CZ140298A3

CZ140298A3 - Hybridní faktor VIII s modifikovanou aktivitou

Info

Publication number: CZ140298A3
Application number: CZ981402A
Authority: CZ
Inventors: Johannes J. Voorberg
Original assignee: Baxter Aktiengesellschaft
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1996-11-13
Publication date: 1998-08-12
Also published as: NO982154L; AU7624296A; AU707410B2; US5910481A; US6156888A; PL326673A1; NO982154D0; US5869292A; JP2001501803A; US6130203A; US6051418A; HUP9901161A2; HUP9901161A3; WO1997018315A1; EP0861326A1; CA2235628A1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká hybridních krevních koagulačních proteinů s modifikovanými aktivitami, jako jsou zesílené koagulační aktivity. Hybridní proteiny podle vynálezu se mohou získat záměnou nejméně jedné oblasti krevního koagulačního proteinu za nejméně jednu oblast z donorového antikoagulačního nebo z antitrombotického proteinu.

Dosavadní stav techniky

Hybridní proteiny se popisovaly už dříve. Za účelem zkombinovat funkce dvou proteinů do jednoho, například interleukin fúzoval s toxinem (Kreitman et al., Biochemistry 33: 11637-44 (1994); Foss et al. , Blood 84: 1765-74 (1994)) se vytvořila řada hybridních proteinů. V jiných případech proteiny fúzovaly s částmi jiných proteinů, které mají specifické biologické funkce. Tímto způsobem se využily například propeptidy homeostatických proteinů (WO 88/03926) nebo stabilizační oblasti albuminu (WO 89/02922).

Substituce různých oblastí doménami odvozených z jiných proteinů se popisuje v případě proteinu C (U.S. Patent č. 5,358,932; EP 296 413), angiogeninu (U.S. Patent č. 5,286,487), fibroblastového růstového faktoru (JP-J03184998), α-interferonu (EP 146 903), tkáňového plazminogenního aktivátoru (WO 88/08451, EP 352 119), faktoru V (U.S. Patent č.5,004,803) a faktoru VIII. Nikdy dříve se nepopisovala záměna oblastí mezi krevními proteiny s antagonistickými funkcemi.

Krevní proteiny, které zahrnují prokoagulačni proteiny, antikoagulačni proteiny a antitrombotické proteiny, patří mezi proteiny, jejichž exprese in vitro je středem pozornosti kvůli izolaci jejich korespondujících genů a cDNA. Existují η

prokoagulační proteiny, které způsobuji koagulaci. Naopak antikoagulačni proteiny inhibuji tvořeni sraženin fibrinu a antitrombotické proteiny inhibuji tvořeni trombů, které jsou obvykle větší než sraženiny fibrinu a obsahuji fibrin, krevní destičky a adhezivní proteiny.

Krevní koagulace zahrnuje série proteolytických kroků, které nakonec vedou ke tvoření nerozpustné sraženiny fibrinu. Schéma krevní koagulace se popisuje jako kaskáda nebo vodopád a závisí na aktivačních vlastnostech různých serinových proteáz (Davie et al., Science 145: 1310-12 (1964); MacFarlane, Nátuře 202: 498-99 (1964). V krvi všechny serinové proteázy, které se účastní krevní koagulace jsou přítomny jako inaktivní prekurzorové proteiny, které se aktivují vhodným aktivátorem k proteolytickému štěpení. Krevní koagulace dále zahrnuje kofaktory, které nejsou enzymy a kontroluji vlastnosti různých krevních proteinů.

Například faktor V a faktor VIII působí jako neenzymatické kofaktory faktoru Xa a faktor IXa ve vnitřní cestě krevní koagulace (Mann et al., Blood 76: 1-16 (1990)). Aktivovaný faktor Vlila působí uprostřed vnitřní koagulační kaskády, působí jako kofaktor aktivace faktoru X faktorem IXa v přítomnosti iontů vápníku a fosfolipidů (Jackson et al., Ann. Rev. Biochem. 49:

765 (1980) ) .

Přírodní antagonista systému krevní koagulace je antikoagulačni systém. V plazmě zdravého savčího organizmu je působení obou systémů dobře vyváženo. V případě žilního poranění krevní koagulace zahrnuje ukládání matrice fibrinu v poškozeném místě. Po zhojení poranění se matrice fibrinu odstraní fibrinolyzí.

V antikoagulačním systému řada cest omezuje rozsah tvoření sraženiny. Několik inhibitorů serinové proteázy, jako je antitrombin a heparinový kofaktor II, specificky na sebe působí s aktivovanými serinovými proteázami krevní koagulační • ·

• · • · ···· ·· • · · · · · • · · · · · · ·· · ·· ···· · • · · · · · ·· ··· · · · · kaskády. Koagulaci dále řídi cesta antikoagulantu proteinu C, což vede k inaktivaci neenzymatických kofaktorů faktoru V a faktoru VIII. Poškozeni antikoagulačnich cest jsou běžně spojeny s cévní trombózou.

Trvalé a dočasné porušeni krevní koagulace a fibrinolyze vyžaduje aplikaci specifických faktorů příslušného systému. Trombotické komplikace vyžadují aplikaci antikoagulačnich proteinů, které se získávají ze savčího koagulačního systému, například protein C nebo protein S.

Během dočasných poškození krevní koagulace (to je ne genové) je nutná aplikace faktoru VIII, faktoru IX nebo jiných krevních koagulačních faktorů. Jedním typem dočasných krevních problémů je chirurgický zákrok. Různé formy hemofilie, které zahrnují genové odchylky, jenž ovlivňují krevní koagulaci, také vyžadují aplikaci specifických koagulačních faktorů, jako je faktor VIII nebo faktor IX.

Nepřítomnost funkce jednoho z prokoagulačních proteinů, které se účastní krevní koagulace, je obvykle spojena krvácením.

Nejběžnější porušení srážlivosti krve u lidí je hemofilie A, což je porušení srážlivosti krve spojené s chromozómem X, které postihuje okolo 0,01% mužské populace.

Hemofilie A je spojená s nepřítomností funkce faktoru VIII.

Hemofilie A se běžně léčí aplikací čištěných přípravků faktoru VIII izolovaného z plazmy zdravých dárců. Léčba má několik nevýhod. Získávání faktoru VIII od dárců plazmy je omezeno a je velmi drahé; koncentrace faktoru VIII v krvi je pouze okolo 100 ng/ml a výtěžky za použití běžných metod pro frakcionaci plazmy jsou nízké.

Ačkoli způsoby přípravy krevních faktorů z lidské plazmy se zdokonalily s ohledem na ochranu proti virům, stále zde přetrvává nebezpečí přenosu infekčních agents, jenž zahrnují virus hepatitidy a HIV.

Izolace funkční cDNA faktoru VIII vedla k produkci rekombinantniho faktoru VIII v kultivovaných buňkách. Zmiňuje se molekulové klonování cDNA faktoru VIII, která se získala z lidské mRNA a následná produkce proteinů, jenž vykazují v savčích, kvasinkových a bakteriálních buňkách aktivitu faktoru VIII (WO 85/01961; EP 160 457; EP 150 735; EP 253 455). Rekombinantní produkce vedla ke zdokonalení s ohledem na čistotu produktu a virovou bezpečnost. Stabilita faktoru VIII se nezlepšila a produkce faktoru VIII in vitro je omezena nízkými výtěžky. Náklady na léčbu jsou vysoké, protože faktor VIII se musí aplikovat často.

Jeden z důvodů časté aplikace faktoru VIII divokého typu při léčbě hemofilie A je jeho krátký poločas rozpadu in vivo. Příjemci někdy vytvoří protilátky proti aplikovanému exogennímu faktoru VIII, které mohou velmi redukovat jeho účinnost, což vede ke zvýšení dávky.

Například zastoupení pacientů s hemofilií A léčených produkty faktoru VIII, u kterých se proti němu vytvořily protilátky, se pohybuje mezi 11 a 13% (Aledort, Sem. Hematol. 30: 7-9 (1993). Za účelem indukovat imunotoleranci u pacientů s protilátkami proti faktoru VIII je nutné těmto pacientům aplikovat vysoké dávky faktoru VIII (Brackman et al. , Lancet 2: 933 (1977)). Ale aplikace vysokých dávek je značně nákladná.

Problémy spojené s aplikací faktoru VIII se mohou překonat, avšak jestliže koncentrace proteinu aplikovaného za účelem získání aktivity faktoru VIII v krvi hemofiliků se drží dostatečně nízko, aby se předešlo imunodetekci a produkci protilátek proti faktoru VIII, přičemž se musí zabezpečit potřebné pozitivní účinky faktoru VIII. Je nutná existence derivátů faktoru VIII, které mají vylepšené funkční vlastnosti tak, že aplikovanou molekulou se zavede do • ····· · · · ···· • · · · · · · ···· ·· · · · · · ·· · organizmu více jednotek aktivity faktoru VIII, to umožňuje redukci dávky a frekvenci aplikace.

Faktor VIII má tři kyselé oblasti, které obsahuji sulfátované tyroziny, které sousedi s místy štěpení trombinu v oblastech z Met³³⁷ do Arg³⁷² a od Ser⁷¹⁰ do Arg⁷⁴⁰ v těžkém řetězci a v lehkém řetězci z Glu¹⁶⁴⁹ do Arg¹⁶⁸⁹ (Mikkelsen et al. , Biochemistry 30: 1533-37 (1991); Pitman et al., loc.

Cit. 31: 3315-25 (1992); Eaton et al. , Biochemistry 25: 834347 (1986)). Ve všech třech případech kyselé oblasti obsahují jeden nebo více tyrozinových zbytků, které jsou sulfátované. Sulfatace Tyr¹⁶⁸⁰ je významná pro interakci faktoru VIII s von Willebrandovým faktorem (Leyte et al., J.Biol.Chem. 266: 74046 (1991)). Zatímco není známa úloha sulfátovaného Tyr³⁴⁶ (Fay et al. Thromb. Haemost. 70: 63-67 (1993), je pravděpodobné, že se podílí na interakci mezi doménami Al a A2 v aktivovaném faktoru VIII. Zjistilo se, že sulfatace Tyr⁷¹⁸, Tyr⁷¹⁹ a Tyr⁷²³zvyšuje vnitřní aktivitu aktivovaného faktoru Vlila (Michnick et al., J. Biol. Chem. 269: 20095-102 (1994)). Funkční analýza faktoru VlII-del(713-1637) vykazuje, že deleční mutant faktoru VIII, kterému chybí většina B-oblasti a kyselá oblast, jenž obsahuje Tyr⁷¹⁸, Tyr⁷¹⁹ a Tyr⁷²³ má defektní prokoagulační aktivitu. Biochemická analýza ukázala, že úplná aktivace faktoru VlII-del(713-1637) vyžaduje zvýšené množství trombinu ve srovnání s molekulou divokého typu (Mertens et al., Brit. J. Haematol. 85: 133-42 (1993)).

Trombin je enzym odpovědný za aktivaci faktoru VIII. Trombin má řadu dalších úloh v koagulační kaskádě. Proteolytické štěpení fibrinogenu trombinem produkuje monomér fibrinu, který pak polymerizuje za vzniku nerozpustné sraženiny fibrinu. Dále trombin může iniciovat řadu pozitivních a negativních zpětných vazeb, které buď udržují nebo snižují formaci sraženiny (Stubbs et al., Thromb. Res. 69: 1-58 (1993); Davie et al., Biochem. 30: 10363-70 (1991).

Λ Λ * Λ • ·

Navázáni trombinu na jeho receptor na krevních destičkách je spojeno se stimulací a agregací krevních destiček (Coughlin et al., J. Clin. Invest. 89: 351-55 (1992)). Omezená proteolýza trombinem aktivuje neenzymatické kofaktory V a VIII, které zesilují aktivaci faktoru X a protrombinu (Kane et al Blood 71: 539-55 (1988)). Existuje důkaz, že trombin se podílí na aktivaci faktoru XI (Gailani et al. , Science 253: 909-12 (1991)). Jestliže se na receptor endoteliální buňky naváže trombomodulin, trombin působí jako antikoagulant tím, že aktivuje protein C (Esmen, Thromb. Haemost. 70: 29-35 (1993)). Za přítomnosti glykozaminoglykans trombin je specificky inhibován inhibitory erinové proteázy, což jsou anti-trombin a heparinový kofaktor II (Huber et al., Biochem. 28: 8952-66 (1989)).

Určení třírozměrné struktury komplexů, které trombin tvoří se syntetickým inhibitorem PPACK stejně jako s hirudinem, což je antikoagulační protein původně izolovaný z pijavic, definovalo důležitou úlohu pozitivně nabité oblasti, známé jako aniontové exomísto, v interakci trombinu s jinými proteiny (Bode et al., EMBO J. 11: 3467-75 (1989); Skrzypczak-Jankun et al. , J. Mol. Biol. 206: 755-57 (1989); Rydel et al., Science 249: 277-80 (1990); Grutter et al. , EMBO J. 9: 2361-65 (1990)). Nejlépe popsanou tříprostorovou strukturou je pak komplex trombin-hirudin, kde kyselá oblast v oblasti karboxylového konce hirudinu je v blízkém kontaktu s aniontovým exmístem trombinu (Grutter et al. , EMBO J. 9: 2361-65 (1990); Rydel et al. , Science 249: 277-80 (1990)). Ukázalo se, že části negativně nabitých aminokyselin receptoru trombinu, trombomodulinu a heparinového kofaktoru II, které jsou podobné těm, jenž obsahuje hirudin, reagují s aniontovým místem trombinu (Liu et al. , J. Biol. Chem. 266: 16977-80 (1991); Vu et al. , Nátuře 353: 674-77 (1991); Mathews et al., Biochemistry 33: 3266-79 (1994); Tsiang et • · ·· · · ·· ····· · • · · · · · ···· ·· · · · · · · · ·· · • ··· · · · · · ··· ·· • · · · · ♦ ·· ···· ·· · · · · · · · ·· al., Biochemistry 29: 10602-12 (1990); Van Deerlin et al., J. Biol. Chem. 266: 20223-31 (1990)). Studie, které využívají syntetických peptidů odpovídající negativně nabitým oblastem těchto proteinů vykazují, že tyto proteiny máji různé afinity trombinu. Uvedené studie indikují, že stupeň afinity trombinu k jiným proteinům závisí s části na kyselých oblastech těchto jiných proteinů (Tsiang et al., Biochem. 29: 10602-12 (1990); Hortin et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 169: 437-442 (1990)).

V aktivovaném stavu je faktor VIII heterotrimér obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 372 (obsahující oblast Al) a 373 až 740 (obsahující oblast A2) těžkého řetězce a zbytků 1690 až 2332 (domény A3-C1-C2) lehkého řetězce (Eaton et al., Biochem. 25: 505-12 (1986); Lollar et al.

Biochemistry 28: 666-74 (1989)). Při srovnání s deaktivovaným prekurzorem faktoru VIII, u aktivního faktoru VIII pak chybí fragment lehkého řetězce 1649 až 1689, který se účastní interakce faktoru VIII s von Willebrandovým faktorem (Lollar et al., J. Biol. Chem. 263: 10451-55 (1988)) stejně jako úplná B-oblast 741 až 1648.

Zjištění, že úplná B-oblast je proteolyticky odstraněna při aktivaci faktor VIII, vede ke konstrukci různých delečních mutantů B-oblasti. Zjistilo se, že takové deleční mutanty B-oblasti faktoru VIII vedou ke zvýšení úrovně produkce rekombinantního faktoru VIII (EP 294 910; WO

86/06101; U.S. Patent č. 4,868,112; Toole et al., Proč. Nat'1 Acad. Sci. USA 83: 5939-42 (1986); Eaton et al. Biochemistry 25: 8343- 47 (1986); Sarver et al. , DNA 6: 553-64 (1987)).

Ukázalo se, že deleční mutantní faktor VlIIdel(868-1562), který je zde nazýván jako faktor VIII dB695, je podoný plazmovému faktoru VIII s ohledem na navázání na faktor von Willebranda, poločas rozpadu a získání faktoru VIII dB695 za účelem aplikace infúzi psům s hemofilií A (Mertens et al., Brit. J. Haematol. 85: 133-142 (1993)).

Popisovaly se i jiné hybridní molekuly s aktivitou faktoru VIII. V US patentu č. 5,004,803 se například popisuje molekula faktoru VIII, která si uchovává aktivitu faktoru VIII v případě, že B-oblast faktoru V se zamění za přirozenou B-oblast. Mezinárodní přihláška WO 94/11013 popisuje chimérický faktor VIII, ve kterém jeden nebo více exonů jsou nahrazeny odpovídajícími exony faktoru V, a chimérický faktor V, ve kterém jeden nebo více exonů jsou nahrazeny odpovídajícími exony faktoru VIII.

US patent č. 5,364,771 popisuje lidské/prasečí hybridy faktoru VIII. Tyto hybridy ze získaly smícháním těžkého řetězce prasečího faktoru VIII s lehkým řetězcem lidského faktoru VIII a opačně nebo pomocí metody technologie DNA. Popisuje se rekombinantní molekula s aktivitou faktoru VIII, kde oblast A2 prasečího faktoru VIII se substituovala oblastí A2 lidského faktoru VIII. WO 94/11503 popisuje různé konstrukce, kde oblasti prasečího faktoru VIII se substituovaly odpovídajícími oblastmi lidského faktoru VIII. Některé z těchto prasečích/lidských hybridů faktoru VIII vykazují zvýšenou aktivitu faktoru VIII ve srovnání s faktorem VIII divokého typu, jak se určilo testem Kabi Coatest Chromogenic Assay. Maximálního nárůstu 3,8 krát se dosáhne pouze, když velká oblast mezi aminokyselinovými pozicemi 336 a 740 v lidském faktoru VIII je nahrazena jejím prasečím protějškem. Tato oblast reprezentuje strukturálně, ale ne biochemicky definovanou jednotku, která oblastí A2 s několika dalšími aminokyselinovými zbytky na každé straně.

Mezinárodní přihlášky WO 95/18827 a WO 95/18829 popisuje deriváty faktoru VIII, kde jednotlivé aminokyseliny v oblasti

A2 jsou deletovány nebo substituovány za vzniku stabilnějšího proteinu s aktivitou faktoru VIII. V pozdější přihlášce jsou

deletovány nebo substituovány pouze jednotlivé aminokyseliny. Prokoagulační aktivita všech těchto derivátů faktoru VIII se však neliší od aktivity faktoru VIII divokého typu.

Mezinárodní přihláška WO 95/18828 popisuje deriváty faktoru VIII, kde jednotlivé aminokyseliny v oblasti A2 se deletovaly a substituovaly se za vzniku proteinu se stejnou aktivitou jako má faktor VIII divokého typu, ale při jejich přípravě metodami rekombinace DNA vzniká větší výtěžek.

S ohledem na jiné proteiny mezinárodní přihláška WO 91/05048 popisuje mutanty inhibitoru lidského plazminogenního aktivátoru, jehož reaktivní centra jsou nahrazena reaktivním centrem antitrombinu III. Výsledkem je, že mutanti mohou vykazovat různé vlastnosti, jako je reaktivita se serinovými proteázami. Ale tato publikace nezahrnuje krevní koagulační proteiny ani inzerci kyselých oblastí. Evropská přihláška 296 413 popisuje hybridní protein C, jehož oblast Gla je nahrazena jinou oblastí Gla, která je odvozena od jiného proteinu závislého na vitamínu K.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje hybridní proteiny, které jsou odvozeny od krevních koagulačních proteinů a mají modifikované charakteristiky, stejně jako metody přípravy takových proteinů a léčbu pacientů takovými proteiny.

Vynález popisuje hybridní proteiny, které mají modifikované charakteristiky tím, že nejméně jedna oblast krevního koagulačního proteinu je nahrazena oblastí(mi) z donorového proteinu, přičemž donorový protein je antikoagulační nebo antitrombotický protein.

Dále vynález popisuje zdokonalené hybridní proteiny, které mají terapeutické vlastnosti faktoru VIII.

Vynález dále popisuje hybridní protein odvozený od krevního koagulačního proteinu, kde hybridní protein obsahuje

oblast nebo oblasti z donorového koagulantu nebo antitrombotického proteinu nebo z celého nebo z částečně syntetického polypeptidu, přičemž hybridní protein má modifikovanou biologickou aktivitu.

Hybridní protein se přednostně odvozuje z krevního koagulačního proteinu vybraného ze skupiny obsahující faktor V, faktor VIII, faktor X, faktor XIII, fibrinogen, protein S a protein C. Také se preferuje, že oblast začleněná do hybridního proteinu má afinitu k serinové proteáze, jako je trombin. Tato oblast(i) mohou mít menší nebo větší afinitu k serinové proteáze, než nativní oblast(i) krevního koagulačního proteinu. Oblast je s výhodou kyselá oblast a obsahuje vazebné místo pro serinovou proteázu. V preferovaném provedení je oblast z proteinu vybraného ze skupiny obsahující heparinový kofaktor II, antitrombin III a hirudin.

Vynález dále poskytuje hybridní proteiny, které obsahují první oblast krevního koagulačního proteinu a druhou oblast antikoagulačního nebo antitrombotického proteinu, kde (A) druhá oblast má afinitu k serinové proteáze a (B) hybridní protein vykazuje biologickou aktivitu, která je charakteristická pro krevní koagulační proteiny, ale která je v hybridním proteinu modifikována. Krevní koagulační protein může být faktor V, faktor VIII, faktor X, faktor XIII, fibrinogen, protein S a protein C. Antikoagulačním nebo antitrombotickým proteinem může být antitrombin III, heparinový cofaktor II a hirudin. Upřednostňuje se, aby oblast z antikoagulačního nebo antitrombotického proteinu byla kyselou oblastí a obsahovala vazebné místo pro serinovou proteázu, jako je trombin.

Krevní koagulační faktor podle vynálezu je faktor VIII nebo mutant faktoru VIII, kterému chybí část B-oblasti, jako je faktor VIII db695 nebo faktor VIII db928. Upřednostňuje se, aby nejméně jedna kyselá oblast z faktoru VIII nebo z • · · · · · • · mutantu faktoru VIII, která se nachází mezi aminokyselinovými zbytky 3 36 a 37 2, aminokyselinovými zbytky 705 a 740, s výhodou 712 až 737 nebo 718 až 732 a aminokyselinovými zbytky 1648 a 1689 byly nahrazeny aminokyselinami 53 až 62 hirudinu nebo aminokyselinami 45 až 90, přednostně 51 až 81 heparinového kofaktoru II. Faktor VIII nebo mutant faktoru VIII může mít nahrazené dvě nebo více kyselých oblastí a/nebo oblastí majících afinitu k serinové proteáze.

Vynález poskytuje farmaceutické kompozice, obsahující hybridní proteiny, polynukleotidy (zahrnující vektory) kódující hybridní proteiny, transformované buňky obsahující tyto polynukleotidy a protilátky směrované proti hybridním proteinům. Vynález také popisuje způsoby modifikace biologických aktivit proteinů.

Vynález popisuje hybridní proteiny, které jsou odvozeny z krevních koagulačních proteinů, které jsou proteiny mající prokoagulační vlastnosti. Tyto hybridní proteiny mohou vznikat inzercí nejméně jedné oblasti z antikoagulačního nebo antitrombotického proteinu nebo syntetických polypeptidů do krevního koagulačního proteinu. Tyto oblasti vykazují s výhodou afinitu k serinové proteáze a ještě výhodnější je, jsou-li tyto oblasti kyselé.

Termín odvozeny ve svých různých gramatických formách znamená také podobnost, která svědčí o prototypu. Hybridní protein odvozený z krevního koagulačního proteinu vykazuje aktivitu, která je charakteristická pro krevní koagulační protein, z kterého je hybridní protein odvozen. Zvláště, charakteristická aktivita může být například schopnost proteinu vzájemně působit na jiné proteiny a způsobovat určitý účinek. Například krevní koagulační protein vzájemně působí na jiný protein za účelem nakonec zajistit výskyt koagulace.

• · · » • · · ·

Překvapivě funkční hybridní proteiny se získaly kombinací oblasti (i) z krevního koagulačního proteinu, který je prokoagulačním proteinem, s oblastí(mi) z antikoagulačního a/nebo antitrombotického proteinu, které jsou funkčními antagonisty prokoagulačních proteinů. Klíčový aspekt vynálezu je neočekávané zjištění, že proteiny, které se chovají jeden k druhému jako antagonisty často obsahují oblasti, které nejsou antagonistické, ale spíše vykazují v daných proteinech stejnou nebo podobnou funkci.

Hybridní proteiny podle vynálezu se mohou získat záměnou jedné nebo více oblastí krevního koagulačního proteinu za jednu nebo více oblastí z donorového proteinu, jako jsou antikoagulačni a/nebo antitrombotické proteiny nebo syntetické polypeptidy, které mají charakteristiky vhodné oblasti. Termín záměna ve svých různých gramatických formách znamená změnu sekvence proteinu tak, že se nahradí nativní aminokyseliny odlišnými aminokyselinami. Upřednostňuje se, aby nahrazená oblast krevního koagulačního proteinu měla afinitu k serinové proteáze a oblast (i) z donorového proteinu měla větší nebo menší afinitu k serinovým proteázám v závislosti na vlastnostech, které musí splňovat výsledný hybridní protein.

Protein, aby byl změněn podle vynálezu, je krevní koagulační protein nebo polypeptid odvozený od takového proteinu. V preferovaném provedení je hybridní protein založen na přirozeně se vyskytujícím krevním koagulačním proteinu nebo na jiném polypeptidu, jako jsou mutanty přirozeně se vyskytujících proteinových a polypeptidových sekvencí modelovaných na základě pravidel vyvinutých pomocí analýz rodin proteinů stejně jako charakteristik jednotlivých aminokyselin.

Jako následek inkluze oblasti z antikoagulačního nebo antitrombotického proteinu se modifikuje jedna nebo více

4 4	44	4«	• 44*
9 9	4 4	•	r	4
4	4 4	4	4	44·
9	• 99 9	4	9		•
4	9	•	9		4
4444	44	4 4		444

• 4 99 • 9 4 9 • 9 99

999 4 4

4 ·

44 biologických aktivit krevního koagulačního proteinu a vzniká hybridní protein. Biologické aktivity, které se mohou modifikovat zahrnují aktivační vlastnosti, enzymatické funkce, imunogenní vlastnosti. Každá z těchto aktivit závisí na primární schopnosti proteinu vzájemně působit na jiné proteiny, jko jsou ko-faktory, enzymy, receptory nebo protilátky. Modifikace může způsobit aktivaci hybridního proteinu, což často způsobuje, že hybridní protein má, ve srovnání s přirozeným krevním koagulačním proteinem, zvýšenou afinitu k vhodnému aktivátoru, jako je serinová proteáza. Změna může také modifikovat enzymatickou aktivitu krevního koagulačního proteinu nebo jeho vazebnou afinitu pro daný typ protilátek.

Změna aktivity může být slabá nebo významná v závislosti na charakteru oblasti, která je zamněněna, stejně jako na charakteru modifikace oblasti, která se začleňuje. Ve skutečnosti může zcela eliminovat biologické vlastnosti proteinu, což je použitelné v případě, že se proteinové antagonisty přirozených hybridního požaduj i

Antagonistický hybridní protein bude mít malou aktivitu, ale stejně bude schopen interakce s proteinů.

nebo žádnou přirozenými vazebnými partnery krevního koagulačního proteinu, ze kterého je odvozen a tak bude bránit interakci endogenního koagulačního faktoru s vazebným partnerem.

Hybridní proteiny podle vynálezu jsou odvozeny od skupiny prokoagulačních proteinů.Prokoagulační proteiny podle vynálezu zahrnují faktor V, faktor VIII, faktor X, faktor XIII, fibrinogen, protein S a protein C nebo libovolný mutant nebo derivát zahrnující fragmenty libovolných těchto proteinů. Inhibitory plazminogenního aktivátoru a plazminu jako krevní koagulační proteiny.

nejsou prokoagulační proteiny a tak nejsou zde definovány • · · φ · ·

Kyselé oblasti podle vynálezu přednostně obsahuji kontinuální nebo skoro kontinuální oblast proteinu, která obvykle zahrnuje více než 6 a méně než 100 aminokyselina zahrnuje tolik kyselých aminokyselin, aby celá oblast získala negativní náboj, což znamená, že nejméně 15% aminokyselin je kyselých. Preferované kyselé aminokyseliny zahrnují kyselinu glutamovou a aspartovou. V jednom provedení vynálezu interakční místo serinové proteázy je vazebné místo trombinu a dochází primárně k modifikaci vlastností krevního koagulačního proteinu, což je afinita proteinu k protrombinu nebo k trombinu. Afinita krevního koagulačního proteinu k protrombinu nebo trombinu se může zvýšit nebo snížit. Mezi použitelné krevní koagulační proteiny, jejichž afinita k trombinu se může modifikovat podle vynálezu, patří faktor V, faktor VIII, protein S nebo protein C. Modifikace, která působí afinitu krevního koagulačního proteinu k protrombinu nebo trombinu může dále způsobovat afinitu krevního koagulačního proteinu k jiným proteinům, jako jsou jiné prokoagulační nebo antikoagulační proteiny nebo protilátky.

Kyselé oblasti mohou obsahovat tyrozinové zbytky, které podléhají tyrozinové sulfataci. Každý náboj, kyselost a přítomnost sulfátových skupin ve specifických oblastech mají důležitý vliv na (i) třidimenzionálni strukturu specifické oblasti a celý protein a (ii) interakci oblasti a/nebo celého proteinu s jinými faktory, podobně jako krevní proteiny. Důležité příklady proteinů s oblastmi, které obsahují tyrozinové zbytky jsou různé prokoagulační a antikoagulační proteiny, jako faktor V, faktor VIII, fibrinogen, heparinový kofaktor II, protein S, protein C nebo hirudin.

V jednom provedení vynálezu kyselá oblast krevního koagulačního proteinu obsahuje jeden nebo více tyrozinových zbytků, s výhodou 1 až 10 tyrozinových zbytků, upřednostňuje • ·

se 1 až 5 tyrozinových zbytků a nej výhodně j ši je 1 až 3 tyrozinové zbytky.

Podle vynálezu jedna nebo více kyselých oblastí krevního koagulačniho proteinu se může nahradit jednou nebo více kyselých oblastí jednoho nebo více donorových proteinů. Například kyselá oblast krevního koagulačniho proteinu se může dále zaměnit jednou nebo několika kyselými oblastmi. Avšak kyselé oblasti z různých proteinů mohou nahradit kyselou oblast nebo oblasti krevního koagulačniho proteinu za vzniku hybridního proteinu.

Donor je podle vynálezu antikoagulační nebo antitrombotický protein. Upřednostňuje se, že donor je ze skupiny heparinového kofaktoru II, hirudinu nebo antitrombinu nebo libovolných derivátů, které zahrnují fragmenty libovolného z těchto proteinů. Donorovým proteinem může dále být zcela nebo částečně syntetický polypeptid, který není odvozený z jednotlivého přirozeného proteinu, ale je spíše vytvořen podle pravidel vyvinutých na základě analýz rodin proteinů, stejně jako charakteristik jednotlivých aminokyselin.

Nahrazení kyselé oblasti v krevním koagulačním proteinu jinou kyselou oblasti donorového proteinu se přednostně objevuje na úrovni DNA. DNA se může získat z genomové DNA nebo z cDNA kódující požadovaný krevní koagulační protein a donorové proteinové oblasti. Nahrazení se může dosáhnout pomocí PCR a jiných metod rekombinace DNA.

DNA kódující kyselou oblast donoru, která by měla nahradit kyselou oblast v krevním koagulačním proteinu je buď amplif ikována z genu nebo z cDNA nebo je syntetizována na polynukleotidovém syntetizéru. Záměny se může dosáhnout mutagenezí nebo použitím metod PCR-mutageneze. Metody PCRmutageneze nevyžaduji amplifikaci DNA kódující kyselou oblast z donoru, ale spíše se mohou použit specificky vytvořené PCR

primery, které se mohou syntetizovat na polynukleotidovém syntetizéru.

Mohou se použit místně specifická a do určitého místa směrovaná mutageneze (Current Protocols in Molecular Biology vol. 1, ch. 8 , Ausubel et al. eds. , J. Wiley and Sons 1989 and Supp. 1990-93); Protein engineering, Oxender and Fox eds., A. Liss, lne. 1987). Navíc se mohou použit metody skenování linkru a metody zprostředkované PCR (PCR Technology Erlich ed., Stockton Press 1989); Current Protocols in Molecular Biology vol. 1 and 2, ch. 8 , Ausubel et al. eds., J. Wiley and Sons 1989 and Supp. 1990-93). V publikacích Protein engineering, Oxender and Fox eds., A. Liss, lne. 1987 a Current Protocols in Molecular Biology vol. 1 and 2, ch. 8, Ausubel et al. eds., J. Wiley and Sons 1989 and Supp. 1990-93 je popsáno sekvenování proteinu, přístupy ke tvoření struktury a modelování proteinů při použití libovolných metod.

V případě, že donorovým proteinem je zcela nebo z části syntetický polypeptid, pak DNA kódující celý polypeptid se může syntetizovat na polynukleotidovém syntetizéru. Upřednostňuje se, aby tato DNA nesla vhodné adaptory pro klonování, které se mohou přímo použít v metodách rekombinace DNA.

Podle vynálezu se mohou také uskutečnit změny v aminokyselinové sekvenci hybridních proteinů. Upřednostňuje se, aby proběhly změny aminokyselin, které mají stejné nebo podobné vlastnosti. Ilustrativní aminokyselinové substituce zahrnují změny: alanin za serin; arginin za lyzin; aspargin za glutamin nebo histidin; aspartát za glutamát; cystein za serin; glutamin za aspargin; glutamát za aspartát; glycin za prolin; histidin za asparagin nebo glutamin; izoleucin za leucin nebo valin; leucin za valin nebo izoleucin; lyzin za arginin, glutamin nebo glutamát; metionin za leucin nebo «··· · · · · • · · · • * · · • · · • · • · · • · • · • « · · · tyrozin, leucin nebo za serin; tryptofan fenylalanin; valin izoleucin; fenylalanin za serin za treonin; treonin za tyrozin za tryptofan nebo leucin.

nebo za metionin; tyrozin; izoleucin proteinů se analogy, zde uvedených hybridních vynálezu. Varianty zahrnují muteiny a mimetiky hybridních proteinů,

Navíc varianty mohou použít podle homology, deriváty, které si zachovávají pozitivní vlastnosti. Varianty se mohou tvořit přímo z hybridních proteinů proteolytických enzymů nebo Navíc se mohou použít metody jako metody syntetizování chemickou kombinací modifikací, těchto dvou genového polypeptidů inženýrství, přímo z hybridních proteinů přístupem, který se Science 253: 792-95 štěpením způsobů, stejně aminokyselinových zbytků.

Nepeptidové látky, které napodobují vazby a funkce částí (mimetics), se mohou produkovat popisuje v publikaci Sarag et al., (1991). Mimetiky jsou molekuly, které napodobují fragmenty proteinové sekundární struktury (Johnson et al. , Peptide Turn Mimetics v Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al., eds. Chapmann and Halí, New York, 1993). Použití peptidových mimetik spočívá v tom, že aminokyselinové boční řetězce jsou na peptidové kostře proteinů tak, že dochází k molekulové interakci. Pro účely za výhodné mimetiky mohou považovat ekvivalenty proteinů

Pro orientovány vynálezu se hybridních proteiny v případě, faktoru VIII, podle že se ujistit, zda hybridní vhodné pro danný účel. Například hybridní proteiny odvozené od metody zahrnují testy aktivit a jejich mutanty. odborníka je jednoduché vynálezu jsou se používají skríningové kofaktoru a prokoagulantu.

V jednom určitém provedení připraví tak, že jako donorový faktoru VIII nebo jeho derivát, protein molekula vynálezu se krevní protein se použije jako jsou koagulační protein • · • · a lidský heparinový kofaktor II. Heparinový kofaktor II je glykoprotein obsažený v lidské plazmě, který inhibuje proteázy, například trombin. Heparinový kofaktor II blízko svého N-konce (v oblasti od aminokyselinového zbytku 51 do aminokyselinového zbytku 81) nese kyselou oblast, která obsahuje dvě tyrozinová sulfatační místa. Tato oblast je pravděpodobně potencionálním vazebným místem trombinu (Van Deerlin et al., J. Biol. Chem. 266: 20223-31 (1991).

V jednom specifickém provedení vynálezu oblast nahrazená ve faktoru VIII nebo v derivátu faktoru VIII je kyselou oblastí. Podle požadovaného typu modifikace biologické aktivity faktoru VIII je možné nahradit jednu nebo dvě nebo všechny tři kyselé oblasti faktoru VIII. Kyselé oblasti faktoru VIII se mohou nahradit kyselou oblastí heparinového kofaktoru II nebo libovolnou jinou oblastí libovolného z donorových proteinů, které jsou uvedeny shora v textu, jako jsou heparinový kofaktor II, antitrombin III nebo hirudin. V případě, že dojde k záměně dvou nebo více oblastí v krevních koagulačních proteinech, substituční oblasti mohou být shodné nebo odlišné a tyto oblasti mohou pocházet ze stejného donorového proteinu nebo z odlišných donorových proteinů. Mohou se však použít různé typy syntetických proteinů.

Navíc fúze více než jedné oblasti může nahradit oblast v krevním koagulačním proteinu. Fúzované oblasti mohou být shodné nebo odlišné a mohou pocházet z jednoho nebo více donorových proteinů.

Mělo by se poznamenat, že čísla (pozice aminokyselin) danná v této přihlášce pro různé oblasti krevních koagulačních a donorových proteinů pochází z preferovaných provedení vynálezu. Oblasti nejsou v žádném případě omezeny na pozice danné v popisu vynálezu. Podobně oblasti mohou být větší nebo menší. Oblasti podle vynálezu mohou být dále fragmenty definovaných oblastí.

• · · · • ·

V provedení podle vynálezu oblast, která pochází z lidského heparinového kofaktoru II je kyselá oblast lokalizována mezi aminokyselinovými zbytky 51 a 81 a nahrazuje libovolnou z kyselých oblastí faktoru VIII. Kyselá oblast heparinového kofaktoru II se může nahradit jednou, dvěmi nebo všemi třemi kyselými oblastmi v molekule faktoru

VIII. Kyselá oblast heparinového kofaktoru II může před nahrazením oblastí v krevním koagulačním proteinu dále fúzovat s jinou kyselou oblastí, například s kyselou oblastí hirudinu.

V jiném provedení vynálezu kyselá oblast lidského heparinového kofaktoru II, která se nachází mezi aminokyselinovými zbytky 51 a 81, se nahrazuje kyselou oblastí lidského faktoru VIII, který se nachází mezi aminokyselinovými zbytky 705 a 740, s výhodou je to oblast od aminokyselinového zbytku 712 do aminokyselinového zbytku 737.

V jiném provedení vynálezu hybridní lidský faktor VIII se odvozuje z mutantu lidského faktoru VIII, kterému chybí velká část B-oblasti. Například aminokyselinové zbytky 51 a 81 heparinového kofaktoru II mohou nahradit původní kyselou oblast, která se za normálních okolností nachází mezi aminokyselinovými zbytky 712 a 737.

Hybridní proteiny se také připravují tak, že vykazují biologickou aktivitu krevního faktoru VIII s ještě zvýšenou prokoagulační aktivitou ve srovnání s aktivitou kofaktoru. Jestliže se tyto hybridní proteiny podávají pacientům s hemofilií, mohou svým působením v kaskádě srážení krve napravovat defekt srážení krve. S ohledem na zvýšenou prokoagulační aktivitu hybridních proteinů mohou se podávat v nižší dávce a může se tak redukovat frekvence aplikace ve srovnání s proteiny s aktivitou faktoru VIII, které se popisuji v předchozím stavu techniky. Tyto skutečnosti jsou velkou výhodou, protože náklady na produkci stejně jako na • ·

léčbu se mohou redukovat a, co je nejduležitější, lze podstatně snížit nebezpečí vzniku inhibičních protilátek u hemofiliků, protože jedna molekula vykazuje více jednotek aktivity faktoru VIII.

Hybridní proteiny s aktivitou faktoru VIII podle vynálezu reprezentují zdokonalení rekombinantních molekul faktoru VIII s ohledem na prokoagulační aktivitu. V jednom provedení polypeptidy s aktivitou faktoru VIII popsané v publikaci EP 294 910 se dále podle vynálezu modifikují. V tomto provedení vynálezu počáteční bod konstrukce hybridních proteinů se zvýšenou prokoagulační aktivitou faktoru VIII je delece mutantů faktoru VIII, kde se odstraní hlavní část Boblasti. Příklady zahrnují faktor VlIIdel(868-1562), který je zde uveden jako faktor VIII dB695, a faktor VIIIdel(7411668) ), který je zde uveden jako faktor VIII dB928.

Konstrukce a sekvence faktoru VIII dB695 se popisují v EP 294 910. V jednom provedení vynálezu se nahradila oblast od nukleotidu 2191 až do nukleotidu 2266 faktoru VIII dB695 (kóduje aminokyseliny 712 až 737) oblastí od nukleotidu 208 do nukleotidu 298 (kóduje aminokyseliny 51 až 80) lidského heparinového kofaktoru II) . Zde uvedená čísla aminokyselin označují pozice aminokyselin ve faktoru VIII divokého typu; pozice nukleotidů označují číslování cDNA faktoru VIII divokého typu, kde první nukleotid iniciačního kodonu translece je 1. Výsledná konstrukce DNA kóduje hybridní faktor VIII, který se zde označuje jako faktor VIII dB695HCII.

Konstrukce DNA může být řízena vhodným promotorovým elementem a může se začlenit do vhodného expresivního vektoru. Příklady vhodných promotorových elementů jsou SV40promotor, CMV- promotor, RSV- promotor, LTR- promotor, EBVpromotor, b-aktin- promotor, hGH- promotor, T4- promotor. T3promotor, T7- promotor, SP6- promotor, metalothionia-adeno-2 promotor, adeno hlavní pozdní svalové specifické promotory, nebo indukovatelné promotory interferonový promotor steroidní hormon.

vektorových systémů myogenní vektorové založené na virových č. 5,445,953),

Expresní faktor VIII , nebo Příklady zahrnuj i systémy systémech,

promotor nebo TK promotor nebo jako jsou myozinové promotory jako hsp- promotor nebo betapromotory z vhodných pBPV, pSVL, (WO 93/09236) jako jsou poxviry (US patent adenoviry, retroviry vektor, který nese dB695-HCII se může genů s odezvou na DNA expresivních pRc/CMV, pRc/RSV, nebo vektory nebo bakuloviry. konstrukci DNA kódující použít pro transformaci hostitelské buňky. Hostitelská buňka pak může růst v systému buněčné kultury, přičemž dochází k expresi proteinu z DNA. Faktor VIII dB695-HCII se pak izoluje a čisti z progenu hostitelské buňky nebo z buněčného kultivačního média, které se používá pro růst hostitelských buněk. Hostitelská buňka může být buď eukaryontní nebo prokaryontní. Mezi preferované prokaryontní hostitele patří E.coli a B.subtilis. Preferovanými eukaryontními hostiteli mohou být nižší eukaryontní buňky, stejně jako savčí buňky. Preferovanými nižšími eukaryontními buňkami jsou Sacharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces a Pichia. Preferované savčí buňky zahrnují CHO, COS, BHK, SK-HEP, C127, MRC5, 293, VĚRO buňky, fibroblasty, keratinocyty nebo myoblasty, hepatocyty nebo kmenové buňky, například jde o hematopoietické kmenové buňky.

Faktor VIII dB695-HCII je zdokonalení svých předcházejících molekul faktoru VIII dB695.

Faktor VIII dB695-HCII si ponechává požadované charakteristiky faktoru

VIII dB695, který byl velkým vylepšením dříve existujících rekombinantních molekul faktoru VIII (EP 294 910). Faktor

VIII dB695-HCII má však schopnosti, které jeho předchůdce neměl. Prokoagulační aktivita faktoru VIII dB695-HCII je podstatně vyšší ve srovnáni s aktivitou kofaktoru, což je vlastnost, kterou zaručuje kyselá oblast heparinového kofaktoru II.

Vynález také popisuje fargmenty a mutanty faktoru VIII dB695-HCII, stejně jako fúzní proteiny, které zahrnují funkční části faktoru VIII dB695-HCII, zahrnujíc prokoagulační aktivitu.

Vynález také popisuje fúzní proteiny, kde faktor VIII dB695-HCII se fúzoval s jiným proteinem nebo s částí jiného proteinu. Faktor VIII dB695-HCII se může například fúzovat se stabilizační částí sérového albuminu nebo s pre-pro- nebo pro-sekvencí, která je odvozena z jiného krevního kofaktoru, jako je faktor IX nebo proetin S.

Vynález dále popisuje diméry a chiméry faktoru VIII dB695-HCII, jmenovitě látky, které mají nejméně jednu biologickou aktivitu faktoru VIII dB695-HCII spojenou s jinou oblastí, která má v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci jako faktor VIII dB695-HCII. Jednotlivé komponenty chiméry mohou mít různé aminokyselinové sekvence. Biologická aktivita zahrnuje schopnost korigovat u pacientů s hemofilií A defekt srážení krve nižší dávkou a během kratšího času srážení ve srovnání s přirozeně se vyskytujícím faktorem VIII.

Za účelem dosažení imunogenicity se mohou kovalentně spojovat různé faktory VIII dB695-HCII a molekuly faktoru VIII dB695-HCII podle vynálezu s velkými imunogenními polypeptidy. Takové imunogenní polypeptidové entity jsou například bovinní sérový albumin, hemocyanin kuželnatky (KLH) a podobně. Tyto konjugované polypeptidy se používají pro indukci protilátek ve vhodném hostitelském organizmu.

Podle vynálezu se může cDNA faktoru VIII v plné délce stejně jako její deriváty použít jako počáteční materiál ke konstrukci hybridů faktor VlII/heparinového kofaktoru II.

• ·

cDNA faktoru VIII stejně jako její deriváty mohou pocházet z libovolných savčích druhů, upřednostňuje se člověk, prase nebo kráva. Všechny formy manipulace a aplikace, které jsou pro faktor VIII dB695-HCII popsány se dají aplikovat na libovolný hybrid faktor VlII/heparinový kofaktor II a jsou součástí popisu.

U jiného provedení vynálezu se popisuje hybridní protein, kde krevní koagulační protein je lidský krevní koagulační faktor VIII nebo jeho libovolný derivát a donorový protein je hirudin. Upřednostňuje se, aby kyselá oblast hirudinu, která se nachází mezi aminokyselinami Phe⁵³ a Gin⁶², nahradila kyselou oblast faktoru VIII dB695, která se nachází mezi aminokyselinovými zbytky 705 a 740, upřednostňuje se kyselá oblast od aminokyseliny 718 do aminokyseliny 732. Výsledný hybridní protein se nazývá faktor VIII dB695-HIR.

Hirudin je velmi potentní inhibitor trombinu a nese vazebné místo pro trombin s vysokou afinitou k trombinu. Na základě záměny faktor VIII obsahuje hirudinové vazebné místo pro trombin a vykazuje vysokou afinitu k trombinu. Hirudin je trombinový specifický antikoagulant pocházející z pijavek Hirudo medicinalis. Ačkoli hirudin nelze izolovat ze savčího systému, považuje se za důležitý antitrombotický faktor.

Vynález dále popisuje nukleové kyseliny, které kódují libovolný z hybridních proteinů podle vynálezu. Nukleovou kyselinou může být DNA nebo RNA. Nukleová kyselina je obsažena v expresivnim vektoru, který poskytuje elementy vhodné pro expresi DNA nebo RNA. Expresivní vektor může také obsahovat elementy pro replikaci zmíněné DNA nebo RNA. Exepresivním vektorem může být DNA nebo RNA vektor. Příklady DNA expresivních vektorů jsou pBPV, pSVL, pRc/CMV, pRc/RSV, myogenní vektorové systémy (WO 93/09236) nebo vektory, které jsou založeny na virových systémech, jako jsou například poxviry (US patent č. 5,445,953), adenoviry, adeno-asociované • · ♦ » viry, herpesové viry, retroviry nebo bakuloviry. Příklady RNA expresivních vektorů jsou vektory, které jsou založeny na RNA virech, jako jsou například retroviry nebo flaviviry.

Při aplikaci geové terapie se nukleová kyselina kódující hybridní protein zavede do savce. Nukleové kyseliny používané v genové terapii se mohou chemicky modifikovat. Chemické modifikace mohou být modifikace, které chrání nukleovou kyselinu před štěpením nukleáz, například stabilizací kostry nebo konce. Metody genové terapie se popisují v publikaci Culver et al., Science 256: 1550-52 (1992); Rosenberg et al., Human Gene Therapy 3: 57-75 (1992).

Expresivní vektor obsahující nukleovou kyselinu, která kóduje hybridní protein podle vynálezu se může použít pro transformaci hostitelských buněk, které pak produkují hybridní proteiny. Transformované hostitelské buňky se mohou kultivovat v buněčném kultivačním systému pro in vitro produkci hybridního proteinu. Hostitelské buňky mohou vylučovat hybridní protein do buněčného kultivačního média, ze kterého se může protein izolovat. Hostitelské buňky mohou také hybridní protein zadržovat uvnitř svých buněčných stěn a hybridní protein se pak izoluje z hostitelských buněk.

Hostitelské buňky mohou být buňky získané ze savčích buněk, jako jsou fibroblasty, keratinocyty, hematopoietické buňky, hepatocyty nebo myoblasty, které mohou být transformovány in vitro expresivním vektorovým systémem nesoucím nukleovou kyselinu podle vynálezu a mohou být znovu implantovány do savce. Hybridní proteiny, které jsou kódované nukleovou kyselinou se budou v těchto buňkách syntetizovat in vivo a budou vykazovat požadovanou biologickou aktivitu u savce.

V jednom provedení vynálezu uvedený savec je člověk trpící hemofílií, hybridním proteinem je faktor VIII dB695HCII, který vykazuje silnější aktivační vlastnosti.

Nukleová kyselina kódující hybridní proteiny podle vynálezu se může také použít pro vytvoření transgenních zvířat, které exprimují hybridní proteiny in vivo. V jednom provedení vynálezu transgenní zvířata mohou exprimovat hybridní proteiny v endogenních žlázách, například v prsních žlázách, které sekretují hybridní proteiny. V případě prsních žláz se hybridní proteiny vylučují do mléka zvířat, z kterého se mohou hybridní proteiny připravovat. Použitelnými zvířaty mohou být myši, králíci, telata, koně, prasata, kozy, ovce nebo jiná použitelná zvířata.

Expresivní vektor obsahující nukleovou kyselinu, která kóduje libovolný hybridní protein podle vynálezu se může dále aplikovat savci bez předchozí in vitro transformace do hostitelských buněk. Praktické informace pro tento druh genové terapie se uvádí v několika publikacích, jako jsou WO 90/11092 a WO 94/28151. Expresivní vektor obsahující nukleovou kyselinu je smíchán s vhodným nosičem, například roztok fyziologického pufru, a zavádí se injekcí do orgánu, přednostně do skeletového svalu, kůže nebo jater savce. Savec je přednostně člověk, s výhodou člověk s genovou poruchou, nejvýhodnější je člověk trpící poruchou srážení krve.

V jednom provedení vynálezu savec je člověk trpící hemofílií a nukleová kyselina, která je obsažena v expresivním vektoru, kóduje faktor VIII dB695-HCII.

Vynález poskytuje způsob produkce protilátek, které vážou hybridní proteiny podle vynálezu. Protilátky mohou být monoklonální nebo polyklonální. Způsoby produkce monoklonálních nebo polyklonálních protilátek jsou v oboru dobře známy (Antibodies, a laboratory manual, E. Harlow and D. Lané eds., CSH Laboratory (1988); Yelton et al., Ann. Rev. Biochem. 50: 657-680 (1981)). Protilátky se mohou použít pro určení přítomnosti nebo absence krevního proteinu podle vynálezu nebo pro kvantifikaci koncentrace hybridního

proteinu v biologickém vzorku, například v tělní tekutině, uvedené protilátky se mohou vázat na faktor VIII dB695-HCII nebo na faktor VIII dB695-HIR a mohou se použít pro určení přítomnosti nebo nepřítomnosti faktoru VIII dB695-HCII nebo faktoru VIII dB695-HIR nebo pro kvantifikaci koncentrace faktoru VIII dB695-HCII nebo faktoru VIII dB695-HIR v biologickém vzorku, například v tělní tekutině nebo v buněčném médiu.

Vynález dále popisuje diagnostický kit, který obsahuje protilátky, které vážou hybridní proteiny podle vynálezu. Takové kity mohou dále obsahovat instrukce pro použití a jiné vhodné reagenty, přednostně pro detekci protilátek vázaných na jejich substrát. Diagnostický kit může být používán pro detekci přítomnosti hybridního proteinu podle vynálezu v biologickém vzorku, jako je krev, sérum, plazma nabo močovina nebo v buněčném kultivačním médiu. Může se dále používat pro kvantifikaci množství hybridního proteinu podle vynálezu v biologickém vzorku, jako je krev, sérum, plazma nebo močovina nebo v buněnčném kultivačním médiu.

Vynález popisuje farmaceutické kompozice, které zahrnují hybridní proteiny na farmaceuticky přijatelném nosiči. Farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnují vodní roztoky, netoxické exipienty, sole, konzervační činidla, pufry a podobně, jak se popisuje v publikaci Remingtonš pharmaceutical sciences, 15^th Ed. Easton: Mack Publishing Co. pp 1405-1412 and 1461-1487 (1975); The National Formulary XIV., 14 th Ed. Washington: Američan Pharmaceutical Association (1975). Příklady nevodných rozpouštědel jsou propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinný olej a injektovatelné organické estery, jako je ethyloleát. Vodné nosiče zahrnují vodu, roztoky alkohol/voda, fyziologické roztoky, parenterální nástroje, jako jsou chlorid sodný, Ringerova dextróza atd. Intravenózní nástroje zahrnují kapalinu a nutriční doplňky. Konzervační činidla zahrnují antimikrobiotika, antioxidanty, chelatační činidla a inertní plyny. Hodnota pH a přesná koncentrace různých komponentů vazebné kompozice jsou upraveny podle praktických znalostí odborníka (Goodman and Gilman^zs The Pharmacological Basis For Therapeutics (7^th ed.). Farmaceutické kompozice mohou zahrnovat polynukleotidy kódující hybridní proteiny nebo transformovanou buňku obsahující tyto polynukleotidy, oba tyto způsoby se obvykle používají v kontextu genové terapie.

Různé farmaceutické kompozice podle vynálezu se mohou použít pro léčbu pacientů. Tyto kompozice zahrnují nukleové kyseliny kódující hybridní proteiny a transformované savčí buňky, které jsou schopny exprimovat hybridní proteiny in vivo, stejně jako samotné hybridní proteiny. Termín léčba ve svých různých gramatických formách ve vztahu k vynálezu znamená prevenci, léčení, reverzi, oslabení, zmírnění, minimalizaci, potlačení nebo zastavení škodlivých působení fáze onemocnění nebo progresi nebo jiný typ abnormálního stavu.

Pacienti trpící stálými nebo dočasnými poruchami koagulace krve se mohou léčit hybridními proteiny odvozenými od vhodných prokoagulačních proteinů. Například pacienti trpící hemofilií by se měli léčit hybridními proteiny, které jsou odvozeny od faktoru VIII nebo od mutantů faktoru VIII, jako je faktor VIII dB695-HCII, faktor VIII dB695-HIR nebo jejich libovolné mutanty.

Látky, které zahrnují hybridní proteiny, nukleové kyseliny a transformované buňky, jak je popisuje vynález v různých kontextech in vivo a in vitro. Tyto látky se mohou používat jako aktivní komponent farmaceutických kompozic pro léčbu pacientů, kteří vykazují nedostatečnost srážení krve, upřednostňuje se hemofílie, nejvýhodnější se jeví hemofílie

A. Farmaceutickým přípravkem se zde míní libovolný přípravek, který se aplikuje zvířatům.

V jiných provedeních vynálezu, kde uvedenou látkou je nukleová kyselina nebo transformovaná buňka, hybridní proteiny se syntetizují in vivo. Všechny informace nutné pro syntézu in vivo nese nukleová kyselina nebo transformovaná buňka. Například jedinec, který podstoupí genovou terapii bude mít hybridní protein zavedený do krevního oběhu, kde pak protein může zmírnit symptomy spojené s nedostatečností srážení krve, jako je hemofílie.

Při přípravě farmaceutické kompozice jsou látky obecně smíchány s parenterálně přijatelnými nástroji nebo jinými vhodnými nosiči s ohledem na postupy, které jsou známy v oboru. Farmaceutická kompozice, kde aktivní látkou je hybridní protein nebo kde nukleová kyselina kóduje takový protein, může být připravena jako sterilní lyofilizovaný přípravek látky, která může být později naředěna přidáním sterilního roztoku, upřednostňuje se, aby jedním z nich měl stejný osmotický tlak jako krev recipienta. V případě, že aktivní látkou je transformovaná buňka, látka je smíchána s přijatelným izotonickým roztokem a je-li to nezbytné, s dalšími parenterálně akceptovanými nástroji nebo jinými vhodnými nosiči s ohledem Farmaceutická kompozice j ednotkové zatavených hybridních proteinů, dávce nebo ampulích proteinů může být které jsou vhodné pro na postupy známé v oboru, se může vyskytovat v kontejnerech v ve vícenásobné dávce, například v nebo lahvičkách. Použití založeno na použití léčbu nedostatečnosti těchto známých srážení krve.

V případě, že hybridní protein má modifikovanou prokoagulační aktivitu faktoru VIII, použití aktivní látky je založeno na použití známých přípravků lidského faktoru VIII, jejichž síla je vhodně upravena. Dávka přípravků lidského ·· ···· faktoru VIII, jak se popisuje v předchozím stavu techniky, závisí na povaze, rozsahu a trvání krvácející léze, stejně jako obtížnosti hemofílie. Obecně počáteční dávka se pohybuje mezi 15 až 50 U/kg tělesné váhy. Další aplikace více nebo méně redukovaných dávek následuje v intervalech od 8 hodin do několika dnů. Hybridní proteiny s modifikovanou prokoagulační aktivitou se mohou lišit v účinné dávce ve srovnání s faktorem VIII divokého typu. Hybridní proteiny se zvýšenou prokoagulační aktivitou faktoru VIII se mohou použít ve srovnání s faktorem VIII divokého typu v redukovaných dávkách, počáteční dávka se pohybuje mezi 1 a 100 U/kg, přednostně mezi 1 a 50U/kg tělesné váhy. Navíc doba mezi jednotlivým podáním se může prodloužit. Redukce dávky a prodloužení doby mezi intervaly aplikace zvažuje individuálně lékař.

Látka se aplikuje in vivo , například injekcí, intravenózně, peritoneálně, do kůže, podkožně nebo jinou vhodnou cestou nebo způsobem.

K popisu aktivity faktoru VIII se používají data ze dvou různých testovacích systémů. Jednostupňový srážecí test měří čas srážení na základě účinku přidání faktoru VIII do plamy, která neobsahuje uvedený faktor VIII. Tento testovací systém reprezentuje in vitro ekvivalent in vivo srážení krve. Data získaná z tohoto testu závisí na schopnosti faktoru VIII, aby byl aktivován trombinem. Tato schopnost molekuly faktoru VIII být aktivován trombinem přímo ovlivňuje měřený čas srážení. Tím déle trvá aktivace faktoru VIII, tím déle se měří čas srážení. V tomto dokumentu se pak aktivita faktoru VIII definuje jako měření Jednostupňovým srážecím testem jako prokoagulační aktivita.

Na rozdíl od Jednostupňoveho srážecího testu

Potahovacím chromogenním testem (Coatest chromogenní test) se měří jedna specifická enzymatická funkce downstream

4444 • ·

od faktoru VIII v kaskádě srážení krve, což je aktivita faktoru Xa. Faktor Vlila, kterým je aktivovaný faktor VIII, působí jako kofaktor při aktivaci faktoru X faktorem IXa. Protože aktivita faktoru Xa je přímo závislá na kofaktorové aktivitě faktoru Vlila, kofaktorová aktivita faktoru VIII znamená množství faktoru VIII ve vzorku.

Přehled obrázků na výkrese

Obrázek č. 1 je schéma reprezentující faktor VIII a heparinový kofaktor II. Oblasti faktoru VIII (A1-A2-B-A3-C1C2) jsou smíchány s kyselými oblastmi v pozicích aminokyselin Met³³⁷ -Argl³⁷² , Ser⁷¹⁰-Arg⁷⁴⁰ a Glu¹⁶⁴⁹ -Arg¹⁶⁸⁹ lidského faktoru

VIII. Místa štěpení trombinu jsou označena šipkami. Podobně kyselá oblast heparinového kofaktoru II, což je inhibitor trombinu se nachází mezi aminokyselinovými zbytky 51 a 81. Reaktivní místo heparinového kofaktoru II, Leu⁴⁴⁴-Ser⁴⁴⁵označené vertikální přímkou (LS). V nižší sekci schématu jsou uvedeny aminokyselinové sekvence oblasti Val⁷⁰⁸ až Ser⁷⁴⁶lidského faktoru VIII a odpovídající oblasti faktoru VIII dB695-HCII. Pod schématem vyšší aminokyselinová sekvence ukazuje oblast Val⁷⁰⁸ až Ser⁷⁴⁶ lidského faktoru VIII (FVIII), který obsahuje kyselou oblast (Ser⁷¹⁰ až Arg⁷⁴⁰ ) a místo štěpení pro trombinv pozici Arg⁷⁴⁰. Tři sulfátované tyroziny v aminokyselinových pozicích 718, 719 a 723 jsou označeny hvězdičkami. Nižší sekvence ukazuje odpovídající oblast faktoru VIII dB695-HCII (FVIII-HCII). Aminokyselinové zbytky odvozené z oblasti A2 lidského faktoru VIII jsou podtrženy. Sulfatované tyrozinové zbytky jsou označeny hvězdičkami.

Obrázek č. 2 je schématický diagram plazmidu pCLB-dB695HCII.Nukleotidová sekvence kódující faktor VIII dB695-HCII se začlenil do plazmidu pBPV (Pharmacia LKB, Sweden) a je řízen promotorem metallotioneinu (MT) a zesilovačem viru myššího sarkomu (MSV). Polyadenylační signál (polyA) je odvozen z • ·

SV40 a beta-laktamázového genu (amp) a počátek replikace (or) je odvozen z plazmidu pML2, který vznikl z pBR322. Přítomnost sekvencí odvozených z hovězího papilomaviru (BPV) umožňuje extrachromozomální replikaci plazmidu. Kyselé oblasti odvozenéod faktoru VIII jsou označeny šrafovaným sloupcem, kyselé oblasti Ile⁵¹ až Ser⁸¹ lidského heparinového kofaktoru II jsou označeny sloupcem s dvojím šrafováním. Deletovaná část B-oblasti faktoru VIII je označena přerušovanou čarou.

Obrázek č. 3 zobrazuje aktivaci faktoru VIII dB695 trombinem. Aktivace acetylovaného faktoru X se uskutečnila v přítomnosti 0,1 nM faktoru IXa, 100 mM fosfolipidů a 0,2 nM faktoru VIII v 100 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, 50 mM Tris (pH7,5) při teplotě 37°C. Reakce se iniciovala přidáním různých koncentrací trombinu: 0,1 nM (°), 0,5 nM (·), 1,0 nM (Δ) a

2,5 nM (). Množství faktoru Xa vytvořené v časovém úseku se monitorovalo odebíráním vzorků do 50 ul stop pufru a přidáním chromogenního substrátu Pefachrome Xa.

Obrázek č. 4 zobrazuje aktivaci faktoru VIII dB695-HCII různými koncentracemi trombinu: 0,1 nM (°) ; 0,2 nM (·) a 0,5 nM ( ^ ) . Experiment proběhl za podmínek jako u obrázku č. 3.

Obrázek č. 5 zobrazuje rychlostní konstanty aktivace faktoru VIII dB695 trombinem a faktoru VIII dB695-HCII. Aktivace faktoru VIII se monitorovala při různých koncentracích trambinu, jak ukazují obrázky č. 3 a 4. Pro každou použitou koncentraci trombinu se určila rychlostní konstanta prvního řádu aktivace faktoru VIII (kx). Ze sklonu závislosti rychlostní konstanty prvního řádu (ki) proti koncentraci trombinu se určily rychlostní konstanty druhého stupně aktivace faktoru VIII dB695 a faktoru VIII dB695-HCII (tabulak č. III). Body korespondují s faktorem VIII dB695 (, O, +) a s faktorem VIII dB695-HCII (A, P) . V případě faktoru VIII dB695 se uvádějí výsledky tří různých • ·

experimentů. V případě faktoru VIII dB695-HCII se uvádějí výsledky dvou různých experimentů. Na ose x je znázorněna koncentrace trombinu (lnM); na ose y je vynesena rychlostní konstanta prvního řádu aktivace (ki), která je odvozena z rovnice 3 (M . min'²) .

Obrázek č. 6 je schéma hybridního faktoru VIII dB695HIR. Oblasti faktoru VIII (A1-A2-B-A3-C1-C2) jsou promýchány s kyselými oblastmi, jak se popisuje na obrázku č. 1. Ve spodní sekci obrázku je zobrazena aminokyselinová sekvence oblasti Val⁷⁰⁸ až Ser⁷⁴⁶ faktoru VIII, která obsahuje kyselou oblast (Ser⁷¹⁰ až Arg⁷⁴⁰ ) a místo štěpení pro trombin v pozici Arg^740, Sulfátované tyroziny v pozici aminokyselin 718, 719 a 723 jsou označeny hvězdičkami. Sekvence FVIII-HIR vykazuje korespondující oblast hybridního proteinu faktoru VIII dB695HIR. Aminokyselinové sekvence odvozené z oblasti A2 faktoru VIII jsou podtrženy. Sulfatovaný tyrozin získaný z kyselé oblasti hirudinu je označen hvězdičkou.

Obrázek č. 7 zobrazuje nukelotidovou sekvenci (SEQ ID NO 1) cDNA faktoru VIII dB695-HIR tak, jak je obsažena ve vektoru pCLB-dB695-HCII a aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 2) kódovanou cDNA (faktor VIII dB695-HCII). Kodón iniciace translace se nachází v nukleotidové pozici 35 a nukleotidová sekvence získaná z heparinového kofaktoru II se nachází v nukleotidové pozici 2225 až 2315. Protein kódovaný touto cDNA je dlouhý 1661 aminokyselin.

Obrázek č. 8 je schéma hybridního faktoru VIII dB695HIR-HCII. Oblasti faktoru VIII (Al-A2-B-A3-C1-C2) s kyselými oblastmi, jak se popisuje na obrázku č. 1. V dolní sekci obrázku je znázorněna aminokyselinová sekvence oblasti Val⁷⁰⁸až Ser⁷⁴⁶ faktoru VIII, která obsahuje kyselou oblast (Ser⁷¹⁰až Arg⁷⁴⁰) a místo štěpení pro trombin v pozici Arg⁷⁴⁰' Sulfátované tyroziny v pozici aminokyselin 718, 719 a 723 jsou označeny hvězdičkami. Sekvence FVIII-HIR vykazuje

9

korespondující oblast hybridního proteinu faktoru VIII dB695HIR-HCII. Pravý box odpovídá aminokyselinové sekvenci odvozené z hirudinu a levý box obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je odvozena z heparinového kofaktoru II. Sulfátované tyroziny jsou označeny hvězdičkou.

Obrázek č. 9 zobrazuje hybridní protein faktoru VIII dB695-HCIIA. Oblasti faktoru VIII (A1-A2-B-A3-C1-C2) a místa štěpení faktoru VIII trombinem jsou označeny podobně jako na obrázku č. 1. Během biosyntézy je faktor VIII proteolyticky štěpen v pozici aminokyseliny Arg¹⁶⁴⁸ , která je označena šipkou. Ve spodní části obrázku je zobrazena sekvence N-konce lehkého řetězce faktoru VIII (obsahující oblasti A3-C1-C2). Zbytek Glu¹⁶⁴⁹ odpovídá N-konci lehkého řetězce faktoru VIII. Místo štěpení trombinem v pozici Arg¹⁶⁸⁹ je označeno šipkou. Dále sulfatované tyroziny v pozici Tyr¹⁶⁶⁴ a Tyr¹⁶⁸⁰ jsou označeny hvězdičkou. Sekvence FVIII-HCIIA vykazuje odpovídající oblast hybridního proteinu FVIII-HCIIA. Aminokyselinová sekvence odvozená z heparinového kofaktoru II je označena rámečkem. Sulfatované tyroziny jsou označeny hvězdičkou.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Modifikace konstrikce pCLB-BPVdB695 cDNA kódující faktor VIII dB695 se klonovala do plazmidu pBPV (pharmacia-KLB, Uppsala, Sweden) za vniku plazmidu pCLBBPVdB695. Plazmid pCLB-BPVdB695 se modifikoval následovně: syntetický, dvouřetězcový oligonukleotidový linker (SEQ ID No 3: sense primer: 5'TCGACCTCCAGTTGAACATTTGTAGCAAGCCACCATGGAAATAGAGCT-3'; SEQ ID

No 4: antisense primer: 5'CTATTTCCATGGTGGCTTGCTACAAATGTTCAACTGGAGG-3') obsahující část nepřekládané oblasti cDNA faktoru VIII spojené s ·» *·*· • * konzervativní sekvencí pro iniciaci translace se fúzoval s restrikčním místem Sací v pozici 10 cDNA faktoru VIII (první nukleotid translačního iniciačního kodonu odpovídá nukleotidu 1). Výsledkem zavedení tohoto určitého linkeru do cDNA faktoru VIII je je substituce glutaminu kyselinou glutamovou v aminokyselinové pozici -18 (první aminokyselina faktoru VIII za štěpícím místem signální skevence je alanin). 3'konec cDNA faktoru VIII dB695 se modifikoval použitím syntetického dvouřetězcového linkru (sense primer SEQ ID No 5: 5'GGGTCGACCTGCAGGCATGCCTCGAGCCGC-3'; antisense primer SEQ ID No 6: 5'-GGCCGCGGCTCGAGGCATGCCTGCAGGTCGACCCTGCA-3'), který se zavedl do Pstl restrikčního místa v nukleotidové pozici 7066 faktoru VIII. Tato modifikace vede ke zkrácení 3 'nekódující oblasti cDNA faktoru VIII. Oba modifikované 5'a 3''konce se klonovaly do plazmidu pBPV, který se štěpil restrikčními enzymy Xhol a Notl. Výsledný plazmid se nazývá pCLB-dB695 a slouží jako počáteční materiál pro konstrukci modifikovaných proteinů faktoru VIII.

Modifikovaný plazmid pCLB-dB695 se může použít jako templát pro konstrukci hybridů faktoru VIII, které obsahují aminokyselinové sekvence pocházející z donorového proteinu. Sekvence DNA kódující aminokyselinové sekvence pocházející z donorového proteinu se zavedly do oblasti pCLB-dB695 kódující faktor VIII dB695, buď se přičlenily k sekvenci kódující faktor VIII dB695 nebo nahradila její část. Začlenění těchto sekvencí vede ke vzniku hybridních proteinů faktoru VIII s modifikovanou aktivitou, jako je zvýšená prokoagulační aktivita.

Příklad 2: Izolace části lidského heparinového kofaktoru

II z cDNA jater.

Technologie PCR se použila pro izolaci části cDNA heparinového kofaktoru II z cDNA jater. Oligonukleotidové primery používané v PCR obsahují části cDNA faktoru VIII.

• 9

Primery používané při amplifikaci fragmentu cDNA, který kóduje oblast od Ile⁵¹ do Ser⁸¹ heparinového kofaktoru II z celkové cDNA jater jsou: sense primer SEQ ID No 7: 5'~

CTGAAGGTTTCTAGTTGT/ATTCCAGAGGGGGAGGAG-3' (pozice 2173 až 2191 v cDNA faktoru VlII/pozice 208 až 226 v cDNA heparinového kofaktoru II) a antisense primer SEQ ID No 8: 5' GGAGAAGCTTCTTGGTTCAAT/CAGACTGTCGACGATGTC-3'(pozice 2266 až 2287 v cDNA faktoru VlII/pozice 280 až 298 v cDNA heparinového kofaktoru II. Lomítko (/) odděluje sekvence pocházející z faktoru VIII a heparinového kofaktoru VIII).

První nukleotidy cDNA faktoru VIII a cDNA heparinového kofaktoru II odpovídají prvnímu nukleotidu iniciačního kodonu translace dvou proteinů. Podle číslovacího systému, který se zde používá, pozice 2173 až 2191 odpovídají sekvenci, která zahrnuje nukleotidy 2173 až 2190, ale nezahrnuje nukleotid 2191. Stejný systém číslování se používá v celé této přihlášce.

Polymerázová řetězová reakce (PCR) se používala při amplifikaci fragmentu 129 bp velkého, který obsahoval fúzi aminokyselinové sekvence Leu⁷⁰⁶ až Asp⁷¹² (Asp⁷¹² není zahrnuta) faktoru VIII, aminokyselinovou sekvenci Ile az Ser (Ser není zahrnuta)heparinového kofaktoru II a aminokyselinová sekvence Ile⁷³⁷ až Gin⁷⁴⁴ (Gin⁷⁴⁴ není zahrnuta) faktoru VIII. Reakční podmínky jsou: 2 min při teplotě 90°C, 20 min při teplotě 50°C, 3 min při teplotě 72°C,; 37 cyklů 45 vteřin při teplotě 90°C, 90 vteřin při teplotě 50°C, 3 min při teplotě

72°C; 5 min při teplotě 65°C, za přítomnosti 1 mM dNTP, Pfu polymerázového reakčního pufru, 50 pMol sense primeru SEQ ID No 7, 50 pM antisense primeru SEQ ID No 8 a 2,5 U Pfu polymerázy (Stratagen, Cambridge, UK) . Připravila se cDNA z lidských jater jak se popisuje dříve v textu (Leyte et al., J. Biochem. 263: 187-94 (1989)) a použila se jako templát.

Produkt PCR je 129bp velký fragment, který reprezentuje rámcovou fúzi oblasti faktoru VIII a část heparinového kofaktoru II.

Přiklad 3: Fúze sekvence faktoru VIII heparinového kofaktoru II s pCLB-dB695

V předchozím příkladu se popisuje izolace fragmentu cDNA heparinového kofaktoru II za použití oligonukleotidových primerů, které jsou nejméně z části založeny na cDNA faktoru VIII. Za použití těchto specifických primerů část izolované cDNA heparinového kofaktoru II může být začleněna do specifického místa v cDNA faktoru VIII. Za použití modifikací metod popsaných v tomto příkladu se mohou fúzovat s cDNA faktoru VIII i jené cDNA sekvence. Mohou se použít i fúze v odlišných místech, než se uvádí v tomto příkladu. PCR primery, které se používají pro zavedení fúzního místa faktor VlII/heparinový kofaktor II do pCLB-dB695 jsou sense primer SEQ ID No 9: 5'-TCTAGCTTCAGGACTCATTGG-3' (nukleotid 1683 až

1704 faktoru VIII) a antisenseprimer SEQ ID No 10: 5'ATACAACTAGAAACCTTCAG-3' (nukleotid 2173 až 2191 faktoru VIII a nukleotid 208 až 210 heparinového kofaktoru II).

Polymerázová řetězová reakce se používá při amplifikaci fragmentu o velikosti 510 bp, který obsahuje nukleotidy 1683 až 2191 faktoru VIII a nukleotid 208 až 210 heparinového kofaktoru II. Rekační podmínky jsou: 2 min při teplotě 90°C, 20 min při teplotě 50°C, 3 min při teplotě 72°C,; 37 cyklů 45 vteřin při teplotě 90°C, 90 vteřin při teplotě 50°C, 3 min při teplotě 72°C; 5 min při teplotě 65°C, za přítomnosti 1 mM dNTP, Pfu polymerázového reakčního pufru, 50 pMol sense primerů (1683 až 1704) SEQ ID No 9 a 50 pMol antisense primerů (2173 až 2191) SEQ ID No 10 a 2,5 U Pfu polymerázy (Stratagen, Cambridge, UK). Fragment o velikosti 510 bp, stejně jako fragment o velikosti 129 bp popsané v příkladu 2 se izolovaly na agaróze, která taje při nízké teplotě, pak ·· ····· • · · • ·· ♦ · · · * · · ♦ ··· · · • » • ··· • · • ··

následovala fenolová extrakce a precipitace etanolem. Následně se použil jako templát pro PCR 1 ng obou fragmentů a PCR primery SEQ ID No 9 a SEQ ID No 8. Reakční podmínky jsou: 2 min při teplotě 90°C, 20 min při teplotě 50°C, 3 min při teplotě 72°C,; 37 cyklů 45 vteřin při teplotě 90°C, 90 vteřin při teplotě 50°C, 3 min při teplotě 72°C; 5 min při teplotě 65°C, za přítomnosti 1 mM dNTP, Pfu polymerázového reakčního pufru, 50 pMol primeru SEQ ID No 9 a SEQ ID No 8 a 2,5 U Pfu polymerázy (Stratagen, Cambridge, UK) . Výsledný fragment o velikosti 619 bp se trávil restrikčními enzymy BamHI a HindlII, výsledkem je 423 bp velký fragment, kde se zaměnila oblast faktoru VIII od nukleotidu 2191 až do 2266 oblastí od nukleotidu 208 do 298 heparinového kofaktoru II. BamHIHindlII fragment o velikosti 423 bp, který obsahuje sekvenci hybridního faktoru VlII-heparinového kofaktoru II, se použil k záměně odpovídajícího fragmentu pCLB-dB695. Následuje transformace do kmene DH1 E.coli. Na základě restrikční analýzy se vybraly klony obsahující fúzi cDNA faktor VIII dB695-heparinový kofaktor II. Výsledný plazmid se nazval pCLB-dB695-HCII a sekvence fragmentu o velikosti 423 bp, který obsahoval sekvenci získanou z heparinového kofaktoru II se ověřil sekvenováním oligonukleotidu. Celá sekvence cDNA faktoru VIII dB695-HCII a aminokyselinová sekvence, která je touto cDNA kódována je znázorněna na obrázku č. 7.

Příklad 4: Exprese pCLB-dB695 a pCLB-dB695-HCII v buňkách C127

V příkladu 3 se uvádí konstrukce cDNA kódující hybridní protein, jehož aminokyselinové sekvence se získaly z faktoru

VIII a heparinového kofaktoru II. Výsledná cDNA se klonuje do plazmidu pBPV, který se běžně používá k expresi proteinů v eukaryontních buňkách. Uvádí se zde způsoby exprese proteinů kódované pCLB-dB695-HCII a pCLB-dB695 v buňkách C127. Podobně

··	·*	··	»···	4·	• 4
• ·	• ·	•	•	•	* ·	•
•	• ·	• ·	···	• ·		• ·
•	··· 4	» ·	• 4	···	•		•
•		•	•	•	C	•	·*	♦
····	··	··	• ··	··

se používají pro expresi různých cDNA, které kódují hybridní proteiny faktoru VIII, jiné eukaryontní a prokaryontní buňky.

Buňky C127 se udržují v Iscově médiu, které je doplněno 10% fetálním telecím sérem, 100 U/ml penicilinu a 100 mg/ml streptomycinu. Subkonfluentní monovrstvy buněk C127 se transfektovaly způsobem CaPO₄' (Graham et al. Virology 52: 456-67 (1973)). Oba plazmidy pCLB-dB695-HCII (20 gg) stejně jako pCLB-dB695 (20 gg) se kotransfektovaly s pPGKhyg (1 gg; Ten Riele et al., Nátuře 348: 649-51 (1990)). Následuje transfekce a selekce transfektovaných buněk s 200 gg/ml hygromycinu. Izolovaly se jednotlivé klony a pomnožily se v selektivním médiu. Sekrece faktoru VIII se monitorovala měřením schopnosti faktoru VIII plnit funkci kofaktoru pro konverzi faktoru Xa závislou na faktoru IXa, přičemž pro faktor Xa se používá chromogenní substrát (Coatest Faktor VIII, Chromogenix, Molndal, Sweden).

Antigen faktoru VIII se určil použitím monoklonálních protilátek, které se charakterizovaly už dřivé (Lenting et al., J. Biol. Chem. 269: 7150-55 (1994)). Monoklonální protilátky CLB-Cag 12 proti lehkému řetězci faktoru VIII se použily jako pevná fáze, zatímco peroxidázou značené protilátky CLB-Cagll7, také proti lehkému řetězci faktoru VIII se použily pro kvantifikaci množství imobilizovaného faktoru VIII. Jako standard se použila normální plazma shromážděná ze 40 zdravých dárců. Prokoagulační aktivita se určila jednostupňovým srážecím testem za použití plazmy bez faktoru VIII. Před analýzou se upravené médium smíchalo s 1/5 objemu 3,8% roztoku citrátu sodného a před použití v testu srážení se naředilo nejméně 5 krát. Za účelem další analýzy se izolovaly klony buněk, které produkovaly podstatné množství faktoru VIII dB695 nebo faktoru VIII dB695 HCII. Proteiny, které exprimovaly vybrané buněčné klony se analyzovaly shora popsaným způsobem.

• ·	··	··	····	··	··
• ·	• ·	• ·	•	• ·	•	•
•	• ·	• ·	···	• ·		• ·
•	···	• · ·	•	• ···	•	•
•	•	• ·	•	•	•	•
····	··	»·	J··	··		··

V publikaci Mertens et al., Brit. J. Haematol. 85: 13342 (1993), se popisují vlastnosti faktoru VIIIdel(868-1562), který se zde nazývá jako faktor VIII dB695. Jeden klon získaný z buněk transfektovaných pCLB-dB695 (klon 14-6521) a jeden klon získaný z buněk transfektovaných pCLB-dB695-HCII (klon 14-6310) se kultivovaly až do dosažení konfluentnosti a následně se shora uvedeným způsobem určila kofaktorová aktivita, prokoagulační aktivita a množství antigenu faktoru VIII. Data jsou uvedena v tabulce I.

Tabulka I

protein faktoru VIII	kofaktorov á aktivita	prokoagula ční aktivita	antigen faktoru VIII	poměr prokoagula ční/kofakt ořové aktivity
faktor VIII dB695	174+/-10	164+/-32	177+/-33	0,94+/- 0,19
faktor VIII dB695-HCII	157+/-13	267+/-20	174+/-32	1,70+/- 0,18

Prokoagulační aktivita faktoru VIII znamená aktivitu měřenou jednostupňovým srážecím testem, který se vztahuje ke schopnosti faktoru VIII být aktivován, zatímco kofaktorová aktivita faktoru VIII znamená spektrometrický test, který monitoruje tvořeni faktoru Xa. Hladiny antigenů se měřily testem ELISA, který je specifický pro lehký řetězec faktoru VIII. Hodnoty představují průměr (+/- standardní odchylka) pěti různých vzorků pro každý mutant. Prokoagulační aktivita faktoru VIII, chromogenní aktivita a množství antigenu se udávají v mU/ml upraveného média. Získaná data ukazují, že upravené médium získané z klonu 14-6521 (faktor VIII dB695) a klon 14-6310 (faktor VIII dB695-HCII) vykazují podobnou kofaktorovou aktivitu. Dále množství antigenu faktoru VIII bylo podobné u faktoru VIII dB695 a faktoru VIII dB695-HCII. Zkoumání prokoagulačních vlastností obou mutantů faktoru VITI

objevilo prokoagulační aktivitu u faktoru VIII dB695, která byla skoro rovna jeho kofaktorové aktivitě a hladině antigenu. Překvapivě prokoagulační aktivita faktoru VIII dB695-HCII byla 1,7 krát vyšší než aktivita zjištěná testem kofaktorové aktivity a haldinami antigenu. Zvýšená prokoagulační aktivita faktoru VIII dB695-HCII se vysvětluje nižším prahem aktivace, který se z pohledu vědecké literatury neočekával. Faktor VIII db695-HCII se aktivuje při nižším množství trombinu, než jiné známé molekuly s aktivitou faktoru VIII.

Tato schopnost být aktivován při nižším množství trombinu se uvádí v tabulce III (uvedená dále v textu). Faktor VIII dB695-HCII se aktivuje přibližně osmkrát rychleji než faktor VIII dB695. Jestliže se v místě porušení cév objeví libovolné množství trombinu vede to ke zvýšené aktivitě faktoru VIII dB695-HCII, což umožňuje této molekule působit jako prokoagulační látka se zvýšenou účinností ve srovnání s jinými látkami s aktivitou faktoru VIII. Jinými slovy z pohledu srážení krve se faktor VIII dB695-HCII aktivuje daleko dříve. Faktor VIII dB695-HCII se aplikuje pacientům s hemofílií A v daleko menší dávce a v redukované frekvenci ve srovnání s jinými molekulami s aktivitou faktoru VIII. To značně redukuje nebezpečí produkce inhibičních protilátek u pacientů. To dále redukuje náklady na produkci a na použití medikamentů.

Příklad 5: Detekce cDNA faktoru VIII dB695-HCII ve stabilně transfektovaných buňkách C127.

V předcházejících příkladech se popisuje konstrukce, exprese a chraktrizace hybridního proteinu faktoru VIII dB695-HCII. Za účelem ověřit sekvenci hybridního proteinu faktoru VIII dB695-HCII v buňkách C127, které jsou stabilně transfektovány pCLB-dB695-HCII (klon 14-6310), se izolovala z • ·

této buněčné linie DNA a fragment začleněné cDNA faktoru VIII, který obsahuje sekvenci heparinového kofaktoru II. DNA se amplifikovala pomocí PCR za použití následujících oligonukleotidových primerů: sense primer SEQ ID No 11: 5'GTAGATCAAAGAGGAAACCAG-3' (nukleotid 1732 až 1753 faktoru VIII) a antisense primer SEQ ID No 12: 5'GTCCCCACTGTGATGGAGC-3' (nukleotidy 2577 až 2596 faktoru VIII) . Podmínky PCR jsou: 2 min při teplotě 90°C, 5 min při teplotě 50°C, 3 min při teplotě 72°C,; 37 cyklů 45 vteřin při teplotě 90°C, 90 vteřin při teplotě 50°C, 3 min při teplotě 72°C; 5 min při teplotě 65°C, za přítomnosti 1 mM dNTP, Taq polymerázového reakčního pufru, 50 pMol sense primeru a 50 pMolů antisense primeru a 2,5 U Taq polymerázy. Výsledný fragment o velikosti 879 bp se klonoval do vektoru pGEM-T (Promega, Madison, WI) a sekvence inzertu se určila použitím Taq polymerázy (Promega, Madison, WI) . Ověření nukleotidové sekvence amplifíkovaného fragmentu ukázala, že fúzní místo faktoru VlII-heparinový kofaktor II se nachází v buněnčé linii. Při srovnání s nukleotidovou sekvencí DNA faktoru VIII dB695-HCII zobrazené na obrázku č. 7 se nanašly žádné nukleotidové substituce.

Příklad 6: Charakterizace a zpracování izolovaného faktoru VIII dB695-HCII a faktoru VIII dB695

Jak ukazuje příklad 4, hybridní protein faktor VIII dB695-HCII, který je obsažen v upraveném médiu buněk transfektovaných pCLB-dB695-HCII, vykazuje zvýšenou prokoagulační aktivitu ve srovnání s faktorem VIII dB695. Další charakterizace faktoru VIII dB695-HCII se uskutečnila následující izolací z upraveného média transfektovaných buněk. Izolace se uskutečnila imunoafinitní chromatografii, jak se popisuje v publikaci Mertens et al., Brit. J. Haematol. 85: 133-42 (1993). Stanovily se první prokoagulační • · a kofaktorové aktivity izolovaného faktoru VIII dB695-HCII a porovnaly se s faktorem VIII dB695. Výsledky jsou uvedeny dále v textu v tabulce II.

Tabulka 2;

Faktor VIII	Prokoagulační aktivita (U/ml; n=3)	Kofaktorová aktivita (U/ml; n=4)
Faktor VIII dB695HCII	185+/-14	105+/-35
Faktor VIII dB695	95+/-38	96+/-25

Kofaktorová aktivita a prokoagulační aktivita se stanovila dříve popsaným způsobem (Mertens et al., Brit. J. Haematol. 85: 133-142 (1993)). Hodnoty představují průměr (+/- standardní odchylka) různých vzorků (n= počet různých vzorků). Data v tabulce II ukazují, že poměr prokoagulační aktivity a kofaktorové aktivity je 1,8 pro faktor VIII dB695HCII a 1,0 u faktoru VIII dB695. V souladu s daty získanými v upraveném médiu transfektovaných buněk izolovaný faktor VIII dB695-HCII vykazuje zvýšenou prokoagulační aktivitu.

Dále se porovnala podjednotková kompozice faktoru VIII dB695-HCII s podjednotkovou kompozicí izolovaného faktoru VIII dB695. Oba proteiny se podrobily gelové elektroforéze s 7,5% SDS-PAGE, pak se provedl imunoblot s monoklonálními a polyklonálními protilátkami proti různým oblastem faktoru VIII. Použily se protilátky: CLB-C_Ag 69; MAS530; pA2 (na základě afinity izolované protilátky proti peptidu, který odpovídá aminokyselinové sekvenci Ile⁴⁸⁰ až Leu⁴⁹⁸ faktoru VIII) a CLB-C_Ag 9. Data ukazují, že faktor VIII dB695-HCII je zpracován do lehkého a těžkého řetězce a jeho subjednotková kompozice je stejná jako subjednotková kompozice faktoru VIII dB695.

Monoklonální protilátky CLB-CAg69 proti aminokyselinové sekvenci Lys¹⁶⁷³ až Arg¹⁶⁸⁹ na N-konci lehkého řetězce faktoru • · • · • ·

VIII, ukázaly přítomnost dvou pruhů, které odpovídají lehkému řetězci faktoru VIII a respektive jednotlivému nezpracovanému řetězci faktoru VIII.

Monoklonální protilátky MAS530 (Sera-Lab, Sussex,

England) určené proti těžkému řetězci faktoru

VIII, rozeznávají jeden řetězec faktoru

VIII dB695-HCII a navíc reaguj í s několika jinýmy pruhy, které reprezentují těžký řetězec oblasti faktoru faktoru VIII s variabilními oblastmi připojené B faktoru VIII. Imunoblotační analýza izolovaného

VIII dB695 uskutečněná stejnými monoklonálními protilátkami vede k identickým výsledkům.

Zjistilo se, že polyklonální protilátky izolované na základě afinity určené proti syntetickému peptidu, který odpovídá oblasti Ile⁴⁸⁰ až Leu⁴⁹⁸ faktoru VIII reagují stejným způsobem jako monoklonální protilátky MAS530. Monoklonální protilátky CLB-CAg 9 jsou určené proti peptidu Asp⁷²¹ až Asn⁷³⁵, tato sekvence není přítomna ve faktoru VIII dB695HCII. Jak se očekávalo faktor VIII dB695-HCII nereaguje s těmito uvedenými protilátkami. Naopak izolovaný faktor VIII dB695 reaguje s monoklonálními protilátkami CLB-CAg 9 a získaný patern je identický s paternem, který se získal s monoklonálními protilátkami MAS530, které jsou určené proti těžkému řetězci faktoru VIII.

Tyto výsledky ukazují, že proteolytické zpracování a podjednotková kompozice faktoru VIII dB695-HCII je stejné jako u faktoru VIII dB695. Rozdíl mezi faktorem VIII dB695 a faktorem VIII dB695-HCII je však překvapivě zvýšená prokoagulační aktivita hybridního proteinu. Proto tyto data naznačují, že faktor VIII dB695-HCII se může používat jako zdokonalené činidlo k léčbě kongenitální poruchy srážení krve u hemofílie A.

Příklad 7: Aktivace faktoru VIII dB695-HCII a faktoru VIII dB695 trombinem.

Příklady 4 a 6 ukazují, že faktor VIII dB695-HCII vykazuje zvýšenou prokoagulační aktivitu ve srovnání s faktorem VIII dB695. Stanovení rychlostní konstanty druhého řádu štěpení trombinem u faktoru VIII dB695-HCII a faktoru VIII dB695, jak zobrazuje obrázek č. 5, dále ukazuje, že ve srovnání s faktorem VIII dB695 je pro aktivaci faktoru VIII dB695-HCII potřeba méně trombinu.

Aktivace faktoru VIII se určila použitím následujících činidel. Fosfolipidové kapsule se připravily z ekvimolárních koncentrací L-a-fosfatidylcholinu (vaječný bílek) a L-afosfatidylserin (lidský mozek) (Sigma, St. Louis, USA). Faktor IXa, trombin, faktor X a faktor Xa se připravily jak bylo popsáno dříve a koncentrace různých proteinových přípravků se stanovila titrací s aktivními centry (Mertens et al., J. Biochem. 223: 599-605 (1984)). Proteiny používané v této studii, jak ukázala SDS-elektroforéza na polyakrylamidovém gelu, byly homogenní. Faktor X se acetyloval za použití dříve popsaného postupu (Neuenschwander et al., Analyt. Biochem. 184: 347-52 (1990)).

Monitorovala se aktivace faktoru VIII dB695 a faktoru VIII dB695-HCII trombinem: fosfolipidové měchýřky (konečná koncentrace 100 mM) se nechaly agregovat po dobu 10 min při teplotě 37 °C v pufru, který obsahuje Ca²⁺ (50mM Tris HC1 pH=7,5, 150 mM NaCl a lOmM Ca Cl₂) · Po té se přidá 0,1 nM faktor IXa, 0,2 mM acetylovaný faktor Xa a 0,5 U/ml faktor VIII. Aktivace faktoru VIII se iniciovala přidáním různých koncentrací trombinu. Množství faktoru Xa vytvořené v čase v reakční směsi se odhadlo rozdělením reakční směsi po 50 ml do stop pufru, který obsahuje 50 mM Tris-HCl pH=7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50U/ml hirudinu, 100 mg/ml vaječného • · • · • · • · · · • · • · · • · ♦ • · · oalbuminu a syntetický substrát Pefachrome Xa (Pentapharm AG, Basel, Switzerland).

Konverze substrátu Pefachrome Xa se monitorovala při 405 nm faktor Xa titrovaný s aktivními centry se použil jako standard. Na obrázku č. 3 je zobrazena aktivace faktoru VIII dB695 pro několik koncentrací trombinu. Množství vytvořeného faktoru Xa se vztahuje ke koncentraci trombinu používaného

pro aktivaci. Za	použití	následující sady	reakcí	se mohou
adekvátně získat	rovnice,	které popisují	aktivaci	faktoru
VIII:
Krok 1:
FVIII	trombin	FVIIIa

Krok 2:

k₂ k₄

FVIIIa-FIXa + FX -4 FVIIIa-FIXa-FX -> FVIIIa-FIXa + Xa «— k₃ kde ki až k₄ jsou rychlostní konstanty různých kroků reakce. Krokem 1 je aktivace faktoru VIII trombinem. Komplex faktor VlIIa-faktor IXa účinně katalyzuje konverzi faktoru X na faktor Xa závislou na fosfolipidech.

V uskutečněných experimentech se fosfolipidy používaly ve vysokých koncentracích. Neuvažuje se, že interakce různých komponentů s fosfolipidy je omezena rychlostí. Konverze faktoru X na jeho aktivní formu (krok 2) se analyzuje podle

standardních Michaelis-Menton kinetik, jejichž výsledkem jsou následující rovnice:

d[FXa] = K₄[FVIIIa - FIXa - FX]_t [FX]_t (1) dt Km + [FX]_t

Kde K_m = (k₃ + k₄)/k₂ a [FX]_t = [FX]₀. Koncentrace faktoru VIII roste v čase od [FVIIIJo (=0) na [FVIII_a]_t. Při použití vhodných koncentrací aktivátoru během iniciační fáze tvoření faktoru Xa, aktivace faktoru VIII se může analyzovat podle metody počátečních rychlostí aktivace.

[FVIIIAjt = ki [FVIIlV

(2)

Kombinace rovnic (1) a (2) a následná integrace mezi hodnotami t=0 a t=t vede k následující expresi tvoření faktoru Xa v čase:

[FXaJt = k₄ki [FVIIlJo [FX]_o t² + [FXa]₀ (3)

Km + [FX]o

Rovnice (3) je velmi podobná obvyklému řešení komplexního kinetického systému, který obsahuje dvě spojené enzymatické reakční kroky (Chibber et al., Biochemistry 24: 3429-34 (1985)). Hodnoty čísel parametrů v rovnici (3) jsou známy. Konstanty aktivační rychlosti faktoru X k4 v přítomnosti faktoru dB695 a faktoru VIII dB695 jsou 11,5+/-5,2 min’¹respektive 17,2+/-5,5 min’¹. Hodnoty těchto konstant lze odhadnout experimentálně z rychlosti tvoření faktoru Xa za stálých podmínek. Michaelisova konstanta (Km) je 200 nM v případě lidských koagulačních faktorů faktor VIII a faktor ··

IXa (Jesty, Haemostasis 21: 208-18 (1991) a [FVIII]o=O.2 nM a [FX]o= 0,2 mM. Získaná data se dosayují do rovnice 3 za použití Enzfitterova software (Elsevier, The Netherlands). Konstantu prvního řádu je možné získat pro každou koncentraci trombinu používanou při aktivaci faktoru VIII dB695. Směrnice křivky závislosti koncentrace trombinu používané při aktivaci faktoru VIII dB695 ke konstantě prvního řádu (kl) je konstanta aktivace druhého řádu (obrázek č. 5). V tabulce III se uvádí pro oba faktory, faktor VIII dB695 a faktor VIII dB695-HCLL, hodnoty konstanty aktivace druhého řádu. Hodnoty konstanty aktivace druhého řádu ukazují, že faktor VIII dB695-HCII se aktivoval trombinem osmkrát rychleji ve srovnání s faktorem VIII dB695.

Tabulka III

protein faktor VIII	konstanta rychlosti druhého řádu (M¹s¹ x 10’⁶)
faktor VIII získaný z plazmy	2,1+/-0,2
faktor VIII dB695	3,0+/-0,8
faktor VIII dB695-HCII	23,2+/-0,5

Konstanta rychlosti aktivace druhého řádu obou faktorů, faktor VIII dB695 a faktoru VIII dB695-HCII, trombinem se stanovila ze směrnice křivky zobrazené na obrázku č. 5. Uvedené hodnoty jsou v jednotkách M^s’¹ +/- S.E..

Příklad 8: Konstrukce hybridního proteinu faktor VlII-hirudin Tento příklad popisuje konstrukci hybridního proteinu, ve kterém aminokyselinová sekvence Tyr⁷¹⁸ až Ser⁷³² lidského faktoru VIII je zaměněna za aminokyselinovou sekvenci Phe⁵⁶až Gin⁶⁵ hirudinu. Pro amplifikaci fragmentu o velikosti 371 bp se používaly sense primer SEQ ID No 13 (5^ZAGGAAATTCCAGAGGAATATTTGCAGA GTAAAAACAATGCCATT-3') a antisense primer SEQ ID NO 12 (5'-GTCCCCACT GTGATGGAGC-3'). Část primeru se sekvencí SEQ ID NO 13, která odpovídá hirudinu se

zakládá na aminokyselinové sekvenci hirudinu. Za účelem sestavení putativní hirudinové cDNA se vybraly vhodné kodony kódující různé aminokyseliny. Část primerů používaných při konstrukci hybridu faktor VlII-hirudin se zakládá na putativní sekvenci cDNA hirudinu. Při amplifikaci fragmentu o velikosti

502 bp se použily sense primer SEQ

ID NO 11 a antisense primer

SEQ

ID NO (5^ZAATATTCCTCTGGAATTTCCTCGAAATCACCAGTGTTCTTGTC-3').

Reakční podmínky amplifikace jsou: 2 min při teplotě 90°C, 20 min při teplotě 50°C, 3 min při teplotě 72°C,; 37 cyklů 45 vteřin při teplotě 90°C, 90 vteřin při teplotě 50°C, 3 min při teplotě 72°C; 5 min při teplotě 65°C, za přítomnosti 1 mM dNTP, Pfupolymerázového reakčního pufru, 50 pMol sense primeru a 50 pMolů antisense primeru a 2,5 U Pfu polymerázy (Stratagene,

Cambridge, UK). Oba fragmenty o velikosti 502 bp a 371 bp se čistily na agaróze s nízkou teplotou tání, po níž následuje extrakce fenolem a precipitace etanolem. 1 ng každého fragmentu se používal jako templát při polymerázové řetězové reakci, kde se používaly primery SEQ ID NO 11 (5'GTAGATCAAAGAGGAAACCAG-3') a SEQ ID NO 12. Reakční podmínky byly podobné těm, které jsou uvedeny shora v textu. Výsledný fragment o velikosti 852 bp se štěpil restrikčními endonukleázami BamHI a HindlII, výsledkem čehož byl fragment o velikosti 396 bp, který se použil k záměně odpovídajícího fragmentu pCLB-dB695. Vybraly se klony obsahující cDNA kódující hybridní protein faktor VlII-hirudin a výsledný plazmid se označil pCLB-dB695-HIR. Ověřila se sekvence fragmentu o velikosti 396 bp, který obsahuje část putativní cDNA hirudinu. Na obrázku č. 6 je uvedeno schéma reprezentující výsledný hybridní protein faktor VIII dB695HIR, který je kódován plazmidem pCLB-dB695-HIR.

Příklad 9: Konstrukce hybridního proteinu, který obsahuje kyselou aminokyselinovou oblast odvozenou od kyselých oblastí heparinového kofaktoru II a hirudinu.

Tento příklad popisuje protein faktor VIII, kde část kyselé oblasti Asp⁷¹² až Ser⁷³² (Ser⁷³² není zahrnuto) se zaměnila za kyselou aminokyselinovou sekvenci odvozenou z kyselých oblastí heparinového kofaktoru II a hirudinu. Při amplifikaci fragmentu o přibližné velikosti 400 bp, kde se použil jako templát plazmid pCLB-dB695-HIR, který se popisuje v příkladu 8, se použily sense primer SEQ ID NO 15 (5'CTATCTGGACTTCGAGGAAATTCCAGAGGAA-3') a antisense primer SEQ ID NO 12. Prvních 10 nukleotidů primeru SEQ ID NO 15 se odvodilo s nukleotidové sekvence heparinového kofaktoru II (nukleotidy 234 až 244, přičemž nukleotid 244 heparinového kofaktoru není zahrnut) . Posledních 21 nukleotidů primeru SEQ ID NO 15 se odvodilo ze sekvence putativní cDNA hirudinu, která se popisuje v příkladu 8. Při amplifikaci fragmentu o přibližné velikosti 510 bp, kde se jako templát použije plazmid pCLBdB695-HCII, jenž se popisuje v příkladu 3, se použily antisense primer SEQ ID NO 16 (5^XATTTTCCTCGAAGTCCAGATAGTCGTCGTCCTC-3') a primer SEQ ID NO 11. Prvních dvanáct nukleotidů se odvodilo z putativní sekvence hirudinu, která se popisuje v příkladu 8 a posledních 21 nukleotidů primeru o sekvenci SEQ ID NO 16 se odvodily z nukleotidové sekvence heparinového kofaktoru II (nukleotidy 223 až 244, přičemž nukleotid 244 heparinového kofaktoru II není zahrnut). Rekační podmínky amplifikace pomocí polymerázové řetězové reakce jsou podobné jako ty popsané v příkladu 8. Amplifikované fragmenty se izolovaly na agaróze tající při nízké teplotě. 1 ng obou izolovaných fragmentů se použil jako templát při polymerázové řetězové reakci, kde se dále používají primery SEQ ID NO 11 a SEQ ID NO 12. Výsledný fragment o přibližné velikosti 880 bp se štěpil restrikčními

endonukleázami BamHI a HindlII a použil se při záměně odpovídajícího fragmentu pCLB-dB695. Vybraly se plazmidy obsahující cDNA kódující hybrid faktor VIII heparinového kofaktoru II-hirudin a ověřila se nukleotidová sekvence konstrukce. Na obrázku č. 8 se uvádí schéma výsledného hybridního proteinu faktor VIII dB695-HIR-HCII, který je kódován plazmidem pCLB-dB695-HIR-HCII.

Příklad 10: Konstrukce hybridu faktor VlII-heparinový kofaktor II, kde část aminokyselinových zbytků, které se nacházejí mezi Arg¹⁶⁴⁸ a Arg¹⁶⁸⁹ je nahrazena kyselou oblastí odvozenou od heparinového kofaktoru II.

V tomto příkladu se popisuje konstrukce hybridu faktor VlII-heparinový kofaktor II, kde aminokyselinová sekvence Leu¹⁶⁵⁵-Gln¹⁶⁸⁵ faktoru VII (Ser¹⁶⁸⁵ není zahrnuta) je zaměněna aminokyselinovou sekvencí Ile⁵¹ až Ser⁸¹ (Ser⁸¹ není zahrnuta) heparinového kofaktoru II. Při amplifikaci fragmentu DNA, kde se jako templát použil pCLB-dB695-HCII, se používaly sense primer SEQ ID NO 17 (5'-GAAATAACTCGTACTACTATTCCAGAGGGGGAGGAG3) a antisense primer SEQ ID NO 18 (5^XGCTGCGGGGGCTCTGATTCAGACTGTCGACGATGTC-3'' ) . Prvních 18 nukleotidů primeru SEQ ID NO 17 odpovídá nukleotidům 5002 až 5020 faktoru VIII (nukleotid 5020 není zahrnut) a posledních 18 nukleotidů tohoto primeru odpovídá nukleotidům 208 až 226 (nukleotid 226 není zahrnut) heparinového kofaktoru II. Prvních 18 nukleotidů primeru SEQ ID NO 18 odpovídá nukleotidům 5110 až 5128 faktoru VIII a posledních 18 nukleotidů tohoto primeru odpovídá nukleotidům 280 až 298 heparinového kofaktoru II.

Při amplifikaci fragmentu DNA, kde se jako templát použil pCLB-dB695, se použily antisense primer SEQ ID NO 19 (δ'-CTCCTCCCCCTCTGGAATAGTAGTACGAGTTATTTC-3') a sense primer

SEQ ID NO 11. Prvních 18 nukleotidů primeru SEQ ID NO 19 se • ·

odvodilo z nukleotidů 208 až 226 (nukleotid 226 není zahrnut) heparinového kofaktoru II. Posledních 18 nukleotidů primeru SEQ ID NO 19 je odvozeno z nukleotidové sekvence 5002 až 5020 (nukleotid 5020 není zahrnut) faktoru VIII. Izolovaly se fragmenty DNA vznikající při amplifikaci s párem primerů SEQ ID NO 17/18 a SEQ ID NO 11/19. 1 ng obou fragmentů se použil jako templát v následné PCR za využití primerů SEQ ID NO 11 a 18.

Při amplifikaci fragmentu DNA, kde jako templát slouží pCLB-dB695, se použily sense primer SEQ ID NO 20 (5^ZGACATCGTCGACAGTCTGAATCAGAGCCCCCGCAGC-3'). Prvních 18 nukleotidů primeru SEQ ID NO 20 odpovídá nukleotidům 280 až 298 (nukleotid 2989 není zahrnut) heparinového kofaktoru II. Posledních 18 nukleotidů primeru SEQ ID NO 20 odpovídá nukleotidům 6560 až 6581 (nukleotid 6581 není zahrnut) faktoru VIII. Primer SEQ ID NO 21 odpovídá nukleotidům 6560 až 6581 (nukleotid 6581 není zahrnut) faktoru VIII. Izolovaly se fragmenty DNA vznikající při amplifikaci s párem primerů SEQ ID NO 11/18 a SEQ ID NO 20/21 a použily se v reakci PCR, kde se využívají primery SEQ ID NO 21 a 11. Výsledný fragment DNA se štěpil restrikázou KpnI (pozice nukleotidu 1811 faktoru VIII) a Apal (pozice nukleotidu 6194 faktoru VIII) a využil se k záměně odpovídajícího fragmentu v pCLB-dB695. Výsledná konstrukce nazývaná pCLB-dB695-HCIIA kóduje hybridní protein faktoru VIII, kde aminokyselinová sekvence Leu¹⁶⁵⁵ až Gin¹⁶⁸⁵ faktoru VIII (Gin¹⁶⁸⁵ není zahrnuta) je zaměněna aminokyselinovou sekvencí Ile⁵¹ až Ser⁸¹ (Ser⁸¹ není zahrnuta) heparinového kofaktoru II (obrázek č. 9).

····

SEKVENČNÍ PROTOKOL (2) Údaje k SEQ ID NO: 1 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 5035 párů baží (B) typ: nukleotidová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA (iii) Znaky:

(A) název/klíč: CDS (B) pozice: 35..5017 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

TCGACCTCCA GTTGAACATT TGTAGCAAGC CACC ATG GAA ATA GAG CTC TCC 52

Met Glu Ile Glu Leu Ser

ACC TGC

TTC Phe

TTT Phe 10

CTG Leu

TGC CTT

TTG CGA

TTC Phe

1 TGC Cys

TTT AGT

GCC Ala 20

5 ACC AGA Thr Arg

100

Thr

Cys

Leu

Arg 15

Phe

Ser

AGA

TAC

CTG

GGT

GCA

GTG

GAA

CTG

TCA

TGG

GAC

TAT

ATG

CAA

AGT

148

Arg

Tyr

Leu

Gly

Ala

Val

Glu

Leu

Ser

Trp

Asp

Tyr

Met

Gin

Ser

25

30

35

GAT

CTC

GGT

GAG

CTG

CCT

GTG

GAC

GCA

AGA

TTT

CCT

AGA

GTG

CCA

196

Asp

Leu

Gly

Glu

Leu

Pro

Val

Asp

Ala

Arg

Phe

Pro

Arg

Val

Pro

40

45

50

AAA Lys 55

TCT TTT

CCA TTC AAC ACC -TCA GTC

GTG TAC AAA

AAG Lys

ACT Thr

CTG Leu

TTT Phe 70

244

Ser

Phe

Pro Phe

Asn 60

Thr Ser Val

Val

Tyr 65

Lys

GTA

GAA

TTC

ACG

GAT

CAC

CTT

TTC

AAC

ATC

GCT

AAG

CCA

AGG

CCA

CCC

292

Val

Glu

Phe

Thr

Asp

His

Leu

Phe

Asn

Ile

Ala

Lys

Pro

Arg

Pro

75

80

85

TGG

ATG

GGT

CTG

CTA

GGT

CCT

ACC

ATC

CAG

GCT

GAG

GTT

TAT

GAT

ACA

340

Trp

Met

Gly

Leu

Gly

Pro

Thr

Ile

Gin

Ala

Glu

Val

Tyr

Asp

Thr

90

95

100

GTG

GTC

ATT

ACA

CTT

AAG

AAC

ATG

GCT

TCC

CAT

CCT

GTC

AGT

CTT

CAT

388

Val

Ile

Thr

Leu

Lys

Asn

Met

Ala

Ser

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

105

110

115

GCT

GTT

GGT

GTA

TCC

TAC

TGG

AAA

GCT

TCT

GAG

GGA

GCT

GAA

TAT

GAT

436

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Tyr

Trp

Lys

Ala

Ser

Glu

Gly

Ala

Glu

Tyr

Asp

120

125

130

GAT

CAG

ACC

AGT

CAA

AGG

GAG

AAA

GAA

GAT

AAA

GTC

TTC

CCT

GGT

484

Asp

Gin

Thr

Ser

Gin

Arg

Glu

Lys

Glu

Asp

Lys

Val

Phe

Pro

Gly

135

140

145

150

GGA

AGC

CAT

ACA

TAT

GTC

TGG

CAG

GTC

CTG

AAA

GAG

AAT

GGT

CCA

ATG

532

Gly

Ser

His

Thr

Tyr

Val

Trp

Gin

Val

Leu

Lys

G1U

Asn

Gly

Pro

Met

155

160

165

GCC

TCT

GAC

CCA

CTG

TGC

CTT

ACC

TAC

TCA

TAT

CTT

TCT

CAT

GTG

GAC

580

Ala

Ser

Asp

Pro

Leu

Cys

Leu

Thr

Tyr

Ser

Tyr

Leu

Ser

His

Val

Asp

170

175

180

CTG

GTA

AAA

GAC

TTG

ΆΑΤ

TCA

GGC

CTC

ATT

GGA

GCC

CTA

GTA

TGT

628

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Ala

Leu

Val

Cys

185

190

195

AGA

GAA

GGG

AGT

CTG

GCC

AAG

GAA

AAG

ACA

CAG

ACC

TTG

CAC

AAA

TTT

67 6

Arg

Glu

Gly

Ser

Leu

Ala

Lys

Glu

Lys

Thr

Gin

Thr

Leu

His

Lys

Phe

200

205

210

ATA

CTA

CTT

TTT

GCT

GTA

TTT

GAT

GAA

GGG

AAA

AGT

TGG

CAC

TCA

GAA

724

Ile

Leu

Phe

Ala

Val

Phe

Asp

Glu

Gly

Lys

Ser

Trp

His

Ser

Glu

215

220

225

230

ACA

AAG

AAC

TCC

TTG

ATG

CAG

GAT

AGG

GAT

GCT

GCA

.TCT

GCT

CGG

GCC

772

Thr

Lys

Asn

Ser

Leu

Met

Gin

Asp

Arg

Asp

Ala

Ser

Ala

Arg

Ala

235

240

245

TGG

CCT

AAA

ATG

CAC

ACA

GTC

ΆΑΤ

GGT

TAT

GTA

AAC

AGG

TCT

CTG

CCA

820

Trp

Pro

Lys

Met

His

Thr

Val

Asn

Gly

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Pro

GGT Gly

CTG ATT

GGA TGC CAC AGG AAA TCA GTC TAT

TGG CAT GTG

ATT Ile

GGA Gly

868

Leu

Ile 265

Gly

Cys

His

Arg .Lys 270

Ser Val Tyr

Trp

His 275

Val

ATG

GGC

ACC

ACT

CCT

GAA

GTG

CAC

TCA

ATA

TTC

CTC

GAA

GGT

CAC

ACA

916

Met

Gly 280

Thr

Pro

Glu

Val 285

His

Ser

Ile

Phe

Leu 290

Glu

Gly

His

Thr

TTT

CTT

GTG

AGG

AAC

CAT

CGC

CAG

GCG

TCC

TTG

GAA

ATC

TCG

CCA

ATA

964

Phe 295

Leu

Val

Arg

Asn

His 300

Arg

Gin

Ala

Ser

Lěu 305

Glu

Ile

Ser

Pro

Ile 310

ACT

TTC

CTT

ACT

GCT

CAA

ACA

CTC

TTG

ATG

GAC

CTT

GGA

CAG

TTT

CTA

1012

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala 315

Gin

Thr

Leu

Met 320

Asp

Leu

Gly

Gin

Phe 325

Leu

CTG

TTT

TGT

CAT

ATC

TCT

TCC

CAC

CAA

CAT

GAT

GGC

ATG

GAA

GCT

TAT

1060

Leu

Phe

Cys

His 330

Ile

Ser

His

Gin 335

His

Asp

Gly

Met

Glu 340

Ala

Tyr

GTC

AAA

GTA

GAC

AGC

TGT

CCA

GAG

GAA

CCC

CAA

CTA

CGA

ATG

AAA

AAT

1108

Val

Lys

Val 345

Asp

Ser

Cys

Pro

Glu 350

Glu

Pro

Gin

Leu

Arg 355

Met

Lys

Asn

AAT

GAA

GCG

GAA

GAC

TAT

GAT

CTT

ACT

GAT

TCT

GAA

ATG

1156

Asn

Glu 360

Glu

Ala

Glu

Asp

Tyr Asp 365

Asp Asp

Leu

Thr 370

Asp

Ser

Glu

Met

GAT

GTG

GTC

AGG

TTT

GAT

GAC

AAC

TCT

CCT

TCC

TTT

ATC

CAA

ATT

1204

Asp 375

Val

Arg

Phe

Asp 380

Asp

Asn

Ser

Pro 385

Ser

Phe

Ile

Gin

Ile 390

CGC

TCA

GTT

GCC

AAG

CAT

CCT

AAA

ACT

TGG

GTA

CAT

TAC

ATT

GCT

1252

Arg

Ser

Val

Ala

Lys 395

Lys

His

Pro

Lys

Thr 400

Trp

Val

His

Tyr

Ile 405

Ala

GCT

GAA

GAG

GAC

TGG

GAC

TAT

GCT

CCC

TTA

GTC

CTC

GCC

CCC

GAT

1300

Ala

Glu

Glu 410

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala 415

Pro

Leu

Val

Leu

Ala 420

Pro

Asp

GAC

AGA

AGT

TAT

AAA

AGT

CAA

TAT

TTG

AAC

AAT

GGC

CCT

CAG

CGG

ATT

1348

Asp

Arg

Ser 425

Tyr

Lys

Ser

Gin

Tyr 430

Leu

Asn

Gly

Pro 435

Gin

Arg

Ile

GGT

AGG

AAG

TAC

AAA

GTC

CGA

TTT

ATG

GCA

TAC

ACA

GAT

GAA

ACC

1396

Gly

Arg 440

Lys

Tyr

Lys

Val 445

Arg

Phe

Met

Ala

Tyr 450

Thr

Asp

Glu

Thr

TTT

AAG

ACT

CGT

GAA

GCT

ATT

CAG

CAT

GAA

TCA

GGA

ATC

TTG

GGA

CCT

1444

Phe 455

Lys

Thr

Arg

Glu

Ala 460

Ile

Gin

His

Glu

Ser 465

Gly

Ile

Leu

Gly

Pro 470

• · 4 · • ·

TTA CTT TAT GGG

GAA Glu 475

GTT GGA GAC ACA CTG TTG ATT ATA TTT AAG AAT

1492

Leu

Leu Tyr Gly

Val

Gly

Asp

Thr

Leu 480

Leu

Ile

Phe

Lys Asn 485

CAA

GCA

AGC

AGA

CCA

TAT

AAC

ATC

TAC

CCT

CAC

GGA

ATC

ACT

GAT

GTC

1540

Gin

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

Ile

Tyr

Pro

His

Gly

Ile

Thr

Asp

Val

490

495

500

CGT

CCT

TTG

TAT

TCA

AGG

AGA

TTA

CCA

AAA

GGT

GTA

AAA

CAT

TTG

AAG

1588

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ser

Arg

Leu

Pro

Lys

Glý

Val

Lys

His

Leu

Lys

505

510

515

GAT

TTT

CCA

ATT

CTG

CCA

GGA

GAA

ATA

TTC

AAA

TAT

AAA

TGG

ACA

GTG

1636

Asp

Phe

Pro

Ile

Leu

Pro

Gly

Glu

Ile

Phe

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

520

525

530

ACT

GTA

GAA

GAT

GGG

CCA

ACT

AAA

TCA

GAT

CCT

CGG

TGC

CTG

ACC

CGC

1684

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

535

540

545

550

TAT

TAC

TCT

AGT

TTC

GTT

AAT

ATG

GAG

AGA

GAT

CTA

GCT

TCA

GGA

CTC

1732

Tyr

Ser

Phe

Val

Asn

Met

Glu

Arg Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

555

560

565

ATT

GGC

CCT

CTC

ATC

TGC

TAC

AAA

GAA

TCT

GTA

GAT

CAA

AGA

GGA

1780

Ile

Gly

Pro

Leu

Ile

Cys

Tyr

Lys

Glu

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

570

575

580

AAC

CAG

ATA

ATG

TCA

GAC

AAG

AGG

AAT

GTC

ATC

CTG

TTT

TCT

GTA

TTT

1828

Asn

Gin

Ile

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

Ile

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

585

590

595

GAT

GAG

AAC

CGA

AGC

TGG

TAC

CTC

ACA

GAG

AAT

ATA

CAA

CGC

TTT

CTC

1876

Asp

Glu

Asn

Arg

Ser

Trp

Tyr

Leu

Thr

Glu

?.sn

Ile

Gin

Arg

Phe

Leu

600

605

610

CCC

AAT

CCA

GCT

GGA

GTG

CAG

CTT

GAG

GAT

CCA

GAG

TTC

CAA

GCC

TCC

1924

Pro

ř.sn

Pro

Ala

Gly

Val

Gin

Leu

Glu

Asp

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

615

620

625

630

AAC

ATC

ATG

CAC

AGC

ATC

AAT

GGC

TAT

GTT

TTT

GAT

AGT

TTG

CAG

TTG

1972

Asn

Ile

Met

His

Ser

Ile

Asn

Gly

Tyr

Val

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

635

640

645

TCA

GTT

TGT

TTG

CAT

GAG

GTG

GCA

TAC

TGG

TAC

ATT

CTA

AGC

ATT

GGA

2020

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp

Tyr

Ile

Leu

Ser

Ile

Gly

650

655

660

GCA

CAG

ACT

GAC

TTC

CTT

TCT

GTC

TTC

TCT

GGA

TAT

ACC

TTC

AAA

2068

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

665

670

675

·· ··. • · · I • · ·	• · • · • *	···· • ···	·· • · • · • · · ·	·· • ♦ • · • ·
• ··« • ·	• · · • · • ·	• • ··	• ··	• « • «
···· ··

CAC His

AAA ATG

GTC TAT

GAA GAC ACA CTC ACC

CTA Leu

TTC Phe 690

CCA Pro

TTC Phe

TCA GGA

2116

Lys 680

Met

Val

Tyr

G1U

Asp 685

•Thr

Leu

Thr

Ser

Gly

GAA

ACT

GTC

TTC

ATG

TCG

ATG

GAA

AAC

CCA

GGT

CTA

TGG

ATT

CTG

GGG

2164

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

Gly

Leu

Trp

Ile

Leu

Gly

695

700

705

710

TGC

CAC

AAC

TCA

GAC

TTT

CGG

AAC

AGA

GGC

ATG

ACC

GCC

TTA

CTG

AAG

2212

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Phe

Arg

Asn

Arg

Gly

Met

Thr

Ala

Leu

Lys

715

720

725

GTT

TCT

AGT

TGT

ATT

CCA

GAG

GGG

GAG

GAC

TAT

CTG

GAC

2260

Val

Ser

Cys

Ile

Pro

Glu

Gly

Glu

Asp

Tyr

Leu

Asp

730

735

740

CTG

GAG

AAG

ATA

TTC

AGT

GAA

GAC

TAC

ATC

GAC

ATC

GTC

GAC

2308

Leu

Glu

Lys

Ile

Phe

Ser

Glu

Asp

Asp Asp

Tyr

Ile

Asp

Ile

Val

Asp

745

750

755

AGT

CTG

ATT

GAA

CCA

AGA

AGC

TTC

TCC

CAG

AAT

TCA

AGA

CAC

CCT

AGC

2356

Ser

Leu

Ile

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ser

Gin

Asn

Ser

Arg

His

Pro

Ser

760

765

770

ACT

AGG

CAA

AAG

CAA

TTT

AAT

GCC

ACC

ACA

ATT

CCA

GAA

AAT

GAC

ATA

2404

Thr

Arg

Gin

Lys

Gin

Phe

Asn

Ala

Thr

Ile

Pro

Glu

Asn

Asp

Ile

775

780

785

790

GAG

AAG

ACT

GAC

CCT

TGG

TTT

GCA

CAC

AGA

ACA

CCT

ATG

CCT

AAA

ATA

2452

Glu

Lys

Thr

Asp

Pro

Trp

Phe

Ala

His

Arg

Thr

Pro

Met

Pro

Lys

Ile

795

800

805

CAA

AAT

GTC

TCC

TCT

AGT

GAT

TTG

ATG

CTC

TTG

CGA

CAG

AGT

CCT

2500

Gin

Asn

Val

Ser

Asp

Leu

Met

Leu

Arg

Gin

Ser

Pro

810

815

820

ACT

CCA

CAT

GGG

CTA

TCC

TTA

TCT

GAT

CTC

CAA

GAA

GCC

AAA

TAT

GAG

2548

Thr

Pro

His

Gly

Leu

Ser

Leu

Ser

Asp

Leu

Gin

Glu

Ala

Lys

Tyr

Glu

825

830

835

ACT

TTT

TCT

GAT

CCA

TCA

CCT

GGA

GCA

ATA

GAC

AGT

AAT

AAC

AGC

2596

Thr

Phe

Ser

Asp

Pro

Ser

Pro

Gly

Ala

Ile

Asp

Ser

Asn

Ser

840

845

850

CTG

TCT

GAA

ATG

ACA

CAC

TTC

AGG

CCA

CAG

CTC

CAT

CAC

AGT

GGG

GAC

2644

Leu

Ser

Glu

Met

Thr

His

Phe

Arg

Pro

Gin

Leu

His

Ser

Gly

Asp

855

860

865

870

ATG

GTA

TTT

ACC

CCT

GAG

TCA

GGC

CTC

CAA

TTA

AGA

TTA

AAT

GAG

AAA

2692

Met

Val

Phe

Thr

Pro

Glu

Ser

Gly

Leu

Gin

Leu

Arg

Leu

Asn

Glu

Lys

875

880

885

·· · »

CTG GGG ACA ACT Leu Gly Thr Thr

GCA GAT

CCT CTT GCT Pro Leu Ala 895

TGG GAT AAC CAC

TAT Tyr 900

GGT Gly

ACT Thr

2740

Ala

Asp

Trp

Asp

Asn

His

890

CAG

ATA

CCA

AAA

GAA

GAG

TGG

AAA

TCC

CAA

GAG

AAG

TCA

CCA

GAA

AAA

2788

Gin

Ile

Pro

Lys

G1U

Glu

Trp

Lys

Ser

Gin

Glu

Lys

Ser

Pro

Glu

Lys

905

910

915

ACA

GCT

TTT

AAG

AAA

AAG

GAT

ACC

ATT

TTG

TCC

CTG

AAC

GCT

TGT

GAA

2836

Thr

Ala

Phe

Lys

Asp

Thr

Ile

Leu

Ser

Leu

Asn

Ala

Cys

Glu

920

925

930

AGC

AAT

CAT

GCA

ATA

GCA

ATA

AAT

GAG

GGA

CAA

AAT

AAG

CCC

GAA

2884

Ser

Asn

His

Ala

Ile

Ala

Ile

Asn

Glu

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro

Glu

935

940

945

950

ATA

GAA

GTC

ACC

TGG

GCA

AAG

CAA

GGT

AGG

ACT

GAA

AGG

CTG

TGC

TCT

2932

Ile

Glu

Val

Thr

Trp

Ala

Lys

Gin

Gly Arg

Thr

Glu

Arg

Leu

Cys

Ser

955

960

965

CAA

AAC

CCA

GTC

TTG

AAA

CGC

CAT

CAA

CGG

GAA

ATA

ACT

CGT

ACT

2980

Gin

Asn

Pro

Val

Leu

Lys

Arg

His

Gin

Arg

Glu

Ile

Thr

Arg

Thr

970

975

980

ACT

CTT

CAG

TCA

GAT

CAA

GAG

GAA

ATT

GAC

TAT

GAT

ACC

ATA

TCA

3028

Thr

Leu

Gin

Ser

Asp

Gin

G1U

Glu

Ile

Asp

Tyr

Asp

Thr

Ile

Ser

985

990

995

GTT

GAA

ATG

AAG

GAA

GAT

TTT

GAC

ATT

TAT

GAT

GAG

GAT

GAA

AAT

3076

Val

Glu

Met

Lys

Glu

Asp

Phe

Asp

Ile

Tyr

Asp

Glu

Asp

Glu

Asn

1000

1005

1010

CAG

AGC

CCC

CGC

AGC

TTT

CAR

AAG

AAA

ACA

CGA

CAC

TAT

TTT

ATT

GCT

3124

Gin

Ser

Pro

Arg

Ser

Phe

Gin

Lys

Thr

Arg

His

Tyr

Phe

Ile

Ala

1015

1020

1025

1030

GCA

GTG

GAG

AGG

CTC

TGG

GAT

TAT

GGG

ATG

AGT

AGC

TCC

CCA

CAT

GTT

3172

Ala

Val

Glu

Arg

Leu

Trp

Asp

Tyr

Gly

Met

Ser

Pro

His

Val

1035

1040

1045

CTA

AGA

AAC

AGG

GCT

CAG

AGT

GGC

AGT

GTC

CCT

CAG

TTC

AAG

AAA

GTT

3220

Leu

Arg

Asn

Arg

Ala

Gin

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Gin

Phe

Lys

Val

1050

1055

1060

GTT

TTC

CAG

GAA

TTT

ACT

GAT

GGC

TCC

TTT

ACT

CAG

CCC

TTA

TAC

CGT

3268

Val

Phe

Gin

Glu

Phe

Thr

Asp

Gly

Ser

Phe

Thr

Gin -Pro

Leu

Tyr

Arg

1065

1070

1075

GGA

GAA

CTA

AAT

GAA

CAT

TTG

GGA

CTC

CTG

GGG

CCA

TAT

ATA

AGA

GCA

3316

Gly

Glu

Leu

Asn

Glu

His

Leu

Gly

Leu

Gly

Pro

Tyr

Ile

Arg

Ala

1080 1085 1090 ·· ·· φ * · » φ φ ·· • ···Φ ·

Φ Φ Φ

ΦΦ Φ·

φφ	φφ	φφ	«φφφ
φ φ	« φ	φ φ	φ
•	φ φ	φ φ	φφφ
•	φφφ	φ φ φ	•
φ	φ	« φ	φ
«φφφ	«φ	φφ	φφφ

GAA GTT GAA GAT ΑΑΤ

ATC ATG GTA ACT

TTC Phe

AGA AAT CAG GCC

TCT CGT 3364

Glu Val Glu Asp 1095

Asn

Ile Met· 1100

• Val

Thr

Arg Asn 1105

Gin

Ala

Ser

Arg 1110

CCC

TAT

TCC

TTC

TAT

TCT

AGC

CTT

ATT

TCT

TAT

GAG

GAA

GAT

CAG

AGG

3412

Pro

Tyr

Ser

Phe

Tyr

Ser

Leu

Ile

Ser

Tyr

Glu

Asp

Gin

Arg

1115

1120

112'

CAA

GGA

GCA

GAA

CCT

AGA

AAA

AAC

TTT

GTC

AAG

CCT

AAT

GAA

ACC

AAA

3460

Gin

Gly

Ala

Glu

Pro

Arg

Lys

Asn

Phe

Val

Lys

Pro

Asn

Glu

Thr

Lys

1130

1135

1140

ACT

TAC

TTT

TGG

AAA

GTG

CAA

CAT

ATG

GCA

CCC

ACT

AAA

GAT

GAG

3508

Thr

Tyr

Phe

Trp

Lys

Val

Gin

His

Met

Ala

Pro

Thr

Lys

Asp

Glu

1145

1150

1155

TTT

GAC

TGC

AAA

GCC

TGG

GCT

TAT

TTC

TCT

GAT

GTT

GAC

CTG

GAA

AAA

3556

Phe

Asp

Cys

Lys

Ala

Trp

Ala

Tyr

Phe

Ser

Asp

Val

Asp

Leu

Glu

Lys

1160

1165

1170

GAT

GTG

CAC

TCA

GGC

CTG

ATT

GGA

CCC

CTT

CTG

GTC

TGC

CAC

ACT

AAC

3604

Asp

Val

His

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Pro

Leu

Val

Cys

His

Thr

Asn

1175

1180

1185

1190

ACA

CTG

AAC

CCT

GCT

CAT

GGG

AGA

CAA

GTG

ACA

GTA

CAG

GAA

TTT

GCT

3 652

Thr

Leu

Asn

Pro

Ala

His

Gly Arg

Gin

Val

Thr

Val

Gin

Glu

Phe

Ala

1195

1200

1205

CTG

TTT

TTC

ACC

ATC

TTT

GAT

GAG

ACC

AAA

AGC

TGG

TAC

TTC

ACT

GAA

3700

Leu

Phe

Thr

Ile

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Ser

Trp

Tyr

Phe

Thr

Glu

1210

1215

1220

AAT

ATG

GAA

AGA

AAC

TGC

AGG

GCT

CCC

TGC

AAT

ATC

CAG

ATG

GAA

GAT

3748

Asn

Met

G1U

Arg

Asn

Cys

Arg

Ala

Pro

Cys

Asn

Ile

Gin

Met

Glu

Asp

1225

1230

1235

CCC

ACT

TTT

AAA

GAG

AAT

TAT

CGC

TTC

CAT

GCA

ATC

AAT

GGC

TAC

ATA

3796

Pro

Thr

Phe

Lys

Glu

Asn

Tyr

Arg

Phe

His

Ala

Ile

Asn

Gly

Tyr

Ile

1240

1245

1250

ATG

GAT

ACA

CTA

CCT

GGC

TTA

GTA

ATG

GCT

CAG

GAT

CAA

AGG

ATT

CGA

3844

Met

Asp

Thr

Leu

Pro

Gly

Leu

Val

Met

Ala

Gin

Asp

Gin

Arg

Ile

Arg

1255

1260

1265

1270

TGG

TAT

CTG

CTC

AGC

ATG

GGC

AGC

AAT

GAA

AAC

ATC

CAT

TCT

ATT

CAT

3892

Trp

Tyr

Leu

Ser

Met

Gly

Ser

Asn

Glu

Asn

Ile

. His

Ser

Ile

His

1275

1280

1285

TTC

AGT

GGA

CAT

GTG

TTC

ACT

GTA

CGA

AAA

GAG

TAT

AAA

ATG

3940

Phe

Ser

Gly

His

Val

Phe

Thr

Val

Arg

Lys

Glu

G1U

Tyr

Lys

Met

1290

1295

1300

<·· · ··

GCA Ala

CTG Leu

TAC AAT Tyr Asn 1305

CTC Leu

TAT Tyr

CCA Pro

GGT GTT •Gly Val 1310

TTT Phe

GAG G1U

ACA Thr

GTG GAA Val Glu 1315

ATG Met

TTA Leu

3988

CCA

TCC

AAA

GCT

GGA

ATT

TGG

CGG

GTG

GAA

TGC

CTT

ATT

GGC

GAG

CAT

4036

Pro

Ser Lys 1320

Ala

Gly

Ile

Trp Arg 1325

Val

Glu

Cys

Leu Ile 1330

Gly

Glu

His

CTA

CAT

GCT

GGG

ATG

AGC

ACA

CTT

TTT

CTG

GTG

TAC

AGC

AAT

AAG

TGT

4084

Leu His 1335

Ala

Gly

Met

Ser Thr 1340

Leu

Phe

Leu

Val Tyr 1345

Ser

Asn

Lys

Cys 1350

CAG

ACT

CCC

CTG

GGA

ATG

GCT

TCT

GGA

CAC

ATT

AGA

GAT

TTT

CAG

ATT

4132

Gin

Thr

Pro

Leu

Gly Met 1355

Ala

Ser

Gly

His Ile 1360

Arg

Asp

Phe

Gin Ile 1365

ACA

GCT

TCA

GGA

CAA

TAT

GGA

CAG

TGG

GCC

CCA

AAG

CTG

GCC

AGA

CTT

4180

Thr

Ala

Ser

Gly Gin 1370

Tyr

Gly

Gin

Trp Ala 1375

Pro

Lys

Leu

Ala Arg 1380

Leu

CAT

TAT

TCC

GGA

TCA

ATC

AAT

GCC

TGG

AGC

ACC

AAG

GAG

CCC

TTT

TCT

4228

His

Tyr

Ser Gly 1385

Ser

Ile

Asn

Ala Trp 1390

Ser

Thr

Lys

Glu Pro 1395

Phe

Ser

TGG

ATC

AAG

GTG

GAT

CTG

TTG

GCA

CCA

ATG

ATT

CAC

GGC

ATC

AAG

4276

Trp

Ile Lys 1400

Val

Asp

Leu

Leu Ala 1405

Pro

Met

Ile

Ile His 1410

Gly

Ile

Lys

ACC

CAG

GGT

GCC

CGT

CAG

AAG

TTC

TCC

AGC

CTC

TAC

ATC

TCT

CAG

TTT

4324

Thr Gin 1415

Gly

Ala

Arg

Gin Lys 1420

Phe

Ser

Leu Tyr 1425

Ile

Ser

Gin

Phe 1430

ATC

ATG

TAT

AGT

CTT

GAT

GGG

AAG

TGG

CAG

ACT

TAT

CGA

GGA

4372

Ile

Met

Tyr

Ser Leu 1435

Asp

Gly

Lys

Lys Trp 1440

Gin

Thr

Tyr

Arg Gly 1445

AAT

TCC

ACT

GGA

ACC

TTA

ATG

GTC

TTC

TTT

GGC

AAT

GTG

GAT

TCA

TCT

4420

Asn

Ser

Thr

Gly Thr 1450

Leu

Met

Val

Phe .Phe 1455

Gly

Asn

Val

Asp Ser 1460

Ser

GGG

ATA

AAA

CAC

AAT

ATT

TTT

AAC

CCT

CCA

ATT

GCT

CGA

TAC

ATC

4468

Gly

Ile

Lys His 1465

Asn

Ile

Phe

Asn Pro 1470

Pro

Ile

Ala Arg 1475

Tyr

Ile

CGT

TTG

CAC

CCA

ACT

CAT

TAT

AGC

ATT

CGC

AGC

ACT

CTT

CGC

ATG

GAG

4516

Arg

Leu His 1480

Pro

Thr

His

Tyr Ser 1485

Ile

Arg

Ser

Thr Leu 14 90

Arg

Met

Glu

TTG

ATG

GGC

TGT

GAT

TTA

AAT

AGT

TGC

AGC

ATG

CCA

TTG

GGA

ATG

GAG

4564

Leu

Met

Gly

Cys

Asp

Leu

Asn

Ser

Cys

Ser

Met

Pro

Leu

Gly

Met

G1U

1495 1500 1505 1510 • · • · • · • · • ·

AGT Ser

AAA Lys

GCA Ala

ATA Ile

TCA GAT Ser Asp 1515

GCA Ala

CAG Gin

ATT Ile

ACT GCT Thr Ala 1520

TCA Ser

TCC Ser

TAC Tyr

TTT ACC Phe Thr 1525

4612

AAT

ATG

TTT

GCC

ACC

TGG

TCT

CCT

TCA

AAA

GCT

CGA

CTT

CAC

CTC

CAA

4660

Asn

Met

Phe

Ala

Thr

Trp

Ser

Pro

Ser

Lys

Ala

Arg

Leu

His

Leu

Gin

1530

1535

1540

GGG

AGG

AGT

AAT

GCC

TGG

AGA

CCT

CAG

GTG

AAT

CCA

AAA

GAG

TGG

4708

Gly

Arg

Ser

Asn

Ala

Trp

Arg

Pro

Gin

Val

Asn

Pro

Lys

Glu

Trp

1545

1550

1555

CTG

CAA

GTG

GAC

TTC

CAG

AAG

ACA

ATG

AAA

GTC

ACA

GGA

GTA

ACT

4756

Leu

Gin

Val

Asp

Phe

Gin

Lys

Thr

Met

Lys

Val

Thr

Gly

Val

Thr

1560

1565

1570

CAG

GGA

GTA

AAA

TCT

CTG

CTT

ACC

AGC

ATG

TAT

GTG

AAG

GAG

TTC

CTC

4804

Gin

Gly

Val

Lys

Ser

Leu

Thr

Ser

Met

Tyr

Val

Lys

Glu

Phe

Leu

1575

1580

1585

1590

ATC

TCC

AGC

AGT

CAA

GAT

GGC

CAT

CAG

TGG

ACT

CTC

TTT

CAG

AAT

4852

Ile

Ser

Gin

Asp

Gly

His

Gin

Trp

Thr

Leu

Phe

Gin

Asn

1595

1600

1605

GGC

AAA

GTA

AAG

GTT

TTT

CAG

GGA

AAT

CAA

GAC

TCC

TTC

ACA

CCT

GTG

4900

Gly

Lys

Val

Lys

Val

Phe

Gin

Gly

Asn

Gin

Asp

Ser

Phe

Thr

Pro

Val

1610

1615

1620

GTG

AAC

TCT

CTA

GAC

CCA

CCG

TTA

CTG

ACT

CGC

TAC

CTT

CGA

ATT

CAC

4948

Val

Asn

Ser

Leu

Asp

Pro

Leu

Thr

Arg

Tyr

Leu

Arg

Ile

His

1625

1630

1635

CCC

CAG

AGT

TGG

GTG

CAC

CAG

ATT

GCC

CTG

AGG

ATG

GAG

GTT

CTG

GGC

4996

Pro

Gin

Ser

Trp

Val

His

Gin

Ile

Ala

Leu

Arg

Met

G1U

Val

Leu

Gly

1640

1645

1650

TGC

GAG

GCA

CAG

GAC

CTC

TAC

TGAGGGTGGC CACTGCAG

5035

Cys

Glu

Ala

Gin

Asp

Leu

Tyr

1655

1660

(2) Údaje k SEQ ID NO: 2 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 1661 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: protein • · • ·

(Xi)

Popis sekvence

: SEQ ID NO:

2

Met 1

Glu

Ile

Glu

Leu 5

Ser

Thr

Cys

Phe

Phe 10

Leu

Cys

Leu

. Arg 15

' Phe 1

cys

Phe

Ser

Ala 20

Thr

Arg

Tyr

Tyr 25

Leu

Gly

Ala

Val

Glu 30

Leu

Ser

Trp

Asp

Tyr 35

Met

Gin

Ser

Asp

Leu 40

Gly

Glu

Leu

Pro

Val 45

Asp

Ala

Arg

Phe

Pro 50

Pro

Arg

Val

Pro

Lys 55

Ser

Phe

Pro

Phe

Asn 60

Thr

Ser

Val

Tyr 65

Lys

Thr

Leu

Phe 70

Val

Glu

Phe

Thr

Asp 75

His

Leu

Phe

Asn

Ile 80

Ala

Lys

Pro

Arg

Pro 85

Pro

Trp

Met

Gly

Leu 90

Leu

Gly

Pro

Thr

Ile 95

Gin

Ala

Glu

Val

Tyr 100

Asp

Thr

Val

Ile 105

Thr

Leu

Lys

Asn

Met 110

Ala

Ser

His

Pro

Val 115

Ser

Leu

His

Ala

Val 120

Gly

Val

Ser

Tyr

Trp 125

Lys

Ala

Ser

Glu

Gly 130

Ala

Glu

Tyr

Asp

Asp 135

Gin

Thr

Ser

Gin

Arg 140

Glu

Lys

Glu

Asp

Asp 145

Lys

Val

Phe

Pro

Gly 150

Gly

Ser

His

Thr

Tyr 155

Val

Trp

Gin

Val

Leu 160

Lys

Glu

Asn

Gly

Pro 165

Met

Ala

Ser

Asp

Pro 170

Leu

Cys

Leu

Thr

Tyr 175

Ser

Tyr

Leu

Ser

His 180

Val

Asp

Leu

Val

Lys 185

Asp

Leu

Asn

Ser

Gly 190

Leu

Ile

Gly

Ala

Leu 195

Leu

Val

Cys

Arg

Glu 200

Gly

Ser

Leu

Ala

Lys 205

Glu

Lys

Thr

Gin

Thr 210

Leu

His

Lys

Phe

Ile 215

Leu

Phe

Ala

Val 220

Phe

Asp

Glu

Gly

Lys 225

Ser

Trp

His

Ser

Glu 230

Thr

Lys

Asn

Ser

Leu 235

Met

Gin

Asp

Arg

Asp 240

Ala

Ser

Ala

Arg 245

Ala

Trp

Pro

Lys

Met 250

His

Thr

Val

Asn

Gly 255

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser 260

Leu

Pro

Gly

Leu

Ile 265

Gly

Cys

His

Arg

Lys 270

Ser

Val

Tyr

Trp

His 275

Val

Ile

Gly

Met

Gly 280

Thr

Pro

Glu

Val 285

His

Ser

Ile

Phe

Leu 290

Glu

Gly

His

Thr

Phe 295

Leu

Val

Arg

Asn

His 300

Arg

Gin

Ala

Ser 1

• ·

Leu 305

Glu

Ile

Ser Pro

Ile 310

Thr Phe Leu Thr Ala Gin Thr Leu Leu Met

315

320

Asp

Leu

Gly

Gin

Phe

Leu

Phe

Cys

His

Ile

Ser

His

Gin

His

325

330

335

Asp

Gly

Met

Glu

Ala

Tyr

Val

Lys

Val

Asp

Ser

Cys

Pro

Glu

Pro

340

345

350

Gin

Leu

Arg

Met

Lys

Asn

Glu

Ala

Glu

Asp

Tyr

Asp

355

360

365

Leu

Thr

Asp

Ser

Glu

Met

Asp

Val

Arg

Phe

Asp

Asn

Ser

370

375

380

Pro

Ser

Phe

Ile

Gin

Ile

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

His

Pro

Lys

Thr

385

390

395

400

Trp

Val

His

Tyr

Ile

Ala

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala

Pro

405

410

415

Leu

Val

Leu

Ala

Pro

Asp

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

Gin

Tyr

Leu

Asn

420

425

430

Asn

Gly

Pro

Gin

Arg

Ile

Gly Arg

Lys

Tyr

Lys

Val

Arg

Phe

Met

435

440

445

Ala

Tyr

Thr

Asp

Glu

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Glu

Ala

Ile

Gin

His

Glu

450

455

460

Ser

Gly

Ile

Leu

Gly

Pro

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

Gly

Asp

Thr

Leu

465

470

475

480

Leu

Ile

Phe

Lys

Asn

Gin

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

Ile

Tyr

Pro

485

490

495

His

Gly

Ile

Thr

Asp

Val

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ser

Arg

Leu

Pro

Lys

500

505

510

Gly

Val

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Phe

Pro

Ile

Leu

Pro

Gly

Glu

Ile

Phe

515

520

525

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

530

535

540

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Ser

Phe

Val

Asn

Met

Glu

Arg

545

550

555

560

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Pro

Leu

Ile

Cys

Tyr

Lys

Glu

565

570

575

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

Ile

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

580

585

590

• · · · • ·

Ile Leu Phe 595

Ser Val

Phe

Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr

Leu

Thr

Glu

. 600

605

Asn

Ile

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Ala

Gly

Val

Gin

Leu

Glu

Asp

610

615

620

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

Ile

Met

His

Ser

Ile

Asn

Gly

Tyr

Val

625

630

635

640

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp

645

650

655

Tyr

Ile

Leu

Ser

Ile

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

'Phe

Phe

660

665

670

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

675

680

685

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

690

695

700

Gly

Leu

Trp

Ile

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Phe

Arg

Asn

Arg

Gly

705

710

715

720

Met

Thr

Ala

Leu

Lys

Val

Ser

Cys

Ile

Pro

Glu

Gly

Glu

725

730

735

Asp

Tyr

Leu

Asp

Leu

Glu

Lys

Ile

Phe

Ser

Glu

Asp

740

745

750

Tyr

Ile

Asp

Ile

Val

Asp

Ser

Leu

Ile

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ser

Gin

755

760

765

Asn

Ser

Arg

His

Pro

Ser

Thr

Arg

Gin

Lys

Gin

Phe

Asn

Ala

Thr

770

775

780

Ile

Pro

Glu

Asn

Asp

Ile

Glu

Lys

Thr

Asp

Pro

Trp

Phe

Ala

His

Arg

785

790

795

800

Thr

Pro

Met

Pro

Lys

Ile

Gin

Asn

Val

Ser

Asp

Leu

Met

805

810

815

Leu

Arg

Gin

Ser

Pro

Thr

Pro

His

Gly

Leu

Ser

Leu

Ser

Asp

Leu

820

825

830

Gin

Glu

Ala

Lys

Tyr

Glu

Thr

Phe

Ser

Asp

Pro

Ser

Pro

Gly

Ala

835

840

845

Ile

Asp

Ser

Asn

Ser

Leu

Ser

Glu

Met

Thr

His

Phe

Arg

Pro

Gin

850

855

860

Leu

His

Ser

Gly

Asp

Met

Val

Phe

Thr

Pro

Glu

Ser

Gly

Leu

Gin

865

870

875

880

• · • ·

Leu Arg Leu Asn	Glu Lys 885	Leu Gly Thr Thr Ala 890	Asp	Pro	Leu	Ala 895	Trp
Asp Asn His Tyr	Gly Thr	Gin Ile Pro Lys Glu	Glu	Trp	Lys	Ser	Gin
900		905			910
Glu Lys Ser Pro	Glu Lys	Thr Ala Phe Lys Lys	Lys	Asp	Thr	Ile	Leu
915		920		925
Ser Leu Asn Ala	Cys Glu	Ser Asn His Ala Ile	Ala	Ala	Ile	Asn	Glu
930		935	940
Gly Gin Asn Lys	Pro Glu	Ile Glu Val Thr Trp	Ala	Lys	Gin	Gly	Arg
945	950	955					960
Thr Glu Arg Leu	Cys Ser	Gin Asn Pro Pro Val	Leu	Lys	Arg	His	Gin
	965	970				975
Arg Glu Ile Thr	Arg Thr	Thr Leu Gin Ser Asp	Gin	Glu	Glu	Ile	Asp
980		985			990
Tyr Asp Aso Thr	Ile Ser	Val Glu Met Lys Lys	Glu	Asp	Phe	Asp	Ile
995		1000		1005
Tyr Asp Glu Asp	Glu Asn	Gin Ser Pro Arg Ser	Phe	Gin	Lys	Lys	Thr
1010		1015	1020
Arg His Tvr Phe	Ile Ala	Ala Val Glu Arg Leu	Trp	Asp	Tyr	Gly	Met
1025	1030 1035				1040
Ser Ser Ser Pro	His Val	Leu Arg Asn Arg Ala	Gin	Ser	Gly	Ser	Val
	1045	1050				1055
Pro Gin Phe Lys	Lys Val	Val Phe Gin Glu Phe	Thr	Asp	Gly	Ser	Phe
1060	1065			1070
Thr Gin Pro Leu	Tyr Arg	Gly Glu Leu Asn Glu	His	Leu	Gly	Leu	Leu
1075		1080		1085
Gly Pro Tvr Ile	Arg Ala	Glu Val Glu Asp Asn	Ile	Met	Val	Thr	Phe
1090		1095	1100
Arg Asn Gin Ala	Ser Arg	Pro Tyr Ser Phe Tyr	Ser	Ser	Leu	Ile	Ser
1105	1110 1115				1120
Tyr Glu Glu Asp	Gin Arg	Gin Gly Ala Glu Pro	Arg	Lys	Asn	Phe	Val
	1125	1130				1135
Lys Pro Asn Glu	Thr Lys	Thr Tyr Phe Trp Lys	Val	Gin	His	His	Met

1140 1145 1150

Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser 1155 1160 1165

4 ·

4

4 4 · · 4 4 · · 4 4··· ♦ · 4 4 · · · · • · · Φ Φ

4444 44 · · · Φ ·

Asp

Val Asp 1170

Leu

Glu

Lys

Asp Val 1175

His

Ser

Gly

Leu Ile 1180

Gly

Pro

Leu

Val

Cys

His

Thr

Asn

Thr

Leu

Asn

Pro

Ala

His

Gly

Arg

Gin

Val

1185

1190

1195

1200

Thr

Val

Gin

Glu

Phe

Ala

Leu

Phe

Thr

Ile

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

1205

1210

121Í

Ser

Trp

Tyr

Phe

Thr

Glu

Asn

Met

Glu

Arg

Asn

Cys

Arg

Ala

Pro

Cys

1220

1225

1230

Asn

Ile

Gin

Met

Glu

Asp

Pro

Thr

Phe

Lys

Glu

Asn

Tyr

Arg

Phe

His

1235

1240

124J

Ala

Ile

Asn

Gly

Tyr

Ile

Met

Asp

Thr

Leu

Pro

Gly

Leu

Val

Met

Ala

1250

1255

1260

Gin

Asp

Gin

Arg

Ile

Arg

Trp

Tyr

Leu

Ser

Met

Gly

Ser

Asn

Glu

1265

1270

1275

1280

Asn

Ile

His

Ser

Ile

His

.Phe

Ser

Gly

His

.Val,

.Phe.

Thr

Val .Arg

Lys

1285

1290

129Σ

Lys

Glu

Tyr

Lys

Met

Ala

Leu

Tyr

Asn

Leu

Tyr

Pro

Gly Val

Phe

1300

1305

1310

Glu

Thr

Val

Glu

Met

Leu

Pro

Ser

Lys

Ala

Gly

Ile

Trp

Arg

Val

Glu

1315

1320

1325

Cys

Leu

Ile

Gly

Glu

His

Leu

His

Ala

Gly

Met

Ser

Thr

Leu

Phe

Leu

1330

1335

1340

Val

Tyr

Ser

Asn

Lys

Cys

Gin

Thr

Pro

Leu

Gly

Met

Ala

Ser

Gly

His

1345

1350

1355

1360

Ile

Arg

Asp

Phe

Gin

Ile

Thr

Ala

Ser

Gly

Gin

Tyr

Gly

Gin

Trp

Ala

1365

1370

1375

Pro

Lys

Leu

Ala

Arg

Leu

His

Tyr

Ser

Gly

Ser

Ile

Asn

Ala

Trp

Ser

1380

1385

1390

Thr

Lys

Glu

Pro

Phe

Ser

Trp

Ile

Lys

Val

Asp

Leu

Ala

Pro

Met

1395

1400

1405

Ile

His

Gly

Ile

Lys

Thr

Gin

Gly

Ala

Arg

Gin

Lys )

Phe

Ser

1410

T4i:

1421

Leu

Tyr

Ilě

Ser

Gin

Phe

Ile

Met

Týr

Ser

Leu

Asp

Gly

Lys

1425

1430

1435

1440

Trp

Gin

Thr

Tyr

Arg

Gly Asn

Ser

Thr

Gly

Thr

Leu

Met

Val

Phe

1445

1450

1455

Gly Asn

Val

Asp Ser 1460

Ser

Gly

Ile Lys His 1465

Asn

Ile

Phe

Asn Pro 1470

Pro

Ile

Ala

Arg

Tyr

Ile

Arg

Leu

His

Pro

Thr

His

Tyr

Ser

Ile

Arg

1475

1480

1485

Ser

Thr

Leu

Arg

Met

Glu

Leu

Met

Gly

Cys

Asp

Leu

Asn

Ser

Cys

Ser

1490

1495

1500

Met

Pro

Leu

Gly

Met

Glu

Ser

Lys

Ala

Ile

Ser

Asp

Ala

Gin

Ile

Thr

1505

1510

1515

1520

Ala

Ser

Tyr

Phe

Thr

Asn

Met

Phe

Ala

Thr

Trp

Ser

Pro

Ser

Lys

1525

1530

1535

Ala

Arg

Leu

His

Leu

Gin

Gly

Arg

Ser

Asn

Ala

Trp

Arg

Pro

Gin

Val

1540

1545

1550

Asn

Pro

Lys

Glu

Trp

Leu

Gin

Val

Asp

Phe

Gin

Lys

Thr

Met

Lys

1555

1560

1565

Val

Thr

Gly

Val

Thr

Gin

Gly Val

Lys

Ser

Leu

Thr

Ser

Met

1570

1575

1580

Tyr

Val

Lys

Glu

Phe

Leu

Ile

Ser

Gin

Asp

Gly

His

Gin

Trp

1585

1590

1595

1600

Thr

Leu

Phe

Gin

Asn

Gly

Lys

Val

Lys

Val

Phe

Gin

Gly

Asn

Gin

1605

1610

1615

Asp

Ser

Phe

Thr

Pro

Val

Asn

Ser

Leu

Asp

Pro

Leu

Thr

1620

1625

1630

Arg

Tyr

Leu

Arg

Ile

His

Pro

Gin

Ser

Trp

Val

His

Gin

Ile

Ala

Leu

1635

1640

1645

Arg

Met

Glu

Val

Leu

Gly

Cys

Glu

Ala

Gin

Asp

Leu

Tyr

1650

1655

1660

(2) Údaje k SEQ ID NO: 3 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 48 párů bázi (B) typ: nukleotidová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA «· 4· ·· ···· ·· ·· • · · · ··· · · · · *· · · ···· · ··· • «···· · ·· · · · · · « · · · · · · · «··· ·· ·» ··· ·· ·· (iii) Hypotetická: ne (iv) Pozitivní: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

TCGACCTCCA GTTGAACATT TGTAGCAAGC CACCATGGAA ATAGAGCT 48 (2) Údaje k SEQ ID NO: 4 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 40 párů baží (B) typ: nukleotidová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

CTATTTCCAT GGTGGCTTGC TACAAATGTT CAACTGGAGG ⁴⁰ (2) Údaje k SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 30 párů baží (B) typ: nukleotidová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

GGGTCGACCT GCAGGCATGC CTCGAGCCGC (2) Údaje k SEQ ID NO: 6 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 38 párů baží (B) typ: nukleotidová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

GG£CGCGGCT CGAGGCATGC CTGCAGGTCG ACCCTGCA (2) Údaje k SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 36 párů baží (B) typ: nukleotidová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

CTGAAGGTTT CTAGTTGTAT TCCAGAGGGG GAGGAG < >

(2) Údaje k SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 39 párů baží (B) typ: nukleotidová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

GGAGAAGCTT CTTGGTTCAA TCAGACTGTC GACGATGTC 39 (2) Údaje k SEQ ID NO: 9 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 21 párů baží (B) typ: nukleotidová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová • · · · (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

TCTAGCTTCA GGACTCATTG G (2) Údaje k SEQ ID NO: 10 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 20 párů baží (B) typ: nukleotidová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:10:

ATACAACTAG AAACCTTCAG (2) Údaje k SEQ ID NO: 11 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 21 párů baží (B) typ: nukleotidová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

GTAGATCAAA GAGGAAACCA G (2) Údaje k SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 19 párů baží (B) typ: nukleotidová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová • · • · • · · 9

(D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

GTCCCCACTG TGATGGAGC ¹⁹ (2) Údaje k SEQ ID NO: 13 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 44 párů baží (B) typ: nukleotidová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

AGGAAATTCC AGAGGAATAT TTGCAGAGTA AAAACAATGC CATT 44 (2) Údaje k SEQ ID NO: 14 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 43 párů baží (B) typ: nukleotidová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:

AATATTCCTC TGGAATTTCC TCGAAATCAC CAGTGTTCTT GTC 43 (2) Údaje k SEQ ID NO: 15:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 31 párů baží (B) typ: nukleotidová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

CTATCTGGAC TTCGAGGAAA TTCCAGAGGA A ³' (2) Údaje k SEQ ID NO: 16:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 33 párů bázi (B) typ: nukleotidová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

ATTTTCCTCG AAGTCCAGAT AGTCGTCGTC CTC 33 (2) Údaje k SEQ ID NO: 17:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 36 párů bázi (B) typ: nukleotidová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

GAAATAACTC GTACTACTAT TCCAGAGGGG GAGGAG 3 6 (2) Údaje k SEQ ID NO: 18 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 36 párů bázi (B) typ: nukleotidová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

GCTGCGGGGG CTCTGATTCA GACTGTCGAC GATGTC 36 (2) Údaje k SEQ ID NO: 19 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 36 párů baží (B) typ: nukleotidová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

CTCCTCCCCC TCTGGAATAG TAGTACGAGT TATTTC (2) Údaje k SEQ ID NO: 20:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 36 párů baží (B) typ: nukleotidová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:

GACATCGTCG ACAGTCTGAA TCAGAGCCCC CGCAGC (2) Údaje k SEQ ID NO: 21:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 21 párů baží (B) typ: nukleotidová kyselina • 4

4 · · · * 4····4

4444 4 4 44

4 4 4444 4444 > 4 4 · 4 4 44 4444·

4 4 · 4444 «444 4« ·· 444 ···· (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:

TGCAACTATT TAAATCACAG C

Claims

Změněné nároky

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Hybridní protein odvozený z krevního koagulačního proteinu, který se vybral ze skupiny zahrnující faktor V, faktor VIII, faktor X, faktor XIII, fibrinogen, protein S a protein C, kde uvedený hybridní protein obsahuje oblast z donorového antikoagulačního nebo antitrombotického proteinu.
2. Hybridní protein podle nároku 1, kde uvedená oblast, která pochází z donorového antikoagulačního nebo antitrombotického proteinu, nahrazuje oblast uvedeného krevního koagulačního proteinu.
3. Hybridní protein podle nároku 1 nebo 2, kde uvedená oblast, která pochází z donorového antikoagulačního nebo antitrombotického proteinu, je kyselou oblastí.
4. Hybridní protein podle libovolného z nároků 1 až 3, kde uvedená oblast, která pochází z donorového antikoagulačního nebo antitrombotického proteinu, vykazuje afinitu k serinové proteáze.
5. Hybridní protein podle libovolného z nároků 1 až 4, kde uvedená oblast, která pochází z donorového antikoagulačního nebo antitrombotického proteinu, obsahuje vazebné místo pro serinovou proteázu.
6. Hybridní protein podle libovolného z nároků 4 nebo 5, kde uvedená serinová proteáza je trombin.

* 9 9 ·9 9
7. Hybridní protein podle libovolného z nároků 1 až 6, kde uvedená oblast, která pochází z donorového antikoagulačního nebo antitrombotického proteinu, je z proteinu vybraného ze skupiny, jenž zahrnuje heparinový kofaktor II, antitrombin III a hirudin nebo deriváty těchto látek.
8. Hybridní protein podle libovolného z nároků 1 až 7, kde uvedený krevní koagulační protein je faktor VIII nebo jeho derivát nebo mutant.
9. Hybridní protein podle nároku 8, kde uvedený mutant faktoru VIII je deleční mutant faktoru VIII.
10. Hybridní protein podle nároku 8, kde uvedenému mutantu faktoru VIII chybí nejméně část oblasti B.
11. Hybridní protein podle nároku 8 nebo 9, kde uvedenému mutantu faktoru VIII chybí pro záměnu kyselá oblast nebo serinové vazebné místo.
12. Hybridní protein podle libovolného z nároků 8 až 11, kde uvedený donorový antikoagulační nebo antitrombotický protein je hirudin a kde aminokyseliny Tyr718 až Ser732 faktoru VIII nebo mutantu faktoru VIII jsou nahrazeny aminokyselinami Phe53 až Gln62 hirudinu.
13. Hybridní protein podle libovolného z nároků 8 až 11, kde uvedený donorový antikoagulační nebo antitrombotický protein je heparinový kofaktor II a kde aminokyseliny Asp712 až Ser737 faktoru VIII nebo mutantu faktoru VIII jsou nahrazeny aminokyselinami Ile51 až Ser81 heparinové kofaktoru

II.

• *
14. Hybridní protein podle libovolného z nároků 8 až 11, kde nahrazená oblast je vybrána ze skupiny aminokyselinových oblastí, které se nacházejí mezi aminokyselinovými zbytky Arg336 a Arg372, aminokyselinovými zbytky Ala705 a Arg740 a aminokyselinovými zbytky Argl648 a Argl689 uvedeného faktoru VIII a delečního mutantu faktoru VIII.
15. Hybridní protein podle libovolného z nároků 1 až 14, kde se nahradily nejméně dvě kyselé oblasti nebo oblasti vykazující afinitu k serinové proteáze.
16. Polynukleotid kódující hybridní protein podle libovolného z nároků 1 až 15.
17. Polynukleotid podle nároku 16, který je obsažen v expresivním vektoru.
18. Transformovaná buňka, vyznačující se tím, že obsahuje polynukleotid podle nároku 16 nebo 17.
19. Farmaceutická kompozice, vyznačuj ící se tím, že obsahuje hybridní protein podle libovolného z nároků 1 až 15 a farmaceuticky přijatelný nosič.
20. Farmaceutická kompozice, vyznačuj ící se tím, že obsahuje polynukleotid podle libovolného z nároků 16 nebo 17 a farmaceuticky přijatelný nosič.
21. Farmaceutická kompozice, vyznačuj ící se tím, že obsahuje transformovanou buňku podle nároku

18 a farmaceuticky přijatelný nosič.

i • · «e ·· • 9 · • ♦ · • · · · • · • ♦9

99 «

99 9 99

99 9 9

9 9 99 9
22. Použiti hybridního proteinu podle libovolného z nároků 1 až 15 pro výrobu léčiva.
23. Použití hybridního proteinu podle nároku 20 pro výrobu léčiva, které je vhodné pro léčbu poruch srážení krve.
24. Způsob produkce hybridního proteinu podle libovolného z nároků 1 až 15, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje

a) přípravu konstrukce DNA, kde kódující sekvence nejméně jedné oblasti uvedeného krevního koagulačniho proteinu je nahrazena nebo substituována kódujícími sekvencemi oblasti odvozené od donorového antikoagulačního nebo antitrombotického proteinu,

b) transfekci hostitelských buněk uvedenou konstrukcí DNA,

c) kultivaci uvedené buňky, přičemž dochází k expresi hybridního proteinu a

d) shromáždění a izolaci uvedeného hybridního proteinu.
25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že nejméně jedna kyselá oblast faktoru VIII je nahrazena kyselou oblastí, která pochází z hirudinu, antitrombinu III nebo heparinového kofaktoru II.
26. Způsob podle nároku 24 nebo 25, vyznačující se tím, že nejméně jedna kyselá oblast mutantu faktoru VIII, které chybí část oblasti B, se nahradí kyselou oblastí hirudinu nebo heparinového kofaktoru II.
27. Způsob podle libovolného z nároků 24 až 26, vyznačující se tím, že rekombinantí DNA se připravuje konstrukcí delečního mutantu krevního faktoru, *

·· ·· • 9 9 9 9

999 9 9 99

9 9 · · · · · • « · · ··· ·· ·· ·· ·· • · « · 9 9 • · · 9 · • 9 · Λ 9 » · • 9 9 9

99 9 9 99 9 9 ·· ···* kterému přinejmenším chybí oblast, jenž se nahrazuje, delecí kódující sekvence oblasti, jenž se nahrazuje, a inzercí kódující sekvence oblasti donorového antikoagulačního nebo antitrombotického činidla.
28. Způsob produkce protilátek, které se váží na hybridní protein, podle nároků 1 až 15, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje podání uvedeného proteinu savci a shromáždění produkovaných protilátek.
29. Protilátky, které váží hybridní protein podle nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že protilátky jsou polyklonální nebo monoklonální.
30. Diagnostický kit pro detekci přítomnosti hybridního proteinu podle libovolného z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že obsahuje protilátky podle nároku 28 nebo 29.
31. Způsob stanoveni přítomnosti hybridního proteinu ve vzorku podle libovolného z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že zahrnuje kontakt uvedeného vzorku s protilátkami podle nároku 28 nebo 19 a detekci uvedených protilátek vázaných na uvedený hybridní protein.