ES2254403T3 - Produccion de muteinas recombinantes de factor de coagulacion sanguinea viii en lineas de celulas humanas. - Google Patents
Produccion de muteinas recombinantes de factor de coagulacion sanguinea viii en lineas de celulas humanas.Info
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Abstract
Una muteína del factor VIII en la que el dominio B entre las posiciones Arg 740 y Glu 1649 de han reemplazado por un péptido de engarce rico en Arg que tiene al menos 3 restos Arg y que comprende 10 a 25 restos de aminoácidos, en los que dicha numeración del factor VIII es con relación a la secuencia del factor VIII de tipo salvaje madura
Description
Producción de muteínas recombinantes de factor de
coagulación sanguínea VIII en líneas de células humanas.
La presente invención se refiere a muteínas
mejoradas del factor VIII, un procedimiento para la producción de
tales muteínas del factor VIII, composiciones farmacéuticas que
comprenden tales muteínas del factor VIII y el uso de tales
muteínas del factor VIII para preparar un medicamento para tratar la
hemofilia.
Los hemofílicos están sufriendo de morbilidad
hemorrágica provocada por la función alterada de componentes
proteicos de la cascada de coagulación de la sangre. Dependiendo del
factor de coagulación afectado se pueden distinguir dos tipos de
hemofilia. Ambos tienen en común la conversión inhibida de
fibrinógeno soluble a un coágulo de fibrina insoluble. Son
enfermedades genéticas recesivas unidas al cromosoma X que afectan
principalmente a la población masculina.
La hemofilia A afecta 1-2
individuos por 10.000 varones. Está provocada por la deficiencia o
ausencia del factor VIII, una glicoproteína muy grande (de
aproximadamente 330 kDa (Furie B., Furie B. C., Cell (1988)
53, 505-518)), que representa un elemento importante
de la cascada de coagulación de la sangre. La secuencia de
polipéptidos se puede subdividir en tres regiones, una región
N-terminal que está constituida por los llamados
dominios A1 y A2, una región central del dominio B y una región
C-terminal compuesta por los dominios A3, C1 y C2
(M. L. Liu y col., British J. Haematol. 103:
1051-1060 (1998)). En la coagulación de la sangre
el factor VIII el factor VIII se presenta como un precursor
inactivo. Está unido estrechamente y no covalentemente al factor de
von Willebrand (vWf), que actúa como una proteína vehículo
estabilizante. La escisión proteolítica del factor VIII mediante la
trombina en tres posiciones específicas (740, 372, 1689) conduce a
su disociación de vWf y libera la función procoagulante dentro de la
cascada. En su forma activa el factor VIII funciona como un
cofactor para el factor IXa, acelerando por lo tanto la activación
proteolítica del factor X en varios ordenes de magnitud.
La Hemofilia B se presenta en aproximadamente 1
de 25.000 varones. Está caracterizada por la deficiencia del factor
IX de la serina proteasa (factor Christmas). Este polipéptido de
415 aminoácidos se sintetiza en el hígado como una glicoproteína de
56 kDa. Con el fin de alcanzar su función apropiada se requiere una
etapa de carboxilación postraduccional que solamente aparece en
presencia de la vitamina K.
El tratamiento de ambos tipos de trastorno de
sangrado tradicionalmente implica infusiones de concentrados de
proteína derivados de plasma humano del factor VIII o factor IX.
Aunque este procedimiento representa una terapia eficaz para
hemofílicos lleva el riesgo de transmisión de diversos agentes
infecciosos, tales como virus que provocan hepatitis o SIDA, o
factores tromboembólicos. Como alternativa se han descrito diversas
técnicas de ADN recombinantes para la producción de factores de
coagulación. Para este propósito los ADNc correspondientes del
factor VIII y factor IX de tipo salvaje se han usado y clonado en
vectores de expresión adecuados (documentos
EP-A-160457;
WO-A-86/01961; patentes de Estados
Unidos números 4.770.999. 5.521.070 y 5.521.070).
En el caso del factor VIII se conoce en la
técnica la expresión de subunidades para la producción de complejos
que muestran actividad coagulante (por ejemplo, a partir de los
documentos EP-A-150735,
EP-A-232112,
EP-A-0500734,
WO-91/074490, WO-95/13300, las
patentes de Estados Unidos 5.045.455 y 5.789.203). Además, se ha
descrito la expresión de versiones de ADNc parcial o completamente
carecen de la secuencia que codifica el dominio B altamente
glucosilado (por ejemplo, en los documentos
WO-86/06101, WO-87/04187,
WO-87/07144, WO-88/00381,
WO-94/29471,
EP-A-251843,
EP-A-253455,
EP-A-254076, las patentes de Estados
Unidos números 4.868.112 y 4.980.456, documentos
EP-A-294910,
EP-A-265778,
EP-A-303540 y
WO-91/09122). Más recientemente se han introducido
una diversidad de mutaciones puntuales seleccionadas para inhibir
la inactivación proteolítica del factor VIII por la proteína
activada C o para reducir la inmunogenicidad que da como resultado
la formación de anticuerpos inhibidores por lo pacientes tratados
(véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 5.859.204,
5.422.260 y 5.451.521, los documentos WO-97/49725,
WO-99/298848.
Los factores de coagulación recombinantes se
aislaron usualmente a partir de líneas celulares eucarióticas y
preferiblemente de mamíferos. Sin embargo, era práctica general
emplear líneas celulares no humanas en los procedimientos de
producción descritos en las referencias mencionadas en esta memoria
descriptiva antes con el fin de excluir el riesgo de copurificar
algunos agentes infecciosos que pueden estar albergados y expresados
por células humanas.
Sin embargo, especialmente para el factor VIII,
el uso de líneas celulares no humanas encontró ciertas desventajas.
Por ejemplo se han reseñado niveles de secreción insatisfactorios de
al proteína expresada en el medio. Esto se puede deber a ligeras
diferencias dentro de diferentes tipos de células de mamíferos
concernientes a rutas intracelulares para la traducción y
modificación de proteínas, que también pudiera tener efecto en al
actividad biológica del polipéptido expresado. Aparte de esto,
había preocupación en que las proteínas purificadas de sistemas de
expresión no humanas estén contaminados con componentes celulares
que pueden dar lugar a reacciones antigénicas en los pacientes.
Además, las proteínas expresadas por sistemas de
expresión no humanos pueden tener patrones de glucosilación no
humanos que dan lugar a reacciones antigénicas en el paciente. Sin
embargo, la estabilidad y eficacia biológica de los factores de
coagulación está sustancialmente influenciada por su patrón de
N-glucosilación. Especialmente monosacáridos
periféricos y terminales son importantes, debido a que están
detectados por receptores específicos de células que son
responsables de su degradación. Los factores de coagulación llevan
como monosacáridos siálicos residuos de ácido siálico. La
modificación en la composición de ácidos siálicos en los salientes
de glucoproteínas como por ejemplo los factores de coagulación
pueden dar como resultado patrones de glucosilación heterogéneos.
De este modo, la estabilidad y eficacia biológica está implicada
crucialmente cuando se produce modificación. Por lo tanto, es una
importante consideración en la producción de factores de coagulación
recombinantes para evaluar la influencia de glucosialción de líneas
celulares de producción no humanas frente a líneas celulares
humanas. Hablando en términos generales, parece plausible que las
líneas celulares humanas están más cualificadas para la producción
de factores de coagulación recombinantes que no humanas. La razón de
esta suposición es que probablemente ningún oligosacárido extraño
se incorporará en el resto oligosacárido durante la síntesis de
factores recombinantes.
Por otra parte, los procedimientos generales para
el alto nivel de expresión de proteínas de un gen deseado que
comprende líneas celulares de mamíferos de células de mamíferos
inmortalizadas, establemente transfectadas que expresan proteínas
activadoras de transcripción viral se han hecho disponibles durante
algún tiempo (por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº
5.712.119). Adicionalmente estas líneas celulares se transforman
con una construcción de vector en la que un promotor de
transcripción viral adecuado está operativamente asociado a una
secuencia de ADN que define un gen de interés, las proteínas
activadoras de transcripción activan el promotor de transcripción
viral y por lo tanto inician la expresión del gen de interés. De
nuevo, había preocupación en que las proteínas activadoras de
transcripción expresadas por estas líneas celulares puedan dar lugar
a contaminaciones en al proteína terapéutica diana.
En vista de lo anterior existe todavía una
necesidad de un procedimiento de producción eficaz para factores de
coagulación de sangre humana.
Sorprendentemente, se encontró que un factor de
coagulación de sangre no contaminada se puede obtener con las
líneas celulares humanas inmortalizadas mencionadas anteriormente.
En particular, las líneas celulares inmortalizadas -si llevan un
vector que tiene un promotor unido funcionalmente a una secuencia de
ADN que codifica el factor de coagulación de sangre y a pesar de
que el hecho de que el promotor no es un promotor viral está
estimulado por dichas proteínas activadoras de transcripción- son
capaces de expresar el factor de coagulación de sangre. En
combinación con la purificación de proteínas adecuada y protocolos
de inactivación de virus este procedimiento proporciona un sistema
eficaz para producir factores de coagulación de sangre de sangre
recombinantes altamente activos para aplicaciones terapéuticas en
seres humanos. Además, las muteínas del factor VIII particulares se
encontraron que son excepcionalmente estables contra la inactivación
proteolítica y de este modo están sometidas a protocolos vigorosos
de inactivación de virus.
La presente invención proporciona
- (1)
- una muteína del factor VIII en al que el dominio B entre las posiciones Arg 740 y Glu 1649 se han reemplazado por un péptido de engarce rico en Arg que tiene al menos 3 residuos Arg y que comprende 10 a 25 restos de aminoácidos, en los que la numeración de dicho factor VIII está en relación con la secuencia del factor VIII de tipo salvaje maduro mostrada en la SEQ ID Nº 2.
- (2)
- Una secuencia de ADN que codifica la muteína del factor VIII como se ha definido en (1) anteriormente;
- (3)
- Un vector que comprende el ADN como se ha definido en (2) anteriormente;
- (4)
- Un vector como se ha definido en (3) antes que es un vector de transferencia de gen;
- (5)
- una célula hospedadora que se transforma con un vector como se ha definido en (3) antes y/o que comprende una secuencia de ADN como se ha definido en (2) antes;
- (6)
- Un procedimiento para la producción de la muteína del factor VIII como se ha definido en (1) antes que comprende
- (a)
- cultivar una célula hospedadora transformada como se ha definido en (5) antes, y
- (b)
- aislar la muteína del factor VIII a partir del caldo de cultivo;
- (7)
- Una composición farmacéutica que comprende al muteína del factor VIII como se ha definido en (1) antes o un vector de transferencia de genes como se ha definido en (4) antes;
- (8)
- el uso de la muteína del factor VIII como se ha definido en (1) antes o un vector de transferencia de genes como se ha definido en (4) antes para preparar un medicamento para tratar hemofilia;
- (9)
- una realización preferida del procedimiento de (6) anterior, que comprende
- (a)
- cultivar una línea celular humana inmortalizada que expresa establemente el antígeno T del virus de Simio y que lleva un vector que lleva un vector que tiene un promotor de CMV unido funcionalmente a una secuencia de ADN que codifica la muteína del factor VIII; y
- (10)
- una línea celular humana inmortalizada que lleva un vector que codifica una muteína del factor VIII como se ha definido en el procedimiento de (9) antes.
La figura 1 muestra los fragmentos utilizados
para la construcción del factor VIII con un dominio B suprimido
(ejemplo 1).
La figura 2 muestra el vector
pTGF8-1, de ADN circular de 8720 pares de bases, la
secuencia exacta de ADN del mismo se proporciona en la SEQ ID Nº 3
(para la proteína del factor VIII codificada por dicha secuencia de
ADN véase la SEQ ID Nº 4).
La figura 3 muestra una secuencia de engarce
preferida de la presente invención (SEQ ID Nº 9).
La figura 3 B muestra el tiempo de coagulación de
hFVIII como se determina en el ejemplo 6.
La figura 4 muestra la estructura molecular común
de pTGF8-2-hyg-s y
pTGF8-3, de AD circular de 10698 pares de bases,
las secuencias de ADN exacta de los mismos se proporcionan en las SQ
ID números 12 y 14 (para la proteína del factor VIII codificada por
dichas secuencias de ADN véase las SEQ ID números 13 y 15).
La figura 5 A muestra la curva de calibración de
ELISA de FVIII como se describe en el ejemplo 4.
La figura 5 B muestra los resultados de la
determinación de las concentraciones de FVIII recombinante en los
diferentes filtrados de cultivos como se describe en la figura
4.
La figura 6 muestra los resultados de un ensayo
de inmunofluorescencia específico del factor VIII como se describe
en el ejemplo 8. Fila superior: células 293 T transfectadas de
manera estable con pTGF8-3, clon 49/19. Fila
inferior: control, negativo: células 293T no transfectadas. A y C:
luz blanca, sin filtro; B y D: detección del factor VIII mediante
fluorescencia, filtro 550 nm.
"Unido funcionalmente" se refiere a las
configuraciones del vector en las que el promotor está localizado
dentro del vector de tal manera que puede estimular la transcripción
de la secuencia de ADN que codifica el factor de coagulación de
sangre humano. "Unido no funcionalmente" se refiere a una
configuración en la que el promotor está así localizado de manera
remota a partir de la secuencia de genes expresada del factor de
coagulación de sangre que no puede estimular su transcripción.
"Gen" se refiere a una secuencia de ADN que
codifica un polipéptido que incluye opcionalmente secuencias guía y
de remolque e intrones y exones.
"Vector" se refiere a cualquier construcción
genética, tal como plásmido, fago, cósmico, etc., que es capaz de
replicación cuando se asocia con los elementos de control
apropiados. El término incluye vehículos de clonación y expresión.
"Que lleva un vector" incluye tanto la incorporación estable
como transitoria de un segmento de ADN funcional en la célula
hospedadora. Si embargo se prefiere a incorporación estable.
"Vector de transferencia de genes" de
acuerdo con la presente invención incluye un vector adecuado para
terapia génica. Tal vector comprende secuencias funcionales para
los propósitos deseados como se conoce en la técnica.
El término "madura" se refiere a la
estructura molecular de una proteína dada directamente después de su
secreción celular (es decir, que carece de su polipéptido de señal
de exportación N-terminal).
"Promotor" se refiere a una región de
secuencias de ADN regulador para la transcripción de un gen al que
se une la ARN polimerasas.
"Dosis terapéuticamente eficaz" de la
composición farmacéutica de al invención se refiere a una dosis
eficaz para el tratamiento de profilaxis, por ejemplo, una dosis
que produce tratamiento o reducción eficaz de los síntomas de
hemofilia. La determinación de una dosis terapéuticamente eficaz
está dentro del alcance de los expertos en la
técnica.
técnica.
"Codifica" o "que codifica" se refiere
a una propiedad de la secuencia de ácidos nucleicos que se
transcribe (en el caso de ADN) o se traduce (en el caso de ARNm) en
un polipéptido in vitro o in vivo cuando se coloca
bajo el control de una secuencia reguladora apropiada.
Para el propósito de esta solicitud
"expresa", "que expresa" o "expresión" se refiere a
la transcripción y traducción de un gen que codifica una
proteína.
La presente invención como se ha descrito en (1)
a (10) anteriormente se describe en esta memoria descriptiva
posteriormente en más detalle. De acuerdo con la realización (9) de
al invención de la presente solicitud el promotor de CMV unido
funcionalmente a la secuencia de ADN que codifica la muteína del
factor VIII no se estimula por el antígeno T del virus de simio
expresado por la línea celular humana inmortalizada.
La línea celular humana inmortalizada
preferiblemente es una célula de riñón, vejiga, hígado, pulmón,
músculo cardíaco, músculo liso, ovario o gastrointestinal. Más
preferiblemente la línea celular humana inmortalizada se deriva de
una célula de riñón humano y lo más preferiblemente es una línea
celular 293 T (ECACC: tsa201, ref. 96121229; DSM ACC494).
La línea celular inmortalizada - además del
antígeno T del virus de Simio expresa adicionalmente proteínas
activadoras tal como proteínas E1A o E1B de adenovirus, una proteína
codificada por la secuencia de ADN de la región del virus de
papelona bovino y las proteínas IE del virus herpes. Preferiblemente
la célula inmortalizada expresa al menos dos proteínas activadoras
de transcripción, por ejemplo, un antígeno SV40 T sensible a la
temperatura y una proteína E1A de adenovirus (tal como la línea
celular 293 T anterior).
De acuerdo con la invención el vector utilizado
en la realización (9) de la invención puede llevar promotores
virales adicionales que se estimulan mediante dichas proteínas
activadoras de transcripción, pero que no están funcionalmente
unidas al factor de coagulación de sangre. Tales promotores virales
se seleccionan entre los promotores derivados de adenovirus, virus
de sarcoma de Rous y citomegalovirus. El vector puede además
comprender una o más de las secuencias funcionales: marcadores de
selección, secuencias reguladoras (por ejemplo, PRE), etc.
La realización (1) de la invención se refiere
particularmente a una muteína del factor VIII. Como se ha expuesto
anteriormente, varias construcciones de expresión del factor VIII
modificado se han diseñado para la expresión recombinante.
Considerando al estructura del dominio de los sitios funcionales de
interacción importantes de los polipéptidos del factor VIII con vWF
se localizan en el dominio A3 (aminoácido 1680-1689)
y el dominio C2 (Kaufman y Pipe, Haemophilia (1998) 4,
370-379). La escisión después de 1689 se propuso
liberar el factor VIII de vWF y permitir que el factor VIII
interactúe con fosfolípidos cargados. Las construcciones
recombinantes del factor VIII que carecen del sitio de unión a vWF
se mostró que eran extremadamente propensos a digestión
proteolítica cuando se inyectan en ratones deficientes en el factor
VIII. La expresión recombinante de las construcciones del factor
VIII truncadas en cultivos de células de mamíferos demostraron que
al supresión completa del dominio B no alteraba la actividad
biológica de la proteína de tipo factor VIII correspondiente (Eaton
y col., Biochemistry (1986) 25, 8343-8347).
Además de las velocidades de expresión observadas de las
construcciones suprimidas del dominio B eran significativamente
mayores comparadas con el factor VIII de tipo salvaje debido a un
incremento del nivel de ARNm en las células (Pittman y col.,
Blood (1993) 81, 2925-2935). Cuatro
productos recombinantes del factor VIII (Recombinate® Baxter
HealthCare; Kogenate® y Kogenate FS® Bayer Corporation y Refacto®
Wyeth, Genetics Institute) están actualmente en el mercado.
En la realización (1) de la invención, la muteína
del factor VIII puede tener al menos una de las siguientes
mutaciones adicionales (a) a (c):
- (a)
- Val en la posición 162 se ha reemplazado por un resto aminoácido neutro seleccionado entre Gly, Ala, Leu, Ile, Met y Pro;
- (b)
- Ser en la posición 2011 se ha reemplazado por un resto aminoácido hidrófilo seleccionado entre Asn, Thr y Gln; y
- (c)
- Val en la posición 2233 se ha reemplazado por un resto aminoácido ácido seleccionado entre Glu y Asp;
en la que dicha numeración del factor VIII es con
relación a la secuencia de aminoácidos del factor VIII de tipo
salvaje mostrada en la SEQ ID Nº 2 (estando la secuencia de
aminoácidos del péptido maduro no incluyendo el péptido señal de 19
aminoácidos, pero incluyendo el dominio B entero (documento WO
99/29848)).
Como se ha expuesto anteriormente, Val en la
posición 162 se puede reemplazar con un resto aminoácido
seleccionado entre Gly, Ala, Leu, Ile, Met y Pro. El resto
aminoácido neutro preferido es Ala. Además, Ser en la posición 2011
se puede reemplazar con un aminoácido hidrófilo seleccionado entre
Asn, Thr y Gln. El resto aminoácido hidrófilo preferido es Asn.
Finalmente, Val en al posición 2223 se puede reemplazar con un
resto aminoácido ácido seleccionado entre Glu y Asp. El resto
aminoácido ácido preferido es Glu.
Entre las muteínas del factor VIII de la
realización (1) se prefiere que la muteína del factor VIII tiene al
menos una de las mutaciones (a), (b) y (c), más preferiblemente al
menos una de las mutaciones (a) y (b), y más preferiblemente las
tres mutaciones (a) a (c) como se ha definido anteriormente. Se
prefiere particularmente que al muteína comprenda las tres
mutaciones V162A, S2011N y V2223E.
\newpage
Sobre el mismo indicio, la secuencia de ADN
comprendida por el vector de la realización (2) de la invención
tiene las mutaciones T485C, G6032A y T6668A con relación a la
secuencia de ADN del factor VIII de tipo salvaje maduro en al SEC
ID Nº 1. En una relación preferida la secuencia de ADN también
contiene la mutación completa T6816C (de nuevo dicha numeración
estando con relación a la secuencia de ADN del factor VIII de tipo
salvaje maduro).
Entre las muteínas del factor VIII de la
realización (1) se prefiere alternativamente que la muteína del
factor VIII tiene la mutación (d) como se ha definido
anteriormente.
De acuerdo con la realización (1) de al invención
la muteína del factor VIII es una muteína en al que el dominio B
entre la posición R740 y E1649 se reemplaza mediante un espaciador
de aminoácido rico en Arg característico. "Rico en Arg" de
acuerdo con la presente invención significa que dicho espaciador
comprende al menos 3, preferiblemente al menos 4 restos Arg. En una
relación más preferida dicho espaciador consta de ocho aminoácidos
del dominio de tipo salvaje seguido de ocho aminoácidos de un
dominio variable (véase la figura 3 A, SEQ ID Nº 9). En tal muteína
del factor VIII que tiene las modificaciones del dominio B descritas
en esta memoria descriptiva antes del sitio de unión a vWF
propuesto permanece sin cambiar para evitar una digestión
proteolítica inmediata del factor VIII secretado en el medio de
cultivo celular o más tarde en los pacientes tratados. Solamente
después de la activación específica mediante el factor VIII de
escisión de trombina se liberará a partir de vWF. El ADNc para la
muteína del factor VIII se construyó mediante ensamblaje de cuatro
fragmentos de ADN, por ejemplo, como se describe en el ejemplo
1.
La proteína de la realización (1) de al invención
puede comprender secuencias adicionales N- o
C-terminales incluyendo, pero no limitadas a, el
péptido señal de exportación natural (correspondiente a Leo restos
aminoácidos -19 a -1 de las proteínas mostradas en las SEQ ID
números 4, 13 y 15) o un fragmento o análogo de las mismas,
péptidos artificiales (por ejemplo,
oligo-His-Tag para purificación de
alta afinidad) y similares.
El vector más preferido para la expresión del
factor VIII es el vector pTGF8-1 mostrado en la
figura 2. La secuencia de ADN de dicho vector se muestra en la SEQ
ID Nº 3, y abarca las cinco mutaciones dirigidas en esta memoria
dirigida antes (las muteínas T485C, G6032A, T6668A y T6816C (aquí:
T1217C, G4088A, T4724A, y T4872C) y una secuencia de ADN que
codifica el engarce del dominio B de la SEQ ID Nº 9) y codifica la
muteína del factor VIII mostrada en la SEQ ID Nº 4.
Los vectores más preferidos adicionalmente son
pTGF8-2-hyg-s y
pTGF8-3, la estructura molecular común de la cual
se muestra en al figura 4. Los
pTGF8-2hyg-s mostrados en la SEQ ID
Nº 12 contiene la mutación silenciosa T T6816C solamente, dando
como resultado una muteína del factor VIII que tiene la sustitución
del dominio B mediante la SEQ ID Nº 9 del péptido engarce, pero sin
cambio adicional en la estructura de la proteína primaria que se
refiere a la secuencia de tipo salvaje SEQ ID Nº 2.
pTGF8-3 mostrado en la SEQ ID Nº
14 contiene las mutaciones T485C, T6668A y T6816C, que dan como
resultado una muteína del factor VIII que muestra las sustituciones
de aminoácidos V162A y V2223S que se refieren a las SEQ ID Nº 2
además de la sustitución del dominio B como se ha descrito
anteriormente.
En el caso de la producción del factor VIII el
cultivo se realza en presencia del factor de von Willebrand. El
factor de von Willebrand se usa preferiblemente en una cantidad de
10 a 100, más preferiblemente 50 a 60 moles de vWF por mol del
factor VIII (en el caldo de cultivo y/o en la solución del factor
VIII durante el procedimiento de purificación (véase más
adelante).
El procedimiento de acuerdo a la realización (9)
de la invención que comprende además las etapas de
(c) purificar el factor de coagulación de sangre
aislado en la etapa (b) y/o
(d) someter el factor de coagulación de sangre
aislado en la etapa (b) o purificado en al etapa (c) a un
tratamiento de inactivación de virus.
Las etapas de purificación adecuadas incluyen
procedimientos que se conocían en la técnica para maximizar el
rendimiento de un producto puro, estable y altamente activo y se
seleccionan entre cromatografía por inmunoafinidad, cromatografía
de intercambio aniónica, cromatografía de exclusión por tamaño,
etc., y las combinaciones de los mismos. En particular, los
protocolos de purificación detallados para los factores de
coagulación de plasma de sangre humana son, por ejemplo, descritos
en los documentos WO 93/15105, EP0813597, WO 96/40883 y WO
96/15140/50. Se pueden adaptar fácilmente a los requerimientos
específicos necesarios para aislar el factor VIII recombinante. La
cantidad y actividad de la proteína purificada y después el
procedimiento de purificación se puede controlar mediante ELISA y
ensayos de coagulación.
Para superar los problemas de las combinaciones
posibles infecciosas en las muestras de proteínas purificadas o en
el producto directamente obtenido a partir del sobrenadante de
cultivo de las celular que contienen la proteína recombinante
secretada de elección, las muestras y/o el sobrenadante del cultivo
se podría tratar con procedimientos para la inactivación de virus
incluyendo tratamiento pos calor (estado sólido o líquido, con o
sin la adición de sustancias químicas que incluyen inhibidores de
proteasas). Después de la inactivación de virus puede ser necesario
una etapa de purificación adicional para retirar las sustancias
químicas. En particular, se describió para el factor VIII aislado
de plasma sanguíneo la recuperación de una proteína inactivada por
virus de alta pureza mediante cromatografía de intercambio aniónico
(documento WO 93/15105). Además se han reseñado varios
procedimientos para la producción de factores de coagulación de alta
pureza, no infecciosos de plasma sanguíneo u otras fuentes
biológicas. Virus revestidos de lípidos se inactivan de manera
eficaz tratando el material potencial infeccioso con una fase
hidrófoba que forma un sistema de dos fases, a partir del que la
parte insoluble se retira posteriormente.. Una ventaja adicional se
ha probado que complemente el tratamiento de fase hidrófoba de
manera simultánea o secuencial con un tratamiento con detergentes
biocompatibles no iónicos y fosfatos de dialquilo o trialquilo. Los
documentos WO 9636369, EP0131740, US 6.007.979). Los virus
revestidos de no lípidos requieren la inactivación de protocolos que
consisten en el tratamiento con detergentes no iónicos seguido de
una etapa de calentamiento (60-65ºC) durante varias
horas (documento WO 94/17834).
En vista de los resultados anteriores se cree que
al combinación de un sistema de expresión de proteínas eficaz
basado en una línea celular humana junto con los procedimientos
aprobados para la inactivación de agentes infecciosos
potencialmente peligrosos que sirven como un sistema de uso seguro y
fácil para la producción de factores de coagulación
recombinantes.
Además, de acuerdo con la realización (1) de la
invención se proporciona un mutante del factor VIII superior. Dicho
mutante del factor VIII puede ser parte de composiciones
farmacéuticas, y se puede usar para preparar medicamentos para
tratar hemofilia (realizaciones (7) y (8) de al invención). Las
composiciones farmacéuticas anteriores y los medicamentos
anteriores pueden comprender el factor VIII en una dosis
terapéuticamente eficaz, por ejemplo, entre 50 y 500 \mug (con
200 ng de factor VIII correspondiente a una subunidad internacional
(IU)). Dependiendo del tipo de hemofilia, un paciente recibe una
dosis anual del factor VIII de hasta 200.000 IU, que se administra
usualmente en dosis semanales o dos veces semanalmente.
Las composiciones farmacéuticas y medicamentos de
las realizaciones (7) y (8) contienen una dosis terapéuticamente
eficaz de la muteína del factor VIII de la realización (1) o el
vector de transferencia de genes de la realización (4). En el caso
de lo anterior, puede adicionalmente comprender aditivos
farmacéuticamente aceptables que incluyen albúmina sérica bovina
(HSA; preferiblemente solución aproximadamente 1 mg/ml); sales
inorgánicas tales como CaCl_{2} (preferiblemente 2 a 5 mM),
aminoácidos tales como glicina, lisina, e histidina (preferiblemente
0,1 a 1 M por aminoácido); disacáridos tales como sacarosa y/o
trehalosa (preferiblemente 0,4 a 1 M); sales orgánicas tales como
citrato de sodio (preferiblemente hasta 50 mM); etc. Las
preparaciones pueden ser acuosas o no acuosas. En este último caso
e componente principal es glicerol y/o polietilenglicol (por
ejemplo., PEG-300) La preparación también puede
estar en la forma seca (a disolver en el disolvente deseado antes
de la administración).
Como se ha expuesto anteriormente, el vector de
transferencia de genes de acuerdo con la realización (4) de al
invención también puede ser parte de composiciones farmacéuticas y
se puede usar para preparar medicamentos para tratar hemofilia
(realizaciones (7) y (8) de la invención). Dichas composiciones
farmacéuticas y medicamentos pueden adicionalmente comprender
formulaciones de matriz adecuadas, por ejemplo, lípidos u hormonas
como se ha descrito en el documento WO 00/49147. La composición
farmacéutica o medicamento que comprende el vector de transferencia
de genes o el vector de transferencia de genes de al presente
invención se puede administrar por vía oral, intravenosa,
intramuscular, subcutánea, tópica, a través de la mucosa (incluyendo
bucal, pulverización nasal) o mediante una pistola de genes. Se
prefiere la administración oral (por ejemplo, en una dispersión de
hormonas micronizada).
La muteína del factor VIII de la realización (1)
de la invención se puede preparar adicionalmente mediante técnicas
recombinantes convencionales (realización (6) de al invención), por
ejemplo, un procedimiento que comprende
- (a)
- cultivar una células hospedadora transformada con el vector de la realización (3) y/o que comprende el ADN de la realización (2) (que también incluye el cultivo de una línea celular humana inmortalizada que expresa establemente el antígeno T del virus Simio y que leva un vector que tiene un promotor de CMV unido funcionalmente a una secuencia de ADN que codifica la muteína del factor VIII (realización (9) de la invención); y
- (b)
- aislar la muteína del factor VIII a partir del caldo de cultivo. Las líneas celulares humanas inmortalizadas son las que se han mencionado en esta memoria descriptiva anteriormente. La línea celular humana inmortalizada utilizada en dicho procedimiento preferiblemente expresa dos proteínas activadoras de transcripción viral, lo más preferiblemente antígeno T de SV40 sensible a la temperatura y proteína E1A de adenovirus. El procedimiento puede adicionalmente comprender las etapas de purificación e inactivación de virus (c) y (d) descritas en esta memoria descriptiva anteriormente.
La línea celular 293 T disponible comercialmente
(ECACC: tsa201, ref. 96121229) se depositó con la DMSZ (Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH, Mascheroder Weg
1b, 38124 Braunschweig, Alemania) el 20 de febrero de 2001 bajo el
número de depositario DSM ACC2494.
La invención se ilustra adicionalmente mediante
los siguientes ejemplos.
La secuencia para el factor VIII recombinante se
obtuvo mediante transcripción inversa a partir de una combinación
de ARN hepatocelular humano completo. Después cuatro fragmentos
(1/1, 3/4, 5/6, 7/8) se amplificaron mediante PCR convencional
usando cebadores diseñados para que contenga sitios de restricción.
Para ajustar juntos los fragmentos 3/4 Y 5/6 el fragmento SmaI/SalI
del plásmido pBSFVIII3/4 se insertó ciego en el sitio SalI de
pBSFVIII5/6 para obtener pBSFVIII3/6. A continuación, el fragmento
3/6 se obtuvo digiriendo pBSFVIII3/6 con XhoI/BspHI y parcialmente
con Alw4I. Este fragmento y el fragmento PstI/Alw441 de pBSFVIII1/2
se ligaron en una etapa en al estructura central del vector de
pBSFVIII1/2 digerido con PstI y XhoI obteniendo por estos medios
pBSFVIII1/6. El fragmento 7/8 se obtuvo digiriendo pBSFVIII7/8 con
SmaI y parcialmente con Mva1269I y se ligó en pBSFVIII1/6 cortado
con XhoI y Mva1269I dando lugar a pBSFVIII1/8. Finalmente el
fragmento SmaI/XhoI de pBSFVIII1/8 se insertó ciego en el sitio SalI
del vector Octagene pTGFG67 (describiéndose la producción de dicho
vector en PCT/EP00/01368) que da como resultado el vector de
expresión eucariótico del factor VIII humano VIII
pTGF8-1(véase las figuras 1 y 2). El vector
resultante codifica una muteína del factor VIII que tiene las
mutaciones V162A, S2011N y V2223E.
Una línea celular preferida es tsA201 (ECACC
Ref.: 96121229) que es una línea celular humana fetal transformada
(293, ECACC número 8512602) que expresa establemente un antígeno T
sensible a la temperatura de SV40 (J. Membrana Biol. 1996; 152:39;
Gene 1995; 156:235; PNAS USA 1994; 91:12785; Pflügers Arch. 1994;
427:136; J. Gen. Physiol. 1994; 104:507; Biotechniques 1993;
15:906). Otros nombres para esta línea celular incluyen
293tsA1609neo (Mol. Cell. Biol., 1987, 7:379) y 293T. Esta línea
celular de tipo epitelial se ha usado en una diversidad de ensayos
de expresión funcional y se he reseñado que produce altos niveles
de proteínas recombinantes. Se puede cultivar en DMEM suplementado
con glutamina 2 mM y FCS al 10%.
Para simplificar la purificación de un
polipéptido expresado, las células se pueden cultivar en medio sin
suero o sin proteína que contiene suplementos adecuados. Por razones
de estabilidad el factor VIII secretado requiere la presencia de
vWF en el medio (US5198349). También se ha reseñado la adición de
lipoproteínas, fosfolípidos, poliglicoles, metales en pequeñas
cantidades, heparina, tensioactivos no iónicos o ciclodextrina
(documentos EP0254076, US5679549, US5198349, US250421, US5576194,
EP0872487, WO94/11525, US5378612).
Las células 293T confluentes de sembraron a baja
densidad en placas de 10 cm en 6 ml de DMEM/10% FCS el día antes de
la transfección. La transfección se realizó en bruto de acuerdo con
Chen y Okayama (Mol. Cell. Biol., 7:2745 (1987)). 12 \mug del
plásmido pTGF8-1 se transfectaron para la producción
del factor VIII. Seis horas después de la transfección el medio se
reemplazó por uno reciente y el sobrenadante se recogió tres días
después de la transfección y o bien se purificó adicionalmente o se
analizó con purificación adicional mediante ELISA o coagulometría
(véanse los ejemplos 4 y 5).
Los niveles del factor VIII recombinante humano
en filtrado de cultivo de células 293T transfectadas se determinaron
por ELISA usando una preparación de anti FVIII:C de oveja
policlonal purificada por afinidad
(F8C-EIA-C, Affinity Biologicals)
como anticuerpo de captura. El revestimiento de realizó durante dos
horas en una cámara húmeda a 22ºC. Las placas (Dynex,
Immulon-4) se revistieron con 100 \mul de una
dilución de anticuerpo 100 veces en tampón de revestimiento
(carbonato sódico 50 mM pH 9,6). El lavado de la placa cuatro veces
(Encore 2000, Merck) con PBS-Tween® (0,1%, v/v) era
suficiente para bloquear las interacciones no específicas.
Después de cada etapa adicional, se requiere
lavado para eliminar proteínas no unidas. 100 \mul de cada uno de
las muestras de filtrado de cultivo recogidas de diferentes clones
de 293T transfectados de manera estable con pTGF8-3
después de 48 h se añadieron a cada pocillo. Se hicieron diluciones
del patrón de FVIII (patrón doméstico, Octapharma) en tampón de
dilución
(HBS-BSA-EDTA-Tween®)
y se incubaron a 100 \mul por pocillo. Para detección, se incubó
una dilución fácil de usar de anti-FVIII policlonal
marcado con peroxidasa (F8C-EIA-D,
Affinity Biologicals) durante 60 minutos a 100 \mul por pocillo.
Para la reacción colorimétrica, un comprimido de 5 mg de
O-fenilendiamina (P-6912, Sigma) se
disolvió en 12 ml de tampón de sustrato inmediatamente antes de uso
y se completó con 12 \mul de H_{2}O_{2} al 30%. 150 \mul de
esta solución de sustrato se añadió a cada pocillo y se realizó el
registro colorimétrico en un lector MRX (Dynex) a 490 nm después de
10 minutos de incubación a temperatura ambiente en la oscuridad y
deteniendo al reacción mediante adición de 50 \mul de
H_{2}SO_{4} 2,5 M a cada pocillo. Los resultados se calcularon
mediante regresión lineal
de concentraciones convencionales frente a absorbancias convencionales (figura 5A) y se resumen en la figura 5 B.
de concentraciones convencionales frente a absorbancias convencionales (figura 5A) y se resumen en la figura 5 B.
La actividad de coagulación del factor VIII
recombinante humano en sobrenadantes de las células 293T de cultivo
celular (transfectadas mediante precipitación con fosfato de calcio
con pTGF8-1 como se describe en el ejemplo 8) se
determinó como sigue:
La actividad de coagulación se ensayó basándose
en un ensayo de tiempo de tromboplastina parcial usando activación
de Cefalina (fosfatidil etanolamina) con un instrumento de
coagulación manual (ML-2, Instrumentation
Laboratories). Para el estudio, 100 \mul de sobrenadante no
diluido de células 293 T transfectadas, 100 \mul de plasma
deficiente (Progen) y 100 \mul de Cefalina (Instrumentation
Laboratories) se incubaron durante 5 minutos a 37ºC. La coagulación
se comenzó mediante al adición de 100 \mul de CaCl_{2}. El
tiempo de coagulación se comparó con plasma normal. Los resultados
se resumen en al figura 3 B. Como se puede observar en al figura 3
B, el sobrenadante de células de células transfectadas con
pTGF8-1 muestra una activación de coagulación
comparable con plasma normal mientras células no transfectadas
proporcionan un valor equivalente al plasma que carece del factor
VIII.
La inactivación viral se realizó de acuerdo con
el procedimiento de la patente de Estados Unidos Nº 6.007.979. A
saber, a una solución de proteínas potencialmente infecciosas se
añadieron los siguientes compuestos se añadieron posteriormente,
con agitación:
- 1.
- 0,2 ml de Tween® 80 y 0,06 ml de TNBP se añadieron a 19,74 ml de la solución o
- 2.
- 0,2 ml de Triton® X-100 y 0,2 ml de TNBP se añadieron a 19,6 ml de la solución.
1 ml de aceite de ricino de añadió a las
preparaciones 1 y 2 que después se extrajeron intensamente a
temperatura ambiente durante una hora.
La centrifugación se realizó en cada caso para al
separación de fases. Para el control de infección, se tomaron
repetidamente 1 ml de cada una a partir de la solución acuosa.
El vector preferido pTGF8-1
comprende construcciones para la expresión transitoria del factor
VIII en células de mamíferos. Para permitir un procedimiento de
selección para un clon de células transfectadas de manera estable,
un módulo para la
higromicin-B-fosfotransferasa
(fragmento HindIII-Mva 1260I de
TK-Hyg, Clontech) se subclonó en el sitio SmaI que
está presente en el vector. Las construcciones resultantes
(pTGF8-1-hyg) entonces comprenden
en cis los módulos de expresión para el factor VIII humano con un
promotor de CMV y una señal de poliadenilación de SV40 y un módulo
de expresión de
higromicin-B-fosfotransferasa con el
promotor de timidina quinasa de HSV y la señal de poliadenilación
de timidina quinasa de HSV.
Los vectores
pTGF8-2hyg-s y
pTGF8-3 (figura 6, SEQ ID números 12 y 14) son
derivados de pTGF8-1hyg, en esas mutaciones
puntuales V162A, S2011N y V2223E
(pTGF8-2hyg-s) y S2011N
(pTGF8-3) se revirtieron a la secuencia de tipo
salvaje mediante un procedimiento dependiente de PCR usando el
protocolo QuickChange® (Stratagene).
Las construcciones anteriormente permiten el
establecimiento de la expresión de manera estable de líneas
celulares mediante transfección por fosfato de calcio y posterior
selección de resistencia a higromicina. Adicionalmente los
plásmidos contiene un elemento sensible a progesterona (PRE).
Primero la concentración crítica de antibióticos
para una selección eficaz de células 293T transfectadas de manera
estable se tenía que establecer. Para este propósito las células se
sembraron a baja dilución y se desarrollaron en presencia de 10 a
800 \mug/ml de higromicina B. Después de 2 semanas a 200 \mug/ml
o más alto no se desarrollaron más células, así esta concentración
se eligió para la selección de células trasnfectadas de manera
estable.
Una transfección típica se realizó en placas de
10 cm con células 293T divididas el día antes a una relación de
1:15. Usando el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio
(Biotechniques 1988 6:7 632-638) 12 \mug
de plásmido por placa se transfectaron y dos días más tarde el medio
se reemplazó con uno reciente que contenía 200 \mug/ml de
higromicina B. Después de 2-3 semanas de selección
el medio se ensayó mediante ELISA (véase el ejemplo 4) para evaluar
la presencia del factor VIII.
Los clones positivos se aislaron y se
transfirieron a una placa de 24 pocillos. Después de seleccionar
mediante ELISA y la determinación de actividad los clones positivos
se sometieron a dos rondas adicionales de subclonación después se
expandieron y se congelaron alícuotas de ellos para uso y
caracterización.
Cada vez, 5 x 10^{7} células 293T transfectadas
de manera estable con pTGF8-3 (clon 49/19) y células
293T no transfectadas (control negativo) de cultivos de adhesión en
DMEM + FBS al 9,1% se separaron de las placas de cultivo mediante
tripsinización, se lavaron varias veces y se resuspendieron en 5 ml
de tampón PBS.
2 \mul de estas suspensiones de células se
transfirieron a portaobjetos de vidrio de microscopio estéril y se
incubaron a temperatura ambiente hasta que se evaporó el líquido.
Las células se fijaron en etanol al 70% durante 10 minutos y se
secaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos
se bloquearon contra la detección no específica mediante incubación
en una dilución al 10% de FBS en tampón PBS. Los anticuerpos
primarios (sh antiFVIII:C F8C-EIA-C,
Affinity Biologicals) se diluyeron 100 veces con tampón PBS que
contenía FBS al 10% y saponina al 0,1% y se incubaron durante 60
minutos a temperatura ambiente en una cámara de incubación húmeda.
Después de lavado intenso con PBS, se preparó una dilución 100 veces
del anticuerpo secundario (conjugado rb anti sh CY3
313-165-003, Jackson ImmunoResearch)
y se incubó de al manera descrita anteriormente. Posteriormente, la
preparación microscópica se lavó intensamente y se cubrió mediante
una capa de glicerol al 50% y un cubre objetos de vidrio. Las
células se visualizaron mediante microscopia de luz blanca y de
fluorescencia (emisión a 570 nm).
Los resultados se muestran en la figura 6.
<110> Octogene GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Producción de factores de coagulación
sanguínea recombinantes en lineas celulares humanas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 010613wo/JH/ml
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6996
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ..(6996)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2332
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8720
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: pTGFS-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (676) ..(5052)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (733)..(5052)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1459
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: pTGF8-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido de engarce al dominio B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido de: péptido de engarce al dominio B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Ala Tyr Arg Tyr Arg Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Sequence: péptido de engarc al dominio B
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Gln Ala Tyr
Arg Tyr Arg Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10698
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: pTGF8-2hyg-s
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<223> (676)..(5052)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (733)..(50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1459
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:
pTGF8-1-2hyg-s
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10698
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: pTGFS-3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (676)..(5052)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (733)..(5052)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1459
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: pTGF8-3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (27)
1. Una muteína del factor VIII en la que el
dominio B entre las posiciones Arg 740 y Glu 1649 de han
reemplazado por un péptido de engarce rico en Arg que tiene al menos
3 restos Arg y que comprende 10 a 25 restos de aminoácidos, en los
que dicha numeración del factor VIII es con relación a la secuencia
del factor VIII de tipo salvaje madura mostrada en la SEQ ID Nº
2.
2. La muteína del factor VIII de la
reivindicación 1, en la que la muteína del factor VIII tiene al
menos una de las siguientes mutaciones adicionales (a), (b) y
(c):
- (a)
- Val en la posición 162 se ha reemplazado por un resto aminoácido neutro seleccionado entre Gly, Ala Leu, Ile, Met y Pro;
- (b)
- Ser en la posición 2011 se ha reemplazado por un resto aminoácido hidrófilo seleccionado entre Asn, Thr y Gln; y
- (c)
- Val en la posición 2223 se ha reemplazado por un resto aminoácido ácido seleccionado entre Glu y Asp.
3. La muteína del factor VIII de la
reivindicación 2 que tiene al menos una de las mutaciones (a) y
(b).
4. La muteína del factor VIII de la
reivindicación 2, que tiene al menos tres mutaciones (a), (b) y
(c).
5. La muteína del factor VIII de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en la que en la
mutación (a) Val en la posición 162 se ha reemplazado por Ala, en la
mutación (b) Ser en al posición 2011 se ha reemplazado por Asn, y/o
en la mutación (c) Val en la posición 2223 se ha reemplazado por
Glu.
6. La muteína del factor VIII de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el péptido
de engarce rico en Arg tiene 14 a 20 restos aminoácidos.
7. La muteína del factor VIII de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el engarce
comprende:
la secuencia de aminoácidos SFSQNSRH, y/o
la secuencia de aminoácidos QAYRYRRG.
8. La muteína del factor VIII de la
reivindicación 7, en la que el engarce tiene la secuencia
SFSQNSRHQAY
RYRRG.
RYRRG.
9. La muteína del factor VIII de la
reivindicación 1, que comprende los aminoácidos 1 a 1440 de la SEQ
ID Nº 4, 13 ó 15.
10. Una secuencia de ADN que codifica la muteína
del factor VIII como se ha definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9.
11. La secuencia de ADN de la reivindicación 10,
que tiene al menos una de las mutaciones T485C, G6032A y T6668A con
relación a la secuencia de ADN del factor VIII de tipo salvaje
maduro mostrado en la SEQ ID nº 1, preferiblemente la secuencia de
ADN comprende las tres de dichas mutaciones.
12. Un vector que comprende el ADN como se ha
definido en la reivindicación 10 u 11.
13. El vector de la reivindicación 12 que es
pTGF8-1,
pTGF8-2hyg-s o
pTGF8-3 como se muestra en las SEQ ID números 3, 12
y 14 respectivamente.
14. El vector de la reivindicación 12 que es un
vector de transferencia de genes.
15. Una célula hospedadora aislada que se
transforma con un vector como se ha definido en la reivindicación
12 y/o que comprende una secuencia de ADN como se ha definido en la
reivindicación 10.
16. Un procedimiento para la producción de la
muteína del factor VIII como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 que comprende
- (a)
- cultivar una célula hospedadora transformada como se ha definido en la reivindicación 15, y
- (b)
- aislar la muteína del factor VIII a partir del caldo de cultivo.
\newpage
17. Una composición farmacéutica que comprende
la muteína del factor VIII como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 o un vector de transferencia de genes como se
ha definido en la reivindicación 14.
18. Uso de la muteína del factor VIII como se ha
definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o un
vector de transferencia de genes como se ha definido en la
reivindicación 14 para preparar un medicamento para tratar
hemofilia, preferiblemente para tratar hemofilia A.
19. El procedimiento de la reivindicación 16 en
el que la etapa (a) comprende cultivar una línea celular humana
inmortalizada que expresa de manera estable el antígeno T del virus
de Simio y que lleva un vector que tiene un promotor de CMV unido
funcionalmente a una secuencia de ADN que codifica la muteína del
factor VIII.
20. El procedimiento de la reivindicación 19, en
el que la línea celular humana inmortalizada es una célula
inmortalizada de riñón, vejiga, hígado, pulmón, músculo cardíaco,
músculo liso, ovario o gastrointestinal.
21. El procedimiento de la reivindicación 20, en
el que la línea celular human inmortalizada se deriva de una célula
de riñón humano y preferiblemente es la línea celular 293 T (DSM
ACC2494).
22. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en el que el vector
comprende un marcador de selección y/o secuencias reguladoras.
23. El procedimiento de la reivindicación 16, en
el que la célula hospedadora es una célula inmortalizada de riñón,
vejiga, hígado, pulmón, músculo cardíaco, músculo liso, ovario o
gastrointestinal, preferiblemente se deriva de una célula de riñón
humano.
24. El procedimiento de la reivindicación 23, en
el que la línea celular inmortalizada expresa al menos una proteína
activadora de transcripción viral, tal como proteínas activadoras
seleccionadas entre proteínas E1A o E1B de adenovirus, una proteína
codificada por la secuencia de ADN de la región temprana de virus de
papiloma bovino y proteínas IE de virus herpes.
25. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, en el que el cultivo se
realiza en la presencia del factor de von Willebrand (vWF).
26. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 16 y 19 a 25 que comprende
adicionalmente
- (c)
- purificar el factor de coagulación de sangre aislado en la etapa (b), y/o
- (d)
- someter el factor de coagulación de sangre aislado en la etapa (b) o purificado en la etapa (c) a un tratamiento de inactivación de virus.
27. Una línea celular humana inmortalizada, como
se ha definido en uno cualquiera de los procedimientos de las
reivindicaciones 19 a 21, que expresa de manera estable al menos una
proteína activadora de transcripción viral, y que lleva un vector
que codifica una muteína del factor VIII, como se ha definido en las
reivindicaciones 1 a 9.
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