overfladen med ikke-spe-cifikke proteiner eller sera, der indeholder sådanne proteiner. De oprindeligt påførte antigener eller immunoglobuliner 15 vil også under denne behandling blive opretholdt intakte, så at antigen-antistof-reaktionen bliver bevaret, og vil forblive i denne tilstand ved tørring og opbevaring.

Et andet aspekt ved opfindelsen udgøres således af et porøst bærelegeme, der indeholder et på forhånd valgt mønster af af-20 grænsede adsorptionsområder af antigener og/eller immunoglobuliner, der er frembragt ved at påføre alikvoter af opløsninger eller suspensioner af et eller flere antigner eller de nævnte immunoglobuliner ved direkte berøring med bærelegemet og endvidere behandlet med overskud af ikke-specifikke 25 proteiner, hvorved den absorberende overflades samtlige resterende adsorptionsevne bliver blokeret. Ved ikke-specifikke proteiner menes her sådanne proteiner, som ikke krydsreagerer med de specifikke antistoffer, der forventes at forefindes i det serum, der skal analyseres, og som også adskiller sig fra 30 de antigener, der er påført det porøse bærelegeme. Et porøst bærelegeme, der på denne måde er præpareret til umiddelbar anvendelse ved immunologiske undersøgelser, især i den tørrede form, som kan oplagres og anvendes længe efter fremstillingen, er af særlig betydning.

35 Et tredie aspekt ved opfindelsen udgøres af anvendelsen af det porøse bærelegeme eller analysesættet til immunologisk analyse.

DK 160336 B

5

Opfindelsen er baseret på erkendelsen af, at antigener eller immunoglobuliner kan påføres ved direkte berøring af de væsker, der indeholder dem, til det porøse bærelegeme, så at der fremkommer afgrænsede adsorptionsområ-5 der, der - om så ønskes - kan være så begrænsede som muligt, ved på passende måde at begrænse rumfangene af de væsker, der skal påføres, at de således frembragte områder ikke breder sig ud på overfladen, og at antigenerne eller immunoglobulinerne hæfter meget fast til 10 den porøse overflade og kan opretholdes i uændret stand gennem et praktisk taget ubestemt tidsrum og er egnet til reaktion med henholdsvis antistoffer eller antigener i biologiske væsker og til deres påvisning ved hjælp af hvilken som helst kendt immunologisk bedømmelsesmetode. Dersom 15 indretningen eller organet f.eks. omfatter antigener, der er bundet til et fast bærelegeme, kan bundne antistoffer påvises ved brug af et (indikator-)antistof, såsom et radioaktivt mærket (indikator-)antistof eller et (indikator-) antistof, der er koblet med et enzym, der giver en farve- ! 20 reaktion. Ved betegnelsen "indikator" menes her et molekyle, hvortil der er forbundet en gruppe, som under nærmere angivne betingelser frembringer et påviseligt og måleligt signal.

Det har også vist sig, at disse immunologiske undersøgel-25 ser kan udføres, selv med yderst små prikker eller pletter af antigener eller immunoglobuliner, uden forstyrrende indbyrdes virkninger mellem de forskellige påførte antigener eller immunoglobuliner og fremmede stoffer, der er inde- ! holdt i prøvevæskerne. Dette er overraskende i j 30 sammenligning med de forskellige metoder til immunologiske undersøgelser, der kendes inden for den tidligere teknik, navnlig dem, der er omtalt ovenfor. Det er især overraskende, j at den enkle indretning og fremgangsmåden til dens anvendelse ifølge opfindelsen har et særdeles bredt anvendelsesområde 35 og kan anvendes til praktisk taget samtlige antigeniske stoffer, herunder f.eks. proteiner, nucleinsyrer, kulhydrater, fedtstoffer og beslægtede stoffer, samt immunoglobuliner af en hvilken som helst art.

DK 160336 B

6

Teknikkens stade inden opfindelsen kan - bortset fra den opdagelse, der er omtalt i den nedennævnte artikel i Proc. Natl. Acad. Sci. USA, der repræsenterer et afgørende fremskridt i anvendelsen af mikroporøse ark til udførelse af 5 antistof-bindingsundersøgelser på reproducerede elektrophero-grammer - eksemplificeres ved US-patentskrift nr. 4.200.690 og europæisk offentligørelsesskrift nr. 27008. US-patent-skriftet omtaler en metode til at forøge bindeevnen af mikroporøse bærelegemer af nitrocellulose ved hjælp af for-10 skellige komplicerede påførings- eller belægningsprocedurer uden kendskab til den høje iboende bindeevne pr. arealenhed, som nitrocellulose udviser. Yderligere er der i et antal tidligere patentskrifter, der er resumeret i den nævnte europæiske patentansøgning, beskrevet, hvorledes binde-15 evnen kan forøges ved brug af forskellige arter af geometriske udformninger af plastiske overflader eller formstof-overflader med bugtninger eller snoninger, perforeringer, indsatse m.v. Der omtales vanskeligheder ved at opnå en fuldstændig fjernelse af overskydende reagenser fra sådan-20 ne overflader. Et væsentligt træk ved nærværende opfindelse er de mikroporøse arks eller banematerialers høje bindeevne, kombineret med den lethed, hvormed en grundig afskylning kan opnås, f.eks. helt enkelt ved at afgive vaskevæske f.eks. med en vaskeflaske af formstof og derefter hælde 25 overskydende reagens fra.

I den nævnte europæiske patentansøgning nr. 27008 er der beskrevet en metode til at udføre et antal antistof-antigen-reaktioner ved anvendelse af belagte formstofrør og indsatse, i berøring med én og samme væskeprøveportion. I den nævnte 30 patentansøgning anføres det, at det med den i ansøgningen omhandlede opfindelse er muligt at foretage et stort antal undersøgelser på samme tid, og fordelene ved og behovet for sådanne multiple undersøgelser er udførligt beskrevet, men der er kun beskrevet eksempler for to samtidige undersøgel-35 ser, og i praksis kan der næppe udføres mere end to på samme tid. Det centrale træk ved den opfindelse, der er genstand for den nævnte europæiske patentansøgning, er den

DK 160336 B

7 fysiske adskillelse af røret og indsatsen efter reaktionen og den særskilte tælling af bunden radioaktivitet. Det er indlysende, at antallet af undersøgelser, der kan udføres med den nævnte opfindelse, kunne forøges ved anvendelse 5 af multiple isotopteknikker, kombineret med den radioimmunologiske undersøgelse, men det nævnte antal kan i | praksis ikke forøges med henblik på rutineundersøgelser ved anvendelse af mere end to isotoper på grund af de komplicerede radioaktivitets-bestemmelser. Dette ville i 10 så fald give et maksimum på fire samtidige undersøgelser.

De givne eksempler omhandler også udelukkende anvendelsen i radioimmunologiske undersøgelser. Til forskel herfra er nærværende opfindelse baseret på den høje bindeevne pr. arealenhed i kombination med den høje iboende opløsnings-15 evne, som de mikroporøse bærelegemer udviser, til at muliggøre en ubegrænset forøgelse i antallet af samtidige undersøgelser. Ydermere er de i det nævnte europæiske offentliggørelsesskrift nr. 27008 omhandlede eksempler begrænset til brug af specifikke antistoffer, der er bundet til bære-20 legemet, og som er bestemt til måling af de modsvarende antigener. Nærværende opfindelse gør det muligt at anvende metoden med et i princippet ubegrænset antal af forskellige antigener til måling af deres modsvarende antistoffer, samt også anvendelsen af bærelegemet for antistoffet, som 25 så vil danne binding med deres modsvarende specifikke antigener, og anvendelsen af specifikke reagenser, .. hvormed det er muligt at identificere antigen-antistof-komplekser, såsom komplement-komponenter.

I en artikel med titlen "Electrophoretic transfer of pro-30 teins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:

Procedure and sane applications", der er offentliggjort i Proc. Natl. Acad. Sci. USA, bind 76, nr. 9, side 4350-4354, september 1979, er der beskrevet en metode til elektroforetisk overførsel af proteiner fra en gel til et mikro-35 porøst ark eller banemateriale og til påvisning af disse proteiner ved immunologiske bedømmelsesprocedurer, der indebærer anvendelsen af antistoffer. Den elektroforetiske

DK 160336 B

8 overførsel af proteinerne giver en tro reproduktion af det oprindelige mønster, der er indeholdt i gelen, på et nitrocelluloseark. Antistof-undersøgelserne med sådanne overførte elektropherogrammer udføres, efter at de reste-5 rende adsorptionsevner for nitrocellulosearket er blevet mættet ved inkubation med et ikke-specifikt protein, hvilket træk også er optaget i nærværende opfindelse. De ovenfor omtalte immunologiske bedømmelser med elektroforetisk overførte proteiner er gjort mulige af den kendsgerning, 10 at der ikke finder nogen udveksling sted mellem de elektroforetisk opsugede specifikke proteiner og de ikke-spe-cifikke proteiner, der anvendes til blokering af bærelegemets resterende adsorptionsevne. Ifølge opfindelsen har det vist sig, at det er muligt på denne måde at bevare 15 sådanne bundne antigener intakt imod en hvilken som helst forstyrrende vekselvirkning med de ikke-specifikke proteiner, der er anvendt til blokering af de resterende adsorptionssteder (baggrundsadsorption), samt at opnå langvarige inkubationer ved antistofbedømmelsen, også i de tilfæl-20 de, hvor antigenerne og/eller immunoglobulinerne påføres direkte, dvs. i fravær af eventuelle elektriske felter, og denne opdagelse er den afgørende faktor for udviklingen af indretningerne eller organerne ifølge opfindelsen og disses anvendelse til antistofanalyse. Det er også over-25 raskende, at der under de videre inkubationer med antisera og indikatorantistoffet ikke optræder nogen forstyrrende sidereaktioner, f.eks. udveksling med de adsorbe-rede ikke-specifikke proteiner. Ydermere kunne det ikke antages, at den tidligere elektroforetiske metode kunne 30 forbedres og gøres kvantitativ ved den enkle direkte påføring af antigenet. På grund af den høje opløsningsevne, som den nye metode udviser, når den anvendes med bærelegemet med et stort antal mikroskopiske prikker eller pletter af antigener, kan den programmeres næsten i det uendelige, 35 idet den på samme tid er yderst enkel at udføre. Dersom det er hensigten af udføre den immunologiske analyse af antistoffet ifølge opfindelsen på en kvantitiv basis, kan immunoglobuliner efter ønske sammen med antigener anbringes

DK 160336 B

9 på det porøse bærelegeme, idet kendte mængder af immunoglobuliner påføres det faste bærelegeme sammen med antigenerne. Disse immunoglobuliner vil så reagere med | indikatorantistoffet til frembringelse af en påviselig 5 reaktion, der kan anvendes som grundlag for sammenligning med den tilsvarende reaktion af immunoglobuliner, der er bundet til antigenerne. Fremgangsmåden til immunologisk analyse ifølge opfindelsen kan således kalibreres ved anvendelse af en passende intern standard, der er ba-10 seret på kendte mængder af f.eks. humane immunoglobuliner. Eftersom det er muligt at anvende metoden til at bestemme et stort antal antistoffer samtidigt, vil det være let at opdage tilfældigt fremkaldte antistoffer, som enten krydsreagerer med et eller andet andet antistof, eller som man 15 tidligere ikke vidste kunne fremkaldes af sygdommen. Ved hjælp af fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det endvidere muligt at sammenføje samtlige kendte diagnostiske prøver, der afhænger af bestemmelsen af individuelle antistoffer, til dannelse af en enkelt universel prøve.

20 Når betegnelsen "forud valgt" er anvendt ovenfor i forbindelse med det mønster, der skal dannes på indretningerne eller organerne ifølge opfindelsen, skal dette forstås derhen, at den geometriske udformning af områderne med det adsorberede antigen eller immunoglobulin er blevet ud-25 tænkt med henblik på at tjene den påtænkte immunologiske bedømmelses formål.

Det porøse bærelegeme kan bestå af et hvilket som helst materiale med tilstrækkelig overfladeporøsitet til at give adgang til immunoglobuliner og en passende overflade-30 affinitet til at binde antigener. I almindelighed foretrækkes mikroporøse strukturer, men materialer, som i den hydratiserede tilstand udviser gel-struktur, kan også anvendes. Hvad deres kemiske egenskaber angår, kan disse materialer være: 35 A) Naturlige polymere kulhydrater og deres syntetisk modificerede, krydsbundne eller substituerede derivater, såsom

DK 160336 B

10 a) agar, agarose, krydsbunden alginsyre, substituerede og krydsbundne guar-guminier, krydsbundne dextran-polymere og stivelser, b) regenererede celluloser, cellulose-estere, især med salpetersyre og carboxylsyre, blandede cellulose-5 estere, cellulose-ethere, især med lavere aliphatiske alkoholer.

B) Naturlige ni-trogenholdige polymere, såsom proteiner og derivater heraf, f.eks. krydsbundet eller modificeret gelatine.

10 C) Naturlige hydrocarbon-polymere, såsom latexer og gummimaterialer.

D) Syntetiske polymere, der kan fremstilles med passende porøse strukturer, såsom a) vinyl-polymere, såsom poly-ethylen, polypropylen, polystyren, polyvinylchlorid, po- 15 lyvinylacetat og dettes partielt hydrolyserede derivater, polyaerylater, polyacrylamider, polymethacrylater, b) copolymer e og terpolymere af de ovennævnte vinyl-monomere indbyrdes og med andre monomere, c) polykondensationspro-dukter, såsom polyestere, polyamider, d) additionspolymere, 20 såsom polyurethaner eller polyepoxider.

E) Uorganiske materialer, der kan fremstilles i en passende porøs form, såsom sulfater eller carbonater af jordalkali-metaller og magnesium, f.eks. bariumsulfat, calciumsulfat, calciumcarbonat, magnesiumcarbonat, eller silicater af 25 alkali- og jordalkalimetaller og/eller aluminium og/eller magnesium, og aluminium- eller silicium-oxider eller -hydrater, såsom lerarter, alumina, talk, kaolin, zeolit, silicagel, glas. Disse materialer kan bruges som de er eller som fyldstoffer i et af de ovenfor nævnte polymere materialer.

30 F) Blandinger eller copolymere af de ovenfor omtalte klasser, såsom podnings-copolymere, der er frembragt ved at udløse polymer!sering af syntetiske polymere på en forud eksisterende naturlig polymer.

DK 160336 B

11

Alle disse materialer kan bruges, som de er, i passende former, såsom folier, baner, plader, cylindre m.v., eller de kan påføres som en belægning på eller hæftes eller lamineres på dertil egnede, inaktive bærere, såsom papir, 5 glas, formstoffolier,metalfolier, tekstiler. Indretningen ifølge opfindelsen er fortrinsvis i form af banematerialer med tykkelse i området mellem omtrent 0,01 mm og 0,5 mm, fortrinsvis omtrent 0,1 mm. Porestørrelsen kan variere indenfor vide grænser, fortrinsvis mellem om-10 trent 0,025 og omtrent 15 mikron, især mellem omtrent 0,15 mikron og omtrent 15 mikron.

Disse bærelegemers overflader kan aktiveres ved hjælp af kemiske processer, der forårsager dannelsen af covalente bindinger mellem antigenerne og/eller immunoglobulinerne 15 og bærelegemet. Den irreversible binding af antigenet eller antistoffet fremkommer imidlertid i almindelighed ved ' adsorption på det porøse materiale ved hjælp af hydrofobe kræfter, som man i øjeblikket ikke ved meget om. Fortrinsvis anvendes der en mikroporøs cellulose-ester, f.eks. en 20 ester af cellulose med en aliphatisk carboxylsyre, såsom en alkancarboxylsyre med fra 1 til 7 carbonatomer, f.eks. eddikesyre, propionsyre, eller en hvilken som helst af smørsyrerne eller valerianesyrerne. Imidlertid kan der også med fordel anvendes banemateriale af nitrocellulose, 25 idet der med denne betegnelse skal forstås en hvilken som helst salpetersyreester af cellulose, om ønsket i blanding med en af de nævnte carboxylsyrecellulose-estere. Der kan således anvendes rene nitrocellulose-estere, der består af en ester af cellulose med omtrent tre nitratgrupper for 30 hver seks carbonatomer. Et materiale på basis af nitrocellulose, der har vist sig særdeles velegnet til fremstilling af organer eller indretninger ifølge opfindelsen, forhandles under handelsnavnet "Millipore" (fra firmaet Millipore,

Bedford, Mass. U.S.A.) og har en porestørrelse på 0,45 3 5 mikron.

DK 160336 B

12

Antigenerne eller iramunoglobulinerne påføres det beskrevne bærelegeme ved direkte berøring, med hvilken betegnelse der skal forstås en hvilken som helst mekanisk overførsel, enten manuel, f.eks. ved hjælp af kapillarrør el-5 ler pipetter eller sprøjter eller ved hjælp af væskeformige eller gasformige drivmidler i form af finfordelt eller forstøvet væske, f.eks. ved hjælp af en passende rettet strøm af luft eller gas, eller en eller anden art skabelon eller påføringsorgan, der er miniaturiseret ved hjælp af 10 metoder, som er almindeligt praktiseret indenfor mikroelektronikken, ved anvendelse af litografiske eller lignende metoder, eller ved fremdrift af elektrisk ladede dråber, således som det kendes fra hurtig elektronisk skrivning. Prøveportionen kan påføres således, at den antager en 15 hvilken som helst egnet geometrisk form, idet de formede adsorptionsområder foreligger i form af f.eks. prikker, pletter eller streger, eller en hvilken som helt anden konfiguration, der er egnet til formålet. Mønsteret kan indeholde et stort antal antigener eller kun nogle få 20 eller også kun et enkelt. Antigen-væskerne eller -seraer-ne påføres fortrinsvis i små rumfang, f.eks. i alikvoter, der er mindre end 1 mikroliter, især mindre end 0,1 mikro-liter. På denne måde kan der frembringes mikroskopiske prikker på den porøse overflade. Mikroskopiske prikker, 25 hvis diameter f.eks. er mindre end 2 mm, især mindre end 0,5 mm, er mest velegnede til sammenstuvning af det størst mulige antal antigener og/eller immunogluboliner, f.eks. på et todimensionalt område eller mønster, idet linier eller streger, f.eks. med en bredde på omtrent 2 mm eller 30 mindre, f.eks. 1 mm, kan være mest velegnede til et mere begrænset antal antigener eller antistoffer, hvor resultaterne uden videre kan synliggøres eller kvantiseres af en eller anden form for mekanisk afsøgningsapparat. Et sådant mønster af parallelle linier eller streger kan så 35 opskæres til dannelse af mange strimler på en måde, der bidrager til at gøre det muligt at masseproducere prøveud-

DK 160336 B

13 styret.

Et typisk prøveorgan ifølge opfindelsen til antistofanalyse af sera kan f.eks. være i den form, der er vist på tegningen, som viser prikkerne eller pletterne som fremkaldt ef-5 ter nedsænkning i de forskellige sera, der skal analyseres, og gjort synlige ved reaktion med indikator-antistoffer, der er koblet med enzymet, som er i stand til at give en farvereaktion med dets substrat. Standarderne 1 til 3 er normalt humant serum i passende fortyndinger. Organer af 10 disse typer kan anvendes til at udføre multi-parameter-ana-lyse efter antistoffer. Tilfældet med prøvesæt, der har et enkelt antigen anbragt på det faste porøse bærelegeme, er især af betydning for søgning efter hybridomer, der frembringer monokloniske antistoffer.

15 Analysesættene ifølge opfindelsen kan programmeres uden begrænsninger eller restriktioner, eftersom et hvilket som helst antal antigener eller kombinationer af antigener eller immunoglobuliner kan være om- \ fattet af en enkelt prøveprocedure og kan i så fald analy-20 seres i en enkelt operation. Opfindelsen anvendes derfor f.eks. til at overvåge koncentrationer af antistoffer, som normalt er endemiske, men som kan variere i en patologisk situation, eller til at påvise tilstedeværelsen og mængden af antistoffer, som kun findes i en patologisk situa-25 tion. Når nitrocellulose anvendes som porøst materiale for bærelegemet, fortrinsvis i form af ark eller banemateriale, er det overraskende, hvor høj systemets opløsningsevne er. Når en prøveportion påføres gennem et mikrokapil-larrør, forbliver prikken eller pletten yderst lille, i 30 sub-millimeter-området, og den breder sig ikke ud under de efterfølgende behandlinger og reaktioner. Sådanne antigen-ark med mikroskopiske prikker kan anvendes til påvisning af tilstedeværelsen og mængden af antistoffer i humane sera indenfor et yderst vidt område.

35 Når de udvalgte antigener og/eller immunoglobuliner er blevet monteret eller anbragt på den nævnte måde på det

DK 160336 B

14 porøse bærelegeme, må indretningen underkastes en yderligere behandling, før det kan anvendes til immunologiske undersøgelser, med henblik på at blokere overskydende bindingssteder på det porøse materiale. Dette gø-5 res ved at inkubere det nævnte bærelegeme, der indeholder mønsteret af antigener og/eller immunoglobuliner, med ikke-specifikke proteiner eller med en blanding af sådanne proteiner, eller med total-serum eller en hvilken som helst kombination af disse ingredienser alene og/eller sammen 10 med den til de efterfølgende immunologiske undersøgelsestrin hørende ingrediens. Den eneste begrænsning består i, at de nævnte proteiner ikke bør forstyrre eller krydsreagere med nogle af henholdsvis antistofferne eller antigenerne i de immunologiske undersøgelser, og - selvsagt -15 at de adskiller sig fra'de proteiner, der er anbragt på bærelegemet. Blokeringen af disse resterende adsorptionssteder kan også udføres trinvis. Således kan et forberedende trin bestå i, at bærelegemet, der indeholder de fikserede antigener eller antistoffer, inkuberes med bovint 20 serum-albumin. Med fordel kan sådanne proteiner fortyndes med fysiologisk saltopløsning, hvorpå organet inkuberes med dem, fortrinsvis ved svagt forhøjede temperaturer, f.eks. mellem 30 og 50°C, fortrinsvis ved 40°C, og skylles med fysiologisk saltopløsning. Efter denne forbereden-25 de behandling kan der vedblivende findes protein-binding-steder, som endnu ikke er blevet fuldstændigt blokeret, og som også skal blokeres, når der skal udføres immunologiske prøver. Hvis der er baggrunds-adsorption på grund af tilbageblivende bindings-steder eller udveksling af det 30 ikke-specifikke protein, kan dette forhindres ved at udføre inkuberingen med det første antiserum og det med indikator-antistoffet i det kontinuerlige nærvær af det samme ikke-specifikke protein og yderligere i nærvær af total-serum som bærestof, afledt fra en art, der adskiller 35 sig fra den art, hvortil prøve-antistoffet hører. Den fortsatte tilstedeværelse af disse blandinger af proteiner vil både blokere tilbageværende bindings-steder og vil være tilbøjelig til ved konkurrence at forhindre udveksling 15 DK 160336 B j af antistofferne med proteiner, som tidligere er blevet bundet til ikke-specifikke steder, eller ikke-specifik i interaktion af en hvilken som helst art med immunoglobuli-ner. Det således anvendte bæreserum bør ikke være fra en ! 5 art, der indeholder immunoglobuliner, som krydsreagerer med indikator-antistoffet.

I tilfælde af en immunologisk undersøgelse til påvisning af antistoffer kan det på den ovenfor omtalte måde præparerede organ f.eks. inkuberes med det antiserum, der 10 skal analyseres, i en fortynding svarende til den forventede antistofkoncentration, i regelen i området mellem 1:100 og 1:10.000 i blokeringsopløsning, f.eks. mellem 2 timer og fra den ene dag til den næste ved stuetemperatur, hvorpå det underkastes en udstrakt skylning med fysiologisk 15 saltopløsning med henblik på at fjerne overskydende ikke-bundne antistoffer. Indikator-antistoffet er radioaktivt i mærket, fluorescereiide eller luminescerende eller konjugeret med et fluorescerende stof, eller med et enzym, der er i stand til at give en farvereaktion med dets substrat. In-20 dikatorantistoffet fortyndes i regelen omtrent 1000 gange j i en blanding af den ovenfor nævnte blokeringsopløsning, inkuberes f.eks. i 2 timer og skylles igen i fysiologisk saltopløsning.

Disse metoder udøves i overensstemmelse med i sig selv 25 kendte teknikker og under anvendelse af kendte indikatorer, herunder staphylokokprotein A. Således kan f.eks.

125 immunoglobulin, der er mærket med I, anvendes i autoradiografi, immunoglobulin konjugeret med fluorescein i den fluorometriske metode eller med peberrodperoxidase 30 i den enzym-immunologiske metode, med anvendelse af o-dianisidin i nærvær af hydrogenperoxid, som substratet for peroxidasen til fremkaldelse af en farvereaktion, i tilfælde af peberrod-peroxidase-metoden, idet det far- f vede reaktionsprodukt er uopløseligt og forbliver immo-35 biliseret på dannelsesstedet.

DK 160336 B

16

Alle arter af antistofholdige væsker fra en patient, såsom serum, plasma, cerebrospinalvæske, colostrum, lymfevæske, mælk, spyt, urin, afføring m.v. kan analyseres med analysesættene ifølge opfindelsen.

5 Påvisningen af antigenerne på det porøse bærelegeme kan udføres, som nævnt ovenfor, med et egnet indikator-antistof eller med en komponent af komplementsystemet eller med et koblet enzymsystem, der er følsomt overfor antigen-antistof-reaktionen. Dette indikator-antistof kan også ud-10 gøres af et hvilket som helst antistof, der vil reagere specifikt med humane eller dyriske immunoglobuliner, eller klasse-specifikke antistoffer, som kun vil reagere med en enkelt ønsket antistof-klasse, såsom IgG, IgM, IgA, IgD eller IgE eller en hvilken som helst ønsket kombination af 15 sådanne specifikke immunoglobuliner. IgM-antistoffer er af speciel interesse, eftersom de er karakteristiske for nylige eller nuværende infektioner, medens IgE er karakteristisk for allergier.

Dersom der anvendes enzymer, der er koblet med indikator-20 antistofferne, skal disse enzymer være sådanne, som kan lokaliseres, eller hvis mængde kan konstateres ved enzymets dannelse af et radioaktivt luminescerende eller fluorescerende produkt eller et produkt med et karakteristisk absorptions- eller refleksions-spektrum i det synlige område 25 eller uden for dette, idet det eneste krav, der stilles, er, at påvisningsreagensen eller reaktionsproduktet forbliver på det sted, hvor antigen-antistof-komplekset er beliggende. Når komplement anvendes til at påvise det bundne antigen-antistof-kompleks, kan det enten selv være mærket på en 30 hvilken som helst af de ovenfor omtalte måder eller være indrettet til igen at kunne påvises ved hjælp af et specifikt anti-komplement-antistof, der er mærket på en hvilken som helst af de ovennævnte måder.

Det porøse bærelegeme ifølge opfindelsen kan være i form af 35 f.eks. nitrocellulose-ark, således som disse fremtræder umid- ]

DK 160336 B

17 delbart efter påføringen af antigenerne. Sådanne indretninger : kan tørres og oplagres på ubestemt tid ved stuetemperatur under forudsætning af, at de holdes i en dehydreret tilstand.

Det porøse bærelegeme ifølge opfindelsen kan imidlertid for-5 trinsvis være i den form, hvori det fremtræder efter inkubering med proteiner med henblik på blokering af resterende adsorptionsevne, enten i et eller flere trin. Også i dette tilfælde kan bærelegemet, når det er tørret, opbevares på ubestemt tid ved den nævnte temperatur, når det er beskyttet mod fugtighed, 10 og denne form er af særlig kommerciel betydning.

Ved fremgangsmåden til anvendelse af det porøse bærelegeme ifølge opfindelsen til immunologisk analyse nedsænkes bærelegemet, der indeholder antigenerne og/eller immunoglobulinerne, 15 efter at være blevet behandlet med ikke-specifikke proteiner (anden indretning), i den væske, der skal analyseres, f.eks. serum eller plasma fra en dyrisk eller menneskelig patient eller fra en person, der undergår en rutinemæssig sundhedsundersøgelse, hvorpå det dyppes i en fortyndet 20 opløsning eller suspension af et indikator-antistof, der er rettet på immunoglobuliner hos den dyreart, hvorfra den væske, der skal analyseres, kommer, f.eks. antihumane immunoglobuliner, såsom et enzym-koblet antistof, hvis enzymreaktionsprodukt er uopløseligt. Det sidste trin er 25 synliggøreisen af det bundne andet antistof, idet den foretrukne reaktion er oxidation af 4-chlor-l-naphthol til dannelse af et uopløseligt farvet produkt. De sidste trin er tilstrækkeligt enkle og hurtige - hele operationen kan udføres på 3 timer eller mindre - til at de er praktisk i 30 gennemførlige i privat lægepraksis.

i I visse tilfælde er det tilrådeligt eller nødvendigt at udføre en grundig tørring af det porøse bærelegeme efter påføringen af antigenerne. Bærelegemet kan fortrinsvis lufttørres i mindst 1 time ved omgivelsernes temperatur. I til- 35 fælde af nucleinsyre er det nødvendigt at foretage en bagning, hvad der kun er valgfrit for andre antigener, uden

DK 160336 B

18 at være skadelig. Det udgør således et særligt aspekt ved opfindelsen, at analysesættene, således som de fremkommer ved direkte påføring af et antigen, underkastes bagning før yderligere behandling, især når nucleinsyreantigener 5 indgår i programmet. Bagningen udføres bekvemt i temperaturområdet fra omtrent 60°C til omtrent 120°C, fortrinsvis ved omtrent 80°C,i et tidsrum, der kan variere fra omtrent 5 minutter til omtrent 12 timer, f.eks. 1 time.

Det vides fra teknikkens stade, at denaturerede nuclein-10 syrer bindes til nitrocellulose under sådanne betingelser.

Det kunne ikke forudses, at naturligt forekommende DNA også ville bindes under de beskrevne betingelser, heller ikke at nogen nucleinsyre ville forblive bundet og udegraderet under antistofundersøgelsens betingelser.

15 Den grundliggende procedure ved udførelsen af en immunologisk undersøgelse med analysesættene ifølge opfindelsen er som følger: Det nævnte organ dannes ved påføring af antigenet på et fast bærelegeme som beskrevet ovenfor.

Der er i princippet to varianter, nemlig "enkeltprikme-20 toden", som kun anvendes, når der kun har været påført et enkelt antigen, og prøverne skal underkastes en søgning efter tilstedeværelsen af det modsvarende antistof, og "mangeprikmetoden", når mere end ét antigen påføres med henblik på prøvning af et eller flere antistoffer. I mange-25 prikmetoden kan anbringelsen af antigenerne på det porøse bærelegeme, f.eks. på et nitrocellulose-ark, være endimensional eller todimensional, således som det allerede er blevet påpeget. Dersom det endelige arrangement skal bestå af et endimensionalt mønster, påføres prøveportionerne som 30 en række parallelle streger eller linier, og en intern standard-serie af kendte koncentrationer af f.eks. total-immunoglobuliner påføres på den samme måde.

Bærelegemets resterende bindeevne blokeres ved at gennemvæde bærelegemet, f.eks. arket, i en stødpude-saltopløs-35 ning plus "blokeringsopløsninger",f.eks. 10% hesteserum, 19 ; DK 160336 B ; [ f.eks. i 2 timer ved 40°C, hvorpå det tørres. Prøve-bære-legemet kan derpå opbevares og forsendes i tør tilstand i denne form eller efter fraskæring af individuelle prø- vestrimler, f.eks. vinkelret på antigen-linierne. Strim-5 lerne kan være så tynde, som det er praktisk muligt, men bør ikke være mere end 3 mm brede. Hvad selve prøven eller undersøgelsen angår, kan samtlige reagenser uden videre opbevares i lyofiliseret fom i dertil egnede alikvoter og rekonstitueres til prøven. Det serum, der skal under-10 søges, fortyndes med en passende faktor i saltopløsning, der indeholder blokeringsopløsning. Fortyndingsfaktorer i området 1:100, 1:1000 og 1:10000, dækker de fleste anvendelser. Strimmelen nedsænkes i en af disse fortyndede opløsninger, f.eks. i en éngangs-brøndindsats af den type, 15 der anvendes med automatiserede mikrotiter-fortyndingsud-styr, og som anvendes som reservoir til samtidig tilførsel af et stort antal identiske prøveportioner til brønde med i mikrotiter-plader. De enkelte brønde er i regelen 10 cm j lange, 4 mm brede og 1 cm dybe. Strimlerne inkuberes i j 20 disse fortyndede opløsninger f.eks. fra 2 timer til fra den ene dag til den anden ved stuetemperatur under forsigtig omrøring. Derpå udvaskes overskydende serum med stødpudesaltopløsning, idet man f.eks. vasker grundigt tre gange. Tidspunkterne for vaskningerne er ikke kritiske.

25 Derpå tilsættes prøveportionerne af indikator-antistoffet.

Dette er i regelen en opløsning på 1:1000 pr. oxidase-koblet gede-antihuman-IgG (tung plus let kæde), og behandlingen fortsættes i op til 2 timer. Fortyndingen er også i regelen den samme i blokeringsopløsningen. Derpå udva-30 skes indikator-antistoffet grundigt ved den samme procedure, f.eks. tre gange 10 minutter. Derpå gøres indikator-antistoffet synligt ved en dertil egnet fremgangsmåde, såsom med fluorescens, autoradiografi eller et egnet substrat for det koblede enzym. I tilfælde af peroxidase kunne 35 der som substrat anvendes o-dianisidin eller chlornaphthol i nærvær af hydrogenperoxid. Derpå gives farvereaktionen lejlighed til at udvikle sig, f.eks. fra 1/2 til 2 timer. Derpå aflæses de enkelte antistof-titere ved valg af |

DK 160336 B

20 det oprindelige serums bedste fortyndingsfaktor og ved sammenligning af farveintensiteten med standardseriens farveintensitet. Farveintensiteten kan også aflæses direkte ved hjælp af et eller andet densitometrisk udstyr, 5 enten ved at nedsænke strimmelen i et medium med et passende brydningsindeks, så at den gøres gennemsigtig, og aflæse transmissionen, eller ved at anvende et udstyr, der er indrettet til at måle den reflekterede intensitet. Udstyr af den art, der anvendes til måling af farveintensi-10 tet på tyndlagskromatogrammer, er egnet for det sidstnævnte formål, og det samme udstyr kan også anvendes til at måle fluorescens-intensitet. Når indikator-antistoffet har et fluorescerende mærke eller et fluorogent substrat af et enzym, kan det også måles eller bedømmes kvantita-15 tivt ved hjælp af et sådant udstyr.

Når titeren bestemmes ved anvendelse af en kalibreringsrække med en intern standard baseret f.eks. på et normalt humant serum eller et rent humant immunoglobulin, er enheden den brøkdel af total-immunoglobulinet, der findes 20 i form af en specifik antistof-klasse eller en simpel koncentration af det nævnte antistof som masseenheder pr. volumenenhed af det oprindelige serum. Denne enhed har da et bredt anvendelsesområde til sammenligning af sera eller plasma fra forskellige individer, selv med forskel-25 lige bedømmelsessystemer.

En mere specifik og foretrukken metode til at udføre de immunologiske undersøgelser ifølge opfindelsen er beskrevet i det følgende: A) Enkeltprikmetoden: 30 (1) Præparering af ark. På et ark nitrocellulose tegnes et retvinklet gitter med sider på mindre end 4 mm, eller der anvendes et nitrocellulose-ark, hvorpå der allerede er trykt et gitter på 3 x 3 mm (Millipore Corporation).

Arket vaskes med destilleret vand i 5 minutter og gives 35 lejlighed til at tørre ved stuetemperatur. Under de føl- DK 160336 B j 21 . gende operationer bør arket manipuleres med sløve eller afrundede pincetter. Vaskningen eller skylningen er ikke altid nødvendig.

(2) Prikning. Når arket er tørt, anbringes en lille dråbe 5 antigenopløsning i hver firkant. Koncentrationen vil variere fra det ene antigen til det næste. Ved komplekse antigener er 0,1 til 1,0 mg/ml passende, og ved en mindre kompleks blanding kan koncentrationen formindskes tilsvarende.

Det er ofte fordelagtigt at tørre arket grundigt på dette 10 stadium, eftersom tørringen kan stabilisere bindingen. Binding af nucleinsyre kræver 2 timer ved 80°C. Det antigenprikkede ark kan opbevares tørt på ubestemt tid ved omgivelsernes temperatur uden noget som helst tab af aktivi tet. Prikkerne bør være så små som muligt. Til dannelse 15 af pletter er det bekvemt at anvende en 20 mikroliters mikropipette, alternativt kan en 5 mikroliters Drummond-mikrodispenser anvendes til prikning af 0,5 mikroliter eller en Hamilton-doseringssprøjte til prikning af 0,1 mikroliter. Dersom antigenet er meget fortyndet, er det 20 muligt at påføre på hinanden følgende doser på det samme i sted, idet der drages omsorg for, at arket får lejlighed i til at tørre efter hver påføring. Arket vaskes eller skylles derpå i TBS, der kan bestå af 0,15-0,2 M NaCl, 0,01- i 0,05 M tris-HCl, med pH 7,4-7,8. De enkelte firkanter kan 25 udskæres, enten medens nitrocellulosen endnu er våd, eller i en tør tilstand. Det kan skæres med et skalpelblad i våd tilstand eller med en saks sammen med det underlagspapir, hvormed det leveres (dette beskytter arket mod at revne under opskæringen). Firkanterne anbringes med forsiden 30 opad i brønden i en mikrotiter-bakke med 96 brønde (Costar Inc., Cambridge, Mass.).

(3) Blokering. I hver brønd tilsættes 150 mikroliter blokeringsopløsning, som kan være bovint serum-albumin, helt j serum eller en hvilken som helst kombination. Det bovine 35 serum-albumin kan være 3%, mens helt serum fra kanin, hest eller ged kan være fra 1 til 10%. Det kan somme tider være

DK 160336 B

22 nødvendigt at dekomplementisere serumet ved at opvarme blokeringssystemet i 30 minutter ved 56°C. Blokeringen udføres i fra 15 minutter til 2 timer ved temperaturer mellem omgivelsestemperaturen og 40°C. De således præpa-5 rerede ark kan også opbevares i ubestemt tid uden tab af aktivitet.

(4) Primær inkubering. Blokeringsopløsningen suges bort ved hjælp af en pipette, f.eks. en Pasteur-pipette, der er forbundet med en sugeledning, og antistof-prøveopløs- 10 ningen (primært antistof) tilsættes. 150 mikroliter pr.

brønd er rigeligt, men halvt så meget vil være tilstrækkeligt. Inkuberingstiden vil variere fra det ene antistof til det andet. For de fleste anvendelser er mellem 2 og 4 timer tilstrækkeligt, men ved at lade inkuberingen løbe 15 fra den ene dag til den næste kan der opnås så meget som en tidobling af følsomheden. Antistoffortyndinger bør omdannes til blokeringsopløsninger.

(5) Vaskning. Antistof-prøvevæsken fjernes fra brøndene, f.eks. ved udhældning, og bærelegemet vaskes mindst fire 20 gange, fortrinsvis med en TBS-opløsning, og varigheden af vaskningen kan være hvad som helst fra nogle få minutter til mange timer.

(6) Sekundær inkubering. Bærelegemet inkuberes i f.eks.

2 timer i 100-150 mikroliter peberrod-peroxidase-konjuge-25 ret anti-"primær-art"-immunoglobulin under forsigtig rystning ved stuetemperatur, idet "primær-arten" er den art, hvortil det antistof, der skal prøves, hører. Dersom det primære antistof er frembragt f.eks. i mus, anvendes der enten peroxidase-konjugeret ged-anti-mus-IgG, f.eks. fra 30 Nordic Laboratories, Tilburg, Holland, eller kanin-anti-mus-IgG, f.eks. fra DAKO, København, Danmark. I tilfælde af, at kaninsera eller humansera skal analyseres, kan tilsvarende passende sekundære (indikator-)antistoffer, f.eks. også fra de ovennævnte selskaber, anvendes. Til på-35 visning af specifikke antistofklasser kan klasse-speci-

DK 160336 B

23 ! j fikke sekundære antistoffer, således som de, der er speci- | fikke for IgG, IgA, IgM, IgD og IgE, som også kan fås f.eks. fra ovennævnte Nordic Laboratories, anvendes. Koncentrationen af antistofvæsken - som fortrinsvis skal an-5 vendes i blokeringsopløsningen, selv om andre opløsningsmidler også kan anvendes - afhænger af den pågældende antistofportion, men en tusindedel antistofvæske i blo keringsopløsningen foretrækkes.

(7) Den under (5) beskrevne vaskning gentages her med hen-10 blik på at fjerne det andet antistof.

(8) Fremkaldelse. 4-Chlor-l-naphthol (Merck), o-dianisidin eller 3,3-diaminobenzidin kan anvendes som chromogene substrater for peroxidasen. 4-Chlor-l-naphthol tilberedes som en 3 mg/ml lageropløsning i methanol, som kan opbeva- 15 res i op til 1 uge i mørke og under afkøling. Umiddelbart inden anvendelsen bør den fortyndes med mellem 5 og 30 rumfang TBS og gøres til 0,01-0,03% i H2®2' ^er * regelen kan fås som en 30%'s vandig opløsning. For hver brønd behøves omtrent 100 til 150 mikroliter .jfremkåldningsopløsning.

! 20 Positive farvereaktioner begynder at vise sig efter 2 mi- j nutter, medens der efter 2 timer ikke kan iagttages yder- j ligere farvefremkaldning. Når reaktionen er fuldbyrdet, vaskes bærelegemet med destilleret vand eller vand fra hanen.

25 (9) Opbevaring. Nitrocellulose-arkene kan opklæbes med 1 i gummilim af den art, der anvendes til opklæbning af fotografier, fortrinsvis medens de endnu er fugtige. Så snart de er tørre, bør de opbevares i mørke.

B) Mangeprikmetoden: De samme trin gennemgås med følgen-30 de ændringer: Antigenerne påføres i parallelle rækker på i gitteret, og blokeringen udføres på hele arket inden opskæringen. Arket underkastes en kort vaskning, hvorpå det tørres og opbevares i denne tilstand. Før brugen gøres arket igen fugtigt med TBS,og et passende antal strimler

DK 160336B

24 afskæres vinkelret på antigen-rækkerne, så at hver strimmel indeholder et af hvert af antigenerne. Strimlerne anbringes i 1-1,5 ml fortyndet serum i trug i en formstof-bakke, der fremstilles af Dynatech (Alexandria, Virginia) 5 og betegnes som engangs-reservoirindsatse. Disse har de samme dimensioner som mikrotiter-plader og multipipette-rings-indretninger (f.eks. Finpipette Multichannel Pipette) . De nævnte bakker kan anvendes til at fortynde otte eller tolv prøveportioner på samme tid. For en ottekanals 10 indsats kan op til toogtredive forskellige antigener anvendes på en 10 cm lang nitrocellulose-strimmel. Med henblik på vaskningen hældes væsken først ud fra bakken, hvorpå resten kastes ud. Vaskevæsken tilføres ved at fylde trugene med en vaskeflaske. For det sekundære antistof an-15 vendes også 1-1,5 ml.

C) Kvantificering. Denne udføres ved en intern standardserie af enten rent immunoglobulin eller med helt serum, der indeholder en kendt mængde af total-immunoglobulin. Farveintensiteten sammenlignes med en af standardernes 20 farveintensitet eller bedømmes kvantitativt ved hjælp af et afsøgningsapparat. Måling af reflektansen udføres med et afsøgningsapparat for tyndlagskromatografi og giver en nøjagtig kvantitativ bedømmelse med et dynamikområde på tre dekader. Antistofkoncentrationen i det op-25 rindelige serum beregnes ud fra standard-kurven, der viser reflektansen som funktion af immunoglobulinmængden.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til antistofanalyse udviser en høj grad af reproducerbarhed af farvereaktionen, når de ovennævnte indikator-antistoffer anven-30 des, og når betingelserne i øvrigt er standardiseret.

Denne farvereaktion er et kvantitativt mål for antistoffets titer, når der er foretaget en passende fortynding af serumet eller plasmaet. Ydermere kan analysen gøres kvantitativ ved at anvende en intern standard-række af 35 humane immunoglobulinkoncentrationer, f.eks. ved at påføre standardiserede mængder af rent human IgG til det mikroporøse bærelegeme, inden de ikke-specifikke steder

DK 160336 B

25 blokeres ved udførelse af den beskrevne procedure. Dette vil give en standard-farveserie efter prøven og vil automatisk kompensere for eventuelle variationer, der skyldes det ukendte serum eller plasma eller andre årsager.

5 En variationskilde består i, at individuelle sera giver forskellige baggrunds-bindingsreaktioner, enten med de proteiner, der anvendes til blokering af de ikke-specifik- j ke bindingssteder eller ved ikke-specifikke steder på det ! mikroporøse ark, som ikke er blevet blokeret. Af ukendte j 10 årsager varierer denne baggrund med individuelle sera og j kan i sig selv have en diagnostisk værdi. Imidlertid til- j lader tilstedeværelsen af de påførte antigener i form af pletter eller prikker en meget følsom direkte visuel bestemmelse af tilstedeværelsen eller fraværet af antistof.

15 Sådanne små forskelle er vanskelige at iagttage visuelt i ^ konventionelle enzym-koblede antistof-bedømmelser,der afhænger af brugen af mikrotiter-plader, f.eks. hvor man kunne komme til at sammenligne prøveportioner, der ligner hinanden meget, i forskellige brønde. Det er ganske uven-20 tet, at den fysisk nære beliggenhed af antigener på dens egen baggrund på det mikroporøse ark gør det muligt at påvise betydelige forskelle, som ellers ville være umulige at bestemme, det være sig visuelt eller spektrofotome-trisk.

25 Den kvantitative farvereaktion og anvendelsen af interne standarder som omtalt ovenfor gør det muligt at anvende måleinstrumenter til kvantitativ bestemmelse af de indivi- | duelle antistoffers titere. Dette kan udføres med et hvilket som helst almindeligt densitometer af den art, der an-30 vendes til analyse af elektropherogrammer eller kromato-grammer. Den optiske tæthed kan bestemmes ved at gøre det mikroporøse ark gennemsigtigt ved at nedsænke det i en væske med et passende brydninqsindeks, som hverken vil gøre det farvede reaktionsprodukt eller det mikroporøse 3 5 ark opløseligt. Fra anvendelsen ved måling af radioaktivitet ved hjælp af scintillationstælling er det kendt, at toluen vil gøre

DK 160336 B

26 nitrocellulose gennemsigtig på denne måde. Det har i praksis vist sig, at hverken toluen, xylen eller en blanding af glycerol og vand vil opløseliggøre farven i o-dianisidin-oxidationsproduktet, samtidigt med at bæreleqemet gøres gen-5 nemsigtigt. Ydermere opnås der et kvantitativt udtryk for antistoffets titer med antistoffet indenfor et område på 1:1000 under den koncentration, der vil mætte antigenet.

En detaljeret fortyndingsrække behøves derfor ikke, hvad der gør opfindelsen særdeles velegnet til rutineundersø-10 gelser.

Det er almindeligt kendt, at der ved nogle sygdomme, især kroniske infektioner, optræder en stor forøgelse i koncentrationen af en heterogen population af antistoffer af en given klasse, men hvis reaktivitet ikke kendes. Dette kal-15 des polyclonisk gammopati. En afprøvning af serum eller plasma fra en sådan patient med et stort antal tilfældigt udvalgte antigener vil lette diagnosen af en sådan sygdom.

F.eks. vil serum fra en patient med smitsom mononucleose udvise uventet høje antistof-titere overfor t'i af de syt-20 ten anvendte antigener, herunder kontrol-antigenerne, jf. eksempel 3. Særlig høj er antistof-titeren overfor mæslingevirus, der antigenmæssigt er ubeslægtet, og som ikke tidligere er beskrevet som havende nogen forbindelse med etiologien for smitsom mononucleose, der skyldes smitte 25 med et fuldstændigt ubeslægtet virus. Denne titer er tilmed højere end i det serum, der findes på markedet som humant mæslinge-positivt kontrolserum. Opdagelsen af denne uventet høje titer overfor mæslingevirus vil være nyttig ved diagnosen af smitsom mononucleose. Ydermere 30 vil den detaljerede antistof-profil udgøre et betydningsfuldt nyt værktøj ved sygdomsdiagnose baseret på poly-klonisk gammopati.

De ovenfor beskrevne indretninger kan ikke blot anvendes til antistofanalyse: De kan således tjene et hvilket som helst

DK 160336 B

27 formål af analytisk art i biokemi og immunologi, som drejer sig om naturligt forekommende makromolekylære organiske stoffer af dyrisk eller vegetabilsk oprindelse, så- j san naturligt optrædende eller kunstigt fremstillede proteiner, j 5 naturligt forekommende protein-konjugater, såsom glyco-proteiner, lipoproteiner eller komplekser af proteiner og nucleinsyre, i den udstrækning det er muligt at påføre dem på den ovennævnte måde på porøse faste bærele- : gemer. Immunoglobuliner vil også hæfte til de nævnte bæ-10 relegemer, og dette er grunden til, at det i den ovenfor j omtalte undersøgelse er nødvendigt at eliminere de ikke- specifikke baggrunds-bindinger, før den immunologiske undersøgelse kan udføres. Ribonucleinsyre og desoxyribo- : nucleinsyrer kan også anvendes ved undersøgelser med ana- 15 lysesættene ifølge opfindelsen, idet de sidstnævnte syrer | især er af betydning, når de indgår i programmet til un- i dersøgelse af sygdom af auto-immun art.

Indretningerne ifølge opfindelsen er også velegnede til påvisning af rheumatoid faktor og cirkuleren-20 de immun-kompleks. Sådanne immunoglobuliner eller anti-gen-immunoglobulin-komplekser optræder ofte i sera fra patienter med kroniske betændelsestilstande, navnlig med bindevævssygdomme. Når det drejer sig om rheumatoid faktor, påføres IgG fra en dyreart, f.eks. kanin, på et porøst 25 bærelegeme, f.eks. nitrocellulose, inkuberes med en blokeringsopløsning som beskrevet ovenfor og inkuberes derpå med det serum, f.eks. humant serum, der skal analyseres.

Den rheumatoide faktor vil binde sig til IgG i anlysesættet, og det således dannede kompleks og den bundne rheumatoide 30 faktor kan identificeres ved hjælp af et indikator-antistof, der er rettet på den art, hvortil det serum, der skal ana- | lyseres, hører, og kan f.eks. være anti-humant antistof, f.eks. kanin-anti-humant. Som sædvanlig kobles indikatorantistoffet til et enzym under dannelse af et farvet reak-35 tionsprodukt med et dertil egnet substrat. Dersom prøven er tilrettelagt med henblik på at påvise rheumatoid faktor, der ikke er artsspecifik, såsom human anti-kaninrheumatoid-

DK 160336 B

28 faktor, ville det kunne forventes, at den ikke-artsspeci-fikke klasse af antistoffer ville blive effektivt udkonkurreret af det store overskud af IgG af andre arter, såsom fra heste, der findes i blokeringsopløsningen, men 5 til stor overraskelse sker dette ikke.

I tilfælde af immun-kompleks-undersøgelser bibeholder proteinet Clq sin evne til specifikt at binde antigen-anti-stof-komplekser selv efter aflejring på nitrocellulosen.

Dette er meget overraskende i betragtning af dette pro-10 teins almindeligt kendte instabilitet. Det forbliver stabilt ved omgivelsernes temperatur i tør tilstand på bærelegemet.

Den gruppe af antigener, der kan anvendes med analysesættene ifølge opfindelsen, f .eks. til udførelse af immunoloT- · 15 giske undersøgelser, er meget omfattende og omfatter f.eks. humant biopsimateriale, væv eller celler af pattedyr, kropsvæske, mycoplasma, metazoiske parasitter, svampe, bakterier, protozoer, vira eller præparater, der er afledt fra hvilke som helst af disse. Udover de antigener, 20 der er beskrevet i de illustrerende eksempler, bør de følgende nævnes som egnede til anvendelse ifølge opfindelsen: Vira eller de herfra præparerede antigener: influenzastammer, herunder A, A^, A^, B, C, parainfluenzastammer 1, 2 eller 3, lymfocytisk choriomeningitis-virus, fåre-25 syge, Q-feber-rakitis, hundegalskab, respiratorisk syncytial virus, rotavirus, røde hunde, adenovirus, Eppstein Barr-virus, brucella, hepatitis B, cocksackie B1-B6, A9, polio 1, 2, eller 3, reo, echo 1-33; svampe-antigener: Histoplasmose capsulatum, Coecidioides immitis,- Blastomyces 30 dermatitidis,Aspergillus fumigatus, flavus eller carnea; parasitiske antigener: Entemeba histolytica. Trypanosoma cruzi, Echinococcus granulosis, Schistosoma mansoni; bakterielle antigener: Spirochete reiter, Treponema pallidum, Escherichia coli, Leptospira, Listeria, Salmonella, 35 Shigella, stafylokokker, streptokokker, Legionella pneumophila; auto-antigener: nuclear RNP, komplement-fraktio- DK 160336 B | 29 ner, humane serum-proteiner, rheumatoid-faktor, insulin, insulin-receptor, thyroid-stimulerende hormon-receptor, i acetylcholin-receptor og andre hormoner eller receptorer; ydermere samtlige allergener, såsom de fra græsplanter, j 5 f.eks. Dactylis glomerata, Festuca elatior, Lolium perenne, Phleum pratense, Poa pratensis, Agristis stolonifera,

Secale cereale, fra urter, f.eks. Artemisia vulgaris, Chrysanthemum leucanthemum, Chenopodium album, Taraxacum vulgare, Solidago virgaurea, Ambrosia trifida, fra træer, 10 f.eks. Olea europea, Juglans californica, Ulmus americana, corylus avellana, Platanus acerifolia, svampe, f.eks.

Penicillium notatum, Cladosporium herbarum, Aspergillus fumigatus, dyriske epitelier, f.eks. fra katte, heste, kvæg, hunde eller marsvin, fra fødevarer, f.eks. mælk, 15 hvede, mandler, krabber, krebs, fra mider, fra støv, fra insekter, f.eks. fra bier eller hvepse, og fra medi- j kamenter, f.eks. penicillin G, penicillin V, synacthen, steroider m.v. j

Immunologiske procedurer vil også have en meget stor be-20 tydning ved påvisning og overvågning af specifikke medikamenter. Sådanne prøver, der er baseret på f.eks. anvendelsen af monoklone antistoffer, og som foretages i løbet af behandlingen af en sygdom, består i at påføre de specifikke antistoffer på et porøst bærelegeme og at 25 påvise og kvantitativt bedømme specifikke antigener ved det modsatte af de immunologiske undersøgelsesprocedurer, som i princippet er beskrevet ovenfor. Komplement-proteiners evne til at binde specifikt til antigen-antistof-komplekser kan derpå anvendes direkte eller indirekte til 30 at synliggøre og kvantitativt bedømme de specifikke antigener, såsom medikamenter eller andre farmakologiske reagenser, eller hormoner, eller en hvilken som helst ønsket kombination af sådanne antigener, i et analysesæt af den heri omtalte art. Med det porøse bærelegeme eller 35 analysesættet ifølge opfindelsen kan derfor antigener af en hvilken som helst art analyseres, f.eks. også medikamenter og hormoner, ved at påføre modsvarende specifikke

DK 160336 B

30 eller monoklone antistoffer på det faste bærelegeme ifølge opfindelsen og påvise antigen-antistof-komplek-serne, f.eks. ved komplement, f.eks. ved komplement Clq, eller ved enzymreaktioner, der er koblet til vekselvirknin-5 gen eller interaktionen mellem antistof og antigen. Overvågningen af specifikke medikamenter og hormoner i biologiske væsker til diagnostiske formål er i de senere år blevet gjort lettere ved anvendelse af de såkaldte "homogene antistofundersøgelsessystemer" med varemærket 10 EMIT tilhørende the Syva Corporation, California, U.S.A.

Ved sådanne undersøgelser er det ikke længere nødvendigt at udføre den omfattende vaskning eller skylning, der behøves i andre immunologiske undersøgelsessystemer, og de er som følge heraf både enklere at udføre og hurtigere.

15 Den homogene antistofundersøgelse er baseret på anvendelsen af et specifikt antistof for det pågældende medikament eller hormon og et addukt mellem medikament- eller hormonmolekylet og et signal-molekyle. Signal-molekylets addukt er et addukt, for hvilket et måleligt signal undertrykkes, 20 når det er bundet til det specifikke antistof. Når sidstnævnte binding hæmmes af tilstedeværelsen af det pågældende medikament eller hormon, fremkommer et positivt signal, der afhænger af koncentrationen af medikamentet eller hormonet i en biologisk væske. Signal-molekylet kan selv være 25 et indikator-enzym eller et substrat, co-faktor eller pro-stetisk gruppe for et indikator-enzym eller en koblet enzymrække, der resulterer i et måleligt signal. 1 en nylig udkommen publikation med titlen "Flavin Adenine Dinucleotide as a Label in Homogeneous Colorimetric Immuno-30 assays" af D.L. Morris, P.B. Ellis, R.J. Carrico, F.M.

Yeager, H.R. Schroeder, J.P. Albarella, R.C. Bogulaski, W.E. Hornby og R. Dawson, i tidsskriftet "Analytical Chemistry", bind 53, side 658-665 (1981), er der beskrevet en metode, hvor et molekyle fra analyten kobles covalent 35 til flavin-adenin-dinucleotid, som er en prostetisk gruppe for enzymet glucose-oxidase. Når det er bundet til et specifikt antistof, er flavin-adenin-nucleotidets addukt med i

DK 160336 B

31 , i analyten ude af stand til at aktivere glucose-oxidasen.

Når adduktet af analytens tilstedeværelse forhindres i at i binde sig til det specifikke antistof, aktiveres glucose- i oxidasen, og aktiveringen afhænger af mængden af det ukend-5 te medikament eller hormon. Den aktiverede glucose-oxidase frembringer ^2^2 som et reaktionsprodukt, og stoffet ^2^2 er et substrat for peroxidase, som derpå kan anvendes sammen med et chromogent substrat til at give en farvereaktion.

Homogene antistof-undersøgelsessystemer kan let tilpasses 10 til anvendelse på et fast bærelegeme ifølge opfindelsen. Det specifikke antistof og signaleringssystemets makromolekylære komponenter, f.eks. glucose-oxidase og peberrod-peroxidase, kan anbringes ved direkte påføring på det porøse bærelegeme i en hvilken som helst ønsket geometrisk udformning, for-15 trinsvis på det samme sted. De koblede enzymers reaktioner vil i så fald drage fordel af deres fysiske sammenfald. I overensstemmelse hermed kan et stort antal antistoffer og j indikator-enzymer tilhørende et signaleringssystem anbringes | på det samme bærelegeme med henblik på at lette den samtidige 20 bedømmelse af et stort antal antigener. Denne måde at gå frem på vil være særdeles nyttig, f.eks. i analysesæt til undersøgelse af narkotikamisbrug og til identifikation af specifikke bakterielle antigener.

I den udstrækning opfindelsen er rettet på anvendelsen af 25 det porøse bærelegeme eller analysesættet til immunologiske bedømmelser på den beskrevne måde, omfatter den også de enkelte trin i en sådan proces.

Ydermere angår opfindelsen analysesæt, der foruden de beskrevne indretninger i form af de porøse bærelegemer 30 også indeholder bakker eller andet udstyr, der er egnet til behandling af de porøse bærelegemer under bedømmelsesforløbet, såvel som præparerede reagenser i tør form, 1 såsom forud bestemte mængder af bæreserum, indikator-antistoffer, peroxidase-substrater mv. Sådanne analysesæt kan [ !

DK 160336 B

32 f.eks. omfatte organerne eller indretningerne ifølge opfindelsen, f.eks. i form af nitrocelluloseark eller -strimler, og hvilke som helst af de ovennævnte tilbehørsdele. I særdeleshed kan bakkerne være af form som formstofbakker 5 med mange rum, og de tørrede reagenser er en lyofiliseret blanding af indikator-antistoffer, salte, puffer, bæreserum eller -proteiner, og farvereagenserne for indikator-enzymerne er på forhånd afvejede alikvoter af chromogent substrat, f.eks. 4-chior-l-naphthol, salte, puffer og ampuller inde-10 holdende forud afmålte mængder af væskeformige substrater, f.eks. hydrogenperoxid.

Opfindelsen omfatter især et analysesæt og/eller et porøst bærelegeme, der omfatter et indikator-antistof.

Opfindelsen er ydermere specielt rettet på et analysesæt 15 og/eller et porøst bæreæegeme, hvori a) bærelegemet indeholder et mønster af et eller flere specifikke antistoffer og reagenser for et signaleringssystem, hvori antigen-antistof-reaktionen resulterer i et måleligt signal, idet signaleringssystemet omfatter et substrat, 20 en co-faktor eller prostetisk gruppe for et indikator-enzym eller en koblet række af enzymer, eller et co-valent addukt mellem antigen og det signalerende molekyle. Enzymet eller det koblede enzymsystem kan påføres på det porøse bærelegeme sammen med det specifikke antistof eller adskilt fra dette; 25 imidlertid behøver det slet ikke at påføres på bærelegemet, men kan anvendes i opløst tilstand, b) mønsteret på det faste bærelegeme indeholder iramuno-globuliner af human eller dyrisk oprindelse eller fragmenter heraf med henblik på påvisning og kvantitativ bedøm- 30 melse af rheumatoid-faktor, c) mønsteret på det faste bærelegeme indeholder komplementprotein for påvisning og kvantitativ bedømmelse af cirkulerende antigen-antistof-komplekser, kendt under betegnelsen cirkulerende immun-komplekser.

DK 160336 B

33

Opfindelsen angår ydermere anvendelsen af samtlige analysesæt og porøse legemer som ovenfor beskrevet til påvisning af kvantitativ bedømmelse af specifikke antigener eller specifikke antistoffer eller begge dele ved immunologiske bedøm-5 melsesmetoder for diagnose, overvågning og prognose af sygdomme hos mennesker og dyr eller til eftersøgning, påvisning og kvantitativ bedømmelse af monoklone eller andre antistoffer eller antigener i forskning og udvikling.

Opfindelsen skal i det følgende belyses nærmere ved hjælp 10 af følgende eksempler.

Eksempel 1.

Variation af størrelsen af pletter eller prikker.

Totalt human-serum påføres direkte på et ark Milli-1 pore med porestørrelse 0,45 ym, og dets andel af IgG 15 farves ved hjælp af peroxidase-koblet ged-anti-humant IgG. Det påførte volumen varieres med henblik på at bestemme den mindste anvendelige størrelse af de mikrosko- piske prikker. Normalt humant serum fortyndes 1:1000 efter rumfang i TBS (0,15 M NaCl, 0,02 M tris-HCl, pH 7,4) med 20 et indhold af 2% bovint serum-albumin. Alikvoter af denne opløsning anbringes derpå direkte som pletter med en mikroskopisk doseringssprøjte (fortrinsvis en Hamilton-mikrosprøjte), der er gradueret i trin på 0,1 yl, på en strimmel Millipore på 3 mm x 100 mm. Derpå tørres strim-25 melen og gennemvædes med TBS med et indhold på 10% (r/r) hesteserum og inkuberes ved 40°C i 2 timer for at blokere de ikke-specifikke protein-bindings-steder på Millipore-arket.

Arket skylles eller vaskes derpå med TBS og gennemvædes derpå i 1 ml peroxidase-koblet ged-anti-humant IgG (Nor-30 die Laboratories, Tilburg, Holland), der i overensstemmelse med fabrikantens specifikationer er opløst i destilleret vand og fortyndet 1:1000 i TBS med et indhold af 10% heste-serum. Behandlingerne udføres i brønden i eri engangs-reservoirindsats for otte trug (Dynatech Labora- - 35 tories, Alexandria, Virginia, U.S.A.). Inkuberingen med det peroxidase-koblede antistof udvirkes ved stuetemperatur i 2 timer med forsigtig omrøring. Det overskydende

DK 160336 B

34 antistof fjernes ved grundig vaskning eller skylning med TBS. Endelig tilberedes peroxidase-substrat-blandingen med 5 ml TBS, 1 yl30%'s 02 i vand, 10 yl o-dianisidin (1% (v/r) i methanol) , og 1 ml af denne opløsning tilsættes 5 truget. Derpå gives reaktionen lejlighed til at forløbe i 2 timer i mørke. De overskydende reagenser udvaskes med afioniseret vand, strimmelén lufttørres ved stuetemperatur, og pletternes eller prikkernes størrelse måles med en skydelære med nonius. Følgende resultater opnås: 10 Serumvolumen Pletdiameter 0,8 y1 1,5 mm 0,6 yl 1,3 mm 0,4 yl 1,0 mm 0,2 yl 0,6 mm 15 0,1 yl 0,3 mm

De små pletters diameter varierer lineært med det påførte volumen, når dette ligger inden, for området mellem 0 og 0,2 yl. Den falder af fra linearitet ved større volumener, sandsynligvis på grund af adsorption ved påføringsstedet.

20 Dersom der ydermere anvendes Millipore-ark med et påtrykt gitter, er tryksværten tilstrækkeligt vandskyende til,at væsken ikke breder sig uden for de trykte firkanter. Den iboende opløsningsevne, som systemer med de små prikker eller pletter udviser, ligger klart et godt stykke under 25 størrelsen af det mindste volumen, som kan påføres med sædvanlige pipetteringsorganer, dvs. 0,3 mm.

En strimmel med en normal længde på 100 mm, der passer ind i brønden på den nævnte reservoirindsats, kunne således indeholde 300 individuelle antigener, anbragt som pletter 30 eller prikker i et endimensionalt mønster. Dersom der anvendes et todimensionalt mønster af prikker, kan et kvadrat med en side på 10 cm indeholde op til 10 individuelle prøveprikker.

DK 160336 B

35

Eksempel 2.

Epidemiologisk søgning efter influenzavirus-antistoffer.

En serie standard-influenzavirus-stammer fremskaffes fra Flow Laboratories (Rockville, Maryland, U.S.A.), 5 således som de anvendes til normale hæmagglutinations-prøver. De virale antigen-suspensioner anbringes som pletter eller prikker i de afmærkede kvadrater på 3 mm x 3 mm på et ark Millipore med porestørrelse 0,45 ym, således som det fås med et påtrykt gitter fra fabrikanten. De på-10 førte prøveportioner er 0,5 yl ufortyndet materiale. En influenzavaccine (Sandoz "Sandovac") påføres også som prikker eller pletter.

Prøveportionerne anbringes som prikker eller pletter i lineære mønstre, idet hver linie kun .indeholder pletter 15 eller prikker af en enkelt stamme, således at arkene efter behandlingen kan opskæres til strimler, hvorved hver strimmel kommer til at indeholde en prik eller plet af hvert af det fuldstændige sæt antigener.

Arkene behandles derpå som beskrevet under eksempel 1 20 med henblik på blokering af de ikke-specifikke bindingssteder med hesteserum, hvorpå de tørres.

Prøveindretningen eller prøveorganet kan, når det holdes tørt, opbevares på ubestemt tid ved omgivelsernes temperatur uden tab af antigen-virkning.

25 Serum udtages fra et individ, som er blevet immuniseret med den ovennævnte vaccine omtrent tre uger før. En række fortyndinger af dette serum tilberedes i TBS lO%'s hesteserum, idet der begyndes med en fortynding på 100 gange og gås videre i trin på 5 gange hver.

30 Fra prøveorganet som ovenfor beskrevet udskæres en række strimler.

DK 160336 B

36

Strimlerne gennemblødes natten?; over ved omgivelsernes temperatur i serum-fortyndingerne under forsigtig omrøring og vaskes derpå grundigt med TBS. Derpå farves det bundne antistof med indikatoren peroxidase-koblet ged-anti-humant 5 IgG, nøjagtigt som beskrevet under eksempel 1. Antistoffets titer fastlægges som den grænseværdi i form af den højeste fortynding, ved hvilken farven endnu er synlig, og titeren udtrykkes som den reciprokke værdi af denne fortyndings faktor. Herved fremkommer følgende resultater: 10 Antigen anvendt til prøven Antistof-titer

Sandovac-vaccine (blanding) A/Brazil/11/78 ^ A/Bangkok/1/79 ( 625.000

A/Singapore/222/79 J

15 Flow-hæmagglutination-prøve-antigener A/PR-8/34 2.500 A-l/FM-1/47 12.500 A-2/Hong Kong/68 <100 A-2/England/42/7 2 <100 20 A-2/Japan/170/62 <100 B/Lee/40 500 B/Mass/3/66 500

Negativ virus-kontrol <100

Dette viser, at serumet har en yderst høj titer af anti-25 stoffer overfor det antigen, hvormed individet var blevet vaccineret, varierende men betydelige titere overfor visse historiske influenza-stammer og ingen påviselig titer overfor kontrol-antigen-præparatet, som ikke indeholder noget virus. Det er således let at titrere samtlige in-30 .fluenza-stammer imod et serum fra et individ i én enkelt operation- Fremgangsmåden er også meget følsom, idet der g kan opnås et slutpunkt ved en fortynding på omtrent 10 gange for antistof med høj titer, og fremgangsmåden kræver kun en meget lille mængde serum, nemlig 10 μΐ i 1 ml

DK 160336 B

37 medium for den laveste fortyndingsgrad. Denne fremgangsmåde er også bedre end de sædvanlige hemagglutination-hæm-ningsprøver eller komplement-fiksationsprøver, hvor der for hvert antigen kræves en individuel bedømmelsesproce-5 dure. Strimmelen udgør også en permanent registrering af resultaterne/ og den kan opbevares i ubestemt tid.

Eksempel 3.

Indretning fremstillet ud fra 10 allerede eksisterende immundiagnostiske sæt.

10 Organet fremstilles ved at danne prikker eller pletter af kommercielt tilgængelige antigener som i eksempel 2. Følgende antigener anvendes, idet de angivne fortyndingsfaktorer er tilstrækkelige til at give den maksimale reaktion. Samtlige antigener fortyndes i TBS.

15 Beskrivelse af antigen_Anvendt fortynding

Behring;

Toxoplasma fra analysesæt med fluorescerende antistof Ufortyndet Mæslinge-hæmagglutination-hæmnings-20 prøve 1/25

Ornithose-komplement-fiksationsprøve Ufortyndet

Herpes simplex type 1 komplement-fiksa-tionsprøve 1/25

Mycoplasma pneumoniae komplement-fiksa-25 tionsprøve 1/5 Tæge-båren encephalitis-virus-komplement-fiksationsprøve Ufortyndet

Varicella zoster virus komplement-fiksationsprøve 1/5 30 Flow:

Adenovirus type 4 virus komplement-fiksa-tionsprøve 1/5

Cytomegalovirus (Ad 169) virus komplement-fiksationsprøve 1/5 35 Sandoz:

Sandovac influenza-vaccine Ufortyndet

DK 160336 B

38

Disse eksempler er udvalgt på grundlag af tilgængeligheden af humane positive kontrol-sera som bestanddel af det diagnostiske analysesæt. Imidlertid kan, som det fremgår af det første eksempel, antallet af antigener for hver prøve 5 forøges efter ønske til et meget større antal.

Prøveportionerne og - når de er tilgængelige - negative kontrol-antigener anbringes som pletter eller prikker på et ark Millipore på et påtrykt gitter som i eksempel 2, hvorpå de ikke-specifikke steder blokeres med hesteserum, 10 og arket tørres og opbevares som i de tidligere eksempler. Som i eksempel 2 udskæres individuelle strimler fra arket og afprøves med de positive og negative kontrol-antisera, således som de indgår i de analysesæt, der er angivet i den foregående tabel. Samtlige sera fortyndes 15 i forholdet 1:100 i TBS - 10% hesteserum, og de relevante prøvestrimler behandles som nævnt under eksempel 2. I denne serie noteres resultaterne som positive eller negative for hvert antigen over for hvert serum. Dette er opsummeret i følgende tabel.

DK 160336 B

39 m ^

•r4 rH

v o .-1 -M Ai O Η II) M >—I Λ3 ^ P O xt

CM Gi M

O 4-1 -Μ CO 0) φ

<β A< C O X DU-P

M I O M tU M C tn 0)(1)0) Αί 4-) i-4 ·Η0)Ο tn tn tn i c Λ > n •η οοιΰπί o gmtnoc 4J α)θ)Ε6ΜΑ;α)·Γ4ε3·-4θ)(ΰ c rHr-toitnojoJtntntnMttjM·-) nj aonjitscncno (0 cn »ro —i I 33r-4^4CCÆtn'-4>0)A30)

0) CCOiOi-r4-r4 4->0)OiOeiO > OOOOrHrH.HGiOCOOJ-t ·& acxxtncncMua)4-)&M

Prøve-antigener £ | 2° I s o κ S < o S >

Toxoplasma Mæslinger + - + -Θ- + -- - + --

Ornithose + 5 Ornithose-kontrol +

Herpes simplex + + - + + - + © + + + + +

Herpes simplex-kontrol +

Mycoplasma + -- -- - + + © + + --

Mycoplasma-kontrol 10 Adenovirus - + - + + - + + + © + + +

Cytomegalovirus + + -- + - + + + -© + -

Cytomegalovirus-kontrol Tæge-båren encephalitis Tæge-båren encephalitis- 15' kontrol -------------

Varicella zoster (skoldkopper) + + - + + - + + + + + + ©

Varicella zoster-kontrol -------------

Influenza + + + + + - + + + + + + +

Influenza-kontrol + 20 I samtlige tilfælde er prikken positiv for kombinationen af et prøve-antigen med det modsvarende prøve-antiserum, som fremhævet ved hjælp af cirklerne.

De negative kontrol-sera er alle negative for det antigen, for hvilket de er tilvejebragt i de anskaffede analysesæt, 25 selv om hvert af dem kan være positive for flere forskellige andre antigener. De negative kontrol-antigener er og-

DK 160336 B

40 så negative med de sera, for hvilke de er tilvejebragt, selv om andre sera lejlighedsvis kan have antistoffer, der er rettet imod disse præparater. Ved hjælp af fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det derfor muligt at 5 opnå den samme specificitet som med de analysesæt, hvorpå den var baseret.

Mange af disse prøver er rettet på antistoffer imod endemiske vira, såsom Herpes simplex. Varicella zoster eller adenovirus. Det er derfor ikke overraskende at finde sådan-10 ne endemiske antistoffer i mange sera, som ikke var specifikt leveret som værende positive for disse antigener.

I praksis vil det fuldstændige fravær af et sådant antistof være en indikation på en brist i individets immunforsvars system, og antyder en stor modtagelighed for smitte 15 af det pågældende smittestof. Ligesom ved mange af de almindeligt brugte serologiske procedurer, er det i praksis kun en titer, der ændrer sig, som er et diagnostisk tegn på faktisk smitte eller infektion. Mononucleose-serumet har en række antistoffer imod mange forskellige tilsyneladende ubeslægtede antigener. Antistof-titeren imod mæslin-20 gevirus er særlig høj. Denne optræden af et bredt spektrum af tilsyneladende irrelevante antistoffer, herunder nogle imod nogle af negative kontrol-antigenpræparater, er tegn på en polyclonisk gammopati, og peger på diagnosen smitsom mononucleose.

25 Foruden de.t smitsomme mononucleose-serum giver flere andre sera antistoffer imod influenza-kontrol-antigenet.

Dette er medtaget for at illustrere det værste tilfælde af et urent antigen. Influenza-antigenet er et højt raffineret viruspræparat, således som det anvendes som vacci-30 ne for mennesker, medens kontrol-antigenet er et meget mindre rent præparat, der endnu indeholder ægproteiner som urenheder. I alle tilfælde er antistof-titeren imod denne kontrol altid lavere end titeren imod det virale antigen. Tilstedeværelsen af sådanne antistoffer imod 35 urenheder er tegn på, at den patient, hvorfra serumet blev taget, var allergisk for urenheder i det alminde-

DK 160336 B

41 ligt anvendte vaccinepræparat. Alternativt kunne det være et tegn på, at personen havde en allergi imod æg. I praksis vil en rutinemæssig overvågning af sådanne antistoffer være nyttig til forhindring af allergier i vacciner, 5 omgivelserne og fødevarer.

Allergier er i regelen knyttet til tilstedeværelsen af cirkulerende antistoffer af typen IgE. Som her beskrevet vil en undersøgelse med indikator-antistoffer af per-oxidase-koblet ged-anti-humant IgG også føre til påvis-10 ning af IgM- og IgE-antistoffer, eftersom det anvendte gede-antistof reagerer med både H- og L-kæder. Det er muligt at konstruere mere specifikke prøver under anvendelse af antistoffer, der er specifikke for f.eks.

IgG eller IgM, eller IgE.

15 Eksempel 4.

Analyse af antistoffer i sera fra patienter med sygdomme af auto-immun og anden art.

Denne indretning er opbygget med de samme antigener, som er anvendt i eksempel 3, men med tillæg af antigener, der 20 kan indikere auto-immunsygdomme. Rene og denaturerede nucleinsyrer, som beskrevet i det følgende samt subcellu-lære fraktioner, der er afledt af Hela-celler, der kan anvendes som en typisk linie af ikke-differentierede humane celler, og som let kan dyrkes i store mængder, anvendes.

25 Actin og myosin anvendes også som antigener (kanin: fra Sigma).

DNA fra laksesperma (Serva, Heidelberg) denatureres ved opvarmning til 100°C i 2 minutter i nærvær af 1 M glyoxal, efterfulgt af hurtig afkøling.

30 Ribosomal RNA fra Escherichia coli tilberedes fra den store ribosomale under-enhed ved hjælp af velkendte metoder (Gordon & Ramjoué, Analytical Biochemistry 83, 763-766 (1977)).

DK 160336 B

42

Der foretages dyrkning af Hela-celler, og de subcellulæ-re fraktioner, nemlig kerner, mitochondria, nucleoler, poly-somer og cytosol-fraktioner, præpareres fra disse celler ved kendte metoder (Penman, S.J. Mol. Biol. YT_, 117-125 5 (1966)).

Alikvoter på 0,5 yl af samtlige nævnte antigener med protein-koncentrationer i området fra 1 til 10 mg pr. ml anbringes som pletter eller prikker på Millipore-ark, som beskrevet i eksempel 3, i to trin, som følger: 10 1) Fiksation af nucleinsyrerne ved direkte påføring af pletter eller prikker og bagning af arket i 2 timer ved 80°C, en procedure der allerede vides at forårsage en irreversibel fiksation af KNA og denatureret DNA til nitrocellulose (P.S. Thomas, Proc. Nat. Acad. Sci. US 77, 15 5201-5205 (1980)). Det har ikke tidligere været kendt, at naturlig DNA også kan bindes på denne måde.

2) Anbringelsen i form af pletter eller prikker på det således behandlede Millipore-ark af resten af samtlige øvrige nævnte proteiner, celler eller subcellulære frak-20 tioner.

Derpå behandles indretningerne som beskrevet i de foregående eksempler, og der afskæres strimler med henblik på at afprøve de individuelle sera fra patienter, der lider af auto-immune sygdomme, og nogle kontrol-patient-sera. Dis-25 se sera afprøves ved fortyndinger på 1/100, 1/1000 og 1/10000 i TBS-10%-hesteserum, og behandles som i de foregående eksempler. I tillæg hertil indeholder indretningerne prikker på 0,5 yl normalt humant serum, som intern standard for IgG i prøven. Disse har fortyndinger på 1/1000, 30 1/2000, 1/4000 og 1/8000 i TBS, 1 mg/ml bovint serum albumin .

Sygdommene diagnosticeres i overensstemmelse med det amerikanske rheumatologiske selskabs kriterie. De opnåede resultater er opsummeret i den følgende tabel.

DK 160336 B

43 ωοο ,r <✓ ί) 9 ^ o <J r-l V* ^ cm ^ ^ 8 <r O <> O ovi oj

M

m

,—i ,—{ CM lo ’—' i—i tO

m -v/ ^ -v- S <o R . oooo mm

Ur-< OOOO'-'r^ ctL rH

y ^ m m tn m V ^ μ cm r-i *< /\ A A Λ r~l 2 £ ιο ζ> Ο Ν ^ ο 1-4 co CD ι—4 ι—I r—I ι—I 1/) tO ι—1 Η ΟΙ ^ V* <Τ> ο

t—4 ι—ι ι—C r—1 CM Η Η ΙΟ τ~Ι r—I

oo rt ri. m in ο »—J r-ί \0 r-4 ΙΟ Ο rH «—1 Ο r-H _4 \/ ^

•vt- r—I γ—( ι—I γ—I Η ι—I tO

Η V ^ V/ (Ο CM ι—It—ι Ο CM ΟΙ ι—I ' <—< iO «Λ 2 ^ O O d 2 ^ Ο m <ΰ m ri in t-ι cm 2 m ^ ^ ς} ci ^ -1 η 2 m in «ο ·

• · j—i «—I to '—ι r-* i—ι CM

CO CM CM ^ N/ ^ r-l

»—4 r—I

i—I ι—I Γ-ί r-4 r-4 r-l <M IO

f~Vin m m ^ 'M' S/NrrV· t, m2 ^ ci- in W r-l IT) /4 co cm ininmininm rH ^ cm .h r-ι .—ι .— m 1 1 Γ"τ CM 1 1 r—1 « I—1 *n o o

Ui r-l ^ MC CM f—1 .—1 Θ -Ι

M

OU-) rH .H r-l O m CM O

2 r-l rfj ^ ^ r-l >—I

z Q in Z II jrf 2 r Q 2 it “ > H 2 51 P j d ft u økoj gy-'ai'flc

-H M r?. a w 0) cntlicn HMcdftMO

rHd QJo.r-ir-ig idCno (¾ -H 60 O C ,¾ Q) M4-> y)x:«oood'-(cjx;ojH>(Uii<u £ nm ' uSJucoco-HD.-Hucuciioa'ds n WoHr-ioOWOiH-'-IP-OdOr-i'-' . t: " -C rH u M UUrQOXW duo cuuo^-i 1-1 (UdJ^OJ-HQIdiN-HiHOfljMlU^Ti^Adc: CL, Z Ω c^irliSl^SsopcJ^E-.gorrigHiCJCOi-tr

DK 160336 B

44

De i denne tabel angivne antistof-titere gælder sera fra normale individer eller fra individer, der lider af de angivne sygdomme. Disse sera er nummereret fra 1-20. Titer- værdien er udtrykt som brøkdelen af total-immunoglobulin -5 5 som specifikt antistof gange 10 . Hvor intet betydende antistof er påvist, er der ikke indført noget i tabellen.

Hvor der findes et betydende antistof, men udenfor standard-området, er resultatet angivet som mindre end 1 eller større end 500.

10 I tabellen betyder SLE systemisk Lupus erythematosus, RA betyder rheumatoid arthritis, MCTD betyder blandet bindevævssygdom, MS betyder multipel sclerose, ICD betyder immun-kompleks-sygdom,og AE betyder angioneurotisk ødem.

15 I de auto-immune sera findes et betydende antal autoantistoffer: i et tilfælde findes antistoffer, der er specifikke imod naturligt DNA, men som ikke reagerer med denatureret DNA, og i andre tilfælde findes der antistoffer, der er specifikke imod hele celler, organeller m.v., 20 hvoraf det fremgår, at prøven er følsom for et meget bredere spektrum af antigener end proteiner alene. I en samling på tohundrede individer viser det sig, at SLE-sera og titere for anti-nativt DNA og anti-denature-ret DNA varierer i vid udstrækning blandt forskellige 25 individer, og uafhængigt af hinanden. Dette viser, at undersøgelsen er specifik. I nogle tilfælde er det muligt, at auto-immune antistoffer ikke længere er til stede, fordi disse sera kommer fra patienter, som allerede er under behandling. Som også under andre omstændig-30 heder, der er beskrevet ovenfor, sker det lejlighedsvis, at antistoffer, der er rettet mod ægprotein> påvises i influenza-virus-kontrollerne.

Dette bedømmelsessystem udviser følgende fordele overfor hidtil eksisterende metoder til diagnose af auto-immune 35 sygdomme: Samtlige antistoffer af interesse kan måles i

DK 160336 B

45 et enkelt forløb i stedet for i særskilte forløb. Antistoffer, der er specifikke imod subcellulære afdelinger, bestemmes normalt ved fluorescens-mikroskopi. Dette er kedsommeligt, subjektivt og tidskrævende, medens frem-5 gangsmåden ifølge opfindelsen er enkel og kan gøres kvantitativ automatisk. Kanin-actin og -myosin er inkluderet på grund af deres tilgængelighed på markedet. Det vil kunne indses, at fremgangsmåden kan anvendes til påvisning af antistoffer imod disse proteiner. Det er imidlertid 10 muligt at erstatte dem med de modsvarende humane proteiner, såvel som med humant collagen, med henblik på diagnose af auto-immune sygdomme. Ydermere er det muligt at inkludere et stort antal forskellige typer af differentierede celler, der fremstiller specialiserede proteiner, 15 såvel som de her anvendte udifferentierede Hela-celler.

Dette analysesæt har den yderligere fordel, at det kan anvendes til overvågning af patienters sera i løbet af behandlingen af auto-immun sygdom med immuno-suppressive midler. Derpå kan man overvåge de patologiske antistof-20 fers forsvinden, og regulere behandlingen på en sådan måde, at man undgår undertrykkelse af de godartede antistoffer, der er endemiske, således at man undgår en fuldstændig ødelæggelse af patientens immunsystem.

Eksempel 5.

25 Grænserne for multiparameter-antistofanalysens følsomhed.

En standardiseret række af fortyndinger af rent humant IgG anbringes som prikker eller pletter på Millipore-ark som under eksempel 1. Arkene behandles derpå på nøjagtig samme måde som nævnt under eksempel 2, under anvendelse af en 30 fortynding på 1/100 af det samme serum,som blev anvendt i eksempe'l 2.

Prikkernes reflektans bedømmes kvantitativt under anvendelse af et afsøgningsapparat for tyndlagskromatogrammer, fremstillet af firmaet "Camag", Muttenz, Schweiz. Der 35 fremkommer følgende resultater:

DK 160336B

46 Mængde af IgG i prik (nq) Reflektans (vilkårlige enheder) 50 54 23,3 49 10,8 41,8 5 5 37 2,33 22 1,08 14 0,5 10 0,23 7 10 Fra denne tabel kan det ses, at reflektansmålingen giver en kvantitativ bedømmelse af antistoffet over et dynamikområde, der er større end tre dekader med hensyn til mængden af bundet antistof, og det er muligt at påvise mindre end 0,5 ng bundet antistof.

15 Eksempel 6.

Sammenligning af forskellige peroxidase-substrater.

Antistofanalysen fra eksempel 5 gentages to gange: I det ene tilfælde går man frem nøjagtigt som angivet under eksempel 5, og i det andet tilfælde udføres følgende 20 ændring: 5 ml TBS, 10 μΐ 1^0^ (30% vægt/vægt i vand) og 0,3 ml 4-chlor-l-naphthol 0,3% vægt/volumen (Merck) i methanol i stedet for o-dianisidin. Farvningsfølsomheden er identisk, men o-dianisidinet giver en baggrund, der er en smule højere end 4-chlor-l-naphtholet. Det er også muligt at an-25 vende diaminobenzidin. Til kommerciel anvendelse bør 4-chlor-l-naphthol foretrækkes, eftersom det ikke er kendt som værende kræftfremkaldende.

Eksempel 7.

Søgning efter monokloniske antistoffer imod neuronale mem-30 branfraktioner.

Ved tilberedelsen af linier af hybridom-celler er det nødvendigt at gennemsøge store antal kloner, der muligvis fremstiller det specifikke antistof, der er af interesse.

DK 160336 B

47

Dersom det ønskes at gennemsøge hver klon efter antistoffer imod multiple særskilte antigener, kan de foregående eksemplers metodologi anvendes med små ændringer. Dersom det ønskes at søge efter antistoffer imod et ankelt anti-5 gen, kan følgende procedure anvendes: Et ark Millipore afmærkes i kvadrater på 4 mm eller mindre, eller de kommercielt tilgængelige Millipore-ark med allerede påtrykte kvadrater anvendes som i de foregående eksempler. Det kan somme tider være en fordel at foretage en forudgående vask-10 ning af Millipore-arket i destilleret vand. Synaptosomal plasma-membran fra rottehjerne (D.H. Jones, A.I. Matus, Biochem. Biophys. Acta 356, 276-287 (1974)) anvendes som antigen ved en proteinkoncentration i området 0,1-1 mg/ml. Rumfangsportioner på 0,5 μΐ af disse antigen-præparater 15 påføres som prikker på Millipore-arket, som beskrevet f.eks. under eksempel 2. Om nødvendigt kan den lokale koncentration forøges ved gentagen påføring på den samme plet, med tørring mellem de forskellige påføringer. Arket vaskes derpå med TBS,og, om ønsket, behandles det med en blokerings-20 opløsning af hesteserum som i de foregående eksempler, hvorpå det tørres og opbevares. De enkelte kvadrater udskæres og anbringes i brøndene i en Costar-bakke (Cambridge, Mass., U.S.A.). Hver brønd behandles med 150 μΐ 3%'s bovint serumalbumin, 1%'s normalt gedeserum i TBS i omtrent 15 minut-25 ter med rystning ved omgivelsernes temperatur. Alternativt kan brøndene, der som Millipore-arket var blevet behandlet med blokeringsopløsningen, dækkes eller belægges særskilt.

De dækkede eller belagte bakker og filtre kan også opbevares i tør tilstand som sådanne.

30 Et antal mus immuniseres med præparater af synaptosomal membran fra rottehjerne, miltene fjernes, hybridiceres med myelom-celler og fordeles i 200 brønde i selektivt medium for at muliggøre vækst af hybridomet, ved hjælp af kendte metoder [G. Kohier, C. Milstein, Nature 256, 495-35 497 (1975)].

Efter 10 dage anbringes alikvoter af supernatanten fra

DK 160336B

48 brøndene i Costar-pladebrøndene, der indeholder kvadraterne (75-150 yl pr. brønd) eller fortyndinger heraf i blokeringsopløsninger, og antistof-bindingsreaktionen gives lejlighed til at forløbe fortsat imellem 2 timer og over nat-5 ten, afhængigt af antistoffets aktivitet. Derpå fjernes mediet, og det overskydende antistof fjernes ved udstrakt vaskning med TBS. Det bundne immunoglobulin underkastes derpå en specifik farvning med peroxidase-koblet ged-anti-mus-IgG, under anvendelse af den samme procedure som i de 10 foregående eksempler. Af de 480 brønde giver de 170 positiv reaktion.

Denne procedure kan anvendes til fremstilling af. analysesæt til gennemsøgning af hybridomer imod hvilke som helst ønskede antigener eller blandinger af sådanne. Den har den 15 fordel, at den gør det lettere at håndtere og opbevare antigenet, dersom dette er immobiliseret på ark eller kvadrater i stedet for på sædvanlige formstofskåle, den kræver mindre antigen end hvis hele brønden i Costar-skålen skal dækkes med antigen, og den muliggør direkte sammenligning 20 af antistofbindingen med antigenet sammenlignet med baggrundsfarvningen på Millipore-arket, og muliggør således en særdeles følsom skelnen samt en undgåelse af falske positive reaktioner, der skyldes høje baggrunds-reaktioner.

Eksempel 8.

25 Vævsfordelingen af rottehjerne-antigen, påvist ved hjælp af et monoklonisk antistof (MIT-23).

Det monokloniske antistof fremskaffes som beskrevet under eksempel 7. Dette monokloniske antistof anvendes til en undersøgelse rettet på MIT-23-antigen i rå homogenater fra forskel-30 lige rottevæv. I hvert tilfælde påføres homogenatet som prikker med 1,0 mg/ml. De pågældende væv er: lever, cerebellum, forhjerne, nyre, thymus, stribet muskelvæv og hjertemuskel. Antigenet MIT-23 forekommer både i cerebellum og forhjernen, men ikke i de øvrige afprøvede væv. Ved 35 forsøg med progressiv formindskelse af antigen-koncentra-

DK 160336 B

49 tionen i prikkerne viser det sig, at MIT-23 kan påvises i et cerebellum-homogenat ved 50 yg/ml men ikke ved 10 yg/ml, hvad der antyder, at de medlemmer af vævsgruppen, der udviser negativ reaktion, har mindre end 5% af det 5 MIT, der findes i cerebellum.

Eksempel 9.

Bestemmelse af rheumatoid-faktor og cirkulerende immun-kompleks i serum fra mennesker eller mus med auto-immun-sygdom.

10 Rheumatoid-faktor defineres som et immunoglobulin, der findes i serum, og som vil bindes til IgG, herunder IgG fra andre arter. Cirkulerende immun-kompleks er et endogent antigen-antistof-kompleks, der findes i kredsløbet under visse sygdomme. Målinger af begge disse indgår ofte som 15 en del af diagnosen af bindevævssygdom. Kanin-IgG (Nordic) anvendes som prøvesubstans for rheumatoid-faktor, humant Clq som prøvesubstans for immun-kompleks. Clq-komplement-fraktionen vil specifikt reagere på antigen-antistof-kom-plekser.

20 IgG og Clq fra kanin opløses med 1 mg/ml i TBS, og prikker på 0,5 yl påføres nitrocellulose. Derpå blokeres arkene med TBS-10% hesteserum som ved de foregående eksempler. Humant auto-immunt serum (SLE: nr. 7 fra eksempel 4, MCTD: nr. 11 fra eksempel 4, og en normal kontrol) 25 og museserum fra den indavlede MRL med medført modtagelighed for auto-immun sygdom, samt en kontrol fra den ikke auto-immune stamme BALB/C, fortyndes samtlige med 100, 1000 og 10000 dele i 10% hesteserum TBS, hvorpå arkene inkuberes i nærvær af disse fortyndinger ved omgivelser-30 nes temperatur over natten.

Prøverne vaskes derpå med TBS og inkuberes med en fortynding på 1/1000 i TBS-10% hesteserum af peroxidase-koblede kanin-anti-humane immunoglobuliner for de humane seras vedkommende, og af kanin-anti-mus-immunoglobuliner for

DK 160336 B

50 rauseseraernes vedkommende. De to sidstnævnte påvisnings-antisera skaffes fra DAKO, København, Danmark. Derpå inkuberes de yderligere i 2 timer ved omgivelsernes temperatur. Overskydende påvisnings-antistof udvaskes derpå 5 med TBS, og det bundne antistof påvises med chlor- napthtol-reaktionen, som i eksempel 5. Farven gives lejlighed til at udvikle sig i yderligere 2 timer, og resultaterne fortolkes.

Begge de humane auto-immune sera udviser betydende rheu-10 matoid-faktor ned til fortyndingerne ved 1/1000, og ingen ses ved nogen som helst fortynding i kontrol-serumet. Muse-auto-immun-serumet viser en positiv reaktion ned til fortyndingen på 1/10000, og kontrol-muse-serumet viser en grænselinie-påviselig positiv reaktion med det 100 gange 15 fortyndede serum. Ved undersøgelsen påvises således tilstedeværelsen af anti-kanin-IgG-antistoffer med høj titer i både de patologiske humane sera og muse-sera. I de patologiske sera påvises også immun-komplekser ved titere på omtrent 10 gange kontrol-seraerne. Cirkulerende immun-20 komplekser med høj titer findes i de auto-immune-muse-sera og i de humane MCTD- og SLE-sera. Yderligere eksempel med en samling på 200 humane SLE-sera og 20 individer MRL-mus, hvorfra der blev taget serumprøver under hele deres levetid, understøtter disse resultater.

25 De betingelser, der er beskrevet i dette eksempel, tilve-jebringer således et brugbart system til påvisning af rheumatoid-faktorer og immun-komplekser, både i klinisk diagnose og dyriske modelsystemer.

Eksempel 10.

30 Forskellige mikroporøse materialer som bærelegemer for prikkerne i den Immunologiske bindingsundersøgelse.

Der anvendes et stort antal forskellige mikroporøse bærematerialer, og prøveportioner af antigen på 0,5 μΐ påføres som i de foregående eksempler:

DK 160336 B

51 (1) New England Nuclear Cor., Boston, Mass., USA "Gene Screen" (mikroporøst polyamid).

(2) Gelman (Gelman Sciences Inc., Ann-Arbor, Michigan, USA) Teflon HT450 (0,45 ym), en aromatisk polysulfon- 5 copolymer for højtemperatur-anvendelse.

(3) Gelman Metricel GN6 "blandet celluloseester" (0,45 ym)..

(4) Gelman Metricel GN6 cellulosetriacetat (0,45 ym).

(5) Schleicher & Schuell (Schleicher & Schuell GmbH,

Dassel, Vesttyskland) nitrocellulose (0,15 ym) 10 BA 80/1.

(6) Schleicher & Schuell nitrocellulose (0,45 ym)BA 85/1.

(7) Schleicher & Schuell nitrocellulose (0,8 ym)AE 91/1.

(8) Schleicher & Schuell nitrocellulose (12 ym)AE 100.

(9) Schleicher & Schuell celluloseacetat (0,45 ym)0E 67.

15 (10) Schleicher & Schuell rekonstitueret cellulose (0,45 ym) RC 57.

(11) FMC (Rockland, Maine, USA) agarose, "Sea plaque".

(12) Difco Noble agar (Difco Laboratory Inc., Detroit,

Michigan, USA).

20 De to sidstnævnte aflejres på et stift formstof-bærelege-me fra FMC Corporation af mærket "Gel Bond" i overensstemmelse med fabrikantens instruktioner, så der fremkommer et lag på 0,5 mg/cm . Dette sidste udføres ved at påføre 1 ml smeltet agar eller agarose på overfladen i en cirkel 25 på 5 cm, hvorpå der tørres under en infrarød lampe. Når agaren rehydreres, udvikler den en porøs struktur.

Følgende antigener påføres i alikvoter på 0,5 yl som i de foregående eksempler, lufttørres, og underkastes de samme processer med anvendelse af humant SLE-serum (nr. 7 fra 30 eksempel 4): (A) Naturlig DNA (0,4 mg/ml).

(B) Denatureret DNA (0,4 mg/ml).

(C) Influenzavirusblanding (ufortyndet Sandovac-vaccine).

(D) Humant igG, 1 yg/ml i 1 mg/ml bovint serum-albumin.

DK 160336 B

52 (E) Humant IgG, 10 ug/ml i 1 mg/ml bovint serum-albumin.

(F) Humant IgG, 100 yg/ml i 1 mg/ml bovint serum-albumin.

(G) 1 mg/ml bovint serum-albumin.

Som ellers udgøres opløsningsmidlet af TBS.

5 Efter tilsætning af DNA-prøverne, og inden tilsætningen af de øvrige, underkastes pletterne bagning ved 80°C i 2 timer.

Følgende resultater fremkommer og sammenlignes med standardsystemet under anvendelse af Millipore-ark med porestørrel-10 se 0,45 ]jm: Bærelegeme_Resultater_ (1) Svagt synlige A, C og F. Øvrige prikker nega-gative.

(2) A, B og C giver farve, D, E, F oq G er nega- 15 tive.

(3) Samtlige prikker positive, D, E og F viser en række med gradueret intensitet.

(4) A og C er svagt positive. Samtlige øvrige negative. Baggrund er højere.

20 (5) Ingen forskel af betydning fra Millipore.

(6) Nøjagtig det samme som Millipore med samme porøsitet.

(7) D giver ingen farvning, i øvrigt som Millipore.

(8) A, B og C giver farvning, D, E, F svagere end 25 Millipore.

(9) A, C og F giver svag farvning. Øvrige er nega tive.

(10) A og B er positive, C svag, øvrige negative.

(11) A, B og C er positive men svage, D, E, F på 30 grænsen til at være synlige.

(12) A, B og C positive, D, E og F svagt positive.

Agar udviser den fordel, at den let kan påføres som en belæg-

DK 160336B

53 ning på et robust bærelegeme, og den er gennemsigtig, hvorfor den kan anvendes til kvantitativ bedømmelse ved gennemlysning i stedet for ved de i eksempel 5 omtalte reflektansmålinger.

5 Eksempel 11.

Antistof-profiler for respiratorisk virus ved multi-prik-undersøgelser.

Dette eksempel svarer til eksempel 3, med den undtagelse, at valget af antigener er baseret på en gruppe respirato-10 riske vira, som ofte kræves til diagnostiske formål som en gruppe, der er vanskelig af skelne alene ved symptomerne. Denne antigen-gruppe skaffes fra Institut Virion,

Zurich, og 0,5 yl af følgende antigener og fortyndinger (som angivet i parentes) i TBS påføres i et mønster af 15 samme art som i de foregående eksempler til Millipore-nitrocellulose (0,45 um)med et påtrykt gitter som i de foregående eksempler.

(1). Adenovirus (1/5), (2). Chlamydia (1/2), (3). Cytomegalovirus (ufortyndet), (3a). Cytomegalovirus kontrol 20 negativt antigen (ufortyndet), (4). Influenza A (1/4), (5). Influenza B (1/2), (6). Parainfluenza 1 (ufortyndet), (7). Parainfluenza 2 (ufortyndet), (8). Parainfluenza 3 (ufortyndet), (8a). Influenza kontrol negativt antigen (ufortyndet), (9). Mycoplasma (1/2), (10). Q-feber (1/2), 25 (11). Respiratorisk syncytialt virus (1/2), og i tillæg hertil fire standarder af humant IgG (Nordic) ved 10, 4,65, 2,15 og 1 ug/ml i TBS og 1 mg/ml bovint serum-albumin. Disse bedømmes derpå som i de foregående eksempler med serum, der er fortyndet med 1:100, 1:1000 og 1:10000 i 30 TBS 10% hesteserum, ved chlornaphthol-metoden under anvendelse af en fortynding på 1:1000 af peroxidase-koblet ged-anti-humant IgG (Nordic). Resultaterne for sera, som -også af Institut Virion - er tilvejebragt som positive kontrol-sera, er opført i følgende tabel.

DK 160336 B

54 I nroncMcMoinro η η η rt n ^ et ο ο cn cn co ir> ^ fororoi^-r^r^-fnfoinnnnMr^Orocor^tnmmrnnr^co«—i

1-1 OOOOOOOOi-<OOOOOOcocoOOOOOOOOO

ft V

44

CO

*rjj_ n coco co cococococor^cocococococomco σ' O O O O co O ΟΟΟιθΓ0ΟΟΟ<ΟΓ0Γ0Ο·-<Ο O -' · .... ..............

rtø OOOOOOOcoOOOOOOOOOOOOOOOOOO

o y\y v y v.

coco coco cm inr^cococommcor'·.

i-i OO r-ιιηΟΟ r^- t—l <—i i-iOOOOi-ii-iOO

σ\ * · · · · · · · · · ·········

Ό _ OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

(1) £ > Φ u> •3} "'"j

Φ -y 1-iOOOOOOOOOOOOOOcocOinOOOOOOOO

003 £ oo ..........*...............

£ 03 OOOOOOOOOOOOOOOcocOr-iOOOOOOOO

ft 0 *d Φ ω g 3 coi r-'Lor^r^-r^r^i^-r^r'r^r^r-^r^r^r-'r^r^.t^-r^cocococot^'

tø 4J OOOrHOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

0 ooooooooodododooooodddoddd £ 44 ft

01 O

T* d mr^ininr^ in m to n io nmo co co co n co

H g i—lOi—li—iO>—li—I·—lOO i-lOOi-iinL0c0r-lt-iOOOOOO

O P vo .......... ...............

+> M OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

(ΰ Φ u ω Ή μ ft Zj iniocotnnmconnccinnr'r^minmcc)t^r~cc)cc)r'cncor^ tn m i-ii-ii-ii-ior-iooooooooi-ii-ii-iooooooooo Φ g “Ί · .........................

U Jj OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

5 V v n ti ,° s .i rocncoccicocnncc!cncnnoocc)cocncncocnc<*>cc)cocncncn<ncci

. OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

Η M- ..........................

Φ H o o o o o o o o o o o o o o o o o p .o, p o p p, o, o p,

3 v WVVVVVWVV ^VWVVWWVV

m 0¾ 0 2- 3i r«. r*. t*. cn m co co in t-~ n co co co co ft -|H OOOO 1-1 O O H O O O O O co 1 to .... . ... ......

ttø tø OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

O φ v +> +> ω ·Η •Η +) co co in co cocococococococococococo co co co m r·.

4J I CM OO 1-1 OcoOOOOOOOOOOOOmOmOOr-lO

S ^ .o o. o o o o cm o. o o p. p odododdodoodoo

<« 0 vvy V VWV v V

3i · ω

Φ Φ -H

i? "ti r^-cor^cor^r^cocococococococo cor-'cococococococo

OH £ r-iOOOOOOOOOOOOOO OOOOOOOOO

φ rtj ,-ι ............... .........

+3 OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

t n «L V V \S U

•Η in

W 3| I

34 Φ g φ Ό 3 Φ

> £ 3i tJ

O -5 .¾ 8 Oi-OIcnstmtOMaOtOHcMCl-iiAvD

U2 i—< Cvim^mvOr^COOSr-^i—1τ-^ι-4τ—tr-it—>1—CS CM CS N N Cv|

DK 160336 B

55

Ingen af de antigener, der er tilvejebragt som negativ kontrol, giver nogen som helst positiv reaktion med noget som helst serum.

Eksempel 12.

5 Sammenligning af prik-immun-bindings-undersøgelse med komplement-fiksations-undersøgelse til opnåelse af antistof-profiler for respiratoriske vira i sera.

Komplement-fiksations-undersøgelse udføres på det samme sæt sera som i eksempel 11, og med den samme antigen-10 gruppe fra Institut Virion, under anvendelse af instituttets materialer og beskrevne procedure for komple-mentfiksation. De forskellige sera klassificeres i grupper med den samme titer, og listeføres derpå i en rækkefølge svarende til faldende titer. De lodrette streger i 15 tdDellen nedenfor viser titer-grupperingerne. De understregede sera er dem, der er tilvejebragt som positive kon-trol-sera for det pågældende antigen. 1 56

DK 160336 B

I t7> 1 -P

i—I O 5-1 (B

o) ω in tn d-d Φ S o d t n t n tn d >i 5-1 c—I I *—1 Φ ^®· J5 5 volr- Μιί1ΙΝ00ΗθίΗΝ(Ί·ί<ΛνΟΟ'Ο<Ο4ιΛΟιΟΗΝη·ί'0

Ό m C H Cd Ir-t Η (N rH rH HHHHHMtMNNMM

d CD O cd N L. < I 1! I I ; d x-rt c -- i Λ4 -p m ® d w (d cd 3 d p in iw g i ,y h d g P *P 0) *h ri (Din'd ^ r_ _ _ _ _ L ij xi ci p lolri oo 'η π <r n oo in id νοσϊ~3 'wmoco-jpwmj omthcm i-i

. 'g "P 5 td »—11.—t .—1 t—I T—I i—1 CM Η Η Η N N N Μ Μ Μ H

-P · -P d O pL, p p tu tn øl CD P g

t n <D (D -P

cd h -P H t n p α) ή Did lp t n <D g p -& O Λ (d tn -Ρ,ϋΦ fl »o n a) in ro m <r pi|n OiOHoir-ccONinOHNtO'jtMfxfio

ij Jj m -r—. t—ir-*»—* r—«|«—<04 CM 04 HHHHH<NMCMCS

Η Φ d -d © s 1_i i_—i I—< I-1 1--3 > 'd 'd <D > c d p > η ω <D d o -H · d M i -P -P d . £ ,_, j-i---1 ij 2 53 „2 ,, Si C h n co I-3- vo 101^5 i^oono'onio-iinr'cooiOHNHNsrin

PO ddtdP 1-1 H|rip(HHHCM(MNH ri HH W N CM CM

O Ή O ih > -p -P-P Η O d cd cd O g cd

P tn Μ P O

ri M <D tn 0) evn ω >d

tn m p p - β <3 <f-|<M|u-> OiMtNHiAHvOCO OOHcMOOiONOOCiONcn'iiO

(Dl -P(Dg(D rH | CM CM, H. HHHHHHHHCMCMCMCMCM, p-P tn-dd-d S 1-1 1-11-11-1 d d τ3η £

P (D 0) ·- fB S

og > a> P tn d ip (D tn (D »cd ·-< ________—---—----1.-1 H dH Qi *p ·~ I 1*

Li O m -Λ crt C CM|MflrM O-M-lTHOMaOirUQMXIOlOHCMCKfinvDOHCM tO

Sg idipp-p M 1-11 HHHHHNNCMNCMNCMHHHH

>—i O (D (D (D

•η x -η m tn >d lp rli

0 Cd (D fB (D P

p p d p 'd o α,ιρ p (D ip 1 <D d t n ip cd cd (D d) <D 1 Mm ΟΙ·-» cMn<firMoa)(JcOHcMn>iiiivOMtio\HcMo-ivo 0 ^ rø ^ (|) i 04 04 J r—l x—< i—i t—! i—I rH r—l t—I *—I i—< .04 04 04 04 04 •P cd (D -P-P “ 1 1 -1 tn cd tn ·η tn -P y •P P *P p -P CD p (D (D tn · -ri ______, d cd o d'd o d .1 . 11 · i 11 i i i i l ri rj d r< o. P r».|o|cM >ίΐηιοιθΜΓΗΝοο·ίΐΛΗοο\θΗθΜθνθΓνοοσιιηιη

Φ <D o d I ° M0'1 <N CM CM Η H CM CM r-C i—1 r—C i—I i—I i—C rH t—C

P cd rH r—I

<P Cd H O <D O

Cd > IBM D P

tn ip -P

d H H <D · d

O -Η -Η P (D O

•P -P +i i-» d x -P OP co -dijvolc^ cMaHNiniciHciMrioooOHcMn-ioNOcMPi-jM)

Cd -d +J.C (D g d r! I . CM CM rH i—I i—I τ—I t—1 rH i—C i—1 i—I CM CM CM CM CM.

hq) p tn o H 1-1 1-11--1 (Dg <D d'H tn > P > (D <D o P p Λ *d tn-P d O Q) Ό Q) ω i-;--11-1 ,-1 V- ω H-Ptn-P UrlCMMt vO|C^ CM CO inoOOlOnMfMlCONCKt'HNOHiCMdvO^

<i *—11 i—1 i—I i—I i—[ H CM CM CM i—1 <—I CM CM CM CM rH rH

DK 160336 B

57 tn d

H

Ή >

•P

i—I td •H •P

^ c\|vo Ninor-iNtAMaO'-ieoHiii<fNoii<fuiaiO cM|cn <r vo ” i—I h 04 i i—I H i—i 04 Η Η Η H t—I 04 04 i 04 04 04

<d > I-1 l....... Il I

u tn ----' •ri > x tn ω -η x u tn o h «* ίο n ο\|-ί mvO'ioj-ir-iC'inNcooHNtoinovOH n|ci m Ό

u M —I —f Η Η N rlHHriiHHNN CM |CM CM CM

4-* ·Η <d P.

u tn •r*i 0) (h Ρί tn dl μ

H oo|r-i|vo t^HNrosfiruois-ci'0'-|Nrt'iino3(j>0(Mn'iinvD

1 i CJ CM 11—I i—I ^ i—I i—I i—I i—I H i—1 i—1 i—I CM CM CM CM CM

.9 Jy

Ή fx, I I * " 1 I I 1 p” i I I

i ælto rs r-(|cM (»iirtooH-iinc'O m a'vOMiD(MM<fOr-iNin }-l O' i-l ι-Ί CMJCM CM CM rH i—l i—I i—I CM CM i—<CM r-l i-< i-l <u

r—I

•H

m 0 cj a\ i—i ] cnlm C7vcoooocoomr-to4<rmv0r-i04<rvor^o4cn<rvo £_j £* I r—I I 04 «—I i i-~< 04. I«—* r-4 OJ . i—I t—l τ—I i—I r—I 04 04 04 04 Q. CO *---J »-* 1-1 l—- ...............

4_j o o i 11 II II l| {

rn Cl 00 OO ΟΝ o Μ Γ-INcrmvOOvPlKTOr·ICMninCMPlMHCMvON

-r_l g h| f—( ·—i CM CM 1—i Η M r-iCMCMCMCM —ι,-Jr-ii—I

-p c td U_| · m md oo|m r-- .-i o\ r-ι m|r-t inNcn<fkocoONcn<tmONto<rvo ^ i—I i—I i—i I 04 , 04 i i—1 H i i—1 «—< t—i i—I r—t 04 04 04 04 04, ca i I i_f I__ i i -.....—....................-i G C4 o c •H « td i H c <u H rø ._, ,----

vj I1 II

d ca vo r-. co|t-i cm co <r io|md MooiOHCMn'juimoHCMti<MnO

^ P_I i—i i—i i—i j i—i i—i i—1 r—i i—1 i—I i—I CM CM CM CM CM CM CM

IH

<d n, · miocn'd-|i^-OvDoocTicM'-<t-icMnint-icO'a-vor^|oocnocM'3-v£)

* CM CM ||—I CM| I_1—l| I_i—I CMj J —II—Il—I I 1—Ir-1 CM CM CM CM I

i—I cd

φ N

4J C

+J " w 3 tn u-t -P c Η ·Η O * r 1|-1 w ca <r I cm ηιηοΜ»ο\ο^ΝΐΊ<Μηιο r^- co σιΟ·—i·—'oJroMj-cnvo

p-i i ·—i i— .—i .— .—i J1—i H CM N CM CM CM CM CM

DK 160336 B

58

Fra tabellerne kan det ses, at i næsten alle tilfælde falder de positive sera i omtrent den samme rang, og der er desuden tilfælde, hvor begge undersøgelser viser, at det serum, der er tilvejebragt som positivt, faktisk er 5 negativt eller har en lav titer. Samtlige undersøgelser viser en ganske god korrelation. Årsagen til undtagelserne kan være, at de to undersøgelsessystemer anerkender forskellige antistof-klasser, og at antigenet præsenteres for antistoffet i en meget forskellig form i de to undersøgel-10 ser.

Eksempel 13.

Anvendelse af en prik-undersøgelse til typebestemmelse af monokloniske antistoffer.

Monoklone antistoffer til ribosomale proteiner fra kyl-15 lingelever præpareres ved den samme procedure som i eksempel 8, og antistoffernes specificitet bestemmes ved den metode, der er offentliggjort af Towbin et al. [Proc. Nat. Acad. Sci. U.S., 76, 4350-4354 (1979)]. Supernatanterne fra hybridom-kulturerne prøves med hensyn til antistof-20 type ved følgende prik-undersøgelse. Typespecifikke ged-anti-mus immunoglobulin-antistoffer fra Nordic opløses i overensstemmelse med fabrikantens vejledning, fortyndes 30 gange, hvorpå alikvoter på 1 pi anbringes som prikker på nitrocellulose, idet strimlerne blokeres med hestese-25 rum som i eksempel 1, inkuberes over natten ved stuetemperatur med ufortyndede hybridom-supernatanter, og underkastes derpå påvisning af bundne antistoffer med immun-peroxidase-farvning som i eksempel 1. Resultaterne er vist i følgende tabel:

DK 160336 B

59

Farvning med antistof imod

Monoklonisk antistof IgG IgM

Anti-S6 +

Anti-L7 - + 5 Anti~Ll8a +

Anti-Pl/P2 - +

Anti-rRNA - + I overensstemmelse med internationalt anerkendt nomenklatur betegnes de monokloniske antistoffer svarende til det 10 ribosomale protein, som det reagerer med. Anti-rRNA er således rettet imod ribosomal RNA. Typebestemmelsen i tabellen er bekræftet i særskilte forsøg, hvor antistofferne analyseres på basis af sarcharose-gradienter: IgG har en sedimentationskonstant på 7S, medens IgM har en konstant på 15 19S.

Dette eksempel viser, at antistoffer kan anbringes på bærelegemet og anvendes til påvisning af deres respektive antigener under forudsætning af, at et dertil egnet påvisningssystem står til rådighed. Denne undersøgelsespro-20 cedure er nyttig ved kvantitativ bedømmelse af mængderne af individuelle antistof-klasser i humane sera, således som det ofte kræves til kliniske analyser. Dette system gør det muligt at opbygge et analysesæt til analyse og kvantitativ bedømmelse af samtlige antistof-klasser sam-25 tidigt i en enkelt operation.

Eksempel 14.

Analysesæt til immunologisk analyse.

Organer fremstilles ved at anbringe alikvoter på 0,5 μΐ af antigenerne fra de foregående eksempler som prikker.

30 Antigen-opløsningerne anbringes som prikker i parallelle rækker på Millipore-ark (0,45 um porestørrelse) med et påtrykt gitter som i de foregående eksempler. Arkene be-

DK 160336 B

60 handles som ellers med 10% hesteserum med henblik på at blokere de ikke-specifikke bindingssteder, og lufttørres. Arkene opskæres til strimler, så at hver strimmel indeholder en prik af hvert antigen, og anbringes for-5 seglet i plastlommer. Reagenser til udførelse af den immunologiske analyse tilberedes som følger.

A. TBS indeholdende 10% hesteserum lyofiliseres i portioner på 100 ml.

B. Ged-anti-humane immunoglobuliner fortyndes 1:1000 10 i TBS indeholdende 10% hesteserum og lyofiliseres i portioner på 100 ml.

C. TBS lyofiliseres i portioner på 100 ml.

D. 4-Chlor-l-naphthol udportioneres i portioner på 9 mg og forsegles i ampuller.

15 E. H202 (30%) udportioneres i portioner på 0,1 ml og forsegles i ampuller.

Efter opbevaring på ubestemt tid, kan de ovennævnte analysesæt anvendes som følger til analyse af ukendte antistoffer i serum, svarende til metodologien i de foregående 20 eksempler. En portion af hver af A, B og C rekonstitueres med 100 ml destilleret vand. Derpå anvendes A til fortynding af de ukendte sera, B for bindingsreaktionen for indikator-antistof, og én portion rekonstitueret C sammen med en ampul af hver af D og E udgør farvereaktionsblan-25 dingen. Yderligere portioner af C rekonstitueres efter behov til skylningerne og efter hvert antistof-bindingstrin.

Der opnås de samme resultater som i de foregående eksempler.

Claims (20)

1. Porøst bærelegeme, kendetegnet ved, a) at det indeholder et forud valgt mønster af et eller flere afgrænsede adsorptionsområder af antigener eller 5 immunoglobuliner eller begge, som hæfter fast og ikke breder sig ud på overfladen, hvilket mønster kan opnås ved at påføre alikvoter af opløsninger eller suspensioner af et eller flere antigener eller immunoglobuliner eller begge ved direkte berøring med bærelegemet ved mekanisk påfø-10 ring, og b) hvor resterende adsorptions-områder uden for eller inden for antigen- eller immunoglobulin-områderne kan være mættet ved tilstedeværelsen af proteiner, der er ikke-speci-fikke med hensyn til deres evne til at reagere med de nævn- 15 te antigener eller immunoglobuliner.

2. Porøst bærelegeme ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mætningen af de resterende adsorptionsområder er opnået ved behandling med total-serum, efter valg fortyndet i fysiologisk natriumchloridopløsning eller 20 andet egnet opløsningsmiddel eller begge, ved stuetemperatur eller ved forhøjet temperatur, efter valg efter tørring af bærelegemet, og også, om nødvendigt, bagning af bærelegemet ved forhøjet temperatur.

3. Porøst bærelegeme ifølge krav 1, kendeteg-25 net ved, at antigenerne er udvalgt fra gruppen bestående af humant biopsi-materiale, væv eller celler fra pattedyr, kropsvæske fra pattedyr, svampe, protozoer, metazoiske parasitter, bakterier, mycoplasma, vira eller præparater herfra.

4. Porøst bærelegeme ifølge krav 1, kendeteg-30 net ved, at det er i form af et ark eller et stykke banemateriale.

5. Porøst bærelegeme ifølge krav 4, kendetegnet ved, at arket eller banematerialet har en tykkelse DK 160336 B 62 i det omtrentlige område fra 0,01 til 0,5 mm.

6. Porøst bærelegeme ifølge krav 4, kendeteg net ved, at arket eller banematerialet har en tykkelse på omtrent 0,1 mm.

7. Porøst bærelegeme ifølge krav 1, kendeteg net ved, at bærelegemets materiale er udvalgt fra gruppen bestående af A) naturlige polymere kulhydrater og deres kunstigt ændrede, krydsbundne eller substituerede derivater, udvalgt fra gruppen bestående af a) agar, agarose, krydsbunden algin- 15 syre, substituerede og krydsbundne guar-gummier, krydsbundne dextran-polymere og stivelser, b) regenererede cellulo-ser, celluloserestere, blandede celluloseestere, cellulo-seethere, B) naturlige nitrogenholdige polymere, udvalgt fra gruppen 20 bestående af proteiner og deres derivater, C) naturlige carbonhydridpolymere,udvalgt fra gruppen bestående af latexer og gummier, D) kunstige polymere, der kan fremstilles eller præpareres med passende porøse strukturer, udvalgt fra gruppen beståen- 25 de af a) vinyl-polymere og deres partielt hydrolyserede derivater, polyacrylater, polyacrylamider, polymethacrylater, b) copolymere og terpolymere af de ovennævnte vinyl-monomere indbyrdes og med andre monomere, c) polyestere og polyamider, d) polyurethaner eller polyepoxider,

30 E) uorganiske materialer, der kan fremstilles eller præpareres i en passende porøs form, udvalgt fra gruppen bestående af sulfater eller carbonater af jordalkalimetaller og magnesium, silicater af alkali- og jordalkalimetaller og/eller aluminium og/eller magnesium, oxider eller hydrater af aluminium eller kisel, samt P) blandinger eller copolymere eller podnings-copolymere af de ovennævnte klasser. DK 160336 B 63

8. Porøst bærelegeme ifølge krav 7, kendetegne t ved, at bærelegemets materiale er en celluloseester med salpetersyre eller med en aliphatisk carboxylsyre med mellem 1 og 7 carbonatomer, eller en blanding af sådanne 5 estere.

9. Porøst bærelegeme ifølge krav 8, kendetegnet ved, at der som celluloseester med salpetersyre anvendes nitrocellulose med omtrent tre salpetersyregrupper for hver seks carbonatomer.

10. Porøst bærelegeme ifølge krav 1, kendeteg net ved, at de afgrænsede antigen- eller immunoglobulin-områder er i form af små prikker med diametre mindre end 2 mm eller i form af streger med en bredde på 2 mm eller mindre.

11. Porøst bærelegeme ifølge krav 1, kendeteg ne t ved, at mønsteret består af en enkelt prik af antigen eller immunoglobulin.

12. Porøst bærelegeme ifølge krav 1, kendetegnet ved, at antigenerne eller immunoglobulinerne er 20 blevet påført på bærelegemet ved manuel eller mekanisk pipettering eller ved hjælp af væske eller gasformige drivmidler.

13. Porøst bærelegeme ifølge krav 2, kendetegnet ved, at nucleinsyrer er påført bærelegemet, efter- 25 fulgt af bagning af bærelegemet ved temperaturer i området fra 60 til 12Q°C i et tidsrum, der varer mellem 5 minutter og 12 timer.

14. Analysesæt til immunologisk analyse, kendetegnet ved, at det omfatter et porøst bærelegeme ifølge krav 30 1, der er præpareret med antigener eller immunoglobuliner og eventuelt blokerings-proteiner eller kombinationer heraf, bakker eller andet mekanisk udstyr til udførelse af de DK 160336 B 64 immunologiske reaktioner, samt reagenser for et indikatorsystem i form af forud præparerede alikvoter eller i dehydreret form.

15. Analysesæt ifølge krav 14, kendetegnet 5 ved, at det omfatter et indikator-antistof.

16. Analysesæt ifølge krav 14, kendetegnet ved, at det mekaniske udstyr omfatter en formstofbakke med et stort antal hulrum, og at reagenserne er tilvejebragt i form af en lyofiliseret blanding af indikator- 10 antistof, salte, puffere, bære-serum eller -protein, samt forud bestemte mængder af indikator-enzym-kromogent substrat, salte, puffere, samt ampuller indeholdende forud udmålte rumfang af væskeformige substrater.

17. Analysesæt ifølge krav 14, kendetegnet 15 ved, at et porøst bærelegeme, der indeholder et mønster af et eller flere specifikke antistoffer og reagenser for et signalerings-system, hvormed antigen-antistof-reaktionen resulterer i et måleligt signal, idet signalerings-systemet omfatter et substrat, en cofaktor eller en prosterisk 20 gruppe for et indikator-enzym eller en som indikator fungerende koblet række af enzymer, eller et covalent addukt mellem antigen og signaleringsmolekylet.

18. Analysesæt ifølge krav 17, kendetegnet ved, at enzymet eller det koblede enzymsystem enten er på- 25 ført sammen med det specifikke antistof på det porøse bæ-relegeme eller er påført adskilt fra det specifikke antistof eller slet ikke.

19. Analysesæt ifølge krav 14, kendetegnet ved, at mønsteret på det porøse bærelegeme indeholder 30 immunoglobuliner af human eller dyrisk oprindelse eller fragmenter deraf, med henblik på påvisning og kvantitativ bedømmelse af rheumatoid-faktor, eller komplement-protein DK 160336 B 65 til påvisning og kvantitativ bedømmelse af cirkulerende antigen-antistof-komplekser, der kendes som cirkulerende immun-komplekser.

20. Anvendelse af det porøse bærelegeme ifølge krav 5 1-13 eller analysesættet ifølge krav 14-19 til påvisning og kvantitativ bedømmelse af specifikke antigener eller specifikke antistoffer eller begge dele, ved immunologiske bedømmelsesmetoder for diagnose, overvågning og prognose af sygdomme hos mennesker og dyr, eller til eftersøg-10 ning, påvisning og kvantitativ bedømmelse af monoklone eller andre antistoffer eller antigener i forskning og udvikling.