Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania cal¬ kowitej zawartosci hormonów lub leków.Znane sq rózne sposoby oznaczania calkowitej za¬ wartosci hormonów lub leków, znajdujacych sie w suro¬ wicy ludzi, zwiazanych czesciowo specyficznymi lub nie- 5 specyficznymi bialkami wiazacymi. Stosunkowo no¬ we techniki radioimmunologiczne odnosily sie glównie do dokladnego oznaczenia hormonów.Szczególowy opis metod radiaimmunologicznych znaj¬ duje sie np. w Clinical Chemistry t. 19, nr 2, 1973 str. 10 145. W Clinical Chemistry t. 19, nr 12, 1973 str. 1339 i ibid. t. 21, nr 7, 1975 str. 829 opisane sa techniki ra¬ dioimmunologiczne, w których stosuje sie przeciwcialo zamkniete w zelu. Zamkniecie przeciwciala w zelu uwa¬ zane jest przez autorów za korzystne, poniewaz wyklu- 15 czone jest wzajemne oddzialywanie na siebie czastek o wysokim ciezarze czasteczkowym. Jednakze te znane sposoby postepowania nie maja na celu oznaczania calkowitej ilosci hormonu. Z medycznego punktu widze¬ nia jednakze jest bardzo istotne oznaczanie calkowitej 20 ilosci hormonu.Metody calkowitego oznaczania hormonów przez enzy¬ matyczna hydrolize wiazania proteinowego i za po¬ moca technik radioimmunologicznych znane sa z J.Clin. Endocrinol. Metab. 42, 189, 1976 i Clinical Che- 25 mistry t. 22, nr 11, 1976 str. 1850. W artykulach tych wykazano, ze enzymatyczne rozszczepienie jest znacznie korzystniejsze w porównaniu do dotychczas stosowanych metod, jak np. ekstrakcja rozpuszczlnikiem lub de- naturacjacieplna. 3° Jako zalety wymieniano zwlaszcza, ze opada ekstrak¬ cja rozpuszczalnikiem organicznym i chromatograficzne oczyszczanie próbek, zmniejsza sie czas oznaczania i koszty, odpada liczenie scyntylacyjne w cieczy, pod¬ wyzszona jest specyficznosc i dokladnosc, metody ozna¬ czania mozna zautomatyzowac, a zwlaszcza chodzi o zastosowanie metody uniwersalnej.Enzym zastosowany do hydrolizy wiazania proteinowe¬ go, atakuje jednakze równiez antycialo, które w nastep¬ nym etapie zostaje dodane i rozklada je. Z tego powo¬ du przed dodaniem przeciwciala enzym musi byc zde- zaktywowany. Dezaktywacje enzymu mozna przeprowa¬ dzic w rózny sposób, np. przez zmiane wartosci pH lub dzialanie termiczne.Etap denaturacji jest jednak w najwyzszym stopniu niekorzystny. Wymaga on albo wprowadzenia dodat¬ kowych chemikalii, przez co zostaja wprowadzone do ukladu dalsze czynniki zaklócajace, albo przy denatu¬ racji termicznej wymaga dlugiego czasu. Dzialanie ter¬ miczne musi wynosic okolo 5 minut, czas chlodzenia okolo 15 minut. Ten etap denaturacji jest istotna przesz¬ koda do zautomatyzowania oznaczania. Nastepnie w zaleznosci od zastosowanego systemu, a zwlaszcza wpro¬ wadzonego enzymu, wymagana jest innego rodzaju de- naturacja, co stoi na przeszkodzie powszechnemu zasto¬ sowaniu znanych metod oznaczania i automatyzacji.Celem wynalazku jest opracowanie sposobu oznacza¬ nia hormonów i leków, w którym nie bylby potrzebny etap denaturacji, dzieki czemu metoda oznaczania mo¬ glaby stac sie uniwersalna, czas oznaczania i koszt 110 972110 972 zmniejszylby sie i mozliwe byloby zautomatyzowanie oz¬ naczania.Cel ten zost£t«psiqgniety przez opracowanie sposobu ^ .-ozrKTCtgaia korjfjionów i leków zwiazanych czesciowo ze ? Vi|i^cyficzhymi lub* niespecyficznymi bialkami wiazacymi ; przez enzymatyczna hydrolize wiazan proteinowych, re¬ akcje Jwmomr lub leku z przeciwcialem i radioim- mu^nologkss^e Tazna-czenie hormonów lub leków polega¬ jace'na zastosowaniu unieruchomionych przeciwcial.Korzystnie przeciwcialo zamyka sie w zelu polimeru.Jako polimer stosuje sie zwlaszcza polimery i kopolimery akryloamidu.Dzieki sposobowi wedlug wynalazku wprowadzone unieruchomienie przeciwciala sa chronione przed en¬ zymem. Przeciwciala sa zamkniete w nosniku polimeru do którego enzym ze wzgledu na swoja wielkosc nie moze przeniknac.W wyniku zastosowania tego prostego srodka w pro¬ cesie wedlug wynalazku mozna eliminowac etap dena- turacji enzymu. Dzieki temu proces ten wymaga mniej¬ szego nakladu pracy i zuzycia czasu. Metoda ta jest uniwersalna i mozna ja stosowac do róznych sposobów, poniewaz odpada koniecznosc denaturacji specyficznego enzymu. Szczególne znaczenie ma fakt, ze umozliwia zautomatyzowanie oznaczenia.Sposób wedlug wynalazku nadaje sie do oznaczania róznych hormonów i leków, które zwiazane czesciowo ze specyficzynmi lub niespecyficznymi bialkami wiazacymi znajduja sie w surowicy lub plazmie. Mozna oznaczac hormony tarczycy, zwlaszcza tyroksyne i trójjodotyronine, hormony sterydowe jak kortizon, testosteron, progestron, estron, estradiol i estriol oraz glikozydy nasercowe jak digitoksyna i digoksyna. Nastepnie mozna oznaczac witaminy, zwlaszcza witamine B12 i kwas foliowy, jak równiez leki zawierajace silne wiazania proteinowe, jak np. antykoagulanty, dwukumarol, analgetika (srodki us¬ mierzajace ból) i salicylany.W celu przeprowadzenia oznaczenia kontaktuje sie surowice lub plazme zawierajace hormon lub lek z en¬ zymem, który rozszczepia hydrolitycznie wiazanie proteino¬ we. Wybór enzymu zalezy od specyficznosci wiazania pro¬ teinowego. W zaleznosci od wiazania stosuje sie np. na¬ stepujace enzymy: aminopeptydaza, bromelina, karboksy- peptydaza, chymotrypsyna, elastaza, ficina, leucynoamino- peptydaza, lipaza, pankreatyna, papina, pepsyna, pro- naza, proteaza, proteunaza, termolizyna i trypsyna. Do oznaczania hormonów takich jak tyroksyna i kortizon odpowiednie sa zwlaszcza enzymy proteolityczne jak pro- teinaza, pronaza lub pepsyna.Reakcja próbki z roztworem enzymatycznym moze byc termostatowana w temperaturach okolo 35°C lub poko¬ jowej. Okres czasu potrzebny do enzymatycznej hydro¬ lizy zalezy od zastosowanego enzymu i lezy w granicach 15 minut — 4 godziny, w wielu przypadkach miedzy 15-30 minut.Po przeprowadzeniu hydrolizy bialka, próbke miesza sie ze znaczonym wskaznikiem haptenem i dodaje do unieruchomionego przeciwciala.Dodawanie przeprowadza sie za pomoca wielokana¬ lowej pompy. Przy wstecznym biegu pompy mieszanina reakcyjna zostaje zassana ilosciowo do kolumienek, w których znajduje sie unieruchomione przeciwcialo. Bez¬ posrednio po tym nastepuje krótka przerwa dla prze¬ biegu reakcji znaczonej i nieznaczonej substancji z unieruchomionym przeciwcialem.Nastepnie elucja woda lub roztworem buforu pozwala na rozdzielenie haptenu zwiazanego z przeciwcialem od wolnego haptenu. Radioaktywnosc ekstraktu wzglednie kolumienek jest miara stezenia oznaczanej substancji. 5 Zasady radioimmunologii sa znane, np. D.S. Skelle/ i inni, Clinical Chemistry t. 19, nr 2, 1973, str. 146, 77.Ewentualnie mozna stosowac alternatywne metody jak oznaczanie fluoroimmunologiczne lub za pomoca io enzymatycznego znakowania.Synteza antygenu, uzyskiwanie antyserum, np. przez uodpornianie królików i wydzielanie jak równiez unieru¬ chamianie przeciwcial jest znane (por. np. D.S. Skelly i inni Clinical Chemistry t. 19, nr 2, 1973 str. 146 77). 15 Unieruchomienie przeciwciala uzyskuje sie np. w ten sposób, ze roztwór przeciwciala dodaje sie do miesza¬ niny monomerów. Szarze poddaje sie polimeryzacji wol- norodnikowej, a otrzymany polimer rozdrabnia sie, prze¬ mywa i suszy. Jako monomer stosuje sie zwlaszcza akry- 20 loamid. Przez kopolimeryzacje akryloamidu z pochod¬ nymi akrylowymi zawierajacymi rózne grupy funkcyjne jak np. kwas akrylowy, kwas metakrylowy i metakrylo- amid mozna uzyskac korzystne warianty nosnika. Przez dodanie kopolimeru mozna zwlaszcza wplywac na wlas- 25 ciwosci hydrofobowe i elektrostatyczne nosnika, a przez to wplywac na reakcje przeciwciala z oznaczonym hor¬ monem lub lekiem.Dla uzyskania por w nosniku o odpowiedniej wielkos¬ ci zmienia sie stezenie monomeru. Stezenie monomeru 30 w zakresie od okolo 20% prowadzi do uzyskania porów o wielkosci 7 do 10 A.Korzystne jest takze zastosowanie w nosniku jono- -wymiennego polimeru. Dzialanie buforowe uzyskane dzieki wymianie jonowej mozna zastosowac w celu 35 zmiany wartosci pH w oznaczonej próbce.Korzystnym ukladem jest, np. kopolimer akryloamidu i 20—60% kwasu akrylowego i/lub metakrylowego otrzy¬ many z okolo 20% roztworu monomeru, w którym co najmniej jedna czesc grup kwasowych jest przeksztal- 40 eona w odpowiednie sole alkaliczne i metali ziem alka¬ licznych.Wynalazek objasniaja dokladniej nastepujace przy¬ klady.Przyklad I. Oznaczanie tyroksyny przez enzyma- 45 tyczna hydrolize za pomoca pronazy.Synteze antygenu przeprowadza sie wychodzac z estru etylowego tyroksyny i sprzezenie z albumina za pomoca karboksydwuimidu. Wytwarzanie przeciwcial przeprowadzono przez uodpornianie królików. 50 Nastepnie zamyka sie przeciwciala w zelu polimeru.Stosuje sie monomer akryloamidu o stezeniu 2,9 m/l.Do szarzy rozpuszcza sie 5 g akryloamidu i 1,25 g N.N^metylenobisakryloamidu w kolbce Bechera w 24 ml buforu fosforanowego o wartosci pH 7,2. Po do- 55 mieszaniu antyserum w 1 ml buforu fosforanowego, reakcje zapoczatkowuje sie 0,15 mg ryboflawiny i 10 ml N,N,N',N'-czterometyloetylenodwuaminy i naswietlaniem swiatlem UV. W trakcie 45 minutowego naswietlania utrzymuje sie temperature ponizej 50°C. Zólty blok zos- 60 taje nastepnie rozdrobniony, przemyty woda destylowana i wysuszony.Surowice zerowa otrzymuje sie przez reakcje 1 ml su¬ rowicy i roztworu pronazy o stezeniu 2 mg/ml w ciagu 30 minut w temperaturze 35°C. Nastepnie dodaje sie 65 2 g zywicy wymieniacza jonowego (Amberlit 400).110972 Nastepnie, 50 jliI surowicy zerowej o zawartosci 18 g tyroksyny (100 ml poddaje sie reakcji ze 350 \i\ roztworu enzymu o stezeniu 2 mg/ml w ciagu 30 minut w tempe¬ raturze 35°C.Do 100 u.l tego roztworu dodaje sie 700 jil roztworu wskaznika izotopowego zawierajacego 5,2 ng/ml tyro¬ ksyny znakowanej izotopowo i 50 ni roztworu buforu o wartosci pH 7,2, 350 ul tego roztworu dodaje sie do 60 mg zelu przeciwciala. Okres inkubacji wynosi 30 mi¬ nut, temperatura 22°C. Nastepnie roztwór jest w ciagu 5 minut eluowany z szybkoscia pompy 0,5 ml/minute.Krzywa efektu dawkowania zostala wykreslona za po¬ moca roztworu tyroksyny o stezeniu 5 ng, 10 ng, 20 ng i 50 ng na 100 ml. Roztwory te poddano reakcji z 350 \i\ roztworu enzymu (stezenie 2 mg/ml) w ciagu 30 minut w temperaturze 35°C.Do 100 u, I tego roztworu dodano 700 u.I roztworu wskaznika izotopowego (5,2 ng/ml) i zamiast buforu 50 |Lil surowicy zerowej. Ocena wykazala odzyskanie w 99 %.Przyklad II. Oznaczanie calkowitej tyroksyny przez enzymatyczna hydrolize za pomoca proteinazy.Postepowano jak w przykladzie I, przy czym zamiast roztworu pronazy zastosowano roztwór proteinazy o stezeniu 2 mg/ml. Zastosowana surowice stanowila su¬ rowica zerowa o zawartosci 6 mg na 100 ml. Odzyska¬ nie wynosilo 98,5%.Przyklad III. Oznaczenie calkowitego kort izon u przez enzymatyczna hydrolize za pomoca pronazy.Postepowano jak w przykladzie I, przy czym zastoso¬ wano surowice, która zawierala 18 |xg kortizonu na 100 ml. Jako roztwór wskaznika izotopowego zastosowano roztwór znakowanego kortizonu o stezeniu 0,15 ng/mL Odzyskanie wynosilo 97%.Przyklad IV. Oznaczanie calkowitego kortizonu przez enzymatyczna hydrolize za pomoca proteinazy.Postepowano jak w przykladzie III, przy czym suro¬ wica zawierala 6 u,g kortizonu w 100 ml i stosowano roztwór proteinazy o stezeniu 2 mg/ml. Odzyskanie wy¬ nosilo 98%. 10 Stosowane w przykladach III i IV przeciwciala otrzy¬ mano przez synteze kortizon-C3-oksym i sprzeganie na albuminie z mieszanym bezwodnikiem, a przeciwciala uzyskano przez uodporniania królików. 5 Przyklad V. Oznaczanie calkowitej tyroksyny przez enzymatyczna hydrolize za pomoca pepsyny. Postepo¬ wano jak w przykladzie I. 10 pil surowicy o zawartosci 18 jxg tyroksyny w 100 ml zadano 160 \x\ roztworu enzymu, który otrzymano z 2 mg/ml pepsyny rozpuszczonej w 0,1 n kwasie solnym.Reakcje z enzymem prowadzono w temperaturze poko¬ jowej w ciagu 30 minut.Nastepnie do tych 170 \i\ dodano 150 u.l roztworu 15 wskaznika izotopowego o zawartosci 5,2 ng/ml znako¬ wanej tyroksyny. Otrzymany roztwór nastepnie dodano do 60 mg zelu przeciwciala.Nosnik z polimeru zelu przeciwciala stanowi kopolimer akryloamidu i 40% molowych soli sodowej kwasu meta- 20 krylowego, otrzymanej z 20% roztworu monomeru. Czas inkubacji wynosil 30 minut, temperatura 22°C. Na ko¬ niec eluowano w ciagu 5 minut przy szybkosci pompy 0,5 ml/min. Ocena wykazala odzyskanie w 98%. 25 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób oznaczania calkowitej zawartosci hormo- 30 nów lub leków zwiazanych czesciowo ze specyficznymi lub niespecyficznymi bialkami wiazacymi przez enzyma¬ tyczna hydrolize wiazania proteinowego, reakcje hor¬ monu lub leku z przeciwcialem i radiaimmunologiczne- go oznaczania hormonu lub leku, znamienny tym, ze 35 stosuje sie przeciwciala unieruchomione. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosu¬ je sie przeciwciala zamkniete w zelu polimeru. 3. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, 40 ze stosuje sie przeciwciala zamkniete w polimerze lub kopolimerze akryloamidu. PL