CN104483445B - 一种噻唑烷二酮快速检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种噻唑烷二酮快速检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒中含有乙醇和乙酸乙酯组成的提取液，磷酸和盐酸组成的萃取液，及检测试剂。该方法为向待测样品中加入提取液，上下颠倒5次，静置使液体中颗粒降沉，过滤收集滤液，加入萃取液，上下颠倒5次，静置分层；向下层溶液中加入检测试剂，根据半分钟内是否产生粉红色沉淀，来判断样品中是否含有噻唑烷二酮。本发明的检测方法操作简便，专属性强，显色反应迅速，可适用于现场快速检测中成药和保健食品中是否掺杂噻唑烷二酮。

Description

一种噻唑烷二酮快速检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及利用沉淀作用对非生物材料的检测，具体涉及一种噻唑烷二酮快速检测试剂盒及其检测方法，进一步涉及一种针对中成药和保健食品中噻唑烷二酮的快速检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

噻唑烷二酮 类药物的 药效

噻唑烷二酮类是治疗Ⅱ型糖尿病药物的一种，代表药物是“盐酸罗格列酮”和“盐酸吡格列酮”。噻唑烷二酮类降糖药不刺激胰岛素的分泌，而是通过激活体内的过氧化物酶体增殖物激活受体，从而使胰岛素的敏感性增加发挥降糖作用，降糖作用稳定而持久。对于那些胰岛功能相对较好的患者来说，是一个不错的选择。

盐酸罗格列酮Rosiglitazone Hydrochloride，罗格列酮分子式：C₁₈H₁₉N₃O₃S，分子量：357.43，化学名称：5-{4-[2-(甲基-2-吡啶氨基)乙氧基]苄基}-2,4-噻唑烷二酮，结构式如式（Ⅰ）所示：

（Ⅰ）。

本品属噻唑烷二酮类抗糖尿病药，通过提高胰岛素的敏感性而有效地控制血糖。本品为过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的高选择性、强效激动剂。人类的PPAR受体存在于胰岛素的主要靶组织如肝脏、脂肪和肌肉组织中。本品激活PPARγ核受体，可对参与葡萄糖生成、转运和利用的胰岛素反应基因的转录进行调控。此外，PPARγ反应基因也参与脂肪酸代谢的调节。在本品临床研究中，空腹血糖（FPG）和HbA1c的检测结果表明，本品可改善血糖控制情况，同时伴有血胰岛素和C肽水平降低，也可使餐后血糖和胰岛素水平下降。本品对血糖控制的改善作用较持久，可维持达52周。Ⅱ型糖尿病的主要病理生理学特征为胰岛素抵抗，本品的抗糖尿病作用已在Ⅱ型糖尿病的动物模型（由于靶组织的胰岛素抵抗而出现高血糖症和/或糖耐量下降）中得到显示。

用法用量为：初始剂量可为4mg/日，每日一次或分两次口服。12周后若空腹血糖控制不理想，剂量增加至8mg/日。最大推荐剂量为8mg/日，每日一次或分两次口服。

盐酸吡格列酮；Pioglitazone Hydrochloride，吡格列酮分子式：C₁₉H₂₀N₂O₃S，分子量：392.90，化学名称：5-{4-[2-(5-乙基-2-吡啶)-乙氧基]-苯基}-2,4-噻唑烷二酮，结构式如式（Ⅱ）所示：

（Ⅱ）。

动物实验表明 ，本品可减少胰岛素抵抗的高血糖、高胰岛素血症及高三酰甘油。本品引起的代谢变化导致了依赖胰岛素的组织应答的增加。由于本品提高了循环胰岛素的作用（即降低胰岛素抵抗），因此它不能降低缺乏内源性胰岛素的动物模型的血糖。

临床研究表明，吡格列酮可改善胰岛素抵抗患者的胰岛素敏感性，提高胰岛素对细胞的反应性，并改善体内葡萄糖平衡障碍。作用至少可持续1年，在临床对照试验中，吡格列酮与磺酰脲、二甲双胍或胰岛素合用，能提高疗效。

吡格列酮的临床试验还选择了脂类异常患者，患者经吡格列酮治疗，可降低三酰甘油水平，增加HDL-C，但LDL及TC则无一致性的改变。用法用量为起始剂量15或30mg，最大剂量为45mg/日。

噻唑烷二酮 类药物的常见副作用

体重增加和水肿是噻唑烷二酮类药物的常见副作用，这种副作用在与胰岛素联合使用时表现更加明显。由于存在体液潴留的不良反应，已经有潜在心衰危险的患者应用该药物可以导致心衰加重。相对于吡格列酮而言，罗格列酮使患者发生心肌梗死、充血性心衰以及死亡的风险更高。

随着现代生活水平的提高，糖尿病的患病率急剧升高。2010年发布的由中华医学会糖尿病学分会开展的全国14省市糖尿病和代谢综合征调查结果显示，城市居民糖尿病患病率高达11.4%。降糖类中成药和保健食品市场销售在不断增长，一方面，显示了人们的需求，另一方面，也给制假劣药品者提供了“商机”。一些造假分子利用老百姓对中药无毒副作用的认识误区，为使降糖效果快速、明显，大量在降糖类中成药和保健食品中非法添加盐酸罗格列酮和盐酸吡格列酮，即噻唑烷二酮。消费者在不知情的情况下购买和使用这些非法掺杂化学药成分的假药劣药，直接给消费者带来巨大危害，尤其在广大的农村和经济欠发达的中小城市，这些地区缺少必要的检验仪器，技术监管能力又相对薄弱。

噻唑烷二酮 的检测方法

目前，检测药品和保健食品中掺杂噻唑烷二酮的方法主要有以下几种：

1. 薄层色谱法[刘舜慧, 吴春敏. 薄层色谱法同时检测降糖中成药中非法添加的盐酸罗格列酮和盐酸吡格列酮. 中国民族民间医药, 2010, 19(17): 44-45.]。

用甲醇提取样品中的待测成分，所得的供试品溶液和对照品（标准品）溶液点在同一块硅胶GF254薄层板上（薄层板通常用硅胶制成），以乙酸乙酯-乙醚-甲醇-氨水（8:2:1:0.06）为展开剂。不同的物质在薄层色谱板不同的位置上以斑点的形式出现（原因是不同的物质有不同迁移的速度，常以色谱迁移值表示展开后斑点到原点之间的距离），根据待测样品是否在与对照品（标准品）相应的位置上出现斑点这一现象来判断待测样品是否含有目标成分。噻唑烷二酮对照品溶液和样品提取所得的供试品溶液在同一块薄层色谱板上点样，展开剂展开，晾干后，于紫外灯下观察，如果供试品溶液薄层色谱图在与噻唑烷二酮对照品相应的位置上出现呈现相同的荧光淬灭斑点，则提示样品中可能含有噻唑烷二酮。

薄层色谱法的优点是不需要使用昂贵的分析仪器，但却存在下述缺点：（1）色谱分辨率较低，中药制剂成分复杂，干扰因素多，易将某些共存成分误判为噻唑烷二酮，某些共存成分如果量较大且色谱迁移值与噻唑烷二酮接近则会干扰目标成分的检出；（2）色谱展开和晾干的时间长，不能满足快速测定的要求；（3）薄层色谱板需要自行铺制，烘干并干燥存放（预制的薄层色谱板需要干燥存放），环境温度和湿度对分离效果的影响大；（4）要求实验人员有较好的经验；（5）需要有固定的实场所，不适合作流动性大的现场检测。

2. 高效液相色谱法[李晓燕, 冉晓静. 降糖胶囊中非法掺入盐酸吡格列酮成分的检测. 中国药事, 2008, 22(8): 706-707.]。

高效液相色谱法是常用的现代分析方法。在相同的色谱条件下，不同的物质有不同的色谱保留时间。在相同的色谱条件下[色谱柱：Phenomenex C₈柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈-离子对缓冲液（取十二烷基硫酸钠1．6g和乙二胺四乙酸二钠0.8g，加水800mL溶解，加三乙胺1mL，异丙醇2mL，用磷酸调节pH值至4.0）（40:60）；检测波长：240nm，波长扫描范围200～360nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量：10μL]，噻唑烷二酮对照品溶液和样品提取所得的供试品溶液分别进样，根据两者的色谱峰保留时间和紫外光谱数据可判断待测样品是否含有噻唑烷二酮。

高效液相色谱法的优点是色谱分离效率高，色谱保留时间精度高，灵敏度高，缺点是：（1）仪器价格昂贵，样品前处理时间长，色谱柱易受污染，分析成本高，不易推广；（2）需要使用昂贵的分析仪器，对环境要求高，需要固定摆放，不适合作流动性大的现场检测。

3. 质谱法[邱颖姮, 梁智渊, 刘中博, 等. 串联四极杆质谱法测定中药降糖制剂中掺入吡格列酮的研究. 中国现代应用药学杂志, 2008, 25(3): 247-248.]。

采用串联四极杆质谱法，通过相对分子质量、二级质谱碎片信息两方面的信息，对中药降糖制剂的提取液进行串联四极杆质谱分析。通过与对照品的质谱行为相比较，对中药降糖制剂中非法掺入的合成降糖药进行定性鉴别。

串联四极杆质谱法可以通过对质荷比的筛选获得复杂基质中单一组分的色谱图，不需要实现其与干扰组分间完全的色谱分离，同时，通过二级质谱分析还可对待测物进行结构确证，以保证药物定性分析的结果准确、可靠，操作更为简便、快速。

质谱仪价格昂贵，维护成本高，易受污染，检测人员需经过专门培训才能操纵，对使用的环境要求较高，需要固定摆放，不适合作流动性大的现场检测。

4. 高效液相色谱-质谱法[邱颖姮, 王铁杰, 李玉兰, 等. 液相色谱-串联四极杆质谱联用法测定中药降糖制剂中掺入罗格列酮的研究. 药物分析杂志, 2008, 8(2): 323-325.]。

高效液相色谱与质谱检测器结合可大大提高检测结果的可靠性，这是因为物质的色谱峰保留时间以及其质谱裂解获得的碎片离子、各离子与基峰离子的相对强度决定于物质的内在性质，具有极高的专属性。高效液相色谱-串联质谱联用法更适合于成分复杂、背景干扰严重的样品分析，这种分析方法可提高检测灵敏度和结果的可靠性。

高效液相色谱-质谱联用法是一种分析成本比高效液相色谱法更高、操作更复杂的分析方法。仪器对使用的环境要求更高，需要固定摆放，不适合作流动性大的现场检测。因此，这类型检验只能在少数技术条件很好的实验室中进行，不适合药品监督部门在现场快速排查。

发明内容

本发明的目的在于提供一种噻唑烷二酮快速检测试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种噻唑烷二酮快速检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种噻唑烷二酮快速检测试剂盒，该试剂盒包括提取液、萃取液和检测试剂；

所述提取液为乙醇和乙酸乙酯组成的有机溶剂；

所述萃取液为磷酸和盐酸组成的无机酸溶液；

所述检测试剂为能与季铵盐产生沉淀反应的试剂。

进一步的，上述提取液中乙醇与乙酸乙酯的体积比为（1.8～2.2）︰（97.8～98.2）。

进一步的，上述萃取液为磷酸与0.09～0.11mol/L盐酸按体积比（2.7～3.3）︰（96.7～97.3）混合所得的无机酸溶液。

进一步的，上述检测试剂为硫氰酸铬铵溶液。

进一步的，上述硫氰酸铬铵溶液浓度为12～13 g/L。

一种噻唑烷二酮的快速检测方法，采用上述所述的一种噻唑烷二酮快速检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：

1）将待检测的药品或/和食品中加入提取液，上下颠倒5次，静置，使液体中颗粒降沉；

2）取上述静置后的上清液进行过滤，收集滤液；

3）在上述滤液中加入萃取液，上下颠倒5次，使两相混合接触，静置分层；

4）向上述静置后的下层溶液中加入检测试剂进行检测，根据半分钟内是否产生粉红色沉淀，来判断样品中是否含有噻唑烷二酮。

进一步的，步骤1）所述提取液与待测样品的体积质量比为（3～4）mL：（0.2～0.6）g。

进一步的，步骤3）中萃取液的体积为提取液的0.5～0.6倍。

进一步的，步骤4）中检测试剂的体积为提取液的5%～6%。

本发明的有益效果是：

1、本发明的检测方法，通过提取、萃取和检测三步即可检验出样品中是否含有噻唑烷二酮，且所用提取液、萃取液和检测剂均为普通的化学试剂，操作简便，分析成本低；

2、本发明的检测方法中各步物质的用量小，整个检测方法在10mL的样品瓶或试管中即可进行，不需要使用贵重分析仪器；

3、本发明的检测方法中，所用提取液、萃取液和检测剂的专属性强，通过提取和萃取过程中利用不同物质的溶解性差异分离除去干扰物质，使得显色反应的灵敏度高，检验结果正确率高，同时显色反应的反应迅速，现象明显，因此本发明适用于现场快速检测中成药和保健食品中是否掺入噻唑烷二酮。

具体实施方式

一种噻唑烷二酮快速检测试剂盒，该试剂盒包括提取液、萃取液和检测试剂；

所述提取液为乙醇和乙酸乙酯组成的有机溶剂；

所述萃取液为磷酸和盐酸组成的无机酸溶液；

所述检测试剂为能与季铵盐产生沉淀反应的试剂。

优选的，上述提取液中乙醇与乙酸乙酯的体积比为（1.8～2.2）︰（97.8～98.2），最优选为2：98。

优选的，上述萃取液为磷酸与(0.09～0.11)mol/L盐酸按体积比（2.7～3.3）︰（96.7～97.3）混合所得的无机酸溶液。

最优选的，上述萃取液为磷酸与0.1mol/L盐酸按体积比3︰97混合所得的无机酸溶液。

优选的，上述检测试剂为硫氰酸铬铵溶液。

优选的，上述硫氰酸铬铵溶液浓度为12～13 g/L，最优选为12.5 g/L。

一种噻唑烷二酮的快速检测方法，采用上述所述的一种噻唑烷二酮快速检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：

1）将待检测的药品或/和食品中加入提取液，上下颠倒5次，静置，使液体中颗粒降沉；

2）取上述静置后的上清液进行过滤，收集滤液；

3）在上述滤液中加入萃取液，上下颠倒5次，使两相混合接触，静置分层；

4）向上述静置后的下层溶液中加入检测试剂进行检测，根据半分钟内是否产生粉红色沉淀，来判断样品中是否含有噻唑烷二酮。

优选的，步骤1）所述提取液与待测样品的体积质量比为（3～4）mL：（0.2～0.6）g，最优选为3.5mL：（0.2～0.6）g。

优选的，步骤3）中萃取液的体积为提取液的0.5～0.6倍。

优选的，步骤4）中检测试剂的体积为提取液的5%～6%。

以下的实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例 1

样品：净宝牌圣健元胶囊（胶囊剂，标示北京圣天方医药科技研究院及河南佰汇康生物科技有限公司生产，批号：20100803，高效液相色谱法（国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件编号2009029）测定结果本品含盐酸吡格列酮1.0mg/粒）。

检测步骤：

（1）取样品1粒，将其内容物（约0.35g）置具塞试管或样品瓶①中，加入提取液（为乙醇和乙酸乙酯按2:98(v/v)混合组成的有机溶剂）3.5mL，旋紧瓶盖，将样品瓶上下颠倒翻转5个来回，静置，使液体中颗粒降沉；

（2）转移向上述静置后的上清液置于安装有滤头的针筒中，过滤，滤液全部收集到另一个具塞试管或样品瓶②中；

（3）于具塞试管或样品瓶②中加入萃取液（为磷酸和0.1mol/L盐酸按3:97(v/v)混合组成的无机酸溶液）2mL，旋紧瓶盖，将样品瓶上下颠倒翻转5个来回，使两相混合接触，静置分层；

（4）将上述静置后的下层溶液中加入检测试剂（为12.5g/L硫氰酸铬铵溶液）约0.2mL，立刻产生明显的粉红色不溶物，即判定净宝牌圣健元胶囊中含有噻唑烷二酮。

实施例 2

样品：益肾养胰胶囊（胶囊剂，标示北京佰仁堂生物科技有限公司生产，批号：20100906，高效液相色谱法（国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件编号2009029）测定结果本品含马来酸罗格列酮0.9mg/粒）。

检测步骤：

（1）取样品1粒，将其内容物（约0.3g）置具塞试管或样品瓶①中，加入提取液（为乙醇和乙酸乙酯按2:98(v/v)混合组成的有机溶剂）3.5mL，旋紧瓶盖，将样品瓶上下颠倒翻转5个来回，静置，使液体中颗粒降沉；

（2）转移向上述静置后的上清液置于安装有滤头的针筒中，过滤，滤液全部收集到另一个具塞试管或样品瓶②中；

（3）于具塞试管或样品瓶②中加入萃取液（为磷酸和0.1mol/L盐酸按3:97(v/v)混合组成的无机酸溶液）2mL，旋紧瓶盖，将样品瓶上下颠倒翻转5个来回，使两相混合接触，静置分层；

（4）将上述静置后的下层溶液中加入检测试剂（为12.5g/L硫氰酸铬铵溶液）约0.2mL，立刻产生明显的粉红色不溶物，即判定益肾养胰胶囊中含有噻唑烷二酮。

实施例 3

样品：双宝清糖胶囊（胶囊剂，标示台州市巴尔海博科技有限公司生产，批号：20100709，高效液相色谱法（国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件编号2009029）测定结果本品含马来酸罗格列酮1.3mg/粒）。

检测步骤：

（1）取样品1粒，将其内容物（约0.25g）置具塞试管或样品瓶①中，加入提取液（为乙醇和乙酸乙酯按2:98(v/v)混合组成的有机溶剂）3.5mL，旋紧瓶盖，将样品瓶上下颠倒翻转5个来回，静置，使液体中颗粒降沉；

（2）转移向上述静置后的上清液置于安装有滤头的针筒中，过滤，滤液全部收集到另一个具塞试管或样品瓶②中；

（3）于具塞试管或样品瓶②中加入萃取液（为磷酸和0.1mol/L盐酸按3:97(v/v)混合组成的无机酸溶液）2mL，旋紧瓶盖，将样品瓶上下颠倒翻转5个来回，使两相混合接触，静置分层；

（4）将上述静置后的下层溶液中加入检测试剂（为12.5g/L硫氰酸铬铵溶液）约0.2mL，立刻产生明显的粉红色不溶物，即判定双宝清糖胶囊中含有噻唑烷二酮。

实施例 4

样品：益仁堂牌蚁泰康胶囊（胶囊剂，标示陕西华纳兄弟生物药业有限公司生产，批号：091001，高效液相色谱法（国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件编号2009029）测定结果本品含马来酸罗格列酮0.5mg/粒）。

检测步骤：

（1）取样品1粒，将其内容物（约0.35g）置具塞试管或样品瓶①中，加入提取液（为乙醇和乙酸乙酯按2:98(v/v)混合组成的有机溶剂）3.5mL，旋紧瓶盖，将样品瓶上下颠倒翻转5个来回，静置，使液体中颗粒降沉；

（2）转移向上述静置后的上清液置于安装有滤头的针筒中，过滤，滤液全部收集到另一个具塞试管或样品瓶②中；

（3）于具塞试管或样品瓶②中加入萃取液（为磷酸和0.1mol/L盐酸按3:97(v/v)混合组成的无机酸溶液）2mL，旋紧瓶盖，将样品瓶上下颠倒翻转5个来回，使两相混合接触，静置分层；

（4）将上述静置后的下层溶液中加入检测试剂（为12.5g/L硫氰酸铬铵溶液）约0.2mL，立刻产生明显的粉红色不溶物，即判定益仁堂牌蚁泰康胶囊中含有噻唑烷二酮。

实施例 5

样品：唐安胶囊（胶囊剂，标示哈尔滨久盛医药科技开发有限公司与哈尔滨中普泰科技有限公司联合生产，批号：091101，高效液相色谱法（国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件编号2009029）测定结果本品含马来酸罗格列酮0.4mg/粒）。

检测步骤：

（1）取样品1粒，将其内容物（约0.3g）置具塞试管或样品瓶①中，加入提取液（为乙醇和乙酸乙酯按2:98(v/v)混合组成的有机溶剂）3.5mL，旋紧瓶盖，将样品瓶上下颠倒翻转5个来回，静置，使液体中颗粒降沉；

（2）转移向上述静置后的上清液置于安装有滤头的针筒中，过滤，滤液全部收集到另一个具塞试管或样品瓶②中；

（3）于具塞试管或样品瓶②中加入萃取液（为磷酸和0.1mol/L盐酸按3:97(v/v)混合组成的无机酸溶液）2mL，旋紧瓶盖，将样品瓶上下颠倒翻转5个来回，使两相混合接触，静置分层；

（4）将上述静置后的下层溶液中加入检测试剂（为12.5g/L硫氰酸铬铵溶液）约0.2mL，立刻产生明显的粉红色不溶物，即判定唐安胶囊中含有噻唑烷二酮。

实施例 6

样品：降糖宁胶囊（胶囊剂，标示惠州市罗浮山制药有限公司生产，批号：1006271，高效液相色谱法（国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件编号2009029）测定结果本品不含马来酸罗格列酮和盐酸吡格列酮）。

检测步骤：

（1）取样品1粒，将其内容物（约0.4g）置具塞试管或样品瓶①中，加入提取液（为乙醇和乙酸乙酯按2:98(v/v)混合组成的有机溶剂）3.5mL，旋紧瓶盖，将样品瓶上下颠倒翻转5个来回，静置，使液体中颗粒降沉；

（2）转移向上述静置后的上清液置于安装有滤头的针筒中，过滤，滤液全部收集到另一个具塞试管或样品瓶②中；

（3）于具塞试管或样品瓶②中加入萃取液（为磷酸和0.1mol/L盐酸按3:97(v/v)混合组成的无机酸溶液）2mL，旋紧瓶盖，将样品瓶上下颠倒翻转5个来回，使两相混合接触，静置分层；

（4）将上述静置后的下层溶液中加入检测试剂（为12.5g/L硫氰酸铬铵溶液）约0.2mL，半分钟内未产生粉红色沉淀，即判定降糖宁胶囊中不含噻唑烷二酮。

下面对本发明方法的相关指标作进一步的检测。

一、转移率的检测

混合物 1 ：取标示为“糖纳舒苗特葛灵胶囊”样品（批号：20120402，生产厂家：郑州华仁医药科技有限公司）5粒、“中华糖宝天桑胶囊”样品（批号：20120701，生产厂家：西安中维生物科技技术有限公司）3粒、“蓝科中华糖宝胶囊”样品（批号：20120618，生产厂家：西安中维生物科技技术有限公司）12粒，将内容物混匀得混合物1，称重，共5.5494g（平均每粒重约0.2775g），高效液相色谱法测得该混合物1是盐酸罗格列酮含量为2.74mg/g。

混合物 2 ：取标示为“唐诺胶囊”样品（批号：20111015，生产厂家：四平市颐宫健康食品技术开发有限公司）6粒、“苦虫灵胶囊”样品（批号：20120205，生产厂家：南宁大单生物科技有限责任公司）6粒、“唐平胶囊”样品（批号：20111015，生产厂家：哈尔滨中普泰科技有限公司）8粒，将内容物混匀得混合物2，称重，共7.2198g（平均每粒重约0.361g），高效液相色谱法测得该混合物2中盐酸吡格列酮含量为2.13mg/g。

提取率测定

分别取上述混合物1和混合物2约1粒重，分别称取6份，精密称定，分别置10mL样品瓶中，加入提取液（为乙醇和乙酸乙酯按2:98(v/v)混合组成的有机溶剂）3.5mL，旋紧瓶盖，将样品瓶从正立至颠倒翻转5次，静置，取上清液1.5mL置另一10mL样品瓶中，留作下一步进行萃取率的检测。另取上清液1.0mL，置于10mL量瓶中，加流动相A[甲醇:0.05mol/L乙酸铵溶液（用冰醋酸调pH 3.50）= 50:50，v/v]至刻度，摇匀，经滤头过滤，将滤液进行高效液相色谱的测定，用相同的方法测定其他样品。高效液相色谱条件如下：C₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm）；以甲醇-0.05mol/L乙酸铵溶液（用冰醋酸调pH 3.50）为流动相，梯度洗脱，0~5min，42%甲醇，5.0~5.1min，甲醇42%升至56%，并持续到12min，12~12.1min，甲醇56%降至42%，并持续到20min；检测波长为268nm、318nm；柱温25℃；流速1.0mL/min；进样量20μL。测定结果见表1和表2。

表1 盐酸罗格列酮提取率测定结果

表2 盐酸吡格列酮提取率测定结果

从表1和表2中可以看出本发明的快速检测方法中，对盐酸罗格列酮的提取率约68.75%，盐酸吡格列酮的提取率约48.53%。

萃取率 测定

取上述提取率检测时吸取的上清液1.5mL，置10mL样品瓶中，加入萃取液（为磷酸和0.1mol/L盐酸按3:97(v/v)混合组成的无机酸溶液）2.0mL，旋紧瓶盖，将样品瓶从正立至颠倒翻转5次，静置。精密吸取下层溶液1.0mL，置10mL量瓶中，加流动相A至刻度，摇匀，经滤头过滤，续滤液进高效液相色谱仪测定，同法测定6份。结果见表3和表4。

表3 盐酸罗格列酮萃取率测定结果

表4 盐酸吡格列酮萃取率测定结果

从表3和表4中可以看出本发明的快速检测方法中，对盐酸罗格列酮的萃取率约82.99%，盐酸吡格列酮的萃取率约81.96%。

转移率计算

根据提取率和萃取率，可以计算出快检方法的盐酸罗格列酮和盐酸吡格列酮的转移率（转移率=提取率×萃取率），结果见表5和表6。

表5盐酸罗格列酮转移率计算结果

表6盐酸吡格列酮转移率计算结果

从表5和表6中可以看出本发明的快速检测方法中，对盐酸罗格列酮的转移率约57.05%，盐酸吡格列酮的转移率约39.75%，说明本方法在兼顾了快速检测方法的操作简便快捷的情况下，仍可以使目标检测物达到较为理想的转移率，为后续检测提供较好的基础。

二、检出限检测

取盐酸罗格列酮标准品（中国药品生物制品检定所，批号：100673-200401）和盐酸吡格列酮标准品（中国药品生物制品检定所，批号：100634-200401），用经乙醇-乙酸乙酯（2:98，v/v）饱和的萃取液（为磷酸和0.1mol/L盐酸按体积比3:97混合组成的无机酸溶液）溶解并稀释成系列浓度溶液（见表7和表8）。加入检测试剂（为12.5g/L硫氰酸铬铵溶液）进行试验，根据转移率计算一粒胶囊样品中盐酸罗格列酮和盐酸吡格列酮的检出限，结果见表7和表8。

表7盐酸罗格列酮检出限的测定

表8盐酸吡格列酮检出限的测定

从表7和表8中可以看出，快速检测方法盐酸罗格列酮的检出限为0.20mg/份，盐酸吡格列酮的检出限为0.40mg/份。

三、本发明方法正确率、灵敏度和特异度的评估

正确率、灵敏度和特异度是表征快筛方法结果准确率的重要参数。三者的计算公式如下：

正确率=（样品总数-误检样品个数）÷样品总数×100%

灵敏度=（实际阳性样品数–假阴性样品个数）÷实际阳性样品数×100%

特异度=（实际阴性样品数–假阳性样品个数）÷实际阴性样品数×100%

用本发明的快速检测方法（如实施例1～6所示）对50批次降糖类中成药和保健食品进行快检，通过与按国家食品药品监督管理局药品检验降糖类中成药补充检验方法（批准件编号2009029）检测结果比较，所检28个阴性样品和22个阳性样品中快检方法结果有一个样品为假阳性，其余均能得出正确的检验结论。方法的正确率为98%，灵敏度为100%，特异度为96.43%。

综上所述，为了使快检方法的操作简便、快速、重现性好，提取和萃取两步都采用将样品瓶从正立至颠倒翻转5次的操作，这样的操作动作不剧烈，易于静置分层，使静置时间缩短，同时有好的重现性。根据盐酸罗格列酮推荐的服用量4mg/次，盐酸吡格列酮推荐的服用量15mg/次，以及已通过高效液相色谱检测的样品中盐酸罗格列酮含量在0.3mg/粒～2.0mg/粒之间，盐酸吡格列酮含量在0.6mg/粒～2.9mg/粒之间，按本快检方法操作可获得超过39%的转移率，同时有可接受的精密度，结合本方法较高的检出限，正确率、灵敏度和特异度均较好，本检测方法完全适用于检验降糖类中成药和保健食品中是否添加盐酸罗格列酮和盐酸吡格列酮。

为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种噻唑烷二酮快速检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括提取液、萃取液和检测试剂；

所述提取液为乙醇和乙酸乙酯组成的有机溶剂；

所述萃取液为磷酸和盐酸组成的无机酸溶液；

所述检测试剂为硫氰酸铬铵溶液。

2.根据权利要求1所述的一种噻唑烷二酮快速检测试剂盒，其特征在于所述提取液中乙醇与乙酸乙酯的体积比为（1.8～2.2）：（97.8～98.2）。

3.根据权利要求1所述的一种噻唑烷二酮快速检测试剂盒，其特征在于：所述萃取液为磷酸与0.09～0.11mol/L盐酸按体积比（2.7～3.3）：（96.7～97.3）混合所得的无机酸溶液。

4.根据权利要求1所述的一种噻唑烷二酮快速检测试剂盒，其特征在于：所述硫氰酸铬铵溶液为12～13 g/L的硫氰酸铬铵溶液。

5.一种噻唑烷二酮的快速检测方法，其特征在于：采用上述1～4任一所述的一种噻唑烷二酮快速检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：

1）将待检测的药品或/和食品中加入提取液，上下颠倒5次，静置，使液体中颗粒降沉；

2）取上述静置后的上清液进行过滤，收集滤液；

3）在上述滤液中加入萃取液，上下颠倒5次，使两相混合接触，静置分层；

4）向上述静置后的下层溶液中加入检测试剂进行检测，根据半分钟内是否产生粉红色沉淀，来判断样品中是否含有噻唑烷二酮。

6.根据权利要求5所述的一种噻唑烷二酮的快速检测方法，其特征在于：步骤1）所述提取液与待测样品的体积质量比为（3～4）mL：（0.2～0.6）g。

7.根据权利要求5所述的一种噻唑烷二酮的快速检测方法，其特征在于：步骤3）中萃取液的体积为提取液的0.5～0.6倍。

8.根据权利要求5所述的一种噻唑烷二酮的快速检测方法，其特征在于：步骤4）中检测试剂的体积为提取液的5%～6%。