JP2010530238A - トロンビンインヒビター - Google Patents
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Abstract
Description
EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(EP25)(配列番号6)
EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES(EP25A22E)(配列番号7)
EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(EP21)(配列番号8)
MHKTAPPFDFEAIPEEYL(MH18)(配列番号20)
DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(DV24)(配列番号9)
DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEYL(DV24K10R)(配列番号10)
SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(配列番号11)
SDQADRAQPKLHRNAPQGDFEAIPDEYL(配列番号12)
SDQSGRAQPKLPRNAPQGDFEAIPDEYL(配列番号13)
SDQGDVAEPKMHKTAPPGDFEAIPEEYLD(配列番号14)
SDQADVAEPKMHKTAPPGDFEAIPEEYLD(配列番号15)。
EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(EP25:活性部位およびエキソサイトIと相互作用)(配列番号6)
APPFDFEAIPEEYLDDES(AP18:エキソサイトIと相互作用)(配列番号16)
SDQGDVAEPKMHKT(エキソサイトIIおよび活性部位と相互作用)(配列番号17)
SDQGDVA(エキソサイトIIと相互作用)(配列番号18)
EPKMHKT(活性部位と相互作用)(配列番号19)
APPFDFEAIPEEYLDDES(エキソサイトIと相互作用)(配列番号16)
SDQGDVAEPK(切断産物1)(配列番号2)
MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(切断産物2;MH22)(配列番号3)
EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(EP21)(配列番号8)
MHKTAPPFDFEAIPEEYL(MH18)(配列番号20)
DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(DV24)(配列番号9)
またはそれらの機能的等価物。
EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES(EP25A22E)(配列番号7)
DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEYL(DV24K10R)(配列番号10)
MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES(MH22A22E)(配列番号5)。
バリエジンおよびEP25の分析
材料および方法
材料
ヒトクエン酸血漿はthe Slovak Institute of Cardiovascular DiseasesのDepartment of Hematology and Transfusiologyから供与された。トロンボクロチン試薬はDade AG(Dudingen、スイス)から入手した。トロンボプラスチンIS試薬およびアクチンFS活性化PTT試薬はDade International Inc.(マイアミ、フロリダ)から入手した。9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)-L-アミノ酸、Fmoc-PEG-PS担持樹脂、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、20%v/vピペリジン(DMF中)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,-3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)は、Applied Biosystems(Foster City、カリフォルニア)から入手した。トリフルオロ酢酸(TFA)、1,2-エタンジチオール、チオアニソール、ウシキモトリプシンおよびウシ血清アルブミン(BSA)は、Sigma Aldrich(St.Louis、Missouri)からから入手した。ヒトフィブリノゲン、FXIIa、組織プラスミノゲンアクチベーター(TPA)、ウロキナーゼ、カリクレインおよびウシトリプシンは、Merck Chemicals Ltd.(Nottingham、UK)から入手した。ヒト第IXa因子(FIXa)、第Xa因子(FXa)、第XIa因子(FXIa)、APCおよびプラスミンは、Hematologic Technologies、Inc.(Essex Junction、Vermont)から入手した。ヒト第VIIa因子(FVIIa)および組換えα-トロンビンは、財団法人化学及血清療法研究所(化血研、日本)(Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute(KAKETSUKEN、Japan))から供与された21,22。発色基質S2222、S2238、S2251、S2288、S2302、S2366、S2444、S2586およびS2765はChromogenix(ミラノ、イタリア)から入手した。Spectrozyme(登録商標)FIXaはAmerican Diagnostica Inc.(Stamford、Connecticut)から入手した。使用した全ての他の化学物質および試薬は分析グレードであった。
A.variegatumのSGEの抽出手順および分画中のタンパク質濃度の推定を以前と同様に記載されている23。
Beckman Instruments 126/168 DAD HPLCシステム(Fullerton、カリフォルニア)を用いた3ステップの逆相HPLC手順によってバリエジンを精製した。第1ステップでは(図1A)、Vydac C-4(5μm;250×4.6mm)カラム(Grace Vydac、Hesperia、カリフォルニア)にSGEをロードした。最も強い抗凝固活性を含有していたプールした分画(図1A、分画AV-III)を、Beckman Ultrasphere C-18(5μm;250×4.6mm)カラムを使用する第2ステップに供した(図1B)。最後に、個々の画分をVydac C-18(5μm;250×4.6mm)カラムを使用してさらに精製して、強力な抗トロンビン活性の3個の画分、AV6/5、AV3/5およびAV5/5を得た(図1C〜D)。AV6/5画分中の主な構成成分をバリエジン(variegin)と名付けた。
トロンビン時間(TT)、プロトロンビン時間(PT)および活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)のアッセイを、SGEおよび画分における抗凝固活性の一次スクリーニングに使用した。ヒトクエン酸血漿(50μl)を、1時間37℃で最大5μlのSGEまたは同体積の150mMのNaCl(対照)とプレインキュベートした。対応する試薬(TT:50μlのトロンボクロチン試薬;PT:100μlのトロンボプラスチンIS試薬;APTT:50μlのアクチンFS活性化PTT、3分間加え、反応は50μlの20mMCaCl2で開始した)を加えた後、フィブリン塊の形成に必要とされた時間を、ストップウォッチを使用して目視で決定した。
AV6/5、AV3/5およびAV5/5中に存在するタンパク質の分子量を、窒素レーザー(337nm)およびグリッドなしのディレイドエクストラクションイオン源を備えるBIFLEX(Bruker-Franzen、Bremen、ドイツ)マトリクス支援レーザー脱離/イオン化リフレクトロン飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析計を使用して、Eurosequence(Groningen、オランダ)によって決定した。部分アミノ酸配列は、自動シーケンサー(モデル494、Applied Biosystems)を使用してN末端エドマン分解によって決定した。AV6/5の完全な配列はMALDI-MS分析によって決定した。
3種類のペプチド(s-バリエジン、EP25およびAP18)を、Applied Biosystems Pioneerモデル433Aペプチド合成装置で固相ペプチド合成法を使用して合成した。アミノ酸のFmoc基を20%v/vピペリジン(DMF中)によって除去し、HATU/DIPEA in situ中和化学法を使用してカップリングさせた。全てのペプチドを事前充填PEG-PS樹脂で合成した。TFA/1,2-エタンジチオール/チオアニソール/水カクテルによる切断はペプチド酸(-COOH)を放出した。合成ペプチドを、AKTA(商標)精製機(GE Healthcare、Uppsala、スウェーデン)およびSunFire(商標)C18(5μm;250mm×10mm)(Waters、Milford、Massachusetts)カラムでRP-HPLCによって精製した。全てのペプチドの純度および質量を、Perkin-Elmer Sciex API 300 LC/MS/MSシステム(Perkin-Elmer Sciex、Selton、Connecticut)を使用してエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)によって決定した。
10mMのリン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)に溶解したバリエジン、s-バリエジン、EP25およびAP18の遠UV CDスペクトル(260〜190nm)を、Jasco J-810分光偏光計(Easton、Maryland)を使用して記録した。全ての測定は、50nm/分のスキャン速度、0.2nmの分解能および2nmの帯域幅で、0.1cm経路長キュベットを使用して室温で実施した。
S2238でのトロンビンアミド分解活性に関する全てのアッセイは、96ウエルのマイクロタイタープレート中、100mMのNaClおよび1mg/mlのBSAを含有する50mMのトリスバッファー(pH7.4)中で室温において実施した。典型的には、100μlのペプチドおよび100μlのトロンビンを、100μlのS2238を加える前に様々な時間プレインキュベートした。着色生成物p-ニトロアニリンの形成率を、ELISAプレートリーダーを用いて10分間405nmで追跡した。インヒビターの不在下を0%として、吸光度の増大率を得ることによって阻害率を計算した。用量応答曲線はOriginソフトウェア(MicroCal、Northampton、Massachusetts)を使用してフィッティングしてIC50値を計算した。
阻害定数Kiを、基質としてS2238を使用して決定した。等モル濃度のインヒビターによって酵素を阻害するとき、インヒビターと酵素の結合は遊離インヒビターの濃度の有意な減少を引き起こす。この強結合阻害を以下の等式によって記載する24:
Vs=(Vo/2Et){[(Ki'+It-Et)2+4Ki'Et]1/2-(Ki'+It-Et)} (1)
上式でVsは定常状態速度であり、Voはインヒビターの不在下で観察した速度であり、Etは酵素の総濃度であり、Itはインヒビターの総濃度であり、かつKi'はみかけの阻害定数である。競合的阻害に関して、等式(2)によってKiをKi'と関連付ける(2):
Ki'=Ki(1+S/Km) (2)
上式でKi'はSと共に直線的に増大し、Kiは阻害定数であり、Sは基質の濃度であり、かつKmはS2238に関するミカエリス定数である(3.25±0.56μMであると決定、図8、報告された値と同様24,25)。バリエジンとs-バリエジンの両方が強結合インヒビターであることが分かった。Originソフトウェアを使用して、これらの等式にデータをフィッティングした。
P=Vst+(Vo-Vs)(1-e-kt)/k+Po (3)
上式でPは形成される生成物の量であり、Poは生成物の初期量であり、Vsは最終的な定常状態速度であり、Voは初期速度であり、tは時間であり、かつkはみかけの一次速度定数である。
k=K4+K3It/[It+Ki‘(1+S/Km)] (4)
Ki=Ki‘[K4/(K3+K4)] (5)
バリエジンの選択性プロファイルを、13種類のセリンプロテアーゼに対して調べた:線維素溶解セリンプロテアーゼ(プラスミン、TPAおよびウロキナーゼ)、抗凝固セリンプロテアーゼAPC、凝固促進セリンプロテアーゼ(FXIIa、FXIa、FXa、FIXa、FVIIa、カリクレインおよびトロンビン)ならびに古典的セリンプロテアーゼ(キモトリプシンおよびトリプシン)。これらのセリンプロテアーゼに対するs-バリエジンの影響は、特異的発色基質を使用してアッセイしたそれらのアミド分解活性の阻害によって決定した。
フィブリノゲン凝固時間を延長するs-バリエジン、EP25およびAP18の能力を、BBLフィブロメーター(BD、Franklin Lakes、New Jersey)を使用して試験した。200μlのフィブリノゲン(最終濃度3mg/ml)を、37℃で100μlのペプチド(様々な濃度)と共にインキュベートした。フィブリノゲンの凝固は、100μlのトロンビン(最終濃度20nM)の添加によって開始した。全ての試薬およびサンプルは、100mMのNaClを含有する50mMのトリスバッファー(pH7.4)中に溶解した。
s-バリエジンおよびEP25(最終濃度:150μM)を、室温と37℃の両方でトロンビン(最終濃度:5μM)と共にインキュベートした。様々なインキュベーション時間の後、反応を0.1%のTFAバッファー(pH1.8)でクエンチし、AKTA(商標)精製機に取り付けたSunFire(商標)C18カラムにロードした。0分インキュベーションのクロマトグラムに存在したピーク以外の新たなピークは切断産物として同定し、ESI-MSに供してそれらの質量を確認した。それらのピークを統合して、ピーク下面積およびそれぞれのピークの相対的割合を算出した。
バリエジンアイソフォームの精製
A.variegatumの粗製SGEは、3種類全ての凝固アッセイ(PT、APTTおよびTT)において強力な抗凝固活性を示した(図9)。強度は順にTT>>APTT>PTであり、SGEが1つまたは複数のトロンビンインヒビターの有望な供給源であることを示した。この1つまたは複数のインヒビターを精製するために、SGEをRP-HPLCによって分画した(図1A)。第1の精製ステップ後、最も強力な抗凝固分画(AV-III)を第2の精製ステップに供した(図1B)。生成した画分は、凝固および発色基質アッセイにおいて抗トロンビン活性に関してスクリーニングした。最も強い活性を有する2つの画分(保持時間23.083分および28.933分)を別の実験でさらに精製した。保持時間23.083分を有する画分はAV3/5およびAV5/5と呼ばれる2つの主要ピークに分離した(図1C)。保持時間28.933分を有する画分は1個の主要ピークおよび小さな「ショルダーピーク」を有し、主要ピークはAV6/5と呼ばれた(図1D)。これら3つの画分(AV3/5、AV5/5およびAV6/5)および粗製SGEの抗凝固活性はPT、APTT、TTおよびTEGアッセイによって確認した。全4種類のアッセイは、AV6/5が最も強い抗凝固活性を含有し、次にAV3/5およびAV5/5が続くことを明らかにした(表1)。
全3個の画分の部分アミノ酸配列をエドマン分解によって決定した。AV6/5に関して、配列および分子量分析はMALDI-TOFによって実施した。AV6/5のMALDIスペクトルは、3769.96Da(モノアイソトピック質量=3768.96Da)の主要m/zシグナルおよび3777.79Da(モノアイソトピック質量=3776.79Da)のマイナーなm/zシグナルを明らかにした。主な構成成分は、Thr14がヘキソース部分によって修飾されている配列SDQGDVAEPKMHKT(hex)APPFDFEAIPEEYLDDES(配列番号1)を有する。これをバリエジンと名付け、さらに特徴付けした。マイナーな構成成分(3776.79Da)はバリエジンとほぼ同一であり、Glu31がHisに置換されている。エドマン分解によって決定した部分配列は、AV3/5画分中の2つの構成成分(m/z3953.54および3409.57Da)およびAV5/5中の3つの構成成分(m/z3680.23、3368.94および3173.62Da)を明らかにした。決定した全ての配列はバリエジンと非常に類似している(図2A)。バリエジンのCDスペクトルはランダムコイルタンパク質に典型的である(表2)。
トロンビンアミド分解活性を阻害するバリエジンの能力を、S2238(活性部位のみと結合する小分子ペプチジル基質)を用いてアッセイした。バリエジンはアミド分解活性を阻害し、かつ阻害の進行曲線は、混合によって平衡定常状態を得たことを示した(図2B)。顕著な阻害(約80%)を、等モル濃度のトロンビンおよびバリエジン(3.33nM)に関して観察した。阻害のIC50は約0.99±0.02nMである(図2C)。バリエジンは、約10.4±1.4pMのKiでトロンビンの迅速かつ強結合の競合的インヒビターである(図2D)。
さらなる特徴付けのために、3種類のペプチドを合成し、精製し特徴付けした。合成バリエジン(SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(配列番号1)、s-バリエジン)はバリエジンの完全配列を有し、一方EP25(EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES)(配列番号6)およびAP18(APPFDFEAIPEEYLDDES)(配列番号16)はN末端から7個および14個の残基が切断されている。天然バリエジン(n-バリエジン)と異なり、s-バリエジンおよびEP25中ではThrはグリコシル化されていない。s-バリエジン、EP25およびAP18のCDスペクトルはn-バリエジンのそれといずれも類似しており、ランダムコイルタンパク質に典型的である(図9)。
特異性を決定するために、トロンビンを含めた13種類のセリンプロテアーゼに対してs-バリエジンをスクリーニングした。トロンビン以外に、1μMのs-バリエジンでさえ、他のセリンプロテアーゼが有意な阻害を示すことはなかった(≦5%)。10%を超える阻害はより高濃度のs-バリエジンで観察された。最も影響を受けやすいプロテアーゼは、プラスミン、トリプシンおよびFXIaであり、これらは100μMのs-バリエジンによって約20〜30%阻害された。対照的に、トロンビンに対しては、類似した約30%の阻害は少なくとも4桁小さい濃度(約3.3nM)で観察された(図3)。したがって、s-バリエジンは特異的かつ強力なトロンビンインヒビターである。
s-バリエジンは、阻害の平衡定常状態が混合によって得られた点でn-バリエジンと類似している。s-バリエジンはn-バリエジンより5倍活性が低く、約30%の阻害は等モル濃度のトロンビンとs-バリエジン(3.33nM)で観察された。用量応答曲線はインキュベーション時間(0分および10分)と無関係に5.40±0.95nMのIC50値を示した(図4A)。したがって、s-バリエジンもトロンビンの迅速かつ強結合インヒビターである。s-バリエジンにおけるThrグリコシル化の不在は、その弱い活性の原因である可能性がある。
s-バリエジン、EP25およびAP18はいずれも用量依存的にフィブリノゲン凝固時間を延長した(図4D)。フィブリノゲンはトロンビンの活性部位とエキソサイト-Iの両方と結合する1,2。AP18はトロンビンのフィブリノゲン溶解活性を阻害したがアミド分解活性は阻害せず、したがって本発明者らは、バリエジンのC末端はエキソサイト-Iと結合すると結論付けた。この観察はヒルジンC末端のそれと一致する28,29。s-バリエジンとEP25の間の活性の違いは、おそらくEP25の緩慢な結合形式が原因である。
s-バリエジンおよびEP25のKiを、基質としてS2238を使用して決定した。s-バリエジンは迅速かつ強結合インヒビターである。Ki'を異なる濃度のS2238の存在下で決定した(図5A)。s-バリエジンはトロンビンの競合的インヒビターであり、そのKi'は漸増濃度のS2238と共に直線的に増大した(等式2)(図5B)。真の阻害定数、Kiは約146.4±13.6pMであることが分かった。これはn-バリエジン(約10.4±1.4pM)より14倍高い。対照的に、EP25はトロンビンの緩慢な結合インヒビターである。阻害の進行曲線を式3にフィッティングしてそれぞれの濃度のEP25に関するkを得た(図5C)。k(初期衝突複合体(EI)と最終的な安定複合体(EI*)の間の平衡を確定するためのみかけの一次速度定数)は、スキーム(2)によって記載されるようにEP25濃度と共に大きく増大した(図5D)。したがって、EP25とトロンビンの間の結合はEIからEI*への異性化を含む。EIの解離定数(Ki‘、式4)は約529.7±76.7pMであり、一方全体の阻害定数Ki(式5)は約149.8±30.5pMであった。したがって、EP25のKiはs-バリエジンのKiとほぼ同じである(約146.4±13.6pM)。これらの結果によって、7個のN末端残基の欠失は強度に影響を与えなかったが、結合形式を迅速から緩慢に変えたことを確認した。
バリエジンはトロンビンの活性部位と結合するので、他のセリンプロテアーゼインヒビターと同様にトロンビンによって切断される可能性がある30。したがって本発明者らは、トロンビンによるs-バリエジンの切断および阻害に対するその影響を調べた。RP-HPLC分析によって、s-バリエジンは室温および37℃でトロンビンによって実際に切断されたことが示された。0分のインキュベーションでは、非切断s-バリエジンおよびトロンビンに対応するピークのみが存在した。切断産物の2つの新たなピークが出現し、増大するインキュベーション時間と共に増大した(図6A)。これらの新たなピークは、それぞれ1045Da(SDQGDVAEPK(配列番号2))および2582Da(MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(配列番号3))の分子量を有しており、Lys10-Met11ペプチド結合での切断に相当した。切断は室温より37℃で迅速に進行した(図9)。
バリエジンは天然で見られる最小トロンビンインヒビターの1つである。その小さなサイズおよび柔軟性のある構造にもかかわらず、バリエジンは強い親和性でトロンビンと結合する。構造-活性試験は、バリエジンはトロンビンの広い表面積と結合することを示す。7個のN末端残基は結合動態に影響を与え、除去したとき、バリエジンの結合特性は迅速から緩慢に変わった。残基8〜14はトロンビンの活性部位と結合するようであり、かつ残基15〜32はエキソサイト-Iと結合するようである。バリエジンはトロンビンによって切断されるが、その阻害活性は切断後に大部分が保持された。
バリエジンの変異体および断片の活性の分析
s-バリエジンおよびEP25のIC50およびKiを決定するための上記のアッセイを、(化血研、日本からの)3.33nMの組換えヒトα-トロンビンの代わりに(化血研、日本からの)1.65nMのヒト血漿由来トロンビンを使用したこと以外、実施例1中に記載したのと同様に繰り返した。
s-バリエジンは大部分が切断後にその活性を保持していることを考慮して、1つまたは複数のその切断産物はトロンビンと強く結合した状態であったと本発明者らは仮定した。s-バリエジン切断後のC末端断片を表すペプチドであるMH22を合成した。
次に、ペプチドEP25A22Eを合成した。このペプチド中では、s-バリエジン中のアラニン22(EP25中のアラニン15)をグルタミン酸に置換した。グルタミン酸はヒルジン中の同じ位置に存在するからである:
EP25(配列番号6):EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES
EP25A22E(配列番号7):EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES
ペプチドMH22A22Eによって表されるEP25A22E切断のC末端断片を合成した:
EP25A22E(配列番号7):EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES
MH22A22E(配列番号5):MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES
EP25A22EとMH22A22Eの両方からの結果は、アラニン22のグルタミン酸での置換はペプチド活性を変えなかったことを示した。次に、アラニン残基を保持することによってペプチドを合成した。
EP21(配列番号8):EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL
MH18(配列番号20):MHKTAPPFDFEAIPEEYL
本発明者らは、s-バリエジンのN末端中の荷電残基がその迅速な結合動態の原因であると仮定したので、EP21のN末端に3個の過剰な残基を有するペプチドDV24を合成して、このペプチドが迅速な結合形式に変わるかどうか試験した:
EP21(配列番号8):EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL
DV24(配列番号9):DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL
大部分のトロンビンインヒビターがs-バリエジンにおいてリシンの代わりにP1位置にアルギニンを有することを考慮して、本発明者らは同じ置換でペプチドDV24K10Rを合成した:
DV24(配列番号9):DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL
DV24K10R(配列番号10):DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEYL
これらの実験結果から、バリエジンの断片およびこれらの断片の突然変異体はトロンビン活性の有効なインヒビターであるという知見が確認される。これらの分子置換実験に由来する情報によって、エキソサイト2との相互作用はトロンビンに最も迅速な結合をもたらすために重要であることも確認した。
ラットにおける全身の定量的オートラジオグラフィー試験
[3H]-標識試験物質を使用して、ラットにおけるバリエジンの分布を調べた。実験は0.4mg/kgの用量レベルで実施した。
用量調製および評価
1mLの透析バッファー(50mMのリン酸ナトリウム、200mMの塩化ナトリウム(pH8.0))中に1mgのバリエジンを溶解した溶液を調製し、[3H]-NSP(400μCi)と共にインキュベートした。
単回静脈内用量を、0.4mg/kg(0.8mL/体重1kg)の投与レベルの容量でシリンジおよび針を使用して、それぞれの動物に投与した。製剤はラットの尾静脈中に単回パルス用量として分配した。それぞれのラットに投与した用量は、投与溶液の投与容量、および規定の放射活性濃度および比活性によって決定した。
[3H]-バリエジンを、0.4mg/kgの公称投与レベルで単回静脈内用量として3匹のオスのラットに投与した。一連の血液サンプルを投与後の以下の時間:0.5、2、4、6、24および48時間で血漿調製用に採取した。
血漿に伴う放射活性を、既知の容量のサンプルの液体シンチレーション計数によって直接決定した。サンプルはUltima Goldシンチラントと混合し、自動外部標準クエンチ補正でPackard液体シンチレーションカウンターを使用して計数した。最適なチャンネル設定を選択した後、クエンチ補正曲線を放射化学標準から作製した。これらの曲線の妥当性は実験を通して調べた。2倍未満のバックグラウンド計数を有する放射活性は正確な定量化の限界未満であると考えた。
静脈内投与後の血漿中のバリエジンの濃度を、PCModfit(バージョン3.0)を使用して分析した。動態データはノンコンパートメント解析(NCA)によって特徴付けた。以下の薬物動態パラメータ:最大ピークの血漿濃度(Cmax)、最大観察濃度の時間(Tmax)、終末半減期(t1/2)、および曲線下面積(AUC)をデータから誘導した。
[3H]-バリエジンを、0.4mg/kgの公称投与レベルで単回静脈内用量として3匹のオスのラットに投与した。用量投与後0.5、1および24時間で、1匹のラットをCO2過剰摂取によって屠殺した。屠殺後、固体二酸化炭素を含む約-80℃に冷却したヘキサン浴中に完全に浸すことによって、動物を迅速に凍結した。
レベルA:眼窩外涙腺
レベルB:眼窩内涙腺
レベルC:ハーダー腺/副腎
レベルD:甲状腺
レベルE:脳および脊髄。
少なくとも14日間約-75℃のフリーザー中に保存した鉛容器中での曝露後、イメージングプレートをFUJI BAS1500生体画像分析器(Raytek Scientific Ltd)を使用して処理した。
濃度をμgまたはng当量バリエジン/g(mL)として報告する場合、放射活性はバリエジンまたは同じ分子量の化合物と関連していると推定される。投与溶液の比活性を全ての例において濃度(μgまたはng当量バリエジン/g(mL))の計算のために使用した。
これらの結果は、投与後、吸収された放射活性は限られた組織中に分布していたことを示す。脳内の放射活性濃縮は全ての時点で定量化の限界未満のレベルであり、これは血液脳関門を越える試験化合物の移動がないことを示唆し得る。組織中の最大濃縮は0.5時間、すなわち第1サンプリング時点で観察された。放射活性の最大濃縮は腎臓および膀胱で観察された。24時間後、全ての組織中の放射活性は検出限界未満に低下していた。
Claims (30)
- トロンビンのエキソサイトIおよび活性部位と相互作用する1または複数の分子にトロンビンを曝露することによる、トロンビン活性の阻害方法。
- 前記1または複数の分子が、トロンビンのエキソサイトI、エキソサイトIIおよび活性部位のすべてと相互作用する、請求項1に記載の方法。
- 前記1または複数の分子が、トロンビン活性部位の前に、エキソサイトI部位およびエキソサイトII部位と相互作用する、請求項2に記載の方法。
- 前記1または複数の分子が、アミド分解アッセイで評価した場合に、10nM未満、好ましくは9nM未満、8nM未満、7nM未満、6nM未満、5nM未満、4nM未満、3nM未満、2nM未満または1nM未満のIC50を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1または複数の分子が、アミド分解アッセイで評価した場合に、200pM未満、好ましくは150pM未満、100pM未満、50pM未満、30pM未満、25pM未満、20pM未満、15pM未満のKiを有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1または複数の分子が特異的にトロンビンを阻害する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1または複数の分子がランダムコイル構造を有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記分子が、アミノ酸配列SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(配列番号1)を有するバリエジン(variegin)タンパク質または該バリエジンタンパク質の機能的等価物である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記バリエジンタンパク質の機能的等価物が、アミノ酸配列SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDHS(配列番号4)を有する変異体である、請求項8に記載の方法。
- 前記バリエジンタンパク質の機能的等価物が、以下のアミノ酸配列:
MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(MH22)(配列番号3);
MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES(MH22A22E)(配列番号5);
EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(EP25)(配列番号6);
EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES(EP25A22E)(配列番号7);
EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(EP21)(配列番号8);
MHKTAPPFDFEAIPEEYL(MH18)(配列番号20);
DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(DV24)(配列番号9);
DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEYL(DV24K10R)(配列番号10);
SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(配列番号11);
SDQADRAQPKLHRNAPQGDFEAIPDEYL(配列番号12);
SDQSGRAQPKLPRNAPQGDFEAIPDEYL(配列番号13);
SDQGDVAEPKMHKTAPPGDFEAIPEEYLD(配列番号14);および
SDQADVAEPKMHKTAPPGDFEAIPEEYLD(配列番号15)
より選択されるアミノ酸配列を有するバリエジンタンパク質の断片またはバリエジンタンパクの変異体の断片である、請求項9に記載の方法。 - in vitroで実施される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- in vivoで実施される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 血液凝固障害に罹患した患者を治療するために、または患者が血液凝固障害を発症するのを予防するために行なわれる、請求項12に記載の方法。
- 異常なトロンビン蓄積に関連する疾患を診断するために行なわれる、請求項11または12に記載の方法。
- 悪性疾患または悪性疾患に関連する状態に罹患した患者を治療するために行われる、請求項12に記載の方法。
- アミノ酸配列SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(配列番号1)を有するバリエジンタンパク質またはその機能的等価物と、トロンビンとの複合体。
- (a)アミノ酸配列SDQGDVAEPK(配列番号2)およびMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(配列番号3)を有するバリエジンタンパク質の切断産物または該バリエジンタンパク質の機能的等価物の切断産物の切断産物と;(b)トロンビンとの複合体。
- バリエジン配列の断片を含み、かつ以下のアミノ酸配列:
EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(EP25:活性部位およびエキソサイトI)(配列番号6)
APPFDFEAIPEEYLDDES(AP18:エキソサイトI)(配列番号16)
SDQGDVAEPKMHKT(エキソサイトII結合および活性部位)(配列番号17)
SDQGDVA(エキソサイトII)(配列番号18)
EPKMHKT(活性部位)(配列番号19)
APPFDFEAIPEEYLDDES(エキソサイトI)(配列番号16)
SDQGDVAEPK(切断産物1)(配列番号2)
MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(切断産物2;MH22)(配列番号3)
EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(EP21)(配列番号8)
MHKTAPPFDFEAIPEEYL(MH18)(配列番号20)
DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(DV24)(配列番号9)
またはそれらの機能的等価物
より選択されるアミノ酸配列を含む、トロンビン・インヒビター。 - 以下のアミノ酸配列:
EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(EP25)(配列番号6)
APPFDFEAIPEEYLDDES(AP18)(配列番号16)
SDQGDVA(エキソサイトII)(配列番号18)
EPKMHKT(活性部位)(配列番号19)
APPFDFEAIPEEYLDDES(エキソサイトI)(配列番号16)
SDQGDVAEPK(切断産物1)(配列番号2)
MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES(切断産物2)(配列番号3)
MHKTAPPFDFEAIPEEYL(MH18)(配列番号20)
DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(DV24)(配列番号9)
より選択されるアミノ酸配列からなるか、またはその機能的等価物である、請求項18に記載のトロンビン・インヒビター。 - 機能的等価物であり、かつ以下のアミノ酸配列:
EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES(EP25A22E)(配列番号7)
DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEYL(DV24K10R)(配列番号10)または
MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES(MH22A22E)(配列番号5)
より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項18または19に記載のトロンビン・インヒビター。 - トロンビンと、請求項18〜20のいずれか1項に記載のトロンビン・インヒビターとの複合体。
- 請求項18〜20のいずれか1項に記載のトロンビン・インヒビターをコードする核酸分子。
- 請求項22に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項22に記載の核酸分子または請求項23に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項18〜20のいずれか1項に記載のトロンビン・インヒビターの調製方法であって、前記タンパク質が発現される条件下で請求項24に記載の宿主細胞を培養するステップ、およびそのようにして産生されたタンパク質を回収するステップを含む、上記方法。
- 請求項18〜20のいずれか1項に記載のトロンビン・インヒビターまたは請求項22に記載の核酸分子および製薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
- 血液凝固障害に罹患した患者の治療方法または患者が血液凝固障害を発症するのを予防する方法であって、該患者に治療上有効量または予防上有効量の請求項18〜20のいずれか1項に記載のトロンビン・インヒビターを投与するステップを含む、上記方法。
- トロンビン蓄積により引き起こされる疾患または状態の診断方法であって、患者または患者から単離した組織に請求項18〜20のいずれか1項に記載のトロンビン・インヒビターを投与するステップ、およびトロンビンに結合した該トロンビン・インヒビターの存在を検出するステップを含み、トロンビンに結合した該トロンビン・インヒビターの検出が該疾患または状態を示すものである、上記方法。
- 前記疾患または状態が、フィブリン血栓または血小板血栓である、請求項28に記載の方法。
- 悪性疾患または悪性疾患に関連する状態の治療方法であって、それを必要とする患者に治療上有効量の請求項18〜20のいずれか1項に記載のトロンビン・インヒビターを投与するステップを含む、上記方法。
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