CN103645179A - 一种降糖类保健食品、中成药和食品中添加磺脲类化合物的快速检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种降糖类药品、保健品或食品中添加磺脲类化合物的快速检测方法及其应用。该方法是取一次服用量的供试品，加入3ml二氯甲烷，振摇使溶散，静置片刻，过滤；取续滤液2ml，加入10mg或者20mg的香草醛固体，再加入2ml浓硫酸溶液，在微沸水浴中加热1分钟，至上层二氯甲烷层挥尽；将上述溶液冷却至室温,缓慢加入5ml乙醇，立即观察分液层及上层溶液的颜色变化，若分液层先变为紫色，轻微振摇，分液层及上层溶液逐渐变为蓝色，即判断为添加磺脲类化合物。本发明的方法及其使用的试剂盒分析成本低、抗干扰能力强、无需专门设备、灵敏度高、显色结果明显易于观察判断、检验结论正确率高、适用于现场快速检测。

Description

一种降糖类保健食品、中成药和食品中添加磺脲类化合物的快速检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及药物检测领域，具体涉及降糖类保健食品、中成药和食品中非法添加化学药品的检测领域，尤其涉及一种降糖类保健食品、中成药和食品中添加磺脲类化合物的快速检测方法及其应用。

背景技术

近年来伴随着人们饮食习惯的改变,糖尿病的发病率呈逐年上升趋势。降糖药物的临床需求一直很大,特别是保健食品、中药降糖制剂由于具有治疗和调理的双重功效,在临床上受到了重视并得到广泛应用。但目前一些不法分子,为了提高疗效擅自在保健食品和中药降糖制剂中掺入化学降糖药物成分。所有的降糖类化学药物均属于处方药，有严格的适应症和用法用量、禁忌症和副作用，因此若患者在不知情的情况下摄入容易加重病情，或引起严重的不良反应甚至导致死亡，对患者的健康与生命安全造成了重大危害。

目前，报道已发现的降糖类健康产品中添加的化学成分包括：二甲双胍、苯乙双胍、丁二胍、格列苯脲、格列吡嗪、格列美脲、罗格列酮、吡格列酮、瑞格列奈等9中；另外有文献报道发现添加的化学成分还有：格列齐特、格列喹酮、甲苯磺丁脲等。涉及的健康产品主要是保健食品、食品和标示“中成药、保健食品和食品”的假冒产品。涉及的剂型基本上为胶囊剂、片剂等。从化学结构来分，降糖类非法添加的化学成分主要有四大类：双胍类、磺脲类、噻唑烷酮类、格列奈类等。由于母核结构不同，相应的物理化学性质也有差异，因此可以采用不同的理化反应方法分别检测。广东省药品检验建立了双胍类（二甲双胍和苯乙双胍）和噻唑烷酮类（罗格列酮和吡格列酮）两个理化反应快速筛查方法，但是在非法添加药物中占很大比例的磺脲类化合物，文献并未报道其快速筛查方法。

磺脲类化合物主要包括格列吡嗪、格列美脲、格列喹酮、格列苯脲、甲苯磺丁脲、吡格列酮、罗格列酮，格列齐特。化合物结构式如下：

格列吡嗪、格列美脲、格列喹酮、格列苯脲、甲苯磺丁脲、吡格列酮、罗格列酮、格列齐特在我国为处方药，患者需要在医生的指导下方能服用，国家对其生产、经营和使用进行了严格的规定。格列苯脲等成分的治疗剂量与中毒剂量非常接近，一般情况下每日剂量7.5mg，最大不超过15mg,而患者对非法添加不知情，信任为“绿色”、“无毒无害”，很可能因为求医心切加大服用量，导致低血糖休克、死亡的严重后果。罗格列酮于1999年在国外上市，并先后在100多个国家和地区销售和使用。由于心血管方面的安全性风险问题，2010年7月美国食品药品管理局（FDA）宣布严格限制使用并继续评估，2010年9月欧盟宣布撤市，我国随后予以限制使用。同为磺脲类的吡格列酮，虽暂未推到风口浪尖，但同样存在心血管疾病的风险。关于其它磺脲类药物的不良反应已有不少报道。近年来，在降糖类药品、保健品和食品中非法添加格列本脲、罗格列酮、吡格列酮等的情况甚为严重，对于降糖类保健食品、中成药和食品中非法添加磺脲类降糖药进行监督检验是一项长期的任务，它涉及范围广，需要进行大量的检验，需要耗费大量的人力物力，建立一种简单易行、快速的检测筛查的方法迫在眉睫。

目前，检验保健食品、中成药和食品中非法添加磺脲类降糖药的方法主要有薄层色谱法、红外光谱法、高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法等。薄层色谱法的优点是不需要使用昂贵的分析仪器，但该方法受外界条件的影响比较大，比移值不稳定，存在边缘效应，色谱展开和晾干的时间长，不能满足快速测定的要求，并且对仪器以及周围的环境要求高，同时还对实验人员技术要求高。高效液相色谱法的优点是色谱分离效率高，灵敏度高，但其缺点是仪器价格昂贵，样品前处理时间长，色谱柱易受污染，分析成本高，仪器对使用环境要求高，需要固定摆放，不适合做流动性大的现场检测；高效液相色谱-质谱联用法适合于成分复杂、背景干扰严重的样品分析，这种分析方法可提高检测结果的可靠性，但是该方法操作更加复杂，仪器对使用环境要求更高。需要固定摆放，不适合做流动性大的现场检验。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种分析成本低、专属性强、灵敏度高、抗共存物干扰能力强、实验现象明显、检验结论正确率高、操作简单易行且不需要使用贵重分析仪器，可实现现场对降糖类保健食品、中成药和食品中添加磺脲类化合物的快速检测方法。

本发明的上述目的在于提供上述快速检测方法在制备磺脲类化合物快速检测试剂盒的应用。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

目前，在降糖类保健食品、中成药和食品中添加的磺脲类化合物为格列吡嗪、格列美脲、格列喹酮、格列苯脲、甲苯磺丁脲、吡格列酮、罗格列酮，格列齐特，通过比对它们的结构可以看出，这八个化合物在结构上都有共同的丙二酰脲特征基团，因此本发明针对丙二酰脲特征基团与香草醛、硫酸的显色反应，提供一种磺脲类化合物的快速检测方法。反应机理如下反应式：

加入乙醇后，反应产物可转为：

该方法是将磺脲类化合物从待测的降糖类保健食品、中成药或食品中提取出来，然后用显色剂对提取液进行显色，通过最后的颜色变化结果能准确的判断待测降糖类保健食品、中成药和食品中是否添加磺脲类化合物，本发明的快速检测方法具体包括如下步骤：

⑴ 取固态或液态的保健食品、中成药或食品，加入3ml分析纯二氯甲烷，振摇使溶散，静置片刻，过滤，收集续滤液。

⑵取步骤⑴得到的续滤液2ml，加入10mg或者20mg的香草醛固体，再加入98%的浓硫酸溶液2ml,在80～90℃水浴中加热1分钟，至上层二氯甲烷层挥尽，若是阳性样品，加热后下层硫酸层显棕红色，若是阴性样品，下层硫酸层颜色无变化。

⑶将步骤⑵得到的溶液冷却至室温，缓慢加入5ml95%乙醇溶液，边加边观察分液层颜色变化，轻轻振摇，观察分液层和上层溶液颜色，2分钟内判断显色结果。

降糖类保健食品、中成药和食品在采取上述方法进行检测前，可先进行一些处理，如片剂和颗粒剂可先研细，胶囊剂则取出内容物。

上述步骤⑴中， 取固态或液态的保健食品、中成药或食品时，固体保健食品和中成药（胶囊、片剂、软胶囊等）取样量为一次服用量，食品（饼干、粥、麦片、奶粉等）和茶剂取样量为1g，液体样品取样量为2ml；加入提取溶剂二氯甲烷3ml，振摇使溶散，静置片刻，过滤，收集续滤液。二氯甲烷、三氯甲烷可以将降糖类保健食品、中成药和食品中的磺脲类化合物提取出来，同时也能带走部分水起到脱水作用；由于三氯甲烷具有一定的毒性，且沸点较二氯甲烷高，在步骤⑵中加热不易挥尽，因此选择二氯甲烷为提取溶剂。

 上述步骤⑵中，取步骤⑴得到的续滤液2ml，除茶剂加入香草醛固体质量为10mg外，其余品种和剂型均加入香草醛固体20mg，再加入98%的浓硫酸溶液2ml,在80～90℃水浴中加热1分钟，至上层二氯甲烷层挥尽，若是阳性样品，加热后下层硫酸层显棕红色，若是阴性样品，下层硫酸层颜色无变化，若样品溶液本身颜色很深，加热后，颜色加深。

上述步骤⑵中，由于茶剂中含有茶碱，茶碱有酰胺结构，具有一个活泼氢，可以与香草醛和硫酸显颜色反应，产生假阳性，但茶碱只具有一个活泼氢，且其没有磺脲类化合物的活泼氢活泼，反应速度慢，颜色浅，所以为了消除茶碱的干扰，减少香草醛的用量，使得茶碱反应速度慢，2分钟内不出现阳性显色结果，消除干扰。

上述步骤⑵中，磺脲类化合物和香草醛的质量比对实验结果影响很大，其质量比为1:1～1:2；水分对实验结果影响也比较大，所以要用98%的浓硫酸，且要加热去除二氯甲烷；香草醛和浓硫酸要分别加入，不能配成香草醛的硫酸溶液。

上述步骤⑶中，将步骤⑵得到的溶液冷却至室温，缓慢加入5ml95%乙醇溶液，边加边观察分液层颜色变化，轻轻振摇，观察分液层和上层溶液颜色，2分钟内判断显色结果。若缓慢加入乙醇时，在分液层呈现紫色，轻轻振摇，分液层和上层溶液逐渐变为蓝色，放置2分钟内蓝色加深，即判断样品中含磺脲类化合物。

上述步骤⑶中，在加入95%乙醇时，不可剧烈振摇，破坏分层，使得下层的深颜色干扰颜色判断。若加入无水乙醇，反应速度很快，结果明显，但样品中若含有活泼氢化合物时，会产生假阳性，因此选择95%乙醇。若样品中含有格列吡嗪、格列美脲、格列喹酮、格列苯脲，终点为深蓝色；若样品中含有甲苯磺丁脲、吡格列酮、罗格列酮，终点为浅蓝色，这主要是因为格列吡嗪、格列美脲、格列喹酮、格列苯脲侧链上具有酰胺吸电子基团，使得丙二酰脲上的氢更加活泼，反应速度快，颜色深。

本方法的显色灵敏度可以达到：格列吡嗪0.30mg, 格列苯脲0.19mg, 格列美脲0.30mg,格列喹酮0.18mg,甲苯磺丁脲0.69mg,罗格列酮0.23mg,吡格列酮0.21mg,格列齐特 0.31mg,此质量低于临床有效剂量的1/100,因此显色灵敏度足够保证不会漏检降糖类保健食品、中成药和食品中磺脲类化合物。在进行显色反应时，通常会平行进行阳性对照反应和空白反应，或配备彩色照片供对照判断。显色结果判断依据如下：

a.  加入乙醇后，如果分液层和上液层出现紫色，但是2分钟内没有变为蓝色，则待测保健食品、中成药或食品中不含磺脲类化合物。

b.  加入乙醇后，如果分液层和上液层出现紫色，但是2分钟内没有变为蓝色，放置5分钟后出现蓝色，则判定待测降糖类保健食品、中成药或食品中不含磺脲类化合物。

c.  加入乙醇后，如果分液层和上液层出现紫色， 2分钟内变为蓝色，则待测降糖类保健食品、中成药或食品中含磺脲类化合物。

由于降糖类保健食品、中成药和食品中的成分非常复杂，尤其是茶剂，含有茶碱等活泼氢化合物，会出现假阳性判断，而磺脲类化合物显色反应速度快，2分钟内出现蓝色，而茶碱放置后才会出现蓝色，因此本发明选择在2分钟内对显色结果进行判断。

基于本发明的快速检测方法，可以制备磺脲类化合物的快速检测试剂盒，也可以制备成适合药品检测车上使用的磺脲类化合物的快速检测套装，用于降糖类保健食品、中成药或食品的快速检验。

与现有技术相比，本发明具有如下有效效果：

1.本发明的方法其分析成本低、不需要专门设备、专属性强、灵敏度高，适用于现场对降糖类保健食品、中成药和食品中是否添加有磺脲类化合物进行快速检测，克服了现有技术存在的缺点，满足保健食品、中成药和食品监督检验需要。

2.由于降糖类保健食品、中成药和食品中成分非常复杂，所以采用二氯甲烷为提取溶剂，将磺脲类化合物提取完全，并起脱水作用，加快反应速度。

3.显色反应发生在硫酸和乙醇的分液层以及乙醇层，解决了干扰色（处于硫酸层）问题，使得显色判断清晰、准确。  

4.本发明的方法具有抗共存物质干扰能力强、显色结果易于判断、检验结论正确率高、操作简便快速，无需对检验人员进行培训，所需检验仪器简单等特点。

5.根据本发明的方法制备快速检测试剂盒，将能满足大批量检验工作和药品检验车现场检验的需要。

具体实施方式

下面结合具体实施例子对本发明作进一步地解释，但具体实施例子并不对本发明做任何限定。

实施例1 胶囊剂的检测

样品：双宝清糖，批号20120905，胶囊剂，HPLC-MS联用法检出吡格列酮、格列本脲。

采用本发明的快速检测方法对样品进行测定，其具体步骤如下：

⑴取样品2粒，将其内容物置于5ml注射器中，加入3ml二氯甲烷，振摇2min，以有机微孔滤头（0.45um孔径，外径12mm）过滤，取续滤液约2ml。

⑵将上述2ml续滤液加入至含有香草醛约20mg的试管中，加浓硫酸2ml，摇匀，置80～90℃水浴中加热约1min，至二氯甲烷基本挥尽，溶液颜色由黄色变为红棕色。

⑶将上述溶液放冷至室温，小心沿壁加入95%乙醇5ml，发现在分液层泛起紫色，轻轻振摇，在分液层和上层溶液紫色泛起，随即变为蓝色，2min内分液层和上层溶液呈现蓝色，由此说明样品中含有磺脲类化合物，该结果与HPLC-MS联用法的检测结果一致。

实施例2 胶囊剂的检测

样品：九味草塘天桑胶囊，批号130106，胶囊剂，HPLC-MS联用法检出吡格列酮、格列本脲。

采用本发明的快速检测方法对样品进行测定，其具体步骤如下：

⑴取样品2粒，将其内容物置于5ml注射器中，加入3ml二氯甲烷，振摇2min，以有机微孔滤头（0.45um孔径，外径12mm）过滤，取续滤液约2ml。

⑵将上述2ml续滤液加入至含有香草醛约20mg的试管中，加浓硫酸2ml，摇匀，置80～90℃水浴中加热约1min，至二氯甲烷基本挥尽，溶液颜色由黄色变为红棕色。

⑶将上述溶液放冷至室温，小心沿壁加入95%乙醇5ml，发现在分液层泛起紫色，轻轻振摇，在分液层和上层溶液紫色泛起，随即变为蓝色，2min内分液层和上层溶液呈现蓝色，由此说明样品中含有磺脲类化合物，该结果与HPLC-MS联用法的检测结果一致。

实施例3 胶囊剂的检测

样品：山芪蔘特制胶囊，批号20110902，胶囊剂，HPLC-MS联用法未检出磺脲类降糖药。

采用本发明的快速检测方法对样品进行测定，其具体步骤如下：

⑴取样品2粒，将其内容物置于5ml注射器中，加入3ml二氯甲烷，振摇2min，以有机微孔滤头（0.45um孔径，外径12mm）过滤，取续滤液约2ml。

⑵将上述2ml续滤液加入至含有香草醛约20mg的试管中，加浓硫酸2ml，摇匀，置80～90℃水浴中加热约1min，至二氯甲烷基本挥尽，溶液颜色由黄色变为红棕色。

⑶将上述溶液放冷至室温，小心沿壁加入95%乙醇5ml，发现在分液层泛起紫色，轻轻振摇，在分液层和上层溶液紫色泛起，2min内紫色无变化，由此说明样品中不含有磺脲类化合物，该结果与HPLC-MS联用法的检测结果一致。

实施例4 茶剂的检测

样品：阿尔发消渴茶，批号2012011316，茶剂，HPLC-MS联用法未检出磺脲类降糖药。

采用本发明的快速检测方法对样品进行测定，其具体步骤如下：

⑴称取样品约1g，将其置于5ml注射器中，加入3ml二氯甲烷，振摇2min，以有机微孔滤头（0.45um孔径，外径12mm）过滤，取续滤液约2ml。

⑵将上述2ml续滤液加入至含有香草醛约10mg的试管中，加浓硫酸2ml，摇匀，置80～90℃水浴中加热约1min，至二氯甲烷基本挥尽，溶液颜色由黄绿色变为棕色。

⑶将上述溶液放冷至室温，小心沿壁加入95%乙醇5ml，发现在分液层泛起紫色，轻轻振摇，在分液层和上层溶液紫色泛起，2min内的紫色无变化，由此说明样品中不含有磺脲类化合物，该结果与HPLC-MS联用法的检测结果一致。

实施例5  液体制剂

样品：华信牌雪源康口服液，批号20120103140，口服液，HPLC-MS联用法未检出磺脲类降糖药。

采用本发明的快速检测方法对样品进行测定，其具体步骤如下：

⑴量取样品约2ml，将其置于5ml注射器中，加入3ml二氯甲烷，振摇2min，以有机微孔滤头（0.45um孔径，外径12mm）过滤，取续滤液约2ml。

⑵将上述2ml续滤液加入至含有香草醛约20mg的试管中，加浓硫酸2ml，摇匀，置80～90℃水浴中加热约1min，至二氯甲烷基本挥尽，溶液颜色由无色变为棕黄色。

⑶将上述溶液放冷至室温，小心沿壁加入95%乙醇5ml，发现在分液层泛起棕黄色，轻轻振摇，在分液层和上层溶液棕黄色泛起，2min内的棕黄色无变化，由此说明样品中不含有磺脲类化合物，该结果与HPLC-MS联用法的检测结果一致。

实施例6 食品类的检测

样品：齐梅降糖奶粉，批号20110604甲(025)，奶粉，HPLC-MS联用法未检出磺脲类降糖药。

采用本发明的快速检测方法对样品进行测定，其具体步骤如下：

⑴称取样品约1g，将其置于5ml注射器中，加入3ml二氯甲烷，振摇2min，以有机微孔滤头（0.45um孔径，外径12mm）过滤，取续滤液约2ml。

⑵将上述2ml续滤液加入至含有香草醛约20mg的试管中，加浓硫酸2ml，摇匀，置80～90℃水浴中加热约1min，至二氯甲烷基本挥尽，溶液颜色由无色变为黄色。

⑶将上述溶液放冷至室温，小心沿壁加入95%乙醇5ml，发现在分液层泛起紫色，轻轻振摇，在分液层和上层溶液紫色泛起，2min内的紫色无变化，由此说明样品中不含有磺脲类化合物，该结果与HPLC-MS联用法的检测结果一致。

Claims (4)

1.一种降糖类保健食品、中成药和食品中添加磺脲类化合物的快速检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

⑴ 取固态或液态的保健食品、中成药或食品，加入3ml分析纯二氯甲烷，振摇使溶散，静置片刻，过滤，收集续滤液；

⑵取步骤⑴得到的续滤液2ml，加入10mg或者20mg的香草醛固体，再加入98%的浓硫酸溶液2ml,在80～90℃水浴中加热1分钟，至上层二氯甲烷层挥尽，若是阳性样品，加热后下层硫酸层显棕红色，若是阴性样品，下层硫酸层颜色无变化；

⑶将步骤⑵得到的溶液冷却至室温，缓慢加入5ml95%乙醇溶液，边加边观察分液层颜色变化，轻轻振摇，观察分液层和上层溶液颜色，2分钟内判断显色结果；若缓慢加入乙醇时，在分液层呈现紫色，轻轻振摇，分液层和上层溶液逐渐变为蓝色，放置2分钟内蓝色加深，即判断样品中含磺脲类化合物。

2.一种降糖类保健食品、中成药和食品中添加磺脲类化合物的快速检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

⑴ 取固态或液态的保健食品、中成药或食品时，固体保健食品和中成药（胶囊、片剂、软胶囊等）取样量为一次服用量，食品（饼干、粥、麦片、奶粉等）和茶剂取样量为1g，液体样品取样量为2ml；加入提取溶剂二氯甲烷3ml，振摇使溶散，静置片刻，过滤，收集续滤液；

⑵取步骤⑴得到的续滤液2ml，除茶剂加入香草醛固体质量为10mg外，其余品种和剂型均加入香草醛固体20mg，再加入98%的浓硫酸溶液2ml,在80～90℃水浴中加热1分钟，至上层二氯甲烷层挥尽，若是阳性样品，加热后下层硫酸层显棕红色，若是阴性样品，下层硫酸层颜色无变化，若样品溶液本身颜色很深，加热后，颜色加深；

⑶将步骤⑵得到的溶液冷却至室温，缓慢加入5ml95%乙醇溶液，边加边观察分液层颜色变化，轻轻振摇，观察分液层和上层溶液颜色，2分钟内判断显色结果；若缓慢加入乙醇时，在分液层呈现紫色，轻轻振摇，分液层和上层溶液逐渐变为蓝色，放置2分钟内蓝色加深，即判断样品中含磺脲类化合物；在加入乙醇时，不可剧烈振摇，破坏分层，使得下层的深颜色干扰颜色判断；若样品中含有格列吡嗪、格列美脲、格列喹酮、格列苯脲，终点为深蓝色；若样品中含有甲苯磺丁脲、吡格列酮、罗格列酮，终点为浅蓝色。

3.一种降糖类保健食品、中成药和食品中添加磺脲类化合物的快速检测方法，其特征在于该方法所述的磺脲类化合物包括格列吡嗪、格列美脲、格列喹酮、格列苯脲、甲苯磺丁脲、吡格列酮、罗格列酮，格列齐特。

4.一种降糖类保健食品、中成药和食品中添加磺脲类化合物的快速检测方法在制备磺脲类化合物的快速检测试剂盒的应用。