CN108362881A - 一种吡唑酮类解热镇痛药物的胶体金快速检测试装置及其制备方法和用途 - Google Patents

一种吡唑酮类解热镇痛药物的胶体金快速检测试装置及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种吡唑酮类解热镇痛药物的胶体金快速检测试装置及其制备方法和用途。该装置包括吡唑酮类解热镇痛药物胶体金试纸条及反应杯两部分。其中吡唑酮类解热镇痛药物胶体金试纸条包括：底板及底板上沿同一方向依次铺设的样品垫，硝酸纤维素膜及吸水纸，所述硝酸纤维素膜上标记有检测线T线及质控线C线。反应杯中包括吡唑酮类解热镇痛药物的胶体金标记抗体。本发明所述胶体金检测装置能够有效检测吡唑酮类解热镇痛药物(如安乃近、氨基比林、安替比林、异丙安替比林、4‑甲氨基安替比林等)，具有特异性好、灵敏度高、操作简便、可实现现场快速检测等优点，能更好的满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要。

Description

一种吡唑酮类解热镇痛药物的胶体金快速检测试装置及其制 备方法和用途
技术领域
本发明专利公开一种胶体金检测装置及其制备方法，旨在提供一种快速简便，灵敏度高，可同时检测吡唑酮类解热镇痛药物(如安乃近、氨基比林、安替比林、异丙安替比林、4-甲氨基安替比林等)的快筛试剂盒，适用于健康产品中非法添加吡唑酮类解热镇痛药物的现场测定，属于生物检测技术领域。
背景技术
近年来，中成药、保健食品及食品等健康产品中非法添加现象层出不穷，其中，镇痛类健康产品已成为非法添加的重灾区，一直是分析领域的研究热点[1-3]。由于解热镇痛抗炎药物是一类具有抗炎、抗风湿和解热镇痛等作用的药物，具有起效迅速、疗效显著的特点，该类药物已成为镇痛类健康产品中非法添加的主要成分[4-8]。
申请人对标称具有解热镇痛功效的中成药、保健食品、食品中非法添加化学药物开展风险监测，发现存在非法添加吡唑酮类解热镇痛药物的情况。吡唑酮类解热镇痛药物具有解热作用显著、镇痛效果强、价廉易得等特点[9]，但其不良反应较多，如安乃近可引起过敏性皮疹、药物热，严重者会出现剥脱性皮炎、再生障碍性贫血[10]；氨基比林可引起粒细胞减少或再生障碍性贫血，产生致癌物亚硝胺[11,12]。因此，凉茶中非法添加吡唑酮类解热镇痛药物存在较大的食品安全隐患。
目前，关于健康产品中非法添加吡唑酮类解热镇痛药物的研究较少，吡唑酮类解热镇痛药的检验方法主要有高效液相色谱法[13]、液相色谱串联质谱法[14]、薄层色谱法[15]、分光光度法[16]、毛细管色谱法[17]等。以上大型仪器方法操作繁琐、检验时间长，不满足现场快速检测的需求。与之相比，本发明专利应用免疫学测定方法，具有特异性好、灵敏度高、操作简便、可实现现场快速检测等优点，能更好的满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要。
[1]吴晓敏，史大军，王明娟，等.止痛止痒类中成药中非法添加化学药物的快速鉴定方法.中成药,2014,36(10):2095-2100
[2]王震红，杨永刚，刘东辉，等.2011年辽宁省中成药及保健食品中非法添加化学药品检验结果分析.中国药事,2012,26(9):929-930
[3]蔡霞，雷毅.我国膏贴类医疗器械产品监管工作存在的问题及对策.中国药房,2013,24(44):4222-4224
[4]巩丽萍，田晨颖，郭常川，等.超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱快速筛查及定量分析中成药或保健品中非法添加的24种消炎止痛类化学成分.中国药学杂志,2015,50(24):2154-2159
[5]吴小红，李焕德，吴高芬，等.HPLC-DAD法同时测定部分中成药及保健品中添加的9种解热镇痛药物.药物分析杂志,2010,30(10):1865-1868
[6]汪元符，抗炎抗风湿功效中成药中非法添加非甾体抗炎药及激素类成分的检测.中国执业药师,2015,12(11):19-26
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[8]温家欣，陈林，赖宇红，等.高效液相色谱法同时快速测定凉茶中11种非法添加化学药物.分析测试学报,2016,35(3):285-291
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[10]侯春霞等.浅谈解热镇痛药的合理应用.基层医学论坛，2012,16(29):3909-3010
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[12]王静.浅谈解热镇痛药的合理使用.中国现代药物应用，2010,4(5):140
[13]郝利华等.HPLC-PDA法同时测定黄芪多糖注射液中非法添加的四种解热镇痛类药物.中国兽药杂志，2012,46(8):28-31
[14]潘炜等.LC-MS/MS法测定中成药制剂中23个非甾体抗炎药.药物分析杂志，2012,32(2):261-266
[15]郝利华等.薄层色谱法快速筛选黄芪多糖注射液中非法添加的化学物质.中国兽药杂志，2012,46(5):29-30
[16]张克良等.三波长分光光度法测定脑清片中氨基比林和咖啡因含量.中国药品标准，2001,2(2):35-36
[17]赵艳芳等.微乳液毛细管电动色谱快速分析解热镇痛药中的有效成分.分析实验室，2012,31(4):90-93
发明内容
为了克服目前技术不能现场快速检测的问题，本发明的目的在于提供一种使用方便，快速简便，灵敏度和准确度高，可现场测定吡唑酮类解热镇痛药物的胶体金检测装置及其制备方法与用途。
本发明的目的在于提供一种吡唑酮类解热镇痛药物的胶体金快速检测试装置及其制备方法和用途。
本发明所采取的技术方案是：
一种吡唑酮类解热镇痛药物的胶体金检测装置，该装置包括试纸条和反应杯两部分：其中试纸条包括底板，沿同一方向依次铺设的样品垫，硝酸纤维素膜和吸水纸，硝酸纤维素膜上含有检测线和质控线；反应杯内含有胶体金标记的吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体。
进一步的，所述检测线为能与吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体结合的吡唑酮类解热镇痛药物偶联抗原。
进一步的，所述质控线为能与吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体结合的兔抗鼠抗体。
上述吡唑酮类解热镇痛药物的胶体金检测装置的制备方法，包括以下步骤：
制备硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线；所述检测线为能与吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体结合的吡唑酮类解热镇痛药物偶联抗原在硝酸纤维素膜上进行线状点样制得；所述质控线为能与吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体结合的兔抗鼠抗体在硝酸纤维素膜上进行线状点样制得；
组装试纸条：在底板上沿同一方向依次搭接粘贴样品垫，硝酸纤维素膜及吸水纸；
制备反应杯：反应杯中含有胶体金标记吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体。
进一步的，所述胶体金标记吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体的制备方法为：调节胶体金溶液pH值至7～9，边搅拌边滴加吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体，0.5～1.5h后加入抗体量相当的PEG，反应20～35min后加入抗体量相当的BSA，继续搅拌20～35min，离心获得均一性胶体金标记吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体沉淀，再加PNPB重悬。
进一步的，所述胶体金的制备方法为：取0.5～1.5％氯金酸溶液0.5～1.5ml，加90～100ml超纯水制成氯金酸溶液，加热沸腾后，取0.5～2％柠檬酸三钠1.0～2ml迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热4～6min，室温冷却，补充失水至原体积。
进一步的，所述吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体的制备方法为：使用吡唑酮类解热镇痛药物免疫抗原免疫小鼠，加强免疫后，采血测效价，待血清效价不再上升，用1.8～2.2倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，3～4天后脱颈致死小鼠，在无菌条件下制备脾细胞，与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按7～9:1的比例混合，加入无血清IPMI1640培养基，离心弃上清，将细胞团轻轻振松，置于36～38℃水浴中；往细胞培养液中滴入0.025～0.05倍体积的45～55％v/v PEG-4000，同时轻轻搅动底部沉淀，静置0.8～1.2min后，25～35s内沿管壁缓慢加入0.025～0.05倍体积的无血清细胞培养基，然后再在25～35s内加入0.05～0.1倍体积的无血清细胞培养基，然后快速加入0.7～1.2倍体积的无血清细胞培养基终止融合过程，离心弃上清，用HAT选择性培养基重悬后加到已铺有饲养细胞的细胞培养板中，36.8～37.3℃、体积分数4.8～5.2％的CO2条件下培养；6.5～7.5天后换成HT培养液，杂交细胞数量达到300个以上时，筛选强阳性、细胞生长旺盛的细胞进行有限稀释克隆化，经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞；
将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备，采用体内诱生腹水法生产抗吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体；在小鼠腹腔注射液体石蜡油0.48～0.52mL/只，6.5～8.5天后腹腔注射杂交瘤细胞3～5×106/只，9～11天后，收集腹水，用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水，得抗吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体。
进一步的，所述吡唑酮类解热镇痛药物免疫抗原的制备方法为：取吡唑酮类解热镇痛药物半抗原0.08～0.12mmol溶于1.5～2.5mLDMF中，搅拌加入0.18～0.22mmol DCC和0.1～0.2mmol NHS；2～6℃搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液；
称取血蓝蛋白KLH 130～150mg溶于PBS中，加入DMF 0.8～1.2mL，混匀得B液；
搅拌条件下，将A液滴入B液中，2～6℃反应10～14h，离心取上清，用生理盐水透析2～4天，每天更换2～5次透析液，得吡唑酮类解热镇痛药物免疫抗原。
进一步的，吡唑酮类解热镇痛药物偶联抗原的制备方法为：取吡唑酮类解热镇痛药物半抗原0.08～0.12mmol溶于1.5～2.5mLDMF中，搅拌加入0.18～0.22mmol DCC和0.1～0.2mmol NHS，2～6℃搅拌反应过夜，离心取上清得A液；
称取人血清蛋白HSA130～150mg溶于PBS中，加入DMF 0.8～1.2mL，混匀得B液；
搅拌条件下，将A液滴入B液中，2～6℃反应10～14h，离心取上清，用生理盐水透析2～4天，每天更换2～5次透析液，得到吡唑酮类解热镇痛药物偶联抗原。
进一步的，所述吡唑酮类解热镇痛药物半抗原的制备方法为：将3～4份安乃近，1～2份溴乙酸，0.05～0.15份碳酸钠，于乙腈溶液中80～954℃反应过夜，旋蒸完后，加水，用稀盐酸将溶液pH调为5.5～6.8后，用乙酸乙酯萃取2～4遍，合并有机相，蒸干后拌样，过柱提纯得吡唑酮类解热镇痛药物半抗原。
进一步的，所述兔抗鼠抗体的制备方法为：用载体蛋白结合抗原免疫新西兰白兔，免疫剂量为50～100μg/次，背部皮下分多点注射；首免，用合成的人工抗原与等量弗氏完全佐剂乳化；加强免疫，用合成的人工抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，连续免疫4～5次，每次间隔4～8周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测其定效价达到105以上时，采血并分离收集高免血清，以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，冻存备用。
一种检测吡唑酮类解热镇痛药物的方法，包括以下步骤：吸取样本待测液滴到反应杯中，混匀，插入试纸条，20-40℃孵育3～8分钟；取出试纸条，进行结果判读；若T线与C线同时显示紫红色条带且T线颜色比C线深，则结果为阴性；若T线颜色比C线浅或C线显色而T线不显色，则结果为阳性；若C线、T线均不显色，则检测装置已失效。
进一步的，所述吡唑酮类解热镇痛药物包括安乃近、氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林。
本发明的有益效果是：
本发明应用层析式免疫胶体金原理，试纸中检测线与质控线线比色来半定量检测样品中的吡唑酮类解热镇痛药物残留量，在短时间内快速准确地检测出样品是否含有吡唑酮类解热镇痛药物(如安乃近、氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林等)，能够满足健康产品对吡唑酮类解热镇痛药物残留量检测需求，能满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要。本发明与现有技术相比，具有使用方便、经济快捷、制作容易、成本低廉的特点。
附图说明
图1是本发明吡唑酮类解热镇痛药物胶体金检测装置的结构示意图。
具体实施方式
一种吡唑酮类解热镇痛药物的胶体金检测装置，该装置包括试纸条和反应杯两部分：其中试纸条包括底板，沿同一方向依次铺设的样品垫，硝酸纤维素膜和吸水纸，硝酸纤维素膜上含有检测线和质控线；反应杯内含有胶体金标记的吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体。
优选的，所述检测线为能与吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体结合的吡唑酮类解热镇痛药物偶联抗原。
优选的，所述质控线为能与吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体结合的兔抗鼠抗体。
上述吡唑酮类解热镇痛药物的胶体金检测装置的制备方法，包括以下步骤：
制备硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线；所述检测线为能与吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体结合的吡唑酮类解热镇痛药物偶联抗原在硝酸纤维素膜上进行线状点样制得；所述质控线为能与吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体结合的兔抗鼠抗体在硝酸纤维素膜上进行线状点样制得；
组装试纸条：在底板上沿同一方向依次搭接粘贴样品垫，硝酸纤维素膜及吸水纸；
制备反应杯：反应杯中含有胶体金标记吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体。
优选的，所述胶体金标记吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体的制备方法为：调节胶体金溶液pH值至7～9，边搅拌边滴加吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体，0.5～1.5h后加入抗体量相当的PEG，反应20～35min后加入抗体量相当的BSA，继续搅拌20～35min，离心获得均一性胶体金标记吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体沉淀，再加PNPB重悬。
优选的，所述胶体金的制备方法为：取0.5～1.5％氯金酸溶液0.5～1.5ml，加90～100ml超纯水制成氯金酸溶液，加热沸腾后，取0.5～2％柠檬酸三钠1.0～2ml迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热4～6min，室温冷却，补充失水至原体积。
优选的，所述离心的转速为8000～10000rpm，离心时间为25～35min。
优选的，所述吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体的制备方法为：使用吡唑酮类解热镇痛药物免疫抗原免疫小鼠，加强免疫后，采血测效价，待血清效价不再上升，用1.8～2.2倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，3～4天后脱颈致死小鼠，在无菌条件下制备脾细胞，与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按7～9:1的比例混合，加入无血清IPMI1640培养基，离心弃上清，将细胞团轻轻振松，置于36～38℃水浴中；往细胞培养液中滴入0.025～0.05倍体积的45～55％v/v PEG-4000，同时轻轻搅动底部沉淀，静置0.8～1.2min后，25～35s内沿管壁缓慢加入0.025～0.05倍体积的无血清细胞培养基，然后再在25～35s内加入0.05～0.1倍体积的无血清细胞培养基，然后快速加入0.7～1.2倍体积的无血清细胞培养基终止融合过程，离心弃上清，用HAT选择性培养基重悬后加到已铺有饲养细胞的细胞培养板中，36.8～37.3℃、体积分数4.8～5.2％的CO2条件下培养；6.5～7.5天后换成HT培养液，杂交细胞数量达到300个以上时，筛选强阳性、细胞生长旺盛的细胞进行有限稀释克隆化，经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞；
将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备，采用体内诱生腹水法生产抗吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体；在小鼠腹腔注射液体石蜡油0.48～0.52mL/只，6.5～8.5天后腹腔注射杂交瘤细胞3～5×106/只，9～11天后，收集腹水，用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水，得抗吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体。
优选的，所述吡唑酮类解热镇痛药物免疫抗原的制备方法为：取吡唑酮类解热镇痛药物半抗原0.08～0.12mmol溶于1.5～2.5mLDMF中，搅拌加入0.18～0.22mmol DCC和0.1～0.2mmol NHS；2～6℃搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液；
称取血蓝蛋白KLH 130～150mg溶于PBS中，加入DMF 0.8～1.2mL，混匀得B液；
搅拌条件下，将A液滴入B液中，2～6℃反应10～14h，离心取上清，用生理盐水透析2～4天，每天更换2～5次透析液，得吡唑酮类解热镇痛药物免疫抗原。
优选的，吡唑酮类解热镇痛药物偶联抗原的制备方法为：取吡唑酮类解热镇痛药物半抗原0.08～0.12mmol溶于1.5～2.5mLDMF中，搅拌加入0.18～0.22mmol DCC和0.1～0.2mmol NHS，2～6℃搅拌反应过夜，离心取上清得A液；
称取人血清蛋白HSA130～150mg溶于PBS中，加入DMF 0.8～1.2mL，混匀得B液；
搅拌条件下，将A液滴入B液中，2～6℃反应10～14h，离心取上清，用生理盐水透析2～4天，每天更换2～5次透析液，得到吡唑酮类解热镇痛药物偶联抗原。
优选的，所述吡唑酮类解热镇痛药物半抗原的制备方法为：将3～4份安乃近，1～2份溴乙酸，0.05～0.15份碳酸钠，于乙腈溶液中80～954℃反应过夜，旋蒸完后，加水，用稀盐酸将溶液pH调为5.5～6.8后，用乙酸乙酯萃取2～4遍，合并有机相，蒸干后拌样，过柱提纯得吡唑酮类解热镇痛药物半抗原。
优选的，所述兔抗鼠抗体的制备方法为：用载体蛋白结合抗原免疫新西兰白兔，免疫剂量为50～100μg/次，背部皮下分多点注射；首免，用合成的人工抗原与等量弗氏完全佐剂乳化；加强免疫，用合成的人工抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，连续免疫4～5次，每次间隔4～8周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测其定效价达到105以上时，采血并分离收集高免血清，以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，冻存备用。
一种检测吡唑酮类解热镇痛药物的方法，包括以下步骤：吸取待测样本滴到反应杯中，混匀，插入试纸条，20-40℃孵育3～8分钟；取出试纸条，进行结果判读；若T线与C线同时显示紫红色条带且T线颜色比C线深，则结果为阴性；若T线颜色比C线浅或C线显色而T线不显色，则结果为阳性；若C线、T线均不显色，则检测装置已失效。
优选的，所述吡唑酮类解热镇痛药物包括安乃近、氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1吡唑酮类解热镇痛药物半抗原的制备
在100mL的三颈瓶中依次加入3.53g安乃近，1.52g溴乙酸，0.1g碳酸钠，于乙腈溶液中90℃反应过夜。旋蒸完后，加水，用稀盐酸将溶液调为微酸性(pH5.5～6.8)后乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相，蒸干后拌样，过柱提纯得吡唑酮类解热镇痛药物半抗原，其化学结构式为：
实施例2吡唑酮类解热镇痛药物免疫抗原的合成
利用吡唑酮类解热镇痛药物半抗原制备免疫抗原。取吡唑酮类解热镇痛药物半抗原0.1mmol溶于2mLDMF中，搅拌加入0.2mmol DCC和0.15mmol NHS。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液，称取血蓝蛋白(KLH)140mg溶于10mL浓度为0.1mol/L的PBS(pH8.0)中。加入DMF1mL，搅拌溶解制备B液，磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清液，4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液，得到的全抗原，以1mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中。
实施例3吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体的制备
利用吡唑酮类解热镇痛药物免疫抗原制备单克隆抗体。使用吡唑酮类解热镇痛药物免疫抗原并鉴定后免疫4只6周龄BALB/C小鼠，加强免疫三次后，采血测效价，待血清效价不再上升，用两倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，三天后脱颈致死小鼠，在无菌条件下取脾脏制备脾细胞，与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按8:1的比例混合于50mL离心管，加入30mL无血清IPMI1640培养基，1100r/min离心5min弃上清，将细胞团轻轻振松，置于37℃水浴中。把1mL50％PEG-4000缓缓加入细胞中，在1min内滴完，同时轻轻搅动底部沉淀，静置1min后，前30s沿管壁缓慢匀速加入无血清培养基1mL，后30s加入2mL，然后快速加入27mL终止融合过程，1100r/min离心5min，弃上清，用HAT选择性培养基重悬后加到已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，37℃、体积分数5％的CO2条件下培养。7天后换成HT培养液，待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，用间接ELISA法筛选，选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备。
采用体内诱生腹水法生产抗吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体。选4只昆明小鼠，腹腔注射液体石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞3～5×106/只，10天后，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水。用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水，经紫外测定抗吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体的含量。
实施例4吡唑酮类解热镇痛药物偶联抗原的制备
取吡唑酮类解热镇痛药物半抗原0.1mmol溶于2mLDMF中，搅拌加入0.2mmol DCC和0.15mmol NHS。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜A液，称取人血清蛋白(HSA)140mg溶于10mL浓度0.1mol/L的PBS(pH8.0)中。加入DMF 1mL，搅拌溶解制备B液，磁力搅拌下，A液逐渐滴B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清液，4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液。得到的全抗原以10mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中备用。
实施例5吡唑酮类解热镇痛药物胶体金检测装置的制备
5.1胶体金的制备
取1％氯金酸溶液1mL，加99mL超纯水成终浓度0.01％的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1％柠檬酸三钠1.6mL一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积。
5.2胶体金标记单克隆抗体的制备
调节胶体金溶液pH值至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入吡唑酮类解热镇痛药物的单克隆抗体，1h后加入抗体量相当的PEG，充分反应30min后加入抗体量相当的BSA，加完后，继续搅拌30min。在9000rpm下离心30min获得均一性金标抗体沉淀，再加PNPB重悬备用。
5.3胶体金检测装置的制备
在试纸条底板上，沿同一方向依次将样品垫，喷涂有吡唑酮类解热镇痛药物偶联抗原(检测线)和兔抗鼠IgG(质控线)的硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接粘连；反应杯内加入胶体金标记抗体，冻干。
实施例6液体样品中吡唑酮类解热镇痛药物的检测
取液体样品1mL，用Tris-PBS缓冲溶液稀释10倍，摇匀备用。滴加上述样品稀释试液于反应杯中，混匀，随后插入试纸条，于20-40℃反应6min。取出试纸条，进行结果判读。若T线与C线同时显示紫红色条带且T线颜色比C线深，则结果为阴性；若T线颜色比C线浅或C线显色而T线不显色，则结果为阳性；若C线、T线均不显色，则检测装置已失效。
实施例7固体样品中吡唑酮类解热镇痛药物的检测
取固体样品约0.1g，加10mL水充分搅拌。静置2min后，取上述样品试液1mL，用Tris-PBS缓冲溶液稀释10倍，摇匀备用。滴加上述样品稀释试液于反应杯中，混匀，随后插入试纸条，于20-40℃反应6min。取出试纸条，进行结果判读。若T线与C线同时显示紫红色条带且T线颜色比C线深，则结果为阴性；若T线颜色比C线浅或C线显色而T线不显色，则结果为阳性；若C线、T线均不显色，则检测装置已失效。
实施例8吡唑酮类解热镇痛药物胶体金检测装置的灵敏度
通过实验，本发明中吡唑酮类解热镇痛药物胶体金检测装置的灵敏度为：安乃近100μg/L，氨基比林100μg/L，安替比林50μg/L，异丙安替比林50μg/L，4-甲氨基安替比林20μg/L。
实施例9吡唑酮类解热镇痛药物胶体金检测装置的特异性实验
在阴性的液体样品中，分别加入安乃近100μg/L，氨基比林100μg/L，安替比林50μg/L，异丙安替比林50μg/L，4-甲氨基安替比林20μg/L，阿司匹林500μg/L，水杨酸500μg/L，对乙酰氨基酚500μg/L，非那西丁500μg/L，双氯芬酸500μg/L，布洛芬500μg/L，萘普生500μg/L，吡罗昔康500μg/L，美洛昔康500μg/L，保泰松500μg/L，醋酸泼尼松500μg/L，醋酸地塞米松500μg/L。实验结果发现，只有加入吡唑酮类解热镇痛药物(安乃近、氨基比林、安替比林、异丙安替比林、4-甲氨基安替比林)的样品能够检出，而加入水杨酸类解热镇痛药物(阿司匹林、水杨酸)、乙酰苯胺类解热镇痛药物(对乙酰氨基酚、非那西丁)、苯乙酸类解热镇痛药物(双氯芬酸)、芳基丙酸类解热镇痛药物(布洛芬、萘普生)、1,2-苯并噻唑类解热镇痛药物(吡罗昔康、美洛昔康)、吡唑烷酮类解热镇痛药(保泰松)、甾体类抗炎药(醋酸泼尼松、醋酸地塞米松)的样品无法检出，说明本检测装置对吡唑酮类解热镇痛药物的特异性较好，对其它类型解热镇痛药物的交叉反应较少。
实施例10吡唑酮类解热镇痛药物胶体金检测装置的保质期实验
用三批常规生产的产品分别做保质期实验，放置于室内室温环境保持，每隔1个月取12个装置，用质控样本检测，分别做阴性，2.5μg/mL，5μg/mL和10μg/mL样品，重复三次，观察数据变化，考察保质期时间。阴性显色从13个月开始下降，在1年时间内产品品质无明显变化，因此确定保质期为1年。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种吡唑酮类解热镇痛药物的胶体金检测装置，其特征在于，该装置包括试纸条和反应杯两部分：其中试纸条包括底板，沿同一方向依次铺设的样品垫，硝酸纤维素膜和吸水纸，硝酸纤维素膜上含有检测线和质控线；反应杯内含有胶体金标记的吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体；
所述检测线为能与吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体结合的吡唑酮类解热镇痛药物偶联抗原；
所述质控线为能与吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体结合的兔抗鼠抗体。
2.权利要求1所述吡唑酮类解热镇痛药物的胶体金检测装置的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线；所述检测线为能与吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体结合的吡唑酮类解热镇痛药物偶联抗原在硝酸纤维素膜上进行线状点样制得；所述质控线为能与吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体结合的兔抗鼠抗体在硝酸纤维素膜上进行线状点样制得；
组装试纸条：在底板上沿同一方向依次搭接粘贴样品垫，硝酸纤维素膜及吸水纸；
制备反应杯：反应杯中含有胶体金标记吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述胶体金标记吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体的制备方法为：调节胶体金溶液pH值至7～9，边搅拌边滴加吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体，0.5～1.5h后加入抗体量相当的PEG，反应20～35min后加入抗体量相当的BSA，继续搅拌20～35min，离心获得均一性胶体金标记吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体沉淀，再加PNPB重悬。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述胶体金的制备方法为：取0.5～1.5％氯金酸溶液0.5～1.5ml，加90～100ml超纯水制成氯金酸溶液，加热沸腾后，取0.5～2％柠檬酸三钠1.0～2ml迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热4～6min，室温冷却，补充失水至原体积。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体的制备方法为：使用吡唑酮类解热镇痛药物免疫抗原免疫小鼠，加强免疫后，采血测效价，待血清效价不再上升，用1.8～2.2倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，3～4天后脱颈致死小鼠，在无菌条件下制备脾细胞，与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按7～9:1的比例混合，加入无血清IPMI1640培养基，离心弃上清，将细胞团轻轻振松，置于36～38℃水浴中；往细胞培养液中滴入0.025～0.05倍体积的45～55％v/v PEG-4000，同时轻轻搅动底部沉淀，静置0.8～1.2min后，25～35s内沿管壁缓慢加入0.025～0.05倍体积的无血清细胞培养基，然后再在25～35s内加入0.05～0.1倍体积的无血清细胞培养基，然后快速加入0.7～1.2倍体积的无血清细胞培养基终止融合过程，离心弃上清，用HAT选择性培养基重悬后加到已铺有饲养细胞的细胞培养板中，36.8～37.3℃、体积分数4.8～5.2％的CO2条件下培养；6.5～7.5天后换成HT培养液，杂交细胞数量达到300个以上时，筛选强阳性、细胞生长旺盛的细胞进行有限稀释克隆化，经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞；
将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备，采用体内诱生腹水法生产抗吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体；在小鼠腹腔注射液体石蜡油0.48～0.52mL/只，6.5～8.5天后腹腔注射杂交瘤细胞3～5×106/只，9～11天后，收集腹水，用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水，得抗吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述吡唑酮类解热镇痛药物免疫抗原的制备方法为：取吡唑酮类解热镇痛药物半抗原0.08～0.12mmol溶于1.5～2.5mLDMF中，搅拌加入0.18～0.22mmol DCC和0.1～0.2mmol NHS；2～6℃搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液；
称取血蓝蛋白KLH130～150mg溶于PBS中，加入DMF0.8～1.2mL，混匀得B液；
搅拌条件下，将A液滴入B液中，2～6℃反应10～14h，离心取上清，用生理盐水透析2～4天，每天更换2～5次透析液，得吡唑酮类解热镇痛药物免疫抗原。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，吡唑酮类解热镇痛药物偶联抗原的制备方法为：取吡唑酮类解热镇痛药物半抗原0.08～0.12mmol溶于1.5～2.5mLDMF中，搅拌加入0.18～0.22mmol DCC和0.1～0.2mmol NHS，2～6℃搅拌反应过夜，离心取上清得A液；
称取人血清蛋白HSA130～150mg溶于PBS中，加入DMF 0.8～1.2mL，混匀得B液；
搅拌条件下，将A液滴入B液中，2～6℃反应10～14h，离心取上清，用生理盐水透析2～4天，每天更换2～5次透析液，得到吡唑酮类解热镇痛药物偶联抗原。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述吡唑酮类解热镇痛药物半抗原的制备方法为：将3～4份安乃近，1～2份溴乙酸，0.05～0.15份碳酸钠，于乙腈溶液中80～954℃反应过夜，旋蒸完后，加水，用稀盐酸将溶液pH调为5.5～6.8后，用乙酸乙酯萃取2～4遍，合并有机相，蒸干后拌样，过柱提纯得吡唑酮类解热镇痛药物半抗原。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述兔抗鼠抗体的制备方法为：用载体蛋白结合抗原免疫新西兰白兔，免疫剂量为50～100μg/次，背部皮下分多点注射；首免，用合成的人工抗原与等量弗氏完全佐剂乳化；加强免疫，用合成的人工抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，连续免疫4～5次，每次间隔4～8周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测其定效价达到105以上时，采血并分离收集高免血清，以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，冻存备用。
10.一种检测吡唑酮类解热镇痛药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：吸取样本待测液滴到反应杯中，混匀，插入试纸条，20-40℃孵育3～8分钟；取出试纸条，进行结果判读；若T线与C线同时显示紫红色条带且T线颜色比C线深，则结果为阴性；若T线颜色比C线浅或C线显色而T线不显色，则结果为阳性；若C线、T线均不显色，则检测装置已失效。
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