CN110514753A - 一种利用多元多维色谱指纹图谱筛查降糖保健品中的非法添加物的方法 - Google Patents

一种利用多元多维色谱指纹图谱筛查降糖保健品中的非法添加物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110514753A
CN110514753A CN201910701943.XA CN201910701943A CN110514753A CN 110514753 A CN110514753 A CN 110514753A CN 201910701943 A CN201910701943 A CN 201910701943A CN 110514753 A CN110514753 A CN 110514753A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
phase
mobile phase
care product
polynary
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910701943.XA
Other languages
English (en)
Inventor
范华均
张薇
谢秀娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Pharmaceutical University
Original Assignee
Guangdong Pharmaceutical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Pharmaceutical University filed Critical Guangdong Pharmaceutical University
Priority to CN201910701943.XA priority Critical patent/CN110514753A/zh
Publication of CN110514753A publication Critical patent/CN110514753A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G01N30/8686—Fingerprinting, e.g. without prior knowledge of the sample components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/067—Preparation by reaction, e.g. derivatising the sample

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Library & Information Science (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及一种利用多元多维色谱指纹图谱筛查降糖保健品中的非法添加物的方法。该方法包括如下步骤：S1：将样品研细，超声提取，离心分相，挥干；S2：将上、下相旋干后重新溶解；S3：采用液相色谱法进行分析，根据分离结果找到基质最复杂的样品；S4～S6：于基质最复杂的样品中加入非法添加物，按S1～S3相同的操作及紫外检测分别得到降糖保健品的多元多维；S7：将待测样品按照S1～S3相同的操作得到色谱信息后与多元多维指纹图谱进行对比分析，即可。本发明的方法将多相萃取和多维指纹图谱检测技术相结合，建立的多元多维色谱指纹图谱既能真实反应样品的基质情况，且可快速、准确筛查降糖保健品中的外源性物质。

Description

一种利用多元多维色谱指纹图谱筛查降糖保健品中的非法添 加物的方法
技术领域
本发明属于检测与分析技术领域，具体涉及一种利用多元多维色谱指纹图谱筛查降糖保健品中的非法添加物的方法。
背景技术
液-液萃取作为一种有效的分离技术，其基本原理是：两溶剂之间由于物理化学性质的差异会形成互不相溶的两相，若样品组分对两相溶剂亲和性不同，将会在两相间进行差别分配，使溶质由一相转移至另一相，从而达到分离、纯化的目的。常见的液-液双相萃取体系可分为：有机溶剂-水体系、有机溶剂-有机溶剂体系、双水相体系。
目前，双相萃取体系的前处理方法已得到广泛使用。Irina等首次将在线注射器糖析萃取与LC-MS相结合，用于测定水果中的四种农药，实现了全自动化分析，形成双相的溶剂为水和乙腈，乙腈可直接注入质谱分析，改善了传统双相萃取使用的有机相与质谱不匹配的缺点，最终测得4种杀虫剂农药在一定浓度范围内线性关系良好(R>0.99)，检出限也符合要求。Shi等采用沸水提取葛根芩连中的12种有效成分，提取液经过滤稀释后，加入一定量的乙腈，于-35℃下冷却使乙腈水分相，取出乙腈相并采用LC-MS分析，12种目标物的检出限均在0.0003～0.0451mg/mL之间，日内精密度小于8.94％、日间精密度小于2.71％。Jorge等采用聚乙二醇和胆碱盐形成双水相体系，并将其用于萃取发酵液中的四环素，经过一系列的条件优化，最终四环素的萃取率可达80％以上，且该体系操作简便，可应用于复杂基质中抗生素的提取。不难看出，双相萃取体系主要用作农残、中药有效成分和抗生素等测定的前处理方法，在保健品非法添加物测定中的应用还未见有报道。
指纹图谱是指样品经过适当的前处理并结合现代分析技术，得到能够呈现样品特征的图谱，是一种有效的质量控制模式。指纹图谱可同时对已知和未知成分进行分析，得到的指纹图谱轮廓能较全面地反映样品中各组分的种类及含量，因此具有高度特异性和选择性。目前，指纹图谱主要作为中药质量评价的一种有效手段。
目前，对于降糖保健品中非法添加物的测定，前处理方法一般为采用单一的有机相提取样品，再结合液相色谱法进行分析测定。由于降糖保健品种类繁多，基质复杂多样，面对层出不穷的非法添加物，采用单一溶剂提取，极易在源头上造成样品信息的丢失；此外通过液相色谱的单波长检测进行定性易造成误判。因此，降糖保健品中非法添加物的筛查方法还有待进一步完善。
发明内容
本发明的目的在于克服现有降糖保健品中非法添加物的筛查方法易造成样品信息丢失，定性检测时易误判，准确度较差的缺陷或不足，提供一种利用多元多维色谱指纹图谱筛查降糖保健品中的非法添加物的方法。本发明首次采用毒性小、萃取性能良好的丁醇-水体系作为样品的前处理方法，使得不同极性的非法添加物能更好地被萃取至各相中，避免了信息的遗漏，同时极性不同的样品基质也分布于两相，从而降低了各相样品溶液的分离难度，更有利于指纹图谱的建立；然后选取多个特征吸收波长和衍生化的方法，建立了降糖保健品的多维紫外指纹图谱，大大提高了筛查结果的准确性。本发明的方法将多相萃取和多维指纹图谱检测技术相结合，建立的多元多维色谱指纹图谱既能真实反应样品的基质情况，且可快速、准确筛查降糖保健品中的外源性物质。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用多元多维色谱指纹图谱筛查降糖保健品中的非法添加物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将多批次的降糖保健品的样品研细，与丁醇-水体系混合，超声提取，离心分相，挥干上、下相溶剂；所述丁醇-水体系中丁醇和水的体积比为1:0.1～3；
S2：将上、下相旋干后重新溶解后分别得上、下相溶液；
S3：将上、下相溶液分别采用液相色谱法进行分析，根据分离结果找到基质最复杂的样品；
S4：于基质最复杂的样品中加入非法添加物，按S1～S3相同的操作得到降糖保健品的多元色谱指纹图谱；
S5：将S3得到的上、下相溶液于235nm波长下进行紫外检测，得到一维紫外指纹图谱；
S6：将S3得到的上、下相溶液于266、276、282、302和313nm波长下进行紫外检测，进行衍生化后于280和350nm波长下进行紫外检测，得到二维紫外指纹图谱；
S7：将待测样品按照S1～S3相同的操作得到色谱信息后与多元色谱指纹图谱、一维紫外指纹图谱和二维紫外指纹图谱进行对比分析，即可。
降糖保健品中最常使用的非法添加物包括四类：双胍类、磺酰脲类、噻唑烷二酮类、格列奈类，具体有以下11种化学成分：盐酸二甲双胍、盐酸苯乙双胍、格列吡嗪、甲苯磺丁脲、格列齐特、盐酸吡格列酮、马来酸罗格列酮、格列苯脲、格列美脲、格列喹酮、瑞格列奈。
本发明采用不同极性的低链无毒(或低毒)醇与水配对成相，通过盐析的方式，试验了不同极性的萃取体系对11种目标物的萃取性能，最终决定采用丁醇-水形成的双相作为萃取剂，针对上述11种非法添加物中，两种双胍类物质被萃取至水相，其余目标物均被萃取至有机相。
利用丁醇-水体系作为样品的前处理方法可使得不同极性的非法添加物能更好地被萃取至各相中，避免了信息的遗漏，同时极性不同的样品基质也分布于两相，从而降低了各相样品溶液的分离难度，更有利于指纹图谱的建立。
另一方面，通过对多批次的样品进行筛选，得到基质最复杂、分离难度最大的样品，可进一步避免样品信息的遗漏。
由于上述11种非法添加物在235nm处均具有特征吸收，故现有的色谱检测方法均选用235nm单一波长下进行检测。但该波长接近末端吸收，很多样品峰也会有吸收，从而对目标物的测定造成干扰，因此采用该单波长进行检测，很容易造成误判。
本发明选用通过选取多个特征吸收波长和衍生化的方法，建立了降糖保健品的多维色谱指纹图谱(一维紫外指纹图谱、二维紫外指纹图谱)。具体的，利用一维紫外指纹图谱对样品进行初步筛查，保留时间和紫外吸收图谱均呈阳性的样品，再利用二维指纹图谱进行确证，大大提高了筛查结果的准确性。
本发明的方法具有如下优点：
(1)将多相萃取和多维指纹图谱检测技术相结合，建立的多元多维色谱指纹图谱既能真实反应样品的基质情况，且可快速、准确筛查降糖保健品中的外源性物质。本发明对市场中15种常见的降糖保健品进行筛查，共测得4批阳性样品，加标回收率均在78.93％～98.61％，RSD在0.68％～3.2％。与单相溶剂萃取相比，双相溶剂萃取具有一定的除杂作用，因此上、下相基质干扰降低，分离时间缩短；此外，样品经多级筛查后仍呈阳性的样品，可直接对其进行定性和定量分析，无需采用LC-MS/MS验证。
(2)丁醇-水体系萃取性能良好、毒性小，因此可有效减少环境污染，更符合绿色化学的要求。
(3)利用建立的多元多维色谱指纹图谱，在不使用液质联用仪的情况下，也可以准确、快速筛查样品中11种已知的非法添加物，还可以获得样品的成分信息，同时利用指纹图谱的轮廓还可以筛查未知的非法添加物。
有机相和水相的相比需要控制在合适范围内，如相比过大，对盐酸二甲双胍和盐酸苯乙双胍的回收率降低；如相比过小，对9种降血糖非法添加物回收率降低。研究发现当相比为1:1时，具有更为优异的提取效果。
优选地，S1中所述-水体系中丁醇和水的体积比为1:1。
优选地，S1中所述样品的浓度为0.02～0.10g/mL。
更为优选地，S1中所述样品的浓度为0.05g/mL。
优选地，S1中所述降糖保健品的剂型为饼剂、粉剂、茶剂、胶囊剂或片剂中的一种或多种。
优选地，S2中利用旋转蒸发仪旋干。
优选地，S3中上相选用的液相色谱条件为：色谱柱：SHIMADZU VP-ODS C18柱；流动相选用流动相A：甲醇，流动相B：醋酸铵溶液；洗脱条件：0～30min为30～40％流动相A，30～50min为40～64％流动相A，50～60min为64％～70％流动相A，60～75min为70％流动相A。
更为优选地，色谱柱：SHIMADZU VP-ODS C18柱，150×4.6mm，5μm。
更为优选地，液相色谱选用的柱温为25℃。
更为优选地，液相色谱选用的进样量为20μL。
更为优选地，液相色谱选用的流速为1.0mL/min。
优选地，S3中下相选用的液相色谱条件为：色谱柱：SHIMADZU VP-ODS C18柱；流动相：流动相选用流动相A：乙腈，流动相B庚烷磺酸钠溶液；洗脱条件：0～15min为9％流动相A，15～30min为9～29％流动相A；30～35min为29％流动相A。
具体的，上相萃取液的色谱分离条件：色谱柱：SHIMADZU VP-ODS C18柱(150×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-0.01mol/L醋酸铵(B)：0～30min为30～40％A，30～50min为40～64％A，50～60min为64％～70％A，60～75min为70％A；柱温：25℃；进样量：20μL；流速：1.0mL/min。
更为优选地，液相色谱选用的柱温为25℃。
更为优选地，液相色谱选用的进样量为20μL。
更为优选地，液相色谱选用的流速为1.0mL/min。
具体的，下相萃取液的色谱分离条件：色谱柱：SHIMADZU VP-ODS C18柱(150×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.05％庚烷磺酸钠(B，pH＝4)：0～15min为9％A，15～30min为9～29％A；30～35min为29％A；柱温：25℃；进样量：20μL；流速：1.0mL/min。
优选地，S4中所述非法添加物为双胍类、磺酰脲类、噻唑烷二酮类或格列奈类中的一种或几种。
更为优选地，S4中所述非法添加物为盐酸二甲双胍、盐酸苯乙双胍、格列吡嗪、甲苯磺丁脲、格列齐特、盐酸吡格列酮、马来酸罗格列酮、格列苯脲、格列美脲、格列喹酮和瑞格列奈。
11种非法添加物中，盐酸吡格列酮、格列吡嗪、马来酸罗格列酮、格列苯脲、格列喹酮和瑞格列奈具有多个特征吸收波长，可直接进行多维检测，而只有单个检测波长的盐酸二甲双胍、盐酸苯乙双胍和甲苯磺丁脲、格列齐特个格列美脲则需进行衍生化后再进行多维检测。
本发明可选用常规的衍生化方法进行衍生化。
优选地，S6中选用的衍生化试剂为对硝基苯甲酰氯或2,4-二硝基氟苯中的一种或几种。
具体的，盐酸二甲双胍、盐酸苯乙双胍采用对硝基苯甲酰氯做衍生化试剂进行衍生化；甲苯磺丁脲、格列齐特和格列美脲采用2,4-二硝基氟苯做衍生化试剂进行衍生化。
优选地，S7中的对比分析过程如下：待测样品的色谱信息与S4得到的多元色谱指纹图谱进行对比分析，如疑似样品的相似度大于0.9，则不含非法添加物；如疑似样品的相似度小于0.9时，与一维紫外指纹图谱和二维紫外指纹图谱进行对比分析进行对比分析，如相似度≥950，可判定非法添加物的种类。
更为优选地，S7中，如相似度≥980，可判定非法添加物为纯物质。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)将多相萃取和多维指纹图谱检测技术相结合，建立的多元多维色谱指纹图谱既能真实反应样品的基质情况，且可快速、准确筛查降糖保健品中的外源性物质。本发明对市场中15种常见的降糖保健品进行筛查，共测得4批阳性样品，加标回收率均在78.93％～98.61％，RSD在0.68％～3.2％。与单相溶剂萃取相比，双相溶剂萃取具有一定的除杂作用，因此上、下相基质干扰降低，分离时间缩短；此外，样品经多级筛查后仍呈阳性的样品，可直接对其进行定性和定量分析，无需采用LC-MS/MS验证。
(2)丁醇-水体系萃取性能良好、毒性小，因此可有效减少环境污染，更符合绿色化学的要求。
(3)利用建立的多元多维色谱指纹图谱，在不使用液质联用仪的情况下，也可以准确、快速筛查样品中11种已知的非法添加物，还可以获得样品的成分信息，同时利用指纹图谱的轮廓还可以筛查未知的非法添加物。
附图说明
图1为235nm下9批样品的HPLC-DAD色谱图(a上相；b下相)；
图2为235nm下降糖保健品多元(一维)色谱指纹图谱(a上相；b下相)；
图3为降糖保健品色谱指纹图谱(a样品3D图谱；b样品二维色谱指纹图谱；
图4为两种衍生化试剂的反应过程(a对硝基苯甲酰氯；b 2,4-二硝基氟苯)
图5为经衍生化后的降糖保健品二维色谱指纹图谱(a磺酰脲类；b双胍类)；
图6为降糖保健品中非法添加物的筛查流程图(M：图谱相似度)
图7为样品与标准色谱指纹图谱的对比结果。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
本发明各实施例选用的降糖保健品的来源如下表1。
表1 9批降糖保健品的来源
实施例1检测波长的选择
依据国家相关部门对降糖保健品中非法添加物的检测要求，共选取了11种常用的化学降糖药作为筛查对象。由化合物的结构可知，11种非法添加物在235nm处均有较高的紫外吸收，故选择该波长可同时对11种目标物进行测定，但由于235nm接近末端吸收，样品基质在此波长下也会有很高的响应，不利于微量目标物的检测。由表2可知，格列吡嗪、马来酸罗格列酮、盐酸吡格列酮、格列苯脲、格列喹酮和瑞格列奈本身具有两个紫外特征吸收波长，其余目标物经衍生化后也具备两个检测波长。为增加筛查结果的准确性，因此11种化合物同时选用多个波长进行检测，以降低基质的干扰，突出非法添加物的信息。
表2 11种非法添加物的紫外和荧光光谱特征
*目标物经衍生化后的检测波长
实施例2双相萃取体系的选择
由于单一溶剂对各非法添加物的萃取性能有很大差异，因此采用单一溶剂往往导致萃取不完全或萃取遗漏，本实施例拟采用双相萃取体系作样品前处理方法，以萃取不同极性的目标物，从源头上保证样品信息的完整。具体地，分别采用不同极性的低链无毒(或低毒)醇与水配对，通过添加一定量的硫酸铵，利用盐析饱和形成不同的双(水)相萃取体系，试验了不同极性的萃取体系对11种目标物的萃取性能，萃取结果见表3。
由表3可知，两种双胍类物质在上相(丁醇相)中的萃取率较低，而且随着有机溶剂碳链增长，有机相的极性减小，对两目标物的萃取率也逐渐降低；而另外9种物质则易于萃取到有机相，且随着碳链增加萃取率增大，其中丁醇的萃取效果最好。根据相似相溶原则，在丁醇与水形成的双相体系中，丁醇与9种物质的极性更匹配，故萃取率高，此时下相(水相)对两种双胍类物质也有较高的萃取率，可以达到分相萃取的作用。此外，丁醇微溶于水，可以自发地分相(不加盐)形成双相溶剂萃取体系，从而可避免下相(水相)中盐的存在给样品前处理和分析带来的麻烦，故选择丁醇-水双相萃取体系更适宜。
表3不同双相萃取体系对11种目标物在上相(有机相)中的萃取率(％，w/w)
实施例3降糖保健品多元多维色谱指纹图谱数据库的建立
基于市场上的降糖保健品，选取销量较高且基质不同的9批样品(如表1)为研究对象，经前处理后，研究9批样品在同一流动相条件下的色谱分离行为，样品上、下相于235nm下的色谱分离结果见图1。
前处理方法：取适量供试品充分研细、混匀(软胶囊则去壳取其内容物)，准确称取约0.2g于15mL玻璃离心管中，加入2mL丁醇和2mL水，超声振摇30min，于2000rpm下离心10min。上层有机相经氮吹仪吹干，采用甲醇-水(1:1)重新溶解并定容至2mL容量瓶中，下层水相于60℃下旋干，采用纯水重新溶解并定容至2mL容量瓶中。
分别精密称取各化学降糖药标准品4.0mg，纯甲醇超声溶解，定容至10mL，配制成400μg/mL的标准储备液，4℃下保存，实验时两种双胍类物质采用纯水进行逐级稀释，其余九种物质则采用甲醇-0.01mol/L醋酸铵(1:1)逐级稀释。
上相萃取液的色谱分离条件：色谱柱：SHIMADZU VP-ODS C18柱(150×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-0.01mol/L醋酸铵(B)：0～30min为30～40％A，30～50min为40～64％A，50～60min为64％～70％A，60～75min为70％A；柱温：25℃；进样量：20μL；流速：1.0mL/min；紫外检测波长：235nm、266nm、276nm、282nm、302nm、313nm、350nm。
下相萃取液的色谱分离条件：色谱柱：SHIMADZU VP-ODS C18柱(150×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.05％庚烷磺酸钠(B，pH＝4)：0～15min为9％A，15～30min为9～29％A；30～35min为29％A；柱温：25℃；进样量：20μL；流速：1.0mL/min；紫外检测波长：235nm、280nm。
由图1可知：9批保健品经双相体系萃取后，根据相似相溶原则，极性大、含量高的样品基质被萃取至水相，其余中等至弱极性的物质则被萃取至有机相，与单相溶剂萃取相比，在一定程度上简化了各相的样品信息，从而更有利于各相样品的分离和指纹图谱的建立。
(1)多元色谱指纹图谱的建立
9批样品中，S8的色谱图更为复杂，为了解非法添加药物在复杂基质干扰下的色谱行为，故向样品S8中加入11种非法添加物，按照前述相同的前处理方法制备样品溶液，上、下相萃取液分别采用甲醇-醋酸铵和乙腈-庚烷磺酸钠为流动相进行梯度洗脱，DAD为检测器，研究非法添加物在两相萃取液的色谱分离行为并建立多元色谱指纹图谱，结果见图2。
由图2可知，在两种色谱条件下，以235nm为检测波长，可实现对上、下相中11种目标物同时进行检测。与传统的单相溶剂萃取体系相比，由于各相样品基质干扰减少，故分离难度降低，分析时间也大大缩短。样品基质中各相目标物间的分离度R均大于1.5，理论塔板数大于10000，保留时间和峰面积的重复精密度分别小于0.23％和1.8％(表4)，表明仪器性能良好。
表4 11种非法添加物的色谱分离参数
(2)多维色谱指纹图谱的建立
为了更直观简洁地筛查，基于11种非法添加物的紫外光谱特征(见表2)，盐酸吡格列酮、格列吡嗪、格列苯脲、马来酸罗格列酮、格列喹酮和瑞格列奈分别选择另一特征吸收波长检测，以尽可能地消除共存基体组分干扰，据此建立了降糖保健品的二维色谱指纹图谱，其结果见图3。
由图3可知，更换检测波长后，样品基质的复杂程度明显降低，分别在266nm、276nm、282nm、302nm和313nm检测波长下，可更清晰的分辨盐酸吡格列酮、格列吡嗪、瑞格列奈、格列苯脲、马来酸罗格列酮和格列喹酮的色谱峰，即样品信息的进一步简化使非法添加物的特征峰更加突出，且样品经多个波长同时检测、互相印证，可有效避免假阴性结果的出现。但盐酸二甲双胍等其余5种非法添加物仅在235nm左右具有一个特征吸收波长，因此拟采取衍生化的方法来简化样品信息。由反应机理可知(图4)，对硝基苯甲酰氯(p-NBC)、2，4-二硝基氟苯(DNBF)两种衍生化试剂可分别与双胍基团、游离的氨基发生反应，相应地生成均三嗪衍生物与2，4-二硝基苯胺衍生物，因而可分别用于双胍类和磺酰脲类物质的鉴别。
p-NBC与两种双胍类化合物进行衍生化反应后，生成的产物在280nm具有较高的紫外吸收；3种磺酰脲类物质格列齐特、甲苯磺丁脲和格列美脲经DNBF衍生化后可在350nm处进行测定，同属该类物质的格列吡嗪、格列苯脲和格列喹酮也可通过DNBF衍生化后作进一步确证。将加标后的S8样品按照上述前处理方法进行双相萃取，上、下相溶液分别加入相应的衍生化试剂，得到衍生化后的色谱指纹图谱如图5所示。由图可知，加标样品经衍生化后，在远离末端吸收的波长下，基质干扰明显降低，目标峰也更加明显。
图5(a)中，经衍生化后的格列吡嗪、格列苯脲和格列喹酮3种衍生物的出峰时间一致，其原因是：3种物质受热分解后均能产生氨基环己烷，氨基环己烷再与DNBF反应生成相同产物，故出峰时间一致，可以筛查类似物质。
表5两类非法添加物衍生化产物的色谱分离参数
由表5可知，目标物间的分离度(除标准品3、6、8外)和理论塔板数分别大于1.5、100000，保留时间和峰面积的重复精密度均在0.34％以下，表明加标样品S8经衍生化后建立的多维色谱指纹图谱满足分析测定的要求。
实施例4多种降糖保健品中非法添加物筛查的评价方法
通过双相萃取和多维检测获得的多元多维色谱指纹图谱数据库，可反映样品和非法添加物的基本特征。利用HPLC指纹图谱轮廓技术，可直观的观察样品中非法添加物的存在与否，再利用多维光谱特征作进一步确证，由此构建一套降糖保健品中非法添加物筛查的评价方法，具体的筛查流程如图6所示。
实际测定过程中，样品首先采用双相体系将目标物萃取至合适的溶剂中，并简化各相样品信息。根据降糖保健品中可能含有的非法添加物，经一维色谱指纹图谱筛查后呈阳性的样品，再与二维色谱指纹图谱进行对比，可直接判断样品是否含有非法添加物，该方法结果准确、可靠，无需使用价格昂贵的LC-MS进行确证，大大节约了成本。
为评价丁醇与水形成的双相体系对基质干扰下11种非法添加物的萃取能力，不断减少样品中11种目标物的加入量，直至萃取到的目标物其紫外吸收图谱与相应的标准图谱刚好存在明显差异(M<950)，各目标物于相应特征吸收波长下的最低检出限量如表6所示。
表6基质干扰下11种非法添加物的检出限
由上表可知：以S8为代表样品建立的指纹图谱，其包含的11种目标物在第一维波长下的检出限要高于或等于其他特征吸收波长下各目标物的检出限，即灵敏度低，其原因是：当检测波长远离末端吸收时，样品基质干扰减少，非法添加物的特征信息更加突出，检测灵敏度也相应增加。
实施例5定量分析方法学考察
各取11种非法添加物的标准储备液适量，加流动相稀释配置成不同浓度的混合标准品溶液，进样20μL，上、下相溶液分别于各自色谱条件下分析，记录不同浓度下各标准品C所对应的峰面积A。由表7可知，各标准品线性方程的相关系数R2均在0.99以上，表明线性关系良好，检出限在0.0550～0.423μg/mL范围内，RSD为0.040％～3.5％，表明仪器性能良好。
表7 11种化非法添加物的线性方程、线性范围、相关系数和检出限
实施例6筛查方法的应用
本实施例利用上述得到的前处理方法及建立的多元多维图谱对实际降糖保健品样品中的非法添加物进行筛查，并进行定量分析。
(1)实际样品的筛查
待测样品的处理过程如下：分别选取15批不同剂型的样品，充分研细、混匀(软胶囊则去壳取其内容物)，准确称取约0.2g于15mL玻璃离心管中，加入2mL丁醇和2mL水，超声振摇30min，于2000rpm下离心10min。上层有机相经氮吹仪吹干，采用甲醇-水(1:1)重新溶解并定容至2mL容量瓶中，下层水相于60℃下旋干，采用纯水重新溶解并定容至2mL容量瓶中。
上相萃取液的色谱分离条件：色谱柱：SHIMADZU VP-ODS C18柱(150×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-0.01mol/L醋酸铵(B)：0～30min为30～40％A，30～50min为40～64％A，50～60min为64％～70％A，60～75min为70％A；柱温：25℃；进样量：20μL；流速：1.0mL/min；紫外检测波长：235nm、266nm、276nm、282nm、302nm、313nm、350nm。
下相萃取液的色谱分离条件：色谱柱：SHIMADZU VP-ODS C18柱(150×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.05％庚烷磺酸钠(B，pH＝4)：0～15min为9％A，15～30min为9～29％A；30～35min为29％A；柱温：25℃；进样量：20μL；流速：1.0mL/min；紫外检测波长：235nm、280nm。得到色谱信息，并与多元多维色谱对比，如图7((a上相235nm；b下相235nm；c上相302nm；d上相350nm；e下相280nm))。
由图7可知，样品SS1、SS2、SS3、SS4中分别含有与指纹图谱中盐酸二甲双胍、盐酸苯乙双胍、格列苯脲、格列美脲相同保留时间的色谱峰。非法添加物与疑似样品峰的色谱峰匹配度值及紫外吸收图谱的相似度结果如表8所示。从结果可知，各样品峰均为纯物质，经多维指纹图谱筛查后，样品峰与相应非法添加物的紫外图谱匹配度均大于950，因此可直接判断SS1中含有盐酸二甲双胍，SS2中含盐酸苯乙双胍，SS3中含格列苯脲，SS4中含格列美脲。
表8非法添加物与样品峰的保留时间、纯度及紫外吸收图谱匹配度结果
*赛默飞世尔科技有限公司默认色谱峰匹配度>980的物质为纯物质
**赛默飞世尔科技有限公司默认UV图谱相似度值M>950的两物质具有一定相似性
(2)阳性样品的定量分析
采用上述定量方法对4批阳性样品进行含量测定，并于样品中加入相应不同浓度的非法添加物，各物质的含量及其加标回收率如下表(表9)所示。
表9阳性样品中非法添加物的含量及其加标回收率
由结果可知：4种非法添加物的含量分别为6.50mg/kg、5.47mg/kg、3.69mg/kg、9.11mg/kg，回收率均在78.93％～98.61％，RSD在0.68％～3.2％，表明本章以S8降糖保健品建立的多元多维色谱指纹图谱可用于降糖保健品中非法添加物的定性和定量测定。
本实施例选用萃取率高的丁醇-水双相体系作为样品前处理方法，将不同极性的非法添加物萃取至上、下相，分别以甲醇-醋酸铵(0.01mol/L)、乙腈-庚烷磺酸钠(0.05％，pH 4.0)为流动相进行分离。与单相溶剂萃取相比，双相溶剂萃取具有一定的除杂作用，因此上、下相基质干扰降低，分离时间缩短，目标特征峰也更加明显。选用基质最复杂的降糖保健品为研究对象建立色谱指纹图谱，确立的分离条件适用于绝大多数降糖保健品中非法添加物的筛查，且能反映较多的样品信息。结合目标物自身光谱特征与衍生化法，11种非法添加物均具有多个特征吸收波长，从而构建多元多维色谱指纹图谱用于筛查不同基质样品中的非法添加物。经多级筛查后仍呈阳性的样品，可直接对其进行定量分析，无需采用LC-MS/MS验证。采用建立的方法已成功用于4批阳性样品的定性和定量分析，表明建立的多元多维色谱指纹图谱是一种快速、准确、高通量筛查非法添加物的方法。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用多元多维色谱指纹图谱筛查降糖保健品中的非法添加物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将多批次的降糖保健品的样品研细，与丁醇-水体系混合，超声提取，离心分相，挥干上、下相溶剂；所述丁醇-水体系中丁醇和水的体积比为1:0.1～3；
S2：将上、下相旋干后分别重新溶解后分别得上、下相溶液；
S3：将上、下相溶液分别采用液相色谱法进行分析，根据分离结果找到基质最复杂的样品；
S4：于基质最复杂的样品中加入非法添加物，按S1～S3相同的操作得到降糖保健品的多元色谱指纹图谱；
S5：将S3得到的上、下相溶液于235nm波长下进行紫外检测，得到一维紫外指纹图谱；
S6：将S3得到的上、下相溶液于266、276、282、302和313nm波长下进行紫外检测，进行衍生化后于280和350nm波长下进行紫外检测，得到二维紫外指纹图谱；
S7：将待测样品按照S1～S3相同的操作得到色谱信息后与多元色谱指纹图谱、一维紫外指纹图谱和二维紫外指纹图谱进行对比分析，即可。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S1中所述-水体系中丁醇和水的体积比为1:1。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S1中所述样品的浓度为0.02～0.10g/mL。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S1中所述降糖保健品的剂型为饼剂、粉剂、茶剂、胶囊剂或片剂中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S3中上相选用的液相色谱条件为：色谱柱：SHIMADZU VP-ODS C18柱；流动相选用流动相A：甲醇，流动相B：醋酸铵溶液；洗脱条件：0～30min为30～40％流动相A，30～50min为40～64％流动相A，50～60min为64％～70％流动相A，60～75min为70％流动相A；
S3中下相选用的液相色谱条件为：色谱柱：SHIMADZU VP-ODS C18柱；流动相：流动相选用流动相A：乙腈，流动相B庚烷磺酸钠溶液；洗脱条件：0～15min为9％流动相A，15～30min为9～29％流动相A；30～35min为29％流动相A。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S4中所述非法添加物为双胍类、磺酰脲类、噻唑烷二酮类或格列奈类中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，S4中所述非法添加物为盐酸二甲双胍、盐酸苯乙双胍、格列吡嗪、甲苯磺丁脲、格列齐特、盐酸吡格列酮、马来酸罗格列酮、格列苯脲、格列美脲、格列喹酮和瑞格列奈。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S6中选用的衍生化试剂为对硝基苯甲酰氯或2,4-二硝基氟苯中的一种或几种。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S7中的对比分析过程如下：待测样品的色谱信息与S4得到的多元色谱指纹图谱进行对比分析，如疑似样品的相似度大于0.9，则不含非法添加物；如疑似样品的相似度小于0.9时，与一维紫外指纹图谱和二维紫外指纹图谱进行对比分析进行对比分析，如相似度≥950，可判定非法添加物的种类。
10.根据其权利要求9所述方法，其特征在于，S7中，如相似度≥980，可判定非法添加物为纯物质。
CN201910701943.XA 2019-07-31 2019-07-31 一种利用多元多维色谱指纹图谱筛查降糖保健品中的非法添加物的方法 Pending CN110514753A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910701943.XA CN110514753A (zh) 2019-07-31 2019-07-31 一种利用多元多维色谱指纹图谱筛查降糖保健品中的非法添加物的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910701943.XA CN110514753A (zh) 2019-07-31 2019-07-31 一种利用多元多维色谱指纹图谱筛查降糖保健品中的非法添加物的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110514753A true CN110514753A (zh) 2019-11-29

Family

ID=68624011

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910701943.XA Pending CN110514753A (zh) 2019-07-31 2019-07-31 一种利用多元多维色谱指纹图谱筛查降糖保健品中的非法添加物的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110514753A (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101285803A (zh) * 2008-03-17 2008-10-15 北京市东城区药品检验所 降糖中药类产品中非法掺入低极性降糖化学药物的定性分析检测方法
CN101581712A (zh) * 2009-06-19 2009-11-18 广东省药品检验所 一种降糖类药品、保健品或食品中添加双胍类化合物的快速检测方法及其应用
CN103645179A (zh) * 2013-11-11 2014-03-19 江苏省食品药品检验所 一种降糖类保健食品、中成药和食品中添加磺脲类化合物的快速检测方法及其应用
CN104991009A (zh) * 2015-07-28 2015-10-21 山东省分析测试中心 用于测定中药及保健品中非法添加物质的方法
CN105158358A (zh) * 2015-08-18 2015-12-16 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 同时检测中成药和保健品中非法添加的42种化学药品的方法
CN107741465A (zh) * 2017-11-27 2018-02-27 浙江公正检验中心有限公司 保健品中18种非法添加降糖降压药物残留量的检测方法
CN109738565A (zh) * 2019-01-31 2019-05-10 徐敦明 一种测定保健食品中非法添加化合物的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101285803A (zh) * 2008-03-17 2008-10-15 北京市东城区药品检验所 降糖中药类产品中非法掺入低极性降糖化学药物的定性分析检测方法
CN101581712A (zh) * 2009-06-19 2009-11-18 广东省药品检验所 一种降糖类药品、保健品或食品中添加双胍类化合物的快速检测方法及其应用
CN103645179A (zh) * 2013-11-11 2014-03-19 江苏省食品药品检验所 一种降糖类保健食品、中成药和食品中添加磺脲类化合物的快速检测方法及其应用
CN104991009A (zh) * 2015-07-28 2015-10-21 山东省分析测试中心 用于测定中药及保健品中非法添加物质的方法
CN105158358A (zh) * 2015-08-18 2015-12-16 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 同时检测中成药和保健品中非法添加的42种化学药品的方法
CN107741465A (zh) * 2017-11-27 2018-02-27 浙江公正检验中心有限公司 保健品中18种非法添加降糖降压药物残留量的检测方法
CN109738565A (zh) * 2019-01-31 2019-05-10 徐敦明 一种测定保健食品中非法添加化合物的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
秦剑红 等: "联用法检测降糖中成药中添加的格列类药品", 《食品与机械》 *
谢秀娟: "HPLC/UPLC-MS/MS多维指纹图谱轮廓技术筛查降糖保健品中非法添加物", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101358953B (zh) 蜂产品中多类农兽药残留同时检测的方法
CN105424850B (zh) 一种石斛药材的检测方法
CN103543224B (zh) 一种阿维菌素和伊维菌素残留的检测方法
CN106546671B (zh) 基于三柱二维液质联用法测定肉制品中残留磺胺类药物的方法
CN108956842A (zh) 一种当归建中汤冻干粉全味药材的快速薄层鉴别方法
CN105467023B (zh) 一种uplc测定穿心莲药材指纹图谱及四种二萜内酯的方法
CN102495167A (zh) 枸杞多糖提取物中枸杞多糖的检测方法
CN104297406A (zh) 一种广谱鉴定β-受体激动剂类药物的方法
CN105548385B (zh) 醒脑静注射液液相指纹图谱的测定方法及其标准指纹图谱
CN106353430A (zh) 一种基于多指标活性成分测定的前列欣胶囊质量评价方法
CN101256176A (zh) 一种色谱峰匹配的分析方法
CN101685089A (zh) 一种快速检测西洋参人参及其制剂质量真伪的方法
CN102539595B (zh) 检测血液或尿液中甲基丙二酸含量的方法
CN107505418B (zh) 一种补肺活血胶囊hplc指纹图谱的构建方法及标准指纹图谱
CN110514753A (zh) 一种利用多元多维色谱指纹图谱筛查降糖保健品中的非法添加物的方法
CN110441445B (zh) 一种鸡冠花hplc特征指纹图谱的构建方法及黄酮类成分含量测定
CN112903887A (zh) 银杏叶滴丸hplc-vwd-elsd特征图谱的建立方法及其特征图谱
CN107991408B (zh) 四味珍层冰硼滴眼液中指标成分含量测定方法
CN103543222A (zh) 一种热毒宁注射液中糖类成分含量的检测方法
CN101334389B (zh) 巴戟天寡糖的含量测定方法
CN100480698C (zh) 一种降压药物的检测方法
CN104792755A (zh) 一种检测连翘酯苷a的组合物及其制备方法
CN108956843A (zh) 一种半夏白术天麻汤冻干粉快速多信息薄层鉴别方法
CN109884222B (zh) 一种小花清风藤的hplc指纹图谱建立方法
CN114577938A (zh) 同时测定松花粉提取物中七种酚类含量的hplc检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191129

RJ01 Rejection of invention patent application after publication