CS200547B2 - Application of immobilized counteractive substances - Google Patents

Description

Vynález se týká použití immabilizovaných protilátek pro celkové stanoveni hormonů a léčiv.

Jsou známy různé způsoby celkového stanovení hormonů něho léčiv, které jsou vázány v lidském séru částečně na specifické nebo nespecifické vazebné bílkoviny. Poměrně nové radioimunologické techniky přispěly podstatně k přesnému stanovení hormonů.

Podrobný popis radioimunologického hodnocení je například v Clinical Chemistry sv. 19, č. 2, 1973, str. 145. V Clinical Chemistry sv. 19, č. 12, 1973, str. 1339 a Clinical Chemistry sv. 21 č. 7, 1975, str. 285 jsou popsány radioimunologické techniky, při kterých se používá protilátek uzavřených do gelu. Uzavření protilátky do gelu je považováno od autorů za výhodné, protože tím lze vyloučit interakce s molekulami o vysoké molekulární hmotnosti. Tyto známé postupy však nejsou zaměřeny na celkové stanovení hormonů. Celkové stanovení hormonů je však z lékařského hlediska podstatné.

Způsob celkového stanovení hormonů enzymatickou hydrolýzou vazebných bílkovin a pomocí radioimunologické techniky jsou známé z J. Clin. Endocrinol. Metab. 42, 189, 1976 a Clinical Chemistry sv. 22, č. 11, 1976, str. 1850. V těchto článcích se uvádí, že enzymové štěpení ve srovnání s dosud užíva2 nými postupy, jako například extrakcí rozpouštědly nebo tepelnou denaturací, vykazuje významné výhody, jako výhody se uvádí zejména, že odpadá extrakce organickými rozpouštědly a chromatografické čištění vzorků, doba stanovení a náklady se snižují, odpadá scintilacní počítání v kapalině, zvyšuje se specifičnost a přesnost, způsob stanovení lze automatizovat a jde zejména o obecně použitelnou metodu.

Enzym používaný k hydrolýze vazebných bílkovin napadá však rovněž protilátku, která se používá v dalším pracovním stupni a ničí ji. Z tohoto důvodu je nezbytné enzym před přidáním protilátky desaktivovat. Inaktivace enzymové aktivity je možná různými způsoby, například enzym lze denaturovat podstatnou změnou hodnoty pH nebo působením tepla.

Tento denaturační stupeň je však velmi nevýhodný. Vyžaduje buď použití dalších chemikálií, čímž se vnášejí do systému další rušivé faktory, nebo vyžaduje při tepelné denaturací dlouhou dobu. Působení tepla musí trvat asi 5 minut, ochlazení asi 15 minut. Tento denaturační stupeň představuje tudíž podstatnou překážku automatizace stanovení. Dále podle použitého systému, zejména podle nasazeného enzymu, je nezbytná odlišná denaturace, což překáží obecné použitelnosti známé metody stanovení a její automatizaci.

Úkolem vynálezu je vytvořit způsob celkového stanovení hormonů a léčiv, u kterého není nezbytný denaturační stupeň, čímž se dosahuje obecné použitelnosti metody stanovení, snižují se doba a náklady na stanovení a umožňuje se automatizace stanovení.

Tato úloha je podle vynálezu vyřešena použitím immobilizovaných protilátek, s výhodou uzavřených v polymerním obalu, například v akrylamidovém polymeru nebo kopolymeru, pro celkové stanovení hormonů nebo léčiv, částečně vázaných na vazebné bílkoviny, enzymovou hydrolýzou vazebných bílkovin, reakcí hormonů nebo léčiv s protilátkou a radioimunologickým stanovením hormonů nebo léčiv.

Protilátky se s výhodou uzavírají do polymerního gelu. Jako polymerní gely přicházejí v úvahu zejména akrylamidové polymery a akrylamidové kopolymery.

Imobilizované protilátky použité podle vynálezu jsou chráněny před enzymem. Protilátky jsou uzavřeny do polymerní matrice, do které enzym v důsledku své velikostí nemůže vnikat. Tímto jednoduchým a elegantním opatřením lze způsobem podle vynálezu vpustit stupeň denaturace enzymu. Tento způsob je tudíž podstatně méně náročný na práci a na čas. Způsob je použitelný obecně na různé systémy, protože odpadá specifická denaturace enzymu. Způsob podle vynálezu je zvláště významný se zřetelem na automatizaci stanovení.

Způsob podle vynálezu je vhodný ke stanovení nejrůznějších hormonů a léčiv, které se vyskytují v séru nebo v plazmě částečně vázány na specifické nebo nespecifické vazebné bílkoviny. V úvahu přicházejí hormony štítné žlázy, zejména thyroxin a trojodthyronin, steroidní hormony, jako kortisol, testosteron, progesteron, estradiol a estriol, a srdeční glykosidy, jako digitoxin a digoxin·. Dále lze stanovit vitamíny, zejména vitamín Bi2, a kyselinu listovou, jakož i léčiva se silnou vazbou na bílkoviny, jako například antikoagulancia, dikumarol, analgetika a salicyláty.

Při provádění stanovení se sérum nebo plazma obsahující hormon nebo léčiva uvádějí do styku s roztokem enzymu, který štěpí hydrolyticky vazebnou bílkovinu. Volba enzymu se řídí podle specifické vazebné bílkoviny. V úvahu přicházejí, vždy podle systému, například následující enzymy.

Aminopeptidáza, bromelin, karboxypeptidáza, chymotrypsin, elastáza, ficin, leucinaminopeptidáza, lipáza, pankreatin, papin, pepšln, pronása, proteáza, proteináza, thermolyzin a trypsin. Pro stanovení hormonů, jako thyroxinu a kortisolu, jsou vhodné zejména protelytické enzymy, jako proteináza, pronáza nebo pepsin.

Reakce vzorku s enzymovým roztokem může probíhat za termostatických podmínek při teplotách okolo 35 °C nebo při teplotě místnosti. Délka doby potřebné pró enzymovou hydrolýzu je závislá na použitém enžymii a činí asi 15 minut až 4 hodiny, v mnoha případech 15 až 30 minut.

Po hydrolýze bílkoviny se přidá ke vzorku značkovaný heptenový indikátor a vzorek ss nanese na imobilizovanou protilátku.

Nanášení se provádí pomocí víc^K^nálového čerpadla. Při zpětném Chodu čerpadla se reakční směs nasává kvantitativně do sloupečků, ve kterých je umístěna imobilizovaná protilátka. :

Následující interval pauzy je určen к reakci značkované a neznačkované látky, která má být stanovena, s imobilizovanou protilátkou.

Konečná eluce vodou nebo roztokem pufru provádí rozdělení heptanu volného a vázaného na protilátku.

Radioaktivita zůstávající v eluátu, popřípa-dě ve sloupečku, je mírou koncentrace stanovovaných látek.

Radioimunologický princip je například znám z práce D. S. Skelleye se spol. Clinical Chemistry, sv. 19, č. 2, 1973, str. 146 a násl.

V úvahu přicházejí popřípadě další metody stanovení, jako fluoroimunológické stanovení pomocí enzymového značení.

Syntéza antlgenů, získávání antisér, například imunizací králíků, a izolace, jakož i immobilizace protilátek jsou známé (srovnej například D. S. Skelley se spol., Clinical Chemistry sv. 19, č. 2, 1973, str. 146 a násl.).

Výroba immobilizovaných protilátek se provádí například tak, že se roztok protilátky přidává ke směsi monomerů. Násada se polymeruje radikálově a získaný polymer se rozmělní, promyje a vysuší. Jako monomer je vhodný zejména akrylamid. Kopolymerací akrylamidu s akrylovými deriváty s různými funkčními skupinami, jako například kyselinou akrylovou, methakrylovou a methakrylamidem, lze však dosáhnout výhodných variací matrice. Přídavkem kopolymerů lze ovlivnit zejména hydrofóbnost a náboj matrice a tím se ovlivňuje reakce protilátky se stanoveným hormonem nebo léčivy.

К dosažení vhodné velikosti pórů polymerní matrice se mění koncentrace monomerů. Koncentrace monomerů v rozmezí okolo 20 procent vede к velikosti pórů asi 7 až 10. . 10’1° m.

Výhodné je použití i polymerní matrice s vyměněnými ionty. Pufrační účinek dosažitelný výměnou iontů lze využít ke změně hodnot pH ve stanoveném vzorku.

Výhodným systémem je například kopolymer akrylamidu s 20 až 50 % kyseliny akrylové a/nebo methakrylové, připravený asi z 20% roztoku monomeru, přičemž alespoň část kyselých skupin se převádí v příslušné soli s alkalickými kovy nebo s kovy alkalických zemin.

Vynález je blíže objasněn následujícími příklady provedení.

Příklad 1

Stanovení thyroxinu enzymovou hydrolýzou pronázou

Syntéza antigenu, vycházející z ethylesteru thyroxinu, probíhala kopulací na albumin pomocí karbodiimidu. Tvorba protilátky byla realizována imunizací králíků.

Protilátka byla potom uzavřena od polymerního gelu. Bylo použito akrylamidového monomeru koncentrace 2,9 mol/1. Pro násadu bylo rozpuštěno 5 g akrylamidu a 1,25 g N,N‘-methylenbisakrylamidu v kádince ve 24 mililitrech fosfátového pufru o hodnotě pH 7,2. Po přidání antiséra v 1 ml fosfátovém pufru byla reakce iniciována 0,15 mg riboflavínu a 0,10 ml N,N,N‘,N‘-tetramethylendiaminu a ozařována ultrafialovým světlem. Během očarování po dobu 45 minut byla udržována teplota pod 50 °C. Blok gelu byl potom rozmělněn, promyt destilovanou vodou a vysušen.

Výroba nulového séra byla provedena tak, že byl 1 ml séra a roztok pronázy o koncentraci 2 mg/ml ponechán reagovat po dobu 30 minut při teplotě 35 °C. Potom byly přidány 2 g iontoměničové pryskyřice (Amberlit 400).

Potom reagovalo 50 <ug nulového séra s obsahem 18 thyroxinu ve 100 ml enzymového roztoku koncentrace 2 mg v ml po dobu 30 minut při teplotě 15 °C.

Ke 100 μΐ tohoto roztoku bylo nyní přidáno 700 <ul roztoku traceru o obsahu 5,2 ng/ /ml radioaktivního značkovaného thyroxinu a 50 /Д roztoku pufru hodnoty pH 7,2. 350 μΐ výše uvedeného roztoku bylo naneseno na 60 mg gelu s protilátkou. Doba inkubace činila 30 minut, teplota 22 °C. Potom byla prováděna eluce po dobu 5 minut rychlostí čerpadla 0,5 ml/min.

Kalibrační křivka dávka — účinnost pro thyroxin byla sestavena pomocí roztoků thyroxinu o koncentraci 5 ng, 10 ng, 20 ng a 50 ng na 100 ml. Tyto roztoky reagovaly s 350 μΐ enzymového roztoku (koncentrace 2 miligramy/ml) po dobu 30 minut při teplotě 35 °C.

Ke 100 μ\ tohoto roztoku bylo přidáno 700 μΐ roztoku traceru (5,2 ng/ml) a místo pufru 50 μΐ nulového séra.

Při vyhodnocování bylo nalezeno 99 % původní aktivity.

Příklad 2

Celkové hodnocení thyroxinu enzymovou hydrolýzou proteinázou

Bylo postupováno metodou podle příkladu 1, přičemž namísto roztoku pronázy byl použit roztok proteinázy o koncentraci 2 miligramy/ml.

Použité sérum bylo nulové sérum o obsahu 6 mg ve 100 ml.

Bylo nalezeno 98,5 °/o původní aktivity.

Příklad 3

Celkové stanovení kortisolu enzymovou hydrolýzou pronázou

Bylo postupováno metodou popsanou v příkladu 1, přičemž však bylo použito séra, které jobsahd.valo 18 ^g kortisolu ve 100 ml. Jako roztok traceru byl použit roztok radioaktivního značeného kortisolu o koncentraci 0,15 ng/ml.

Bylo nalezeno 87 % původní aktivity.

Příklad 4

Celkové stanovení kortisolu enzymovou hydrolýzou pomocí proteinázy

Bylo postupováno metodou popsanou v příkladu 3, přičemž sérum však obsahovalo 6 kortisolu ve 100 ml a pracovalo se s roztokem proteinázy o koncentraci 2 mg/ml.

Bylo nalezeno 98 % původní aktivity.

Použité protilátky v příkladech 3 a 4 byly získány syntézou kortisolu-C3-oximu a kopulací na albumin se směsným anhydridem a přípravou protilátky imunizací králíků.

Příklad 5

Celkové stanovení thyroxinu enzymovou hydrolýzou pepsinem

Bylo postupováno podle obecné metody z příkladu 1.

μΐ séra s obsahem 18 thyroxinu ve 100 ml reagovalo se 160 μΐ enzymového roztoku, který sestával z 2 mg/ml pepsinu rozpuštěného v 0,1 N kyselině chlorovodíkové.

Reakce s enzymem byla prováděna po dobu 30 minut při teplotě místnosti.

К těmto 170 //1 bylo potom přidáno 150 μΐ roztoku traceru o obsahu 5,2 ng/ml radiaktivního značeného thyroxinu.

Veškerý roztok byl potom nanesen na 60 miligramů gelu s protilátkou.

Polymerní matrice gelu s protilátkou byla z kopolymeru a akrylamidu a 40 % mol. sodné soli kyseliny methakrylové, připravené z 20% roztoku monomeru.

Doba inkubace Činila 30 minut, teplota 22 stupňů Celsia.

Potom byla prováděna eluce po dobu 5 minut rychlostí čerpadla 0,5 ml/min.

Při vyhodnocování bylo nalezeno 98 % původní aktivity.

Claims (1)

1. Použití immobilizovaných protilátek, s výhodou uzavřených v polymerním gelu, například v akrylamidovém polymeru nebo kopolymeru, pro celkové stanovení hormonů nebo léčiv, částečně vázaných na vazebné bílkoviny, enzymovou hydrolýzou· vazebných bílkovin, reakcí hormonů nebo léčiv s protilátkou a radioimunoíogickým stanovením hormonů nebo léčiv.