ES2227605T3 - Tampon de almacenamiento de sal de borato y diluyente de muestra. - Google Patents
Tampon de almacenamiento de sal de borato y diluyente de muestra.Info
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Abstract
UNA COMPOSICION, QUE TIENE UTILIDAD COMO TAMPON DE ALMACENAJE Y COMO DILUYENTE DE LA MUESTRA ANTES DEL ANALISIS POR ELECTROFORESIS CAPILAR DE ZONA (CZE), FORMADO POR AGUA, UN COMPUESTO DE BORATO, UN COMPUESTO TAMPON Y UN MODIFICADOR DE PH PARA MANTENER UN PH FISIOLOGICO. ADEMAS, ESTA PRESENTE UN COMPUESTO DE AJUSTE DE LA CONDUCTIVIDAD DE FORMA QUE LA CONDUCTIVIDAD DE LA COMPOSICION SEA APROXIMADAMENTE IGUAL A LA DEL TAMPON UTILIZADO EN UNA ELECTROFORESIS CAPILAR PROSPECTIVA. LOS RECIPIENTES CON EL TAMPON PARA ALMACENAJE/DILUCION DE LA MUESTRA PUEDEN ENSAMBLARSE EN UN KIT PARA LA REALIZACION DE ELECTROFORESIS DE PROTEINAS DEL SUERO (SPE) O ANALISIS POR IMMUNOSUSTRACCION (IFE/S). ADEMAS, EL TAMPON PARA ALMACENAJE/DILUCION DE LA MUESTRA PUEDE USARSE EN METODOS PARA PREPARACION DE MUESTRAS PARA ANALISIS POR CZE, TALES COMO DILUCIONES CUANTITATIVAS Y REACCIONES INMUNOLOGICAS O ENZIMATICAS.
Description
Tampón de almacenado de sal de borato y diluyente
de muestra.
El análisis proteínico de muestras clínicas, tal
como sangre completa, suero, plasma, liquido cerebroespinal y orina,
puede facilitar información valiosa al investigador. Por ejemplo,
los niveles altos y bajos de ciertos componentes proteínicos del
suero, tal como albúmina, alfa-1 lipoproteína,
alfa-2 macroglobulina, beta-1
lipoproteína, e inmunoglobulinas (que incluyen las gammaglobulinas)
pueden indicar una enfermedad o trastorno físico subyacente.
Un ejemplo típico, es la albúmina, la proteína
principal del suero. La albúmina está habitualmente presente en una
concentración entre 3,2 y 5,0 g/dl. Unas concentraciones inferiores
de albúmina pueden ser indicativas de enfermedad renal, mientras
que unas concentraciones mayores de albúmina son características de
la deshidratación. Un segundo ejemplo es el aumento de la alfa 1
lipoproteína, que puede ser indicativa de alcoholismo crónico o
hiperestrogenismo debido, p. ej. al embarazo. Un ejemplo adicional
es el que los niveles elevados de beta-1
lipoproteína, pueden ser indicativos de un colesterol elevado.
El análisis del aumento y tipo de
inmunoglobulinas es particularmente importante en el diagnóstico de
"gamopatías monoclonales". Estas anomalías se caracterizan por
inmunoglobulinas del mismo idiotipo, que se producen a niveles
elevados por clones de una sola célula B no regulada. Las
gamopatías monoclonales no causan necesariamente trastornos
clínicos en un individuo. Se puede indicar esta situación como una
"gamopatía monoclonal benigna" o "gamopatía monoclonal de
importancia indeterminada". Sin embargo, muchos trastornos
clínicos están asociados a la gamopatía monoclonal. Por ejemplo, se
asocia la IgM monoclonal, es decir un aumento en la producción de
un idiotipo IgM por clones de célula B no regulada, a la
macroglobulinenia de Waldenström. Como la IgM tiene un peso
molecular relativamente alto, se asocia el aumento de la producción
de IgM al aumento de la viscosidad de la sangre del paciente,
llamada "hiperviscosidad". Se asocia la hiperviscosidad a
síntomas, tales como dolor de cabeza, mareo y vértigo.
El mieloma múltiple es otro trastorno clínico
asociado a la gamopatía, que puede manifestarse con un aumento de
los idiotipos IgG, IgA, IgD o IgE. Por otra parte, las cadenas
ligeras kappa o lambda o gama, alfa, mu o las cadenas pesadas delta
pueden ser elevadas. Una característica patológica principal del
mieloma múltiple es la destrucción ósea, es decir la deformación
ósea o las fracturas patológicas dolorosas agudas. Clínicamente, el
paciente puede experimentar dolor óseo, infecciones debidas a la
menor producción de Ig normal y anemia. El veinte por ciento de los
pacientes con mieloma produce proteínas Bence Jones, que son
cadenas ligeras monoclonales libres. Por su tamaño relativamente
pequeño, las proteínas Bence Jones son normalmente excretadas en la
orina del paciente. El mieloma múltiple puede igualmente afectar al
tejido neural, es decir la médula espinal, las raíces nerviosas y
los nervios craneales o periféricos.
Las proteínas del suero, incluidas las
inmunoglobulinas, pueden ser separadas utilizando métodos
electroforéticos normalmente geles sometidos a un campo eléctrico.
De manera similar, las proteínas de muestras clínicas pueden ser
analizadas igualmente utilizando electroforesis capilar zonal
("CZE"). Ver, por ejemplo, Chen, Fu-Tai, et
al.. "Capillary Electrophoresis " - A New Clinical Tool.
Clin. Chem. 77/1:14-19 (1991): ver igualmente, la
Patente U.S. No. 5.120.413.
La técnica CZE permite separaciones rápidas y
eficientes de sustancias cargadas, incluidas las proteínas. La
separación de los constituyentes de muestras clínicas puede
realizarse en menos de 20 minutos, normalmente en menos de 10
minutos. En general, la CZE implica la introducción de una muestra
líquida en un tubo capilar lleno de un tampón electrolítico normal.
El tubo capilar habitualmente tiene un diámetro interno de unos 2 a
2000 micras aproximadamente ("\mum"). La aplicación de un
campo eléctrico al tubo al mismo tiempo arrastra la muestra a
través del tubo y la separa en sus partes constituyentes. Por
consiguiente, cada uno de los constituyentes de la muestra tiene su
propia movilidad electroforética individual. Aquellos que tienen
una mayor movilidad se desplazan por el tubo capilar más
rápidamente que los que tienen una movilidad más lenta. Como
resultado, los constituyentes de la muestra se resuelven en zonas
discretas del tubo capilar durante su migración a través del tubo.
Se puede utilizar un detector en-línea para
controlar de forma continua la separación y proporcionar datos
sobre los diversos constituyentes basados en las zonas
discretas.
discretas.
La composición del tampón normal es un factor
importante en las separaciones de la CZE. Los compuestos de borato,
en particular, han demostrado ser útiles como constituyentes de los
tampones normales CZE. Además, para proporcionar baja conductividad
y suficiente capacidad de tampón en la gama de pH de unos 8 a 11,
los boratos pueden formar complejos estables con residuos de azúcar
en las glicoproteínas. Por consiguiente, se modifica la movilidad
electroforética de una glicoproteína, eluyendo con pico más tardío
que una homóloga de proteína no modificada. Dicha complexación de
constituyentes de azúcar depende fuertemente del pH del tampón y la
concentración de borato, ambos parámetros pueden ser ajustados para
la optimización de un tampón de electroforesis. En general, un pH
más alto y una mayor concentración de borato dan por resultado una
mayor proporción de las especies complexada y en una carga neta más
negativa. Pueden encontrarse ejemplos de borato que contengan
tampones de electroforesis en la Patente U.S. No. 5.120.413.
La especificidad del ligante asociada con
anticuerpos y su(s) agente(s) ligante(s)
antigénico(s) receptivo(s) ha sido ampliamente
utilizada para identificar clínicamente proteínas importantes. La
Inmunoelectroforesis, Electroforesis de Inmunofijación y la
Electroforesis de Inmunosubstracción (IFE/s) son ejemplos de
métodos inmunológicos que se utilizan en conjunción con una fase de
separación electroforética. En particular, las IFE/s son aptas para
explotar tanto la velocidad de la electroforesis capilar como la
especificidad de las reacciones inmunológicas que implican antígenos
y anticuerpos. Ver por ejemplo, la Patente U.S. No. 5.228.960.
Durante las IFE/s, se preincuba una muestra
clínica con un agente ligante específico dirigido a un
constituyente de muestra. El agente ligante específico es
normalmente una inmunoglobulina insolubilizada, que puede retirarse
substancialmente de la muestra. Una comparación de partes alícuotas
de muestra, que hayan sido sometidas o no a la inmunosubstracción,
mediante análisis CZE. La ligazón del agente ligante específico
insolubilizado puede dar por resultado una reducción elevada del
nivel de un constituyente de muestra. De este modo, la
inmunosubstracción puede revelar la identidad del constituyente de
la muestra. Este método es particularmente útil en la
identificación y tipificación de las gamopatías monoclonales.
Generalmente se diluyen las muestras clínicas
antes del análisis por electroforesis capilar. Dicha dilución
facilita entre otros que se logre una relación analítica deseada, y
ayuda asimismo para la utilización de la sensibilidad asociada al
análisis de electroforesis capilar. Una muestra clínica no diluida,
en particular suero, puede proporcionar demasiado componente
proteínico dificultando el análisis. Cuando se analicen directamente
especímenes clínicos directamente mediante electroforesis capilar,
se elige el diluyente normalmente para que sea compatible con el pH
y la conductividad del tampón de electroforesis. Alternativamente,
cuando se llevan a cabo procedimientos bioquímicos, tales como
reacciones enzimáticas o inmunológicas, antes de realizar el
análisis electroforético, es generalmente apropiado un diluyente
salino ligeramente tamponado que no afecte a los componentes de
reacción de manera
perjudicial.
perjudicial.
Se realiza frecuentemente la localización previa
de las anomalías de proteínas del suero mediante electroforesis de
proteína del suero (SPE). En caso de que se detecte la posibilidad
de una anomalía, se puede llevar a cabo una segunda prueba
inmunológica o enzimática para obtener un diagnóstico más
definitivo. Por ejemplo, se puede utilizar la inmunosubstracción
(IFE/s) para el seguimiento de un análisis cuando se sospeche una
gamopatía. Asimismo, el procedimiento (IFE/s) o enzimático incluye
normalmente una separación tipo SPE concurrente para los efectos de
comparación.
Como los electroferogramas SPE e IFE/s están
sujetos a comparación directa, sería ventajoso que los tampones y
los diluyentes utilizados para preparar las muestras para el
análisis CZE fueran substancialmente idénticos. El tampón de
almacenado ideal debiera ser compatible con los requisitos de los
IFE/s para almacenar reactivos inmunológicos y llevar a cabo
reacciones de inmunosubstracción. Asimismo, el diluyente de muestra
ideal debiera ser compatible con el tampón normal utilizado para la
fase de análisis de CZE de SPE e IFE/s. El uso de un
tampón/diluyente substancialmente idéntico para SPE e IFE/s
contribuiría a eliminar cualquier resultado contradictorio que se
observe para los dos métodos. Asimismo, el uso de un solo tampón de
diluyente/almacenamiento de muestra para ambos métodos introduce
una simplificación interesante a nivel de costes del
almacenamiento, fabricación, embalado y procedimientos de
documentación.
La presente invención cumple las necesidades de
una composición que puede ser utilizado a la vez como tampón de
almacenado y como diluyente de muestra antes de la electroforesis
capilar de una muestra clínica, eliminando de este modo la
necesidad de formulaciones separadas. La composición comprende; (a)
agua, (b) compuesto de borato presente en una cantidad de 5 a 150
mM, (c) un compuesto de tampón con una gama de tamponado efectivo
de pH de 6 a 8 y un modificador de pH presente en una cantidad
suficiente para ajustar el pH del compuesto entre 6 y 8; y el
compuesto de borato está presente como ácido bórico en una cantidad
de 20 mM a 150 mM o como tetraborato en una cantidad de 10 mM a 40
mM.
El tampón de almacenado o diluyente de muestra de
la presente invención difiere substancialmente de los tampones
utilizados en la técnica. La patente U.S. 5.120.413 describe un
tampón normal de electroforesis capilar que contiene ácido bórico y
sal de borato. La patente U.S. Nº 5.120.413 describe el uso de un
tampón para diluir muestras de suero. Se utiliza una composición
separada que contiene borato, tal como tampón de electrolito. James
P. Landers et al. (Anylitical Biochemistry, tomo. 205, nº 1,
16 de Agosto 1992, páginas 115-124) describe un
tampón normal utilizado para almacenar y diluir muestras. La
introducción de las reivindicaciones unidas a la misma se basa en la
patente EP-A-0494544 que describe
numerosos tampones útiles en la electroforesis capilar, incluyendo
el tampón normal de electroforesis que contiene 6 mM de borato
sódico.
El compuesto de tampón está normalmente presente
en una cantidad de aproximadamente 5 a 25 mM. Los compuestos de
tampón preferidos pueden elegirse del grupo que consiste en fosfato
sódico, fosfato potásico, acetato sódico y ácido
2-tris(hidroximetil)metilamino-etanosulfónico
(TES). El modificador de pH es normalmente hidróxido sódico, ácido
clorhídrico o fosfato potásico. El compuesto de ajuste de la
conductividad está normalmente presente en una cantidad de
aproximadamente 1 a 150 mM y se puede elegir del grupo que consiste
en cloruro sódico, cloruro potásico y una mezcla de cloruro sódico y
cloruro potásico.
Las muestras clínicas preparadas para el análisis
electroforético pueden ser sangre completa, plasma, suero, orina o
líquido cerebroespinal. Los constituyentes de muestra de particular
interés incluyen la inmunoglobulina humana, la transferrina, la
beta-lipoproteína y el complemento C3.
El tampón de almacenado/diluyente de muestra
puede igualmente contener al menos un marcador externo que puede ser
de la especie iónica o de carga neutra, para ayudar a la
identificación y/o cuantificación de los picos de constituyentes
durante el análisis electroforético. Las especies iónicas pueden
seleccionarse del grupo consistente en ácido fórmico, ácido
acético, ácido benzofosfórico, ácido propiónico, ácido
isopropiónico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido benzoico,
ácido benzosulfónico, ácido o-clorobenzóico, ácido
m-clorobenzóico, ácido
p-clorobenzóico, ácido triclorobenzóico, ácido
naftilsulfónico, ácido benzonaftalínico, ácido
clorobenzonaftalínico , ácido cloronaftilsulfónico, ácido
tetrayodobenzonaftilsulfónico, y ácido
di-yodoantracenilsulfónico. Las especies de carga
neutra pueden ser alcohol de bencilo, óxido de mesitilo.
isopropanol, metanol, etanol, etilenglicol, dimetilformamida (DMF),
formamida, péptidos protegidos o ácidos aminos protegidos.
Cuando se utiliza la composición para
inmunosubstracción de electroforesis capilar, comprende asimismo al
menos un agente ligante específico de un constituyente de la
muestra. De preferencia, el agente ligante específico puede ser
retirado substancialmente del compuesto, por ejemplo ligando un
material insolubilizado. El anticuerpo antihumano es un agente
ligante específico particularmente útil para los fines de
diagnóstico, en especial el anticuerpo de inmunoglobulina
antihumana.
Un modo de realización preferido del tampón de
almacenado/diluyente comprende a) agua; b) tetraborato sódico
presente en una cantidad de unos 10 mM; c) fosfato sódico presente
en una cantidad de aproximadamente 20 mM; c) cloruro sódico
presente en una cantidad suficiente para ajustar la conductividad
del compuesto a aproximadamente 7 mMho; y e) un modificador de pH
presente en una cantidad suficiente para ajustar el pH a
aproximadamente 7.
La composición puede ser un componente de kits de
prueba utilizado para la preparación de muestras antes de la
electroforesis de proteína de suero (SPE) o la inmunosubstracción
eletroforética capilar (IFF/s). Los kits de SPE pueden incluir un
primer recipiente, que contenga el borato que contenga el diluyente
descrito más arriba, y un segundo recipiente para retener
la(s) muestra(s) durante la dilución. El kit de IFE/s
puede incluir un primer recipiente que incluya diluyente sin ningún
agente ligante específico, y un segundo recipiente que tenga tampón
de almacenado/diluyente que si que incluya un agente ligante
específico.
Asimismo, se puede utilizar el compuesto en
métodos para la preparación de muestras antes del SPE e IFE/s. Los
métodos pueden incluir las fases de medir, una parte alícuota de
una muestra clínica y la dilución de la muestra con de 1 a 100
partes de tampón de almacenado/diluyente.
Se deducirán estas y otras características,
aspectos y ventajas de la presente invención con relación a la
siguiente descripción, reivindicaciones acompañatorias y dibujos
unidos en los cuales:
La Fig. 1A es un electroferograma de una muestra
de suero de control normal diluida en 150 mM de tampón de borato,
(37,5 mM de tetraborato sódico), pH 10.0, con marcadores de alcohol
de bencilo y ácido triclorobenzóico, separados en sus constituyentes
por CZE.
La Fig. 1B es un electroferograma de una muestra
de suero de control normal diluida en 150 mM de tampón de borato,
(ácido bórico), pH 7.0, con marcadores de alcohol de bencilo y
ácido triclorobenzóico, separados en sus constituyentes por
CZE.
La Fig. 1C es un electroferograma de una muestra
de suero de control normal diluida en 20 mM de fosfato potásico, 75
mM de tampón cloruro sódico, pH de 7.0, con marcadores de alcohol de
bencilo y ácido tricolorobenzóico, separados en sus constituyentes
por CZE.
La Fig. 1D es un eletroferograma de una muestra
de suero de control normal diluida en 20 mM de fosfato potásico, 75
mM de tampón de cloruro sódico, pH 10.0, con marcadores de alcohol
de bencilo y ácido tricolorobenzóico, separados en sus
constituyentes por CZE.
La Fig. 2A es un primer electroferograma de una
muestra de suero de control normal diluida en 10 mM de TES, 70 mM de
NaCl, pH 7.0, con marcadores de alcohol de bencilo y ácido
tricolorobenzóico, separados en sus constituyentes por CZE.
La Fig. 2B es un segundo electroferograma de la
misma muestra de control de suero normal que la Fig. 2A separada en
sus constituyentes por CZE bajo idénticas condiciones.
La Fig. 3 es un electroferograma de la misma
muestra de control de suero normal que las Fig. 2A y 2B, diluida en
10 mM de TES, 10 mM de tetraborato de sodio y 55,5 mM de NaCl, pH
7,0, separada en sus constituyentes por CZE.
La Fig. 4A es un electroferograma de la misma
muestra de control de suero normal diluida en 20 mM de fosfato
sódico, 10 mM de tetraborato sódico, 0,1% de ázida sódica, y 29,6%
de mM de NaCl, pH 7.0, separada en sus constituyentes por CZE; y
la
Fig. 4B es un segundo eletroferograma de la misma
muestra de control de suero normal que la Fig. 4A separada en sus
constituyentes por CZE bajo idénticas condiciones.
La presente invención es una composición que se
puede utilizar tanto como tampón de almacenado como diluyente para
muestras y reactivos bioquímicos antes del análisis de CZE. La
composición incluye agua, un compuesto de borato, un compuesto
tampón y un modificador de pH para mantener un pH fisiológico.
Asimismo, está presente un compuesto para ajustar la conductividad
de modo que la conductividad de la solución sea aproximadamente la
misma que un tampón normal de electroforesis capilar previsto. Se
pueden montar los recipientes de tampón de almacenado/diluyente de
muestra en un kit para realizar electroforesis de proteína de suero
(SPE) o análisis de inmunosubstracción (IFE/s). Asimismo, se puede
utilizar el tampón de almacenado/diluyente de muestra en métodos
para preparar muestras para análisis de CZE, tales como diluciones
cuantitativas, y reacciones enzimáticas o inmunológicas.
La adición de un compuesto de borato a las
muestras clínicas antes de la electroforesis capilar da por
resultado una mejora en la definición y reproductibilidad de
análisis electroforéticos subsiguientes. Los solicitantes creen que
como muchas de las proteínas encontradas en las muestras clínicas
son glicoproteínas, la complexación del borato con constituyentes
de azúcar puede desempeñar un papel en esta mejora inesperada. Esto
es particularmente ventajoso, porque se puede utilizar una
composición que contenga un borato como tampón de almacenado para
reactivos bioquímicos y como diluyente para muestras clínicas. La
mejora subsiguiente de la definición electroforética permite una
comparación fiable entre muestras clínicas antes y después de una
reacción bioquímica dirigida a un componente de la muestra.
El compuesto de borato es normalmente ácido
bórico o tetraborato sódico, el cual está presente en la composición
en una concentración mínima de 20 nM ó 5 mM, respectivamente. No se
observa ninguna mejora de la definición electroforética con
concentraciones inferiores de borato. De forma similar, tampoco se
observa ninguna mejora adicional en la definición electroforética a
niveles de ácido bórico o tetraborato sódico superiores a unos 160
mM ó 40 mM, respectivamente. De preferencia, el ácido bórico está
presente en una cantidad de entre 30 y 80 mM o el tetraborato
sódico está presente en una cantidad de entre aproximadamente 10 y
20 mM. Una concentración preferida de ácido bórico es de
aproximadamente 40 mM y una concentración preferida de tetraborato
sódico es de 10 mM. Estas concentraciones proporcionan los modelos
de proteínas de suero más reproducibles durante la electroforesis
capilar, en particular la región Beta.
Consistente con el uso de la composición como
tampón de almacenado para reactivos bioquímicos, el pH de la
solución contiene un compuesto tampón, con una gama de tamponado
efectiva de aproximadamente 6 a 8. Esta gama de pH no inactiva las
actividades biológicas de agentes ligantes específicos, tales como
anticuerpos y antígenos o enzimas y substratos. Asimismo, los
reactivos de ensayos utilizan frecuentemente enlaces orgánicos
entre una biomolécula y material de fase sólida, por ejemplo, un
anticuerpo ligado a la agarosa a través de un enlace activado por
CNBr. Estos enlaces son menos susceptibles a la hidrólisis con un
pH 7 aproximadamente.
Los compuestos tampón adecuados incluyen el
fosfato sódico, fosfato potásico, acetato sódico y ácido 2-[tris
(hidroximetil)metil)] amino-etanosulfónico
(TES). Un compuesto tampón preferido es TES, el cual tiene una
capacidad de tamponado dentro de la gama de pH deseada. No
obstante, el compuesto tampón preferido es el fosfato sódico, que
es compatible con las formulaciones salinas tamponadas con fosfato
standard. El compuesto tampón está normalmente presente en una
cantidad de aproximadamente 5 mM a 25 mM. La concentración
mayormente preferida de TES es de aproximadamente 10 mM y la
concentración mayormente preferida de fosfato sódico es de
aproximadamente 20 mM. Se añade una cantidad suficiente de
modificador de pH, tal como hidróxido sódico, ácido clorhídrico o
fosfato potásico, a la composición para llevar el pH entre 6 y 8,
de preferencia entre 6,5 a 7,5, y preferiblemente, de
aproximadamente pH 7.
Para la mejor definición de los constituyentes de
muestra, la conductividad de la composición debiera ser
aproximadamente equivalente a la del tampón normal de electroforesis
capilar previsto. Esto ayuda a atenuar los problemas potenciales
con las asimetrías de pico o los ensanchamientos. Estas anomalías de
pico se pueden desarrollar cuando existe una gradiente de
conductividad en los límites entre la muestra y los compartimentos
de separación del capilar.
Un tampón normal de electroforesis corriente es
de 150 mM de borato, pH 10, el cual tiene una conductividad de
aproximadamente 7 mMho. Se ajusta la conductividad de la presente
invención para que se sitúe aproximadamente entre 5 y 8 mMho, con
mayor preferencia a aproximadamente 7 mMho. Esto se puede lograr
añadiendo cloruro sódico, cloruro potásico o una mezcla de cloruro
sódico y cloruro potásico en una cantidad de hasta 150 mM. Una gama
de concentración preferida para el compuesto de ajuste de la
conductividad se sitúa entre aproximadamente 30 y 120 mM y una
concentración mayormente preferida es de aproximadamente 75 mM.
Las muestras clínicas que se preparen para el
análisis por SPE o IFE/s pueden ser sangre completa, plasma, suero,
orina o liquido cerebroespinal. Los constituyentes de muestra a
separar incluyen normalmente proteínas de suero, tales como
albúmina, transferrina, beta-lipoproteína y
transferrina. Las inmunoglobulinas son constituyentes de muestra de
particular interés para el diagnóstico de las gamopatías
monoclonales. Las inmunoglobulinas incluyen las clases gamma, mu,
alfa, delta y epsilon de cadenas pesadas al igual que cadenas
ligeras kappa y lambda. Tal como se describe más detalladamente a
continuación, los constituyentes de muestra pueden proporcionar
sitios ligantes específicos para agentes ligantes específicos, por
ejemplo antígenos para anticuerpos de inmunoglobulina antihumana.
durante las IFE/s.
Por comodidad, el diluyente de muestra puede
incluir marcadores externos, los cuales son separables de los
constituyentes de la muestra durante el análisis CZE. Los
marcadores externos pueden incluir una especie iónica y/o una
especie de carga neutra que ayude a la identificación y/o
cuantificación de los constituyentes de la muestra. Una especie de
carga neutral tiene una carga neta de cero y tendrá una movilidad
relativa más rápida que las especies cargadas negativamente durante
la CZE. De este modo, las especies de carga neutral aparecerán
antes que todos los demás picos de electroferogramas durante el CZE.
Por "especie iónica" se entiende una especie cargada
negativamente que tenga una mayor densidad de carga que la de cada
uno de los constituyentes principales de la muestra. Por
consiguiente, se detecta la especie iónica después de todos los
picos de constituyentes principales durante el CZE. Los métodos para
utilizar marcadores externos para identificar y cuantificar los
constituyente de la muestra se describen en la Patente U.S. Nº
5.139.630 y 5.228.960, respectivamente. Se puede seleccionar la
especie iónica del grupo que consiste en ácido fórmico, ácido
acético, ácido benzofosfórico, ácido propiónico, ácido
isopropiónico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido benzoico,
ácido benzosulfónico, ácido orto-clorobenzóico,
ácido metaclorobenzóico, ácido paraclorobenzóico, ácido
naftilsulfónico, ácido benzonaftalínico, ácido
clorobenzonaftalínico, ácido cloronaftilsulfónico, ácido
tetrayodobenzonaftilsulfónico y ácido
di-yodoantracenil sulfónico. Asimismo, se pueden
seleccionar las especies de carga neutra del grupo que consiste en
óxido de mesitilo, isopropanol, metanol, etanol, etilenglicol,
dimetilformamida (DMF), formamida, péptidos protegidos y ácidos
aminos protegidos. Una especie iónica mayormente preferida es el
ácido 2,4,6 triclorobenzóico y una especie neutra preferida
mayormente es el alcohol de bencilo. Los marcadores están
preferiblemente presentes en el diluyente de la muestra en una
cantidad que tiene una doble concentración (2X), es decir, una
cantidad que proporcionará una concentración final deseada cuando
esté diluida de 1:2. Para el alcohol de bencilo, una concentración
2X es de aproximadamente 0,8 g/l, mientras que para el ácido 2, 4, 6
triclorobenzóico, una concentración 2X es de aproximadamente 0,2
g/l.
Un agente ligante específico de un constituyente
de muestra de interés puede ser ventajosamente incluido en los
tampones de almacenado. Los ejemplos de agentes ligantes
específicos incluyen anticuerpos que se ligan a un antígeno o a una
enzima que se liga a un substrato. El agente ligante específico
puede ser soluble o insoluble. Centrándose en el ejemplo de
anticuerpo, el agente ligante específico es preferiblemente
insoluble y tendrá tendencia a posarse en el fondo de un recipiente
de reacción. Se pueden formar los agentes insolubles ligantes
específicos acoplando el agente ligante específico a un soporte
sólido. La selección de un soporte sólido es a criterio del
investigador, no obstante un soporte sólido preferido es
Sepharose^{TM} (Pharmacia) activada de bromuro cianógeno. Están
disponibles anticuerpos (de cadena pesada o ligera) de
inmunoglobulina antihumana en empresas comerciales, por ejemplo DAKO
Co. Estos anticuerpos pueden acoplarse directamente a dicho soporte
sólido antes mencionado. Respecto a los constituyentes de muestra
de IgG, un agente ligante específico insoluble alternativo es la
Proteína G (Isolab) acoplada a agarosa. Como pueden apreciar los
expertos en la materia, la Proteína G es una proteína de superficie
aislada del grupo G de estreptococos que ligan específicamente a la
IgG de cierto número de mamíferos, incluidos los humanos. No
obstante, se pueden utilizar anticuerpos de IgG antihumana con una
eficiencia substancialmente equivalente.
Se puede preparar un kit de electroforesis de
proteínas de suero (SPE) que incluya uno o más recipientes llenos
de una versión preferida del diluyente de muestra. Por ejemplo,
puede llenarse un primer recipiente con diluyente de muestra
carente de marcadores externos y se puede llenar un segundo
recipiente con muestra que tenga marcadores externos. Asimismo, el
kit puede contener al menos un receptáculo de muestra que puede ser
utilizado para realizar las diluciones. El receptáculo de muestra
puede tener múltiples cámaras para realizar múltiples diluciones de
iguales o distintas muestras.
De forma similar, puede prepararse un kit de
inmunosubstracción (IFE/s) que incluya uno o más recipientes llenos
de diluyente de muestra. Asimismo, puede incluirse otro recipiente
que incluya al menos un agente ligante específico en el tampón de
almacenado. Un kit de IFE/s preferido tiene un recipiente lleno de
diluyente de muestra y un segundo recipiente que tiene múltiples
cámaras que contengan diferentes agentes ligantes específicos. Por
ejemplo, un kit de IFE/s preferido tiene un segundo recipiente con
inmunoglobulinas anti-K,
anti-\lambda, anti-IgG,
anti-IgA y anti-IgM en cámaras
separadas.
Se puede utilizar una receta standard para
preparar diluyentes de muestra combinando varias soluciones de
reserva. Las soluciones de reserva pueden incluir: 100 mM de NaCl;
100 mM de NaCl más marcadores doblemente concentrados, es decir 0,2
g/L de ácido 2,4,6-triclorobenzóico (TCBA) y 0,8 g/L
de alcohol de bencilo; y 100 mM de soluciones de cada compuesto de
tampón ajustado al pH deseado. Pueden prepararse diluyentes con
compuesto de tampón 10 mM más 70 mM de NaCl combinando 1 parte de
compuesto de tampón concentrado, 5 partes de 100 mM de NaCl más
marcadores, 2 partes de 100 mM de NaCl solo y 2 partes de H_{2}O
desionizado. Se pueden hacer las mediciones de la conductividad con,
por ejemplo, un Contador de Conductividad YSI Modelo 35. Esta
receta standard produce diluyentes con una conductividad de
aproximadamente 5,6 mMho. En comparación, la conductividad del
tampón normal es de aproximadamente 7,0 mMho.
Con el fin de preparar los diluyentes a una
conductividad igual a la del Tampón normal, las soluciones que
contengan fosfato sódico, fosfato potásico, acetato sódico o
"Buenos tampones" tales como TES y concentraciones variables de
tetraborato de sodio o ácido bórico pueden complementarse con
distintas cantidades de NaCl adicional. Por ejemplo, 10 mM de NaCl
da una conductividad medida de aproximadamente 0,9 mMho. Se pueden
preparar estos diluyentes disolviendo cantidades medidas de sal de
tampón y de tetraborato sódico o ácido bórico en 90 mL de agua
desionizada, ajustándolos al pH deseado con 1,0 M de NaOH o HCl y
ajustando el volumen a 100 mL. Se mide entonces la conductividad de
la solución y se aplica a la ecuación:
[(7 mMho -
(conductividad de la solución))/9 =
X]
donde X es la cantidad de NaCl, en
milimoles, que se necesita para elevar la conductividad para que
iguale el Tampón normal. Se añade la cantidad requerida de NaCl
cristalina y se vuelve a medir la conductividad. Se considera
aceptable 7,0 mMho \pm 0,7. No se añade cloruro sódico cuando la
concentración es borato y, por consiguiente, la conductividad es
mayor que 150 mM de tampón normal de
borato.
Puede utilizarse la composición como diluyente de
muestra para SPE. Se mezcla una parte alícuota de muestra clínica
con 1 a 100 partes del tampón de almacenado/diluyente, dependiendo
de la muestra. Por ejemplo, la concentración de proteína para una
muestra de suero de un individuo sano es de aproximadamente 60
mg/ml. Los valores de concentración similares para la orina y el
líquido cerebroespinal (CSF) es de aproximadamente 10 \mug/ml y
de aproximadamente entre 150 y 400 \mug/ml, respectivamente.
Centrándose en el suero, la dilución es normalmente de 1 parte de
muestra para aproximadamente 9 partes de diluyente (1:10 = 0,1)
hasta aproximadamente 1:100 (0,01). La dilución de suero preferida
es de 1:20. Las muestras de orina y de CSF pueden requerir un
procedimiento de concentración y/o de diálisis del diluyente de la
muestra para proporcionar unas concentraciones de proteínas
aproximadamente equivalentes a las de las muestras de suero.
Puede utilizarse igualmente la composición como
diluyente de muestra y/o tampón de almacenado en un procedimiento
IFE/s, como en la patente U.S. Nº 5.228.960, la cual se incorpora
en la presente como referencia. Normalmente, se prediluye una
muestra de suero a, por ejemplo, 1:2, 1:7 ó 1:15. Se combina
entonces una parte del suero prediluido con una proporción de 5 a
100 partes de una suspensión de fase sólida, que se denomina
generalmente "fango de gel". La solución sólida comprende
generalmente un agente ligante específico insolubilizada, por
ejemplo, anticuerpo unido a agarosa, suspendido en tampón de
almacenado/diluyente de muestra. Pueden ajustarse las diluciones
para que faciliten una proporción deseada de diluyente de muestra
al agente ligante específico en la mezcla. Se incuba la muestra
hasta que se pose el agente ligante específico en el fondo del
recipiente de reacción. Se somete entonces el sobrenadante
"inmunosubstraído" al análisis CZE.
Las versiones anteriormente descritas de la
presente invención tienen muchas ventajas. Para la composición,
éstas incluyen la comodidad de poder usar una sola formulación para
almacenar reactivos, realizar reacciones bioquímicas y diluir
muestras antes del análisis de CZE. Asimismo, la inclusión de
compuestos de borato en la formulación tiene efectos sorprendentes
para mejorar la definición de las proteínas del suero por análisis
CZE. La reproductibilidad de la separación mejorada permite
comparar de forma fiable los electroferogramas con los análisis de
CZE correspondientes, como el SPE y el IFE/s. Asimismo, el uso de
un tampón común para estos procedimientos correspondientes
introducen la economía de escala en la fabricación de los reactivos
al igual que las alternativas de embalaje convenientes, tales como
los kits de SPE y el IFE/s Ejemplos.
Se realizaron los experimentos siguientes para
encontrar un tampón común para almacenar reactivos y diluir muestras
durante los procedimientos de SPE e IFE/s. Las fases de separación
por electroferesis capilar durante los SPE e IFE/s presentaron
ligeras diferencias en la migración y definición de algunas
proteínas del suero, haciendo que resultaran difíciles las
comparaciones entre los métodos. Para el SPE, la causa de las
diferencias fue que se introdujeron las muestras en distintos
entornos. Para el PSE, se diluyó la muestra en un tampón de borato
de pH 10.0 y a continuación se inyectó. Para el IFE/s, se prediluyó
la muestra en un tampón de borato (pH 10.0 ó 10.2) o en un tampón de
fosfato (pH 7.0) y a continuación se diluyó nuevamente en el Tampón
de Almacenado de Fase Sólida (solución salina tamponada con
fosfato, pH 7.0). Aunque se utilizó el mismo tampón normal, al
inyectar la muestra en tampones que diferían en la elaboración
química y el pH, se produjeron diferentes electroferogramas. Los
exámenes adicionales, tales como el diseño de instrumento óptimo y
el embalaje del reactivo, impulsaron aun más a buscar un tampón
común.
El cloruro sódico, tetraborato sódico
(decahidrato) y el fosfato sódico monobásico eran productos de
Mallinckrodt Specialty Chemicals, París, KY. La ázida sódica fue un
producto de BDH Laboratory Supply, Poole, Inglaterra. Se obtuvo el
alcohol de bencilo de Sigma Chemical Company, y se obtuvo el ácido
2,4,6-triclorobenzóico de Aldrich Chemical Company,
ambas de St. Louis, MO. Se obtuvo el TES (sal sódica), es decir,
ácido
{[2-(tris-(hidroximetil)-metil)]-amino}-etanosulfónico
de Calbiochem, San Diego, CA:
- -
- el "Diluyente ICS" es un producto de Beckman Instruments, Brea, CA, y consiste en 20 mM de fosfato sódico, 75 mM de cloruro sódico, 2 mM de cloruro potásico, y 0,1% (p/v) de ázida sódica, pH 7,0. En este estudio, se utilizó como "genérico" solución salina tamponada con fosfato.
- -
- el "Tampón ICS" es diluyente ICS complementado con 4% de polietilenglicol (PEG).
- -
- el "ID ZONE" es un producto de control de suero de Beckman Instruments y contiene polietilenglicol como conservante. Se utilizó este material como muestra de suero para estos estudios.
Los reactivos para electroforesis capilar
incluían Tampón normal que comprendía 37,5 mM de tetraborato sódico,
pH 10,0, que se denomina igualmente 150 mM de borato: una Solución
de Aclarado de 0,1 N de NaCl, que se utilizó para limpiar capilares
entre operaciones de laboratorio y el Tampón de Almacenado de Fase
Sólida, que consiste en 20 mM de fosfato sódico, 75 mM de cloruro
sódico y 0,1% (p/v) ázida sódica, pH 7,0.
En este estudio, se probaron varias formulaciones
para el "Diluyente de Prueba". El Diluyente de Prueba puede
ser el vehículo por el cual se añaden dos marcadores externos a la
muestra. Se añadieron el alcohol de bencilo (0,4 mL por litro) y el
ácido 2, 4, 6 triclorobenzóico (0,1 g por litro) a algunos
Diluyentes de prueba como marcadores externos.
Se realizaron las pruebas en un instrumento
prototipo identificado como "CALCITE" (Beckman Instruments,
Inc. Fullerton, CA). Este instrumento tiene seis capilares de sílice
fundida sin tratar paralelos, que miden cada uno 25 \mum X 27 cm,
con un espacio de separación de 18 ó 20 cm. Se revistieron las
superficies externas de los capilares con poliimida para proteger
los capilares de la rotura (Polymicro Technologies, Inc. Phoenix,
AZ). Se alinearon un módulo óptico, que incluye una fuente de luz
UV (lámpara de deuterio) y un filtro de nanómetro 214, así como un
detector, con una abertura, situada a 6,5 cm de una salida de tubo
capilar. Cada capilar utiliza las mismas muestras y diluyente de
modo que se pueda observar y eliminar la variación capilar errónea
del análisis.
Para simular las condiciones de SPE standard, se
inyectó una muestra de una parte de ID ZONE más 9 partes de
diluyente, es decir, se inyectó una dilución de 1:10 con una
segunda de vacío. Se realizó la electroforesis a 9000 voltios
durante 5 minutos.
Para simular las condiciones de IFE/s standard,
se diluyó la muestra de una parte de ID ZONE con una parte de
diluyente. Se volvió a diluir entonces de nuevo la muestra
prediluída con 160 \mul de tampón de almacenado. Se inyectó la
muestra totalmente diluida con una segunda vacía y se sometió a
electroforesis a 7.600 voltios durante 6 minutos.
Se evaluaron los electroferogramas resultantes
sin normalizar utilizando el software AUTO-CAP
versión 2.04 (Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA) y se
compararon visualmente para observar su reproducibilidad y la
definición de los diversos picos y topes.
Se realizó un experimento para ver si las
diferencias de morfología de pico observadas durante las fases de
separación de SPE comparado con IFE/s se debían a compuestos tampón
diferentes (borato comparado con fosfato) o las diferencias del pH.
Se prepararon las soluciones tampón siguientes:
1) 150 mM de borato, pH 7.0 (ácido bórico)
2) 150 mM de borato, pH 10.0 (37,5 mM de
tetraborato sódico)
3) 20 mM de fosfato potásico dibásico, pH 7.0, 75
mM de cloruro sódico,
4) 20 mM de fosfato potásico dibásico, pH 10.0,
75 mM de cloruro sódico.
Con el fin de simular las condiciones de la
electroforesis IFE/s, se prediluyó una parte de una muestra de
suero (10 \mul) con una parte de diluyente de muestra (10
\mul). Se utilizaron entonces los tampones detallados más arriba
para sustituir los 160 \mul de tampón de almacenado para seguir
diluyendo la muestra. Se realizó la electroforesis a 7,6 kV durante
6 minutos utilizando 150 mM de borato, pH 10,0 como Tampón
Normal.
Cuando se utilizaron 150 mM de borato en lugar
del tampón de almacenado, se definieron las proteínas del suero en
la región beta en una migración menor más rápida y un mayor pico
inferior de migración (ver las figuras 1A y 1B). Asimismo, cuando
el tampón de borato, pH 7 sustituyó el tampón de almacenado, mejoró
inesperadamente la definición de las proteínas del suero en la
región beta (ver la figura 1B) con relación al diluyente corriente
de SPE, 150 mM de borato, pH 10 (Figura 1A). Los dos picos de la
región beta, que presumiblemente corresponden al complemento y a la
transferrina, fueron mucho más pronunciados y bien separados. En
comparación, el tampón de fosfato, con pH 7 ó 10, (Figuras 1C y 1D)
solamente presentaba un solo pico pronunciado en la región beta que
no estaba resuelto en dos picos para complemento y transferrina.
Este experimento sugirió que la presencia de borato en la muestra
favorece la definición de las proteínas del suero, en especial en
la región beta.
Se realizó este estudio con tampón TES, para
evitar la posible interacción entre el fosfato y el borato que
pudiera afectar a los resultados. Se prepararon los tampones con 10
mM de TES más la cantidad deseada de tetraborato sódico ajustado al
pH 7.0 con 6N de HCl, a continuación se añadió NaCl para alcanzar la
conductividad final equivalente a la del tampón normal. De este
modo, a medida que aumenta la concentración del borato, disminuye
la concentración de cloruro sódico. Para la mayor concentración de
borato (40 mM de tetraborato), la conductividad fue ligeramente
superior a la del tampón normal sin la adición de NaCl. Se utilizó
ID Zone en condiciones de SPE.
Las figuras 2A y 2B son eletroferogramas
representativos que muestran las regiones beta divididas y
variables que se producen cuando se utilizan los tampones TES sin
borato. Cuando el tampón incluye aproximadamente de 5 a 20 mM de
tetraborato, por ejemplo, ver la figura 3, dos picos bien definidos
aparecen dentro de la región beta. Asimismo, la morfología de los
picos quedó esencialmente igual cuando se repitieron las
condiciones experimentales. Por encima de 20 mM de tetraborato, la
morfología del escaneado no cambia demasiado sino que parece
volverse menos reproducible con las muestras repetitivas (no
representadas). Por consiguiente, se produjeron los
electroferogramas más reproducibles de las proteínas del suero en la
región beta dentro de una gama de concentración de tetraborato de 5
a 20 mM aproximadamente.
Se utilizaron los diluyentes de muestra con 10 mM
de TES como sal de tampón más 5 ó 10 mM de borato, pH 7,0 para
diluir muestras de ID Zone. Se realizaron treinta repeticiones de
cada diluyente de prueba en condiciones SPE. El uso de 5 mM de
tetraborato en el diluyente seguía permitiendo una gran variabilidad
en la región beta (no representada aquí), sobre todo en la forma y
número de topes del pico principal. No obstante, el uso de 10 mM de
tetraborato en el diluyente produjo un escaneado muy reproducible
como en la Fig. 3, con dos picos en la región beta.
Se preparó el diluyente de muestra con 20 mM de
fosfato sódico monobásico, 10 mM de tetraborato sódico, 0,1% de
ázida sódica y 29,6 mM de NaCl, pH 7,0. La conductividad del
diluyente era equivalente al tampón normal, es decir,
aproximadamente 7,0 mMho. Este diluyente produjo un electroferograma
muy similar al de la Fig. 3, con dos picos bien resueltos en la
región beta. Cuando se repitió la separación electroforética bajo
condiciones idénticas, se produjo esencialmente el mismo perfil
(ver las figuras 4A y 4B). Por lo tanto, una solución salina
tamponada con fosfato, pH 7.0, con 10 mM de tetraborato añadido,
proporciona un electroferograma aceptable y reproducible.
Se probó el uso del ácido bórico en el diluyente
de muestra/tampón de almacenado. Asimismo, se incluyeron
concentraciones crecientes de fosfato potásico monobásico y/o
dibásico para ajustar el pH a 7.0 y para mejorar la capacidad de
tamponado. Puede resultar necesario mantener un pH neutro al
almacenar un reactivo, tal como un anticuerpo unido a un soporte
sólido.
Se prepararon los siguientes tampones:
1) 143,4 mM de borato (ácido bórico)
\hskip1cm 4,4 mM de fosfato potásico
dibásico
2) 150 mM de borato (ácido bórico)
\hskip1cm 7,5 mM de fosfato potásico
dibásico
\hskip1cm 2 mM de fosfato potásico
monobásico
3) 150 mM de borato (ácido bórico)
\hskip1cm 10 mM de fosfato potásico
dibásico
\hskip1cm 2 mM de fosfato potásico
monobásico
4) 150 mM de borato (ácido bórico)
\hskip1cm 12,5 mM de fosfato dibásico
\hskip1cm 3 mM de fosfato potásico
monobásico
5) 150 mM de borato (ácido bórico)
\hskip1cm 15 mM de fosfato potásico
dibásico
\hskip1cm 5 mM de fosfato potásico
monobásico
Cuando se utilizaron cualquiera de estos tampones
de ácido bórico/fosfato, como diluyente de muestra/tampón de
almacenado como en el Ejemplo 1, los electroferogramas
correspondientes presentaron dos picos bien definidos en la zona
beta (no representados). Por lo tanto, el ácido bórico era una
fuente adecuada de borato para el tampón de almacenado/diluyente de
muestra. Asimismo, las mayores concentraciones de fosfato no
causaron cambios significativos en la morfología de pico mejorado
obtenida en presencia de borato.
Se comparó la capacidad de tamponado con la del
tampón ICS observando los cambios de pH mientras que se añadía una
pequeña cantidad (20 \muL cada vez) de 5 N de NaOH (Tabla 1) y 6N
HCl (Tabla 2). Como regla general, la capacidad de tamponado a
aproximadamente un pH 7 mejoró aumentando las concentraciones de
fosfato.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Se estudiaron los efectos de los componentes
adicionales en el tampón de 150 mM de borato (ácido bórico), 15 mM
de fosfato potásico dibásico, 5 mM de fosfato potásico monobásico,
pH 7.0. Se detallan a continuación los componentes sometidos a
prueba y sus concentraciones:
1) 0,40 mM y 75 mM de cloruro sódico;
2) 0,1% p/v de ázida sódica; y
3) 4% de polietilenglicol
El perfil electroforético obtenido después de
usar los tampones con los componentes detallados más arriba, como
diluyentes de muestra no presentaron diferencias significativas en
la morfología del pico en comparación con los electroferogramas
obtenidos utilizando tampones de borato carentes de los componentes
adicionales.
Aunque la presente invención ha sido descrita muy
detalladamente con referencia a algunas versiones preferidas, son
posibles otras versiones. Por ejemplo, se pueden utilizar otros
compuestos de tampón que tengan una capacidad de tamponado dentro
de la gama de un pH de 6 a 8 aproximadamente, en el diluyente de
muestra/tampón de almacenado. Por lo tanto, el ámbito de las
reivindicaciones adjuntas no se limita a la descripción de las
versiones preferidas contenidas en la presente memoria.
Claims (30)
1. Composición útil como tampón de almacenaje o
diluyente de muestra antes de la electroforesis capilar de una
muestra clínica seleccionada del grupo consistente por sangre
completa, plasma, suero, orina y líquido cerebroespinal que
comprende:
- a)
- agua;
- b)
- un compuesto de borato presente en una cantidad de 5 a 150 mM;
- c)
- un compuesto tampón con una gama de tamponado de pH eficaz de 6 a 8 y un modificador de pH presente en una cantidad suficiente para ajustar el pH de la composición entre 6 y 8; y
caracterizada
porque
el compuesto de borato está
presente bajo la forma de ácido bórico en una cantidad de 20 mM a
150 mM o como tetraborato en una cantidad de 10 mM a 40
mM.
2. Composición de la reivindicación 1, que
comprende además un compuesto de ajuste de la conductividad.
3. Composición de la reivindicación 1, donde el
ácido bórico está presente en una cantidad de 40 mM.
4. Composición de la reivindicación 1, donde el
compuesto tampón está presente en una cantidad de 5 a 25 mM.
5. Composición de la reivindicación 1, donde se
selecciona el compuesto tampón del grupo consistente en fosfato
sódico, fosfato potásico y ácido 2-[tris (hidroximetil)
metil-amino-etanosulfónico
(TES).
6. Composición de la reivindicación 5, donde el
compuesto tampón es fosfato sódico.
7. Composición de la reivindicación 5, donde el
compuesto tampón es TES.
8. Composición de la reivindicación 6, donde el
fosfato sódico está presente en una cantidad de 20 mM.
9. Composición de la reivindicación 7, donde TES
está presente en una cantidad de 10 mM.
10. Composición de la reivindicación 2, donde el
compuesto que ajusta la conductividad es seleccionado del grupo
consistente en cloruro sódico, cloruro potásico y una mezcla de
cloruro sódico y de cloruro potásico.
11. Composición de la reivindicación 10, donde el
compuesto de ajuste de la conductividad está presente en una
cantidad de 1 a 150 mM.
12. Composición de la reivindicación 11, donde el
compuesto que ajusta la conductividad está presente en una cantidad
de 30 a 120 mM.
13. Composición de la reivindicación 12, donde el
compuesto de ajuste de la conductividad está presente en una
cantidad de 75 mM.
14. Compuesto de la reivindicación 1, que
comprende además: e) al menos un marcador externo seleccionado del
grupo consistente en una especie iónica y una especie de carga
neutra.
15. Composición de la reivindicación 14, donde la
especie iónica es seleccionada del grupo consistente en ácido
fórmico, ácido acético, ácido benzofosfórico, ácido propiónico,
ácido isopropiónico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido
benzoico, ácido benzosulfónico, ácido ortoclorobenzóico, ácido
metaclorobenzóico, ácido paraclorobenzóico, ácido naftilsulfónico,
ácido benzonaftalínico, ácido clorobenzonaftalínico, ácido
cloronaftilsulfónico, ácido tetrayodobenzonaftilsulfónico y ácido
diyodoantracenilsulfónico.
16. Composición de la reivindicación 14, donde la
especie de carga neutra es seleccionada en el grupo consistente en
óxido de mesitilo, isopropanol, metanol, etanol, etilenglicol,
dimetilformamida (DMF), formamida, péptidos protegidos y amino
ácidos protegidos.
17. Composición de la reivindicación 14, donde al
menos un marcador externo comprende alcohol de bencilo y ácido 2,4,6
triclorobenzóico.
18. Composición de la reivindicación 1, donde el
modificador del pH seleccionado del grupo consistente en hidróxido
sódico, ácido clorhídrico y fosfato potásico.
19. Composición de la reivindicación 1, donde la
composición está adaptada a una utilización en un análisis de
inmunosubstracción de un constituyente de una muestra por
electroforesis capilar, comprendiendo la composición además al menos
un agente ligante específico del constituyente de la muestra.
20. Composición de la reivindicación 19, donde el
agente ligante específico es capaz de ser sensiblemente retirado de
la composición.
21. Composición de la reivindicación 20, donde el
agente ligante específico comprende una sustancia capaz de ligarse a
un material insolubilizado.
22. Composición de la reivindicación 19 donde el
agente ligante específico comprende un anticuerpo antihumano.
23. Composición de la reivindicación 22, donde el
agente ligante específico comprende un anticuerpo
antiinmunoglobulina antihumana.
24. Composición de la reivindicación 2, donde el
compuesto de borato es tetraborato sódico presente en una cantidad
de 10 mM; donde el compuesto tampón es fosfato sódico presente en
una cantidad de 20 mM; donde el compuesto que ajusta la
conductividad es cloruro sódico presente en una cantidad suficiente
para ajustar la conductividad de la composición a 7 mMho; y donde el
modificador de pH está presente en una cantidad suficiente para
ajustar el pH a 7.
25. Kit de prueba para preparar unas muestras
para la electroforesis capilar de las proteínas del suero que
comprende:
- (a)
- un primer recipiente que contiene la composición de la reivindicación 1, como diluyente de la muestra y tampón de almacenaje; y
- (b)
- un segundo recipiente para retener al menos una muestra, pudiendo el diluyente de la muestra y el tampón de almacenado ser mezclados con la muestra para diluir y almacenar la muestra antes de la carga en un aparato para electroforesis capilar.
26. Kit de prueba según la reivindicación 25, que
comprende además al menos un marcador externo seleccionado del grupo
consistente en una especie iónica y una especie de carga
neutra.
27. Kit de prueba de la reivindicación 25, donde
el kit es para preparar muestras para inmunosubstracción
electroforética capilar donde el primer recipiente comprende además
al menos un marcador externo seleccionado del grupo consistente en
una especie iónica y una especie de carga neutra; y donde el
segundo recipiente comprende además al menos un agente ligante
específico en un constituyente de la muestra.
28. Kit de prueba según la reivindicación 27,
donde el segundo recipiente comprende una multiplicidad de cámaras
donde cada cámara comprende además un agente ligante específico
diferente.
29. Método de preparación de una muestra para
electroforesis capilar que comprende las etapas de:
- a)
- medir una parte alícuota de una muestra clínica, siendo la muestra seleccionada del grupo consistente en sangre entera, plasma, suero, orina y líquido cerebroespinal; y
- b)
- diluir la muestra con 1 a 100 partes de la composición de la reivindicación 1 antes de la carga en un aparato para electroforesis capilar.
30. Método de la reivindicación 29 donde el
método es para preparar una muestra para inmunosubstracción por
electroforesis capilar y donde el diluyente de la muestra y el
tampón de almacenado comprenden además al menos un agente ligante
específico del constituyente de la muestra.
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