CH640060A5 - Verfahren zur gesamtbestimmung von hormonen und pharmaka. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einVerfahren zur Gesamtbestimmung von Hormonen und Pharmaka.

Es sind verschiedene Verfahren zur Gesamtbestimmung von Hormonen oder Pharmaka, die im menschlichen Serum teilweise an spezifische oder nicht-spezifische Bindungsproteine gebunden vorliegen, bekannt. Die verhältnismässig neuen radioimmunologischen Techniken haben zur genauen Hormonbestimmung wesentlich beigetragen.

Eine ausführliche Beschreibung des Radioimmunoassays findet sich beispielsweise in Clinical Chemistry Vol. 19 No. 2, 1973 Seite 145. In Clinical Chemistry Vol. 19 No. 12,1973 Seite 1339 und Clinical Chemistry Vol. 21 No. 7,1975, Seite 829 sind radioimmunologische Techniken beschrieben, bei denen ein in Gel eingeschlossener Antikörper verwendet wird. Der Einschluss des Antikörpers in Gel wird von den Autoren als vorteilhaft erachtet, weil dadurch Wechselwirkungen mit Molekülen hohen Molekulargewichts ausgeschaltet werden können. Diese bekannten Arbeitsweisen sind jedoch nicht auf die Gesamthormonbestimmung gerichtet. Die Gesamthormonbestimmung ist jedoch aus medizinischer Sicht wesentlich.

Verfahren zur Gesamtbestimmung von Hormonen durch enzymatische Hydrolyse der Bindungsproteine und mittels radioimmunologischer Techniken sind aus J. Clin. Endocrinol. Metab. 42,189,1976 und Clinical Chemistry Vol. 22 No. 11, 1976 Seite 1850 bekannt geworden. In diesen Artikeln wird ausgeführt, dass die enzymatische Spaltung gegenüber den bisher verwendeten Verfahren, wie beispielsweise Lösungsmittelextraktion oder Hitzedenaturierung, wesentliche Vorteile aufweist. Als Vorteile werden insbesondere genannt, dass die Extraktion mit organischen Lösungsmitteln und die chromatographische Reinigung der Proben entfallt, die Bestimmungszeit und die Kosten verringert werden, die Scintilla-tionszählung in der Flüssigkeit entfällt, Spezifität und Genauigkeit erhöht werden, die Bestimmungsmethode automatisiert werden kann und insbesondere es sich um eine universell anwendbare Methode handelt.

Das zur Hydrolyse des Bindungsproteins verwendete Enzym greift jedoch auch den Antikörper, der im nächsten Arbeitsschritt eingesetzt wird, an und zerstört diesen. Aus diesem Grund muss das Enzym vor der Zugabe des Antikörpers desaktiviert werden. Die Inaktivierung der enzymatischen Aktivität ist auf verschiedene Weise möglich, beispielsweise kann das Enzym durch wesentliche Änderung des pH-Wertes oder durch Hitzeeinwirkung denaturiert werden.

Diese Denaturierungsstufe ist jedoch äusserst nachteilig. Sie erfordert entweder den Einsatz von zusätzlichen Chemikalien, wodurch weitere Störfaktoren in das System eingebracht werden oder benötigt bei der Hitzedenaturierung lange Zeit. Die Hitzeeinwirkung muss etwa 5 min betragen, die Abkühlzeit beträgt etwa 15 min. Diese Denaturierungsstufe ist folglich ein wesentliches Hindernis zur Automatisierung der Bestimmung. Ferner ist je nach verwendetem System, insbesondere dem eingesetzten Enzym, eine andersartige Denatu-. rierung erforderlich, was der allgemeinen Anwendbarkeit der 5 bekannten Bestimmungsmethode und deren Automatisation entgegensteht.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Gesamtbestimmung von Hormonen und Pharmaka, bei dem eine Denaturierungsstufe nicht erforderlich ist, wodurch io eine universelle Anwendbarkeit der Bestimmungsmethode erreicht wird, die Bestimmungszeit und der Bestimmungsaufwand verringert werden, und eine Automatisierung der Bestimmung ermöglicht wird.

Diese Aufgabe wird gemäss der Erfindung durch ein Ver-15 fahren zur Gesamtbestimmung von teilweise an Körperproteine gebundene Hormone oder Pharmaka durch enzymatische Hydrolyse der Körperproteine, Reaktion der Hormone oder Pharmaka mit einem Antikörper und radioimmunologische Bestimmung der Hormone oder Pharmaka gelöst, das 2o durch die Verwendung von immobilisierten Antikörpern gekennzeichnet ist.

Vorzugsweise wird der Antikörper in einem Polymergel eingeschlossen. Als Polymergel kommen insbesondere Acryl-amidpolymere und Acrylamidcopolymere in Betracht. 25 Durch den erfindungsgemässen Einsatz von immobilisierten Antikörpern sind diese vor dem Enzym geschützt. Die Antikörper sind in der Polymermatrix eingeschlossen, in die das Enzym aufgrund seiner Grösse nicht einzudringen vermag. Durch diese einfache und elegante Massnahme kann bei 30 dem erfindungsgemässen Verfahren auf die Denaturierungsstufe des Enzyms verzichtet werden. Das Verfahren gestaltet sich somit als wesentlich weniger arbeits- und zeitintensiv. Das Verfahren ist universell auf verschiedene Systeme anwendbar, da die spezifische Enzymdenaturierung entfällt. 3S Von besonderer Bedeutung ist das erfindungsgemässe Verfahren in Richtung auf die Automatisierung der Bestimmung.

Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich zur Bestimmung der verschiedensten Hormone und Pharmaka, die im Serum oder Plasma zum Teil an spezifische oder nicht-spezifi-40 sehe Bindungsproteine gebunden vorliegen. In Betracht kommen die Schilddrüsenhormone, insbesondere Thyroxin und Trijodthyronin, die Steroidhormone, wie Cortisol, Testosteron, Progesteron, Östron, Östradiol und Östriol und die Herzglycoside, wie Digitoxin und Digoxin. Ferner können 45 bestimmt werden Vitamine, besonders Vitamin B12 und Folsäure, sowie Pharmaka mit starker Proteinbindung, wie beispielsweise Antikoagulantien, Dicumarol, Analgetika und Salyzilate.

Die Bestimmung wird üblicherweise wie folgt durchge-50 führt: das das Hormon oder Pharmaka enthaltende Serum oder Plasma wird mit einer Lösung eines Enzyms in Kontakt gebracht, das das Bindungsprotein hydrolytisch spaltet. Die Auswahl des Enzyms richtet sich nach dem spezifischen Bindungsprotein. In Betracht kommen je nach System beispiels-55 weise folgende Enzyme:

Aminopeptidase, Bromelin, Carboxypeptidase, Chymo-trypsin, Elastase, Ficin, Leucinaminopeptidase, Lipase, Pankreatin, Papin, Pepsin, Pronase, Protease, Proteinase, Ther-molysin und Trypsin. Zur Bestimmung von Hormonen wie fi0 Thyroxin und Cortisol eignen sich besonders proteolytische Enzyme, wie Proteinase, Pronase oder Pepsin.

Die Reaktion der Probe mit der enzymatischen Lösung kann thermostatisiert bei Temperaturen um 35 °C oder bei Zimmertemperatur ablaufen. Die benötigte Zeitdauer für die enzymatische Hydrolyse des Proteins ist abhängig von dem 65 verwendeten Enzym und liegt zwischen 15 min und 4 h, in vielen Fällen zwischen 15 und 30 min.

Nach der Hydrolyse des Proteins wird die Probe mit markiertem Indikatorhapten versetzt und auf den immobilisierten Antikörper aufgegeben.

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Die Aufgabe erfolgt mit Hilfe einer Mehrkanalkolbenpumpe. Bei Rückwärtslauf der Pumpe wird das Reaktionsgemisch quantitativ in Säulchen gesaugt, in denen sich der immobilisierte Antikörper befindet.

Ein anschliessendes Pausenintervall wird zur Reaktion der markierten und nicht-markierten, zu bestimmenden Substanz mit dem immobilisierten Antikörper vorgesehen.

Eine abschliessende Elution mit Wasser oder Pufferlösung ergibt die Trennung von an den Antikörper gebundenem und freiem Hapten.

Die im Eluat bzw. im Säulchen verbleibende Radioaktivität ist ein Mass für die Konzentration der zu bestimmenden Substanzen.

Das radioimmunologische Prinzip ist beispielsweise aus D.S. Skelley et al, Clinical Chemistry, Band 19, Nr. 2 1973, Seiten 146 ff. bekannt.

Gegebenenfalls kommen auch alternative Bestimmungsmethoden, wie die fluoroimmunologische Bestimmung oder die Bestimmung mittels enzymatischer Markierung, in Betracht.

Die Synthese der Antigene, die Gewinnung von Antise-ren, beispielsweise durch Immunisierung von Kaninchen, und die Isolierung sowie Immobilisierung der Antikörper sind bekannt (vgl. beispielsweise D.S. Skelley et al, Clinical Chemistry, Band 19, Nr. 2, 1973, Seiten 146 ff.).

Die Herstellung des immobilisierten Antikörpers erfolgt beispielsweise indem eine Lösung des Antikörpers einem Mo-nomergemisch zugegeben wird. Der Ansatz wird radikalisch polymerisiert und das erhaltene Polymerisat zerkleinert, gewaschen und getrocknet. Als Monomer eignet sich insbesondere Acrylamid. Durch Copolymerisation des Acrylamids mit Acrylderivaten mit verschiedenen funktionellen Gruppen, wie beispielsweise Acrylsäure, Methacrylsäure und Meth-acrylamid, können jedoch vorteilhafte Variationen der Matrix erzielt werden. Durch den Zusatz von Copolymeren kann insbesondere die Hydrophobizität und die Ladung der Matrix beeinflusst werden und dadurch die Reaktion des Antikörpers mit dem zu bestimmenden Hormon oder Pharmaka beeinflusst werden.

Zur Erzielung einer geeigneten Porengrösse der Polymermatrix wird die Monomerkonzentration variiert. Eine Mono-merkonzentration im Bereich von etwa 20% führt zu einer Porengrösse von etwa 7 bis 10Â.

Vorteilhaft ist auch die Verwendung einer ionenausgetauschten Polymermatrix. Die durch Ionenaustausch erzielbare Pufferwirkung kann dazu verwendet werden, die pH-Werte in der zu bestimmenden Probe zu verändern.

Ein vorteilhaftes System ist beispielsweise ein Copolyme-risat von Acrylamid und 20 bis 60% Acrylsäure und/oder Methacrylsäure, hergestellt aus einer etwa 20%igen Monomerlösung, bei dem zumindest ein Teil der Säuregruppen in die entsprechenden Alkali- oder Erdalkalisalze überführt sind.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Bestimmung von Thyroxin durch enzymatische Hydrolyse mit Pronase

Die Antigensynthese erfolgte ausgehend von Thyroxin-äthylester und Kupplung an Albumin mittels Carbodiimid. Die Antikörperproduktion erfolgte durch Immunisierung von Kaninchen.

Der Antikörper wurde danach im Polymergel eingeschlossen. Es wurde Acrylamidmonomer einer Konzentration von 2,9 Mol/1 verwendet. Für einen Ansatz wurden 5 g Acrylamid und 1,25 g N,N'-Methylenbisacrylamid im Becherglas in 24 ml Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2 gelöst.

Nach Zumischen des Antiserums in 1 ml Phosphatpuffer wurde die Reaktion mit 0,15 mg Riboflavin und 0,10 ml N,N,N',N'-Tetramethyläthylendiamin gestartet und mit UV-

Licht bestrahlt. Während der Bestrahlungszeit von 45 min wurde die Temperatur unter 50 °C gehalten. Der Gelblock wurde anschliessend zerkleinert, mit destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet.

5 Die Herstellung des Nullserums erfolgte, indem 1 ml Serum und eine Pronaselösung einer Konzentration von 2 mg/ml 30 min bei 35 °C reagieren gelassen wurden. Anschliessend wurden 2 g Ionenaustauschharz (Amberlite 400) zugegeben.

10 Anschliessend wurden 50 p.1 Nullserum mit einem Gehalt von 18 |tg Thyroxin je 100 ml mit 350 |tl Enzymlösung einer Konzentration von 2 mg je ml 30 min bei einer Temperatur von 35 °C umgesetzt.

Zu 100 |il dieser Lösung wurden nun 700 jj.1 Tracerlösung 15 mit einem Gehalt von 5,2 ng/ml radioaktiv markiertem Thyroxin und 50 |tl Pufferlösung eines pH-Wertes von 7,2 zugegeben. 350 jj.1 der vorgenannten Lösung wurden auf 60 mg des Antikörpergels aufgebracht. Die Inkubationszeit betrug 30 min, die Temperatur 22 °C. Anschliessend wurde 5 min bei ei-m ner Pumpgeschwindigkeit von 0,5 ml/min eluiert.

Eine Dosiswirkungskurve für Thyoxin wurde mittels Thy-roxinlösungen mit Konzentrationen von 5 ng, 10 ng, 20 ng und 50 ng je 100 ml aufgestellt. Diese Lösungen wurden mit 350 |il Enzymlösung (Konzentration 2 mg/ml) 30 min bei ei-25 ner Temperatur von 35 °C umgesetzt.

Zu 100 jj.1 dieser Lösung wurden 700 |il Tracerlösung (5,2 ng/ml) und anstatt des Puffers 50 jo.1 Nullserum zugesetzt. Die Auswertung zeigte eine Wiederfindung von 99%.

30 Beispiel 2

Gesamtbestimmung von Thyroxin durch enzymatische Hydrolyse mit Proteinase

Es wurde gemäss der Arbeitsweise des Beispiels 1 verfahren, wobei jedoch anstelle der Pronaselösung eine Proteinase-35 lösung mit einer Konzentration von 2 mg/ml eingesetzt - wurden.

Das verwendete Serum bestand aus einem Nullserum mit einem Gehalt von 6 mg je 100 ml.

Die Wiederfindung betrug 98,5%.

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Beispiel 3

Gesamtbestimmung von Cortisol durch enzymatische Hydrolyse mit Pronase

Es wurde gemäss der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeits-« weise verfahren, wobei jedoch ein Serum eingesetzt wurde, das einen Gehalt von 18 ng Cortisol je 100 ml aufwies. Als Tracerlösung wurde eine Lösung von radioaktiv markiertem Cortisol einer Konzentration von 0,15 ng/ml eingesetzt. Die Wiederfindung betrug 97%.

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Beispiel 4

Gesamtbestimmung von Cortisol durch enzymatische Hydrolyse mittels Proteinase

Es wurde entsprechend der in Beispiel 3 beschriebenen Ar-55 beitsweise verfahren, wobei jedoch das Serum 6 jug Cortisol je 100 ml enthielt und mit einer Proteinaselösung einer Konzentration von 2 mg/ml gearbeitet wurde.

Die Wiederfindung betrug 98%.

60 Der bei den Beispielen 3 und 4 eingesetzte Antikörper wurde durch Synthese von Cortisol-C3-Oxim und Kupplung an Albumin mit gemischtem Anhydrid und Antikörperproduktion durch Immunisierung von Kaninchen erhalten.

65 Gesamtbestimmung von Thyroxin durch enzymatische Hydrolyse mit Pepsin

Es wurde gemäss der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 1 verfahren.

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10 ni Serum mit einem Gehalt von 18 ng Thyroxin je 100 ml wurden mit 160 jj.1 einer Enzymlösung versetzt, die aus 2 mg/ml Pepsin gelöst in 0,1 n Salzsäure bestand.

Die Reaktion mit dem Enzym wurde bei Raumtemperatur 30 min durchgeführt.

Zu diesen 170 |xl wurden anschliessend 150 nl Tracerlösung mit einem Gehalt von 5,2 ng/ml radioaktiv markiertem Thyroxin zugegeben.

Die gesamte Lösung wurde danach auf 60 mg Antikörpergel aufgebracht.

Die Polymermatrix des Antikörpergels bestand aus einem Copolymerisat aus Acrylamid und 40 Mol% des Natriumsalzes der Methacrylsäure, hergestellt aus einer 20%igen Monomerlösung.

s Die Inkubationszeit betrug 30 min, die Temperatur 22 °C.

Anschliessend wurde 5 min bei einer Pumpgeschwindigkeit von 0,5 ml/min eluiert.

Die Auswertung zeigte eine Wiederfindung von 98%.

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640 060 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Gesamtbestimmung von teilweise an Körperproteine gebundene Hormone oder Pharmaka durch enzymatische Hydrolyse der Körperproteine, Reaktion der Hormone oder Pharmaka mit einem Antikörper und radioimmunologischer Bestimmung der Hormone oder Pharmaka, gekennzeichnet durch die Verwendung von immobilisierten Antikörpern.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Polymergel eingeschlossene Antikörper verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Acrylamidpolymer oder Acrylamidco-polymer eingeschlossene Antikörper verwendet werden.