KR20030011079A

KR20030011079A - 인간 세포계 내 재조합 혈액 응고 인자의 제조

Info

Publication number: KR20030011079A
Application number: KR1020027012443A
Authority: KR
Inventors: 하우저샤를로테; 안드레아 홀스터; 슈뢰더카롤라; 레네러미하엘
Original assignee: 옥타게네 게엠베하
Priority date: 2000-03-22
Filing date: 2001-03-21
Publication date: 2003-02-06
Also published as: US7572619B2; FR15C0003I2; IL151857A0; MXPA02009221A; AU2006201848A1; IL151857A; HU228091B1; US20040023333A1; NO20024475D0; CZ20023166A3; EP1460131A3; ES2254403T3; WO2001070968A3; EE200200538A; DE60115613D1; EA004317B1; SK15042002A3; DE60115613T2; RS50743B; BE2014C077I2

Abstract

본 발명은 바이러스성 전사 활성화 단백질을 지속적으로 발현시키고 혈액 응고 인자를 코딩하는 DNA 서열과 기능적으로 이어진 프로모터가 있는 벡터를 운반하는 불멸화된 인간 세포계를 사용하여, 재조합 인간 혈액 응고 인자, 특히 재조합 인자 Ⅷ 및 재조합 인자 Ⅸ의 개선된 제조 방법(상기 프로모터는 상기 바이러스성 전사 활성화 단백질에 의하여 자극되는 바이러스성 프로모터는 아님을 조건으로 함); 상기 벡터를 운반하는 불멸화된 인간 세포계; 상기 제조 방법에 특히 적합한 인자 Ⅷ의 뮤테인(mutein); 상기 인자 Ⅷ의 뮤테인을 포함하는 제약학적 조성물 및 혈우병 치료용 약제 제조에 있어서 상기 인자 Ⅷ의 뮤테인의 용도에 관한다.

본 발명은 재조합 인간 혈액 응고 인자, 특히 인자 VIII 및 인자 IX를 제조하는 개선된 방법에 관한다.

Description

인간 세포계 내 재조합 혈액 응고 인자의 제조{PRODUCTION OF RECOMBINANT BLOOD CLOTTING FACTORS IN HUMAN CELL LINES}

도입

본 발명은 바이러스성 전사 활성화 단백질을 지속적으로 발현시키고 혈액 응고 인자를 코딩하는 DNA 서열과 기능적으로 이어진 프로모터가 있는 벡터를 운반하는 불멸화된 인간 세포계을 사용하여, 재조합 인간 혈액 응고 인자, 특히 재조합 인자 Ⅷ 및 재조합 인자 Ⅸ의 개선된 제조 방법에 있어서, 상기 프로모터는 상기 바이러스성 전사 활성화 단백질에 의하여 자극되는 바이러스성 프로모터는 아니고; 불멸화된 인간 세포계가 상기 벡터를 운반하며; 인자 Ⅷ의 뮤테인(mutein)이 상기 제조 방법에 특히 적합하고; 제약학적 조성물이 상기 인자 Ⅷ의 뮤테인을 포함한다는 조건 하의 방법 및 혈우병 치료용 약제 제조에 있어서 상기 인자 Ⅷ의 뮤테인의 용도에 관한다.

관련 분야의 개요

혈우병은 혈액 응고 단계의 단백질 성분의 기능 장애로 인한 출혈성 이환상태를 앓는 것이다. 작용하는 혈액 응고 인자에 따라, 두 종류의 혈우병이 구별될 수 있다. 양자 모두 일반적으로 용해성 피브리노겐이 불용성 피브린-덩어리로 전환되는 것이 억제된다. 양자 모두 주로 X-염색체와 관련된 반성 열성 유전병이어서 주로 남성들에게 발병한다.

혈우병 A는 남성 10,000명당 1-2 명 정도에게 발생한다. 이는 매우 큰 글리코프로테인[Mr 대략 330 kDa (Furie B., Furie B.C., Cell(1988) 53, 505-518)]인 인자 Ⅷ의 결함 또는 결손에 의한 것으로, 상기 인자는 혈액 응고 단계에 있어서 중요한 요소이다. 폴리펩티드 서열은 일명 A1-도메인 및 A2-도메인으로 이루어진 N-말단 영역, 중앙의 B-도메인 영역 및 A3-도메인, C1-도메인 및 C2-도메인으로 구성된 C-말단 영역의 3개의 리글론(reglon)으로 나뉘어진다. 혈액 응고에 있어서, 인자 Ⅷ는 불활성화된 상태인 전구체로서 나타난다. 상기 인자 Ⅷ는 von Willebrand 인자(vWF)와 비공유결합을 통해 단단히 결합되어 있는데, 이는 담체 단백질을 안정화시키는 작용을 한다. 트롬빈에 의하여 3개의 특정 위치(740, 372, 1689)에서 인자 Ⅷ가 분해되면 인자 Ⅷ는 vWF 와 분리되어 응고 단계 내에서 전응고 기능을 개시시킨다. 인자 Ⅷ가 활성 형태의 경우, 이는 인자 Ⅸa와 함께 작용하는 인자(cofactor)로서 작용하여, 몇몇 순서를 거쳐 인자 Ⅹ의 단백질분해 작용을 가속화시킨다.

혈우병B 는 남성25,000중 대략 1명 꼴로 발생한다. 세린 분해효소 인자 Ⅸ(Christmas 인자)의 결함이 특징이다. 이의 415개 아미노산 폴리펩티드는 56kDa 글리코프로테인으로서 간에서 합성된다. 상기 인자 Ⅸ가 적당한 기능을 수행하기 위하여, 비타민 K의 존재하에만 일어나는 번역 후 카복실레이팅 (posttranslation carboxylation) 단계가 요구된다.

두 가지 종류의 출혈 질환 치료는 통상적으로 인자 Ⅷ 또는 인자 Ⅸ의 농축물인 인간 혈장에서 유도된 단백질의 주입을 포함한다. 상기 방법은 혈우병에 효과적인 치료법이나, 이는 간염 또는 AIDS, 또는 혈전색전증 인자를 유발하는 바이러스와 같은, 바이러스 감염 물질이 옮겨질 수 있는 위험을 수반한다. 이와는 달리, 혈액 응고 인자를 제조하는 몇몇 재조합 DNA 기법이 기술되어 왔다. 이를 위하여, 천연(wild type) 인자 Ⅷ 및 인자 Ⅸ에 상응하는 cDNA가 분리되여 적합한 발현 벡터내로 클로닝되어 왔다. (EP-A-160457; WO-A-86/01961, U.S. 특허 4,770,999, 5,521,070 및 5,521,070)

인자 Ⅷ의 경우, 응고 활성을 보이는 착물 제조용 하위단위(subunit)의 재조합 발현은 업계에 공지되어 있다.(예를 들어, EP-A-150735, EP-A-232112, EP-A-0500734, WO-91/07490, WO-95/13300 미국특허 5,045,455 및 5,789,203) 더구나, 고글리코실레이팅된(highly glycosylated) 또한, 고도로 글리코실레이팅된 (glycosylated) B-도메인을 코딩하는 서열이 부분적으로 또는 전체적으로 없는 cDNA-절단형의 발현도 기술되어 있다. (예를 들어, WO-86/06101, WO-87/04187, WO-87/07144, WO-88/00381, EP-A-251843, EP-A-253455, EP-A-254076, 미국 특허 4,868,112 및 4,980,456, EP-A-294910, EP-A-265778, EP-A-303540 및 WO-91/09122) 최근에는 엄선된 점돌연변이가 일어난 변종을 도입하여, 활성화된 단백질 C에 의하여 단백질분해로 인한 인자 Ⅷ의 불활성을 억제하거나 또는 면역원성을 감소시킴으로써 치료받은 환자에게서 억제성 항체를 생성시켜왔다. (예를 들어, 미국 특허 5,859,204, 5,422,260 및 5,451,521, WO-97/49725 및 WO-99/29848)

재조합 혈액 응고 인자를 지속적으로 트렌스펙팅된(transfected) 진핵세포 및 바람직하게는 포유류 세포계의 배지로부터 일반적으로 분리하였다. 그러나, 인간 세포 내에 잠복하여 발현될 수 있는 일부 감염 물질로 오염될 수 있는 위험을 배제하기 위하여, 인간 이외의 세포계를 사용하는 일반적인 실시가 상기 언급된 참조 문헌에 기재되어 있다.

그러나, 특히 인자 Ⅷ의 경우, 인간 이외의 세포계을 사용하는 것은 불편함을 야기시킬 수 있다. 예를 들어, 배지 내에서 발현된 단백질이 만족스럽지 못한 수준으로 분비(secretion)되는 것이 보고되어 왔다. 이는 단백질을 번역하고 변형시키는 세포 과정에 있어서, 상이한 종의 포유류 세포에 존재하는 미차에 의한 것으로, 이는 또한 발현된 폴리펩티드의 생물학적 활성에 영향을 끼칠 수도 있다. 이와는 별개로, 인간 이외의 발현 시스템에서 정제된 치료용 단백질은 환자에게 항원 반응을 일으킬 수 있는 세포 성분으로 오염될 우려가 있다.

더구나, 인간 이외의 발현 시스템에서 발현된 단백질은 환자에게 항원 반응을 일으키는 비-인간형으로(non-human) 글리코실레이팅된 형으로서 존재할 수 있다. 그러나, 혈액 응고 인자의 생물학적 안정성 및 효능은 실질적으로 인자의 N-글리코실레이팅된 형태에 영향을 받는다. 특히, 말초 모노사카라이드 및 말단 모노사카라이드는 이들의 감성(減性)에 반응하는 세포에서 특정 수용기에 의하여 검출되기 때문에, 이들은 중요하다. 혈액 응고 인자는 말단 모노사카라이드로서 시알산 잔기를 운반한다. 예를 들어 혈액 응고 인자와 같은 글리코프로테인의 감지기 내의 시알산 조성물을 변형시킨 결과 이질적인 글리코실레이팅된 형을 만들 수 있다. 따라서, 생물학적 안정성 및 효능은 변형을 통하여 결정적으로 달성될 수 있다. 그러므로, 재조합 혈액 응고 인자의 제조에 있어서, 인간 세포계 대 인간 이외의 세포계으로부터의 글리코실레이팅의 영향을 평가하는 것은 매우 중요하게 고려되어야 하는 것이다. 일반적으로, 인간 이외의 세포계보다 인간 세포계가 재조합 혈액 응고 인자의 제조에는 훨씬 알맞다고 여겨진다. 상기와 같은 추측의 근거는 아마도 중요치 않은 올리고사카라이드가 재조합 인자의 합성동안 올리고사카라이드 부분들로 합체되지 않는 점일 것이다.

반면, 바이러스성 전사 활성화 단백질을 발현시키는 불멸화되고 지속적으로 트랜스펙팅된 포유류 세포계를 포함하는, 목적하는 유전자를 이용하여 단백질을 고도로 발현시키는 통상적인 방법이 얼마동안 사용되었다.(예를 들어, 미국 특허 5,712,119) 이에 덧붙여, 적합한 바이러스성 전사 프로모터가 관심있는 유전자로 한정된 DNA서열과 기능적으로 결합되고, 전사 활성화 단백질은 바이러스성 전사 프로모터를 활성화시켜 관심있는 유전자의 발현을 개시시키는 벡터 구축물을 통하여 상기 세포는 추가로 형질전환된다. 역시, 상기 세포계에 의하여 발현된 전사 활성화 단백질이 목표 치료용 단백질 내 오염을 야기할 우려가 있다.

상기 살펴본 바와 같이, 인간 혈액 응고 인자를 효과적으로 제조하는 방법이 여전히 필요했다.

놀랍게도, 오염되지 않은 혈액 응고 인자를 상기 언급하였던 불멸화된 인간 세포계과 함께 얻을 수 있음이 밝혀졌다. 특히, 불멸화된 세포계 - 혈액 응고 인자를 코딩하는 DNA 서열과 기능적으로 이어진 프로모터가 상기 바이러스성 전사 활성화 단백질로 자극되는 바이러스성 프로모터가 아님에도 불구하고, 상기 불멸화된 세포계가 상기 프로모터가 있는 벡터를 운반한다면 - 혈액 응고 인자를 발현시킬수 있다. 적합한 단백질 정제 및 바이러스-불활성화 프로토콜(protocol)을 조합되어, 상기 방법은 인간의 치료용으로 안전하고도 고도로 활성화된 재조합 혈액 응고 인자를 제조하는 효과적인 시스템을 제공한다. 더구나, 단백질분해 불활성화에 대하여 이례적으로 안정하여 강력한 바이러스 불활성화 프로토콜에 적합한 인자 Ⅷ의 뮤테인이 특히 발견되었다.

발명의 개요

본 발명은

(1) (a)인간의 혈액 응고 인자를 코딩하는 DNA 서열과 기능적으로 이어진 프로모터가 하나 이상의 바이러스성 전사 활성화 단백질에 의하여 자극되는 바이러스성 프로모터가 아니라는 조건 하에, 상기 프로모터가 있는 벡터를 운반하고 하나 이상의 바이러스성 전사 활성화 단백질을 지속적으로 발현시키는 불멸화된 인간 세포계을 배양하는 단계

(b)배양액으로부터 혈액 응고 인자를 분리하는 단계

로 이루어지는 재조합 인간 혈액 응고 인자의 제조 방법;

(2) 상기 방법(1)의 바람직한 구체예에 있어서, 인간 혈액 응고 인자가 인자 Ⅷ 또는 이의 뮤테인인 구체예;

(3) 상기 방법(2)의 바람직한 구체예에 있어서, 인자 Ⅷ가 하나 이상의 하기돌연변이를 갖는 뮤테인이고:

(a) 162번 위치의 발린이 다른 중성 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이

(b) 2011번 위치의 세린이 다른 친수성 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이

(c) 2223번 위치의 발린이 산성 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 및

(d) 740번 위치의 아르기닌과 1649번 위치의 글루탐산 사이에 있는 B-도메인이 10-25개의 , 바람직하게는 14-20개의 아미노산 잔기로 이루어진 아르기닌이 풍부한 링커 펩티드로 치환된 돌연변이

상기 인자 Ⅷ의 배열된 아미노산의 번호(numbering)는 서열번호 2 성숙한 천연 (mature wild-type) 인자 Ⅷ의 서열과 관계있는 구체예;

(4) 상기 방법(1)의 바람직한 구체예에 있어서, 인간 혈액 응고 인자가 인자 Ⅸ 또는 이의 뮤테인인 구체예;

(5) 상기 방법(1) 내지 방법(4)의 인간 혈액 응고 인자를 코딩하는 벡터를 운반하는 불멸화된 인간 세포계;

(6) 상기 방법(3)의 인자 Ⅷ의 뮤테인;

(7) 상기 방법(6)의 인자 Ⅷ의 뮤테인을 코딩하는 DNA 서열;

(8) 상기 방법(7)의 DNA 를 포함하는 벡터;

(9) 상기 방법(8)의 유전자 변형 벡터;

(10) 상기 방법(8)의 벡터로 형질전환되고/되거나 상기 (7)의 DNA 서열을 포함하는 숙주 세포;

(11) 상기 방법(6)의 인자 Ⅷ의 뮤테인 또는 상기 (9)의 유전자 변형 벡터를 포함하는 약제학적 조성물;

(12) 상기 방법(6)의 인자 Ⅷ의 뮤테인 또는 상기 방법(9)의 유전자 변형 벡터의 혈우병 치료용 약제 제조이 있어서의 용도; 및

(13) 상기 방법(6)의 인자 Ⅷ의 뮤테인 또는 상기 방법(9)의 유전자 변형 벡터를 인간 혈우병에 적용하는 것을 포함하는 혈우병 치료방법

도1에서는 B-도메인이 결실된 인자 Ⅷ의 제조에 사용되는 단편을 나타내었다.(실시예 1)

도2에서는 8720 bps 의 원형 DNA인 벡터 pTGF8-1 의 DNA 서열(이의 정확한 DNA 서열은 서열번호 3임.)을 나타내었다.(상기 DNA 서열로 코딩된 인자 Ⅷ 단백질은 서열번호 4를 참조하시오.)

도3에서는 5753 bps 의 원형 DNA인 벡터 pTGFG36 의 DNA 서열(이의 정확한 DNA 서열은 서열번호 6임.)을 나타내었다.(인자 Ⅸ 단백질을 코딩하는 서열번호 6 내의 689-2071 베이스)

도4에서는 8124 bps 의 원형 DNA 인 벡터 pTG36hyg 를 나타내었다.

도5A에서는 본 발명의 바람직한 링커(linker)서열(서열번호 9)을 나타내었다.

도5B에서는 실시예 6에서 측정된 재조합 hFⅧ의 응고 시간을 나타내었다.

도6에서는 10698 bps 의 원형 DNA 인 pTGF8-2hyg-s 및 pTGF8-3(이들의 정확한 DNA 서열은 서열번호 12 및 14임.)의 통상적인 분자 구조를 나타내었다.(상기 DNA 서열로 코딩되는 인자 Ⅷ 단백질은 서열번호 13 및 15를 참조하시오.)

도7A에서는 실시예5에 기술된 FⅧ ELISA의 교정 곡선(calibration curve)을 나타내었다.

도7B에서는 실시예5에 기술된 상이한 배지 여과액 내의 재조합 FⅧ의 농도 측정 결과를 나타내었다.

도8에서는 실시예 9에 기술된 인자 Ⅷ 특이 면역형광 검출법 결과를 나타내었다. 상위 열(upper row): pTGF8-3로 지속적으로 트랜스펙팅된 293T 세포, 클론 49/19. 하위 열(lower row): 음성 대조구(negative control)트랜스펙팅되지 않은 293T 세포. A 및 C: 백광이며 필터가 없고; B 및 D: 550mm의 필터로 형광으로 검출한 인자 Ⅷ.

도9에서는 실시예 10에 기술된 배양 여과액 내 FIX 활성에 대한 열처리의 영향을 나타내었다.

도10에서는 배양액에 비타민 K를 보충에 대한 활성 재조합 인자 Ⅸ의 발현의 의존성을 나타내었다.

"기능적으로 이어진"이란 인간 혈액 응고 인자를 코딩하는 DNA 서열의 전사를 촉진할 수 있는 방법으로 벡터 내에 프로모터가 놓인 벡터의 위치를 말한다. "기능적이지 않게 이어진"이란 프로모터가 혈액 응고 인자로 발현되어야 하는 유전자 서열로부터 너무 멀리 놓여 상기 유전자의 전사를 촉진할 수 없는 위치에 놓인 것을 말한다.

"유전자"란 임의로 리더(leader) 및 트레일러(trailer) 서열 및 인트론과 엑손을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 말한다.

"벡터"란 플라스미드, 파지, 코스미드 등과 같은 혹종의 유전자 구축물로서, 적당한 조절 요소와 결합되면 복제될 수 있는 유전자 구축물을 말한다. 상기 용어는 클로닝 및 발현체를 포함한다. "벡터를 운반하는 것"이란 숙주 세포 내로 기능성 DNA 단편을 지속성이 있으며 일시적으로 합체시키는 것을 포함한다. 그러나 지속적인 합체가 바람직하다.

본 발명에 있어서 "유전자 변형 벡터"는 유전자 치료에 적합한 벡터를 포함한다. 상기와 같은 벡터는 원하는 목적에 따라 업계에 공지된 기능성 서열로 이루어진다.

"성숙한(mature)"이라는 용어는 단백질이 세포에서 분비된 직후의 분자 구조를 갖는 것을 말한다. [즉, 단백질의 N-말단 방출-시그날(export-signal) 폴리펩티드가 없는 상태를 말함.]

"프로모터"란 RNA 중합효소가 결합된 유전자의 전사를 조절하는 조절 DNA 서열의 리글론을 말한다.

본 발명의 약제학적 조성물의 "치료에 효과적인 양"이란 예를 들어, 혈우병 증상을 효과적으로 치료하거나 감소시키는 양과 같이, 치료 또는 예방에 효과적인 양을 말한다.

"코딩하는" 또는 "코딩하는"이란 적절한 조절 서열 하에 놓인 경우, 시험관 내 또는 생체 내에서 폴리펩티드로 전사(DNA 의 경우)되거나 번역(mRNA 의 경우)되는 핵산 서열의 특성을 말한다.

본 출원의 목적에 있어서, "발현되다", "발현되는" 또는 "발현"이란 단백질을 코딩하는 유전자의 전사 및 번역을 말한다.

상기 (1) 내지 (13) 에 기술되어 있는 본 발명은 이하 더욱 상세히 기술된다. 본 출원의 발명의 구체예(1)에 있어서, 인간 혈액 응고 인자를 코딩하는 DNA 서열과 기능적으로 이어진 프로모터는 불멸화된 인간 세포계에 의하여 발현되는 하나 이상의 바이러스성 전사 활성화 단백질에 의하여 촉진되는 바이러스성 프로모터가 아니다.

불멸화된 인간 세포계는 바람직하게는 불멸화된 신장 세포, 방광 세포, 간 세포, 폐 세포, 심장 근육 세포, 평활(smooth)근육 세포, 난소 세포 또는 위장 세포이다. 불멸화된 인간 세포계는 태아의 신장 세포에서 유도된 것이 더욱 바람직하고 293T (ECACC:tsa201, ref.96121229;DSM ACC2494) 세포계가 가장 바람직하다.

불멸화된 세포계에 의하여 발현된 하나 이상의 전사 활성화 단백질은 Simina 바이러스 T 항원, 아데노바이러스 E1A 또는 E1B 단백질, 소 유도종 바이러스 초기 영역 DNA 서열에 의하여 코딩된 단백질 및 포진 바이러스 IE 단백질을 포함한다. 바람직하게 불멸화된 세포는 예를 들어, 온도에 민감한 SV40 T 항원 및 아데노신바이러스 E1A 단백질(상기 293T 세포계과 같은)와 같은 2개 이상의 바이러스성 전사 활성화 단백질을 발현시킨다.

인간 혈액 응고 인자를 코딩하는 DNA 서열에 기능적으로 이어진 프로모터는 바람직하게는 다음과 같은 프로모터를 포함한다;

(ⅰ) 상기와 같이 (SV40 및 CMV과 같이) 정의된 불멸화된 세포를 통하여 발현되는 활성화 단백질에 의하여 자극되지 않는 바이러스성 프로모터;

(ⅱ) 내재되어 있는(housekeeping) 숙주 프로모터(알부민); 및

(ⅲ) (간의 경우 α-안티트립신과 같은) 특정 조직의 프로모터.

본 발명에 있어서, (불멸화된 세포를 통해 발현된 전사 활성화 단백질이 상기 프로모터에 의하여 자극되지 않으나,) CMV 프로모터가 가장 바람직하다.

본 발명에 있어서, 벡터는 상기 바이러스성 전사 활성화 단백질에 의하여 촉진되나, 혈액 응고 인자와는 기능적으로 이어지지 않는 추가의 바이러스성 프로모터를 운반할 수 있다. 상기 바이러스성 프로모터는 아데노바이러스, 로우스 육종 바이러스 및 사이토메갈로바이러스로부터 유도된 프로모터 중 선택된다. 벡터는 하나 이상의 선택 마커(marker), 조절 서열(예를 들어, PRE) 등의 기능성 서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 구체예(1)에 따른 인간 혈액 응고 인자는 인자 Ⅸ, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅶ, 인자 Ⅴ, von Willebrand 인자(vWF) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구체예(2)의 경우, 벡터는 인자 Ⅷ 또는 이의 뮤테인을 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 재조합 인자 Ⅸ는 혈장으로부터 분리된 천연 단백질과 통상 구조적으로 일치하는 반면, 일부 변형된 인자 Ⅷ 발현 제조물은 재조합발현이 되도록 설계되어 왔다. 기능적 인자 Ⅷ 폴리펩티드의 도메인 구조를 살펴보면, vWF 와 상호작용하는 중요한 부위는 A3-도메인(아미노산 1680-1689) 및 C2-도메인 [Kaufman & Pipe,Haemophilia(1998) 4, 370-379]내에 있다. 1689 이후가 절단되면 vWF 로부터 인자 Ⅷ가 분리되어 인자 Ⅷ이 대전된 포스폴리피드와 상호작용할 수 있게 된다. vWF와 결합하는 부위가 없는 재조합 인자 Ⅷ 구축물은 인자 Ⅷ에 결함이 있는 쥐에 투여하였을 때, 극히 용이하게 분해되는 것으로 나타났다. 포유류 세포 배양액 내의 B-도메인이 완전히 없다고 입증된 절단된 인자 Ⅷ의 재조합 발현물은 이와 상응하는 인자 Ⅷ와 유사한 단백질의 생물학적 활성을 변화시키지 않는다.[Eaton 등,Biochemistry(1986)25, 8342-8347]이 밖에도, B-도메인이 제거된 제조물의 관찰될 수 있을 정도의 발현율은, 세포 내 증가된 mRNA-수준으로 인하여 천연 인자 Ⅷ에 비하여 상당히 높았다.[Pittman 등, Blood (1993) 81, 2925-2935] 4가지의 재조합 인자 Ⅷ 제품(RecomninateBaxter HealthCare; Kogenate및 Kogenate FSBayer Corporation 및 RefactoWyeth, Genetics Institute)이 현재 시판되고 있다.

본 발명의 바람직한 구체예(3)에 있어서, 인자 Ⅷ의 뮤테인은 하기 돌연변이 (a) 내지 (d)중 하나 이상이 일어난 것으로서,;

(a) 162번 위치의 발린이 다른 중성 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이;

(b) 2011번 위치의 세린이 다른 친수성 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이;

(c) 2223번 위치의 발린이 산성 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이; 및

(d) 740번 아르기닌과 1649번 글루탐산 사이에 있는 B-도메인이, 10-25개의바람직하게는 14-20개의 아미노산 잔기로 이루어진 아르기닌이 풍부한 링커 펩티드로 치환된 돌연변이

상기 인자 Ⅷ의 아미노산 서열의 번호(numberibg)은 서열번호 2 [19 아미노산 시그날 펩티드는 포함하지 않으나, 완전한 B-도메인(WO 99/29848)을 포함하는 성숙한 펩티드의 아미노산 서열로 됨]의 천연 인자 Ⅷ의 아미노산 서열과 관계있다.

본 발명에 있어서 "다른 중성 아미노산 잔기"에는 글리신, 알라신, 류신, 이소류신 메티오닌 및 프롤린을 포함되며 알라닌이 바람직하다. "다른 친수성 아미노산 잔기"에는 아스파라긴, 트레오닌 및 글루타민이 포함되며 아스파라긴이 바람직하다. 산성 아미노산 잔기는 글루탐산 및 아스파라긴산에서 선택되며 글루탐산이 바람직하다.

구체예(3)의 인자 Ⅷ의 뮤테인 중에서 인자 Ⅷ의 뮤테인에 상기 돌연변이 (a), (b) 및 (c) 중 하나 이상이 있는 것이 바람직하고, 돌연변이 (a) 및 (b) 중 하나 이상이 더욱 바람직하며, 3개의 돌연변이 (a) 내지 (c)가 모두 있는 것이 가장 바람직하다. 뮤테인이 3개의 돌연변이 V162A, S2011N 및 V2223E를 모두 포함하는 것이 특히 바람직하다.

상기와 동일하게, 본 발명의 구체예(4)의 벡터가 포함하는 DNA 서열은 서열번호 1의 성숙한 천연 인자 Ⅷ의 DNA 서열에 관하여 돌연변이 T485C, G6032A 및 T6668A 가 일어난 것이다. 바람직한 구체예의 경우, 상기 DNA 서열은 잠재성(즉, 침묵) 돌연변이 T6816C (역시, 성숙한 천연 인자 Ⅷ의 DNA 서열에 관한 상기 아미노산 서열의 번호임.) 또한 함유한다.

구체예(3)의 인자 Ⅷ의 뮤테인 중 이와 별개로, 인자 Ⅷ의 뮤테인에 상기 돌연변이 (d)가 일어난 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 발현 시스템은 - 상기 점 돌연변이 (a) 내지 (c) 외에도- 인자 Ⅷ의 B-도메인이 부분적으로 또는 전체적으로 없는 특유의 인자 Ⅷ의 뮤테인을 사용하는 것인데, R740 및 E1649 사이의 B-도메인이 상기 (d)의 아르기닌이 풍부한 아미노산 스페이서(spacer)로 치환된 것이 특징인 뮤테인이 바람직하다. 본 발명에 있어서 "아르기닌이 풍부한"이란 상기 스페이서가 3 이상, 바람직하게는 4 이상의 아르기닌 잔기를 포함하는 것을 뜻한다. 가장 바람직한 구체예의 경우, 상기 스페이서는 천연 B-도메인의 8개의 아미노산 다음에 변종 도메인(도5A, 서열번호 9를 참조하시오)의 8개의 아미노산으로 이루어졌다. 이전에 논의되었던 변형된 B-도메인이 있는 구축물의 경우, 제안된 vWF-결합 부위는 바뀌지 않은 채로 남아 세포 배양 배지 또는 이후 치료되어야 하는 환자의 혈액 내에서 분비된 인자 Ⅷ가 즉시 분해되는 것을 억제한다. 트롬빈에 의한 특이 활성 이후에만, 인자 Ⅷ가 분해되어 vWF 로부터 분리될 수 있다. 바람직한 인자 Ⅷ의 cDNA 는 예를 들어, 실시예 1에 기술된 바와 같이 4개이 DNA-단편을 결합시켜 제조하였다.

본 발명의 구체예(3)의 단백질은 자연적으로 방출되는 시그날 펩티드(서열번호 4, 13 및 15에 나타난 단백질의 아미노산 잔기 -19 내지 -1에 해당함) 또는 단편 또는 이의 유사체, 합성 펩티드 (예를 들어, 정제하기 쉬운 올리고-히스티딘-태그와 같은) 등을 포함하여 (그러나 이에 국한되지 않음)을 포함하는 N-말단 서열또는 C-말단 서열을 추가로 포함할 수 있다.

인자 Ⅷ 발현을 위한 가장 바람직한 벡터는 도2에 나타난 pTGF8-1 벡터이다. 상기 벡터의 DNA 서열은 서열번호 3에 나타나며, 이것은 상기 언급되었던 5개의 모든 돌연변이[돌연변이 T485C, G6032A, T6668A 및 T6818C (여기에서는:T1217C, G4088A, T4724A 및 T4872C) 및 서열번호 9의 B-도메인 링커를 코딩하는 DNA 서열]를 포함하고 서열번호 4에 상술된 인자 Ⅷ의 뮤테인을 코딩한다.

가장 바람직한 벡터는 pTGF8-2hyg-s 및 pTGF8-3이고, 이들의 일반적인 분자구조는 도6에 기술되어 있다.

서열번호 12의 pTGF8-2hyg-s 는 잠재성 돌연변이 T6816C 만을 함유하는데, 그 결과 인자 Ⅷ의 뮤테인은 B-도메인이 서열번호 9의 링커(linker) 펩티드로 치환되나, 서열번호 2의 천연 서열로 언급된 초기 단백질 구조가 더 이상 변하지는 않는다.

서열번호 14의 pTGF8-3은 돌연변이 T485C, T6668A 및 T6816C를 함유하여, 그 결과 인자 Ⅷ의 뮤테인은 상기 언급된 B-도메인의 치환 외에도 서열번호 2의 V162A 및 V2223E 치환된 아미노산이 나타낸다.

인자 Ⅷ를 제조하는 경우, von Willebrand 인자의 존재하에 배양한다. von Willebrand 인자는 인자 Ⅷ 1mol 당 바람직하게는 10-100, 더욱 바람직하게는 50-60 mol 로 [배양액 내/또는 정제 과정에서 인자 Ⅷ 용액 내에서 (하기 내용을 보시오)] 사용된다.

본 발명의 바람직한 구체예(4)에 있어서 인간 혈액 응고 인자는 인자 Ⅸ 또는 이의 뮤테인이고, 바람직하게는 서열번호 5의 천연 인자 Ⅸ이다. 인자 Ⅸ의 적당한 뮤테인은 인자 Ⅸ가 점돌연변이되고 절단된 형태의 인자 Ⅷ를 포함한다. 인자 Ⅸ 발현에 가장 바람직한 벡터는 도3 및 도4에 각각 나타낸 pTGFG36 및 pTG36hyg 벡터이다.

인자 Ⅸ를 제조에 있어서, 배양액 1ml 당 바람직하게는 0.1-100㎍, 더욱 바람직하게는 1-20㎍의 양으로 존재할 수 있는 비타민 K의 존재하에 배양된다.

본 발명의 구체예(1)에 따른 방법은 하기와 같은 단계를 추가로 포함한다;

(c) 단계(b)에서 분리된 혈액 응고 인자를 정제하는 단계 및/또는

(d) 단계(b)에서 분리되었거나 단계(c)에서 정제된 혈액 응고 인자를 바이러스 불활성화 처리하는 단계

적절한 정제 단계는 순수하고 안정적이며 고도로 활성화된 생성물을 최대한 생산할 수 있는 업계에 공지된 방법을 포함하고, 이는 면역친화 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등 및 이들의 조합이다. 구체적으로, 인간 혈장으로부터 응고 인자를 정제하는 세부 프로토콜은 예를 들어, WO93/15105, EP0813597, WO96/40883 및 WO96/15140/50에 기재되어 있다. 상기 세부 프로토콜은 재조합 인자 Ⅷ 및 Ⅸ를 분리할 필요가 있는 특정 조건에 용이하게 접목시킬 수 있다. 인자 Ⅸ의 경우, 효과적인 프로토콜에는 암모늄 설페이트 침전 단계에 이어 헤파린 친화 크로마토그래피(US 5919909)는 물론 DEAE 및 HIC 텐타클(tentacle) 크로마토그래피를 포함하여 도입되어 왔다. 정제 과정동안 및 정제 과정 이후의 정제된 단백질의 양 및 활성은 ELISA 및 응고 검사를 통하여 측정될 수 있다.

정제된 단백질 시료 내의 또는 분비된 재조합 단백질의 선택, 시료 및/또는 배양 상청액을 함유하는 세포 배양 상청액에서 직접 얻은 생산물의 감염에 의한 오염 문제는 (건조한 상태 또는 액체 상태 내에서 단백질 분해 효소 억제자를 포함하여 화학 물질을 첨가하거나 하지 않은 채) 열처리를 포함하여 바이러스 불활성화 과정으로 극복될 수 있다. 바이러스 불활성화 이후, 화학 물질을 제거하는 추가적인 정제 단계가 필요할 것이다. 구체적으로, 혈장에서 분리된 인자 Ⅷ의 경우, 고순도의 바이러스-불활성화된 단백질을 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 수거하는 것이 기술되었다.(WO93/15105) 이 밖에도, 혈장 또는 기타 생물학적 재료로부터 얻은 고순도이면서 감염되지 않은 응고 인자를 제조하는 몇몇 방법이 보고되어 있다. 잠재적인 감염 물질을 소수성 상 내로 처리하고 2 개이 상 시스템을 형성하여, 실질적으로 수불용성인 부분이 제거되게 하면, 지질이 피복된 바이러스는 효과적으로 불활성화된다. 소수성 상 처리와 동시에 또는 순차적으로 비이온 생분해성 세제및 디알킬 또는 트리알킬 포스페이트로 처리하면 추가적 잇점이 있는 것으로 입증되었다.(WO 9636369, EP0131740, US 6,007,979) 지질로 피복되지 않은 바이러스는 비이온성 세제로의 처리 및 이어서 몇 시간동안의 열처리 단계(60-65℃)로 이루어진 불활성화 프로토콜(WO94/17834)이 요구된다.

상기 결과를 고려해 볼 때, 잠재적으로 위험한 감염 물질을 불활성화시키는 승인된 방법을 인간 세포계에 기초한 효과적인 단백질 발현 시스템과 조합한 것이 재조합 혈액 응고 인자의 제조를 위한 안전하고 용이한 사용 시스템을 제공한다고사료된다.

또한, 본 발명의 구체예(6)에 따라 인자 Ⅷ의 우수한 뮤테인이 제공된다. 상기 인자 Ⅷ의 뮤테인은 제약학적 조성물의 일부가 될 수 있고, 혈우병 치료용 약제 제조에 사용될 수도 있으며 혈우병 치료 방법[본 발명의 구체예 (11) 내지 (13)]에 적용될 수 있다. 상기 제약학적 조성물 및 약제는 인자 Ⅷ를 치료에 효과적인 양으로, 예를 들어 50-500㎍[국제 단위(IU)에 는 200ng에 해당함]으로 포함할 수 있다. 혈우병의 종류에 따라, 환자는 1년간 200,000IU 이하의 인자 Ⅷ를 제공받는데, 이는 통상적으로 일주일 또는 2주일마다 투여된다.

구체예 (11) 내지 (13)의 혈우병 치료 방법에 적용되는 약제학적 조성물, 약제 또는 조제품은 치료에 효과적인 양의 구체예 (6)의 인자 Ⅷ의 뮤테인 또는 구체예 (9)의 유전자 변형 벡터를 함유한다. 전자의 경우, 인간 세럼 알부민(HSA; 용액 1ml 당 약 1mg의 양이 바람직함); CaCl₂(2-5mM이 바람직함)와 같은 무기 염, 글리신, 류신, 및 히스티딘(아미노산 당 0.1-1M이 바람직함)과 같은 아미노산; 수크로스 및/또는 트레할로스(0.4-1M이 바람직함)와 같은 디사카라이드; Na-시트레이트(50mM 이하가 바람직함)와 같은 유기 염; 등을 포함하여, 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 조제품은 수성 또는 비-수성일 수 있다. 후자의 경우, 주요 성분은 글리세롤 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, PEG-300)이다. 조제품은 또한 (투여 전에 바람직한 용매 내에 용해될 수 있는)건조된 형태일 수 있다.

상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 구체예 (9)에 따른 유전자 변형 벡터는 또한 제약학적 조성물의 일부가 될 수 있고, 혈우병 치료용 약제 제조에 사용될 수 있으며 혈우병 치료 방법[본 발명의 구체예(11) 내지 (13)]에 적용될 수 있다. 상기 제약학적 조성물 및 약제는 추가로 적당한 매트릭스(matrix) 조성물, 예를 들어 지질 또는 WO 00/49147에 기술(이에 관한 내용은 이하 본 출원의 내용에 합체되어 있음)되어 있는 호르몬 등을 추가로 함유할 수 있다. 유전자 변형 벡터 또는 본 발명의 유전자 변형 벡터를 포함하는 제약학적 조성물 또는 약제는 경구적으로, 정맥 내로, 근육 내로, 피하 내로, 점막을 통하여 점점 퍼지도록[협(頰)측 분무, 비(鼻)측 분무를 포함함) 또는 유전자 총으로 투여된다. (예를 들어, 마이크로화된 호르몬 분산액 내)경구 투여가 바람직하다.

본 발명의 구체예 (6)의 인자 Ⅷ의 뮤테인은 상기 구체예 (3)과 관련된 것이 바람직하다. 상기 FⅧ의 뮤테인은 예를 들어, 하기의 단계로 이루어진 방법과 같은 표준 재조합 기법을 이용하여 추가로 제조될 수 있다.

(a) 구체예(8)의 벡터로 형질전환되고/되거나 구체예(7)의 DNA 를 포함하는 숙주 세포의 배양 단계 (상기 배양 단계는 또한, 하나 이상의 바이러스성 전사 활성화 단백질에 의하여 자극되는 하나 이상의 바이러스성 전사 활성화 단백질을 지속적으로 발현시키고, 혈액 응고 인자를 코딩하는 DNA 서열에 기능적으로 이어진 바이러스성 전사 프로모터가 있는 벡터를 운반하는 불멸화된 인간 세포계의 배양 단계를 포함한다.)

(b) 배양액으로부터 혈액 응고 인자를 분리하는 단계.

적당한 불멸화된 인간 세포계, 전사 활성화 단백질 및 바이러스성 프로모터는 이전에 언급된 것들이다. 상기 방법에 사용된 불멸화된 인간 세포계는 바람직하게는 두 개의 바이러스성 전사 활성화 단백질을, 가장 바람직하게는 온도 민감성 SV40 T 항원 및 아데노바이러스 E1A 를 발현시킨다. 상기 방법은 이전에 기술되었던 단계(c) 및 (d)의 정제 및 바이러스 불활성화를 추가로 포함할 수 있다.

시판될 수 있는 세포계 293T(ECACC: tsa201, 96121229를 참조하시오.)를 DMSZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany)에 2001년 2월 20일에 기탁번호 제DSM ACC2494번으로 기탁하였다.

본 발명은 이하 실시예에서 더욱 상세히 기술된다.

실시예 1 - 인자 Ⅷ의 클로닝

재조합 인자 Ⅷ를 위한 서열은 인간의 간세포의 전체 RNA 풀(pool)로부터 역전하에 의하여 얻었다. 이 후, 4개의 단편(1/2, 3/4, 5/6, 7/8)을 제한 부위를 함유하도록 설계된 프라이머를 이용한 표준 PCR 을 통하여 증폭시켰다. 단편 3/4 및 5/6 을 연결하기 위하여 플라스미드 pBSFⅧ3/4로부터 얻은 SmaI/SalI 단편을 pBSFⅧ5/6의 SalI 부위에 블런트(blunt) 말단으로서 삽입하여 pBSFⅧ3/6을 얻었다. 그 다음으로, XhoI/BspHI 및 부분적으로 Alw44I 을 사용하여 pBSFⅧ3/6을 분해하여 단편 3/6을 얻었다. 상기 단편과 pBSFⅧ1/2 로부터 얻은 PstI/Alw44I 단편을 PstI 및XhoI 으로 분해된 pBSFⅧ1/2 의 주요 벡터(vector backbone)내로 한번에 리게이팅하여(ligated) pBSFⅧ1/6을 얻었다. SmaI 및 부분적으로 Mva1269I 을 사용하여 pBSFⅧ7/8을 분해함으로써 단편 7/8을 얻어, 이를 XhoI 및 Mva1269I 으로 절단된 pBSFⅧ1/6내로 리게이팅하여 pBSFⅧ1/8을 얻었다. 마지막으로 pBSFⅧ1/8으로부터 얻은 SmaI/XhoI 단편을 Octagene Vector pTGFG67 (PCT/EP00/01368에 기술된 상기 벡터의 제품명임)의 SalI 부위에 블런트 말단으로써 삽입하여 인간 인자 Ⅷ pTGF8-1의 진핵세포 발현 벡터(도1 및 도2를 참조하시오.)를 얻었다. 결과물로 얻은 벡터는 돌연변이 V162A, S2011N 및 V2223E 가 있는 인자 Ⅷ의 뮤테인을 코딩한다.

실시예 2 - 인자 Ⅸ의 클로닝

벡터 pUC19 (MBI Fermentas)를 XbaI으로 분해하고, Klenow 효소로 처리한 후, 다시 리게이팅하였다. XbaI 이 없는 상기 벡터는 이후 EcoRI으로 분해되고, Klenow 효소로 처리되어 다시 리게이팅함으로써 EcoRI 부위를 삭제하였다. 상기 벡터의 SacI 부위 내로 XbaI 부위를 삽입하기 위하여, 상기 벡터를 SacI 으로 분해하고, 알칼리성 포스파타아제로 디포스포릴레이팅된 (dephosphorylated) T4-DNA-중합효소로 처리하여 XbaI-링커(linker) CTCTAGAG (Biolabs #1032)를 리게이팅시켰다. 다른 XbaI-부위를 새로이 만들어진 벡터를 HindⅢ로 분해하여 삽입하고, 이를 Klenow로 처리한 후, 알칼리성 포스파타아제로 디포스포릴레이팅하여 이를 XbaI-링커(linker) CTCTAGAG (Biolabs #1032)와 리게이팅시켰다. 상기 벡터를 pUC19/X라고하였다.

벡터 phGFP-S65T(Clontech)내 존재하는 XbaI-부위를 파괴하기 위하여, 상기 벡터를 XbaI 으로 처리하고, Klenow 효소로 처리하여 리게이팅시켜 GFP-유전자를 함유하는 벡터 pGFP/0. A 2.3 kb 단편을 얻었는데, 이후 pGFP/0 을 MluI으로 분해하고, Klenow 효소로 처리한 후, 이를 BamHI 로 분해시켜 상기 GFP-유전자를 분리하였다. 상기 단편을 벡터 pUC19/X 의 다중 클로닝 부위에 삽입하여 이를 SalI으로 분해하고, Klenow 효소로 처리한 후 BamHI 으로 분해하였다. 결과물로 얻은 벡터를 pTGFG1이라고 하였다.

올리고뉴글레오티드(Metabion) PRE-5 (5′-GGG GTA CCA GCT TCG TAG CTA GAA CAT CAT GTT CTG GGA TAT CAG CTT CGT AGC TAG AAC ATC ATG TTC TGG TAG CCC -3′; 서열번호 10) 및 PRE-AS (5′-GGG GTA CCA GAA CAT GAT GTT CTA GCT ACG AAG CTG ATA TCC CAG AAC ATG ATG TTC TAG CTA CGA AGC TGG TAC CCC -3′; 서열번호 11)를 하이브리딩하고 (hybridized) 키나아제(kinase) 반응으로 포스포릴레이팅하여, 결과물로서 삽입물 PRE(ds)를 얻었다.

벡터 pTGFG1 을 EcoO109I 으로 분해하고, Klenow 효소로 처리한 후 알칼리성 포스파타아제로 디포스포릴레이팅시켰다. 이후, 이를 PRE(ds)삽입물과 리게이팅시켜, 결과물로서 벡터 pTGFG5 를 얻었다. 벡터 pUC19 (MBI Fermentas) 를 SalI 으로 분해하고, Klenow 효소로 처리한 후 알칼리성 포스파타아제로 디포스포릴레이팅시켰다. 이를 NotI-링커(linker) GCGGCCGC (Biolabs # 1045)와 리게이팅시켜, 결과물로서 벡터 pUC19/N 을 얻었다.

인자 Ⅸ의 cDNA 를 인자 Ⅸ의 개방 판독틀(open reading frane) 의 개시 코돈 및 종결 코돈과 부분적으로 합치하는 2개의 프라이머를 사용하여 인간의 간 cDNA (Clontech)로부터 증폭시켜, 결과물로서 완전한 개방 판독틀을 함유하는 1387 bp의 단편을 얻었다. EcoRI (상부: upstream) 및 BamHI (하부: downstream) 의 제한 부위는 각 프라이머의 말단에 포함되어 클로닝에 이용되었다. Pwo DNA 중합효소(Boehringer Mannheim) 을 이용하여 50㎕ 의 반응액 [10mM 의 Tris HCl pH 8.85, 25mM 의 KCl, 5mM 의 (NH₄)₂SO₄, 2mM 의 MgSO₄] 내에서 1분 동안 96℃, 1분 동안 60℃, 2분 동안 72℃로 30회 배양하고, 이어서 10분 동안 72℃로 최종 연장 단계를 거쳐 증폭시켰다.

반응 생성물을 pUC19의 EcoRI-부위 및 BamHI-부위 내로 리게이팅시켜 대장균 DH5-α를 형질전환시켰다. 형질전환된 클론을 선택하였다. 서열을 주기 서열결정기(cycle requencing)(Amersham)를 이용하여 표지된 프라이머(IR-700)로 양 말단을 확인하고 LiCor 서열결정기 시스템 (MWG, Biotech)상에서 자동 분석하였다.

사용된 프라이머는 하기와 같다.:

GGAATTCCGCAAAGGTTATGCAGCGCGTGAACATGATCATGGC (상부; 서열번호 16)

CGCGGATCCATTAAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTTAATCC (하부; 서열번호 17)

인간 응고 인자 Ⅸ의 개방 판독틀을 포함하는 1.4 kb 의 단편(인간 cDNA 라이브러리에서 분리하였음.)을 상기 제조한 벡터 pUC19/N 의 PstI 부위 내로 삽입하여, 이를 PstI 로 분해하고, T4-중합효소로 처리한 후 알칼리성 포스파타아제로 디포스포릴레이팅시켰다. 결과물로 얻은 벡터 pUC19/N-FIX 로부터 인간 응고 인자 Ⅸ의 개방 판독틀을 함유하고 있는 1.4 kb 의 단편을 Hind Ⅲ 및 NotI 으로 이중-분해하여 절단해내었다. 상기 단편을 Hind Ⅲ 및 NotI 으로 이중-분해된 벡터 pTGFG5의 4.3 kb 의 단편과 리게이팅시켜, 도3에 나타나는 pTGFG36을 얻었다. 상기 벡터는 인자 Ⅸ를 코딩하는 발현 카세트(cassette)를 세포 내로 운반하는 바람직한 벡터로, 이의 DNA 서열은 서열번호 6에 나타나 있다.

실시예 3 - 단백질 발현을 위한 인간 세포계

바람직한 세포계은 tsA201(ECACC 참조문헌:96121229)로서, 이는 온도 민감성 T 항원인 SV40(J. Membrane Biol. 1996; 152:39; Gene 1995;156:235; PNAS USA 1994;91:12785; Pfluegers Arch. 1994;427:136; J. Gen. Physiol. 1994;104:507; BioTechniques 1993;15:906) 을 지속적으로 발현시키는 형질전환된 태아 신장 세포계(293, ECACC 번호 85120602)이다. 상기 세포계의 다른 명칭에는 293tsA1609neo (Mol. Cell. Biol., 1987, 7:379) 및 293T를 포함된다. 상기 유사상피 세포계은 뮤테인의 기능적 발현을 검정하는데 사용되어 왔으며 높은 수준의 재조합 단백질을 제조한다고 보고되어 왔다. 이들은 2mM 의 글루타민과 10%의 FCS가 보충된 DMEM 내에서 배양될 수 있다. 효과적으로 인자 Ⅸ를 생산하기 위하여, 배양액은 100㎍/ml 이하의 비타민 K 를 첨가함으로써 개질될 수 있다.(US4770999)

발현된 폴리펩티드의 정제를 단순화하기 위하여, 적당한 보충물을 함유하나세럼이 없거나 또는 단백질이 없는 매질 내에서 배양할 수 있다. 안정성을 이유로 분비되는 인자 Ⅷ는 매질 내에 vWF 가 존재하는 것이 필요하다.(US5198349) 또한 리포프로테인, 포스포리피드, 폴리글리콜, 매량의 금속, 헤파린, 비이온성 계면활성제 또는 시클로덱스트린이 첨가되는 것이 보고되어 왔다.(EP0254076, US5679549, US5198349, US5250421, US5576194, EP0872487, WO94/11525, US5378612)

실시예 4 - 인자 Ⅷ 및 인자 Ⅸ의 일시적인 생산을 위한 293T 세포로의 칼슘 포스페이트 트랜스펙팅(transfection)

융합(confluent) 293T 세포를 6 ml의 DMEM/10%의 FCS (FIX 용 10 ㎍/ml 의 비타민 V) 내 10cm 접시에 저 밀도 상태로 트랜스펙팅 하루 전에 놓았다. Chen 및 Okayama[Mol. Cell Biol. 7:2745 (1987)] 에 따라 트랜스펙팅하였다. 인자 Ⅷ를 생산하기 위한 12㎍의 플라스미드 pGF8-1 및 인자 Ⅸ를 생산하기 위한 12㎍의 플라스미드 pTGFG36 를 트랜스펙팅하였다. 트랜스펙팅 6시간 후, 매질을 새로운 것으로 바꾸고 주입한지 3일 후 상청액에서 상기 인자들을 분리하였으며, ELISA 또는 코아굴로메트리 (coagulometry)에 의한 추가적인 정제는 아니나, 추가로 정재하거나 분석하였다. (실시예 5 및 6을 참조하시오.)

실시예 5 - ELISA 를 이용한 FⅨ 및 FⅧ의 농도 측정

인자 Ⅸ: 트랜스펙팅된 293T 세포의 상청액 내의 인간 재조합 인자 Ⅸ의 정도를 염소의 폴리클로날 (polyclonal) 항-인간 FIX(Enzyme Research Laboratories)를 항체 캡처(capture) 사용하는 ELISA 를 통하여 측정하였다. 22℃의 습한 챔버(chamber)에서 2 시간동안 모두 배양하였다. 플레이트(Dynex, Immulon-4)를 8.8㎍/ml의 항체가 있는 100㎕의 피복용 완충액으로 피복시켰다. 상기 조건하에서, 블록킹(blocking)은 필요하지 않다. 플레이트를 PBS-Tween(0.1% v/v)로 4회 세척하는 것으로(Encore 2000, Merck) 특정되지 않은 반응을 충분히 블록킹할 수 있다.

각각의 추가되는 단계 이후, 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거할 필요가 있다. 10㎕의 10mM PMSF 및 10㎕의 0.11M 소듐 시트레이트로 처리된 100㎕의 상청액을 각각의 용기에 가하였다. 시료 및 표준용액 [인간 인자 Ⅸ로 하우스(house) 표준임. Octapharma]의 희석액을 희석 완충액(HBS-BSA-EDTA-Tween)으로 만들고 각 용기당 100㎕로 배양하였다. 검출 항체는 1ml 의 희석 완충액 당 1㎍ 항체의 농도인 퍼옥시다제 표지된 염소 폴리클로날 안티-FIX (Enzyme Research Laboratories)로, 각 용기당 100㎕로 배양되었다. 150㎕의 ABTS(Roche)를 각 용기에 기질로서 가하고, 비색분석적 반응을 통하여 1-2 시간 후에 405nm에서 검사하였다. 결과는 표준 농도 대 표준 흡광도의 선형 회귀(linear regression)로 계산되었고 이를 하기 표에 요약하였다.

세포의 수[/ml]	인자 Ⅸ-농도[ng/ml]	응고 시간[s]
2.1 ×10⁵	36	45
8.7 ×10⁵	20	79

정상 혈장 : 37-39s

인자 Ⅸ가 없는 혈장 : 137-140s

인자 Ⅷ: 트랜스펙팅된 293T 세포의 배양 여과액 내의 인간 재조합 인자 Ⅷ 수준을 정제되기 용이한 폴리클로날 양 항 FⅧ:C 제조물(F8C-EIA-C, Affinity Biologicals)을 캡처 항체로서 사용한 ELISA 를 이용하여 측정하였다. 22℃의 습한 챔버에서 2 시간동안 코팅하였다. 플레이트(Dynex, Immulon-4)를 코팅 완충액(50mM 소듐 카보네이트 pH 9.6)내 100㎕의 100-fold 항체 완충액으로 피복시켰다. 플레이트를 PBS-Tween(0.1% v/v)로 4회 세척하는 것으로(Encore 2000, Merck) 특정되지 않은 반응을 충분히 블록킹할 수 있었다.

각 추가 단계 이후, 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위하여 세척할 필요가 있었다. 48시간 동안 배양한 후 지속적으로 pTGF8-3으로 트랜스펙팅된 상이한 293T 클론에서 뽑아낸 100㎕의 각 배양 여과액 시료를 각 용기에 가하였다. FⅧ 표준 희석액(house standard, Octapharma)을 희석 완충액(HBA-BSA-EDTA-Tween)로 제조하고 용기당 100㎕로 배양하였다. 검출을 위해 퍼옥시다제 표지된 폴리클로날 항-FⅧ (F8C-EIA-D, Affinity Biologicals)을 의 사용되기 전의 희석액을 60분 동안 용기당 100㎕로 배양하였다. 비색분석적 반응에서, 5mg 의 O-페닐렌디아민(P-6912, Sigma)정제를 사용 전에 12ml의 기질 완충액 내에 간단히 용해시키고 12㎕의 30% H₂O₂로 마무리하였다. 150㎕의 상기 기질 용액을 각 용기에 가하고 상온의 암실에서 MRX Reader(Dynex)를 이용하여 490nm에서 배양한지 10분 후에, 검출 결과를 기록하였고, 50㎕의 2.5M H₂SO₄를 각 용기에 가하여 반응을 종결시켰다. 결과는 표준 농도 대 표준 흡광도의 선형 회귀 곡선(도7A)으로 계산되었고 이는 도7B에 요약되었다.

실시예 6 : 인간 응고 인자 Ⅷ 및 인자 Ⅸ의 활성 측정

배양된 세포 293T 세포(실시예 4에 기술된 바와 같이 pTGF8-1 로 칼슘 포스페이트 침전에 의하여 트랜스펙팅되었음.)의 상청액 내의 인간 재조합 인자 Ⅷ의 응고 활성을 하기와 같이 측정하였다.:

응고 활성은 Cephalin (포스파티딜 에탄올아민)활성화를 이용하는 일부 트롬보플라스틴 시간법에 기초하여 수동식 응고 기계(ML-2, Instrumentation Laboratories)평가하였다. 연구를 위하여, 트랜스펙팅된 293T 세포로부터 얻은 100㎕의 희석되지 않은 상청액, 100㎕의 결핍 혈장(Progen) 및 100㎕의 Cephalin (Instrumentation Laboratories)을 5분 동안 37℃에서 배양하였다. 100㎕의 CaCl₂을 가함으로서 응고가 시작되었다. 시료의 응고 시간은 정상 혈장의 응고 시간과 비교하였다. 결과를 도5B에 나타내었다. 도5B에 나타나는 바와 같이, pTGF8-1 로 트랜스펙팅된 세포로부터 얻은 세포 상청액 정상 세포에 비해 응고 활성을 보였으나 트랜스펙팅되지 않은 페소는 인자 Ⅷ가 결핍된 혈장과 동일한 정도의 응고 활성을 보였다.

인자 Ⅸ에 관하여도 유사한 평가를 하였다. 결과를 실시예 5의 표에 나타내었다. 비타민 K의 존재하의 발현 의존도는 표10에 나타내었다.

실시예 7 - 바이러스 불활성화

미국 특허 제6,007,979호의 방법에 따라 바이러스 불활성화를 수행하였다. 즉, 잠재적인 감염 단백질 용액에 하기와 같이 화합물을 순차적으로 교반하면서 가하였다.:

1. 0.2ml 의 Tween80 및 0.06ml 의 TNBP 를 19.74 ml의 용액에 가하였다. 또는

2. 0.2ml 의 TritonX-100 및 0.2ml 의 TNBP 를 19.6 ml의 용액에 가하였다.

1ml의 캐스터 오일(castor oil)을 1 및 2의 제조물에 가하고 이후, 상온에서 1시간 동안 철저히 추출하였다.

상 분리를 위하여 각각의 경우 원심분리하였다. 감염되지 않도록 주의하면서, 1ml씩의 시료를 수성 부분에서 반복하여 제거하였다.

실시예 8 - 지속적으로 인자 Ⅷ 및 인자 Ⅸ를 발현시키는 세포계의 제조

인자 Ⅸ: 바람직한 벡터 pTGF8-1 및 pTGFG36는 포유류 세포 내에서 인자 Ⅷ 및 인자 Ⅸ를 일시적으로 발현시키는 구조물을 각각 포함한다. 지속적으로 트랜스펙팅된 세포 클론을 분비하는 방법을 가능하게 하기 위하여, 하이그로마이신-B-포스포트랜스퍼라아제(TK-Hyg로부터 얻은 HindⅢ-Mva 1260I 단편, Clontech)를 두 벡터내에 존재하는 SmaI 부위내로 서브클로닝시켰다.(subcloned) 결과물로 얻어진 구축물(pTGF8-1-hyg 및 pTG36hyg)는 이후 CMV-프로모터 및 SV40-폴리아데닐레이팅된(polyadenylation) 시그날이 있는 인간 인자 Ⅷ 또는 인자 Ⅸ를 위한cis발현 카세트 및 HSV 티미딘 키나아제 프로모터 및 HSV 티미딘 키나아제 폴리아데닐레이팅된 시그날이 있는 하이그로마이신-B-포스포트랜스퍼라아제 발현 카세트를 포함한다.(도4를 참조하시오.)

벡터 pTGF8-2hyg-s 및 pTGF8-3 (도6, 서열번호 12 및 14)는 pTGF8-1hyg의 유도체인 점에서 돌연변이 V162A, S2011N 및 V2223E(pTGF8-2hyg-s) 및 S2011N(pTGF8-3)은 QuikChang프로토콜 (Stratagene) 을 사용하는 PCR에 의존하는 방법을 통하여 천연형 서열로 전환된다.

응고 인자를 위한 코딩 서열을 선택된 혹종의 유전자 서열로 치환할 수 있다. 상기 구축물로 칼슘 포스페이트 트랜스펙팅에 의하여 지속적으로 발현하는 세포계을 만든 다음 하이그로마이신에 저항성이 있는 세포계을 선택한다. 이 밖에도 플라스미드는 프로게스테론 반응 요소(PRE)를 함유한다. pTG36hyg 로 일시적인 트랜스펙팅 실험하는 경우, 배양 배지 1ml 당 약 40ng 활성 인자 Ⅸ 반응물이 ELISA 및 코아굴로메트릭 평가 (coagulometric assay)에 의하여 발견될 것이다. (실시예 5 및 6을 참조하시오.)

인자 Ⅸ의 제조를 위하여, 293T 세포를 10%의 FCS 및 10㎍/ml의 비타민 K가 보충된 DMEM(미국특허 제 4,770,999; 역시 도10을 참조하시오.) 내에서 배양하였다. 먼저 지속적으로 트랜스펙팅된 293T 세포를 효과적으로 선택하기 위한 항생제 중요한 농도가 결정되어야 했다. 상기 목적을 위하여, 상기 세포를 저 희석액에 놓고 10-800 ㎍/ml 하이그로마이신 B 의 존재하에 배양하였다. 2주 후, 200㎍/ml 이상으로는 세포가 성장하지 않아므로, 상기 농도를 지속적으로 트랜스펙팅되는 세포를 선택하기 위한 농도로 채택하였다.

10ml의 접시 내에서 이전에 1:15로 분배되었던 293T 세포를 하루 동안 통상적인 방법으로 트랜스펙팅하였다. 칼슘포스페이트 침전법(Biotechniques1988 6:7 632-638)을 이용하여 1 접시당 12㎍의 플라스미드를 트랜스펙팅하고 이틀 후 배지를 200㎍/ml 의 하이그로마이신 B를 함유하는 새 배지로 교체하였다. 선택한 지 2-3 주 후, 인자 Ⅷ 및 인자 Ⅸ의 존재 여부를 배지를 ELISA (실시예 6을 참조하시오.)로 조사였다. 상기 인자가 존재하는 클론을 분리하여 24개의 플레이트 용기에 옮겼다. ELISA 및 활성 측정으로 스크리닝한(screening) 후, 양성인 클론을 두 개의 추가적 서브클로닝 과정을 거치게 하여 더욱 발전시킨 후 추가의 용도 및 특화를 위하여 이들의 분별물들은 냉동시켰다.

실시예 9 : 인자 Ⅷ 발현에 대한 in-situ 면역형광 검출법을 이용하여 지속적으로 트랜스펙팅된 세포 표현형이 균일함의 입증

pTGF8-3(클론 49/19)로 지속적으로 트랜스펙팅되는 5 ×10⁷293T 세포 및 DMEM + 9.1 %의 FBS 의 배양액에 접착되어 있는 트랜스펙팅되지 않은 293T 세포(음성 대조구)를 트립시네이팅(trypsination)을 이용하여 배양접시로부터 떼어내어, 수 회 세척하고 5ml의 PBS 완충액에 재현탁시켰다.

2㎕의 상기 세포 현탁액들을 살균된 현미경 유리 슬라이드에 옮기고 상온에서 모든 액체가 증발될 때까지 배양하였다. 세포를 70%의 에탄올 내에서 10분 동안 고정시키고 5분 동안 상온에서 건조시켰다. 슬라이드를 PBS 완충액 내 10% 의 FBS 희석액 내에서 불특정 검출에 대하여 블록킹시켰다. 1차 항체(sh 항FⅧ:C F8C-EIA-C, Affinity Biologicals)를 10%의 FBS 및 0.1%의 사포닌을 함유하는 PBS 완충액으로 100배 희석시키고 상온의 습한 배양 챔버 내에서 60분동안 배양하였다. PBS로 철저히 세척한 후, 2차 항체(rb 항 sh CY3 컨쥬게이트 313-165-003, Jackson ImmunoResearch)의 100배로 희석된 희석액을 제조하여 상기 기재한 방법대로 배양하였다. 그 다음으로, 현미경에 사용할 수 있도록 제조된 제조물을 철저히 세척하고 50%의 글리세롤 층 및 덮개 유리로 덮었다. 세포를 백광 형광 현미경 및 형광 현미경(570nm에서 방출됨)으로 관찰하였다.

결과를 도8에 나타내었다.

실시예 10 : 배양 여과액 내의 재조합 인자 Ⅸ에 대한 열적 안정성

여과액: 100㎍/ml 의 비타민 K의 존재 하에 pTGFG36으로 일시적으로 트랜스펙팅하고 48시간 후 293T 세포로부터 분리하여 -80℃에서 7일 동안 저장해 놓았던 배양 여과액을 재빨리 해동시켜, 7500㎕의 분별물로 나눈 후, 하기와 같이 열 배양하였다.:

시료	온도(℃)	시간(분)
1	0	240
2	20	30
3	20	60
4	20	240
5	37	30
6	37	60
7	37	240

시료를 얼음으로 냉각시키고 실시예 6에 기재되어 있는 바와 같이(이중 측정)FⅨ 활성을 측정하였다. 결과를 도9에 나타내었다. 활성은 240분 37℃ 이하의 조건의 배양의 경우 거의 안정하게 유지되었다.

Claims

(a) 인간 혈액 응고 인자를 코딩하는 DNA 서열에 기능적으로 이어진 프로모터가 하나 이 상의 바이러스 전사 활성화 단백질에 의하여 자극되는 바이러스 프로모터가 아니라는 조건하에 하나 이상의 바이러스성 전사 활성화 단백질을 지속적으로 발현시키고 상기 프로모터를 갖는 벡터를 운반하는 불멸화된 인간 세포계을 배양하는 단계; 및

(b) 배양액으로부터 상기 혈액 응고 인자를 분리하는 단계

로 이루어지는 재조합 인간 혈액 응고 인자를 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서,

(ⅰ) 불멸화된 인간 세포계는 불멸화된 신장 세포, 방광 세포, 간 세포, 폐 세포, 심장 근육 세포, 평활(smooth) 근육 세포, 난소 세포 또는 위장 세포이고; 및/또는

(ⅱ) 하나 이상의 바이러스성 전사 활성화 단백질이 Simian 바이러스 T 항원, 아데노바이러스 E1A 또는 E1B 단백질, 소 유두종 바이러스의 초기 영역 DNA 서열에 의하여 코딩되는 단백질 및 포진 바이러스의 IE 단백질에서 선택되며; 및/또는

(ⅲ)프로모터는 바이러스성 프로모터, 숙주에 내재되어 있는 프로모터(housekeeping host promoter) 및 조직 특이성 프로모터에서 선택되는 방법.
제 2 항에 있어서, 불멸화된 세포계는 태아 신장 세포에서 유도되며 바람직하게는 293T 세포계(DSM ACC2494)이고, 프로모터는 CMV 프로모터인 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 선택 마커 및/또는 조절 서열을 추가로 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 인간 인자 Ⅷ 또는 이의 뮤테인(mutein)을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 방법.
제 5 항에 있어서, 벡터가 서열번호 2의 성숙한 천연 인자 Ⅷ (mature wild-type factor Ⅷ)을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 방법.
제 5 항에 있어서, 벡터가 인자 Ⅷ의 뮤테인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 방법으로서, 상기 뮤테인은 점돌연변이된 뮤테인이며, 뮤테인의 C-말단 또는 N-말단에서 절단된 뮤테인이고/또는 B-도메인이 부분적으로 또는 전체적으로 없는 뮤테인으로서, 바람직하게는

(a) 162번 위치의 발린이 다른 중성 아미노산 잔기로 치환되는 돌연변이;

(b) 2011번 위치의 세린이 다른 친수성 아미노산 잔기로 치환되는 돌연변이;

(c) 2223번 위치의 발린이 산성 아미노산 잔기로 치환되는 돌연변이; 및

(d) 740번 위치의 아르기닌과 1649번 위치의 글루탐산 사이의 B-도메인이 10-25,바람직하게는 14-20개의 아미노산 잔기로 이루어진, 아르기닌이 풍부한 링커(linker) 펩티드로 치환되는 돌연변이(이 때, 상기 인자 Ⅷ의 아미노산 번호(numbering)는 서열번호 2의 성숙한 천연 인자 Ⅷ의 서열에 대응됨)

중 하나 이상의 돌연변이를 갖는 인자 Ⅷ의 뮤테인인 방법.
제 7 항에 있어서, 인자 Ⅷ의 뮤테인은 돌연변이 (a), (b) 및 (c) 중 하나 이상의 돌연변이를 갖고, 바람직하게는 돌연변이 (a) 및 (b) 중 하나 이상의 돌연변이를 갖는 방법.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 인자 Ⅷ의 뮤테인에 3개의 돌연변이 (a), (b) 및 (c)를 모두 갖는 방법.
제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 (a)의 경우 162번 위치의 발린이 알라닌으로 치환되고, 돌연변이 (b)의 경우 2011번 위치의 세린이 아스파라긴으로 치환되며/치환되거나 돌연변이 (c)의 경우 발린이 글루탐산으로 치환되는 방법.
제 7 항에 있어서, 인자 Ⅷ의 뮤테인을 코딩하는 DNA 서열에 서열번호 1의 성숙한 천연 인자 Ⅷ의 DNA 서열에 관하여 돌연변이 T485C, G6032A 및 T6668A 중 하나 이상의 돌연변이를 갖고, 바람직하게는 상기 돌연변이 3개 모두를 갖는 방법.
제 6 항, 제 7 항 또는 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 Ⅷ 또는 이의 뮤테인을 코딩하는 DNA 서열이 잠재적인(quiet) 돌연변이 T6816C 를 함유하는 방법.
제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 Ⅷ의 뮤테인이 부분적으로 또는 전체적으로 이의 B-도메인이 결손되는 방법.
제 7 항, 제 12 항 또는 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 뮤테인이 제 7 항의 돌연변이 (d)를 갖는 방법.
제 7 항 또는 제 14 항에 있어서, 아르기닌이 풍부한 링커 펩티드는 3개 이상의 아르기닌 잔기를 포함하는 방법.
제 7 항, 제 14 항 또는 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 아미노산 서열 SFSQNSRH 및/또는 아미노산 서열 QAYRYRRG를 포함하고, 바람직하게는 링커가 서열 SFSQNSRHQAYRYRRG 를 갖는 방법.
제 7 항에 있어서, 인자 Ⅷ의 뮤테인은 서열번호 4, 13 또는 15의 1-1440 아미노산을 포함하는 방법.
제 5 항 또는 제 7 항이 있어서, 벡터가 도2의 pTGF8-1, 또는 도6의 pTGF8-2hyg-s 또는 pTGF8-3인 방법.
제 5 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 1 mol의 인자 Ⅷ 당 바람직하게는 10-100 mol, 더욱 바람직하게는 50-60 mol의 von Willebrand 인자 (vWF)의 존재 하에 배양하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 인간 인자 Ⅸ 또는 이의 뮤테인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 방법.
제 20 항에 있어서, 벡터가 서열번호 5의 천연 인자 Ⅸ를 코딩하는 DNA 서열을 포함하고 상기 벡터가 바람직하게는 도4의 벡터 pTG36hyg 인 방법.
제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 배양액 1ml 당 바람직하게는 0.1-100㎍, 더욱 바람직하게는 1-20㎍의 비타민 K의 존재 하에 배양하는 방법.
제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,

(c) 단계(b)에서 분리된 혈액 응고 인자를 정제하는 단계; 및/또는

(d) 단계(b)에서 분리된 혈액 응고 인자 또는 단계(c)에서 정제된 혈액 응고 인자를 바이러스 불활성화 처리하는 단계

를 추가로 포함하는 방법.
하나 이상의 바이러스성 전사 활성화 단백질을 지속적으로 발현시키고 제 1 항 내지 제 18 항 및 제 20 항 및 제 21 항 중 어느 한 항의 인간 혈액 응고 인자를 코딩하는 벡터를 운반하는 불멸화된 인간 세포계.
제 7 항의 돌연변이 (a) 내지 (d) 중 하나 이상의 돌연변이가 일어난 제 7 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 인자 Ⅷ의 뮤테인.
제 25 항의 인자 Ⅷ의 뮤테인을 코딩하는 DNA 서열.
제 26 항의 DNA 를 포함하는 벡터.
제 27 항에 있어서, 벡터가 유전자 변형 벡터인 벡터.
제 27 항의 벡터로 형질전환되고/되거나 제 26 항의 DNA 서열을 포함하는 숙주 세포.
제 25 항의 인자 Ⅷ의 뮤테인 또는 제 28 항의 유전자 변형 벡터를 포함하는제약학적 조성물.
제 25 항의 인자 Ⅷ의 뮤테인 또는 제 28 항의 유전자 변형 벡터를 혈우병 치료용, 바람직하게는 혈우병 A 치료용 약제 제조에 사용하는 용도.
제 25 항의 인자 Ⅷ의 뮤테인 또는 제 28 항의 유전자 변형 벡터를 인간 혈우병에 처방하는 것을 포함하는 혈우병 치료, 바람직하게는 혈우병 A 치료 방법.