JPS61277059A - 複数項目分析方法 - Google Patents

複数項目分析方法

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JPS61277059A
JPS61277059A JP60119228A JP11922885A JPS61277059A JP S61277059 A JPS61277059 A JP S61277059A JP 60119228 A JP60119228 A JP 60119228A JP 11922885 A JP11922885 A JP 11922885A JP S61277059 A JPS61277059 A JP S61277059A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は複数項目分析方法に係り、特に免疫反応を利用
して試料の複数項目を分析し得る分析方法に関する。
〔発明の背景〕
免疫反応を利用する分析方法には、糧々のものが知られ
ている。例えば、″石川、河合、官井著:酵素免疫測定
法、第1〜3頁、医学書院発行。
1978年”には、ラジオイムノアッセイ法、けい光イ
ムノアッセイ法、酵素イムノアッセイ法等の各種方法を
紹介されている。
ラジオイムノアセイ法は放射性物質を使用するために特
別な設備が必要であり、汎用性に問題がある。またラジ
オイムノアッセイ法およびエンザイムイムノアッセイ法
の免疫分析方法は、その原理からして増量の同一被検試
料につき複数の成分を同時に分析することが困難である
。したがって被検試料中の各種の成分もしくは項目につ
き免疫分析しようとする場合、成分ごとに被検試料を希
釈し被検試料中の特定成分と試薬との反応を行なわなけ
ればならない。このように、従来の免疫分析方法は、各
種成分の分析につき、試料、試薬の必要量が多くなると
いう問題があった。
〔発明の目的〕
本発明の目的は、1回のサンプリングに対応して、特定
の試料から複数項目の反応を生じさせ、それらの項目の
定性または定量を行ない得る分析方法を提供することに
ある。
〔発明の概要〕
本発明は、免疫反応が特定成分と特定の試薬の間で特異
的に行われることを利用している。
本発明は、試料を展開し得る展開層体上の異なる場所に
複数の抗原または抗体を有する試薬を担持させておき、
上記展開層体の特定の場所に試料を添加して移動させ、
試料が上記各試薬担持場所を移動したあと反応生成物を
観測することを特徴とする。
〔発明の実施例〕
本発明の望ましい実施例では、展開層体に担持させる試
薬として1発色反応に寄与する物質を封入したマイクロ
カプセルを用いている。このマイクロカプセルは、抗原
抗体反応または補体活性により表面が溶解作用を受ける
ものである。マイクロカプセルに封入された物質は、キ
レート剤、酵素、補酵素、けい光発光物質の中から選択
される。
酵素には、それ自体が酵素活性を有する酵素と、補酵素
の共存によって酵素活性を持つようになるアポ酵素を用
い得る1反応生成物の観測は、光学的測定または電気的
測定によってなされる。光学的測定としては、単色光を
照射してその反射光を検出し、反射光の強度から被検項
目濃度を演算表示する構成が好適である。透過光検出で
も測定可能の場合がある。
本発明の望ましい実施例では、目的とする試料中の複数
の成分(抗原あるいは抗体)それぞれに対応して、特異
的に反応する複数の抗体あるいは抗原を含む試薬を保持
する展開層中で、試料を移動させ、試料中の各成分に対
応する移動位置において、展開層に保持されている試薬
と試料中の個個の目的成分と特異的に反応させ、同一試
料を用いて、試料中の目的とする複数の成分を同時に、
光学的手段あるいは電気手段を用いて定性あるいは定量
する。
試料を展開する担体よりなる展開層は試料を移送できる
ようにしであるものであって、試料を展開する担体は試
料中の成分抗体あるいは抗原と特異的に反応する抗原あ
るいは抗体を含む試薬を物理的吸着あるいは化学結合に
より保持し、あるいは固定化することができればよく、
たとえば、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、ポリビ
ニルアルコール、あるいはポリビニルピロリドン等のよ
うな極性基を有する合成高分子のゲルアガロース等の多
糖類のゲル、あるいはコラーゲン、ゼラチン等の蛋白質
ゲル、あるいは水酸化アルミニウム。
水酸化チタン等の金属水酸化のゲル、あるいはイオン交
換樹脂表面処理により表面にアミド基等の極性基を有し
または有さない多孔性ガラスピーズ。
あるいはプラスチック膜、ゼオライト、モンモリロナイ
ト等のようなりレイ等の結合支持体が挙げられる。これ
ら担体に試料の成分(抗原あるいは抗体)と特異的に反
応する抗原あるいは抗体を有する試薬が物理的吸着ある
いは化学的結合により固定化される。
試料を展開する担体よりなる展開層に保持されている試
薬としては、抗原抗体反応によって溶解作用を受けるか
あるいは補体活性により溶解作用を受けるマイクロカプ
セル表面に、試料の目的成分と特異的に反応する抗原あ
るいは抗体を結合すると共に内部に検出可能な物質を収
容したマイクロカプセルを有するもの、あるいは展開層
に保持されている試薬中には、検出可能な物質を含まず
試料中の目的成分と特異的に反応する物質を含んでいる
だけでもよく、この場合、試料を展開し試薬と目的物質
とを特異的に反応させた後に、新たに反応生成物と反応
する検出可能な標識物質を展    −開させてもよい
、マイクロカプセルとしては、動物の赤血球やリポソー
ムを用いることができる。
上記の分析方法を行うと次のようにして、同−試料中の
例えば3種類の成分を同時に分析することができる。
先ず、試料を展開する担体よりなる展開層に、試料たと
えば血液試料を展開層に電場をかけることにより泳動さ
せるかカラムクロマトグラフィーによって移動させるか
、あるいは薄層上で移動させる。移動した血液試料は、
目的とする試料成分と特異的に反応する第1番目の試薬
を保持した部分に到達する。到達後、対応する項目のみ
が反応開始する。血液試料中の抗原あるいは抗体と、第
1番目の試薬が特異的に反応する。試料中の試薬と反応
しなかった残りの成分は、移動し続け、第2番目の試薬
位置に到達する。該当する第2番目の項目のみが反応す
る。
さらに試料は移動を続け、第1番目、第2番目の試薬と
は異なった試料中の成分と反応する第3番目の試薬を保
持した部分に到達する。到達後、試料中の抗原あるいは
抗体と試薬が特異的に反応する。第1.2.3の試薬と
反応しなかった残りの生体成分が、完全に第3番目の試
薬の部分を移送した後に、展開層中に保持されたままに
なっている3種類の反応生成物の量を例えば光学的に測
定して、これから同時にあるいは順次試料中の成分濃度
を求める。
試料が展開層を移動する速度は、試薬と試料中の目的成
分とが反応するのに十分であり、かつ、反応生成物が展
開層中に保持されているようにする。このような免疫分
析方法によれば反応生成物を測定する際、試料中の夾雑
物は、試料を移動することによって検出系から除かれる
ため、夾雑物の影響がない状態で分析することができる
。このため精度の高い分析が可能となる。
反応を検出するためのマーカがたとえばキレート剤であ
り、キレート化合物を検知するのであれば、反応生成物
の有無を肉眼で判定することができる。このために、複
数成分のスクリーニング検査などの目的で多数サンプル
を分析することに応用することもできる。反応生成物を
光学的手段を用いて測定すれば、定性分析だけでなく試
料中の成分を定量分析できる。
(実験例1) この実験例は、この発明に基づく免疫分析方法を用いて
、試料中のIgG、IgA、IgM (各種免疫グロブ
リン)を定性分析するものである。
展開層の例を第1図に示す。展開層の担体としてはセル
ロースゲル(例えば商品名、ファルマシャ社のセファロ
ース−4B)を用いた。またセファロース−4Bに抗体
を結合させる方法は、次の様に行った。ブロモシアンで
活性化したセファロース−4Bを0.2 M炭酸緩衝液
(pH8,8)で十分洗浄したのち、ブロモシアンで活
性化したセフ7O−24Bを1IIn  当り、抗体1
0101l乾燥重量)を加え4℃で1晩振とうして、セ
ファロース−4Bに抗体を結合させた。
上記反応液IIIQ  当り0.2 gのグリシンを加
え、4℃で8時間振とうし、抗体と結合しなかった一N
H基をグリシンと反応させた。上記の様にしてセファロ
ース−4Bにそれぞれ抗IgG抗体。
抗IgA抗体、抗IgM抗体を結合させ、抗IgG抗体
−セファロース−4B、抗IgA抗体−セファロースー
4B、抗IgM抗体−セファロースー4Bを調製した。
   − 展開層の調製は、次の様にして行った。0.1Mリン酸
緩衝液(pH7,4)に懸濁していたセファロース−4
Bをガラス製の平板上に厚みIIに平滑に層を作り、抗
IgG抗体、抗IgA抗体。
抗IgM抗体の結合したセファロース−4Bをのせるた
めに、3ケ所薄層を取り除き抗体の結合したセファロー
ス−4Bを第1図のa、b、Qの位置に平滑にのせた。
第1図の展開層体10は、担体としてセファロース−4
Bを有する。位置aは抗IgG抗体を有し、位置すは抗
IgA抗体を有し、位置Cは抗IgM抗体を有する。試
料スポット位置gに、IgG、IgAおよびIgMを含
む試料5uQをスポットし、0.1  Mリン酸緩衝液
を展開液として、展開させた。試料が展開層上端まで到
達後、    −エオシン−標識抗IgG抗体をdの位
置に、エオシン−標識抗IgA抗体をeの位置に、エオ
シン−標識抗IgM抗体をfの位置にそれぞれスポット
し、試料展開方向に対して直角方向に各エオシン−標識
抗体を展開させた。展開液は0.1 Mリン酸緩衝液p
H7,4を用いた。その結果、展開層中に保持されてい
る試料中の成分であった。
■gG、IgA、IgMはエオシンで標識されたことを
肉眼で確認した。これを第1表に示す。試料に添加した
IgG、IgA、IgMの有無と肉眼で確認したエオシ
ンの色とがほぼ一致した。
試料として尿を用いた場合3種類の蛋白を同時に定性で
きることが確認された。
第1表 実験例I  IgG、IgA、IgM定性結果 A:添加有■、添加無O B:本法測定結果 (実験例2) この実験例は、本発明に基づく免疫分析方法を用いて血
清中の3種類のホルモンを同時に定量分析するものであ
る。展開層は第2図および第3図に示す、展開層の担体
にはアガロースゲルを用いた。サンプル添加位置はgで
ある。展開層中の試料中の成分と特異的に反応する試薬
は、位置atta2にあり、試薬はリポソームを含む。
リポソーム膜の調製は、酵素ハンドブック(Metho
ds inEnzymclogy  7土、152−1
61)に記載のC、T、Ta1n、 5anauel 
W、 Chanらの方法に従って行い、リポソームに抗
体を結合する方法はネイチャー誌(Nature、 2
88 、602 (1985) )に記載のLeeらの
方法に従って行った。膜中には常法に従って市販キレー
ト剤であるTAMSMBを封入した。
リポソーム膜を含む試薬とゲルの間にはメツシュeがあ
りこのメツシュはリポソーム膜が移動せずかつ試薬中の
成分は、通過できるようにしたものである。泳動緩衝液
はリン酸緩衝液p H6、0を用い電流ti−BCにか
けて試料5μQを泳動させた。展開層体11の位置ai
には抗−チロキシン(T4)−抗体の結合したリポソー
ムを含み、位置a2には抗トリヨートチロンジ(T3)
−抗体の結合したリポソームを含ませた。位置a1およ
びa2を試料が通過するとき、第3図に示すメツシュe
を境にしであるリポソーム膜上の抗体を試料中の成分が
特異的に反応して目的とする成分はリポソーム膜上に保
持された。試料を電極のプラス側Bからマイナス側Cま
で泳動させた後、a4a、にリン酸緩衝液中に補体と金
属を含む試薬10μaを注入しリポソーム膜と反応させ
た。試料の抗原と結合したリポソーム膜は、補体活性の
溶解作用により膜が破れ、リポソーム膜中に封入されて
いたキレート剤TAMSMBが膜外に流出した。
キレート剤TAMSMBは金属と反応してキレートを形
成して発色した。。補体と金属を注入してから20分後
渡長585nmにおける吸収量から試料中の73、T4
の量を定量した。
第4図および第5図の検量線はT3.T4の濃度5点を
取り作成した。この検量線から試料中のT、、T、を求
めた。添加回収実験の結果、添加した量とほぼ一致した
値が結果として得られた。これを第2表に示す。この実
験結果から血清中のT、、T、の同時測定が可能である
ことが確認された。
第  2  表 上述した実施例によれば、サンプリングした微量の一被
検体試料を用いて各種の生体成分を同時°に定性あるい
は定量する免疫分析方法を提供することができる。特に
展開層中で目的成分と他の成分を分別できるため1分析
する際夾雑物が存在しないという利点がある。さらに展
開層中に担持する試薬の種類と、数を変化させることに
より、目的とする複数の成分を同時に分析することが可
能となる。
〔発明の効果〕
本発明によれば、同じ試料について複数反応を容易に生
せしめることができ、複数項目分析を簡単な操作で実行
することができる。
【図面の簡単な説明】
第1図は、実験例1の展開層体を説明する図、第2図は
、実験例2の展開層体を説明する図、第3図は第2図の
側面図、第4図はT4の検量線例を示す図、第5図はT
3の検量線例を示す図である。 a・・・抗IgG抗体、b・・・抗1gA抗体、C・・
・抗IgG抗体、d、e、f・・・スポット位置、g・
・・試料スポット位置。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、試料を展開し得る展開層体上の異なる場所に複数の
    抗原または抗体を有する試薬を担持させておき、上記展
    開層体の特定の場所に試料を添加して移動させ、試料が
    上記各試薬担持場所を移動したあと反応生成物を観測す
    ることを特徴とする複数項目分析方法。 2、特許請求の範囲第1項において、上記試薬は、発色
    反応に寄与する物質を封入したマイクロカプセルである
    ことを特徴とする複数項目分析方法。 3、特許請求の範囲第2項において、上記マイクロカプ
    セルは、抗原抗体反応または補体活性により表面が溶解
    作用を受けるものであることを特徴とする複数項目分析
    方法。 4、特許請求の範囲第2項において、上記マイクロカプ
    セルに封入された物質は、キレート剤、酵素、補酵素、
    けい光発光物質の中から選択されることを特徴とする複
    数項目分析方法。 5、特許請求の範囲第1項において、上記反応生成物の
    観測は、光学的測定または電気的測定によつてなされる
    ことを特徴とする複数項目分析方法。
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