CN104076036B - 检测制品中双胍类物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测制品中双胍类物质的方法。具体地说，涉及一种检测制品中是否添加有双胍类物质的方法，该方法包括以下步骤：(1)取待测的制品适量，与提取溶剂混合，振摇使充分混合，得混合试液；(2)将步骤(1)所得混合试液过滤，得澄清滤液；(3)向步骤(2)所得滤液中加入检测试剂，摇匀，得混合液，目视观察混合液的变化；(4)如果步骤(3)所得混合液出现沉淀，则表示所述制品中添加有双胍类物质；如果所述混合液未出现沉淀，则表示所述制品中未添加有双胍类物质。本发明方法与现有方法相比，成本低、操作过程简单，适用于在基层部门广泛开展。

Description

检测制品中双胍类物质的方法

技术领域

本发明涉及一种药品、保健食品或食品的分析技术领域，尤其涉及一种非常简单的快速筛查药品、保健食品或食品中非法添加的双胍类降糖药的方法。

背景技术

双胍类化合物具有降糖的功效，其作用机理是促进肌肉细胞对葡萄糖的摄取和糖酵解，减少肝脏产生葡萄糖，从而起到抗高血糖作用。我国临床使用的双胍类降糖药物为盐酸二甲双胍和盐酸苯乙双胍。

其中盐酸二甲双胍的化学名为1,1-二甲基双胍盐酸盐，英文名为MetforminHydrochloride，其结构如式(I)所示。其常见别名有“美迪康”、“盐酸甲福明”、“立克糖”等。

盐酸苯乙双胍的化学名为1-(2-苯乙基)双胍盐酸盐，英文名为PhenforminHydrochloride，其结构如式(II)所示。其别名有“降糖灵”、“盐酸苯乙福明”等。

由于盐酸二甲双胍和盐酸苯乙双胍价格低廉，降糖效果确切，常被不法分子添加至药品、保健食品或食品中。但双胍类药物使用时存在不良反应和严格的禁忌症，可能会由于药物的累积引发乳酸性酸中毒，继而导致生命危险。因此对降糖类药品、保健食品或食品等制品中非法添加双胍类化合物的违法行为必须进行长期有效的打击。但这种监督检查涉及范围广，检验量大，在药品监督部门人力物力财力有限的广大农村地区和经济欠发达城市，彻底开展相应监管活动有很大难度。

目前药品检验领域针对这种非法添加双胍类物质的检验方法进行了大量研究，主要有基于高效液相色谱-质谱联用仪和高效液相色谱仪的现代仪器分析法，以及基于薄层色谱和化学反应的快速鉴别法。其中快速鉴别筛查技术以其成本低，覆盖面广等优点而得到了业界许多人士的重视。

例如，公开号为CN101581712A(申请号200910040383.4，公开日2009年11月18日，发明名称为“一种降糖类药品、保健品或食品中添加双胍类化合物的快速检测方法及其应用”)的专利文献公开了一种检测方法：对待测样品首先加入乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷，振摇分散后过滤，弃去滤液，收集过滤物。然后采用浓度为90%～100%的乙醇溶液作为提取试剂对过滤物进行提取。接下来将提取液点样于硅胶板上，最后用等体积的10%亚硝酰铁氰化钠溶液、10%铁氰化钾溶液及10%氢氧化钠溶液混合而成的显色剂进行显色。若样品点样位置出现棕红或红褐色，且5分钟内颜色不发生变化，与双胍类阳性对照品颜色一致，则可判断待测降糖类药品、保健品或食品中含有双胍类化合物。这种方法操作较简单，但步骤略多，从配制溶液和显色剂开始，完成全部操作约耗时10分钟，且使用的有机溶剂二氯甲烷或三氯甲烷易挥发，毒性较大。

公开号为CN101629942A(申请号200910041895.2，公开日2010年1月20日，发明名称为“中成药、保健品和食品中掺杂化学降糖成分的筛查方法”)的专利文献也公开了一种检测方法：对待测样品首先用乙醇溶液溶解，过滤后依次加入硫酸溶液和钼酸铵溶液，摇匀，进行显色反应。三分钟后观察颜色变化，若溶液由浅黄绿色或浅棕色变为墨绿色或紫蓝色则表明样品中掺入了化学降糖成分；其中，化学降糖成分为格列苯脲、格列吡嗪、格列齐特、盐酸吡格列酮、盐酸二甲双胍、格列喹酮、盐酸苯乙双胍或瑞格列奈。虽然这种方法操作相对简单，完成全部操作约耗时5分钟，但由于使用了有腐蚀性的硫酸溶液等化学试剂，该方法更适于有适当防护的专业人员进行操作。

因此，人们仍然需要一种操作更简单、速度更快且更安全、污染更小抗干扰能力更强的检验方法，以便于准确快速的鉴别出药品、保健食品和食品中是否添加双胍类物质。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够快速、简便、安全、和/或低污染地检测怀疑掺有双胍类物质的制品(例如称为药品、保健食品或食品等的制品)中是否含有双胍类物质的方法。本发明人令人惊奇地发现，当使用适当溶剂处理所述制品并取滤液后，向滤液中加入适量的磷钼酸试液，可以方便地在现场对怀疑掺有双胍类物质的制品进行检查，并且方法快速、简便、安全、和/或低污染。本发明基于以上发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了一种检测制品中是否添加有双胍类物质的方法，该方法包括以下步骤：

(1)取待测的制品适量，与提取溶剂混合，振摇使充分混合，得混合试液；

(2)将步骤(1)所得混合试液过滤，得澄清滤液；

(3)向步骤(2)所得滤液中加入检测试剂，摇匀，得混合液，目视观察混合液的变化；

(4)如果步骤(3)所得混合液出现沉淀，则表示所述制品中添加有双胍类物质；如果所述混合液未出现沉淀，则表示所述制品中未添加有双胍类物质。

本发明第一方面的方法还可以称之为是一种检测怀疑掺有双胍类物质的制品中是否含有双胍类物质的方法。

根据本发明第一方面的方法，其中所述的双胍类物质为盐酸二甲双胍和/或盐酸苯乙双胍。

根据本发明第一方面的方法，其中所述制品，或者所述怀疑掺有双胍类物质的制品，其包括非液体的任何欲意给予哺乳动物例如人类的任何人工制成品，特别是人工混合制品，其包括不限于药品、保健食品、食品、食品添加剂等。在一个实施方案中，所述的制品是药品、保健食品。短语“怀疑掺有双胍类物质的制品”是指一种制品，本领域技术人员(特别是健康/卫生/药监主管部门或者其工作人员)主观上或者客观上认为，该制品中可能有意或者无意地掺入有双胍类物质，从而使得该制品能够主要或者次要地产生双胍类物质所具有的生物学效应，例如产生治疗糖尿病的生物学效应。在本发明中，该制品亦可称为样品、检测样品等，本领域技术人员根据本发明的语境理解指代该制品的不同术语所具有的含义，例如使该制品与提取溶剂振摇后，得到的混合液体可以称为混合试液。在本发明中，该制品应是固体，例如粉末或块状物或丸状物或颗粒状物等。

根据本发明第一方面的方法，步骤(1)中所述提取溶剂为质子溶剂，优选为有机溶剂。在一个实施方案中，所述的有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或其组合，或者它们的含其他物质的溶液。该提取溶剂的作用在于使双胍类物质溶解，并提供后续与检测试剂进行化学反应的溶媒。因此任何能够实现该功能的提取溶液均是适用的。在一个实施方案中，所述的有机溶剂为乙醇。在一个实施方案中，所述的有机溶剂为浓度大于75%的乙醇。在一个实施方案中，所述的有机溶剂为浓度大于85%的乙醇。在一个实施方案中，所述的有机溶剂为浓度大于90%的乙醇，例如浓度为90～99.5%的乙醇。出人意料地发现，在使用乙醇时，当浓度低于85%时出现假阴/阳性结果，而当乙醇浓度大于等于90%时检测准确率达100%，即“假阳性和假阴性率”为0%。

根据本发明的方法，在步骤(1)中，所述制品和提取溶剂的量和比例不必作特别的限制，只要制品和提取溶剂混合后，可能存在的双胍类物质溶解在溶剂中并达到本发明方法检测限即可。例如在一个实施方案中，在步骤(1)中的提取溶剂为1～50ml，例如2～10ml，例如5ml；所取的制品的量为0.1～1g，例如0.1～0.5g。根据本发明的方法，其中步骤(1)中待测制品与提取溶剂比为0.1～0.5g:5ml。众所周知，对于以片剂形式或者胶囊剂形式提供的药品、保健品或保健食品，每个片剂或者每粒胶囊剂的重量通常在0.1～0.5g范围内，因此每个片剂或者每粒胶囊剂与5ml提取溶剂混合是非常方便的，并且使用的提取溶剂用量也少，减少浪费。

根据本发明第一方面的方法，步骤(1)中所述振摇使充分混合是通过手振摇，时间可以是0.5～5分钟，一般而言振摇1～2分钟。已经发现，在100余次试验中用手振摇1～2分钟，均未出现假阳性或者假阴性结果。因此在本发明中，步骤(1)中所述振摇是通过手振摇1～2分钟。

根据本发明第一方面的方法，步骤(2)中所述过滤是使用滤纸或者过滤器过滤，例如可以使用商品化的微孔滤膜(例如0.4um规格，在本发明中如未另外说明，试验中均使用此规格滤膜)过滤，过滤的目的在于使混合试液中未溶解的成分去除，得到澄清的溶液。考虑到本发明方法通常适用于市场监督而非用于实验室检测，因此使用微孔滤膜是特点优选的。

根据本发明第一方面的方法，步骤(2)中所述过滤是使用微孔滤膜过滤器，商品化的微孔滤膜过滤器配合医药实验室常用的注射器例如塑料注射器，使用非常方便。即，将步骤(1)所得混合试液抽入注射器中，将商品化的微孔滤膜过滤器套到注射器上，推动注射器使试液从过滤器中滤出，接取澄清的滤液即可，操作极为简单，便于在市场监督中即时操作。

根据本发明第一方面的方法，步骤(2)中接取澄清滤液0.5～2ml用于下一步骤，由于本发明方法相当灵敏，本发明在对100余次检测在发现，在步骤(3)中使用澄清滤液0.5ml(与2-4滴检测试剂)即足够，并且假阴性或假阳性的出现率为0%；试验还发现使用澄清滤液1ml(与2-4滴检测试剂)时假阴性或假阳性的出现率亦为0%。然而尚无法解释的是，当步骤(2)中接取澄清滤液2ml用于下一步骤并与2-4滴检测试剂时，对100余次检测在发现，假阴性或假阳性的出现率达35%。因此，在本发明一个实施方案中，步骤(2)中接取澄清滤液0.5～1ml用于下一步骤。

根据本发明第一方面的方法，步骤(3)中所述检测试剂是磷钼酸试液。在一个实施方案中，所述检测试剂是磷钼酸的水溶液。在一个实施方案中，所述检测试剂是3-7%磷钼酸水溶液。在一个实施方案中，所述检测试剂是4-6%磷钼酸水溶液。在一个实施方案中，所述检测试剂是5%磷钼酸水溶液。本发明已经出人意料地发现，选择适宜浓度的磷钼酸试液对于降低假阴性或假阳性的出现率是有益的。

根据本发明第一方面的方法，步骤(3)中所述检测试剂的加入量是所述滤液量的1/6～1/4，优选1/5。例如，当滤液量为0.5ml时加入2滴检测试剂即可。这样，步骤(3)的操作可以容易地在1ml的塑料管中例如塑料离心管中进行，而这种塑料管极其容易获得并且携带、使用方便。

根据本发明第一方面的方法，步骤(3)中所述摇匀可以容易地通过手工实现，并且摇匀的时间在0.5～1min即可。在本发明中，摇匀后即可观察混合液的变化，即观察是否出现沉淀物。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，如果观察到混合液出现沉淀，则表示所述制品中添加有双胍类物质，为阳性；如果所述混合液未出现沉淀，则表示所述制品中未添加有双胍类物质，为阴性。

根据本发明第一方面的方法，其包括以下步骤：

(1)取待测的制品0.1～0.5g，与提取溶剂(浓度大于90%的乙醇)5ml混合，振摇1～2分钟使充分混合，得混合试液；

(2)将步骤(1)所得混合试液抽入注射器中，用微孔滤膜过滤器过滤，得澄清滤液，取0.5～1ml用于下一步骤；

(3)向步骤(2)所得滤液中加入1/6～1/4滤液体积量的4-6%磷钼酸水溶液，摇匀，得混合液，目视观察混合液的变化；

(4)如果步骤(3)所得混合液出现沉淀，则表示所述制品中添加有双胍类物质，为阳性；如果所述混合液未出现沉淀(无变化)，则表示所述制品中未添加有双胍类物质，为阴性。

如果所述制品被判定为其中可能含有双胍类物质，则该制品可以进一步用其它方法进行检测，例如通过实验室的方法，例如HPLC法等。这样，本发明的方法特别适用于在市场上或者其它检测现场进行更大样本的检测和筛查，并进而减少实验室的工作量。

基于本发明第一方面的方法，本发明第二方面提供了一种试剂盒，其用于检测怀疑掺有双胍类物质的制品中是否含有双胍类物质，或者用于检测制品中是否添加有双胍类物质，所述试剂盒包括：

(i)至少一份提取溶剂，其单独或者共同封装于溶剂瓶中；

(ii)至少一个注射器、至少一个微孔滤膜过滤器、至少一个用于接取滤液的容器(例如塑料管，例如塑料离心管)；

(iii)至少一个装有检测试剂的瓶子；

(iv)使用说明资料，其上记载有使用该试剂盒检测怀疑掺有双胍类物质的制品中是否含有双胍类物质的操作方法。

根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述各组件具有如本发明第一方面任一项所述的特征。

根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述操作方法具有如本发明第一方面任一项所述的特征。

本发明第三方面提供了一种信息说明资料，其中基本上记载了本发明第一方面任一项所述的方法。

在一个实施方案中，该信息说明资料是呈选自下列的形式：纸质文件(包括但不限于文件单页、小册子、刊物)、磁介质、光盘、软盘、电子出版物、网络出版物等，以及它们的组合。

本发明第四方面提供了根据本发明第三方面信息说明资料检测怀疑掺有双胍类物质的制品中是否含有双胍类物质的方法。

本发明第五方面提供了根据本发明第三方面信息说明资料检验怀疑掺有双胍类物质的制品。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。

下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

本文使用的术语“掺”、“掺有”、“掺入”等，它们可以是有意或者无意地向所述制品中加入双胍类物质。

本发明与其它双胍类物质的快速检测方法相比，具有如下优点：

(1)结果判断直观：各种方法的结果判断方式比较如下。与其它专利方法相比较，本发明根据客观检测数值进行结果判断，判定方式直观，不需仔细观察颜色变化趋势，不受复杂样品溶液各种颜色的限制和干扰，不易出现无法判断的情况。

(2)快速：使用本发明进行检测时，操作简单，步骤少，整个过程仅需要不到3分钟(溶解样品仅需0.5～1分钟，过滤10秒，与检测试剂混合、观察1分钟)。而其它方法耗时至少5～10分钟。

(3)简便：与其它文献报道的方法相比，操作更加简便。

(4)安全环保：本发明进行鉴别判断时采用环保试药，而其它专利方法则采用亚硝酰铁氰化钠、铁氰化钾及氢氧化钠配制的有毒溶液，或采用有毒的硫酸溶液和钼酸铵溶液。因此本发明方法在鉴别判断时更加安全环保，对操作人员及环境无任何影响。

(5)检测成本低，便于广泛应用：与现有高效液相色谱法和液/质联用法相比，检测设备价格及运行费用较低、操作过程简单，适用于在基层部门广泛开展。

具体实施方式

下面通过具体的实例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

实施例1、检测药品/保健品中是否含有双胍类物质

1、操作过程：

(1)取待测的制品0.25g，与提取溶剂(浓度95%的乙醇)5ml混合，振摇1分钟使充分混合，得混合试液；

(2)将步骤(1)所得混合试液抽入注射器中，用微孔滤膜过滤器过滤，得澄清滤液，取0.5ml用于下一步骤；

(3)向步骤(2)所得滤液中加入1/5滤液体积量(2滴)的5%磷钼酸水溶液，摇匀10秒，得混合液，目视观察混合液的变化；

(4)如果步骤(3)所得混合液出现沉淀，则表示所述制品中添加有双胍类物质，为阳性；如果所述混合液未出现沉淀(无变化)，则表示所述制品中未添加有双胍类物质，为阴性。

本发明人在市场监督中从市场上抽查了125个品种/批次的标示有降血糖功能但是未标明有二甲双胍和/或苯乙双胍的药品、保健品、和保健食品的制品，均为片剂或胶囊剂，每片(或每粒约250mg)。使用以上方法进行现场检查；另外将这些样品带回到实验室进行HPLC检查(使用该品种的质量标准的HPLC条件，其它众多文献公开的HPLC方法亦可使用)，以再次确定这些制品哪些含有胍类化合物，哪些不含胍类化合物(这些试样中，有33个试样含有二甲双胍，有52个加有苯乙双胍，其余未加胍类化合物)；HPLC结果可用于确定对于每一试样通过本发明方法检测所得结果是否有假阳性或假阴性。

使用本发明上述方法，经检测，125个制品均未出现假阳性和假阴性的结果，其可用“假阳性和假阴性率”表示，为0%。

实施例2：对实施例1操作细节进行改变的检测试验

实施例2a：操作方法基本上同实施例1，不同的仅仅是分别使用浓度50%、70%、85%、90%、99.5%的乙醇进行操作。五种乙醇浓度处理试样并测定125个试样，结果假阳性和假阴性率分别为41%、29%、7%、0%、0%。可见使用90%以上乙醇处理是有益的。

实施例2b：操作方法基本上同实施例1，不同的仅仅是在步骤(1)中分别取待测的制品0.1g或0.5g待检制品进行操作。对125个试样进行测定，两种情况下，假阳性和假阴性率分别均为0%。可见使用待测制品与提取溶剂比为0.1～0.5g:5ml是可行的。

实施例2c：操作方法基本上同实施例1，不同的仅仅是在步骤(1)中振摇2分钟，对125个试样进行测定，结果假阳性和假阴性率为0%。

实施例2d：操作方法基本上同实施例1，不同的仅仅是在步骤(3)中分别使用2%、3%、4%、6%、7%、8%的磷钼酸水溶液进行操作。对125个试样进行测定，六种情况下，假阳性和假阴性率分别为27%、9%、0%、0%、5%、19%。可见使用4-6%磷钼酸水溶液是有益的。

实施例2e：操作方法基本上同实施例1，不同的仅仅是在步骤(3)中分别使用1/7、1/6、1/4、1/3滤液体积量的5%磷钼酸水溶液进行操作。对125个试样进行测定，四种情况下，假阳性和假阴性率分别为8%、0%、0%、11%。可见使用1/6～1/4滤液体积量的磷钼酸水溶液是有益的。

实施例2f：操作方法基本上同实施例1，不同的仅仅是在步骤(1)中分别使用甲醇、乙酸乙酯、丙酮作为提取溶剂进行操作。对125个试样进行测定，三种情况下，假阳性和假阴性率分别为18%、34%、27%。可见使用其它溶剂不能实现本发明目的。

本发明通过上文对本发明的各个方面作了详细的说明，然而本发明并不限于这述这些具体实施方案，本发明的精神和范围应以所附权利要求书为准。本发明的方法不需要过滤样品溶液，检测全过程仅耗时2～3分钟，具有快速、简便、安全、灵敏度高等优点。

Claims (9)

1.检测制品中是否添加有双胍类物质的方法，该方法包括以下步骤：

(1)取待测的制品适量，与提取溶剂90~99.5%乙醇混合，通过手振摇1~2分钟使充分混合，得混合试液；

(2)将步骤(1)所得混合试液过滤，得澄清滤液，接取澄清滤液0.5~1ml用于下一步骤；

(3)向步骤(2)所得滤液中加入检测试剂4-6%磷钼酸试液，摇匀，得混合液，目视观察混合液的变化；

(4)如果步骤(3)所得混合液出现沉淀，则表示所述制品中添加有双胍类物质；如果所述混合液未出现沉淀，则表示所述制品中未添加有双胍类物质。

2.根据权利要求1的方法，其中所述双胍类药物为盐酸二甲双胍或盐酸苯乙双胍。

3.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)中待测制品与提取溶剂比为0.1~0.5g:5ml。

4.根据权利要求1的方法，步骤(2)中所述过滤是使用滤纸或者过滤器过滤。

5.根据权利要求1的方法，步骤(2)中所述过滤是使用微孔滤膜过滤器。

6.根据权利要求1的方法，步骤(3)中所述检测试剂是5%磷钼酸试液。

7.根据权利要求1的方法，步骤(3)中所述检测试剂的加入量是所述滤液量的1/6~1/4。

8.根据权利要求1的方法，步骤(4)中，如果观察到混合液出现沉淀，则表示所述制品中添加有双胍类物质，为阳性；如果所述混合液未出现沉淀，则表示所述制品中未添加有双胍类物质，为阴性。

9.根据权利要求1的方法，其包括以下步骤：

(1)取待测的制品0.1~0.5g，与浓度90~99.5%的乙醇5ml混合，振摇1~2分钟使充分混合，得混合试液；

(2)将步骤(1)所得混合试液抽入注射器中，用微孔滤膜过滤器过滤，得澄清滤液，取0.5~1ml用于下一步骤；

(3)向步骤(2)所得滤液中加入1/6~1/4滤液体积量的4-6%磷钼酸水溶液，摇匀，得混合液，目视观察混合液的变化；

(4)如果步骤(3)所得混合液出现沉淀，则表示所述制品中添加有双胍类物质，为阳性；如果所述混合液未出现沉淀，则表示所述制品中未添加有双胍类物质，为阴性。