CN102026652B

CN102026652B - 凝血酶抑制剂

Info

Publication number: CN102026652B
Application number: CN200880102585.0A
Authority: CN
Inventors: 玛丽亚·卡济米罗娃; R·曼朱纳塔·基尼; 许祖尧
Original assignee: Natural Environmental Research Council
Current assignee: National University of Singapore
Priority date: 2007-06-18
Filing date: 2008-06-18
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2028-06-18
Also published as: WO2008155658A2; GB0711779D0; US9217027B2; US20130183237A1; WO2008155658A3; AU2008264890A1; JP2010530238A; WO2008155658A8; CA2691243A1; EP2185185A2; JP5699393B2; CN102026652A; EP2185185B1

Abstract

本发明涉及源自食血节肢动物唾液腺的凝血酶抑制剂，且具体涉及通过与凝血酶在2或3个不同位点相互作用起作用的二价和三价凝血酶抑制剂。

Description

凝血酶抑制剂

将正文中提及的和该说明书结尾处列出的全部文件通过参考引入本文。

血液凝固是针对血管损伤的部分生理响应，其中丝氨酸蛋白酶的循环酶原继而受到有限蛋白水解作用的活化，从而导致血纤蛋白凝块的形成。在该反应网络中，凝血酶在维持止血完全性中起重要作用。凝血酶与大多数酶原及其辅助因子相互作用，这在血液凝固中起到多种前凝血剂和抗凝血剂作用^1，2。作为前凝血剂蛋白酶，在开始阶段中产生的第一凝血酶痕迹活化因子V(FV)和因子VIII(FVIII)，从而提供阳性反馈，导致凝血酶爆发。凝血酶还可以活化因子XI，从而触发固有途径。凝血酶将纤维蛋白原裂解为血纤蛋白，形成不可溶的凝块。血纤蛋白聚合物通过由凝血酶活化的因子VIII引发的共价交联进一步加强和稳定化。凝血酶还促进血小板栓塞的生成，这可能通过两种机制：(a)其通过与蛋白酶活化的受体(PARs)和糖蛋白V相互作用活化血小板；和(b)其通过使用血小板反应蛋白1型基序灭活ADAMTS13，解联蛋白和金属蛋白酶，防止血小板栓塞的去稳定化，所述血小板反应蛋白1型基序裂解冯维勒布兰德因子(VWF)。作为抗凝血剂蛋白酶，凝血酶在存在辅助因子凝血调节蛋白的条件下活化蛋白C(APC)。APC灭活因子Va(FVa)和因子VIIIa(FVIIIa)，从而下调凝血酶的产生^1-5。

血栓栓塞病症是死亡率和发病率的主要原因⁶。抗凝血剂是预防和治疗这些病症的关键。尽管肝素和香豆素衍生物(维生素K拮抗剂)是抗凝固治疗法的基础，但是这两类药物具有充分记载的局限性，诸如窄治疗窗(window)和可高度变化的剂量响应。这些局限性驱使不断的和强烈的努力来开发新型抗凝血剂，主要靶向特异性凝固因子⁷。凝血酶代表良好的靶标，这归因于其在凝固级联中的重要作用^6，8。

数十年来被广泛用于治疗的凝血酶抑制剂诸如肝素及其类似物是间接凝血酶抑制剂，即它们起部分抗凝血酶复合物的作用并且自身不直接与凝血酶活性位点相互作用。这意味着它们仅能够灭活可溶性凝血酶而不能与血纤蛋白-结合的凝血酶反应。直接凝血酶抑制剂能够灭活可溶性和血纤蛋白-结合的凝血酶二者。这赋予相当可观的治疗益处，因为这些试剂可以抑制凝块本身内正在进行的凝固过程，而不仅是形成新凝块(Di Nisio，M.，S.Middeldorp，和H.R.Buller.2005.直接凝血酶抑制剂(Direct thrombininhibitors.N Engl J Med(新英格兰医学杂志)353：1028-40)。

直接凝血酶抑制剂的一些实例包括水蛭素，比伐卢定(hirulog)(或比伐卢定(bivalirudin))和agratroban^7-9。在进化过程中，食血动物产生了丰富储存的血液凝固蛋白酶的抑制剂^16-20并且两种已知的直接凝血酶抑制剂，水蛭素和比伐卢定，源自食血蛋白。水蛭素是由医学水蛭Hirudomedicinalis的唾液腺中分离的65个氨基酸的蛋白^7，8，10。其具有球状N端结构域和酸性C端尾部，二者均结合凝血酶分子中的位点。该C端尾部与凝血酶外位点(exosite)-I通过静电和疏水性相互作用而相互作用。N端结构域结合凝血酶活性位点附近的非极性位点，从而阻断其可达性^11-13。比伐卢定(hirulog)(或比伐卢定(bivalirudin))，20-mer多肽，是通过使用4个Gly残基作为间隔区将水蛭素C端尾部嫁接到活性位点结合部分D-Phe-Pro-Arg-Pro的合理设计的产物^14，15。与水蛭素和比伐卢定，即结合凝血酶的外位点I和活性位点的二价抑制剂不同，argatroban是单价抑制剂且仅结合活性位点⁸。

然而，关于与凝血酶活性位点相互作用的直接凝血酶抑制剂的问题是它们最终可以被凝血酶裂解，从而导致失去抑制活性。保持对更有效的直接凝血酶抑制剂，且特别是较不可能由于凝血酶裂解失去抑制活性的凝血酶抑制剂的需要。

发明内容

按照本发明的第一方面，提供通过使凝血酶暴露于与凝血酶上的外位点I和活性位点相互作用的一种或多种分子来抑制凝血酶活性的方法。优选地，所述一种或多种分子与凝血酶上的外位点I、外位点II和活性位点均相互作用。

按照本发明的第二方面，提供适合于在本发明第一方面的方法中使用的一种或多种凝血酶抑制剂分子，其与凝血酶的外位点I和活性位点相互作用。优选地，所述一种或多种凝血酶抑制剂分子与凝血酶的的外位点I、外位点II和活性位点均相互作用。

优选地，本发明第一或第二方面的一种或多种分子通过首先与凝血酶的外位点I和II相互作用和再与凝血酶的活性位点相互作用抑制凝血酶活性。

按照本发明的第三方面，还提供本发明第二方面的一种或多种分子和凝血酶的复合物，其中所述凝血酶抑制剂分子与凝血酶的外位点I和活性位点，优选与全部凝血酶的外位点I、外位点II和活性位点相互作用。

优选地，本发明第一方面的方法中使用的分子，本发明第二方面的或本发明第三方面的复合物中存在的凝血酶抑制剂是具有氨基酸序列SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(SEQ ID NO 1)的variegin蛋白或所述variegin蛋白的功能等价物。

由蜱彩饰花蜱(Amblyomma variegatum)的唾液中分离具有上述氨基酸序列的variegin蛋白记述在WO03/091284中，其中variegin蛋白称为EV445。WO03/091284公开了variegin蛋白抑制凝血酶刺激的血小板凝集。然而，WO03/091284没提供任何关于variegin蛋白是否是通过与凝血酶直接相互作用发挥其作用的直接凝血酶抑制剂的实验证据。

令人惊讶地，现在发现variegin蛋白不仅与凝血酶直接相互作用，而且其在3个分开的位点处进行。本文中所示的结果显示variegin蛋白的残基1-7与凝血酶的外位点II相互作用，variegin蛋白的残基8-14与凝血酶的活性位点相互作用并与之结合，且variegin蛋白的残基15-32与凝血酶的外位点I相互作用并与之结合。现有的直接凝血酶抑制剂，天然的和合成的，例如水蛭素和比伐卢定，是二价的。它们与凝血酶上的外位点和凝血酶活性位点本身相互作用。Variegin蛋白是本发明人已知的与凝血酶外位点和凝血酶活性位点二者相互作用的第一个实例。Variegin蛋白的残基1-7和15-32与凝血酶外位点II和I的相互作用似乎调整(align)用于与凝血酶活性位点结合的variegin蛋白的残基8-14，随后的残基15-32与外位点I的结合加强活性位点的结合。

与其他凝血酶抑制剂不同，variegin蛋白在本文中显示不与其他丝氨酸蛋白酶交叉相互作用，即一种也被认为是归因于其与凝血酶中多结构域相互作用的能力的特征。

天然variegin蛋白，即在位置14处被糖基化，在本文中显示展现关于凝血酶的高亲和性和在上述类型的酰胺分解测定(amidolytic assay)的高抑制活性水平(约10.4pM的Ki和约0.99nM的IC50)。具有相同序列但在位置14处无糖基化的合成variegin蛋白在上述类型的酰胺分解测定中展现出约146pM的Ki和约5.40nM的IC₅₀。认为凝血酶抑制作用开始的速度归因于variegin与凝血酶相互作用的天性且有效用于这样的临床情形中，其中需要迅速有效抗凝作用，诸如急性心肌梗死、血栓形成性中风、肺栓塞或弥散性血管内血凝固后的急救应用。本文中所示的数据显示variegin具有0.86小时的血浆半衰期和117.2小时的终点消除半衰期。本文中所示的放射自显影法研究显示variegin通过肾途径迅速排泄，这证实其有可能通过有效用于手术过程中的短期抗凝固。

已经阐明了凝血酶的晶体结构，并且公知凝血酶的活性位点、外位点I和外位点II的特征和位置。凝血酶高度同源于其他丝氨酸蛋白酶，诸如胰凝乳蛋白酶，且具有活性位点袋，其中底物被两个带电区域，外位点I和II环绕着结合。术语凝血酶的“活性位点”、“外位点(exosite)I”和“外位点II”，用于本文中时，因此意欲指现有技术中所述的，例如Lane等(Blood(血液)，2005年10月15日；106(8)：2605-12)中所述的这些位点。

简言之，术语“活性位点”用于描述凝血酶中的袋，其中纤维蛋白原底物结合且其包含由60环-和γ-环加框(framed)的活性丝氨酸残基(S195)。60-环是疏水性的，其具有由两个相邻的Pro残基(P60b，P60c)提供的结构刚性。其与底物的疏水性残基，裂解位点的N端相互作用。γ-环更易变，是亲水性的，且可以使得与裂解位点C端的残基相接触。术语“外位点I”用于本文中时，是与集中在残基K36，H71，R73，R75，Y76，R77a，和K109/110上的活性位点相邻的位点。术语“外位点II”用于本文中时，是与集中在残基R93，K236，K240，R101，和R233上的活性位点相邻的位点，其位于与外位点I相对的凝血酶位点上。

本发明的一种或多种分子可以通过静电相互作用与凝血酶上的位点相互作用。所述静电相互作用可以是短程静电相互作用和/或远程静电相互作用。优选地，静电相互作用足够强以在所述分子和凝血酶上的位点之间形成离子键。

本发明的分子抑制凝血酶活性的能力可以通过本领域中已知的标准测定确定。例如，凝血酶酰胺分解活性可以通过在存在S2238的条件下用假定的凝血酶抑制剂温育凝血酶后检测对-硝基苯胺的形成来评估。本发明的分子可以具有小于30nM，小于25nM，小于20nM，小于15nM，小于14nM，小于13nM，小于12nM，或小于11nM的IC₅₀。优选地，当以所述凝血酶酰胺分解测定评估时，本发明的分子具有小于10nM，优选小于9nM，小于8nM，小于7nM，小于6nM，小于5nM，小于4nM，小于3nM，小于2nM或小于1nM的IC₅₀。本发明的分子可以具有小于小于15nM，小于10nM，小于5nM，小于1nM，小于750pM，小于500pM，小于400pM，小于300pM，或小于250pM的Ki。优选地，当以所述凝血酶酰胺分解测定评估时，本发明的分子具有小于200pM，优选小于150pM，小于100pM，小于50pM，小于30pM，小于25pM，小于20pM，小于15pM的Ki。优选地，本发明的第一或第二方面的一种或多种分子通过阻止纤维蛋白原接近凝血酶的活性位点抑制凝血酶活性。本发明分子的纤维蛋白原溶解(fibrinogenolytic)活性可以通过检测延长纤维蛋白原凝固时间，例如，通过用纤维蛋白原温育所述分子和通过添加凝血酶起始凝固来评估。

本发明第一和第二方面的一种或多种分子与凝血酶分子上的位点相互作用的能力可以通过一些方法，诸如本文中实施例中所述的那些确定。例如，在上述测定中具有酰胺分解活性的分子能够与凝血酶活性位点相互作用，而纤维蛋白原溶解活性需要纤维蛋白原与凝血酶的活性位点和外位点I二者的结合。表现出酰胺分解活性和纤维蛋白原溶解活性的分子可以因此推断与活性位点和外位点I二者相互作用。所述分子与外位点II相互作用的能力可以通过分析反应结合动力学变化评估。与外位点II的相互作用的存在似乎导致快速结合特征，且与外位点II相互作用的残基的缺失导致结合特征由快到慢的变化。缺失突变体可以用于确定与这些不同的位点结合的分子中的结构域的精确位置。

优选地，本发明第一方面的方法中使用的一种或多种分子和本发明第二方面的一种或多种分子特异性抑制凝血酶。优选地，本发明的一种或多种分子表现出非常低的抑制其他丝氨酸蛋白酶的水平，优选完全不抑制其他丝氨酸蛋白酶。本发明的一种或多种分子特异性抑制凝血酶的能力可以通过以上述酰胺分解测定评估其抑制多种丝氨酸蛋白酶的酰胺分解活性测试，所述测定使用关于各种丝氨酸蛋白酶的特异性发色团底物。优选地，本发明的一种或多种分子不抑制其他的血纤蛋白溶解丝氨酸蛋白酶(诸如纤维蛋白溶酶，TPA和尿激酶)，抗凝血剂蛋白酶APC或其他抗凝血剂丝氨酸蛋白酶(诸如FXIIa，FXI1，FX1，FIXa，FVIIa和激肽释放酶)，或其它经典丝氨酸蛋白酶(诸如胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶)。

优选地，本发明第一方面的方法中使用的一种或多种分子和本发明第二方面的一种或多种分子具有无规卷曲结构。本发明分子的无规卷曲结构可以通过圆形二色性光谱法评估。

本发明第一方面的方法中使用的一种或多种分子和本发明第二方面的一种或多种分子在体内施用时，可以具有小于1小时的半衰期。

如上所公开地，本发明第一方面的方法中使用的分子和本发明第二方面的分子优选是variegin蛋白或其功能等价物。

Variegin蛋白发明的“功能等价物”包括这样的分子，其与variegin蛋白表现出显著的结构相似性并保持上述本发明分子的优选特征。具体地，功能等价物保持与凝血酶上的外位点I和活性位点相互作用和优选与凝血酶上的外位点I、外位点II和活性位点相互作用的能力。Variegin蛋白的功能等价物因此优选具有无规卷曲结构，连同本发明的其他分子保持上述优选Ki和IC50值，并表现出特异性抑制凝血酶活性的能力。

本文中所示的结果显示variegin蛋白对凝血酶的亲和性是这样的，即与二价或单价直接凝血酶抑制剂诸如比伐卢定不同，variegin蛋白即使在已被凝血酶裂解时，不显示出凝血酶活性的任何显著缺失。假定variegin蛋白在若干位点处相互作用的能力导致蛋白质与凝血酶活性位点强亲和性，且该强亲和性通过即使在被凝血酶裂解后的variegin裂解产物维持。这些裂解产物因此被共同认为是variegin蛋白的功能等价物。Variegin蛋白在氨基酸10和11之间被凝血酶裂解。本发明第一方面的方法可以因此包括通过使凝血酶暴露于具有氨基酸序列SDQGDVAEPK(SEQ ID NO 2)和MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(MH22)(SEQ ID NO 3)的variegin裂解产物或这些裂解产物的功能等价物而抑制凝血酶活性。另外，本发明第三方面的复合物可以包括凝血酶和具有氨基酸序列SDQGDVAEPK(SEQ IDNO 2)和MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(SEQ ID NO 3)的variegin的裂解产物，或这些裂解产物的功能等价物。

Variegin序列或裂解产物的功能等价物还包括变体，其中variegin蛋白序列，或variegin蛋白裂解产物序列中的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多氨基酸被置换为备选的氨基酸，条件是保持在外位点I和活性位点处，优选在外位点II，外位点I和活性位点处与凝血酶相互作用的能力。优选地，变体应该包含与原始variegin蛋白序列相比保守的氨基酸置换。典型的所述置换在Ala，Val，Leu和Ile之中；在Ser和Thr之中；酸性残基Asp和Glu之中；在Asn和Gln之中；在碱性残基Lys和Arg之中；或在芳香族残基Phe和Tyr之中。

本文中所示的结果证明variegin蛋白变体的存在，所述变体在variegin蛋白序列的位置4，5，6，8，11，12，13，14，17，18，25和31中一些或全部处具有氨基酸置换。本文中所示的结果还证明在位置10和22处具有氨基酸置换的variegin蛋白序列突变体保持凝血酶抑制活性。Variegin蛋白的优选功能等价物因此包括在这些位置中的一处或多处具有氨基酸置换的变体。优选的功能等价物包括这样的变体，其中位置4的Gly被Ala或Ser替换，位置5处的Asp被Gly替换，位置6处的Val被Arg替换，位置8处的Glu被Gln替换，位置10处的Lys被Arg替换，位置11处的Met被Leu替换，位置12处的His被Pro替换，位置13处的Lys被Arg替换，位置14处的Thr被Asn替换，位置17处的Pro被Gln替换，位置18处的Phe被Gly替换，位置22处的Ala被Glu替换，位置25处的Glu被Asp替换，或位置31处的Glu被His替换。功能等价物包括包含这些变化中的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或全部14种的变体。优选的变体是这样的变体，其中位置31处的Glu被His替换，所述变体具有氨基酸序列SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDHS(SEQ ID NO 4)。该变体可以另外包括位于以上提及的位置处和分子中其他位置处的置换。本发明另一种变体是裂解产物之一的变体，其在variegin序列的位置22处具有Glu到Ala的氨基酸置换，其由此具有序列MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES(MH22A22E)(SEQ ID NO 7)。

优选地，所述variegin蛋白或裂解产物的变体表现出改善的抑制凝血酶活性的能力。所述改善的抑制凝血酶活性的能力可以归因于与凝血酶上的外位点I、外位点II和/或活性位点中的一种或多种改善的相互作用。改善的凝血酶活性抑制可以通过利用本文中所述的测定确定所述变体的IC₅₀和Ki值来评估。所述变体还可以表现出与variegin蛋白类似的体内半衰期。

术语“功能等价物”还包括variegin蛋白的片段或其变体的片段，条件是这些片段保持与凝血酶上的外位点I和活性位点，优选与凝血酶上的外位点I、外位点II和活性位点相互作用的能力。所述片段典型地与variegin蛋白序列或其变体相一致，区别仅在于由variegin蛋白序列N端缺失1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸和由C端缺失1，2，3或4个氨基酸。所述片段还可以在上述位置中的一处或多处包含氨基酸置换。所述片段的实例包括具有选自以下各项的氨基酸序列的片段：

EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(EP25)(SEQ ID NO 6)

EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES(EP25A22E)(SEQ ID NO 7)

EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(EP21)(SEQ ID NO 8)

MHKTAPPFDFEAIPEEYL(MH 18)(SEQ ID NO 20)

DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(DV24)(SEQ ID NO 9)

DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEYL(DV24K10R)(SEQ ID NO 10)

SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(SEQ ID NO 11)

SDQADRAQPKLHRNAPQGDFEAIPDEYL(SEQ ID NO 12)

SDQSGRAQPKLPRNAPQGDFEAIPDEYL(SEQ ID NO 13)

SDQGDVAEPKMHKTAPPGDFEAIPEEYLD(SEQ ID NO 14)

SDQADVAEPKMHKTAPPGDFEAIPEEYLD(SEQ ID NO 15)

功能等价物还包括variegin蛋白及其变体和片段的修饰形式，其通过将糖基团或聚合物基团添加到variegin蛋白或其变体内的氨基酸中修饰。具体地，功能等价物包括variegin蛋白的糖基化形式。在variegin的天然形式中，全长序列的位置14处的Thr被己糖部分修饰。功能等价物因此包括在对应于variegin蛋白序列的位置14的位置处被糖基化修饰的variegin蛋白，和上述variegin蛋白的变体和片段。功能等价物还包括在其他位置处被糖基化修饰的variegin蛋白及其变体和片段。优选地，糖基化包括引入己糖残基。功能等价物还包括variegin蛋白及其变体和片段的PEG化形式。所述PEG化形式可能特别有效用于延长这些分子在某些医学应用中的半衰期。

按照本发明使用的功能等价物还可以是融合蛋白，其例如通过将框内编码variegin蛋白或其变体或片段多核苷酸克隆到异源蛋白序列的编码序列获得。术语“异源”，当用于本文中时，意指除variegin蛋白或其功能等价物以外的任何多肽。在N或C端包含所述融合蛋白的异源序列的实例如下：膜结合蛋白的胞外结构域，免疫球蛋白恒定区(Fc区)，多聚化结构域，胞外蛋白的结构域，信号序列，输出序列，或容许通过亲合层析法纯化的序列。这些异源序列中的许多可在商业上在表达质粒中获得，因为这些序列普遍包含在融合蛋白中，从而在不显著削弱该蛋白与其融合的特异性生物学活性的条件下提供另外的特性(Terpe K，Appl MicrobiolBiotechnol(应用微生物学和生物技术)，60：523-33，2003)。所述另外的特性的实例是在体液中较长久的半衰期，胞外定位，或通过标记物诸如组氨酸或HA标记物容许的较容易的纯化程序。

融合蛋白还应该具有医学应用。例如，由于variegin蛋白及其功能等价物能够结合凝血酶，所以它们可以用作将治疗分子运送到血纤蛋白或血小板血栓位点的工具。异源蛋白可以因此是有效用于治疗血纤蛋白或血小板血栓的治疗分子。优选地，所述治疗分子是抗炎试剂或溶血栓试剂。

异源蛋白还可以是标记结构域。优选地，标记结构域是荧光标记物，容许通过亲和性结合纯化的表位标记物，容许组织化学或荧光标记的酶标记物，或放射化学标记物。在优选的实施方案中，标记结构域是放射化学标记物。所述融合蛋白应该用作诊断工具。例如，由于variegin蛋白能够结合凝血酶，所以其在与合适的标记结构域，诸如合适的放射化学标记物相连接时，可以用作成像血纤蛋白或血小板血栓的工具。

用于生成融合蛋白的方法是本领域中的标准，且应该是技术人员读者已知的。例如，最普通的分子生物学、微生物学、重组DNA技术和免疫学技术可以参见Sambrook等(2000)或Ausubel等(1991)。一般地，融合蛋白可以最方便地由核酸分子通过重组方式生成，在所述核酸分子中，两个核酸序列在框内融合在一起。这些融合蛋白应该由包含所讨论的融合蛋白的相关编码序列的核酸分子编码。

功能等价物还包括上述variegin蛋白、变体、片段、修饰的变体或片段、或融合蛋白的多聚体。这些多聚体组成本发明的另一方面，以及有效用于本发明第一方面的方法。认为所述variegin蛋白的多聚体可以特别有效用于结合和抑制大量凝血酶。这些多聚体中的variegin蛋白可以都通过它们的C端与中间连接体部分相连。备选地，variegin蛋白可以以长串N端与C端相连。优选地，所述多聚体包括variegin蛋白或其变体、片段功能等价物的2，3，4，5或更多个拷贝。所述多聚体中的variegin蛋白或其功能等价物可以都彼此相同，或它们可以不同。例如，多聚体可以包括variegin的若干不同变体。

本发明第一方面的方法可以在体外或体内进行。

当所述方法在体外进行时，其可以在无细胞系统中或在包含编码与凝血酶相互作用的一种或多种分子的核苷酸序列的细胞中进行。本发明因此还提供核酸分子，其包含编码按照本发明第二方面的凝血酶抑制剂的核苷酸序列，其应该有效用于本发明第一方面的方法中。所述分子包括单链或双链DNA、cDNA和RNA，以及合成的核酸种类。优选地，所述核酸序列包括DNA。当本发明的方法如下所述在体内执行时，也可以使用这些核酸序列。

本发明还包括克隆和表达载体，其包含本发明这个方面的核酸分子。所述表达载体可以将适当的转录和翻译控制序列，例如，增强子元件、启动子-操纵子区，终止终止序列，mRNA稳定性序列，起始和终止密码子或核糖体结合位点，与本发明的核酸分子框内合并相连。另外地，可以方便地引起由某些宿主分泌一种或多种重组凝血酶抑制剂分子。因此，所述载体的其他成分可以包括编码分泌物的核酸序列，信号传导和处理序列。

按照本发明的载体包括质粒和病毒(包括噬菌体和真核病毒)，以及其他线性或环状DNA载体，诸如使用转座因子或同源重组技术的那些。在本领域中已知并记载了许多这样的载体和表达系统(Fernandez & Hoeffler，1998)。特别合适的病毒载体包括基于杆状病毒-，腺病毒-和牛痘病毒的载体。

用于重组表达的合适宿主包括普遍使用的原核物种，诸如大肠杆菌(E.coli)，或可以用于表达高水平重组蛋白和可以容易地大量生长的真核酵母。体外生长的哺乳动物细胞系也是合适的，特别是当使用病毒引发的表达系统时。另一种合适的表达系统是杆状病毒表达系统，其包括使用昆虫细胞作为宿主。表达系统还可以组成具有引入它们的基因组中的DNA的宿主细胞。蛋白，或蛋白片段还可以体内，例如在昆虫幼虫或在哺乳动物组织中表达。

可以使用多种技术将载体引入到原核或真核细胞中。合适的转化或转染技术充分记述在文献(Sambrook等，1989；Ausubel等，1991；Spector，Goldman & Leinwald，1998)中。在真核细胞中，表达系统根据系统需要，可以是瞬时的(例如，游离型的)或永久的(染色体整合)。

本发明还提供反义核酸分子，其在高度严格杂交条件下与编码按照本发明第二方面的凝血酶抑制剂的核酸分子杂交。高度严格杂交条件在本文中定义为在包含50％甲酰胺，5XSSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5x Denhardt杂交溶液，10％葡聚糖硫酸酯，和20微克/ml变性、剪切鲑鱼精子DNA的溶液中在42℃过夜温育，随后在约65℃，在0.1X SSC中清洗滤器。在优选的实施方案中，能够被检测的标记物附着于这些反义核酸分子。优选地，所述标记物选自由放射性同位素、荧光化合物和酶组成的组。

本发明还包括转化或转染的原核或真核宿主细胞，其包含核酸分子，反义核酸分子或如上定义的载体。优选地，所述宿主细胞是原核细胞，优选大肠杆菌细胞。当本发明的方法在体外执行时，其可以在所述细胞中执行。

本发明的另一方面提供用于制备按照本发明第二方面的凝血酶抑制剂分子的方法，其包括在这样的条件下培养含有按照本发明的核酸分子的宿主细胞，通过所述条件表达蛋白并回收由此产生的蛋白。由此产生的凝血酶抑制剂可以用在本发明第一方面的方法中。

当本发明第一方面的方法在体内执行时，其可以用于治疗。具体地，体内执行的方法可以用于治疗或预防血液凝固病症。

按照本发明第一方面的优选实施方案，由此提供治疗患有凝血病的患者或预防患者发展为凝血病的方法，其包括抑制凝血酶与外位点II和凝血酶分子上活性位点处的纤维蛋白原的相互作用。优选地，本发明第一方面的这个实施方案的方法包括抑制凝血酶与凝血酶的全部外位点I、外位点II和活性位点处的纤维蛋白原的相互作用。

优选地，本发明这个方面的方法包括向患者供应本发明第二方面的一种或多种分子，其通过与外位点I和活性位点相互作用，优选通过与外位点I、位点II和活性位点相互作用的一种或多种分子相互作用抑制凝血酶。优选地，所述一种或多种分子是variegin蛋白或其功能等价物，如上所述。备选地，所述方法可以包括供应编码所述本发明第二方面的一种或多种分子的核酸，如上所述。

通过“凝血病”意指任何血液凝固病症。术语“治疗有效量”意指治疗或改善靶向的疾病或病症所需的化合物的量。术语“预防有效量”用于本文中时，意指预防靶向的疾病或病症所需的化合物的量。准确的剂量通常应该取决于施药时患者的状态。当确定剂量时可能考虑的因素包括患者中疾病状态的严重性，患者的一般健康状态，年龄，体重，性别，饮食，施药的时间和频率，药物组合，反应灵敏性和患者对治疗的耐受性或响应。精确的量可以通过常规实验确定，但是可能最终依赖于临床医生的判断。一般地，有效剂量应该是0.01mg/kg(药物质量与患者质量相比)-50mg/kg，优选0.05mg/kg-10mg/kg。

当本发明的方法在体内执行时，与凝血酶相互作用的一种或多种分子，或编码它们的核酸分子，优选以与药用载体联合的药物组合物的形式提供。

术语“药用载体”，用于本文中时，包括基因、多肽、抗体、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸和失活病毒粒子或实际上任何其他试剂，条件是该赋形剂本身不诱导毒性作用或导致产生对接受药物组合物的个体有害的抗体。药用载体可以另外包含液体，诸如水、盐水、甘油、乙醇或辅助性物质诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。赋形剂可以容许所述药物组合物被配制为片剂、丸剂、糖衣丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆料、混悬液，以协助患者摄取。药用载体的彻底讨论可见于Remington′sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)(Mack Pub.Co.，N.J.1991)。

抗凝血剂和凝血酶抑制剂，特别地，在治疗和预防广泛疾病和病症中具有应用。上述分子和组合物可以用在任何这样的情形中，其中需要诱导抗凝固作用，以预防或治疗凝血病。

当需要抗凝固作用时，治疗包括为了诊断或治疗原因涉及经皮、经血管或经器官导管插入术的程序。所述程序可以包括但不仅限于：冠状血管成形术；血管内支架程序；通过动脉或静脉导管直接施用溶血栓试剂，诸如中风或冠状动脉血栓症后；电复律(electrical cardioversion)；放置心脏起搏器导程；血管内和心脏内监测压力、气体饱和度或其他诊断参数；放射学或涉及经皮或经器官导管插入术的其他程序；以确保长期植入血管内母体营养导管的开放性；从而确保血管进入端口无论长期或短期的开放性。

已经证明了二价直接凝血酶抑制剂诸如比伐卢定比肝素及其类似物优越地用在所述程序中(Lehman，S.J.，和D.P.Chew.2006，Vasc Health RiskManag(血管健康分析管理)2：357-63；Maclean，A.A.等，2006.Tech VascInterv Radiol(相关和干涉放射学技术)9：80-3；Lewis，B.E.，和M.J.Hursting.2007.，Expert Rev Cardiovasc Ther(心血管治疗专家综述)5：57-68.；Watson，K.等，2007，Pharmacotherapy(药物疗法)27：647-56.)。具体地，手术前后出血的发生频率基本下降，且在患有急性冠状综合征(ACS)的患者中，随后的MI发生频率下降(Stone，G.W.等，2006，N Engl J Med(新英格兰医学杂志)355：2203-16.；Manoukian，S.V.等，2007.J Am CollCardiol(美国心脏病学学院杂志)49：1362-8.；Stone，G.W.等，2007，Lancet369：907-19)。因此预期，上述凝血酶抑制剂也应该比肝素及其类似物优越地用在所述程序中。

本发明第一方面的方法的另外体内应用包括在血栓栓塞事件后的紧急抗凝固作用，包括但不仅限于：急性心肌梗死；血栓形成性中风；深度静脉血栓症；血栓性静脉炎；肺栓塞；栓塞和微栓塞发作，其中来源可以是心脏，动脉粥样硬化斑，瓣膜或血管修复物或未知来源；弥散性血管内凝固(DIC)。

本发明的方法还可以用于在器官灌注程序过程中，诸如在心肺分流术，肝分流术和作为器官移植附件过程中预防凝固。由CPB促成的大量血栓形成反应不能被间接凝血酶抑制剂诸如肝素及其类似物完全拮抗(Edmunds，和Colman.2006，Ann Thorac Surg(胸部手术记录)82：2315-22.)。

当需要抗凝固作用时的其他实例包括在血液透析、血液过滤或血浆交换程序中。抗凝固作用在涉及交叉夹紧血管的手术程序过程中也可能是需要，从而最小化末梢循环中的凝固风险。这样的程序可以包括但不仅限于动脉内膜切除术、插入血管支架、修补大动脉和其他动脉动脉瘤。

另外地，本发明的方法和凝血酶抑制剂可以有效用于在肝素抗性患者中诱导抗凝固作用。

所述方法和凝血酶抑制剂还可以有效用于治疗或预防肝素诱导的血小板减少症。所述治疗可以施用于患有或处于HIT风险和患有或不患有活性血栓症的患者，且可以施用直到血小板计数恢复到正常范围内或直到血栓症风险已经度过(Girolami和Girolami 2006，Semin Thromb Hemost(血栓症和止血法研究会)32：803-9；Lewis，B.E.，和M.J.Hursting.2007.ExpertRev Cardiovasc Ther(心血管治疗专家综述)5：57-68.)。

按照本发明的具体方面，所述体内方法涉及向患有由凝血酶累积引起的病症的患者供应融合蛋白，所述融合蛋白包含处于治疗有效量的本发明第二方面的凝血酶抑制剂，其遗传地或化学地与治疗分子融合。本发明的方法涉及与凝血酶的直接相互作用。该特征意味着它们可以用于将治疗分子运送到凝血酶累积位点。优选地，所述治疗分子是抗炎试剂或溶血栓试剂。优选地，所述病症是血纤蛋白或血小板血栓。

凝血酶抑制剂可以通过任何合适的途径施用。优选施药途径包括静脉内、肌肉内或皮下注射和口服施用。治疗可以通过静脉内灌输或作为单一或重复推注连续施用。凝血酶抑制剂可以单独施用于患者或可以与其他试剂、药物或激素组合施用。例如，本发明的凝血酶抑制剂可以与口服抗凝血剂诸如香豆素衍生物一起施用，直到患者变得稳定化的时刻，其后，可以用香豆素衍生物单独处理患者。

本发明还提供本发明第一方面的方法可以用于诊断。由于这些方法涉及通过与凝血酶相互作用特异性抑制凝血酶活性，所以它们可以用于检测凝血酶的存在并由此用于诊断由凝血酶累积导致的病症，诸如血纤蛋白或血小板血栓。本发明因此提供本发明第一方面的方法可以涉及诊断由凝血酶累积引起的病症，其通过将如上所述的本发明第二方面的凝血酶抑制剂施用于患者或由患者分离的组织，和检测所述凝血酶抑制剂或其功能等价物的存在实现，其中所述凝血酶抑制剂或与凝血酶结合的功能等价物的检测指示所述疾病或病症。优选地，凝血酶抑制剂或功能等价物采用融合蛋白的形式，其包含如上更详细描述的用于促进检测的标记结构域。优选地，所述标记结构域是放射化学标记物，由此检测可以利用已知的成像方法进行。优选地，所述疾病或病症是血纤蛋白或血小板血栓。

按照本发明第一方面的另一方面，本发明第一方面的体内方法可以用于治疗恶性肿瘤疾病或与恶性肿瘤疾病有关的病症。

数十年来，已经公认恶性肿瘤疾病通常与增加的血栓栓塞发作倾向有关。例如，Trousseau综合征的特征在于短暂的血栓性静脉炎和潜在的恶性肿瘤，且凝血酶抑制剂诸如肝素已经用在其处理中(Varki A.Trousseau′sSyndrome：multiple definitions and multiple mechanisms(Trousseau综合征：多重定义和多种机制).Blood(血液)2007)。更近期，变得清楚的是，前凝血剂因子诸如凝血酶的产生可能是恶性肿瘤疾病某些方面的原因而非结果(Nierodzik ML，Karpatkin S.Thrombin induces tumor growth，metastasis，and angiogenesis：Evidence for a thrombin-regulated dormant tumor phenotype(凝血酶诱导肿瘤生长、转移和血管发生：关于凝血酶调节的休眠肿瘤表型的证据).Cancer Cell(癌细胞)2006；10(5)：355-62.)。

凝血酶，VEGF和IGFII已经显示出促进癌细胞的存活和侵入(GieselerF，Luhr I，Kunze T，等Activated coagulation factors in human malignanteffusions and their contribution to cancer cell metastasis and therapy(人恶性肿瘤渗出物中的活化的凝固因子及其对癌细胞转移和治疗的贡献).Thromb Haemost(血栓症和止血法)2007；97(6)：1023-30.)。骨桥蛋白COOH端的凝血酶裂解已经显示出在小鼠中促进乳腺癌(Mi Z，Oliver T，Guo H，Gao C，Kuo PC.Thrombin-cleaved COOH(-)terminal osteopontin peptidebinds with cyclophilin C to CD147 in murine breast cancer cells(凝血酶裂解的COOH(-)端骨桥蛋白肽在鼠科乳腺癌细胞中结合亲环蛋白C-CD147).Cancer Res(癌症研究)2007；67(9)：4088-97.)。凝血酶似乎在前列腺癌转移中通过减少细胞与胞外基质的粘附和将恶性肿瘤细胞定位在用于迁移的“就绪状态”起作用(Loberg RD，Tantivejkul K，Craig M，Neeley CK，PientaKJ.PAR1-mediated RhoA activation facilitates CCL2-induced chemotaxis inPC-3cells(PAR1-诱导的RhoA活性在PC-3细胞中促进CCL2诱导的趋化性).J Cell Biochem(细胞生物化学杂志)2007)。因此，在手术诸如基本前列腺切除术或前列腺活组织检查过程中使用有效的凝血酶抑制剂可以减少将恶性肿瘤细胞释放到系统循环中并减少释放的那些细胞的存活。

本发明第一方面的方法和本发明第二方面的分子可以因此有效用于治疗Trousseau综合征，特别是当禁忌肝素及其类似物(例如，在肝素诱导的血小板减少症中)；用作抗癌试剂；和在程序诸如手术切除、恶性肿瘤操作或活组织检查过程中使用，以减小转移的风险。当本发明的这个方面中使用的分子是variegin蛋白或其功能等价物时，其优选采用已经被糖基化或PEG化的修饰形式，从而增长分子的半衰期。

本文中所示的结果提供variegin蛋白的功能结构域的首次公开，以及variegin分子的裂解产物的首次公开。具体地，本文中所示的结果公开了variegin蛋白的残基1-7与凝血酶外位点II相互作用，variegin蛋白的残基8-14与凝血酶的活性位点相互作用，且残基15-32与凝血酶外位点I结合位点相互作用。认为这些区域以全长variegin蛋白共同起作用，以抑制凝血酶活性。然而，如在导言中讨论地，许多现有的凝血酶抑制剂是单价或二价结合体。因此预期仅与凝血酶上的这些区域之一相互作用的variegin蛋白或其变体片段也应该是凝血酶抑制剂。事实上，本文中所示的结果显示含有关于凝血酶活性位点的结合位点和关于外位点I(EP25)的结合位点的片段具有与全长合成variegin蛋白类似的IC50和Ki值。仅与凝血酶内的一个或两个位点相互作用的variegin蛋白片段可以具有全长variegin蛋白关于医学应用的优势，原因在于它们更迅速地从循环中清除。这使得它们理想地用于短程序诸如心脏导管插入术中，其中不需要抗凝固作用持续到该程序结束后。

按照本发明的另一方面，因此提供凝血酶抑制剂，其中所述凝血酶抑制剂包含variegin序列的片段且包含选自以下各项的氨基酸序列：

EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(EP25-与活性位点和外位点I相互作用)(SEQ ID NO 6)

APPFDFEAIPEEYLDDES(AP18-与外位点I相互作用)(SEQ ID NO16)

SDQGDVAEPKMHKT(与外位点II和活性位点相互作用)(SEQ IDNO 17)

SDQGDVA(与外位点II相互作用)(SEQ ID NO 18)

EPKMHKT(与活性位点相互作用)(SEQ ID NO 19)

APPFDFEAIPEEYLDDES(与外位点I相互作用)(SEQ ID NO 16)

SDQGDVAEPK(裂解产物1)(SEQ ID NO 2)

MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(裂解产物2；MH22)(SEQ ID NO 3)

EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(EP21)(SEQ ID NO 8)

MHKTAPPFDFEAIPEEYL(MH18)(SEQ ID NO 20)

DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(DV24)(SEQ ID NO 9)

或其功能等价物。

本发明这个方面的凝血酶抑制剂是variegin蛋白的片段且因此不包含具有氨基酸序列SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(SEQ IDNO 1)的variegin蛋白的完整序列。然而，本发明的这个方面的凝血酶抑制剂可以在上述特异性片段序列的N或C端包含来自variegin蛋白序列的另外的氨基酸序列，条件是该凝血酶不包含variegin蛋白的所有氨基酸。

本发明这个方面的凝血酶抑制剂还包括含有多于一种上述特异性片段的分子。例如，凝血酶抑制剂可以包含SDQGDVA(SEQ ID NO 18)与外位点II相互作用)和APPFDFEAIPEEYLDDES(与外位点I相互作用)(SEQID NO 16)。优选地，这些外位点II和外位点I相互作用位点通过连接体分子相连接，所述连接体分子大约与全长variegin蛋白中存在的凝血酶活性结合位点等长。

本发明这个方面的凝血酶抑制剂可以由上述序列之一或其功能等价物组成。

按照本发明第四方面的凝血酶抑制剂优选表现出上述本发明第二方面的凝血酶抑制剂特征，诸如优选的Ki和IC50值和特异性抑制凝血酶而不抑制其他丝氨酸蛋白酶的能力。

本发明这个方面的凝血酶抑制剂的功能等价物包括这样的分子，所述分子对本发明第四方面的凝血酶抑制剂表现出显著的结构相似性并与其来源的凝血酶抑制剂保持与凝血酶相同区域相互作用的能力。按照本发明这个方面的功能等价物包括上述特异性凝血酶抑制剂的变体，其包含一个或多个氨基酸置换，所述氨基酸置换基本不改变凝血酶抑制剂与凝血酶的相互作用。优选地，所述氨基酸置换是保守的氨基酸置换，诸如关于以上本发明第一和第二方面的分子所述的那些。优选的置换是以上关于全长variegin蛋白的变体讨论的氨基酸位置处发生那些。

所述功能等价物的实例包括具有选自以下各项的氨基酸序列的变体：

EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES(EP25A22E)(SEQ ID NO 7)

DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEYL(DV24K10R)(SEQ ID NO 10)

MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES(MH22A22E)(SEQ ID NO 5)

本发明这个方面的凝血酶抑制剂的功能等价物还包括凝血酶抑制剂的片段，条件是这些片段保持抑制凝血酶活性的能力。

功能等价物还包括通过另外的基团，诸如糖基团或聚合物基团共价附着修饰的凝血酶抑制剂及其片段的修饰形式。以上关于在本发明第一方面方法中使用的功能等价物variegin蛋白提供的所述修饰的实例同等地适用于本发明这个方面的凝血酶抑制剂。

本发明第一方面的功能等价物还包括凝血酶抑制剂的融合蛋白。对于包含在所述融合蛋白中合适的配偶体连同含有全长variegin序列的融合蛋白一起在上文中讨论。

本发明还提供按照本发明这个方面的凝血酶抑制剂和凝血酶的复合物。

本发明还提供核酸分子，所述核酸分子包括编码按照本发明这个方面的凝血酶抑制剂的核苷酸序列。所述分子包括单链或双链DNA、cDNA和RNA，以及合成的核酸种类。优选地，所述核酸序列包括DNA。

本发明还包括包含这些核酸分子的克隆和表达载体。所述载体可以包含另外的控制序列，诸如关于连同本发明这个方面的方法一起使用的表达载体所述的那些和如上所述的本发明第二方面的凝血酶抑制剂。

本发明还包括反义分子，其在高度严格条件下与编码按照本发明这个方面的凝血酶抑制剂分子的核酸分子杂交。高度严格条件的实例连同本发明第一和第二方面的分子一起记述在上文中。

本发明还包括转化或转染的原核或真核宿主细胞，其包含核酸分子、反义核酸分子或编码本发明这个方面的凝血酶抑制剂分子的载体。合适的宿主细胞和用于制备所述宿主细胞的方法连同本发明的第一和第二方面记述在上文中。

本发明还包括制备按照本发明这个方面的凝血酶抑制剂分子的方法，其包括在由此表达蛋白的条件下培养包含按照本发明的核酸分子的宿主细胞和回收由此生成的蛋白。

本发明还包括按照本发明这个方面的凝血酶抑制剂在治疗中的用途。按照本发明这个方面的凝血酶抑制剂可以采用药物组合物的形式，所述药物组合物另外包含药物有效载体，如上文中讨论的。按照本发明这个方面的凝血酶抑制剂可以用于治疗或预防可以利用上述本发明第一和第二方面的方法或分子治疗的任何病症。本发明这个方面的凝血酶抑制剂还可以用于关于以上本发明第一和第二方面的方法和分子所讨论的任何诊断方法中。

现在将通过实施例的方式更详细地描述本发明的不同方面和实施方案。应该理解，在不偏离本发明范围的条件下可以对详细信息进行改进。

附图

图1.纯化凝血酶抑制剂variegin同种型。(A)在第一步中，用10-100％乙腈的梯度分馏SGE 90分钟。汇集的AV-I-AV-VIII馏分中的蛋白质浓度的范围是0.08(AV-I)-1.39μg/μl(AV-IV)。对于TT测定(对照凝固时间＝19s)：NC-添加＜0.01μg蛋白/50μl血浆后无凝固；^***添加＜0.01μg蛋白/50μl血浆后延长凝固＞1分钟；^**添加＜0.01μg蛋白/50μl血浆后延长凝固＞40s；^*与对照相比的任何凝固延迟。对于APTT测定(对照凝固时间＝40s)：NC-添加＜0.01μg蛋白/50μl血浆后无凝固；●●●添加＜0.01μg蛋白/50μl血浆后延长凝固＞1分钟；●●添加＜0.1μg蛋白/50μl血浆后延长凝固＞1分钟；●与对照相比的任何凝固延迟。对PT测定(对照凝固时间＝15s)：○○添加0.5μg蛋白/50μl血浆后延长凝固＞1分钟；○与对照相比的任何凝固延迟。(B)用10-40％乙腈梯度对馏分AV-III进行第二纯化步骤60分钟。馏分中的蛋白浓度的范围是0.05-0.17μg/μl。用S2238对具有抗凝固活性(虚线，用PT，APTT和TT测定)的馏分的范围进行测试，以获得抗凝血酶活性。用星号表示的馏分抑制凝血酶酰胺分解活性。具有最强活性的两个馏分(保留时间23.083和28.933分钟，由箭头表示)进一步利用第三纯化步骤(10-40％乙腈梯度，60分钟)纯化(n＝2)。(C)将具有保留时间23.083分钟的馏分分成两个主峰，表示为AV 3/5和AV5/5。(D)具有保留时间28.933的馏分具有一个主峰和具有一个小“肩峰”，且表示为AV 6/5。

图2.variegin的氨基酸序列及其凝血酶抑制活性。(A)馏分AV 6/5(variegin)，AV 3/5和AV 5/5中的肽序列高度类似。(B)利用S2238(100μM)作为底物，由variegin引起的凝血酶抑制的线性进程曲线的实例(■：0.020nM，□：0.039nM，●：0.078nM，○：0.156nM，▲：0.313nM，Δ：0.625nM，

1.25nM，2.5nM，◆：5nM，10nM)，其显示在混合时获得的稳态平衡。(C)利用活性位点定向的底物S2238(100μM)测定variegin(0.001nM，0.003nM，0.01nM，0.03nM，0.1nM，0.3nM，1nM，3nM，10nM，30nM和100nM)抑制凝血酶(3.33nM)酰胺分解活性的能力。由variegin(■)引起的凝血酶抑制的剂量响应曲线显示凝血酶和variegin(3.33nM)等摩尔浓度的显著抑制(～80％)。该抑制的IC₅₀是～0.99±0.02nM(n＝3)。(D)由于variegin表现为紧密结合抑制剂，由处于类似浓度(0.020nM，0.039nM，0.078nM，0.156nM，0.313nM，0.625nM，1.25nM，2.5nM，5nM，10nM)的variegin引起的凝血酶(1.8nM)抑制利用S2238(100μM)作为底物来检查。将获得的数据适用于方程式(1)和(2)，以获得Ki～10.4±1.4pM(n＝3)。

图3.由variegin引起的抑制的特异性。针对13种丝氨酸蛋白酶筛选S-variegin：血纤蛋白溶解丝氨酸蛋白酶(纤维蛋白溶酶，TPA和尿激酶)，抗凝血丝氨酸蛋白酶APC，前凝血剂丝氨酸蛋白酶(FXIIa，FXIa，FXa，FIXa，FVIIa，激肽释放酶和凝血酶)和经典丝氨酸蛋白酶(胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶)。在圆括号中分别以nM和mM给出蛋白酶和底物的最终浓度：纤维蛋白溶酶(3.61)/S2251(1.2)，TPA(36.9)/S2288(1)，尿激酶(40U/ml)/S2444(0.3)，APC(2.14)/S2366(0.67)，FXIIa(20)/S2302(1)，FXIa(0.125)/S2366(1)，FXa(0.43)/S2765(0.65)，FIXa(333)/

FIXa(0.4)，FVIIa(460)/S2288(1)，激肽释放酶(0.93)/S2302(1.1)，α-凝血酶(3.33)/S2238(0.1)，胰凝乳蛋白酶(1.2)/S2586(0.67)和胰蛋白酶(0.87)/S2222(0.1)。针对三种s-variegin浓度测试凝血酶：

代表0.01μM，代表0.1μM和

代表1μM。对于其他蛋白酶，使用更高得多的s-variegin浓度：(■)代表1μM，

代表10μM和(□)代表100μM(n＝3)。

图4.由s-variegin、EP25和AP18引起的凝血酶抑制。(A)利用活性位点定向的底物S2238(100μM)测定s-variegin、EP25和AP18抑制凝血酶酰胺分解活性的能力。由s-variegin(0.1nM，0.3nM，1nM，3nM，10nM，30nM，100nM，300nM，1000nM)引起的凝血酶(3.33nM)抑制的剂量响应曲线显示凝血酶和variegin(3.33nM)等摩尔浓度的显著抑制(～30％)。该抑制的剂量-响应曲线和IC₅₀与温育时间无关：(■)代表10min温育(IC₅₀～5.40±0.95nM)和(○)代表10min温育(IC₅₀～5.49±0.42nM)(n＝3)。(B)由EP25(0.1nM，0.3nM，1nM，3nM，10nM，30nM，100nM，300nM，1000nM)引起的凝血酶(3.33nM)抑制的剂量-响应曲线显示依赖温育时间的移动。IC₅₀在无温育条件下是～139.30±7.02nM(■)，在1分钟温育条件下是～22.55±2.52nM(○)，在2分钟温育条件下是～10.39±1.53nM(▲)，在5分钟温育条件下是～6.42±0.50nM

在10分钟温育条件下是～6.80±0.57nM(◆)和在20分钟温育条件下是～5.63±0.45nM(+)(n＝3)。(C)AP18(3μM，10μM，30μM，100μM，300μM)不能抑制S2238(100μM)上凝血酶(3.33nM)酰胺分解活性；而是在高浓度AP18时，S2238的水解略微提高(n＝3)。(D)全部三种肽，s-variegin(■；0.3nM，1nM，3nM，10nM，30nM 100nM，300nM)，EP25(○；3nM，10nM，30nM，100nM，300nM，1000nM，3000nM)和AP18(▲；0.1μM，0.3μM，1μM，3μM，10μM，30μM，100μM，300μM)延长的纤维蛋白原凝固时间(n＝3)。没有用凝血酶预温育肽。AP18抑制的凝血酶纤维蛋白原溶解活性而非酰胺分解活性，这提示结合于外位点I。

图5.s-variegin和EP25的抑制常数Ki。(A)S-variegin是凝血酶的快速和紧密结合抑制剂。S-variegin(0.313nM，0.625nM，1.25nM，2.5nM，5nM，10nM)与不同浓度S2238混合：12.5μM(■)，25μM(○)，50μM(▲)，80μM

100μM(◆)，150μM(+)，200μM(×)和300μM(*)，以确定K_i’。反应以添加凝血酶(1.8nM)开始。将数据适用于方程式(1)(n＝3)。(B)K_i’针对底物浓度的图显示线性曲线，这说明s-variegin竞争性抑制S2238上的凝血酶酰胺分解活性。通过将数据适用于方程式(2)，显示抑制常数K_i是～146.4±13.6pM。(C)尽管如果用凝血酶预温育，EP25也抑制等摩尔浓度的凝血酶，但是在无预温育条件下的起始抑制很弱。EP25的K_i在无预温育条件下以凝血酶至少8倍的浓度来确定。在这些测定条件下，EP25与凝血酶的结合不引起自由EP25浓度的显著减少，因此“紧密结合”条件不被认为用于数据适用。利用S2238(100μM)作为底物，由不同浓度的EP25引起的凝血酶(0.9nM)抑制的进程曲线：7.8nM(■)，12.5nM(□)，15.6nM(●)，25nM(○)，31.3nM(▲)，50nM

62.5nM

100nM(◇)和125nM(◆)。该进程曲线是非线性的，且显示两相均衡的典型缓慢结合抑制。将数据适用于方程式(3)，以获得所用的各种EP25浓度的k(n＝3)。(D)表观一级速度常数k针对EP25浓度的图是由方程式(4)所述的双曲线，且因此适用于该方程式以获得K_i`～529.7±76.7pM，这代表最初碰撞复合物(initial collision complex)EI的解离常数。总抑制常数K_i由方程式(5)计算，并发现是～149.8±30.5pM。

图6.由凝血酶引起的s-variegin和EP25的裂解。(A)在37℃由凝血酶裂解的s-variegin的HPLC分析的典型色谱图。(i)在温育＝0分钟，单峰对应于未裂解的s-variegin。(ii)30分钟温育后，2个新的峰似乎对应于团块(mass)1045(代表N端片段SDQGDVAEPK(SEQ ID NO 2))和团块2582(代表C端片段MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(SEQ ID NO 3))的裂解产物，而未裂解的s-variegin的量减少。(iii)裂解在180分钟温育后几乎完成。(B)在室温下，用凝血酶(5μM)温育s-variegin(150μM)不同的时间(n＝2)。s-variegin以凝血酶的30倍过量存在。由凝血酶引起的s-variegin裂解使用RP-HPLC分析。未裂解的s-variegin

团块1045(代表N端片段SDQGDVAEPK)(SEQ ID NO 2)的裂解产物

和团块2582(代表C端片段MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES)(SEQ ID NO 3)的裂解产物

的相对百分比由峰下面积计算。(C)在室温下用凝血酶(3.33nM)温育s-variegin至多24hr，并在不同的时间点测定抑制S2238(100μM)上凝血酶酰胺分解活性的能力。(D)进行类似的实验，将s-variegin替换为EP25。s-variegin或EP25的浓度：10nM(■)，100nM

和1000nM(□)(n＝2)。在100nM s-variegin或EP25时，抑制剂也以凝血酶的30倍过量存在，且因此主要用于与来自HPLC分析的裂解数据进行比较。

图7.比较variegin和其他凝血酶抑制剂。(A)n-variegin，s-variegin，EP25，AP18，比伐卢定-1和水蛭素的氨基酸序列比对显示高度类似的C端序列。N-variegin在Thr(T)处葡糖基化，比伐卢定-1含有D-Phe(F)且水蛭素在Tyr(Y)处硫酸化。TTI的序列与variegin明显不同，且没有比对。(B)显示不同类型的凝血酶抑制剂及其结构特征的示意图。(i)水蛭素：致密N端结合活性位点，酸性和延长的C端结合外位点I；(ii)rhodniin：以头-尾排列的2个Kazal类型结构域，其N端结构域结合活性位点且C端结构域结合外位点I；(iii)ornithodorin：以尾-尾排列的2个Kunitz类型结构域，其N端结构域结合活性位点且C端结构域结合外位点I；(iv)haemadin：致密N端结构域结合活性位点，酸性和延长的C端结合外位点II；(v)triabin：单β-桶状结构域结合外位点I；(vi)bothrojaracin：C型凝集素结构域的2个不同的链分别结合外位点I和外位点II。没有描述其他原型凝血酶抑制剂诸如theromin和TTI，因为缺乏详细的结构信息。(C)提议的关于EP25与凝血酶的结合机制：(i)C端上的静电电荷将EP25指引到凝血酶并随后提供特定范围的相互作用，(ii)在无N端残基(SDQGDVA(SEQ ID NO 18))的指引作用的条件下，活性位点结合部分不适当定向以适合凝血酶活性位点，因为最初碰撞复合物(EI)具有较高的K_i，且(iii)在缓慢的步骤中，活性位点结合部分(EPKMHKT(SEQ ID NO19))采用对于最适结合和形成稳定复合物的正确构象。(D)提议的关于variegin与凝血酶的结合机制：(i)variegin N端和凝血酶外位点II之间以及variegin C端和凝血酶外位点I之间的互补静电电荷将variegin指引到凝血酶，(ii)所有的静电相互作用迅速发生并预定向处于正确构象的活性位点结合部分(EPKMHKT(SEQ ID NO 19))，以快速结合凝血酶活性位点。

图8.遵从Michaelis-Menton方程式，作为底物(S2238)浓度函数的反应速度(V_max)的图。确定用Michaelis-Menton方程式计算的K_m为3.25±0.56μM，这与报告值^33，34相似。

图9.溶解在10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)中的n-variegin，s-variegin，EP25和AP18的远-UV光谱(260-190nm)。所有光谱均是典型的无规卷曲蛋白。

图10.RP-HPLC分析显示s-variegin在37℃和室温下被凝血酶裂解。(A)在37℃用凝血酶(5μM)温育S-variegin(150μM)不同的时间(n＝2)。(B)在室温下用凝血酶(5μM)温育S-variegin(150μM)不同的时间(n＝2)。未裂解的s-variegin

团块1045(代表N端片段SDQGDVAEPK)(SEQID NO 2)的裂解产物和团块2582(代表C端片段MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES)(SEQ ID NO 3)的裂解产物

的相对百分比由色谱图中的峰下面积计算。

图11.variegin的C端片段MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(MH22)(SEQ ID NO 3)的凝血酶抑制活性。评估不同浓度的MH22在室温下用凝血酶温育0min(■)，10min(●)，20min(▲)，30min120min(◆)，1080min(+)或1680min(×)后，利用活性位点定向的底物S2238抑制凝血酶酰胺分解活性的能力。

图12.MH22的酰胺分解活性减小的逆转。在使用凝血酶的延长温育(1680min预温育，IC₅₀＝479.7±16.1nM)后MH22的酰胺分解活性的减小可以通过在测定设置中包括增加浓度的BSA(1mg/ml(■)，5mg/ml(●)，10mg/ml)(▲)来逆转。

图13.MH22的Ki。MH22在不同浓度的底物(S2238)的K_i’通过描述快速和紧密结合的方程式确定。K_i’在所用的浓度范围(12.5nM-200nM)始终没有显著改变，这说明MH22是凝血酶酰胺分解活性的非竞争性抑制剂。K_i’＝K_i且发现平均K_i是13.2±0.91nM。

图14.variegin突变片段EP25A22E的凝血酶抑制活性。评估不同浓度的具有序列EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES(SEQ ID NO 7)的EP25A22E在室温下用凝血酶温育0min(■)，20min(●)或30min(▲)后，利用活性位点定向的底物S2238抑制凝血酶酰胺分解活性的能力。在EP25A22E中，s-variegin中的丙氨酸22(EP25中的丙氨酸15)被替换为谷氨酸，因为谷氨酸存在于水蛭素的相同位置。

图15.EP25A22E的Ki。EP25A22E的K_i利用缓慢结合抑制剂方程式确定并发现是0.311±0.070nM。

图16.variegin突变片段MH22A22E的凝血酶抑制活性。评估不同浓度的具有序列MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES(SEQ ID NO 5)的MH22A22E在室温下用凝血酶温育0min(■)或20min(●)后，利用活性位点定向的底物S2238抑制凝血酶酰胺分解活性的能力。MH22A22E是EP25A22E的C端裂解片段。

图17.MH22A22E的Ki。当用100μM底物(S2238)检测时，MH22A22E具有15.1±1.04nM的K_i’。

图18.variegin片段EP21的凝血酶抑制活性。评估不同浓度的EP21EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(SEQ ID NO 8)在室温下用凝血酶温育0min(■)，20min(●)或30min(▲)后，利用活性位点定向的底物S2238抑制凝血酶酰胺分解活性的能力。EP21对应于EP25，只是其在C端缺少4个残基

图19.EP21的Ki。发现通过缓慢结合方程式确定的EP21的Ki是0.315±0.024nM。

图20.variegin片段MH18的凝血酶抑制活性。评估不同浓度的MH18MHKTAPPFDFEAIPEEYL(SEQ ID NO 20)在室温下用凝血酶温育0min(■)或20min(●)后，利用活性位点定向的底物S2238抑制凝血酶酰胺分解活性的能力。MH18对应于MH22，只是其在C端缺少4个残基。

图21.MH18的Ki。利用快速和紧密结合方程式，在100μM底物(S2238)时，MH18的Ki’＝14.9±3.50nM。假设在C端除去4个残基不改变抑制机制，则MH18也是具有K_i＝14.9±3.50nM的非竞争性抑制剂。

图22.variegin片段DV24的凝血酶抑制活性。评估不同浓度的DV24DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(SEQ ID NO 9)在室温下用凝血酶温育0min(■)或20min(●)后，利用活性位点定向的底物S2238抑制凝血酶酰胺分解活性的能力。DV24对应于EP21，只是其在N端含有另外3个残基。

图23.DV24的Ki。DV24的Ki’在100μM底物(S2238)时＝9.74±0.91nM，且确定DV24的K_i是0.306±0.029nM。

图24.variegin突变片段DV24K10R的凝血酶抑制活性。评估不同浓度的DV24K 10R DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEYL(SEQ ID NO 10)在室温下用凝血酶温育0min(■)或20min(●)后，利用活性位点定向的底物S2238抑制凝血酶酰胺分解活性的能力。DV24K10R对应于DV24，只是其在位置6处含有精氨酸而非赖氨酸(氨基酸10是variegin)。

图25.DV24K10R的Ki。确定DV24K10R的K_i是0.259±0.015nM。

图26.用于显示[³H]-Variegin剂量溶液的HPLC放射色谱图。

图27.在将[³H]-Variegin单一静脉内施用于雄性白化病大鼠(0.4mg/kg)后30分钟时组织内的放射性分布。水平1-5表示穿过大鼠身体的连续1cm的纵切面。

图28.在将[³H]-Variegin单一静脉内施用于雄性白化病大鼠(0.4mg/kg)后1小时时组织内的放射性分布。水平1-5表示穿过大鼠身体的连续1cm的纵切面。

图29.在将[³H]-Variegin单一静脉内施用于雄性白化病大鼠(0.4mg/kg)后30分钟时肾内的放射性分布。

实施例

实施例1：分析variegin和EP25

材料和方法

材料

人柠檬酸盐血浆由斯洛伐克心血管病研究所(Slovak Institute ofCardiovascular Diseases)的血液学和输血学部(Department of Hematologyand Transfusiology)提供。Thromboclotin试剂来自Dade AG(Düdingen，瑞士)。促凝血酶原激酶(Thromboplastin)IS试剂和肌动蛋白FS活化PTT试剂来自Dade国际公司(迈阿密，佛罗里达)。9-芴基甲氧羰基(Fmoc)-L-氨基酸、Fmoc-PEG-PS支持树脂、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、处于DMF中的20％v/v哌啶、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，-3-四甲基uronium六氟磷酸酯(HATU)和N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)来自Applied Biosystems(应用生物系统)(Foster City，加利福尼亚)。三氟乙酸(TFA)、1，2-乙烷二硫醇、苯硫基甲烷、牛胰凝乳蛋白酶和牛血清清蛋白(BSA)来自Sigma Aldrich(西格玛奥德里奇)(St.Louis，密苏里州)。人纤维蛋白原，FXIIa，组织纤维蛋白溶酶原活化剂(TPA)，尿激酶，激肽释放酶和牛胰蛋白酶来自MerckChemicals Ltd.(默克化学制品公司)(Nottingham，英国)。人类因子IXa(FIXa)，因子Xa(FXa)，因子XIa(FXIa)，APC和纤维蛋白溶酶来自Hematologic Technologies，Inc.(血液学技术公司)(Essex Junction，佛蒙特州)。人类因子VIIa(FVIIa)和重组α-凝血酶是来自Chemo-Sero-TherapeuticResearch Institute(化学-血清学-治疗研究所)(KAKETSUKEN，日本)21，22的礼物。发色底物S2222，S2238，S2251，S2288，S2302，S2366，S2444，S2586和S2765来自Chromogenix(米兰，意大利)。

FIXa来自American Diagnostica Inc.(美国诊断公司)(斯坦福，康涅狄格州)。使用的所有其他化学制品和试剂均是分析等级的。

唾液腺提取和蛋白质浓度评估

先前描述了彩饰花蜱(A.variegatum)SGE提取程序和分馏过程中蛋白质浓度的评估²³。

variegin同种型的纯化

Variegin通过使用Beckman Instruments(贝克曼仪器)126/168 DADHPLC系统(Fullerton，加利福尼亚)的三步反相HPLC程序纯化。在第一步中(图1A)，将SGE加载到Vydac C-4(5μm；250x4.6mm)柱(Grace Vydac，Hesperia，加利福尼亚)上。利用Beckman Ultrasphere(贝克曼超球)C-18(5μm；250x4.6mm)柱，对汇集的含有最强抗凝血剂活性的馏分(图1A，馏分AV-III)进行第二步(图1B)。最后，利用Vydac C-18(5μm；250x4.6mm)柱进一步纯化各种馏分，以获得三种有效抗凝血酶活性的馏分：AV 6/5，AV3/5和AV 5/5(图1C-D)。AV 6/5馏分中的主要成分称为variegin。

凝固测定

凝血酶时间(TT)，凝血酶原时间(PT)和活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测定用于SGE和馏分中抗凝固活性的最初筛选。柠檬酸盐人血浆(50μl)用最多5μl SGE或相同体积的150mM NaCl(对照)在37℃预温育1分钟。加入相应的试剂(TT：50μl Thromboclotin试剂；PT：100μl促凝血酶原激酶IS试剂；APTT：50μl肌动蛋白FS活化PTT加入3min并开始与50μl 20mM CaCl₂反应)后，形成血纤蛋白凝块所需要的时间利用秒表视觉确定。

在Oxford Hemophilia Centre of Churchill Hospital(丘吉尔医院牛津血友病中心)(牛津，英国)中，检验粗SGE和三种馏分(AV 6/5，AV 3/5和AV5/5)的活性。TT，PT和APTT利用MDA-180分析仪(Organon Teknika Ltd.，剑桥，英国)进行。将10μl SGE或含有AV 6/5，AV 3/5和AV 5/5的稀释馏分加入到290μl血小板不足的血浆中，混合并在37℃温育5分钟。还利用凝血弹性描记图分析仪(Thromboelastograph Analyzer)(Haemoscope Inc.，Skokie，伊利诺斯州)来验证活性。将5μl样品加入到335μl柠檬酸盐全血中，温育5分钟并在重新石灰化(recalcification)后在TEG上运行样品。

蛋白序列分析

AV 6/5，AV 3/5和AV 5/5中存在的蛋白的分子量由Eurosequence(Groningen，荷兰)使用装备有氮激光(337nm)和无栅延时提取离子源的BIFLEX(Bruker-Franzen，Bremen，Germany)基质辅助激光解吸附/离子化反射时间飞行(MALDI-TOF)质谱仪来确定。部分氨基酸序列通过使用自动化测序仪(494型，Applied Biosystems(应用化学系统))的N端Edman-降解来确定。AV 6/5的完整序列通过MALDI-MS分析确定。

肽合成和纯化

在应用生物系统先锋433A型肽合成仪(Applied Biosystems PioneerModel 433A Peptide Synthesizer)上，利用固相肽合成法合成三种肽(s-variegin，EP25和AP18)。氨基酸的Fmoc基团通过DMF中的20％v/v哌啶去除并利用HATU/DIPEA原位中和化学偶联。所有的肽在预加载的PEG-PS树脂上合成。由TFA/1，2-乙烷二硫醇/苯硫基甲烷/水的混合物引起的裂解释放肽酸(-COOH)。合成的肽通过在使用SunFire^TM C18(5μm；250mmx10mm)(Waters，Milford，马萨诸塞州)柱的

纯化仪(GEHealthcare(GE卫生保健)，Uppsala，瑞典)上RP-HPLC纯化。所有肽的纯度和质量均通过利用Perkin-Elmer Sciex API 300LC/MS/MS系统(Perkin-Elmer Sciex，Selton，康涅狄格)的电喷离子化质谱法(ESI-MS)确定。

圆形二色性(CD)光谱法

利用Jasco J-810偏振分光计(Easton，马里兰)记录溶解在10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)中的variegin，s-variegin，EP25和AP18的远-UV CD光谱(260-190nm)。所有的测量在室温下利用0.1cm径长的小管，以50nm/min扫描速度，0.2nm的分辨率和2nm的带宽进行。

抑制凝血酶酰胺分解活性

关于S2238上的凝血酶酰胺分解活性的所有测定均在96-孔微滴定板中，含有100mM NaCl和1mg/ml BSA的50mM Tris缓冲液(pH 7.4)中，室温下进行。典型地，在添加100μl S2238前，对100μl肽和100μl凝血酶预温育不同的期间。使用ELISA板读数器，在405nm观察形成有色产物对-硝基苯胺的速度10分钟。百分比抑制通过将缺乏抑制剂条件下吸光度的增加率作为0％来计算。利用Origin software(原点软件)(MicroCal，Northampton，马萨诸塞州)拟合剂量-响应曲线，从而计算IC₅₀值。

确定抑制常数K_i

利用S2238作为底物确定抑制常数K_i。当酶受到等摩尔浓度的抑制剂抑制时，抑制剂与酶的结合导致自由抑制剂浓度的显著减小。该紧密结合抑制通过以下方程式²⁴描述：

V_s＝(V_o/2E_t){[(K_i’+I_t-E_t)²+4K_i’E_t]^1/2-(K_i’+I_t-E_t)}(1)

其中V_s是稳态速度，V_o是缺乏抑制剂条件下观察到的速度，E_t是总酶浓度，I_t是总抑制剂浓度且K_i’是表观抑制常数。对于竞争抑制，K_i通过方程式(2)与K_i’相关：

K_i’＝K_i(1+S/K_m) (2)

其中K_i’随S线性增加，K_i是抑制常数，S是底物浓度且是关于S2238的米氏常数(Michaelis constant)(确定为3.25±0.56μM，图8，与报告值^24，25相似)。发现variegin和s-variegin均是紧密结合抑制剂。利用Originsoftware(原点软件)将数据适用于这些方程式。

如果抑制剂与酶的相互作用速率很慢，以使得缓慢达到受抑制的稳态速度，则该缓慢结合抑制的产物形成的进程曲线通过方程式(3)²⁶描述：

P＝V_st+(V_o-V_s)(1-e^-kt)/k+P_o (3)

其中P是形成的产物的量，P_o是产物的初始量，V_s是最终稳态速度，V_o是初始速度，t是时间，和k是表观一级速度常数。

存在两种可能的用于描述所述缓慢结合反应的最小动力学机制^26，27：

方案(1)：

其中E是酶，I是抑制剂和EI^*是稳定的酶-抑制剂复合物，K₁是结合率常数和K₂是解离率常数。在该方案中，缓慢结合主要归因于缓慢的K₁。表观一级速度常数将随抑制剂浓度线性增加。备选地：

方案(2)：

其中EI是最初碰撞复合物，K₃是正向异构化速率和K₄ i是反向异构化速率。在该方案中，结合涉及快速形成最初碰撞复合物(EI)，所述最初碰撞复合物随后经历缓慢异构化，以形成最终酶-抑制剂复合物(EI^*)。k随抑制剂浓度而以双曲线增加。EI的解离常数(表示为K_i`)可以由方程式(4)计算：

k＝K₄+K₃I_t/[I_t+K_i`(1+S/K_m)] (4)

总抑制常数K_i可以由方程式(5)计算：

K_i＝K_i`[K₄/(K₃+K₄)] (5)

发现EP25是遵从方案2机制的缓慢结合抑制剂。利用Origin software(原点软件)将数据适用于这些方程式。

丝氨酸蛋白酶特异性

针对13种丝氨酸蛋白酶检验variegin的选择性特征：血纤蛋白溶解丝氨酸蛋白酶(纤维蛋白溶酶，TPA和尿激酶)，抗凝血剂丝氨酸蛋白酶APC，前凝血剂丝氨酸蛋白酶(FXIIa，FXIa，FXa，FIXa，FVIIa，激肽释放酶和凝血酶)和经典丝氨酸蛋白酶(胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶)。s-variegin对这些丝氨酸蛋白酶的作用通过利用特异性发色底物测定的其酰胺分析活性抑制确定。

纤维蛋白原凝固时间

s-variegin，EP25和AP18延长纤维蛋白原凝固时间的能力利用BBLfibrometer(BD，Franklin Lakes，新泽西)测试。使用100μl肽(不同浓度)在37℃温育200μl纤维蛋白原(终浓度3mg/ml)。纤维蛋白原的凝固通过添加100μl凝血酶(终浓度20nM)起始。所有试剂和样品均溶解在含有100mM NaCl的50mM Tris缓冲液(pH 7.4)中。

由凝血酶裂解s-variegin

在室温和37℃下，用凝血酶(终浓度：5μM)温育s-variegin和EP25。在不同温育时间后，用0.1％TFA缓冲液(pH 1.8)猝灭反应并将其加载在与纯化仪相连的SunFire^TM C18柱上。将除0分钟温育色谱图中存在的那些以外的新峰确定为裂解产物并对其进行ESI-MS以验证其质量。对该峰进行整合，以计算峰下面积和各个峰的相对百分比。

结果

variegin同种型的纯化

彩饰花蜱的粗SGE在全部三种凝固测定(PT，APTT和TT)中均表现出有效的抗凝固活性(图9)。潜力处于TT＞＞APTT＞PT的顺序，这说明SGE是有前途的有效凝血酶抑制剂来源。为了纯化该抑制剂，通过RP-HPLC分馏SGE(图1A)。第一步纯化后，对最有效的抗凝血剂馏分(AV-III)进行第二纯化步骤(图1B)。在凝固和发色底物测定中筛选由此产生的馏分的抗凝血酶活性。两份具有最强活性(保留时间23.083和28.933min)的馏分在单独的运行中进一步纯化。将具有保留时间23.083min的馏分分为两个主峰，表示为AV 3/5和AV 5/5(图1C)。具有保留时间28.933的馏分具有一个主峰并具有小“肩峰”并表示为AV 6/5(图1D)。这三种馏分(AV 3/5，AV 5/5和AV 6/5)和粗SGE的抗凝固活性通过PT，APTT，TT和TEG测定验证。全部四种测定揭示AV 6/5含有最有效的抗凝固活性，随后是AV 3/5和AV 5/5(表1)。

表1.彩饰花蜱SGE(雌性，喂食9天)的抗凝固活性。结果显示两次重复值的平均。在对照中，用150mM NaCl代替SGE。

	TT(s)	APTT(s)	PT(s)
				对照	17	28	15
SGE蛋白(μg)
				0.025	50
0.05	105
				0.10	＞180
0.25		28	15
				0.50		38	19
1.00		45	22
				2.50		＞180	40
5.00			＞180

蛋白质序列分析

全部三种馏分的部分序列通过Edman降解确定。关于AV 6/5，序列和分子量通过MALDI-TOF完成。AV 6/5的MALDI光谱揭示主要m/z信号3769.96Da(单同位素质量＝3768.96Da)和次要m/z信号3777.79Da(单同位素质量＝3776.79Da)。主要成分具有序列SDQGDVAEPKMHKT(hex)APPFDFEAIPEEYLDDES(SEQ ID NO 1)，其中Thr14受到己糖部分的修饰。这称为variegin并进一步表征。次要成分(3776.79Da)几乎与variegin一致，其Glu31被His替换。由Edman降解确定的部分序列揭示AV 3/5馏分中的两种成分(m/z 3953.54和3409.57Da)和AV 5/5中的三种成分(m/z 3680.23，3368.94和3173.62Da)。确定的所有序列高度类似于variegin(图2A)。variegin的CD光谱是典型的无规卷曲蛋白(表2)。

表2.彩饰花蜱SGE和RP-HPLC馏分的抗凝固活性。AV 6/5是所有测定中确定的最有效的馏分。对AV 6/5中的主要成分进行测序并命名为variegin。由于APTT，PT和TT在柠檬酸盐血小板缺乏血浆(PPP)中进行，并且因此代表在其中评估其抗凝固潜力的非生理学环境，所以样品的活性也用TEG验证，其容许利用凝块形成的粘弹性评估作为终点在全血中进行凝固监测。(PNP：汇集的正常血浆；r：r阶段，由将血液置于TEG中直到最初血纤蛋白形成的潜伏期的时期；k：k阶段，速度达到某种凝块强度水平的测量)。

BLAST结果说明variegin不显示出与数据库中任何已知蛋白的相似性。有趣地是，其C端(DFEAIPEEYL)(SEQ ID NO 21)与水蛭素的C端(残基55-64：DFEEIPEEYL(SEQ ID NO 22))几乎一致。因此，我们假设varieginC端与水蛭素C端在结合凝血酶中起相似的作用。然而，水蛭素的Tyr63是硫酸化的^28，29，而variegin中相应的Tyr不是。

由variegin引起的凝血酶酰胺分解活性抑制及其K_i

Variegin抑制凝血酶酰胺分解活性的能力使用S2238，即仅结合活性位点的小肽基底物来测定。Variegin抑制酰胺分解活性，且抑制的进程曲线显示随混合获得稳态平衡(图2B)。关于等摩尔浓度的凝血酶和variegin(3.33nM)观察到显著的抑制(～80％)。该抑制的IC₅₀是～0.99±0.02nM(图2C)。variegin是快速和紧密结合的凝血酶竞争抑制剂，其具有K_i～10.4±1.4pM(图2D)。

合成s-variegin和变体

为了进一步表征，合成、纯化并表征三种肽。合成的variegin(SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(SEQ ID NO 1)，s-variegin)具有variegin的完整序列，而EP25(EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES)(SEQ ID NO 6)和AP18(APPFDFEAIPEEYLDDES)(SEQ ID NO 16)具有由N端截断的7和14个残基。与天然variegin(n-variegin)不同，Thr在s-variegin和EP25中不是糖基化的。s-variegin，EP25和AP18的CD光谱均类似于n-variegin，典型的无规卷曲蛋白(图9)。

由variegin引起的抑制的特异性

为了确定特异性，针对13种丝氨酸蛋白酶包括凝血酶筛选s-variegin。除凝血酶以外，没有其他丝氨酸蛋白酶显示出显著的抑制(≤5％)，即使在1μM s-variegin时。在高得多的s-variegin浓度下观察到＞10％的抑制。最易受影响的蛋白酶是纤维蛋白溶酶，胰蛋白酶和FXIa，其由100μMs-variegin抑制～20-30％。相反，针对凝血酶，相似的～30％抑制在至少4个数量级更低的浓度(～3.3nM)时观察到(图3)。因此，s-variegin是特异性且有效的凝血酶抑制剂。

由s-variegin，EP25和AP18引起的凝血酶酰胺分解活性的抑制

s-variegin与n-variegin类似，因为随着混合获得抑制的稳态平衡。其比n-variegin 5倍更不活跃，并且在等摩尔浓度凝血酶和s-variegin(3.33nM)时观察到～30％抑制。剂量响应曲线显示IC₅₀值为5.40±0.95nM，其与温育时间(0分钟和10分钟)无关(图4A)。因此，s-variegin也是凝血酶的快速和紧密结合抑制剂。s-variegin中缺少Thr糖基化可以解释其较弱的活性。

EP25也抑制凝血酶的酰胺分解活性。然而，与n-variegin和s-variegin不同，抑制的进程曲线显示在缺少预温育条件下的两阶段平衡。在～10min预温育后相对缓慢地获得稳态平衡抑制。EP25的剂量响应曲线依赖于温育时间。因此7个N端残基(SDQGDVA(SEQ ID NO 18))的缺失使结合模式由快变慢。然而，EP25的潜力不受该缺失的影响。当获得最终稳态平衡(20分钟预温育)时，EP25抑制凝血酶达到与s-variegin相同的程度(EP25和s-variegin的IC₅₀值分别是5.63±0.45nM和5.40±0.95nM)(图4B)。

相反，AP18不抑制凝血酶酰胺分解活性，即使在300μM时，这提示其不结合活性位点。而AP18以剂量依赖性模式略微增强凝血酶酰胺分解活性(图4C)。这与报告的水蛭素C端行为²⁸相一致。总之，这些结果提示variegin上的活性位点结合部分位于位置8-14(EPKMHKT)内。

抑制凝血酶纤维蛋白原溶解活性

S-variegin，EP25和AP18均以剂量依赖性模式延长纤维蛋白原凝固时间(图4D)。纤维蛋白原结合凝血酶的活性位点和外位点I^1，2。AP18抑制纤维蛋白原溶解而非凝血酶的酰胺分解活性，并且因此我们得出结论variegin的C端结合外位点I。该观察与水蛭素C端的相一致^28，29。s-variegin和EP25之间的活性差别可能归因于EP25的缓慢结合模式。

s-variegin和EP25的抑制常数K_i

s-variegin和EP25的K_i利用S2238作为底物确定。s-variegin是快速和紧密结合抑制剂。K_i’在存在不同浓度的S2238的条件下确定(图5A)。s-variegin是凝血酶的竞争抑制剂，且其K_i’随增高S2238浓度而线性增加(方程式2)(图5B)。发现真实抑制常数K_i是～146.4±13.6pM，其是n-variegin(～10.4±1.4pM)的14倍。相反，EP是凝血酶的缓慢结合抑制剂。抑制的进程曲线针对方程式3拟合，以获得每种EP25浓度的k(图5C)。关于在最初碰撞复合物(EI)和最终稳定复合物(EI^*)之间建立平衡的k，即表观一级速度常数，随EP25浓度而以双曲线增加(图5D)，如由方案(2)所述。因此，EP25和凝血酶之间的结合涉及EI异构化为EI^*。EI的解离常数(K_i`，方程式4)是～529.7±76.7pM，而总抑制常数K_i(方程式5)是～149.8±30.5pM。因此，EP25的K_i与s-variegin的K_i(～146.4±13.6pM)基本相同。这些结果验证缺失7个N端残基不影响潜力但使结合由快转变为慢。

由凝血酶裂解s-variegin

由于variegin结合凝血酶活性位点，所以其可以被凝血酶裂解，这与其他丝氨酸蛋白酶抑制剂相似³⁰。因此，我们检查凝血酶引起的s-variegin裂解及其对抑制的影响。RP-HPLC分析显示在室温和37℃下，s-variegin确实被凝血酶裂解。在温育0分钟时，仅存在与未裂解的s-variegin和凝血酶相对应的峰。两个新的裂解产物峰出现并随增长温育时间而增加(图6A)。这些新的峰分别具有分子量1045Da(SDQGDVAEPK(SEQ ID NO 2))和2582Da(MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(SEQ ID NO 3))，并对应于在Lys10-Met11肽键处的裂解。裂解在37℃比在室温下进行得更快(图9)。

为了验证variegin裂解的作用，用凝血酶温育s-variegin和EP25至多24h，并在不同时间点测定抑制凝血酶酰胺分解活性的能力。结果显示s-variegin和EP25都仅在用凝血酶延长温育后失去其活性(图6B-D)。有趣的是，以相同温度(24℃)和摩尔比率(s-variegin的30倍过量)，60分钟温育后，～30％s-variegin裂解，而没有观察到s-variegin和EP25抑制活性的损失。s-variegin和EP25抑制活性的～30％损失需要24h温育。在EP25的缓慢结合抑制的情形中，百分比抑制随温育时间增加直到20分钟，并然后由于凝血酶的裂解而减小(图6D)。因此，裂解产物保持与凝血酶活性位点的强烈结合是可能的。

讨论

Variegin是天然存在最小凝血酶抑制剂之一。尽管其小尺寸和灵活结构，但是variegin以强亲和性结合凝血酶。结构-活性研究说明variegin结合在凝血酶的展开表面区域上。7个N端残基影响结合动力学；当去除时，variegin的结合特征由快变慢。残基8-14似乎结合凝血酶活性位点，且残基15-32似乎结合外位点I。尽管variegin被凝血酶裂解，但是其抑制活性在裂解后在很大程度上保留。

近年来，已经从食血动物和蛇毒液中分离了许多凝血酶抑制剂。然而，在variegin和其他凝血酶抑制剂的一级结构中不存在相似性。半胱氨酸的缺乏，即提示灵活结构，也与原型凝血酶抑制剂诸如水蛭素(致密N-端，酸性和延长的C端)^6，11-13，rhodniin(双结构域Kazal型抑制剂)^31，32，ornithodorin(双结构域Kunitz型抑制剂)³³和theromin(酸性和antitastin样N端，致密C-端)³⁴不同，尽管它们都结合凝血酶上的相同位点(活性位点和外位点I)(图7A)。尽管variegin残基19-28与水蛭素C端几乎一致，但是它们的N端完全不同(图7B)。与水蛭素不同，variegin在Tyr残基处不被硫酸化并在末端具有三个额外的残基。水蛭素的脱硫酸化²⁴或其C端肽(hirugen)²⁹保持抗凝血酶活性，尽管亲和性²⁴和活性²⁹减小10倍。我们的结果说明AP18结合外位点I并略微增强凝血酶酰胺分解活性，其与报告的水蛭素C端^28，29行为相当，这提示关于这两种序列的相似功能。这似乎是两个在系统发生上关系远的谱系中趋同进化的实例。

Variegin也与其他凝血酶抑制剂诸如haemadin^35，36，triabin^37，38和bothrojaracin³⁹不同。Haemadin具有与水蛭素相似的结构，以其N端结合凝血酶活性位点，并以延长的C端结合外位点II^35，36。Triabin仅抑制外位点I并具有与lipocalins相似的结构^37，38。Bothrojaracin，一种C型凝集素蛋白，结合外位点I和外位点II二者³⁹。至今仅报告了2种类似尺寸的其他凝血酶抑制剂，但是它们似乎与variegin无关。尽管也具有32个残基，但是由舌蝇刺舌蝇(Glossina morsitans morsitans)分离^40，41的舌蝇凝血酶抑制剂(TTI)，不与variegin共享任何序列相似性(图7A)。由骆驼蜱，嗜驼璃眼蜱(Hyalomma dromedarii)分离另一种低分子量凝血酶抑制剂(3.2kDa)(NTI-1)⁴²。与variegin不同，NTI-1是凝血酶的弱(K_i＝11.7μM)且非竞争性抑制剂，仅结合凝血酶上的一个位点(图7A)。当前，不存在关于NTI-1的详细结构信息。

或许，与比伐卢定相比，variegin是最好的合成的凝血酶抑制剂，其通过将水蛭素C端通过四个Gly残基的连接体嫁接到活性位点结合部分D-Phe-Pro-Arg-Pro设计而成¹⁴(图7A)。虽然比伐卢定的开发(以比伐卢定销售)代表成功的合理药物设计，variegin证明通过进化产生类似“设计”的天然能力。因此，variegin可以被描述为“天然”比伐卢定。S-variegin和EP25作为凝血酶抑制剂具有若干超越比伐卢定的优势。第一，variegin和EP25包含天然氨基酸(比伐卢定通常具有D-Phe)。第二，即使无Thr糖基化，其关于凝血酶的亲和性高于比伐卢定-1的。EP25(在长度上与比伐卢定-1相当)以强得多的亲和性(EP25和比伐卢定-1的K_i值分别是～149.8±30.5pM和～2500pM⁴³)抑制凝血酶。最后，尽管比伐卢定和variegin均被凝血酶裂解，但是variegin(和EP25)以比比伐卢定慢得多的速度损失其针对凝血酶的抑制活性。例如，在抑制剂与凝血酶比3∶1时，比伐卢定-1在～15min后损失针对凝血酶酰胺分解活性的全部抑制活性⁴³，而s-variegin和EP25仅在24h温育后损失＞90％抑制活性。因此，variegin和EP25似乎比比伐卢定优越。

由于比伐卢定和variegin的C端高度相似(图7A)，所以我们提议variegin的改善的亲和性和延迟的活性损失主要归因于N端。我们的结果显示variegin上的活性位点结合部分具有序列EPKMHKT(SEQ ID NO19)，且凝血酶在K-M之间裂解variegin。该底物序列似乎与凝血酶的大多数天然底物的序列不同。例如，尽管可能，但是非常罕见地观察到P1处的Lys⁴⁴。同样地，P3处的Glu，S1’处的Met，S2’处的His和P4’处的葡糖基化Thr均罕见^44，45。因此，该独特的活性位点结合部分的鉴定可以在理解凝血酶底物优选性和发现开发直接凝血酶抑制剂的新引导中均具有强烈暗示。

定点突变和固有荧光性研究提示在水蛭素结合凝血酶过程中的下列事件^25，46：(1)由于水蛭素C端和凝血酶外位点I的互补电场的静电操纵，(2)通过水蛭素C端特异性残基之间的直接相互作用的离子束缚诱导凝血酶-水蛭素C端复合物的构象变化和稳定化，和(3)水蛭素N端随后结合活性位点附近的非极性位点。利用固有荧光性研究检测的随着水蛭素C端结合发生的构象变化(步骤2)被观察为速度限制性步骤⁴⁶。水蛭素在其中离子相互作用削弱的高离子强度溶液(＞0.2M)中表现为缓慢结合抑制剂²⁴。有趣的是，在variegin中，7个N端残基的缺失导致在不显著损失结合亲和性的条件下由快速结合抑制剂转变为缓慢结合抑制剂。关于EP25观察到的这种缓慢结合是可推测的，因为损失N端残基而非关于水蛭素观察到的削弱离子束缚，这提示不同速度限制性步骤。动力学研究说明EP25的缓慢结合模式可能涉及凝血酶-EP25复合物的异构化作用。我们提议EP25的C端和凝血酶外位点I之间的远程静电相互作用容许最初碰撞复合物(EI)的快速形成。这导致EPKMHKT(SEQ ID NO 19)随后在缓慢步骤中结合活性位点，从而通过短程相互作用形成稳定化的酶-抑制剂复合物(EI^*)(步骤3是速度限制性步骤)(图7B)。通过对比，在全长variegin中，N端，可能通过SDQGDVA(SEQ ID NO 18)中的2个带负电的残基，提供另外的静电操纵效应，以将N端预定向靠近活性位点，从而容许短程相互作用的快速形成。N端的静电操纵效应通过存在高度碱性的(basic)的外位点II得到促进。外位点II位于距活性位点约10

处，即理论上可以由延长构象中的7个N端残基覆盖的距离(图7C)。

总之，我们介绍了有效的二价凝血酶抑制剂，variegin的分离、特征和结构-功能关系。其是一种新凝血酶抑制剂类型，并为新凝血酶抑制剂的开发提供优秀的平台。

实施例2：分析variegin的变体和片段的活性

如实施例1中所述重复上述用于确定s-variegin和EP25的IC₅₀和K_i的测定，区别是使用1.65nM人血浆来源的凝血酶(来自KAKETSUKEN，日本)代替3.33nM重组人α-凝血酶(来自KAKETSUKEN，日本)。

在这些实验中，发现s-variegin具有约9nM的IC₅₀和约0.318nM的K_i。发现EP25具有约13nM的IC₅₀和约0.365nM的K_i。与实施例1中获得的结果相比，该实验中IC₅₀和K_i值之间差别的原因被确定是使用人血浆来源的凝血酶代替重组人α-凝血酶。

如下讨论地，还进行实验评估多种variegin片段和这些片段的突变体的IC₅₀和K_i，并比较这些片段和突变体的IC₅₀和K_i值和已知的凝血酶抑制剂比伐卢定-1(bivalirudin)的IC₅₀和K_i值。也利用人血浆来源的凝血酶进行所有这些实验，从而使结果应该是可直接比较的。

这些结果的总结显示在下表3中。

分析MH22-MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES

鉴于s-variegin在裂解后，在很大程度上保持其活性，我们假设裂解产物保持与凝血酶紧密连接。合成一种肽，即MH22，其代表s-variegin裂解后的C端片段。

由凝血酶裂解

↓

s-variegin(SEQ ID NO 1)： SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES

MH22(SEQ ID NO 3)： MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES

在不存在任何使用凝血酶预温育的条件下，发现MH22以11.5±0.71nM的IC₅₀抑制凝血酶酰胺分解活性(图11)。当用凝血酶预温育MH22一段短时期时，没有观察到抑制活性的显著变化(10分钟预温育IC₅₀＝13.4±0.76nM；20分钟预温育IC₅₀＝12.3±1.89nM)，这说明MH22是快速结合的。

MH22在使用凝血酶的延长温育后，表现出减小的酰胺分解活性(1680分钟预温育IC₅₀＝479.7±16.1nM)。该活性损失可以通过增加测定设置中的BSA浓度恢复(图12)，这说明活性损失很大程度上归因于肽吸附到反应板。在使用较高浓度的BSA时，1680分钟预温育后，IC₅₀由479.7±16.1nM(1mg/ml BSA)降至60.9±3.05nM(5mg/ml BSA)和62.9±10.9nM(10mg/ml BSA)。

MH22在不同底物(S2238)浓度时的表观K_i’通过描述快速和紧密结合的方程式确定。K_i’在贯穿所用的浓度范围内(12.5nM-200nM)没有显著变化，这说明MH22是凝血酶酰胺分解活性的非竞争性抑制剂(图13)。对于非竞争性抑制剂，K_i’＝K_i且在该情形中，发现平均K_i是13.2±0.91nM。

分析EP25A22E-EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES(SEQ ID NO 3)

接下来，合成肽EP25A22E。在该肽中，s-variegin中的丙氨酸22(EP25中的丙氨酸15)被替换为谷氨酸，因为谷氨酸存在于水蛭素的相同位置。

EP25(SEQ ID NO 6)：EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES

EP25A22E(SEQ ID NO 7)：EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES

与EP25类似，EP25A22E，是缓慢结合抑制剂，其在不使用凝血酶预温育的条件下具有IC₅₀＝124.3±22.7nM，在20分钟预温育条件下IC₅₀＝13.5±2.08nM和IC₅₀＝13.6±3.15nM(图14)。与EP25相比，该替换不有害地影响酰胺分解活性。

EP25A22E的K_i利用缓慢结合抑制剂方程式确定并发现是0.311±0.070nM(图15)。与EP25的K_i相比，该替换不因此有害地影响与凝血酶的结合亲和性。

分析MH22A22E-MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES(SEQ ID NO 5)

合成EP25A22E裂解的C端片段，由肽MH22A22E表示。

EP25A22E(SEQ ID NO 7)：EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES

MH22A22E(SEQ ID NO 5)：MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES

与MH22类似，MH22A22E的IC₅₀在不用凝血酶预温育条件下是13.6±0.45nM，且在20分钟预温育条件下IC₅₀＝15.6±0.36(图16)。

同样与MH22类似，MH22A22E在用100μM底物(S2238)测试时，具有15.1±1.04nM的K_i’。假设由丙氨酸到谷氨酸的单残基替换不改变抑制机制，则MH22A22E也是具有K_i＝15.1±1.04nM的非竞争性抑制剂(图17)。

分析具有序列EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(SEQ ID NO 8)的EP21和具有序列MHKTAPPFDFEAIPEEYL(SEQ ID NO 20)的MH18

来自EP25A22E和MH22A22E二者的结果显示将丙氨酸22替换为谷氨酸不改变肽活性。接下来，通过保留丙氨酸残基合成肽。

鉴于当与已知的凝血酶抑制剂比伐卢定相比较时，s-variegin在C端具有额外的四个残基，合成肽EP21和MH18，以确定这四个额外的残基的作用。

EP21(SEQ ID NO 8)：EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL

MH18(SEQ ID NO 20)：MHKTAPPFDFEAIPEEYL

评估这两种片段抑制凝血酶活性的能力。当除去这4个残基时，无显著活性损失。EP21也是缓慢结合抑制剂，不用凝血酶预温育条件下具有176.9±6.77nM的IC₅₀，20分钟预温育条件下IC₅₀＝16.2±2.93nM和30分钟预温育条件下IC₅₀＝16.20±2.93nM(图18)。通过缓慢结合方程式确定的EP21的K_i被发现是0.315±0.024nM(图19)。

类似地，对MH18没有观察到活性的显著损失。不用凝血酶预温育条件下IC₅₀＝10.9±1.20nM且20分钟预温育条件下IC₅₀＝11.7±1.88nM(图20)。

使用快速和紧密结合方程式，MH18的K_i’，在100μM底物(S2238)时＝14.9±3.50nM。假设除去C端的四个残基不改变抑制机制，则MH18也是非竞争性抑制剂，其K_i＝14.9±3.50nM(图21)。

分析DV24-DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(SEQ ID NO 9)

由于我们假定s-variegin的N端中的带电残基是造成其快速结合动力学的原因，因此我们合成了肽DV24，其在EP21的N端上具有3个额外的残基，从而测试该肽是否转变为快速结合模式。

EP21(SEQ ID NO 8)：EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL

DV24(SEQ ID NO 9)：DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL

如预期地，DV24是快速和紧密结合抑制剂，其在不用凝血酶预温育的条件下IC₅₀＝7.49±0.28nM，且在20分钟预温育的条件下IC₅₀＝10.1±0.60nM(图22)。DV24被凝血酶裂解并且裂解后观察到的活性归因于裂解产物的C端片段(该片段由肽MH18表示)。

使用快速和紧密结合方程式，DV24的K_i’，在100μM底物(S2238)时＝9.74±0.91nM，且确定DV24的K_i是0.306±0.029nM，假设该肽是竞争性抑制剂(图23)。

分析DV24K10R-DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEYL(SEQ ID NO 10)

鉴于大多数凝血酶抑制剂在P1位置处具有精氨酸，而不是s-variegin中的赖氨酸，我们合成具有相同替换的肽DV24K10R。

DV24(SEQ ID NO 9)：DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL

DV24K10R(SEQ ID NO 10)：DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEYL

DV24K10R也是快速和紧密结合抑制剂，其在不用凝血酶预温育的条件下IC₅₀＝6.98±0.76nM，且在20分钟预温育的条件下IC₅₀＝12.01±0.41nM(图24)。DV24K10R也被凝血酶裂解并且裂解后观察到的活性归因于裂解产物的C端片段(该片段由肽MH18表示)。

使用快速和紧密结合方程式，DV24K10R的K_i’，在100μM底物(S2238)时＝8.22±0.48nM，且确定DV24K10R的K_i是0.259±0.015nM，假设该肽是竞争性抑制剂(图25)。用精氨酸替换赖氨酸由此改善该片段的活性。

结论

这些实验结果验证了这样的发现，即variegin的片段和这些片段的突变体是凝血酶活性的有效抑制剂。由这些分子置换实验获得的信息也证实与外位点2的相互作用对最快速结合于凝血酶很重要。

表3：IC₅₀和K_i值的比较

肽

序列

预温育时间

IC₅₀(nM)

K_i(nM)

(min)
		s-variegin	SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(SEQ ID NO 1)	0	8.50±0.16	0.318±0.020
10	9.62±0.30
				20	10.59±0.30
30	11.54±1.28
				120	13.15±1.25
1080	21.79±5.64
				1680(1mg/mlBSA)	504.22±27.98
1680(5mg/mlBSA)	53.41±12.16
				1680(10mg/mlBSA)	38.99±0.43

		EP25	EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(SEQ ID NO6)	0	173.13±25.86	0.365±0.109
10	14.09±1.12
				20	13.12±0.67

30	13.59±1.34
				120	12.43±1.83
1080	26.80±4.09
				1680(1mg/mlBSA)	437.92±4.90
1680(5mg/mlBSA)	39.06±9.37
				1680(10mg/mlBSA)	38.43±5.39

		MH22	MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(SEQ ID NO 3)	0	11.46±0.71	13.16±0.91
10	13.36±0.76
				20	12.34±1.89
30	14.94±0.77
				120	14.63±2.32
1080	34.52±4.59
				1680(1mg/mlBSA)	479.74±16.05
1680	60.90±3.05

		(5mg/mlBSA)
							1680(10mg/mlBSA)	62.89±10.90

					比伐卢定-1	DFPRPGGGGNGDFEEIPEEYL(SEQ ID NO 23)	0	72.58±3.90	2.94±0.12
		10	101.62±12.92
							45	133.85±15.78
		120(1mg/mlBSA)	258.77±25.72
							120(5mg/mlBSA)	279.72±4.74
		120(10mg/m1 BSA)	281.84±6.21

EP25A22E	EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES(SEQ ID NO7)	0	124.32±22.74	0.311±0.070

		20	13.49±2.08
							30	13.55±3.15

					MH22A22E	MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES(SEQ ID NO 5)	0	13.62±0.45	15.07±1.04
		20	15.63±0.36

EP21	EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(SEQ ID NO 8)	0	176.87±6.77	0.315±0.024
							20	16.20±2.93
		30	13.85±1.29

MH18	MHKTAPPFDFEAIPEEYL(SEQ ID NO 20)	0	10.93±1.20	14.94±3.50
							20	11.73±1.88

					DV24	DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL (SEQID NO 9)	0	7.49±0.28	0.306±0.029
		20	10.07±0.60

DV24K10R	DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEYL (SEQ IDNO 10)	0	6.98±0.76	0.259±0.015
							20	12.01±0.41

实施例3：大鼠中的定量全身放射自显影法研究

利用[³H]-标记的测试底物，研究Variegin在大鼠中的分布。实验以0.4mg/kg的剂量水平进行。

实验程序

剂量准备和评估

制备溶解在1mL透析缓冲液(50mM磷酸钠，200mM氯化钠(pH 8.0))中的1mg Variegin溶液并用[³H]-NSP(400μCi)温育。

将该溶液转移到透析管(1000kda)中并透析约96小时，更换透析缓冲液三次/日。然后将该溶液加载到NAP5柱(用10mL缓冲液溶液，pH8预平衡)上，并弃去洗出液。再添加缓冲液并收集洗出液，以提供约0.5mg/mL的[³H]-标记的蛋白溶液。

为了通过液体闪烁计数进行放射性测定，去除[³H]-Variegin溶液的等分试样。在给药验证蛋白标记功效前，通过HPLC分析[³H]-Variegin溶液的其他等分试样(见图26)。

剂量施用

利用注射器和针头，根据体积，以0.4mg/kg(0.8mL/kg体重)的剂量水平，对每只动物施用单一静脉内剂量。将该制剂作为单脉冲剂量分配到大鼠的尾静脉中。施用于每只大鼠的剂量的量通过给药的体积，和该剂量溶液的规定放射性浓度和特异性活性确定。

药物动力学研究

将[³H]-Variegin作为单一静脉内剂量，以名义剂量水平(nominal doselevel)0.4mg/kg施用于三只雄性大鼠。在给药后的以下时间，取得连续血液样品以用于血浆制备：0.5，1，2，4，6，24和48小时。

为了获得血浆，样品在收集后尽快离心。收获血浆并保留等分试样以用于放射性测量。弃去血细胞。

测量放射性

与血浆有关的放射性通过液体闪烁计数已知体积的样品直接确定。将样品与Ultima Gold闪烁体混合并利用具有自动外标猝灭校正的Packard液体闪烁计数器计数。在选择最佳通道设置后，由放射性化学标准制作猝灭校正曲线。贯穿实验始终检验该曲线的有效性。具有小于两倍背景计数的放射性被认为低于精确量化的界限。

药物动力学

静脉内施药后，Variegin在血浆中的浓度利用PCModfit(版本3.0)分析。动力学数据通过非房室分析(non-compartmental analysis，NCA)表征。以下药物动力学参数来源于数据：最大峰血浆血液浓度(C_最大)；最大观察到的浓度的时间(T_最大)；终点半衰期(t1/2)，和曲线下面积(AUC)。

AUC利用线性/log梯形法确定。数值0用于被记录为低于量化界限(BLQ)的任何血浆浓度。AUC_inf(观察的)基于观察到的浓度，计算为由给药时刻外推到时间无穷大的曲线下面积。AUC_inf参数因此是外推参数，其提供更典型的暴露评估，因为其包含由最后数据点到估计浓度为0时(将来)的时间-浓度分布的额外部分。

组织分布研究

将[³H]-Variegin作为单一静脉内剂量，以名义剂量水平0.4mg/kg，施用于三只雄性大鼠。在剂量施用后0.5，1和24小时时，通过CO₂过量给药杀死一只大鼠。处死后，通过在使用固体二氧化碳冷却到ca.-80℃的己烷浴中整体浸没快速冷冻该动物。

去除胡须、腿和尾后，将每只冷冻的畜体置于一块1％(w/v)水性羧甲基纤维素中并固定在保持在ca.-20℃的Leica(莱卡)CM3600低温超薄切片机的台架上。然后由经由畜体的5个水平获得径向切片(名义上30μm)，以包括所有主要的组织和器官。

水平A：眼窝外泪腺

水平B：眼窝内泪腺

水平C：Harderian腺/肾上腺

水平D：甲状腺

水平E：脑和脊髓

将固定在放射自显影带上的切片置于与FUJI(富士)成像板(BAS-III型，Raytek Scientific Ltd(Raytek科学公司)，Sheffield)接触。这些程序基于Ullberg(Acta.Radiol.Suppl.(放射学录集增刊)118，22)的工作。

全身放射自显影图的图像分析

在保存在ca.-75℃冷冻器中的铅容器中暴露至少14天后，利用FUJIBAS 1500生物-图像分析仪(Raytek Scientific Ltd(Raytek科学公司))加工成像板。

利用有效的基于PC的图像分析预装件(package)(SeeScan密度计量学软件，LabLogic，Sheffield)分析电子图像。制备一组[³H]-标记的血液标准，并用于在一定范围的放射性浓度范围内构建校准线。

将关于该程序的量化下限定义为微小规模中包括的最低可计量标准(36.6nCi/g)。各种组织的放射性浓度以nCi/g表述，并利用剂量制剂中测试物质计算的特异性活性转化为μg等价物Variegin/g(μg equiv/g)。这提供量化下限为6.83μg equiv/g。

在可能时，关于每种组织定义单放射自显影内的最大面积，以用于测量。对于一些组织，这是不切实际的且所以选择一个特殊的区域来测量。这些组织，以及相应的测量面积，列表如下：

放射自显影图的电子图像用于制作图27-29。图27-29中的水平1-5指经由大鼠身体的连续1cm纵切面。

结果与讨论

当以μg或ng等价物/g(mL)报告浓度时，假设放射性与Variegin或与相同分子量的化合物有关。剂量溶液的特异性活性用于在所有情形中计算浓度(μg或ng equiv/g(mL))。

药物动力学研究：

在对三只雄性Sprague Dawley大鼠静脉内施用[³H]-Variegin后观察到的总放射性平均药物动力学参数的总结在下表4和5中提供：

表4：在以名义剂量水平0.4mg/kg静脉内施用[³H]-Variegin后，由雄性大鼠获得的血浆中的总放射性浓度

时间(小时)	1M	2M	3M	平均值(n＝3)	sd
						0.5	425.9	540.3	441.0	469.1	62.15

1	245.6	316.7	260.5	274.3	37.50
						2	127.7	139.2	144.4	137.1	8.546
4	92.97	104.6	100.3	99.29	5.880
						6	98.61	122.6	101.4	107.5	13.12
24	96.47	92.32	102.2	97.00	4.961
						48	83.17	84.89	83.62	83.89	0.892

BLD低于检测界限(＜2x背景dpm)

sd标准偏差

结果表示为ng等价物/g

表5：单一静脉内施用[³H]-variegin后，由雄性大鼠获得的血浆中测量的平均药物动力学参数(总放射性)的总结。

参数	总放射性
		C_最大(ng equiv./g)T_最大(小时)AUC_0-48(ng equiv./g.h)AUC_inf(ng equiv./g.h)t1/2^a(小时)t1/2^b(小时)	469.10.54943.419147117.20.86

C_最大＝最大血浆浓度

T_最大＝最大血浆浓度的时间

AUC_0-48＝由给药到最后可测量的浓度的曲线下面积

AUC_inf＝由给药时间外推到无穷大的曲线下面积

t1/2^a＝表观终点消除半衰期

t1/2^b＝表观分布半衰期组织分布研究：

组织分布研究的结果显示在下表6和7中。

表6：以名义剂量水平0.4mg/kg单一静脉内施用[³H]-variegin后，雄性白化病大鼠组织中的放射性浓度

组织	0.5小时	1小时	24小时
				肾肾皮质肾髓质皮肤(无色素)膀胱	25.729.18.1517.063.6	18.8BLQBLQBLQ43.8	BLQBLQBLQBLQBLQ

结果表示为μg等价物/g

BLQ低于量化界限(＜6.83μg等价物/g)

表7：以名义剂量水平0.4mg/kg单一静脉内施用[³H]-variegin后，在雄性白化病大鼠组织中测量的放射性浓度

组织	大鼠4M 大鼠5M 大鼠6M0.5小时 1小时 24小时
		肾肾皮质肾髓质皮肤(无色素)膀胱	137.8 101.0 BLQ156.0 BLQ BLQ43.7 BLQ BLQ91.2 BLQ BLQ341.0 234.5 BLQ

结果表示为nCi/g

BLQ低于量化界限(36.6nCi/g)

在0.5小时(第一采样时间点)时，放射性遍及有限的组织分布。在肾(25.7μg equiv./g)，(肾皮质：29.1μg equiv./g和肾髓质：8.15μg equiv./g)，皮肤(17.0μg equiv./g)和膀胱(63.6μg equiv./g)中观察放射性浓度，。所有其他组织处于低于检测界限的水平(＜6.83μg equiv./g)。在1小时时，仅在肾(18.8μg equiv./g)和膀胱(43.8μg equiv./g)中观察浓度。到24小时时，所有组织中的放射性均下降到低于检测界限。

结论

结果说明给药后，吸附的放射性遍及有限的组织分布。脑中的放射性浓度处于低于所有时间点量化界限的水平，这应该提示不存在测试化合物跨越血脑屏障的迁移。组织中的最大浓度在0.5小时，即第一采样时间点时观察到。在肾和膀胱中观察到最大放射性浓度。24小时后，所有组织中的放射性均下降到低于检测界限。

这些数据说明[³H]-Variegin由大鼠非常快速地消除。获得的数据也与公开的大鼠中水蛭素行为相一致，其中在肾中恢复80％的放射性(Bichler，Baynes和Thorpe，Biochem J(生物化学杂志)(1993)296，771-776)。

这些研究由此证实variegin，如同其他小肽抗凝血酶试剂诸如比伐卢定，通过肾途径快速排泄。该特性使其适合于在手术程序中短期静脉内抗凝固。由于直接凝血酶抑制剂，与间接凝血酶抑制剂肝素不同，不能通过使用维生素K逆转，具有短半衰期是如果发生出血时的优势，所以该药物应该被迅速消除，从而使得用于去除剩余药物的其他测量诸如超滤或透析更加不必要。如果需要延长的抗凝固作用，则可以通过连续但中断的静脉内灌输施用药物，假设正常肾功能，则几乎所有剩余药物应该在1-2小时时期内清除。对于短程序，诸如典型持续约30分钟的冠状关节成形术，单一推注注射应该提供足够的保护并在不需要逆转的条件下被消除。

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序列表

<110>新加坡国立大学

<110>斯洛伐克科学院动物研究所

<120>凝血酶抑制剂

<130>P047489WO

<140>PCT/IB2008/_______

<141>

<150>GB 07117799

<151>2007-06-18

<160>19

<170>SeqWin99，版本1.02

<210>1

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>1

Ser Asp Gln Gly Asp Val Ala Glu Pro Lys Met His Lys Thr Ala Pro

1 5 10 15

Pro Phe Asp Phe Glu Ala Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Asp Asp Glu Ser

20 25 30

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>2

Ser Asp Gln Gly Asp Val Ala Glu Pro Lys

1 5 10

<210>3

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>3

Met His Lys Thr Ala Pro Pro Phe Asp Phe Glu Ala Ile Pro Glu Glu

1 5 10 15

Tyr Leu Asp Asp Glu Ser

20

<210>4

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>4

Ser Asp Gln Gly Asp Val Ala Glu Pro Lys Met His Lys Thr Ala Pro

1 5 10 15

Pro Phe Asp Phe Glu Ala Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Asp Asp His Ser

20 25 30

<210>5

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>5

Met His Lys Thr Ala Pro Pro Phe Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu

1 5 10 15

Tyr Leu Asp Asp Glu Ser

20

<210>6

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>6

Glu Pro Lys Met His Lys Thr Ala Pro Pro Phe Asp Phe Glu Ala Ile

1 5 10 15

Pro Glu Glu Tyr Leu Asp Asp Glu Ser

20 25

<210>7

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>7

Glu Pro Lys Met His Lys Thr Ala Pro Pro Phe Asp Phe Glu Glu Ile

1 5 10 15

Pro Glu Glu Tyr Leu Asp Asp Glu Ser

20 25

<210>8

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>8

Glu Pro Lys Met His Lys Thr Ala Pro Pro Phe Asp Phe Glu Ala Ile

1 5 10 15

Pro Glu Glu Tyr Leu

20

<210>9

<211>24

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>9

Asp Val Ala Glu Pro Lys Met His Lys Thr Ala Pro Pro Phe Asp Phe

1 5 10 15

Glu Ala Ile Pro Glu Glu Tyr Leu

20

<210>10

<211>24

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>10

Asp Val Ala Glu Pro Arg Met His Lys Thr Ala Pro Pro Phe Asp Phe

1 5 10 15

Glu Ala Ile Pro Glu Glu Tyr Leu

20

<210>11

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>11

Ser Asp Gln Gly Asp Val Ala Glu Pro Lys Met His Lys Thr Ala Pro

1 5 10 15

Pro Phe Asp Phe Glu Ala Ile Pro Glu Glu Tyr Leu

20 25

<210>12

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>12

Ser Asp Gln Ala Asp Arg Ala Gln Pro Lys Leu His Arg Asn Ala Pro

1 5 10 15

Gln Gly Asp Phe Glu Ala Ile Pro Asp Glu Tyr Leu

20 25

<210>13

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>13

Ser Asp Gln Ser Gly Arg Ala Gln Pro Lys Leu Pro Arg Asn Ala Pro

1 5 10 15

Gln Gly Asp Phe Glu Ala Ile Pro Asp Glu Tyr Leu

20 25

<210>14

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>14

Ser Asp Gln Gly Asp Val Ala Glu Pro Lys Met His Lys Thr Ala Pro

1 5 10 15

Pro Gly Asp Phe Glu Ala Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Asp

20 25

<210>15

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>15

Ser Asp Gln Ala Asp Val Ala Glu Pro Lys Met His Lys Thr Ala Pro

1 5 10 15

Pro Gly Asp Phe Glu Ala Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Asp

20 25

<210>16

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>16

Ala Pro Pro Phe Asp Phe Glu Ala Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Asp Asp

1 5 10 15

Glu Ser

<210>17

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>17

Ser Asp Gln Gly Asp Val Ala Glu Pro Lys Met His Lys Thr

1 5 10

<210>18

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>18

Ser Asp Gln Gly Asp Val Ala

1 5

<210>19

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>19

Glu Pro Lys Met His Lys Thr

1 5

<210>20

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶抑制剂片段

<400>20

Met His Lys Thr Ala Pro Pro Phe Asp Phe Glu Ala Ile Pro Glu

1 5 10 15

Glu Tyr Leu

<210>21

<211>10

<212>PRT

<213>彩饰花蜱(Amblyomma variegatum)

<220>

<223>Vagarin C端片段

<400>21

Asp Phe Glu Ala Ile Pro Glu Glu Tyr Leu

1 5 10

<210>22

<211>10

<212>PRT

<213>彩饰花蜱(Amblyomma variegatum)

<220>

<223>Hirudin c端片段

<400>22

Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu

1 5 10

<210>23

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>Hirudin同源片段

<220>

<221>位点

<222>1

<223>Phe是D氨基酸

<400>23

Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile

1 5 10 15

Pro Glu Glu Tyr Leu

20

Claims

1.凝血酶抑制剂，其中所述凝血酶抑制剂由选自以下的氨基酸序列组成：

DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(DV24)(SEQ ID NO9);

EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(EP25–活性位点和外位点I)(SEQ ID NO6);

APPFDFEAIPEEYLDDES(AP18–外位点I)(SEQ ID NO16);

SDQGDVAEPKMHKT(外位点II结合和活性位点)(SEQ ID NO17);

SDQGDVA(外位点II)(SEQ ID NO18);

EPKMHKT(活性位点)(SEQ ID NO19);

SDQGDVAEPK(切割产物1)(SEQ ID NO2);

MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(切割产物2;MH22)(SEQ ID NO3);

MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES(MH22A22E)(SEQ ID NO5);

EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(EP21)(SEQ ID NO8);

MHKTAPPFDFEAIPEEYL(MH18)(SEQ ID NO20);

EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES(EP25A22E)(SEQ ID NO7);

DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEYL(DV24K10R)(SEQ ID NO10);

SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(SEQ ID NO11);

SDQADRAQPKLHRNAPQGDFEAIPDEYL(SEQ ID NO12);

SDQSGRAQPKLPRNAPQGDFEAIPDEYL(SEQ ID NO13);

SDQGDVAEPKMHKTAPPGDFEAIPEEYLD(SEQ ID NO14);或

SDQADVAEPKMHKTAPPGDFEAIPEEYLD(SEQ ID NO15);

或是其功能等价物，其中所述功能等价物是所述氨基酸序列的PEG化形式，

或是SEQ ID NO:9,6,17,19,3,8,20,7,10,11,14或15的功能等价物，其中所述功能等价物通过苏氨酸处被糖基化而被修饰。

2.权利要求1的凝血酶抑制剂在制备用于抑制凝血酶活性的试剂中的应用。

3.按照权利要求2的应用，其中所述试剂用于诊断与异常凝血酶累积有关的疾病。

4.凝血酶与按照权利要求1的凝血酶抑制剂的复合物。

5.编码由权利要求1中定义的氨基酸序列组成的凝血酶抑制剂的核酸分子。

6.包含按照权利要求5的核酸分子的载体。

7.包含按照权利要求5或权利要求6的核酸分子或载体的宿主细胞。

8.制备按照权利要求1的凝血酶抑制剂的方法，其包括在这样的条件下培养按照权利要求7的宿主细胞以使得表达蛋白质并回收由此生成的蛋白质。

9.药物组合物，其包含按照权利要求1的凝血酶抑制剂或按照权利要求5的核酸分子和药用载体。

10.权利要求1的凝血酶抑制剂在制备用于诊断由凝血酶累积引起的疾病或病症的诊断剂中的应用，其中所述凝血酶抑制剂施用于患者或由所述患者分离的组织，其中检测到与凝血酶结合的所述凝血酶抑制剂是所述疾病或病症的指示。

11.按照权利要求10的应用，其中所述疾病或病症是血纤蛋白或血小板血栓。

12.按照权利要求1的凝血酶抑制剂在制备用于治疗患有凝血病的患者或预防患者发展为凝血病的药物中的应用。

13.按照权利要求1的凝血酶抑制剂在制备用于治疗恶性肿瘤疾病或与恶性肿瘤疾病有关的病症的药物中的应用。

14.由氨基酸序列SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(SEQ ID NO1)组成的合成的variegin蛋白在制备在外科手术过程中用于短期抗凝固、用于在血栓栓塞事件后紧急抗凝固、或用于在血液透析、血液过滤或血浆交换程序中抗凝固的药物中的应用。

15.权利要求14的应用，其中所述外科手术过程包括经皮、经血管或经器官导管插入术，冠状血管成形术，血管内支架程序，心脏导管插入术，动脉内膜切除术，插入血管支架，修补大动脉和其他动脉动脉瘤。

16.权利要求14的应用，其中所述血栓栓塞事件是急性心肌梗死；血栓形成性中风；深度静脉血栓症；血栓性静脉炎；肺栓塞；栓塞和微栓塞发作，其中来源可以是心脏，动脉粥样硬化斑，瓣膜或血管修复物或未知来源；或弥散性血管内凝固(DIC)。

17.权利要求14的应用，其中所述药物通过静脉灌输连续施用或作为单一或重复推注施用。

18.抑制凝血酶活性的体外方法，其包含将凝血酶暴露于权利要求1中定义的凝血酶抑制剂。