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Zweistufiger Agglutinationsschnelltest zum kombinierten
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Nachweis "seropositiver" und "seronegativer" Rheumafaktoren
BESCHREIBUNG
Es ist bekannt, daß man Rheumafaktoren der IgM-Klasse rnittels direkter Aggl utinationsreaktionen
in Körperflüssigkeiten n achwei sen kann.
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Folgende Methoden sind bekannt: 1.) Waaler-Rose-Methode: IgG von Kaninchen
wird immunologisch an Hammelerythrocyten gebunden.
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2.) Latex-RF-Methode Humanes IgG wird auf Latexpartikel adsorbiert.
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Bei beiden Methoden sind die Fc-Enden des Beladungs IgG weitgehend
nach außen, vom Partikel weg, orientiert. Die IgM-RF binden im Bereich des F -Endes
der durch die Adsorption konformationsverc änderten IgG1s, überbrücken das sogenannte
Zetapotential zwischen einzelnen Partikeln und bilden schließlich größere, visuell
erkennbare Agglutinate.
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Die mit diesen Methoden nicht nachweisbaren Rheumafaktoren (RF) wurden
als "seronegative" RF jedoch für die Rheumadiagnostik zunehmend interessanter, zumal
sie nach dem heutigen Kenntnisstand wahrscheinlich besser mit dem Krankheitsgeschehen
korrelieren, als die als recht unspezifisch bekannten IgM-RF. Trotz alledem sind
sie bisher diagnostisch nur sehr umständlich faßbar. Ein für die Routine geeignetes
Verfahren ist nicht bekannt.
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Beim Nachweis der IgM-RF werden normalerweise IgG - und IgA-RF (falls
auch vorhanden) zum Teil mit an die beladenen Partikel gebunden, sodaß sich IgG-RF
und IgA-RF dem speziellen Nachweis aus dem überstand weitgehend entziehen.
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In IgM-freien Seren, die man natürlich auch aus seropositiven Rheumatikerseren
durch Filtrations- oder Elektrophoresetechniken oder durch chrornatographische Verfahren
erhalten kann, konnte man bisher keine Rheumafaktoren anhand einer Aggl utinationsreaktion
nachweisen.
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Aufgabe der Erfindung ist der einfache Nachweis dieser "seronegativen"
RF durch erkennbare Agglutinationsreaktionen. Voraussetzung ist hierfür die Verwendung
von IgG einer vom Menschen verschiedenen Spezies zur Beladung der Partikel, da Rheumafaktoren
hierzu spezifisch in ihrer Eigenschaft als human-Globuline nachgewiesen werden sollen
und somit Kreuzreaktionen oder gar spezifische Reaktionen mit der Basisbeladung
stören würden.
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Das für diesen Nachweis verwendete Antihuman-Globulin bzw. Antihuman
IgG muß ebenfalls frei von Kreuzreaktivitäten bezüglich des in der Basisbeladung
verwendeten IgG ' s sein und hierzu entsprechend vorbereitet werden.
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Überraschenderweise ist es erfindungsgemäß gelungen, mit demselben
Reagenz IgM-RF und nach chromatographischer Aufreinigung von Rheumatikerseren auch
in der IgG-RF-Fraktion Rheumafaktoren durch positive Agglutinationsreaktion nachzuweisen.
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Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis von
Rheumafaktoren (RF) der IgG- bzw. IgA-Klasse (sog. "seronegative" RF) mittels der
direkten Agglutinationsmethode, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem ersten
Schritt ein beliebiges nichthumanes IgG auf für Agglutinationsreaktionen geeignete
Partikel adsorbiert oder chemisch koppelt und dies als Reagenz mit der die "seronegativen"
RF enthaltenden Körperflüssigkeit in Verbindung bringt, wobei die Rheumafaktoren
im Fc-Bereich des adsorbierten IgG binden, aber - als "seronegative" RF - keine
Agglutinationsreaktionen verursachen und daß man in einem zweiten Schritt die so
gebundenen RF mittels tierischem und nicht mit dem Basis-IgG kreuzreagierenden Anti-human-Globulin
als human-Globuline (IgG oder IgA) in einer positiven Agglutationsreaktion nachweist.
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Rheumafaktoren sind als Autoimmunproteine unterschiedlicher und oft
undefinierter Spezifität vorwiegend bei Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises
nachweisbar. Meist handelt es sich dabei un Immunglobuline der IgM- und IgG-Klasse,
aber auch der IgA-Klasse, sowie um Immunkomplexe und möglicherweise Bruchstücke
der genannten Strukturen.
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Von IgM- und IgG-Rheumafaktoren ist die immunologische Bindungsaffinität
zum F -Bereich von adsorbiertem und dadurch in seiner c Konformation verändertem
IgG verschiedenster Spezies bekannt.
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Aus dieser Eigenschaft resultiert auch Bauweise und Funktion der beiden
bekannten Screening-Diagnosesysteme für Rheumafaktoren.
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Beim Waaler-Rose-Verf ah ren werden Schaferythrocyten mit Anti-Schaferythrocyten-IgG
vom Kaninchen immunologisch beladen, wodurch die F -Domänen der Kaninchen-IgG's
vom Partikel wegdeuten und c sich somit den Rheumafaktoren anbieten. Die Verknüpfung
vieler Erythrocyten führt dann zur Ausbildung eines makroskopisch erkennbaren Netzwerkes.
Es tritt "Agglutination" ein.
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Entsprechende Orientierung von IgG verschiedener Spezies, bevorzugt
aber von humanen IgG auf Latexpartikeln kann durch geeignete Adsorptions- bzw. Beladungstechniken
erreicht werden und wird in den bekannten Latex-RF-Tests zum Nachweis von Rheumafaktoren
genutzt.
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Zwischen beiden Methoden sind geringfügige Spezifitätsunterschiede
erkennbar, weswegen beide Methoden in der Rheumadiagnostik parallel angewandt werden.
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IgG unterschiedlicher Spezies ( Proc. Int. Sym. 1971, S. 79-82) ergeben
bei der Verwendung für den Latex-RF-Test leicht unterschiedliche Ergebnisse bei
verschiedenen nichtrheumatischen Erkrankungen, jedoch lassen sich auch hiermit die
"seronegativen" RF nicht erfassen. Das zu überbrückende Zetapotential bleibt für
IgG-RF zu hoch.
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Neuerdings ist ein wachsendes klinisches Interesse am diagnostischen
Nachweis der "seronegativen" RF (die also weder mit dem Waaler-Rose-Verfahren noch
im Latex-Test erkennbar sind) zu beobachten.
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Einerseits ist die Nichtnachweisbarkeit von RF bei subjektiv schweren
rheumatischen Beschwerden unbefriedigend, zumal man im Frühstadium der Erkrankung
noch am ehesten therapeutische Chancen sieht.
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Andererseits ist die mangelnde Korrelation der IgM-RF mit der Krankheitsentwicklung
unbefriedigend und man verspricht sich hier von den IgG-RF eine bessere Hilfe.
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Ausgehend von Tier-IgG-Latexbeladungen, mit denen man IgM-RF nachweisen
kann, ergibt sich, unter Verwendung von nicht mit diesem Tier-IgG kreuzreagierenden
Anti-human-Glubulin (AHG) oder von Antihuman-IgG die Möglichkeit die immunologisch
gefundenen "seronegativen" RF in einer Agglutinationsreaktion analog dem bekannten
serologischen Coombs-Test nachzuweisen. Hierbei ist die Verwendung eines viel IgM
enthaltenden AHG's besonders günstig.
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Zur Herstellung des Latexreagenz für dieses Verfahren werden für immunologische
Agglutinationstests geeignete Partikel insbesondere Latexpartikel (weiß oder farbig)
als Grundlage verwendet.
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Als Latex dient vorzugsweise Polystyrollatex (das ggf. auch chemisch
modifiziert eingesetzt werden kann, um eine chemische Kopplung zu erleichtern),
wobei Partikel mit einem Durchmesser von 0,1 - 2 jum, bevorzugt aber von 0,2 - 1
pm, als 0,05 - 30prozentige, bevorzugt aber 1 - 4prozentige Suspension in Wasser
oder Puffer eingesetzt werden. Als Puffer eignen sich alle gängigen Beladungspuffer,
bevorzugt werden daher Glycin-NaCl-Puffer zwischen 0,01 und 1 m Glycin, bevorzugt
zwischen 0,2 und 0,5 m und pH 6 - 10 bevorzugt pH 6,5 und 8,2, wobei die NaCl-Konzentration
zwischen 0 und 5 %, bevorzugt aber bei 0,8 % und 2 % liegen kann.
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Als IgG-Präparation wird Tierserum, bevorzugt Serum vom Schwein oder
Hund z.B. durch Ammoniumsulfatfällung bezüglich IgG angereichert und diese IgG-Fraktion
als 2 - 20prozentige Proteinlösung zur Beladung verwendet.
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Zur Beladung werden Latexsuspension, Puffer und IgG-Präparation in
einem geeigneten Gefäß gemischt und inkubiert, hierbei sind Rührbedingungen, Temperaturführung
und Zeit von Bedeutung.
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Es hat sich als günstig erwiesen, die Latexsuspension nach der Beladung
zu zentrifugieren und in einem evtl. von Beladungspuffer unterschiedlichen Endpuffer,
der evtl. Albumin und Verstärkungsfaktoren enthält, zu resuspendieren. Das Reagenz
wird 0,05 -10 %ig vorzugsweise aber 1 - 4 %ig bezüglich Latex (Gewicht g/100 ml)
angewendet.
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In der ersten Stufe der RF-Testdurchführung wird im beschriebenen
System 1 Tropfen Latexreagenz mit einem Tropfen Serum auf einer Testplatte vermischt,
im ovalen Fleck dann ca. 2 Minuten durch Schwenken der Glasplatte gemischt und zwischen
1 und 10 Minuten.
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bevorzugt aber bei 2 Minuten auf Agglutination geprüft.
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Positive Agglutinationsreaktion bedeutet die Anwesenheit von IgM-RF
mit oder ohne IgG-RF oder IgA-RF. Zur Prüfung auf IgG-RF ist bei einem solchen Serum
eine Vortrennung durch z.B. Ultrafiltration (oder aber durch chromatographische
evtl. auch elektrophoretische Methoden) notwendig. Keine Agglutinationsreaktion
auf dieser Stufe bedeutet die Abwesenheit von IgM, gegebenenfalls anwesende "seronegative"
RF (IgG- bzw. IgA-RF) reagieren nicht.
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Um auf IgG oder IgA zu untersuchen, wird in einer zweiten Stufe jetzt
das Testreagenz (Latexsuspension) mit dem zu testenden Serum ert, d.h. bei 4 - 60
OC bevorzugt aber bei 30 C für 5 - 60 Minuten, bevorzugt 5 - 30 Minuten geschwenkt.
Hierzu eignet sich besonders ein Polyethylenröhrchen (Minisorb , wobei Reagenz und
Serum bevorzugt 1 : 1 also z.B. 50 pl und 50 p1 eingesetzt werden.
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Nach dieser Inkubationsphase wird ein Tropfen der jetzt "doppelt beladenen"
Latex-Suspension mit einem Tropfen AHG-Lösung auf der Testp]atte verrührt und wie
auf Stufe I 2 Minuten geschwenkt. Eine positive Agglutinationsreaktion innerhalb
von 2 - 30 Minuten (bevorzugt 2 - 10 Minuten) weist "seronegative" Rheurnafaktoren
des IgG- bzw. IgA-typs nach.
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Das AHG-Reagenz bzw. das Anti-human IgG wird folgendermaßen präpariert:
Anti-human-Globilinserum (bzw. Antihuman-IgG-Serum ) der IgM-Phase von Ziege, Schaf
oder Kaninchen - wie es auch im Coombstest verwendet wird - wird mit sphärischen
Proteinpartikeln (vgl.
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Patentanmeldung P 34 19 782.6) hergestellt aus Tierserum der Spezies,
deren IgG für die Latexbeladung verwandt wurde, also bevorzugt von Schwein und Hund,
inkubiert (Zeit 30 - 60 Minuten.
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bei 4 - 60 C, bevorzugt bei 30 OC).
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Danach werden die Partikel durch Zentrifugation abgetrennt und ggf.
für einen neuen Adsorptionsschritt regeneriert. Das AHG-Reagenz wird aufkonzentriert
(Proteingehalt 0,5 - 10 %,bevorzugt 5 %) und dann mit der Latexsuspension gemäß
Stufe I, d.h. 1 : 1 ohne Zusatz von humanem Serum auf Kreuzreaktionen geprüft. Zur
kritischeren Prüfung sollte bis zu 10 Minuten auf Agglutination geprüft werden,
falls auch nur Anzeichen einer Kreuzreaktion zu bemerken sind, wird nochmals in
der beschriebenen Weise mit Proteinpartikeln adsorbiert.
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In der gleichen Weise kann anstelle von AHG auch mit Anti-human-IgG-Serum
verfahren werden, wenn man nur IgG-RF nachweisen möchte.
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Ein Testkit für das beschriebene Nachweisverfahren besteht aus - Latexsuspension,
beladen mit IgG (Stufe I) - AHG-Reagenz (Stufe II) - Testbesteck (Kontrollreagenzien,
Testplatte etc.)