JP2004525608A - 修飾された因子ｖｉｉｉ - Google Patents

Abstract

ヒト因子ＶＩＩＩの特定のアミノ酸位置は、因子ＶＩＩＩで処理した後、血友病患者の阻害性抗体と相互作用する。アミノ酸配列が特定の位置の１または２以上における置換により変化されている、修飾された因子ＶＩＩＩが開示される。修飾された因子ＶＩＩＩは、阻害性抗体の作用を回避または防止するために、血友病に有効である。

Description

【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、もとのタンパク質または他の因子ＶＩＩＩ、例えば、ヒト因子ＶＩＩＩに比較して免疫原性および／または抗原性が減少したアミノ酸置換を有する修飾された哺乳動物因子ＶＩＩＩに関する。
【０００２】
発明の背景
病変部位における外傷血管の切断壁に血小板が付着するとき、血液凝固が開始する。引き続いて、酵素的に調節された反応のカスケードにおいて、可溶性フィブリノゲン分子は酵素トロンビンによりフィブリンの不溶性鎖に変換され、これらの鎖は血栓の中に血小板を一緒に保持する。カスケードの各工程において、タンパク質前駆体はプロテアーゼに変換され、このプロテアーゼは系列中の次のタンパク質前駆体を切断する。工程の大部分において、コファクターを必要とする。
【０００３】
因子ＶＩＩＩは血液中の不活性前駆体として循環し、フォン・ウィルブランド因子に緊密に非共有結合する。因子ＶＩＩＩはトロンビンまたは因子Ｘａによりタンパク質分解的に活性化され、トロンビンまたは因子Ｘａは因子ＶＩＩＩをフォン・ウィルブランド因子から解離させ、カスケードにおいてその前凝固機能を活性化する。タンパク質因子ＶＩＩＩは、その活性形態において、因子Ｘを活性化する因子ＩＸａの触媒効率を数桁増加させるコファクターである。
【０００４】
因子ＶＩＩＩで治療されない因子ＶＩＩＩまたは因子ＶＩＩＩに対する抗体を欠如する人々は、関節における炎症反応から早い死までの、ある範囲の重大な症状を引き起こすことがある、コントロールされない内部の出血を患う。米国において約１０，０００人に達する、重症の血友病患者はヒト因子ＶＩＩＩ注入により治療することができ、ヒト因子ＶＩＩＩは、十分な頻度および濃度で投与される場合、正常の血液凝固能力を回復させるであろう。因子ＶＩＩＩの古典的定義は、血友病Ａの個体に由来する血漿における凝固欠如を補正する、正常の血液の中に存在する物質である。
【０００５】
因子ＶＩＩＩの活性を阻害する抗体 （ 「インヒビター」 または 「阻害性抗体」 ） の発生は、血友病患者の管理における重大な合併症である。自己抗体は、血友病Ａ患者のほぼ２０％において、因子ＶＩＩＩの治療的注入に応答して発生する。インヒビターを発生させる従来未治療の血友病Ａ患者において、インヒビターは通常治療の１年以内に発生する。さらに、以前に因子ＶＩＩＩレベルが正常であった個体において、因子ＶＩＩＩを不活性化させる自己抗体が発生することがある。因子ＶＩＩＩ （ｆＶＩＩＩ） に対する阻害性抗体 （インヒビター） は、ｆＶＩＩＩ注入後の血友病Ａ患者において同種異系抗体として、あるいは非血友病において自己抗体として発生する （Ｈｏｙｅｒ， Ｌ． Ｗ． およびＤ． Ｓｃａｎｄｅｌｌａ， １９９４， “Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ： ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，” Ｓｅｍｉｎ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ３１５ ： １−５） 。
【０００６】
Ａ１−Ａ２−Ｂ−ａｐ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ ｆＶＩＩＩ分子内のＡ２、ａｐ−Ａ３、およびＣ２ドメイン中のエピトープに対する抗体は、大部分のインヒビター血漿中のすべての抗凝固活性の原因である （Ｐｒｅｓｃｏｔｔ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， １９９７， “Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｍｏｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ ｈｅｍｏｈｐｉｌｉａ Ａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｈａｎ ｉｎ ｍｏｓｔ ｎｏｎｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃｓ ｗｉｔｈ ｆＶＩＩＩ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” Ｂｌｏｏｄ ８９：３６６３−３６７１；Ｂａｒｒｏｗ， Ｒ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．， ２０００， “Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｔｏｗａｒｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｌａｓｍａｓ ｕｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｙ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｈｙｂｒｉｄ ｈｕｍａｎ／ｐｏｒｃｉｎｅ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，” Ｂｌｏｏｄ ９５：５５７−５６１）。
【０００７】
１８ ｋＤａのＣ２ドメインは、一本鎖ヒトｆＶＩＩＩ中の残基Ｓｅｒ ２１７３−Ｔｙｒ ２３３２として定義され、ｆＶＩＩＩの正常の前凝固機能に必要な、リン脂質膜結合性部位を含有する。ヒトＣ２特異的抗ｆＶＩＩＩ抗体はこの相互作用を阻害する （Ａｒａｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９８９， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ−ＶＩＩＩ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ − ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ｔｏ ｆａｃｔｏｒ−ＶＩＩＩ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ−ＶＩＩＩ ｗｉｔｈ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ，” Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８３：１９７８−１９８４） 。これと一致して、リン脂質はｆＶＩＩＩインヒビターによる不活性化から保護する （Ａｒａｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ；Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅ， Ｔ． Ｗ． ｅｔ ａｌ．， １９８３， “Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｆｒｏｍ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ． １０１：３４−４３） 。
【０００８】
Ｃ２ドメインは、また、フォン・ウィルブランド因子 （ｖＷｆ） 結合性部位の一部分を含有する （Ｓａｅｎｋｏ， Ｅ． Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９９４， “Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１１６０１−１１６０５；Ｓａｅｎｋｏ， Ｅ． Ｌ． およびＳｃａｎｄｅｌｌａ， Ｄ．， １９９７， “Ｔｈｅ ａｃｉｄｉｃ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｆｏｒｍ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｆｏｒ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ，” Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１８００７−１８０１４） 。
【０００９】
いくつかのインヒビターは、この相互作用を妨害することによって作用ことができる （Ｓｈｉｍａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｃｏｍｍｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｌｌｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ，” Ｂｒ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ． ９１：７１４−５７２１；Ｓａｅｎｋｏ， Ｅ． Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９９６， “Ｓｌｏｗｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ｃｌｅａｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｆｒｏｍ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｂｙ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，” Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２７２４−２７４３１；Ｇｉｌｌｅｓ， Ｊ． Ｇ． ｅｔ ａｌ．， １９９９， “Ｓｏｍｅ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ （Ｆ ＶＩＩＩ） ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ａ Ｆ ＶＩＩＩ ｅｐｉｔｏｐｅ（ｓ） ｔｈａｔ ｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｏｎｌｙ ｏｎ Ｆ ＶＩＩＩ−ｖＷｆ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，” Ｔｈｒｏｍｂｏ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ８２：４０−４５） 。
【００１０】
インヒビター力価が十分に低いかぎり、因子ＶＩＩＩの投与量を増加することによって、患者を管理することができる。しかしながら、因子ＶＩＩＩがインヒビター力価を圧倒することができないほど、インヒビター力価はしばしば高い。別の戦略は、因子ＩＸ複合体調製物 （例えば、ＫＯＮＹＮＥ^ＴＭ、Ｐｒｏｐｌｅｘ^ＴＭ） または組換えヒト因子ＶＩＩＩａを使用して、正常の止血作用間に因子ＶＩＩＩの必要性を回避することである。さらに、ブタ因子ＶＩＩＩは通常ヒト因子ＶＩＩＩよりも実質的に低いインヒビターとの反応性を有するので、部分的に精製されたブタ因子ＶＩＩＩ調製物 （ＨＹＡＴＥ：Ｃ^ＴＭ） を使用する。ヒト因子ＶＩＩＩに対する阻害性抗体を発生させた多数の患者はブタ因子ＶＩＩＩで首尾よく治療されてきており、長期間このような治療に耐性であった。しかしながら、因子ＶＩＩＩの投与は完全な解決法ではない。１または２回以上の注入後に、ブタ因子ＶＩＩＩに対するインヒビターが発生することがある。
【００１１】
変化する程度の純度を有するヒト血漿由来因子ＶＩＩＩのいくつかの調製物が、血友病Ａの治療のために商業的に入手可能である。これらは下記のものを包含する：ウイルスについて熱処理および洗浄剤処理されているが、有意なレベルの抗原性タンパク質を含有する、多数のドナーのプールした血液に由来する、部分的に精製された因子ＶＩＩＩ；より低いレベルの抗原不純物およびウイルス汚染を有する、モノクローナル抗体精製因子ＶＩＩＩ；および組換えヒト因子ＶＩＩＩ、それらについての臨床実験が実施されている。不都合なことには、ヒト因子ＶＩＩＩは生理学的濃度およびｐＨにおいて不安定であり、極めて低い濃度 （０．２ μｇ／ｍｌ血漿） で血液中に存在し、低い特異的凝固活性を有する。
【００１２】
血友病者は、出血および生ずる変形性血友病関節症を防止するために、因子ＶＩＩＩの毎日の置換を必要とする。しかしながら、供給は不適切であり、単離および精製の困難、免疫原性、およびエイズおよび肝炎感染性の危険を除去する必要性のために、治療的用途における問題が起こった。組換えヒト因子ＶＩＩＩまたは部分的に精製されたブタ因子ＶＩＩＩの用途はすべての問題を解決しないであろう。
【００１３】
普通に使用され、商業的に入手可能な、血漿由来因子ＶＩＩＩに関連する問題は、よりすぐれた因子ＶＩＩＩ生成物の開発において有意な関心を刺激した。分子当たりより多い単位の凝固活性が放出されるように、より高い効力の因子ＶＩＩＩ分子；選択したｐＨおよび生理学的濃度において安定である因子ＶＩＩＩ分子；阻害性抗体の産生を引き起こす傾向が低い因子ＶＩＩＩ分子；およびヒト因子ＶＩＩＩに対する抗体を既に獲得した患者において免疫検出を回避する因子ＶＩＩＩ分子が必要とされている。
【００１４】
Ｌｏｌｌａｒに対する米国特許第６，１８０，３７１号明細書には、生ずる因子ＶＩＩＩ分子の抗原性を変更するヒト因子ＶＩＩＩのＡ２ドメイン中のアミノ酸置換が記載されている。米国特許第６，１８０，３７１号明細書において、野生型因子ＶＩＩＩまたは対応する組換え因子ＶＩＩＩに比較して、抗原性または免疫原性を減少させるＣ２ドメイン中の特定のアミノ酸置換は開示または示唆されていない。
【００１５】
Ｌｏｌｌａｒに対する米国特許第５，８５９，２０４号明細書には、ヒト因子ＶＩＩＩの４８４−５０９領域におけるアミノ酸置換が記載されている。より詳しくは、米国特許第５，８５９，２０４号明細書において、ヒトタンパク質に関係して位置４８５、４８７、４８８、４８９、４９２、４９５、５０１または５０８においてアミノ酸置換を有する修飾された因子ＶＩＩＩが教示されている。米国特許第５，８５９，２０４号明細書において、野生型因子ＶＩＩＩまたは対応する組換え因子ＶＩＩＩに比較して、抗原性または免疫原性を減少させるＣ２ドメイン中の特定のアミノ酸置換は開示または示唆されていない。
【００１６】
Ｌｏｌｌａｒに対する米国特許第５，８５９，２０４号明細書には、ヒトおよび他の非ヒト因子ＶＩＩＩサブユニットまたはドメインの単離および組換えにより産生された、ハイブリッド前凝固因子ＶＩＩＩが開示されている。
Ｌｏｌｌａｒに対する米国特許第５，７４４，４４６号明細書には、Ａ２ドメイン中にアミノ酸置換を有するハイブリッド因子ＶＩＩＩが記載されている。
【００１７】
Ｌｏｌｌａｒに対する米国特許第５，６６３，０６０号明細書には、非ヒトおよびヒト重鎖および軽鎖サブユニットの組み合わせから構成されたハイブリッド因子ＶＩＩＩが記載されている。米国特許第５，５８３，２０９号明細書には、米国特許第５，６６３，０６０号明細書におけるハイブリッド因子ＶＩＩＩをコードする核酸が記載されている。
米国特許第５，３６４，７７１号明細書には、ヒト重鎖および軽鎖サブユニットのヒトおよびブタの組み合わせから構成された、精製されたハイブリッド因子ＶＩＩＩが記載されている。また、ヒトＡ２ドメインと交換されたブタＡ２ドメインを有するヒト因子ＶＩＩＩが開示されている。
【００１８】
米国特許第６，１８０，３７１号、第５，８８，９７４号、第５，５８９，２０４号、第５，７４４，４４６号、第５，６６３，０６０号、第５，５８３，２０９号、および第５，３６４，７７１号明細書 （それらのすべては引用することによって本明細書の一部とされる） には、野生型因子ＶＩＩＩまたは対応する組換え因子ＶＩＩＩに比較して、抗原性または免疫原性が減少した因子ＶＩＩＩのＣ２ドメイン中の置換は開示されていないか、あるいは特定のアミノ酸置換は開示または示唆されていない。世界中の研究所において数年の集中的研究にかかわらず、本明細書において詳細に説明する因子ＶＩＩＩのＣ２ドメインに関する本発明は、どこかにおいて記載または示唆されてきていないと思われる。
【００１９】
Ｐｒａｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９９， “Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ａｔ １．５ Å ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，” Ｎａｔｕｒｅ：４０２：４３９−４４２） は、１．５ Å分解能におけるヒト因子ＶＩＩＩのＣ２ドメインの結晶構造を報告した。Ｐｒａｔｔ ｅｔ ａｌ． は、因子ＶＩＩＩのＣ２領域中の突然変異が出血性障害に導く理由を構造により部分的に説明されることを報告した。事実、Ｃ２領域中の２１残基は血友病Ａ患者における有害な点突然変異部位であることが報告された。例えば、Ｖ２２２３は点突然変異が起こる位置であり、そして出血性障害に関係付けられる。こうして、当業者はＶ２２２３が修飾された因子ＶＩＩＩに治療的活性を提供する置換の合理的候補であることを期待しないであろう。事実、Ｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ． は、Ｃ２結合抗体インヒビターがリン脂質およびフォン・ウィルブランド因子の結合に関して因子ＶＩＩＩを妨害することを報告している。
【００２０】
こうして、Ｐｒａｔｔ ｅｔ ａｌ． が教示するように、Ｃ２インヒビター、すなわち、血友病Ａの個体におけるいくつかの出血性障害に関するインヒビターは、リン脂質およびフォン・ウィルブランド因子に対するＣ２ドメインの結合を妨害する。この結論をＭ２１９９、Ｆ２２００、Ｌ２２５１、Ｌ２２５２、Ｖ２２２３、およびＲ２２２０がタンパク質−リン脂質界面に出現するという彼らの決定と組み合わせると、これらの残基の突然変異がリン脂質および／またはフォン・ウィルブランド因子を変更させると同時に、それに関連して出血性障害を増加させることが示唆される。これらの研究から、どのアミノ酸残基および対応する置換が因子ＶＩＩＩ分子の改良に導くかどうかは明らかではない。
【００２１】
予期せざることには、因子ＶＩＩＩのＣ２ドメインについて最近入手可能なＸ線構造において同定された３つの疎水性あし （ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｆｅｅｔ） における突然変異は、阻害性抗体に対する結合を減少させ、性質を改良させ、および／または免疫原性を減少させることを本発明者らは発見した。
したがって、本発明の他の目的は、因子ＶＩＩＩを欠如するか、あるいは因子ＶＩＩＩに対するインヒビターを有する患者における血友病を補正する因子ＶＩＩＩを提供することである。
【００２２】
本発明の他の目的は、血友病を治療する方法を提供することである。
本発明のなお他の目的は、選択したｐＨおよび生理学的濃度において安定である因子ＶＩＩＩを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ヒト因子ＶＩＩＩより大きい凝固活性を有する因子ＶＩＩＩを提供することである。
【００２３】
発明の要約
本発明は、一般に、組換え哺乳動物因子ＶＩＩＩを含んでなる組成物に関する。本発明の組成物は、凝固活性を有する、単離され、精製された組換え哺乳動物因子ＶＩＩＩ分子を含んでなり、ここで組換え因子ＶＩＩＩはそれらが由来したタンパク質または他の因子ＶＩＩＩ調製物に比較して、抗原性を減少させるＣ２ドメイン中のアミノ酸置換を有する。また、本発明の新規な組成物をコードするＤＮＡ配列ならびに新規な組成物を製造する方法が提供される。また、因子ＶＩＩＩを使用する治療を必要とする患者を治療する方法もまた本発明の範囲内に入る。
【００２４】
本発明の第１態様は、Ｃ２ドメイン中の１または２以上のアミノ酸置換を有する組換え哺乳動物因子ＶＩＩＩを含んでなる新規な組成物を提供する。修飾された組換え因子ＶＩＩＩのＣ２ドメイン中の１または２以上のアミノ酸残基は、それらが由来したタンパク質または他の入手可能な因子ＶＩＩＩ調製物に比較して、阻害性抗体の抗凝固活性を減少させるＣ２ドメイン中のアミノ酸置換を有する。本発明の新規な組成物は凝固活性を有し、阻害性抗体に対する結合が減少している。リン脂質膜および／または阻害性抗体に対するｆＶＩＩＩの結合に参加する残基における置換は好ましい。
【００２５】
ヒト因子ＶＩＩＩに対して相同的である位置において好ましい置換は、Ｍｅｔ２１９９、Ｐｈｅ２２００、Ｖａｌ２２２３、Ｌｅｕ２２５１、およびＬｅｕ２２５２を包含するが、これらに限定されない。本発明の新規な組成物は、単一突然変異、二重突然変異、三重突然変異、または四重突然変異であることができる。本発明のアミノ酸置換の例は、Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ、Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ、Ｌｅｕ２２５２Ｐｈｅ、Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ／Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ、Ｖａｌ２２２３Ａｌａ／Ｌｙｓ２２２７Ｇｌｕ、Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ／Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ／Ｖａｌ２２２３Ａｌａ／Ｌｙｓ２２２７Ｇｌｕを包含するが、これらに限定されず、それらのすべてはヒト因子ＶＩＩＩナンバリング系に対して言及され、ここでアミノ酸番号１は成熟因子ＶＩＩＩのアミノ末端アラニンである。組換えブタまたはヒト因子ＶＩＩＩは好ましい。
【００２６】
本発明の第２態様は、Ｃ２ドメイン中に１または２以上のアミノ酸置換を有する組換え因子ＶＩＩＩを含んでなる新規なハイブリッド因子ＶＩＩＩを提供する。この態様の新規な組成物は、Ｃ２ドメイン中にアミノ酸置換を有するハイブリッド因子ＶＩＩＩを調製することによって構築される。因子ＶＩＩＩの他のドメインは、種々の哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ブタ、ラット、およびイヌおよびその他に由来することができる。この態様の新規な組成物は、凝固活性を有し、阻害性抗体に対する結合が減少している。
【００２７】
突然変異させて本発明の新規な組成物を提供することができるアミノ酸位置の例は、Ｍｅｔ２１９９、Ｐｈｅ２２００、Ｖａｌ２２２３、Ｌｅｕ２２５１、およびＬｅｕ２２５２を包含するが、これらに限定されず、それらのすべてはヒト因子ＶＩＩＩに対して言及される。この態様内のアミノ酸置換の例は、Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ、Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ、Ｌｅｕ２２５２Ｐｈｅ、Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ／Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ、Ｖａｌ２２２３Ａｌａ／Ｌｙｓ２２２７Ｇｌｕ、Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ／Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ／Ｖａｌ２２２３Ａｌａ／Ｌｙｓ２２２７Ｇｌｕを包含するが、これらに限定されず、それらのすべてはヒト因子ＶＩＩＩに対して言及される。
【００２８】
本発明の他の態様は、本発明の新規な組成物をコードする配列を含んでなるＤＮＡ配列を提供する。本発明のなお他の態様は、本発明の新規な組成物を製造する方法を提供する。
本発明は、また、因子ＶＩＩＩ分子の免疫原性を減少させる方法ならびにこの方法により製造された免疫原性が減少した組換え因子ＶＩＩＩを提供する。特に、Ｃ２ドメイン中に置換を有する免疫原性が減少した修飾された組換え因子ＶＩＩＩ分子およびこのような分子を製造する方法が記載される。
また、医薬組成物および組換え因子ＶＩＩＩおよびそのハイブリッドバージョンを投与することを含んでなる因子ＶＩＩＩを欠如する患者を治療する方法が提供される。
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、一般に、組換え哺乳動物因子ＶＩＩＩを含んでなる組成物に関する。本発明の組成物は、凝固活性を有する、単離し、精製された組換え哺乳動物因子ＶＩＩＩを含んでなる。最近入手可能なＸ線構造において同定された３つの疎水性あし中の因子ＶＩＩＩのＣ２ドメインにおける突然変異は、それらが由来するタンパク質および／または他の因子ＩＸ調製物に比較して、突然変異体の阻害性抗体の結合を減少させることが驚くべきことには発見された。こうして、本発明の新規な組成物は、それらが由来するタンパク質に比較して抗原性を減少させるアミノ酸置換をＣ２ドメイン中に有する組換え因子ＶＩＩＩを含んでなる。
【００３０】
さらに、本発明は、また、他の入手可能な因子ＶＩＩＩ調製物に比較して抗原性を減少させるアミノ酸置換をＣ２ドメイン中に有する組換え因子ＶＩＩＩを提供する。本発明の関係する態様は、因子ＶＩＩＩの治療を必要とする患者を治療する方法、本発明の新規な組換え因子ＶＩＩＩ組成物を製造する方法、新規な組換え因子ＶＩＩＩタンパク質のコーディング配列を含んでなるＤＮＡ配列、および新規な因子ＶＩＩＩタンパク質を含んでなる医薬組成物を提供する。
【００３１】
さらに、本発明は、活性な組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩ分子またはそれらのフラグメント、これらのハイブリッドをコードする核酸配列、それらを調製し、単離する方法、およびそれらを特性決定する方法を提供する。これらのハイブリッドは、ヒト／動物、動物／動物、または他のこのようなハイブリッド因子ＶＩＩＩ分子を含んでなり、そして他種の因子ＶＩＩＩの対応するアミノ酸配列 （またはアミノ酸） を置換する１種の因子ＶＩＩＩの１または２以上のユニークアミノ酸を包含する、Ｃ２ドメイン中の少なくとも１つの特定のアミノ酸配列をさらに含んでなるか、あるいはヒト、動物、またはハイブリッド因子ＶＩＩＩ中の特定のアミノ酸配列を置換する因子ＶＩＩＩに対する未知の配列同一性を有する１または２以上のアミノ酸を包含する、Ｃ２ドメイン中の少なくとも１つの配列を含んでなる。生ずる組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩは、ヒトまたはブタ因子ＶＩＩＩに比較して、因子ＶＩＩＩ阻害性抗体に対する免疫原性が減少しているか、あるいはこのような免疫原性をもたない。
【００３２】
「対応する」核酸またはアミノ酸または配列は、本明細書において使用するとき、他種の因子ＶＩＩＩ分子中の部位と同一の構造および／または機能を有する因子ＶＩＩＩ分子またはそのフラグメント中の部位として存在するものであるが、核酸またはアミノ酸番号は異なることができる。他の因子ＶＩＩＩ配列「に対応する」ＤＮＡ配列は、このような配列に実質的に対応し、ストリンジェント条件下に、表示する配列番号の配列に対してハイブリダイゼーションする。他の因子ＶＩＩＩ配列「に対応する」ＤＮＡ配列は、また、因子ＶＩＩＩまたはそのフラグメントの発現を生じ、遺伝暗号の重複性を除外して、表示する配列番号の配列に対してハイブリダイゼーションする配列を包含する。
【００３３】
「ユニーク」アミノ酸残基または配列は、本明細書において使用するとき、他種の因子ＶＩＩＩ分子中の相同的残基または配列と異なる１種の因子ＶＩＩＩ分子中のアミノ酸配列または残基を意味する。
【００３４】
「比活性」は、本明細書において使用するとき、ヒト因子ＶＩＩＩ欠乏血漿の凝固欠如を補正する活性を意味する。比活性は標準的アッセイにおいて凝固活性単位／ｍｇの全因子ＶＩＩＩタンパク質で測定し、ここでヒト因子ＶＩＩＩ欠乏血漿の凝固時間を正常のヒト血漿のそれと比較する。因子ＶＩＩＩ活性の１単位は１ ｍｌの正常のヒト血漿中に存在する活性である。アッセイにおいて、凝固時間が短いほど、アッセイする因子ＶＩＩＩの活性はより大きい。ブタ因子ＶＩＩＩはヒト因子ＶＩＩＩアッセイにおいて凝固活性を有する。
【００３５】
「発現」は遺伝情報を利用して産物が産生されるとき起こるプロセスの組である。ブタ因子ＶＩＩＩのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを哺乳動物宿主細胞内で「発現」させて、修飾された因子ＶＩＩＩタンパク質を生じさせることができる。所定のＤＮＡ配列を発現させる物質、遺伝的構造、宿主細胞および条件はこの分野においてよく知られており、そして発現の時間および量、ならびに発現されたタンパク質の細胞内または細胞外の位置にに影響を与えるように操作することができる。
【００３６】
例えば、ブタ因子ＶＩＩＩをコードするＤＮＡの５′末端 （コンベンションにより５′末端はタンパク質のＮＨ_２末端をコードする末端である） におけるシグナルペプチドをコードするＤＮＡを含めることによって、発現されたタンパク質は宿主細胞の内部から培地の中に輸出されるようになる。ブタ因子ＶＩＩＩをコードするＤＮＡと組み合わせてシグナルペプチドをコードするＤＮＡを準備することは有利である。なぜなら、発現された因子ＶＩＩＩは培地の中に輸出され、これにより精製プロセスは簡素化されるからである。好ましいシグナルペプチドは 哺乳動物因子ＶＩＩＩシグナルペプチドである。
【００３７】
因子ＶＩＩＩ ｃＤＮＡヌクレオチドおよび予測されたアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および２に示す。「ドメイン」配列ＮＨ_２−Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２−ＣＯＯＨを規定する内部の配列相同性を有する、ほぼ３００ ｋＤａの一本鎖調製として、因子ＶＩＩＩを合成する。因子ＶＩＩＩ分子において、「ドメイン」は、本明細書において使用するとき、内部のアミノ酸配列同一性およびトロンビンによるタンパク質分解的切断部位による規定されるアミノ酸の連続的配列である。特記しない限り、配列をヒトアミノ酸配列 （配列番号２） と整合させるとき、因子ＶＩＩＩドメインは下記のアミノ酸残基を含む：Ａ１、残基Ａｌａ１−Ａｒｇ３７２；Ａ２、残基Ｓｅｒ３７３−Ａｒｇ７４０；Ｂ、残基Ｓｅｒ７４１−Ａｒｇ１６４８；Ａ３、残基Ｓｅｒ１６９０−Ｉｌｅ２０３２；Ｃ１、残基Ａｒｇ２０３３−Ａｓｎ２１７２；Ｃ２、残基Ｓｅｒ２１７３−Ｔｙｒ２３３２。Ａ３−Ｃ１−Ｃ２配列はＳｅｒ１６９０−Ｔｙｒ２３３２を含む。
【００３８】
残りのセグメント、残基Ｇｌｕ１６４９−Ａｒｇ１６８９は、通常因子ＶＩＩＩ軽鎖活性化ペプチドとして言及される。因子ＶＩＩＩをフォン・ウィルブランド因子から解離させて、前凝固機能を有する因子ＶＩＩＩａを形成する、トロンビンまたは因子Ｘａにより、因子ＶＩＩＩはタンパク質分解的に活性化される。因子ＶＩＩＩａの生物学的機能は、因子Ｘ活性化に対する因子ＩＸａの触媒的機能を数桁増加させることである。トロンビン活性化因子ＶＩＩＩａは１６０ ｋＤａのＡ１／Ａ２／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ヘテロマーであり、これは血小板または単球上で因子ＩＸａおよび因子Ｘと複合体を形成する。「部分的ドメイン」は、本明細書において使用するとき、ドメインの一部分を形成するアミノ酸の連続的配列である。
【００３９】
ヒトまたは動物の因子ＶＩＩＩの「サブユニット」は、本明細書において使用するとき、タンパク質の重鎖および軽鎖である。因子ＶＩＩＩの重鎖は３つのドメイン、Ａ１、Ａ２およびＢを含有する。因子ＶＩＩＩの軽鎖は３つのドメイン、Ａ３、Ｃ１およびＣ２を含有する。
【００４０】
用語「エピトープ」、「抗原部位」、および 「抗原決定基」 は、本明細書において使用するとき、同義的に使用され、抗体により特異的に認識されるヒト、または動物の因子ＶＩＩＩまたはそのフラグメントの一部分として定義される。それは任意の数のアミノ酸残基から成ることができ、タンパク質の一次、二次、または三次構造に依存することがある。
【００４１】
用語 「免疫原性部位」 は、本明細書において使用するとき、日常的プロトコル、例えば、本明細書に記載する、イムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、またはベセスダアッセイ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ ａｓｓａｙ） により測定して、ヒトまたは動物において、因子ＶＩＩＩまたはそのフラグメントに対する抗体の産生を特異的に誘発する、ヒトまたは動物の因子ＶＩＩＩまたはそのフラグメントとして定義される。それは任意の数のアミノ酸残基から成ることができ、タンパク質の一次、二次、または三次構造に依存することがある。ある態様において、ハイブリッドまたはハイブリッド同等物の因子ＶＩＩＩまたはそのフラグメントは、動物またはヒトにおいて非免疫原性であるか、あるいはヒトまたはブタの因子ＶＩＩＩよりも低い免疫原性である。
【００４２】
「因子ＶＩＩＩ欠乏症」は、本明細書において使用するとき、欠陥のある因子ＶＩＩＩの産生により、因子ＶＩＩＩの不適切な産生または非産生により、またはインヒビターによる因子ＶＩＩＩの部分的または完全な阻害により引き起こされた、凝固活性の欠乏症を包含する。血友病Ａは、Ｘ結合遺伝子の欠陥およびそれがコードする因子ＶＩＩＩタンパク質の非存在または欠乏から生ずる因子ＶＩＩＩ欠乏症の１つの型である。
【００４３】
本明細書において使用するとき、「診断アッセイ」は、ある方法において抗原−抗体の相互作用を利用して、被験試料の中に存在する特定の抗体を検出しおよび／または定量して医学的療法の選択を促進するアッセイを包含する。この分野において知られている多数のアッセイが存在する。本明細書において使用するとき、ヒト、ブタまたは修飾されたブタ因子ＶＩＩＩまたはそのフラグメントおよびそれらから発現されたタンパク質は、全体または一部分において、その他の点で既知のアッセイにおいて対応する試薬と置換することができ、これにより変更されたアッセイを使用して因子ＶＩＩＩに対する抗体を検出および／または定量することができる。
【００４４】
これらの試薬、因子ＶＩＩＩ ＤＮＡまたはそのフラグメントまたはそれらから発現されたタンパク質を使用して、ヒトまたは動物の因子ＶＩＩＩに対する抗体を検出する既知のアッセイを変更することができる。このようなアッセイは、ＥＬＩＳＡ、免疫拡散アッセイ、およびイムノブロットを包含するが、これらに限定されない。これらのアッセイを実施するために適当な方法はこの分野において知られている。本明細書において使用するとき、タンパク質の少なくとも１つのエピトープを含む因子ＶＩＩＩまたはそのフラグメントは診断剤として使用することができる。ヒト、ブタまたは修飾されたブタ因子ＶＩＩＩまたはそのフラグメントを使用できる他のアッセイの例は、ベセスダアッセイおよび抗凝固アッセイを包含する。
【００４５】
用語「タンパク質、例えば、ブタ因子ＶＩＩＩをコードするＤＮＡ」は、遺伝暗号の既知の関係に従い、タンパク質、例えば、ブタ因子ＶＩＩＩのアミノ酸配列について宿主細胞に対するコーディング情報を含むヌクレオチド配列を有する、ポリデオキシ核酸を意味する。
【００４６】
ヒトまたは動物の因子ＶＩＩＩまたは修飾された因子ＶＩＩＩをコードするＤＮＡの「発現産物」は、適当な宿主細胞中の参照ＤＮＡの発現から得られた産物であり、参照ＤＮＡによりコードされるタンパク質の翻訳前または翻訳後の修飾のこのような特徴、例えば、グリコシル化、タンパク質分解的切断およびその他を包む。このような修飾は起こることができ、宿主細胞の型および他の因子に依存して多少異なることがありそして前凝固活性を保持する、産物の分子イソ型を生ずることがあることはこの分野において知られている。例えば、下記の文献を参照のこと：Ｌｉｎｄ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３２：１９２７ （１９９５）、引用することによって本明細書の一部とされる。
【００４７】
「発現ベクター」はＤＮＡ要素であり、これはしばしば環状構造であり、所望の宿主細胞中で自律的に複製するか、あるいは宿主細胞ゲノムの中に組込まれる能力を有し、また、適切な部位においてかつ適切な向きでベクター配列の中に挿入されたコーディングＤＮＡの発現を可能とする、ある種のよく知られている特徴を有する。このような特徴は、コーディングＤＮＡの転写開始を指令する１または２以上のプロモーター配列、および他のＤＮＡ要素、例えば、エンハンサー、ポリアデニル化部位およびその他を包含するが、これらに限定されず、これらのすべてはこの分野においてよく知られている。
【００４８】
用語「発現ベクター」は、その配列内に挿入された発現すべきＤＮＡコーディング配列を有するベクター、および挿入部位の中に挿入されたコーディングＤＮＡを発現する働きをすることができるように、挿入部位に関して配置された、必要な発現コントロール要素を有するベクターの両方を意味するために使用され、これらのすべてはこの分野においてよく知られている。こうして、例えば、プロモーターを欠如するベクターは、コーディングＤＮＡと組み合わせてプロモーターを挿入することによって、発現ベクターとなる。
【００４９】
阻害性抗体の結合を減少させる因子 ＶＩＩＩ 中の突然変異の発見
最近、ヒトｆＶＩＩＩ Ｃ２ドメインの１．５ Å Ｘ線構造が報告された （Ｐｒａｔｔ， Ｋ． Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９９９， “Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ａｔ １．５ Å ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，” Ｎａｔｕｒｅ ４０２：４３９−４４２）。この構造を検査すると、Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ／Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ、Ｖａｌ２２２３、およびＬｅｕ２２５１／Ｌｅｕ２２５２から成る３つの溶媒暴露された疎水性「あし （ｆｅｅｔ） 」が明らかにされた。Ａｒｇ２２１３、Ａｒｇ２２２０、Ｌｙｓ２２２７、およびＬｙｓ２２４９を包含する、正に帯電した残基のリングがこれらの残基を取り囲む。このモチーフから示唆されるように、膜の結合は膜二重層の中への疎水性あしの挿入から成り、負に帯電したリン脂質との静電相互作用することによって安定化される。
【００５０】
大部分のｆＶＩＩＩインヒビターはブタｆＶＩＩＩとそれほど交差反応しない。この観測により、ヒトｆＶＩＩＩ Ｃ２ドメイン中にブタ置換を含有する１系列の構築物を使用して、Ｃ２エピトープの主要な決定因子は残基Ｇｌｕ２１８１−Ｖａｌ２２４３にマッピングされた （Ｈｅａｌｅｙ， Ｆ． Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， “Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｇｌｕ２１８１−Ｖａｌ２２４３ ｃｏｎｔａｉｎ ａ ｍａｊｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ，” Ｂｌｏｏｄ ９２：３７０１−３７０９）。本発明において、ヒトｆＶＩＩＩ中の残基Ｍｅｔ２１９９、Ｐｈｅ２２００、Ｖａｌ２２２３、Ｌｙｓ２２２７、および／またはＬｅｕ２２５２に対して相同的である、ブタ、ネズミ、またはイヌｆＶＩＩＩ中の残基を１系列の組換えｆＶＩＩＩ分子をつくるために使用した。
【００５１】
第１図は、ヒト、ブタ、ネズミおよびイヌのｆＶＩＩＩ Ｃ２ドメインの整合を示す。５つの提案された疎水性リン脂質結合性残基のうちの４つにおいて、ヒトｆＶＩＩＩと異なる１種が存在する：Ｍｅｔ２１９９ → Ｉｌｅ （ブタ）、Ｐｈｅ２２００ → Ｌｅｕ （イヌ）、Ｖａｌ２２２３ → Ａｌａ （イヌ）、およびＬｅｕ２２５２ → Ｐｈｅ （ネズミ）。４つの提案された塩基性残基のうちの１つにおいてのみ種の差が存在する、Ｌｙｓ２２２７ → Ｇｌｕ （ブタ）。したがって、ヒトＢ―ドメインレスｆＶＩＩＩ中のＭｅｔ２１９９Ｉｌｅ、Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ、Ｖａｌ２２２３Ａｌａ、Ｖａｌ２２２３Ａｌａ、Ｌｅｕ２２５２Ｐｈｅ、およびＬｙｓ２２２７Ｇｌｕの単一突然変異を作った。さらに、２つの二重突然変異、Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ／Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ （Ｃ２ Ｄ１と表示する） およびＶａｌ２２２３Ａｌａ／Ｌｅｕ２２５２Ｐｈｅ （Ｃ２ Ｄ２）、および四重突然変異、Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ／Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ／Ｖａｌ２２２３Ａｌａ／Ｌｅｕ２２５２Ｐｈｅ （Ｃ２ Ｑ） を作った。ｆＶＩＩＩのＸ線構造中の突然変異した残基の位置を第２図に示す。Ｍｅｔ２１９９／Ｐｈｅ２２００およびＬｅｕ２２５１／Ｌｅｕ２２５２は２つのヘアピンループから突起する。Ｖａｌ２２２３は隣接するループから突起し、Ｌｙｓ２２２７付近に存在する。
【００５２】
突然変異体はベイビーハムスター腎由来細胞系統から無血清培地中で安定に発現され、次いで部分的に精製された。ＥＬＩＳＡアッセイに基づくハイブリッドの特異的凝固活性は「材料および方法」に記載されているＨＢ−のそれに等しいか、あるいはそれより大きく、それらが抗原性の研究のために適当であることが示された。「材料および方法」に記載されているベセスダアッセイを使用して、突然変異体とＣ２特異的ｆＶＩＩＩインヒビターとの相互作用を測定した。結果をヒトＢ−ドメインレスｆＶＩＩＩ （ＨＢ−） およびハイブリッドヒト／ブタｆＶＩＩＩ分子、ＨＰ２０ （これは全ブタＣ２ドメインの置換を除外してヒトである） と比較した （Ｈｅａｌｅｙ， Ｊ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， “Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｇｌｕ２１８１−Ｖａｌ２２４３ ｃｏｎｔａｉｎ ａ ｍａｊｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ，” Ｂｌｏｏｄ ９２：３７０１−３７０９）。
【００５３】
大部分のｆＶＩＩＩインヒビターはＣ２ドメインの内側および外側の両方のエピトープに対して向けられたポリクローナルＩｇＧ集団である （Ｐｒｅｓｃｏｔｔ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ， １９９７；Ｆｕｌｃｈｅｒ， Ｃ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９８５， “Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｔｏ ｔｗｏ ｐｏｌｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：７７２８−７７３２）。しかしながら、いくつかのインヒビターはＣ２特異的であり、Ｃ２ドメインの中への非ヒト配列の置換の効果を評価するために有用である（Ｈｅａｌｅｙ， Ｊ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， “Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｇｌｕ２１８１−Ｖａｌ２２４３ ｃｏｎｔａｉｎ ａ ｍａｊｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ，” Ｂｌｏｏｄ ９２：３７０１−３７０９）。Ｍｅｔ２１９９、Ｐｈｅ２２００、および／またはＬｅｕ２２５２における突然変異のための抗原性の減少が観測されたが、個々のインヒビターはそれらが認識する残基において変化した。
【００５４】
驚くべきことには、最も顕著にはＶａｌ２２２３Ａｌａ突然変異体を使用して、ベセスダ力価の有意な増加がしばしば存在した。二重突然変異Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ／Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕはすべての５つの抗体に対して低い抗原性を示し、Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅおよび／またはＰｈｅ２２００Ｌｅｕの抗原性が常に減少するという事実と一致した。パラドックス的に、二重突然変異Ｖａｌ２２２３Ａｌａ／Ｌｙｓ２２２７Ｇｌｕは３つの場合 （ＡＡ、ＡＪ、およびＨＲ） においてであるがすべての５つのポリクローナル抗体に対する抗原性の減少を表示し、対応する個々の突然変異は未変化または増加した抗原性を表示した。四重突然変異Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ／Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ／Ｖａｌ２２２３Ａｌａ／Ｌｙｓ２２２７Ｇｌｕの抗原性は、単一または二重の突然変異に等しいか、あるいはそれより大きかった。ＨＰ２０の抗原性はすべての突然変異のうちで最低であった。これは、この研究において突然変異Ｍｅｔ２１９９、Ｐｈｅ２２００、およびＬｅｕ２２５２に加えて、抗原性残基の存在と一致した。
【００５５】
ＨＢ−および突然変異体ｆＶＩＩＩ分子に対する抗体ＢＯ２Ｃ１１のベセスダ力価（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ， Ｍ． Ｇ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， “Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ｓｔｕｄｙ ｗｉｔｈ ａｎ ＩｇＧ４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，” Ｂｌｏｏｄ ９２：４９６−５０６） およびＮＭＣ ＶＩＩＩ−５ （Ｓｈｉｍａ， Ｍ． Ｇ． ｅｔ ａｌ．， １９９３， “Ａ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ａ ｈｕｍａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｌｌｏａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｂｉｎｇｉｎｇ ｔｏ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｏ ｐｈｏｓｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ，” Ｔｈｒｏｍｂｏ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ６９：２４０−２４６） をそれぞれ第４図および第５図に示す。
【００５６】
ＢＯ２Ｃ１１は、血友病Ａインヒビター患者の形質転換されたＢ細胞に由来する、Ｃ２特異的ヒトＩｇＧ４κモノクローナル抗体である。それは今日までクローニングされた唯一のＣ２特異的ヒト抗体である。ＢＯ２Ｃ１１およびＮＭＣ ＶＩＩＩ−５の両方はｆＶＩＩＩのＣ２ドメインを認識し、ｖＷｆおよびリン脂質に対するｆＶＩＩＩの結合を阻害する。ＮＭＣ ＶＩＩＩ−５はｆＶＩＩＩに対するヒトポリクローナルインヒビターの結合について競合することができる。ＢＯ２Ｃ１１およびＮＭＣ ＶＩＩＩ−５を使用した結果は、ポリクローナル抗体ＨＲを使用して得られた結果に類似した （第３図）。すべての３つの抗体において、Ｐｈｅ２２００は抗原性であるが、Ｖａｌ２２２３およびＬｙｓ２２２７は抗原性を減少するように見える。
【００５７】
Ｍｅｔ２１９９、Ｐｈｅ２２００、および／またはＬｅｕ２２５２における突然変異は７つの試験した抗体における抗原性の減少に関連し （表１）、これはしばしば顕著であった （第３図〜第５図）。これはＭｅｔ２１９９／Ｐｈｅ２２００およびＬｅｕ２２５１／Ｌｅｕ２２５２ループが膜の結合に参加するという仮説と一致する。すべての７つのインヒビターはＭｅｔ２１９９／Ｐｈｅ２２００ループを認識したが、Ｍｅｔ２１９９およびＰｈｅ２２００における突然変異の効果はしばしば異なった。例えば、抗体ＡＪに対してＭｅｔ２１９９Ｉｌｅは抗原性の減少を表示し、Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕは抗原性の増加表示したが、ＢＯ２Ｃ１１についてはこれと反対であった。こうして、ＡＪおよびＢＯ２Ｃ１１のアミノ酸特異性は変化したが、両方はＭｅｔ２１９９／Ｐｈｅ２２００ループを認識する。
【００５８】
従来、１系列の組換えハイブリッドヒト／ブタｆＶＩＩＩ分子を使用して、１または２以上のＣ２エピトープの主要な決定因子は残基Ｇｌｕ２１８１−Ｖａｌ２２４３により境界されるセグメントにマッピングされた （Ｈｅａｌｅｙ， Ｊ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， “Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｇｌｕ２１８１−Ｖａｌ２２４３ ｃｏｎｔａｉｎ ａ ｍａｊｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ，” Ｂｌｏｏｄ ９２：３７０１−３７０９）。Ｍｅｔ２１９９／Ｐｈｅ２２００ループはこの領域内に含有されている。
【００５９】
また、ブタｆＶＩＩＩは残基２２５１および２２５２にロイシンを含有するので、この分析においてＬｅｕ２２５１／Ｌｅｕ２２５２ループを含めず、また排除しなかった。ヒトｆＶＩＩＩの中への全ブタＣ２ドメインの置換は、ＨＰ２０と表示する分子を産生し、現在の研究においてなされたいっそう制限された置換よりも低い抗原性に関連する （第３図〜第５図）。これにより示されるように、Ｃ２インヒビターによる結合に寄与する残基がＭｅｔ２１９９／Ｐｈｅ２２００およびＬｅｕ２２５１／Ｌｅｕ２２５２ループの外側に存在する。
【００６０】
最近、リン脂質非存在における因子Ｖ Ｃ２ドメインの２つのコンフォメーションのＸ線構造が報告された（Ｍａｃｅｄｏ−Ｒｉｂｅｉｒｏ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， １９９９， “Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｖ，” Ｎａｔｕｒｅ ４０２：４３４−４３９）。著者らは、ｆＶＩＩＩ中のＭｅｔ２１９９およびＰｈｅ２２００に対して相同的である、位置２６および２７ （ヒト因子Ｖ Ｃ２ドメインのナンバリング） にトリプトファンを含有するループを包含するリン脂質膜結合のモデルを提案した。リン脂質膜結合におけるこのループの掛かり合いを支持する、かなりの量の証拠が存在する。
【００６１】
ＰＳに対する因子Ｖの結合をブロックする阻害性モノクローナル抗体、ＨＶ−１はこのループにマッピングされる （Ｋｉｍ， Ｓ． Ｗ． ｅｔ ａｌ．， ２０００， “Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｃ２−ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ Ｖ ｕｓｉｎｇ ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，” Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１９５１−１９５８；Ｏｒｔｅｌ， Ｔ． Ｌ． ｅｔ ａｌ．， “ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ Ｃ−ｔｙｐｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｖ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｈｉｍｅｒａｓ，” Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１５８９８−１５９０５；Ｏｒｔｅｌ， Ｔ． Ｌ． ｅｔ ａｌ．， “Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｎｔｉ−ｆａｃｔｏｒ Ｖ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｉｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒ Ｖ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ，” Ｂｌｏｏｄ ９１：４１８８−４１９６）。因子Ｖａ中のＴｒｐ２６およびＴｒｐ２７に等しい残基に対するアラニン置換は、ＰＳに対する結合の減少および凝固活性の喪失に関連する （Ｋｉｍ， Ｓ． Ｗ． ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ， ２０００， “Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｃ２−ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ Ｖ ｕｓｉｎｇ ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，” Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１９５１−１９５８）。
【００６２】
さらに、ｆＶＩＩＩ中のＬｅｕ２２５１に対して相同的である、Ｌｅｕ７９を含有するループ、および残基Ａｓｎ４１−Ａｓｎ５１を含有するループもまたＴｒｐ２６／Ｔｒｐ２７ループに対する近接性に基づいてリン脂質膜結合に参加することが提案された （Ｍａｃｅｄｏ−Ｒｉｂｅｉｒｏ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， １９９９， “Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｖ，” Ｎａｔｕｒｅ ４０２：４３４−４３９）。Ａｓｎ４１−Ａｓｎ５１ループに対して相同的であるｆＶＩＩＩセグメント、Ｈｉｓ２０７６−Ａｓｎ２０８２は、リン脂質膜結合部位として提案されなかった （Ｐｒａｔｔ， Ｋ． Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９９９， “Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ａｔ １．５ Å ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，” Ｎａｔｕｒｅ ４０２：４３９−４４２）。
【００６３】
逆に、ｆＶＩＩＩ中のＶａｌ２２２３ループに対して相同的である因子Ｖ中のループは、リン脂質膜結合に参加することが提案されなかった。現在の研究において、Ｖａｌ２２２３ＡｌａおよびＬｙｓ２２２７Ｇｌｕ突然変異は通常抗原性の増加に関係付けられた （表１）。こうして、これらの結果は、これらの残基がリン脂質膜結合に参加するという仮説を支持いない。しかしながら、それらはリン脂質に結合するが、頻繁には阻害性抗体のターゲットとされない。
【００６４】
２つの因子Ｖ Ｃ２構造は「開いた」および「閉じた」と表示する、異なるコンフォメーションを有し、これらはリン脂質膜結合部位におけるＴｒｐ２６およびＴｒｐ２７の主要な動きに関係付けられる。これらの状態は、それぞれ、リン脂質膜結合状態のオンおよびオフをスイッチすることが提案される。Ｖａｌ２２２３およびＬｙｓ２２２７に関係付けられる抗原性の減少が生ずることがある。なぜなら、これらの残基はｆＶＩＩＩにおいて低いアフィニティーの膜および抗体の結合に関係付けられる、同様な「閉じた」コンフォメーション状態を安定化するからである。次いで、Ｖａｌ２２２３ＡｌａおよびＬｙｓ２２２７Ｇｌｕ突然変異によるこの状態の緩和は高いアフィニティーの抗体結合に導くであろう。選択的に、Ｖａｌ２２２３およびＬｙｓ２２２７は、他のｆＶＩＩＩ残基 （例えば、Ｍｅｔ２１９９、Ｐｈｅ２２００、およびその他） との高いアフィニティーの接触を包含する、抗原−抗体のカギをかける相互作用を単に妨害することができる。
【００６５】
ヒトＣ２特異的モノクローナル抗体ＢＯ２Ｃ１１は、ポリクローナルインヒビターの分析を確証する異質性を有するので、ポリクローナルインヒビターと比較して重要である。ＢＯ２Ｃ１１の機能的性質はネズミモノクローナル抗体ＮＭＣ ＶＩＩＩ−５に類似する。両方の抗体はＰＳおよびｖＷｆに対するｆＶＩＩＩの結合を阻害し、ｆＶＩＩＩ−ｖＷｆ複合体の解離を促進する（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ， Ｍ． Ｇ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， “Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ｓｔｕｄｙ ｗｉｔｈ ａｎ ＩｇＧ４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，” Ｂｌｏｏｄ ９２：４９６−５０６；Ｓｈｉｍａ， Ｍ． Ｇ． ｅｔ ａｌ．， １９９３， “Ａ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ａ ｈｕｍａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｌｌｏａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｂｉｎｇｉｎｇ ｔｏ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｏ ｐｈｏｓｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ，” Ｔｈｒｏｍｂｏ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ６９：２４０−２４６）。
【００６６】
これらの結果が示すように、Ｍｅｔ２１９９ではなくＰｈｅ２２００は両方の抗体による認識されるエピトープの重要な部分である （第４図および第５図）。しかしながら、ＮＭＣ ＶＩＩＩ−５はＬｅｕ２２５２を認識するが、ＢＯ２Ｃ１１は認識しない。Ｖａｌ２２２３およびＬｙｓ２２２７は両方の抗体に関して抗原性を減少させる。こうして、ＢＯ２Ｃ１１およびＮＭＣ ＶＩＩＩ−５はオーバーラッピングを認識するが、同一のエピトープではないように見える。
【００６７】
低温殺菌ｆＶＩＩＩ産物、ＣＰＳ−Ａ、に対する暴露から生じたインヒビター「エピデミック」の一部分である血友病Ａ患者からＲｖＲ抗体を得た （Ｓｗａｍｏｔｏ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， “Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ａ ｈｅａｔ ｐａｓｔｅｕｒｉｚｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ， ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ， ＣＰＳ−Ｐ， ｉｎ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，” Ｔｈｒｏｍｂｏ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ７９：６２−６８）。
【００６８】
１９９０年および１９９１年において、幾人かの前に治療されたインヒビターをもたない患者は、オランダ国およびベルギー国においてこの産物に対して暴露後、Ｃ２特異的抗体を速やかに発生させた。ＲｖＲ抗体はＰＳおよびｖＷｆの両方に対するｆＶＩＩＩの結合をブロックする （Ｓｗａｍｏｔｏ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ， １９９８）。ＲｖＲエピトープは大部分のＣ２インヒビターにより認識されるｆＶＩＩＩ Ｃ２ドメインのＮ末端のＧｌｕ２１８１−Ｖａｌ２２４３領域にマッピングされる （Ｈｅａｌｅｙ， Ｊ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， “Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｇｌｕ２１８１−Ｖａｌ２２４３ ｃｏｎｔａｉｎ ａ ｍａｊｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ，” Ｂｌｏｏｄ ９２：３７０１−３７０９）。
【００６９】
現在の研究における高い分解能のマッピングにより、ＲｖＲは主としてＭｅｔ２１９９／Ｐｈｅ２２００およびＬｅｕ２２５１／Ｌｅｕ２２５２ループを認識する典型的なＣ２インヒビターであることが示される。こうして、ＣＰＳ−Ａに関係付けられる免疫原性はネオペプチドの発生よりむしろ正常の免疫優性エピトープの免疫認識の増強のためであるように見える。
【００７０】
方法の一般的説明
米国特許第５，３６４，７７１号明細書には、凝固活性を有するハイブリッドヒト／ブタ因子ＶＩＩＩ分子の発見が記載されており、ここでヒトまたはブタの因子ＶＩＩＩ分子の要素は他種の因子ＶＩＩＩ分子の対応する要素を置換している。米国特許第５，６６３，０６０号明細書には、前凝固ハイブリッドヒト／動物およびハイブリッド等価因子ＶＩＩＩ分子が記載されており、ここで１種の因子ＶＩＩＩ分子の要素は他種の因子ＶＩＩＩ分子の対応する要素を置換している。
【００７１】
現在の情報はＢドメインが阻害性エピトープをもたず、因子ＶＩＩＩ機能に対する既知の作用をもたないので、ある態様において、Ｂドメインは本明細書に記載する方法により調製された活性ハイブリッドまたはハイブリッド等価因子ＶＩＩＩ分子またはそれらのフラグメント （「Ｂ （−） 因子ＶＩＩＩ」） において完全にまたは部分的に欠失されている。
【００７２】
ヒト因子ＶＩＩＩ遺伝子は、下記の文献において報告されているように、単離され、哺乳動物細胞中で発現され：Ｔｏｏｌｅ， Ｊ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３４２−３４７ （Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３２６−３３０ （Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；Ｗｏｏｄ， Ｗ． Ｉ． ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３３０−３３７ （Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）； Ｖｅｈａｒ， Ｇ． Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３３７−３４２ （Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ＷＯ ８７／０４１８７；ＷＯ ８８／０８０３５；ＷＯ ８８／０３５５８；米国特許第４，５７５，００６号、そしてアミノ酸配列はｃＤＮＡから推定された。Ｃａｐｏｎ他は、哺乳動物宿主細胞中で因子ＶＩＩＩを産生する組換えＤＮＡ法およびヒト因子ＶＩＩＩの精製を開示している。
【００７３】
ＣＨＯ （チャイニーズハムスター卵巣） 細胞およびＢＨＫＣ （ベイビーハムスター腎細胞） 上のヒト因子ＶＩＩＩの発現は報告された。ヒト因子ＶＩＩＩはＢドメインの一部分またはすべてを欠失させるように修飾され （米国特許第４，８６８，１１２号）、ヒト因子Ｖ Ｂドメインによるヒト因子ＶＩＩＩ Ｂドメインの置換が試みられた （米国特許第５，００４，８０３号）。ヒト因子ＶＩＩＩをコードするｃＤＮＡ配列および予測されたアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１および２に示されている。配列番号１において、コーディング領域はヌクレオチド位置２０８において開始し、トリップレットＧＣＣは配列番号２に記載する成熟タンパク質のアミノ酸番号１ （Ａｌａ） のコドンである。
【００７４】
ブタ因子ＶＩＩＩは血漿から単離された［Ｆａｓｓ， Ｄ． Ｎ． ｅｔ ａｌ． （１９８２） Ｂｌｏｏｄ ５９：５９４］。セルロプラスミンおよび凝固因子Ｖに対する相同性を有するＮ末端軽鎖の一部分に対応するブタ因子ＶＩＩＩの部分的アミノ酸配列が記載された：Ｃｈｕｒｃｈ ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６９３４。Ｔｏｏｌｅ， Ｊ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３４２−３４７は、ブタ因子ＶＩＩＩの４つのアミノ酸フラグメントの部分的配列決定を記載したが、因子ＶＩＩＩ分子中のそれらの位置としてフラグメントを特性決定しなかった。
【００７５】
ブタ因子ＶＩＩＩのＡ２ドメインのＢおよび一部分は、Ｔｏｏｌｅ， Ｊ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：５９３９−５９４２により報告された。ブタ因子ＶＩＩＩの完全なＡ２ドメインをコードするｃＤＮＡ配列および予測されたアミノ酸配列、およびすべてのドメイン、すべてのサブユニット、および特異的アミノ酸配列の置換を有するハイブリッドヒト／ブタ因子ＶＩＩＩは、米国特許第５，３６４，７７１号、発明の名称「ハイブリッドヒト／ブタ因子ＶＩＩＩ」、１９９４年１１月１５日発行、およびＷＯ ９３／２００９３、１９９３年１０月１４日公開に開示された。配列番号１に示す、成熟ヒト因子ＶＩＩＩ中の残基３７３−７４０に対応するブタ因子ＶＩＩＩのＡ２ドメインをコードするｃＤＮＡ配列、および予測されたアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３および４に示す。
【００７６】
より最近において、最初の１９８アミノ酸を欠如するＡ１ドメインおよびブタ因子ＶＩＩＩのＡ２ドメインの一部分のヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列は、ＷＯ ９４／１１５０３、１９９４年５月２６日公開において報告された。完全なＡ１ドメイン、活性化ペプチド、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを包含する、ブタ因子ＶＩＩＩをコードする全ヌクレオチド配列、ならびにコード化アミノ酸配列は、Ｌｏｌｌａｒにより、米国特許第５，８５９，２０４号、１９９９年１月１２日発行、およびＷＯ ９７／４９７２５、１９９７年１２月３１日公開 （両方は引用することによって本明細書の一部とされる） に開示されているように、最終的に得られた。
【００７７】
ブタおよび因子ＶＩＩＩの両方は、２つのサブユニットタンパク質として血漿から単離された。サブユニットは、重鎖および軽鎖として知られており、カルシウムおよび他の２価の金属イオンを必要とする非共有結合により一緒に保持される。因子ＶＩＩＩの重鎖は、共有結合した３つのドメイン、Ａ１、Ａ２、およびＢを含有する。また、因子ＶＩＩＩの軽鎖は、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２と表示する、３つのドメインを含有する。Ｂドメインは既知の生物学的機能をもたず、因子ＶＩＩＩの多数の測定可能なパラメーターを有意に変化させないで、タンパク質分解的にまたは組換えＤＮＡ技術の方法により分子から除去するか、あるいは部分的除去ことができる。ヒト組換え因子ＶＩＩＩは血漿由来因子ＶＩＩＩに類似する構造および機能を有するが、哺乳動物細胞中で発現されない限りでグリコシル化されない。
【００７８】
ヒトおよびブタ活性化因子ＶＩＩＩ （「因子ＶＩＩＩａ」） の両方は、Ａ１ドメインとＣ２ドメインとの間の重鎖の切断のために、３つのサブユニットを有する。この構造はＡ１／Ａ２／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２と表示される。ヒト因子ＶＩＩＩａはブタ因子ＶＩＩＩａを安定化する条件下に不安定である。これは多分ヒト因子ＶＩＩＩａのＡ２サブユニットのアソシエーションが弱いためである。ヒトおよびブタ因子ＶＩＩＩａのＡ２サブユニットの解離は、因子ＶＩＩＩａ分子における活性の喪失に関係付けられる。
Ｙａｋｈｙａｅｖ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ９０：Ｓｕｐｐｌ． １， Ａｂｓｔｒａｃｔ ＃ １２６は、低密度のリポタンパク質レセプター関係タンパク質によるＡ２ドメインの結合を報告し、このような結合による仲介されるＡ２の細胞吸収が因子ＶＩＩＩ活性をダウンレギュレートする作用をすることが示唆される。
【００７９】
「Ｂ−ドメインレス因子ＶＩＩＩ」の発現は、Ｂ−ドメインの部分を含めることによって増強される。「ＳＱ」と表示されるＢ−ドメインの部分の包含 ［Ｌｉｎｄ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） ｓｕｐｒａ］ は好適な発現を生ずることが報告された。「ＳＱ」構築物は、ＢドメインＮ末端の５アミノ酸およびＢドメインのＣ末端の９アミノ酸を除外して、ヒトＢドメインのすべてを欠如する。
【００８０】
精製された修飾因子ＶＩＩＩまたはそのフラグメントは、標準的アッセイ、例えば、無血漿因子ＶＩＩＩアッセイ、１段階凝固アッセイ、および標準として精製された組換えヒト因子ＶＩＩＩを使用して酵素結合免疫吸着アッセイにより、免疫反応性および凝固活性についてアッセイすることができる。
【００８１】
訓練した実施者の採択および判断に依存して、プラスミドおよび真核生物ウイルスベクターを包含する、他のベクターを使用して、真核細胞中で組換え遺伝子構築物を発現させることができる （例えば、下記文献を参照のこと、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｐｔｅｒ １６）。細菌、酵母、および昆虫細胞を包含する、他のベクターおよび発現系を使用することができるが、グリコシル化が異なるか、あるいはそれを欠如するために好ましくない。
【００８２】
培養および組換え哺乳動物タンパク質発現に普通に使用されている種々の細胞中で、組換え因子ＶＩＩＩタンパク質を発現させることができる。特に、大きいタンパク質の発現のために、多数の齧歯類細胞系統がことに有用であることが見出された。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ） 米国マリイランド州２０８５２、ロックビレパークローンドライブ１２３０１） から入手可能である、好ましい細胞系統は、ベイビーハムスター腎細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣 （ＣＨＯ） 細胞を包含し、これらは日常的手順および培地を使用して培養される。
【００８３】
ブタ因子ＶＩＩＩのより大きい凝固活性についての基準は、ブタ因子ＶＩＩＩａからのブタＡ２サブユニットよりも、ヒト因子ＶＩＩＩａからのヒトＡ２サブユニットの自発的解離が速いことにあるように見える。Ａ２サブユニットの解離は活性の喪失に導く［Ｌｏｌｌａｒ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１６８８−１６９２；Ｌｏｌｌａｒ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：２３６５２−２３６５７；Ｆａｙ， Ｐ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１３２４６−１３２５０］。
【００８４】
免疫反応性が減少した因子 ＶＩＩＩ
因子ＶＩＩＩの凝固活性を阻害する抗体 （「インヒビター」または「阻害性抗体」） と免疫反応性であるエピトープは、因子ＶＩＩＩにおける既知の構造−機能の関係に基づいて特性決定された。多分、インヒビターは、因子ＶＩＩＩのドメイン構造に関連する高分子の相互作用またはフォン・ウィルブランド因子、トロンビン、因子Ｘａ、因子ＩＸａ、または因子Ｘとのそのアソシエーションを崩壊させることによって作用することができるであろう。
【００８５】
しかしながら、ヒト因子ＶＩＩＩに対する大部分の阻害性抗体は、下記の文献に記載されているように、因子ＶＩＩＩの４０ ｋＤａのＡ２ドメインまたは２０ ｋＤａのＡ２ドメインに結合し、これらはドメインに関連する特異的機能を崩壊させることによって作用する：Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：７７２８−７７３２；Ｓｃａｎｄｅｌｌａ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：６１５２−６１５６。Ｓｃａｎｄｅｌｌａ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｂｌｏｏｄ ８２：１７６７−１７７５によれば、Ａ２およびＣ２エピトープに加えて、因子ＶＩＩＩの軽鎖のＡ３またはＣ１ドメイン中に第３エピトープが存在しうる。この推定上の第３エピトープの意味は未知であるが、それは因子ＶＩＩＩにおけるエピトープの反応性の小部分を占めるように見える。
【００８６】
抗Ａ２抗体は、Ｌｏｌｌａｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９３：２４９７−２５０４が示すように、因子Ｘ活性化をブロックする。Ｗａｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ． Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ３：７０３−７１６が記載する欠失突然変異誘発による以前のマッピングの研究により、Ａ２エピトープは４０ ｋＤａのＡ２ドメインのＮＨ_２末端の２０ ｋＤａの領域内に位置決定された。競合免疫放射分析アッセイにより、Ａ２インヒビターは共通のエピトープまたは狭く集団化したエピトープを認識することが示され、これはＳｃａｎｄｅｌｌａ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｔｈｒｏｍｂｏ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ６７：６６５−６７１に記載され、米国特許第５，８５９，２０４号において証明されている。
【００８７】
修飾された因子ＶＩＩＩ分子は、臨床被験によりヒトにおいて抗原性の減少についておよび／または免疫原性の減少について試験することができる。因子ＶＩＩＩが阻害性抗体と免疫反応性であるかどうかを決定するように設計された、１つの型の試験において、治療的ヒト因子ＶＩＩＩの凝固活性を阻害する抗体を有する、因子ＶＩＩＩ欠乏症の患者のほぼ２５人に、因子ＶＩＩＩを、好ましくは静脈内注入により、投与する。動物または修飾された動物因子ＶＩＩＩの投与量は、５〜５０単位／ｋｇ体重、好ましくは１０〜５０単位／ｋｇの範囲、最も好ましくは４０単位／ｋｇ体重である。
【００８８】
各投与後ほぼ１時間に、血液試料からの因子ＶＩＩＩの回復を１段階凝固アッセイにおいて測定する。注入後５時間に試料を再び採取し、回復を測定する。完全な回復および試料からの因子ＶＩＩＩの消失速度は抗体力価および阻害活性を予測させる。抗体力価が高い場合、因子ＶＩＩＩの回復は通常測定不可能である。回復の結果を、血漿由来ヒト因子ＶＩＩＩ、組換えヒト因子ＶＩＩＩ、血漿由来ブタ因子ＶＩＩＩ、および他の普通に使用されている治療的形態の因子ＶＩＩＩまたは因子ＶＩＩＩ代替物で治療された患者における回復の結果と比較する。
【００８９】
臨床的に有意なエピトープの同定後、組換え因子ＶＩＩＩ分子を発現させることができ、これらはｉｎ ｖｉｔｒｏで広い範囲の阻害性血漿に対して試験したとき、血漿由来ブタ因子ＶＩＩＩに比較して低いか、あるいはそれに等しい交差反応性を有する。エピトープ領域における追加の突然変異誘発を実施して、交差反応性を減少させることができる。交差反応性の減少は、望ましいが、汚染ブタタンパク質または汚染感染因子、例えば、ウイルスまたはプリオンのために副作用引き起こすことがある、現存する血漿由来ブタ因子ＶＩＩＩ濃厚物を超えた利点を有する生成物を製造するためには不必要である。組換えブタまたは修飾されたブタ因子ＶＩＩＩ分子は外来ブタタンパク質を含有しないであろう。
【００９０】
診断アッセイ
因子ＶＩＩＩ ｃＤＮＡおよび／またはそれから発現されたタンパク質は、全体または一部分において、基質、例えば、因子ＶＩＩＩ欠乏症の患者の血清および体液の試料中のヒトまたは動物因子ＶＩＩＩまたは修飾された因子ＶＩＩＩに対する阻害性抗体を検出する診断試薬として使用することができる。これらはアッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイ、イムノブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫拡散アッセイ、および因子ＶＩＩＩの生物学的活性のアッセイ （例えば、凝固アッセイ） のようなアッセイを包含する。これらの試薬を調製する技術およびそれらの使用法はこの分野において知られている。例えば、患者の血清試料中の阻害性抗体を検出するイムノアッセイにおいて、試験試料を十分な量の因子ＶＩＩＩと反応させ、試験因子ＶＩＩＩの試料中の阻害性抗体と検出可能な複合体を形成でき、これが事実抗原性であることを試験する。
【００９１】
修飾された因子ＶＩＩＩ ｃＤＮＡまたはタンパク質分子またはそのフラグメントの配列をベースとして、核酸およびアミノ酸プローブを調製することができる。ある態様において、これらを商業的に入手可能な色素または酵素的、蛍光性、化学発光性、または放射性標識で標識化することができる。例えば、ヒト、動物、またはハイブリッドヒト／動物因子ＶＩＩＩに対するインヒビターの存在が推測される血清または他の体液をスクリーニングするために、アミノ酸プローブを使用することができる。インヒビターのレベルを患者において定量し、健康的な対照と比較し、例えば、因子ＶＩＩＩ欠乏症の患者を動物または修飾された動物因子ＶＩＩＩで治療できるかどうかを決定するために、使用することができる。ｃＤＮＡプローブは、例えば、ＤＮＡライブラリーをスクリーニングする研究目的に使用することができる。
【００９２】
組換え因子 ＶＩＩＩ の調製
真核生物タンパク質発現系を使用して、組換え因子ＶＩＩＩを製造することができる。一般に、欠乏する遺伝子と、発現しようとする組換えＤＮＡとを含んでなるベクターで、必要な遺伝子を欠如する真核細胞系統を形質転換させる。形質転換は、エレクトロポレーションまたはウイルスデリバリーのような技術により達成することができる。タンパク質を産生するように選択された細胞系統は、問題のタンパク質とコンパティブルであり、問題のタンパク質を連続的に発現することができ、問題のタンパク質の精製を促進する培地上で成長することができるように、当業者に知られている他の因子とともに、選択される。このような技術の例は、欧州特許出願０ ３０２ ９６８ Ａ２および米国特許第５，１４９，６３７号 （それらの両方はそれらの全体において引用することによって本明細書の一部とされる） に開示されている。
【００９３】
組換え因子 ＶＩＩＩ 分子の試験
組換え因子ＶＩＩＩ分子は、少なくとも２つの型の臨床被験によりヒトにおいて抗原性の減少についておよび／または免疫原性の減少について試験することができる。組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩが阻害性抗体と免疫反応性であるかどうかを決定するように設計された、１つの型の試験において、治療的ヒトまたはブタ因子ＶＩＩＩの凝固活性を阻害する因子ＶＩＩＩに対する抗体を有する、因子ＶＩＩＩ欠乏症の患者のほぼ２５人に、組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩを、好ましくは静脈内注入により、投与する。
【００９４】
組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩの投与量は、５〜５０単位／ｋｇ体重、好ましくは１０〜５０単位／ｋｇの範囲、最も好ましくは４０単位／ｋｇ体重である。各投与後ほぼ１時間に、血液試料からの因子ＶＩＩＩの回復を１段階凝固アッセイにおいて測定する。注入後５時間に試料を再び採取し、回復を測定する。完全な回復および試料からの因子ＶＩＩＩの消失速度は抗体力価および阻害活性を予測させる。抗体力価が高い場合、因子ＶＩＩＩ回収物は通常測定不可能である。回復の結果を、血漿由来ヒト因子ＶＩＩＩ、組換えヒト因子ＶＩＩＩ、ブタ因子ＶＩＩＩ、および他の普通に使用されている治療的形態の因子ＶＩＩＩまたは因子ＶＩＩＩ代替物で治療された患者における回復の結果と比較する。
【００９５】
組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩが免疫原性であるかどうか、すなわち、患者が阻害性抗体を発生するかどうかを決定するように設計された、臨床試験の第２型において、組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩを、前の節に記載されているように、因子ＶＩＩＩに対する抗体を発生しなかった、以前に未治療の血友病患者のほぼ１００人に投与する。治療は６ヶ月〜１年の期間にわたってほぼ２週毎に実施される。この期間の間に１〜３ヶ月において、血液試料を抜き出し、ベセスダアッセイまたは他の抗体アッセイを実施して阻害性抗体の存在を決定する。また、回復のアッセイを、前述したように、各注入後に実施する。結果を、血漿由来ヒト因子ＶＩＩＩ、組換えヒト因子ＶＩＩＩ、ブタ因子ＶＩＩＩ、および他の普通に使用されている治療的形態の因子ＶＩＩＩまたは因子ＶＩＩＩ代替物を投与された血友病患者と比較する。
【００９６】
医薬組成物
組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩ単独と、またはそれと薬学的安定化化合物、デリバリー賦形剤、および／または担体賦形剤とを含んでなる医薬組成物は、既知の方法に従い、Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されているように製造される。
【００９７】
１つの好ましい態様において、静脈内注入のために好ましい担体またはデリバリー賦形剤は生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水である。
好ましい態様において、適当な安定化化合物、デリバリー賦形剤、および担体賦形剤は、他のヒトまたは動物タンパク質、例えば、アルブミンを包含するが、これらに限定されない。
【００９８】
また、リン脂質小胞またはリポソーム懸濁液は薬学上許容される担体またはデリバリー賦形剤として好ましい。これらは当業者に知られている方法に従い製造することができ、例えば、ホスファチジルセリン／ホスファチジルコリンまたは一緒になって表面に負電荷を付与するリン脂質または洗浄剤の組み合わせを含有することができる。なぜなら、因子ＶＩＩＩは負に帯電したリン脂質膜に結合するからである。１または２以上の適当な脂肪 （例えば、ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン、およびコレステロール） を無機溶媒中に溶解し、次いでこの溶媒を蒸発させ、容器表面上に乾燥した脂肪の薄層を残すことによって、リポソームは製造することができる。次いで、ハイブリッド因子ＶＩＩＩの水溶液を容器の中に導入する。次いで容器を手により攪拌して容器側面から脂質物質を遊離させ、これによりリポソーム懸濁液を形成する。
【００９９】
組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩを他の適当な安定化化合物、デリバリー賦形剤、および／または担体賦形剤、例えば、ビタミンＫ依存的凝固因子、組織因子、およびフォン・ウィルブランド因子 （ｖＷｆ） または因子ＶＩＩＩ結合部位を含有するｖＷｆフラグメント、および多糖類、例えば、スクロースと組み合わせることができる。
【０１００】
また、レトロウイルスベクターのようなデリバリー手段を使用して、ヒト因子ＶＩＩＩを送出すことができる同一の方法において、遺伝子治療により組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩを送出すことができる。この方法は、因子ＶＩＩＩ ｃＤＮＡをヒト細胞の中に組込み、ヒト細胞を因子ＶＩＩＩ欠乏症の患者に直接移植するか、あるいは因子ＶＩＩＩ分子に対する透過性であるが、細胞に対して不透過性である、植可能な装置の中に入れ、次いで移植することから成る。好ましい方法はレトロウイルス仲介遺伝子転移であろう。
【０１０１】
この方法において、外因的遺伝子 （例えば、因子ＶＩＩＩ ｃＤＮＡ） を修飾されたレトロウイルスのゲノム中にクローニングする。遺伝子をウイルス機構により重鎖のゲノムの中に挿入し、ここで遺伝子を細胞により発現させる。レトロウイルスベクターがウイルスを産生せず、宿主のウイルス感染を防止するように、レトロウイルスベクターを修飾する。この型の療法の一般原理はこの分野において知られており、そして文献において概観されてきている （例えば、Ｋｏｈｎ， Ｄ． Ｂ． ｅｔ ａｌ．［１９８９］Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２９：８１２−８２０）。
【０１０２】
組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩをｖＷｆに結合させて貯蔵して、ハイブリッド分子の半減期および貯蔵寿命を増加させることができる。さらに、因子ＶＩＩＩの凍結乾燥はｖＷｆの存在下に活性分子の収率を改良する。商業的供給会社が使用しているヒトおよび動物因子ＶＩＩＩを貯蔵する現在の方法を、ハイブリッド因子ＶＩＩＩの貯蔵に使用することができる。これらは方法は下記の工程を包含する： （１） 部分的精製された状態の因子ＶＩＩＩを凍結乾燥する （それ以上精製しないで注入される因子ＶＩＩＩ「濃厚物」として） ； （２） 因子ＶＩＩＩを安定化するアルブミンの存在下にジンマーマン （Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ） 法および凍結乾燥によりイムノアフィニティー精製する； （３） アルブミンの存在下に組換え因子ＶＩＩＩを凍結乾燥する。
【０１０３】
さらに、ハイブリッド因子ＶＩＩＩを４℃において０．６ＭのＮａＣｌ、２０ ｍＭのＭＥＳ、および５ ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ ６．０中で不定的に安定であり、また活性の喪失を最小にして、これらの緩衝液中で凍結させて貯蔵し、融解させることができる。
【０１０４】
治療方法
組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩを使用して、阻害性抗体をもつか、あるいはもたない血友病者、および阻害性抗体発生のために後天性因子ＶＩＩＩ欠乏症の患者において、因子ＶＩＩＩ欠乏症のためのコントロールされない出血 （例えば、関節内、頭蓋内、または胃腸管の出血） を治療する。活性物質は静脈内に投与することが好ましい。
【０１０５】
さらに、組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩは、前述したように、ハイブリッドを産生するように遺伝子操作された細胞の移植により、またはこのような細胞を含有する装置の移植により投与することができる。
好ましい態様において、組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩ単独と、またはそれと安定剤、デリバリー賦形剤、および／または担体とを含んでなる医薬組成物を、ヒトまたは動物因子ＶＩＩＩの注入に使用されているのと同一手順に従い、患者の静脈内に注入される。
【０１０６】
このような治療を必要とする患者に投与できる組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩの治療投与量は、因子ＶＩＩＩ欠乏症の重症度に依存して変化するであろう。一般に、投与量レベルは、各患者の出血エピソードの重症度および期間と一致させた頻度、期間、および単位で調節される。したがって、標準凝固アッセイにより測定して、出血を停止させる治療的に有効な量のハイブリッドを患者に送達させるために十分な量で、ハイブリッド因子ＶＩＩＩを薬学上許容される担体、デリバリー賦形剤、または安定剤の中に添加する。
【０１０７】
因子ＶＩＩＩは、古典的には、血友病Ａの個体に由来する血漿における凝固欠如を補正する、正常の血液の中に存在する物質であると定義される。因子ＶＩＩＩの精製されたおよび部分的に精製された形態のｉｎ ｖｉｔｒｏ凝固活性はヒト患者における因子ＶＩＩＩ注入投与量の計算に使用され、患者の血漿から回収された活性およびｉｎ ｖｉｖｏ出血欠陥の補正の信頼できるインジケーターである。下記の文献によれば、新規な因子ＶＩＩＩ分子の標準アッセイと、イヌ注入モデルまたはヒト患者におけるそれらの挙動との間の説明は存在しない：Ｌｕｓｈｅｒ， Ｊ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， ３２８ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２８：４５３−４５９；Ｐｉｔｔｍａｎ， Ｄ． Ｄ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｂｌｏｏｄ ７９：３８９−３９７；およびＢｒｉｎｋｈｏｕｓ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８２：８７５２−８７５５。
【０１０８】
通常、組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩの投与により患者における達成すべき所望の血漿因子ＶＩＩＩレベルは、正常の３０〜１００％の範囲である。組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩの好ましい投与モードにおいて、組成物は約５〜５０単位／ｋｇ体重の好ましい投与量、好ましくは１０〜５０単位／ｋｇ体重の範囲、最も好ましくは２０〜４０単位／ｋｇ体重の投与量で静脈内投与される；間隔頻度は約８〜２４時間の範囲であり （高度に影響を受けた血友病者において） ；そして治療日数は１〜１０日の範囲または出血エピソードが解決されるまでである。
【０１０９】
例えば、下記の文献を参照のこと：Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｈ． Ｒ． およびＭ． Ｒ． Ｊｏｎｅｓ， “Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ−Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ （因子ＩＩ、因子Ｖ、および因子ＶＩＩ〜ＸＩＩ），” Ｃｈ． １５３、１４５３−１４７４、１４６０、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｗ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９０）。インヒビターを有する患者はより多い組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩを必要とすることがあるか、あるいは患者はより少ない組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩを必要とすることがある。なぜなら、その比活性がヒト因子ＶＩＩＩよりも高いか、あるいは抗体反応性または免疫原性が減少することがあるからである。
【０１１０】
ヒトまたはブタ因子ＶＩＩＩを使用する治療におけるように、組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩの注入量は１段階因子ＶＩＩＩ凝固アッセイにより規定され、選択された場合において、注入後の患者の血漿中で因子ＶＩＩＩを測定することによってｉｎ ｖｉｖｏ回復を決定する。特定の被検体について、特別の投与養生法は個々の要求および組成物を投与するか、あるいはその組成物の投与を監督する人の職業的判断に従い経時的に調節すべきであり、そして本明細書に記載する濃度範囲は例示のみを目的とし、特許請求の範囲に記載する組成物の範囲または実施を限定することを意図しないことを理解すべきである。
【０１１１】
治療は、必要に応じて、組成物の単一の静脈内投与または延長した時間にわたる周期的または連続的投与の形態を取る。選択的に、組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩは皮下に投与するか、あるいは１回または変化する時間間隔で数回の投与においてリポソームを使用して経口的に投与することができる。
【０１１２】
また、ヒト因子ＶＩＩＩに対する抗体を発生した血友病者における因子ＶＩＩＩ欠乏症による、コントロールされない出血を治療するために、因子ＶＩＩＩを使用することができる。この場合において、ヒトまたは動物ヒト因子ＶＩＩＩ単独の凝固活性よりも高い凝固活性は不必要である。ヒト因子ＶＩＩＩの凝固活性よりも低い （すなわち、３，０００単位／ｍｇより低い） 凝固活性は、その活性が患者の血漿中の抗体により中和されない場合、有効である。
下記の非限定的実施例を参照すると、一般的に前述した、組換えまたは組換えハイブリッド因子ＶＩＩＩ分子およびそれを単離し、特性決定し、製造し、使用する方法は理解されるであろう。
【０１１３】
実施例
材料−クエン酸塩添加血友病Ａ血漿および正常のプールしたヒト血漿 （ＦＡＣＴ） をジョージ・キング・バイオメディカル・インコーポレーテッド （Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ， Ｉｎｃ．） （カンサス州オーバーランドパーク） から購入した。ヘパリン−セファローズをシグマ・ケミカル・カンパニー （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．） （ミゾリー州セントルイス） から購入した。胎仔ウシ血清、ゲネチシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地およびＡＩＭ−Ｖ培地をライフ・テクノロジー・インコーポレーテッド （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．） （マリーランド州ガイサーバーグ） から購入した。
【０１１４】
Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼおよびファージミドｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ⁻をストラタジーン （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） （カリフォルニア州ラジョラ） から購入した。ネズミ抗ヒトｆＶＩＩＩモノクローナル抗体ＥＳＨ４およびＥＳＨ８をアメリカン・ダイアグノスチカ （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ） （コネチカット州グリーンウィッチ） から購入した。ネズミｆＶＩＩＩ Ｃ２特異的阻害性モノクローナル抗体ＮＭＣ ＶＩＩＩ−５をＭｉｄｏｒｉ Ｓｈｉｍａ博士 （日本国奈良医学大学） から入手した。ヒトｆＶＩＩＩ Ｃ２特異的ＩｇＧ４κモノクローナル抗体ＢＯ２Ｃ１１を、血友病患者からの形質転換されたＢ細胞系統からクローニングし、以前に記載されているように調製した （Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ， Ｍ． Ｇ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， “Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ｓｔｕｄｙ ｗｉｔｈ ａｎ ＩｇＧ４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，” Ｂｌｏｏｄ ９２：４９６−５０６） 。
【０１１５】
５人のインヒビター患者からのクエン酸塩添加血漿、ＡＡ、ＡＪ、ＨＲ、ＬＫ、およびＲｖＲをＤｏｒｏｔｈｅａ Ｓｃａｎｄｅｌｌａ博士から入手した。それらをそれ以上精製しないで （ＡＡ、ＲｖＲ 、およびＡＪ） またはＩｇＧ調製物 （ＬＫおよびＡＡ） として使用した。インヒビターＩｇＧを以前に記載されているように調製した （Ｓｃａｎｄｅｌｌａ， Ｄ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． １９９２， “Ａ ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ Ａ２ ｄｏｍａｉｎ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｓｏｍｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ，” Ｔｈｒｏｍｂｏ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ６７：６６５−６７１）。
【０１１６】
ＨＲ、ＬＫ、ＡＡ、およびＲｖＲ抗体は、抗体中和アッセイにより判断して、Ｃ２ドメインに対して特異的であった （Ｐｒｅｓｃｏｔｔ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， １９９７， “Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｍｏｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ ｈｅｍｏｈｐｉｌｉａ Ａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｈａｎ ｉｎ ｍｏｓｔ ｎｏｎｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃｓ ｗｉｔｈ ｆＶＩＩＩ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” Ｂｌｏｏｄ ８９：３６６３−３６７１）。ＡＪは組換えハイブリッドヒト／ブタｆＶＩＩＩ分子のパネルを使用してＣ２特異的として同定された （Ｂａｒｒｏｗ， Ｒ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．， ２０００， “Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｔｏｗａｒｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｌａｓｍａｓ ｕｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｙ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｈｙｂｒｉｄ ｈｕｍａｎ／ｐｏｒｃｉｎｅ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，” Ｂｌｏｏｄ ９５：５５７−５６１）。
【０１１７】
無アルブミン組換え全長因子ＶＩＩＩをバクスター・ヘルスケアー （Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ） のハイランド・イムノ・ディビジョン （Ｈｙｌａｎｄ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ） （イリノイ州ディーアフィールド） から入手した。合成オリゴヌクレオチドをライフ・テクノロジー・インコーポレーテッド （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．） （マリーランド州ガイサーバーグ） から購入した。制限酵素はニュー・イングランド・バイオラブス （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ） またはプロメガ （Ｐｒｏｍｅｇａ） （ウィスコンシン州マディソン） から購入した。
【０１１８】
ベイビーハムスター腎細胞に由来する細胞系統はＲ． Ｔ． Ａ． Ｎａｃｇｉｌｌｉｖｒａｙ博士から入手した （Ｆｕｎｋ， Ｗ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．， １９９０， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈａｌｆ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，” Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：１６５４−１６６０）。Ａ、Ｂ−ドメインレスｆＶＩＩＩ発現ベクターは、ＨＢ−／ＲｅＮｅｏと表示し、停止コドンに対して２塩基３’に２つのＮｏｔＩ１部位と、アンピシリンおよびゲネチシン耐性遺伝子を含有し、以前に記載されているように調製した （Ｈｅａｌｅｙ， Ｊ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， “Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｇｌｕ２１８１−Ｖａｌ２２４３ ｃｏｎｔａｉｎ ａ ｍａｊｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ，” Ｂｌｏｏｄ ９２：３７０１−３７０９）。
【０１１９】
鋳型としてＨＢ−／ＲｅＮｅｏを使用して、本質的に対応するブタ分子について以前に記載されているように （Ｈｅａｌｅｙ， Ｊ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， “Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｇｌｕ２１８１−Ｖａｌ２２４３ ｃｏｎｔａｉｎ ａ ｍａｊｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ，” Ｂｌｏｏｄ ９２：３７０１−３７０９）、スプライシング−バイ−オーバーラップ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ−ｂｙ−ｏｖｅｒｌａｐ）エクステンション （ＳＯＥ） 突然変異誘発 （Ｈｏｒｔｏｎ， Ｒ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９９３， “Ｇｅｎｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ，” Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２１７：２７０−２７９） により、 ＨＳＱ／ＲｅＮｅｏ、すなわち、ヒトｆＶＩＩＩ中にＢドメインの代わりに１４のアミノ酸セグメント、Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇを含有するヒトＢ−ドメインレスｆＶＩＩＩ分子 （Ｌｉｎｄ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９９５，” Ｎｏｖｅｌ ｆｏｒｍｓ ｏｆ Ｂ−ｄｏｍａｉｎ−ｄｅｌｅｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，” Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３２：１９−２７） を構築した。ＨＰ２０、すなわち、ヒトＡ１、Ａ２、ａｐ−Ａ３、およびＣ１ドメインおよびブタＣ２ドメインを含有するＢ−ドメインレスハイブリッドヒト／ブタｆＶＩＩＩ分子を以前に記載されているように （Ｈｅａｌｅｙ， Ｊ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ， １９９８）調製した。
【０１２０】
クイアゲン・プラスミド・マクシ・キット （Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ） （Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ． カリフォルニア州バレンシア） を使用して、プラスミドＤＮＡを精製した。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを使用してハイブリッド・オムニジーン （Ｈｙｂｒｉｄ ＯｍｎｉＧｅｎｅ） サーマルサイクラーｂｙ、ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、エタノール沈降させ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ （Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インジアナ州インジアナポリス） を使用してプラスミドＤＮＡ中に結合させた。インサートを含有するプラスミドを使用して、大腸菌 （Ｅ． ｃｏｌｉ） Ｅｐｉｃｕｒｅａｎ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を形質転換した。アプライド・バイオシステムス （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） （カリフォルニア州フォスターシティー） ３７３ａ自動化ＤＮＡ配列決定装置およびＰＲＩＳＭ色素ターミネーターキットを使用してジデオキシ配列決定により、ＰＣＲにより発生させたすべての新規なｆＶＩＩＩ ＤＮＡ配列を確認した。
【０１２１】
実施例 １． ｆＶＩＩＩ 突然変異体 ｃＤＮＡ の構築
ＨＳＱコドン中でＳＯＥ突然変異誘発により突然変異を作り、下記のタンパク質を産生させる：Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ （ヒト→ブタ）、ＡＴＧ→ＡＴＣ、Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ （ヒト→イヌ）、ＴＴＴ→ＴＴＧ、Ｖａｌ２２２３Ａｌａ （ヒト→イヌ）、ＧＴＧ→ＧＣＣ、Ｌｙｓ２２２７Ｇｌｕ （ヒト→ブタ）、ＡＡＡ→ＧＡＧ、Ｌｅｕ２２５２Ｐｈｅ （ヒト→ブタ）、ＣＴＴ→ＴＴＣ、Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ／Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ、ＡＴＧ→ＡＴＣおよびＴＴＴ→ＴＴＧ、Ｖａｌ２２２３Ａｌａ／Ｌｙｓ２２２７Ｇｌｕ、ＧＴＧ→ＧＣＣおよびＡＡＡ→ＧＡＧ、Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ／Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ／Ｖａｌ２２２３Ａｌａ／Ｌｙｓ２２２７Ｇｌｕ、ＡＴＧ→ＡＴＣ、ＴＴＴ→ＴＴＴ、ＧＴＧ→ＧＣＣ、およびＡＡＡ→ＧＡＧ。
【０１２２】
ＨＳＱ／ＲｅＮｅｏをＰＣＲ反応において鋳型として使用した。第１のＰＣＲ反応において、センスプライマーとして、ＨＳＱ配列中のヌクレオチド３７６３−３７８６に対応する、ヒトＣ１プライマー、配列番号３、５’−ＧＴＧ ＧＡＴ ＴＣＡ ＴＣＴ ＧＧＧ ＡＴＡ ＡＡＡ ＣＡＣ−３’ （Ｈ３７６３＋と表示する） を使用した。下記のプライマーをアンチセンスプライマーとして使用した：Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ、配列番号４、５’−ＡＧＧ ＡＧＡ ＣＣＡ ＧＧＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＧＴ ＡＡＡ ＧＴＡ ＧＧＡ ＴＧＡ−３’、Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ、配列番号５、５’−ＴＧＡ ＡＧＧ ＡＧＡ ＣＣＡ ＧＧＴ ＧＧＣ ＣＡＡ ＣＡＴ ＡＴＴ ＧＧＴ ＡＡＡ ＧＴＡ ＧＧＡ−３’、Ｖａｌ２２２３Ａｌａ、配列番号６、５’−ＣＣＡ ＣＴＣ ＴＴＴ ＴＧＧ ＡＴＴ ＡＴＴ ＧＧＣ ＣＴＧ ＡＧＧ ＴＣＴ ＣＣＡ ＧＣＧ ＡＴＴ−３’、Ｌｙｓ２２２７Ｇｌｕ、配列番号７、５’−ＧＴＣ ＣＡＣ ＴＴＧ ＣＡＧ ＣＣＡ ＣＴＣ ＣＴＣ ＴＧＧ ＡＴＴ ＡＴＴ ＣＡＣ ＣＴＧ ＡＧＧ−３’、Ｌｅｕ２２５２Ｐｈｅ、配列番号８、５’−ＣＴＴ ＣＡＣ ＡＴＡ ＣＡＴ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＡＡ ＣＡＧ ＡＧＡ ＴＴＴ ＴＡＣ ＴＣＣ ＣＴＧ−３’、Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ／Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ、配列番号９、５’−ＡＧＧ ＡＧＡ ＣＣＡ ＧＧＴ ＧＧＣ ＣＡＡ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＧＴ ＡＡＡ ＧＴＡ ＧＧＡ ＴＧＡ−３’、およびＶａｌ２２２３Ａｌａ／Ｌｙｓ２２２７Ｇｌｕ、配列番号１０、５’−ＣＡＣ ＴＴＧ ＣＡＧ ＣＣＡ ＣＴＣ ＣＴＣ ＴＧＧ ＡＴＴ ＡＴＴ ＧＧＣ ＣＴＧ ＡＧＧ ＴＣＴ ＣＣＡ ＧＧＣ−３’。
【０１２３】
第２のＰＣＲ反応において、アンチセンスプライマーとして、Ｃ２ドメインに対して３’である、ＲｅＮｅｏプライマー、配列番号１１、５’−ＡＧＴ ＴＴＴ ＴＣＴ ＡＣＡ ＡＣＡ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＴＧ−３’ （ＲＥ１１１０−と表示する） を使用した。下記のプライマーをセンスプライマーとして使用した：Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ、配列番号１２、５’−ＴＣＡ ＴＣＣ ＴＡＣ ＴＴＴ ＡＣＣ ＡＡＴ ＡＴＣ ＴＴＴ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＧＧ ＴＣＴ ＣＣＴ−３’、Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ、配列番号１３、５’−ＴＣＣ ＴＡＣ ＴＴＴ ＡＣＣ ＡＡＴ ＡＴＧ ＴＴＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＧＧ ＴＣＴ ＣＣＴ ＴＣＡ−３’、Ｖａｌ２２２３Ａｌａ、配列番号１４、ＡＡＴ ＧＣＣ ＴＧＧ ＡＧＡ ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＣＣ ＡＡＴ ＡＡＴ ＣＣＡ ＡＡＡ ＧＡＧ ＴＧＧ−３’、Ｌｙｓ２２２７Ｇｌｕ、配列番号１５、５’−ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＴＧ ＡＡＴ ＡＡＴ ＣＣＡ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＣＴＧ ＣＡＡ ＧＴＧ ＧＡＣ−３’、Ｌｅｕ２２５２Ｐｈｅ、配列番号１６、５’−ＣＡＧ ＧＧＡ ＧＴＡ ＡＡＡ ＴＣＴ ＣＴＧ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＧＣ ＡＴＧ ＴＡＴ ＧＴＧ ＡＡＧ−３’、Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ／Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ、配列番号１７、５’−ＴＣＡ ＴＣＣ ＴＡＣ ＴＴＴ ＡＣＣ ＡＡＴ ＡＴＣ ＴＴＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＧＧ ＴＣＴ ＣＣＴ−３’、およびＶａｌ２２２３Ａｌａ／Ｌｙｓ２２２７Ｇｌｕ、配列番号１８、５’−ＧＣＣ ＴＧＧ ＡＧＡ ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＣＣ ＡＡＴ ＡＡＴ ＣＣＡ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＣＴＧ ＣＡＡ ＧＴＧ−３’。
【０１２４】
ＳＯＥ反応において、鋳型としてＰＣＲ反応からのフラグメントおよびプライマーとしてＨ３７７６３＋およびＲＥ１１１０を使用した。ＳｗａＩおよびＮｏｔＩを使用して、ＳＯＥ生成物およびＨＳＱ／ＲｅＮｅｏ結合フラグメントを発生させた。
Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ／Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ／Ｖａｌ２２２３Ａｌａ／Ｌｙｓ２２２７Ｇｌｕ ｃＤＮＡを次のようにして構築した。Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ／Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−の中に動かし、Ｂｓｕ３６Ｉで消化した。また、Ｖａｌ２２２３Ａｌａ／Ｌｙｓ２２２７ＧｌｕをＢｓｕ３６Ｉで消化し、適当なフラグメントを結合させた。生ずるＭｅｔ２１９９Ｉｌｅ／Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ／Ｖａｌ２２２３Ａｌａ／Ｌｙｓ２２２７Ｇｌｕ ｃＤＮＡを、ＳｗａＩおよびＮｏｔＩを使用する消化により、ＲｅＮｅｏの中に動かした。
【０１２５】
実施例 ２． 組換え ｆＶＩＩＩ 分子の発現
１０％の胎仔ウシ血清、５０単位／ｍｌのペニシリン、および５０ μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するダルベッコ最小必須培地−Ｆ１２中で、トランスフェクトされた細胞系統を維持した。使用前に、胎仔ウシ血清を５６ ℃において１時間熱不活性化した。ＲｅＮｅｏ中の突然変異体ｃＤＮＡはＢＨＫ細胞の中に安定にトランスフェクトされ、ゲネチシン耐性について選択し、発現のために無血清ＡＩＭ−Ｖ培地にスイッチし、以前に記載されているようにヘパリン−セファローズクロマトグラフィーにより部分的に精製した （Ｈｅａｌｅｙ， Ｊ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ， １９９８）。
【０１２６】
実施例 ３． ＦＶＩＩＩ および ｆＶＩＩＩ インヒビターのアッセイ
組換えｆＶＩＩＩタンパク質の活性を１段階凝固アッセイにより測定した （Ｂｏｗｉｅ， Ｅ． Ｊ． Ｗ． およびＣ． Ａ． Ｏｗｅｎ， １９８４， “Ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，” Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ， Ｏ． Ｄ． ＲａｔｎｏｆｆおよびＣ． Ｄ． Ｆｏｒｂｅｓ （編者） 、Ｇｒｕｎｅ ＆ Ｓｔｒａｔｔｏｎ， Ｉｎｃ． フロリダ州オーランド、４３−７２）。１単位のｆＶＩＩＩを１ ｍｌの正常のクエン酸塩添加ヒト血漿中の活性として定義する。ＦＶＩＩＩインヒビター力価を次のようにしてベセスダアッセイの変更バージョンにより測定した （Ｋａｓｐｅｒ， Ｃ． Ｋ． ｅｔ ａｌ．， １９７５， “Ａ ｍｏｒｅ ｕｎｉｆｏｒｍ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，” Ｔｈｏｒｏｍｂ． Ｄｉａｔｈ． Ｈａｅｍｏｒｒｈ． ３４：８６９−８７２）。組換え ｆＶＩＩＩを血友病Ａ血漿に０．８〜１．２単位／ｍｌの最終濃度に添加し、変化する濃度のインヒビターと３７℃において２時間インキュベートした。
【０１２７】
ベセスダ単位を規定する５０％阻害点を決定するために、少なくとも３５％〜６５％の範囲をスパンする残留活性を産生するインヒビター希釈物を調製した。ある場合において、複製希釈物を調製し、この場合において平均を使用した。各ベセスダ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ） 力価を測定するために、平均１０の希釈物を調製した。残留活性％／阻害希釈の逆数対数の半対数プロットはすべての場合において線形であった。データをマルクワット （Ｍｒｑｕａｒｄｔ） アルゴリズム （ＳｉｇｍａＰｌｏｔ ５．０、ＳＰＳＳ， Ｉｎｃ．） を使用する非線形回帰により下記方程式に適合させた：
【０１２８】
残留活性％ ＝ ｍ （ｌｏｇ ｘ − ｌｏｇ ｘ_５０） ＋ ５０
ここで適合されたパラメーターｘ_５０は５０％の阻害を生成する逆数希釈であり、適合されたパラメーターｍは半対数線の勾配であり、そして独立変数ｘはインヒビター試料の逆数希釈である。６２ベセスダアッセイについての推定値の標準誤差 （回帰線からのデータ点の平均偏差は１０．０±４．０ （平均±ＳＤ） であり、このアッセイにおいて固有であり、比較的低い精度を示す。
【０１２９】
ベセスダ力価はｘ_５０ ^−１に等しい。ベセスダ力価にｘ_５０の変動係数を掛けることによって、ベセスダ力価の標準誤差 （ＳＤ） の推定値を計算した。ＶＩＩＩ突然変異体およびＨＢ−のベセスダ力価をスチューデントｔ検定により比較した。以前に記載されているように捕捉抗体としてＥＳＨ４および検出抗体としてビオチニル化ＥＳＨ８を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡにより、部分的に精製した調製物中のｆＶＩＩＩの質量濃度を決定した （Ｌｕｂｉｎ， Ｉ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９９４， “Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍａｊｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ，” Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：８６３９−８６４１）。全長の組換えｆＶＩＩＩを標準として使用し、そして因子ＶＩＩＩの全長およびＢ−ドメインレスの形態間の質量の差について値を補正した。
【０１３０】
試料を四重反復実験においてアッセイした。平均変動係数は９．０％であった。ＥＬＩＳＡにより測定した濃度で凝固活性を割ることによって、ｆＶＩＩＩ分子の比活性を得た。下記の値が得られた （単位／ｍｇ） ：ＨＢ−、７，８００；Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ、１２，８００；Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ、１０，２００；Ｖａｌ２２２３Ａｌａ、１９，６００；Ｌｙｓ２２２７Ｇｌｕ、３６，２００；Ｌｅｕ２２５２Ｐｈｅ、１０，１００；Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ／Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ、１０，０００；Ｖａｌ２２２３Ａｌａ／Ｌｙｓ２２２７Ｇｌｕ、３３，２００；Ｍｅｔ２１９９Ｉｌｅ／Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ／Ｖａｌ２２２３Ａｌａ／Ｌｙｓ２２２７Ｇｌｕ、１４，２００。突然変異体のいくつかの見掛けの比活性はＨＢ−より高い。これはＨＢ−に比較して捕捉または検出抗体に結合する突然変異体の能力の減少が比較的小さく、ｆＶＩＩＩの質量を低く推定し、比活性を高く推定させるためである。
【０１３１】
【表１】

【０１３２】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、リン脂質に関係する推定上のｆＶＩＩＩ残基を示す。ヒト （Ｖｅｈａｒ， Ｇ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ， １９８４；Ｔｏｏｌｅ， Ｊ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， １９８４， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｃ ｆａｃｔｏｒ” Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３４２−３４７）、ブタ （Ｈｅａｌｅｙ， Ｊ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， １９９６， “Ｔｈｅ ｃＤＮＡ ａｎｄ ｄｅｒｉｖｅｄ ａｍｉｎｏ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ，” Ｂｌｏｏｄ ８８：４２０９−４２１４）， ネズミ （Ｅｌｄｅｒ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．， １９９３， “Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｃＤＮＡ，” Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １６：３７４−３７９） およびイヌ （Ｃａｍｅｒｏｎ， ｅｔ ａｌ．， １９９８， “Ｔｈｅ ｃａｎｉｎｅ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｃＤＮＡ ａｎｄ Ｓ’ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，” Ｔｈｒｏｍｂｏ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ７９：３１７−３２２） ｆＶＩＩＩのＣ２ドメインの整合配列が示されている。ヒトにおける提案されたリン脂質結合性残基 （Ｐｒａｔｔ， Ｋ． Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９９９， “Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ａｔ １．５ Å ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，” Ｎａｔｕｒｅ ４０２：４３９−４４２） および相同的残基はボールドフェースで示されている。
【図２】
図２は、ヒトｆＶＩＩＩ Ｃ２ドメイン中の突然変異した部位を示す。Ａ．リン脂質膜結合性およびＬｙｓ２２２７、４つの推定上の正に帯電した結合性残基の１つに関係することが提案された疎水性残基を示すリボンダイヤグラム （Ｐｒａｔｔ， Ｋ． Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９９９， “Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ａｔ １．５ Å ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，” Ｎａｔｕｒｅ ４０２：４３９−４４２）。これはヒト、ブタ、ネズミ、およびイヌのｆＶＩＩＩにおいて保存されているＬｅｕ２２５１は突然変異しなかった。Ｂ．膜から見上げる場合、空間充填モデルは回転した。
【図３】
図３は、患者のポリクローナル抗体および抗ｆＶＩＩＩ抗体のベセスダ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ） 力価を示す。組換えｆＶＩＩＩを血友病Ａ血漿中に希釈し、抗体ＡＡ、ＡＪ、ＨＲ、ＬＫ、およびＲｖＲのベセスダ力価を 「材料および方法」 に記載されているように測定した。非線形最小二乗回帰解析により決定された平均および標準偏差が示されている。Ｃ２ Ｄ１はＭｅｔ２１９９Ｉｌｅ／Ｐｈｅ２２００Ｌｅｕ二重突然変異である。Ｃ２ Ｄ２はＶａｌ２２２３Ａｌａ／Ｌｙｓ２２２７Ｇｌｕ二重突然変異である。ＨＰ２０はヒトＡ１、Ａ２、ａｐ−Ａ３およびＣ１ドメインおよびブタＣ２ドメインに比較してＢ−ドメインレスハイブリッドヒト／ブタｆＶＩＩＩ分子である。突然変異体とＨＢ−との間の差についての信頼限界は９９．９％水準において^{“ ＊＊ ”}であり、そして９９％水準において^{“ ＊ ”}である。ＮＳ、有意でない。
【図４】
図４は、患者のモノクローナル抗体ＢＯ２Ｃ１１のベセスダ力価を示す。略号および記号法は第３図の説明文に記載されている通りである。
【図５】
図５は、ネズミのモノクローナル抗体ＮＭＣ ＶＩＩＩ−５のベセスダ力価を示す。略号および記号法は第３図の説明文に記載されている通りである。

Claims (49)

1. ２１９９、２２００、２２２３、２２２７、および２２５２から成る群から選択される１または２以上の位置においてアミノ酸置換を含んでなる修飾されたヒト因子ＶＩＩＩ。
2. Ｂ−ドメインを欠如する請求項１に記載の修飾されたヒト因子ＶＩＩＩ。
3. メチオニン２１９９を置換するイソロイシンを含んでなる請求項１に記載の修飾されたヒト因子ＶＩＩＩ。
4. フェニルアラニン２２００を置換するロイシンを含んでなる請求項１に記載の修飾されたヒト因子ＶＩＩＩ。
5. ロイシン２２５２を置換するフェニルアラニンを含んでなる請求項１に記載の修飾されたヒト因子ＶＩＩＩ。
6. メチオニン２１９９を置換するイソロイシンおよびフェニルアラニン２２００を置換するロイシンとを含んでなる請求項１に記載の修飾されたヒト因子ＶＩＩＩ。
7. バリン２２２３を置換するアラニンおよびリシン２２２７を置換するグルタミン酸塩とを含んでなる請求項１に記載の修飾されたヒト因子ＶＩＩＩ。
8. メチオニン２１９９を置換するイソロイシン、フェニルアラニン２２００を置換するロイシン、バリン２２２３を置換するアラニン、およびリシン２２２７を置換するグルタミン酸塩とを含んでなる請求項１に記載の修飾されたヒト因子ＶＩＩＩ。
9. 対応するヒトタンパク質に比較して抗原性が減少した請求項１に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
10. 対応するヒトタンパク質に比較して免疫原性が減少した請求項１に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
11. 対応するヒトタンパク質に比較して免疫原性が減少しかつ抗原性が減少した請求項１に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
12. 約２，０００単位／ｍｇより大きい比活性を有する請求項１に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
13. 約３，０００単位／ｍｇより大きい比活性を有する請求項１に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
14. 約５，０００単位／ｍｇより大きい比活性を有する請求項１に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
15. 約１０，０００単位／ｍｇより大きい比活性を有する請求項１に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
16. 単一突然変異である請求項１に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
17. 二重突然変異である請求項１に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
18. 三重突然変異である請求項１に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
19. 四重突然変異である請求項１に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
20. ヒト因子ＶＩＩＩに比較して少なくとも１つのＣ２−特異的阻害性抗体に対してより低い抗原性を有する請求項１に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
21. ヒト因子ＶＩＩＩまたは全長の組換え因子ＶＩＩＩに比較してモノクローナル抗体Ｂ０２０１１のベセスダ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ） 力価が増減した、請求項１に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
22. ヒト因子ＶＩＩＩまたは全長の組換え因子ＶＩＩＩに比較してモノクローナル抗体ＮＭＣ−Ｓのベセスダ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ） 力価が増減した、請求項１に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
23. ヒト因子ＶＩＩＩまたは組換えヒト因子ＶＩＩＩに比較して少なくとも１つの阻害性抗体調製物に対するベセスダ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ） 力価が増減した、請求項１に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
24. 対応するヒト因子ＶＩＩＩアミノ酸に対する非ヒト因子ＶＩＩＩの少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる修飾された因子ＶＩＩＩ。
25. 少なくとも１つの非ヒト因子ＶＩＩＩアミノ酸置換が非ヒト哺乳動物からである、請求項２４に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
26. 非ヒト哺乳動物がブタ、イヌおよび／またはネズミである、請求項２５に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
27. 凝固活性と、修飾された因子ＶＩＩＩが由来した因子ＶＩＩＩ分子または他の因子ＶＩＩＩ調製物に比較して改良された抗原性とを有する、請求項２５に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
28. アミノ酸置換がアラニンではない、請求項２５に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
29. 修飾された因子ＶＩＩＩが由来した因子ＶＩＩＩ分子または他の因子ＶＩＩＩ分子に比較して免疫原性が減少している、請求項２５に記載の修飾された因子ＶＩＩＩ。
30. 阻害性抗体に対する反応性が減少しかつ前凝固活性が保持されるように、位置２１９９、２２００、２２２３、２２２７、および２２５２の少なくとも１つにおける天然に存在するアミノ酸を免疫反応性減少性アミノ酸で置換することを含んでなる、因子ＶＩＩＩを修飾する方法。
31. 少なくとも１つの置換されたアミノ酸が位置２１９９にある、請求項３０に記載の方法。
32. 少なくとも１つの置換されたアミノ酸が位置２２００にある、請求項３０に記載の方法。
33. 少なくとも１つの置換されたアミノ酸が位置２２２３にある、請求項３０に記載の方法。
34. 少なくとも１つの置換されたアミノ酸が位置２２２７にある、請求項３０に記載の方法。
35. 少なくとも１つの置換されたアミノ酸が位置２２５２にある、請求項３０に記載の方法。
36. 修飾された因子ＶＩＩＩが単一突然変異である請求項３０に記載の方法。
37. 修飾された因子ＶＩＩＩが二重突然変異である請求項３０に記載の方法。
38. 修飾された因子ＶＩＩＩが三重突然変異である請求項３０に記載の方法。
39. 修飾された因子ＶＩＩＩが四重突然変異である請求項３０に記載の方法。
40. 抗原性が減少しかつ前凝固活性が保持されるように、位置２１９９、２２００、２２２３、２２２７、および２２５２の少なくとも１つにおける天然に存在するアミノ酸を免疫反応性減少性アミノ酸で置換することを含んでなる、因子ＶＩＩＩを修飾する方法。
41. 少なくとも１つの置換されたアミノ酸が位置２１９９にある、請求項４０に記載の方法。
42. 少なくとも１つの置換されたアミノ酸が位置２２００にある、請求項４０に記載の方法。
43. 少なくとも１つの置換されたアミノ酸が位置２２２３にある、請求項４０に記載の方法。
44. 少なくとも１つの置換されたアミノ酸が位置２２２７にある、請求項４０に記載の方法。
45. 少なくとも１つの置換されたアミノ酸が位置２２５２にある、請求項４０に記載の方法。
46. 修飾された因子ＶＩＩＩが単一突然変異である請求項４０に記載の方法。
47. 修飾された因子ＶＩＩＩが二重突然変異である請求項４０に記載の方法。
48. 修飾された因子ＶＩＩＩが三重突然変異である請求項４０に記載の方法。
49. 修飾された因子ＶＩＩＩが四重突然変異である請求項４０に記載の方法。

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