CN110412284B - 一种吡格列酮检测装置及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中成药及保健品安全检测技术领域，具体涉及一种吡格列酮检测装置，包括试纸条和反应杯；其中，所述试纸条包括检测线和质控线，所述检测线包含吡格列酮偶联抗原，所述质控线包含抗吡格列酮抗体；所述反应杯包含胶体金标记的吡格列酮抗体。该装置具有灵敏度高、特异性好、快速简便的优势，能够满足对吡格列酮残留量检测需求，具有使用方便、经济快捷、制作容易、成本低廉的特点。
Description
技术领域
本发明属于中成药及保健品安全检测技术领域，具体涉及一种吡格列酮检测装置及其应用。
背景技术
噻唑烷二酮类化合物(TZDs)，是一类常用的降糖药物，可改善胰岛素抵抗，增加人体组织对胰岛素的敏感性，临床上用于治疗二型糖尿病，能显著改善胰岛素抵抗及相关代谢紊乱。降糖药物属于处方药，根据其适应症有严格的服用剂量，而非法添加降糖药物存在剂量、种类、药物相互作用、禁忌不明等风险，具有较强的潜在危害性。随着糖尿病患病率的逐年上升，“纯天然”、“中药调理”、“老中医偏方”等宣传点切中了大批患者尤其是老年患者盲目求效的心理，一些不法分子为了达到让原本疗效缓慢的中药制剂起到速效、特效的作用，不考虑剂量及适用症地添加西药成分。患者由于不了解添加情况，很可能同时服用其他的降糖药物，在联合用药的情况下降糖效果易产生放大作用，容易造成低血糖甚至低血糖休克、死亡，或导致血糖值反复大波动，加速、加重糖尿病并发症。根据2011～2012年广东省药品检验所对吡格列酮中成药、保健品的专项抽检监测结果分析，非法添加降糖化学成分主要为格列苯脲、苯乙双胍、二甲双胍、罗格列酮、格列美脲、吡格列酮等。其中在检出的阳性样品中噻唑烷二酮类占阳性成分的62.5％，且大部分存在多组分联合添加的情况。
吡格列酮，是目前应用最广泛的噻唑烷二酮类化合物(TZDs)，临床不良反应有增加体重、增加骨折风险、增加心血管不良反应、诱发肺水肿、与磺脲类和胰岛素联用增加低血糖风险等。服用非法添加吡格列酮的保健食品、中成药等对老年糖尿病患者群体的安全性隐患相当大。现有吡格列酮的检验方法有液相色谱(LC)、高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)，以及薄层色谱法(TLC)、近红外光谱法(NIR)、拉曼光谱法(Raman spectroscopy，RS)等。LC和LC-MS/MS检测具有精度高、分离效率高、选择性好、假阳性率低、重现性好等优点，但操作复杂、设备昂贵，对操作人员技术要求高，且不能立即显示结果等问题，不适用于快速的在线检测和监控。TLC、NIR及RS，操作简单，分析速度快，但灵敏度差，多个成分之间经常会有干扰，专属性不好，且中成药及复杂食品基质容易出现假阳性的情况，一般需要运用专属性更高的方法予以进一步确认。因此，本领域亟需一种快速简便，灵敏度高，可检测保健食品或声称具有相应保健功效的食品、中成药中掺有吡格列酮降糖成分的快速检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性好、快速简便的检测中成药及保健食品等类似物品中吡格列酮的快速检测装置及其应用。
本发明所采用的技术方案是：
一种吡格列酮检测装置，包括试纸条和反应杯；其中，所述试纸条包括检测线(T线)和质控线(C线)，所述检测线包含吡格列酮偶联抗原，所述质控线包含抗吡格列酮抗体；所述反应杯包含胶体金标记的吡格列酮抗体。
进一步地，所述检测线由吡格列酮偶联抗原线状点样制得；所述质控线由抗吡格列酮的抗体线状点样制得。
进一步地，所述吡格列酮偶联抗原包括偶联的吡格列酮半抗原和载体。
进一步地，所述载体为人血清蛋白、牛血清蛋白、血蓝蛋白或卵清蛋白；优选地，所述载体为人血清蛋白。
进一步地，所述吡格列酮半抗原具有式(I)所示的结构：
进一步地，所述吡格列酮半抗原的制备方法，包括以下步骤：吡格列酮、溴乙酸乙酯和碳酸钠于二甲基甲酰胺中反应，旋蒸，萃取，提纯得吡格列酮中间体；吡格列酮中间体溶于甲醇与氢氧化钠反应，调pH值，萃取，提纯得吡格列酮半抗原。
进一步地，所述吡格列酮偶联抗原具有式(II)所示的结构：
进一步地，所述吡格列酮偶联抗原的制备方法，包括以下步骤：
1)吡格列酮半抗原溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌过夜，离心取上清A液；
2)载体溶于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，加入二甲基甲酰胺，得B液；
3)A液缓慢滴入B液中，反应后离心取上清，透析后得吡格列酮偶联抗原。
进一步地，所述吡格列酮抗体来源于哺乳动物；优选地，所述吡格列酮抗体来源于鼠、兔、羊；更优选地，所述吡格列酮抗体为鼠源单克隆抗体。
进一步地，所述抗吡格列酮抗体来源于哺乳动物；优选地，所述抗吡咯列酮抗体来源于鼠、兔、羊；更优选地，所述抗吡格列酮抗体为羊源多克隆抗体；更优选地，所述抗吡格列酮抗体为羊抗鼠lgG抗体。所述抗吡格列酮抗体与吡格列酮抗体结合。
进一步地，所述试纸条包括底板，以及沿样品流动方向依次铺设在所述底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述硝酸纤维膜上包含所述检测线和所述质控线。
进一步地，所述样品垫为聚对苯二甲酸丙二酯纤维样品垫、聚对苯二甲酸-1,4-环己二甲酯纤维样品垫或聚对苯二甲酸乙二酯纤维样品垫中的一种；所述吸水纸为脱脂棉吸水纸或硅胶吸水纸；所述底板为PVC底板或PE底板。
进一步地，所述胶体金标记的吡格列酮抗体的制备方法，包括以下步骤：
调节胶体金溶液pH值至弱碱性，搅拌状态下，逐滴加入吡格列酮抗体，后加入与吡格列酮抗体等量的聚乙二醇(PEG)反应，继续加入与吡格列酮抗体等量的牛血清蛋白(BSA)，反应后得胶体金标记的吡格列酮抗体。
进一步地，所述胶体金采用柠檬酸三钠还原法制备得到。
本发明还提供一种上述吡格列酮检测装置的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备硝酸纤维膜，在所述硝酸纤维膜上形成检测线和质控线；
(2)制备试纸条，在底板上沿样品流动方向依次铺设样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；
(3)制备反应杯，所述反应杯中含有胶体金标记的吡格列酮抗体；
(4)将制备得到的试纸条和反应杯组合在一起，即为吡格列酮检测装置。
本发明还提供一种检测吡格列酮的方法，所述方法包括使用所述的吡格列酮快速检测装置。
本发明还提供一种检测吡格列酮的试剂盒，所述试剂盒包括所述试纸条和所述反应杯。
本发明还提供一种上述吡格列酮快速检测装置、上述检测吡格列酮的方法和上述检测吡格列酮的试剂盒在噻唑烷二酮类化合物检测中的应用，优选地，在中成药或保健样品中吡格列酮检测中的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明提供了一种吡格列酮速检测装置，检测原理是使被检测物质首先与胶体金标记的吡格列酮抗体发生竞争形式的结合；利用样品垫形成的毛细管虹吸效应，渗入试纸条，当胶体金标记的吡格列酮抗体过量时，多余的抗体泳动到检测线，与吡格列酮偶联抗原结合并显色；而与检测物结合的胶体金标记的吡格列酮抗体，其V区结合位点被检测物质占据，只能跨越检测线泳动到质控线与羊抗鼠IgG抗体非特异性结合，同检测线进行比色而得到检测结果。
2、本发明提供了一种吡格列酮检测装置，试纸中检测线与质控线比色来半定量检测样品中的吡格列酮残留量，快速、准确、操作方便，能够满足健康产品对吡格列酮残留量检测需求，能满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要，具有使用方便、经济快捷、制作容易、成本低廉的特点。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为吡格列酮检测装置示意图，(A)为试纸条示意图，(B)为反应杯示意图；
图2为吡格列酮单克隆抗体SDS电泳图；
图3为实施例9的检测结果判读示意图；
图4为实施例10的检测结果判读示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1吡格列酮半抗原的制备
在100mL三颈瓶中依次加入3.53g吡格列酮、1.52g溴乙酸乙酯和0.1g碳酸钠，于45mLDMF溶液中90℃反应过夜。反应液旋蒸，加水，用稀盐酸将溶液调为微酸性后用乙酸乙酯萃取2～3遍，合并有机相，蒸干后拌样，过柱提纯得中成药及保健食品中吡格列酮中间体。
将吡格列酮中间体溶于10mL甲醇中再加入20mL 10％氢氧化钠溶液，60℃搅拌反应5h，加水，用稀盐酸将溶液调为微酸性后乙酸乙酯萃取2～3遍，合并有机相，蒸干后拌样，过柱提纯得吡格列酮半抗原。
吡格列酮半抗原具有式(I)所示的结构：
实施例2吡格列酮偶联抗原的制备
取实施例1制备得到的吡格列酮半抗原0.1mmol溶于2mL DMF中，搅拌加入0.2mmolDCC和0.15mmol NHS，4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清液为A液。称取血蓝蛋白(KLH)140mg溶于10mL浓度为0.1mol/L的PBS(pH8.0)中，加入DMF1mL，搅拌溶解制备B液，磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h，反应液离心后取上清，4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液，既得吡格列酮偶联抗原。得到的偶联抗原以1mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中，冻存于-20℃冰箱中；吡格列酮偶联抗原具有式(II)所示的结构：
实施例3吡格列酮单克隆抗体的制备
取实施例2制备得到的吡格列酮偶联抗原免疫4只6周龄的BALB/C小鼠，加强免疫三次后，采血测效价，待血清效价不再上升，用两倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠。三天后脱颈处死小鼠，在无菌条件下取脾脏制备脾细胞，与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按8:1的比例混合于50mL离心管，加入30mL无血清IPMI1640培养基，1100r/min离心5min弃上清，将细胞团轻轻振松，置于37℃水浴中。把1mL50％PEG-4000缓缓加入细胞中，在1min内滴完，同时轻轻搅动底部沉淀，静置1min后，前30s沿管壁缓慢匀速加入无血清培养基1mL，后30s加入2mL，然后快速加入27mL终止融合过程，1100r/min离心5min，弃上清。用HAT选择性培养基重悬后加到已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，在37℃、体积分数5％的CO2条件下培养。7天后换成HT培养液，待每孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，用间接ELISA法筛选，选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化。经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩大培养，以备单克隆抗体的制备。
采用体内诱生腹水法生产吡格列酮单克隆抗体。选4只昆明小鼠，腹腔注射液体石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞3～5×106/只。10天后，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水。用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水，经SDS电泳图测定吡格列酮单克隆抗体的纯度，结果如图2所示，单抗纯度大于88％。
实施例4胶体金标记的吡格列酮单克隆抗体的制备
胶体金的制备
取1％氯金酸溶液1mL，加99mL超纯水成终浓度0.01％的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1％柠檬酸三钠1.6mL一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积，得到胶体金溶液。
胶体金标记的吡格列酮单克隆抗体的制备
调节胶体金溶液pH值至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入实施例3制备得到的吡格列酮的单克隆抗体，1h后加入与吡格列酮的单克隆抗体等量的PEG，充分反应30min后加入与吡格列酮的单克隆抗体等量的BSA，加完后，继续搅拌30min。在9000rpm下离心30min获得均一性胶体金标记的吡格列酮单克隆抗体沉淀，再加PNPB重悬备用。
实施例5抗吡格列酮抗体的制备
以羊作为免疫动物，取实施例3制备得到的鼠源吡格列酮单克隆抗体，对无病原体羊进行免疫，连续免疫4～5次，每次间隔4～8周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测其定效价达到105以上时，采血并分离收集高免血清，以饱和硫酸铵盐析法提取羊抗鼠IgG抗体，即得到可以与吡格列酮单克隆抗体结合的抗吡格列酮抗体，-20℃冻存备用。
实施例6吡格列酮快速检测装置的制备
制备硝酸纤维素膜：在该硝酸纤维素膜上用实施例2制备得到的吡格列酮偶联抗原进行线性点样形成检测线，用实施例5制备得到的与吡格列酮抗体结合的羊抗鼠lgG抗体进行线性点样形成质控线；
制备试纸条：在底板上沿样品流动方向依次铺设样品垫、制备好的硝酸纤维素膜和吸水纸。
制备反应杯：将实施例4制备得到的胶体金标记的吡格列酮单克隆抗体加入反应杯，冻干。
将制备得到的试纸条和反应杯组合在一起，即为吡格列酮快速检测装置。
实施例7使用实施例6制备的装置检测固体样品中的吡格列酮
取固体样品约0.1g，加10mL水充分搅拌。静置2min后，取上述样品试液1mL，用Tris-PBS缓冲溶液稀释10倍，摇匀备用。滴加上述样品稀释试液于反应杯中，混匀，随后插入试纸条，于20-40℃反应6min。取出试纸条，进行结果判读。若T线与C线同时显示紫红色条带，则结果为阴性，说明样品中不含吡格列酮；若T线颜色比C线浅或C线显色而T线不显色，则结果为阳性，说明样品中含有吡格列酮；若C线、T线均不显色，则检测装置已失效。
实施例8使用实施例6制备的装置检测液体样品中的吡格列酮
取液体样品1mL，用Tris-PBS缓冲溶液稀释10倍，摇匀备用。滴加上述样品稀释试液于反应杯中，混匀，随后插入试纸条，于20-40℃反应6min。取出试纸条，进行结果判读。若T线与C线同时显示紫红色条带，则结果为阴性；若T线颜色比C线浅或C线显色而T线不显色，则结果为阳性；若C线、T线均不显色，则检测装置已失效。
实施例9吡格列酮快速检测装置的灵敏度
设置系列浓度梯度的吡格列酮，用该吡格列酮快速检测装置进行检测，结果如图3所示，液体和固体样品的检测灵敏度均为0.5μg/mL。
实施例10吡格列酮快速检测装置的特异性实验
在阴性的液体样品中，分别加入噻唑烷二酮类化合物(吡格列酮0.5μg/mL，罗格列酮0.5μg/mL)，盐酸二甲双胍1.0μg/mL，盐酸苯乙双胍1.0μg/mL，盐酸丁二胍1.0μg/mL，格列本脲1.0μg/mL，格列吡嗪1.0μg/mL，瑞格列奈1.0μg/mL，那格列奈1.0μg/mL。实验结果如图4所示，可以看出，只有加入吡格列酮、罗格列酮的样品能够检出，而加入双胍类降糖药物(盐酸二甲双胍，盐酸苯乙双胍，盐酸丁二胍)、磺脲类降糖药物(格列本脲、格列吡嗪)、格列奈类降糖药物(瑞格列奈，那格列奈)的样品无法检出，说明本检测装置对噻唑烷二酮类化合物中的吡格列酮和罗格列酮的特异性较好，对其它类型解热镇痛药物的交叉反应较少。
实施例11吡格列酮检测装置的保质期实验
用三批常规生产的吡格列酮检测装置分别做保质期实验，放置于室内室温环境保持，每隔1个月取12个装置，用质控样本检测，分别做阴性，0.5μg/mL，1μg/mL和10μg/mL样品，重复三次，观察数据变化，考察保质期时间。阴性显色从13个月开始下降，在1年时间内产品品质无明显变化，因此确定保质期为1年。
本领域技术人员应该理解的是，本发明并不受限于上述特定的描述。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求书所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。
Claims (9)
1.一种吡格列酮检测装置，其特征在于，包括试纸条和反应杯；其中，
所述试纸条包括检测线和质控线，所述检测线包含吡格列酮偶联抗原，所述质控线包含能与吡格列酮抗体结合的抗体；
所述反应杯包含胶体金标记的所述吡格列酮抗体；
所述吡格列酮偶联抗原包括偶联的吡格列酮半抗原和载体；
所述载体为人血清蛋白、牛血清蛋白、血蓝蛋白或卵清蛋白；
所述吡格列酮半抗原具有式(I)所示的结构：
所述吡格列酮抗体由所述吡格列酮偶联抗原制备得到。
2.根据权利要求1所述的吡格列酮检测装置，其特征在于，所述载体为人血清蛋白。
3.根据权利要求1～2中任一项所述的吡格列酮检测装置，其特征在于，所述吡格列酮抗体为鼠源单克隆抗体。
4.根据权利要求1～2中任一项所述的吡格列酮检测装置，其特征在于，所述能与吡格列酮抗体结合的抗体为鼠源、兔源或羊源多克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的吡格列酮检测装置，其特征在于，所述试纸条包括底板，以及沿样品流动方向依次铺设在所述底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述硝酸纤维膜上包含所述检测线和所述质控线。
6.一种检测吡格列酮的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1～5中任一项所述的吡格列酮检测装置检测吡格列酮。
7.一种检测吡格列酮的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～5任一项所述的试纸条和权利要求1～5中任一项所述的反应杯。
8.一种如权利要求1～5中任一项所述的吡格列酮检测装置、如权利要求6所述的检测吡格列酮的方法和如权利要求7所述的检测吡格列酮的试剂盒在噻唑烷二酮类化合物检测中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为在中成药或保健样品中吡格列酮检测中的应用。
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| CN (1) | CN110412284B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101285803A (zh) * | 2008-03-17 | 2008-10-15 | 北京市东城区药品检验所 | 降糖中药类产品中非法掺入低极性降糖化学药物的定性分析检测方法 |
| CN101538266A (zh) * | 2009-04-27 | 2009-09-23 | 华南农业大学 | 罗格列酮半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用 |
| CN102353747A (zh) * | 2011-06-30 | 2012-02-15 | 广东省药品检验所 | 一种中成药、保健食品中罗格列酮或吡格列酮的检测方法 |
| CN104483445A (zh) * | 2014-12-03 | 2015-04-01 | 广东省食品药品检验所 | 一种噻唑烷二酮快速检测试剂盒及其检测方法 |
| CN108362881A (zh) * | 2018-01-30 | 2018-08-03 | 广东省药品检验所（广东省药品质量研究所、广东省口岸药品检验所） | 一种吡唑酮类解热镇痛药物的胶体金快速检测试装置及其制备方法和用途 |
-
2019
- 2019-07-03 CN CN201910592263.9A patent/CN110412284B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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