CN109824772A - 一组提高血清糖皮质激素水平的基因重组人促皮质素前体及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及四种具有提高血清中糖皮质激素水平作用的基因重组人促皮质素（ACTH）前体蛋白：ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80、ProACTH141，以及这四种前体蛋白的制备方法。ProACTH113包含阿黑皮素原（Pro‑opiomelanocortin，POMC）的第105‑217位氨基酸多肽链，ProACTH72包含POMC的第105‑176位氨基酸多肽链，ProACTH80包含POMC的第138‑217位氨基酸多肽链，ProACTH141包含POMC的第77‑217位氨基酸多肽链；这四种ACTH前体蛋白中均包含ACTH多肽第1至39位氨基酸序列。为便于纯化，ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80、ProACTH141等四种前体蛋白的N端与肠激酶底物序列（EKst）相连接，利用连有组蛋白标签的肠激酶体外切除这四种前体蛋白N端连有的多余肽段，产生游离的ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80、ProACTH141，再利用镍柱除去连有组蛋白标签的肠激酶。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和蛋白质工程制药领域，具体涉及一组促皮质素前体蛋白(ProACTH)及其DNA和蛋白质的序列，以及这组前体蛋白的制备工艺。
背景技术
促皮质素(Corticotropin)也称促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropichormone，ACTH)，是由垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种39个氨基酸的多肽类激素，具有调控GC的合成与分泌，调节糖、脂肪、和蛋白质的生物合成和代谢，调节心脑血管功能，提高抵抗力，神经损伤保护与再生，抗炎，免疫抑制，抗毒素，抗休克等作用。ACTH是临床治疗两岁以下婴儿惊厥症的唯一特效药，该病发病率0.5％～1％，6～33％的婴儿惊厥症患儿在3岁前死亡，70～90％患儿智力发育缓慢，30％发展为自闭症。ACTH也用于红斑狼疮、多发性硬化病急性恶化、肾病综合征、全身性皮肌炎和结节病的治疗；还用于银屑病关节炎、风湿性关节炎、强直性脊柱炎以及严重眼部过敏和炎症等的辅助治疗。ACTH不稳定，体内半衰期只有不超过15分钟。目前国内临床应用的ACTH主要从动物组织中提取，生产成本相对较高，并且有传播动物病毒和支原体的潜在风险。本发明从工程菌中表达制备基因重组ACTH前体蛋白(ProACTH)，具有生产成本低，减少传播动物病毒和支原体潜在风险等优点。
ACTH由阿黑皮素原(Pro-opiomelanocortin，POMC)在丝氨酸蛋白内切酶水解作用下产生，对应POMC第138-176位氨基酸多肽链。POMC中存在多个蛋白酶切位点，本发明中利用到的包括第76-77位、104-105位、137-138位、176-177位以及217-218位氨基酸残基之间的酶切位点。本发明利用以上酶切位点构建4种前体蛋白，分别为ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80和ProACTH141。ProACTH113包含POMC的第105-217位氨基酸多肽链；ProACTH72包含POMC的第105-176位氨基酸多肽链；ProACTH80包含POMC的第138-217位氨基酸多肽链；ProACTH141包含POMC的第77-217位氨基酸多肽链。构建成重组融合表达载体、纯化并测定对GC的影响。这些ACTH的前体蛋白均能够提高动物血清中糖皮质激素的水平。
ACTH在人体中最主要的生理和药理学作用是调控肾上腺皮质激素的合成。ACTH通过激活黑素皮质素2型受体(MC2R)发挥作用。MC2R属于7次跨膜G蛋白偶联受体(GPCR)，激活后引起细胞内第二信使环腺苷酸(cAMP)含量增加。cAMP激活蛋白激酶A(PKA)，后者使转录因子——cAMP反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化。磷酸化CREB(p-CREB)调节GC合成的关键酶的基因表达，从而发挥对体内GC水平的长时程调控作用。肾上腺皮质激素(Adrenocorticalhormones，ACH)是肾上腺皮质分泌的激素的总称，它的表达主要受ACTH调节。肾上腺皮质激素包括GC、盐皮质激素和性激素。GC为甾体类激素，在人体中的主要以皮质醇形式存在，具有促进蛋白质、糖、脂肪的生物合成和代谢、抗炎和抑制免疫应答等作用。由于体内GC的合成严格受到促皮质素的调控，所以血清中GC的浓度可以作为评价ACTH样作用的指标。
四种融合蛋白的cDNA架构分别为HisTag-EKst-ProACTH113-pET21a，HisTag-EKst-ProACTH72-pET21a、HisTag-EKst-ProACTH80-pET21a、HisTag-EKst-ProACTH141。其中HisTag为多次重复组氨酸标签，EKst为肠激酶(Enterokinase)底物序列(氨基酸序列为DDDDK)。肠激酶可以在EKst末端切开多肽链，得到不含多余氨基酸的ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80、ProACTH141蛋白。
发明内容
1.发明的目的
本发明利用工程菌制备一组具有提高血清中糖皮质激素水平作用的基因重组ACTH前体蛋白，包括ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80、ProACTH141，以及制备方法。
2.发明的技术方案
一、合成两端带有内切酶位点(NdeI和SalI)的cDNA架构：NdeI-HisTag-EKst-ProACTH141-SalI，对ProACTH141基因序列进行序列优化与cDNA合成，此架构中ProACTH141前插入了一段EKst碱基序列，EKst的5'端连有编码连续6个组氨酸的HisTag碱基序列。采用类似方法构建ProACTH113：NdeI-HisTag-EKst-ProACTH113-SalI，区别在于HisTag中含有8个组氨酸。以NdeI-HisTag-Ekst-ProACTH141-SalI为模板，利用包含限制性酶切位点的引物，PCR扩增出其它cDNA，包括：ProACTH72：NdeI-HisTag-EKst-ProACTH72-SalI以及ProACTH80：NdeI-HisTag-EKst-ProACTH80-SalI。
二、利用限制性内切酶NdeI与SalI双酶切上一步实验中得到的NdeI-HisTag-EKst-ProACTH113-SalI、NdeI-HisTag-EKst-ProACTH72-SalI、NdeI-HisTag-EKst-ProACTH80-SalI、NdeI-HisTag-EKst-ProACTH141-SalI以及pET21a空白质粒，产生粘性末端。
三、用T4连接酶将切出粘性末端的NdeI-HisTag-EKst-ProACTH113-SalI、NdeI-HisTag-EKst-ProACTH72-SalI、NdeI-HisTag-EKst-ProACTH80-SalI、NdeI-HisTag-EKst-ProACTH141-SalI以及pET21a空白质粒连接，构建出表达HisTag-EKst-ProACTH113(图1)、HisTag-EKst-ProACTH72(图2)、HisTag-EKst-ProACTH80(图3)、HisTag-EKst-ProACTH141(图4)的表达质粒。
四、将构建好的表达质粒分别转入大肠杆菌工程菌株BL21-DE3，筛选高表达菌株，诱导表达。
五、破碎菌体，离心收集上清，分别得到富含HisTag-EKst-ProACTH113、HisTag-EKst-ProACTH72、HisTag-EKst-ProACTH80和HisTag-EKst-ProACTH141的上清溶液。
六、利用镍(Ni)柱纯化HisTag-EKst-ProACTH113、HisTag-EKst-ProACTH72、HisTag-EKst-ProACTH80和HisTag-EKst-ProACTH141蛋白。
七、用带有His标签的肠激酶体外酶切HisTag-EKst-ProACTH113、HisTag-EKst-ProACTH72、HisTag-EKst-ProACTH80和HisTag-EKst-ProACTH141，分别得到含有ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80和ProACTH141蛋白的四种溶液。
八、用Ni柱从上述四种溶液中去除带有His标签的肠激酶以及切下来的HisTag-EKst，得到纯化的ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80和ProACTH141蛋白。
动物体内实验，比较野生型ACTH以及ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80和ProACTH141等ACTH前体蛋白提高动物血清中GC水平的作用。
附图说明
图1.HisTag-EKst-ProACTH113-pET21a表达质粒图谱。
图2.HisTag-EKst-ProACTH72-pET21a表达质粒图谱。
图3.HisTag-EKst-ProACTH80-pET21a表达质粒图谱。
图4.HisTag-EKst-ProACTH141-pET21a表达质粒图谱。
图5.HisTag-EKst-ProACTH113-pET21a、HisTag-EKst-ProACTH72-pET21a、HisTag-EKst-ProACTH80-PET21a和HisTag-EKst-ProACTH141-pET21a表达质粒的NdeI及SalI双酶切验证结果。
M：分子量标记；泳道1：pET21a空白质粒；
泳道2：HisTag-EKst-ProACTH113-pET21a质粒NdeI及SalI双酶切，小片段为
HisTag-EKst-ProACTH113，大片段为pET21a载体片段；
泳道3：HisTag-EKst-ProACTH72-pET21a质粒NdeI及SalI双酶切，小片段为
HisTag-EKst-ProACTH72，大片段为pET21a载体片段；
泳道4：HisTag-EKst-ProACTH80-pET21a质粒NdeI及SalI双酶切，小片段为
HisTag-EKst-ProACTH80，大片段为pET21a载体片段；
泳道5：HisTag-EKst-ProACTH141-pET21a质粒NdeI及SalI双酶切，小片段为
HisTag-EKst-ProACTH141，大片段为pET21a载体片段。
图6.表达HisTag-EKst-ProACTH113的质粒DNA测序结果。合计390个碱基，包括5'末端起始密码子ATG、HisTag-EKst-ProACTH113编码序列以及3'末端三重终止密码子TAATAATAA。其中的HisTag核苷酸序列编码8个重复的组氨酸。
图7.表达HisTag-EKst-ProACTH72的质粒DNA测序结果。合计261个碱基，包括5'末端起始密码子ATG、HisTag-EKst-ProACTH72编码序列以及3'末端三重终止密码子TAATAATAA。其中的HisTag核苷酸序列编码6个重复的组氨酸。
图8.表达HisTag-EKst-ProACTH80的质粒DNA测序结果。合计285个碱基，包括5'末端起始密码子ATG、HisTag-EKst-ProACTH82编码序列以及3'末端三重终止密码子TAATAATAA。其中的HisTag核苷酸序列编码6个重复的组氨酸。
图9.表达HisTag-EKst-ProACTH141的质粒DNA测序结果。合计468个碱基，包括5'末端起始密码子ATG、HisTag-EKst-ProACTH141编码序列以及3'末端三重终止密码子TAATAATAA。其中的HisTag核苷酸序列编码6个重复的组氨酸。
图10.在BL21-DE3工程菌中表达的HisTag-EKst-ProACTH113、HisTag-EKst-ProACTH72、HisTag-EKst-ProACTH80和HisTag-EKst-ProACTH141蛋白质电泳结果。分别表达的蛋白质经SDS-PAGE(15％Tris-Glycine聚丙烯酰胺凝胶)分离后，用考马斯亮蓝R-250原位染色，用BIO-RAD ChemiDocTM XRS+凝胶成像系统检测蛋白质条带。M：分子量标记；
泳道1：HisTag-EKst-ProACTH113-pET21a质粒未诱导，
泳道2：HisTag-EKst-ProACTH113-pET21a质粒诱导表达；
泳道3：HisTag-EKst-ProACTH72-pET21a质粒未诱导，
泳道4：HisTag-EKst-ProACTH72-pET21a质粒诱导表达；
泳道5：HisTag-EKst-ProACTH80-pET21a质粒未诱导，
泳道6：HisTag-EKst-ProACTH80-pET21a质粒诱导表达；
泳道7：HisTag-EKst-ProACTH141-pET21a质粒未诱导，
泳道8：HisTag-EKst-ProACTH141诱导表达。
图11.诱导表达的HisTag-EKst-ProACTH113、HisTag-EKst-ProACTH72、HisTag-EKst-ProACTH80和HisTag-EKst-ProACTH141在原核细胞内表达后用镍柱纯化结果图。重组质粒在BL21-DE3工程菌中表达后，经超声破碎，上清液用镍柱纯化后，经SDS-PAGE(15％Tris-Glycine聚丙烯酰胺凝胶)分离，再用考马斯亮蓝R-250原位染色，用BIO-RADChemiDocTM XRS+凝胶成像系统检测蛋白质条带。M：分子量标记；
泳道1：HisTag-EKst-ProACTH113-pET21a质粒诱导表达后未经纯化的菌体裂解上清液，泳道2：镍柱纯化后的HisTag-EKst-ProACTH113蛋白；
泳道3：pET21a-HisTag-EKst-ProACTH72全菌诱导表达，泳道4：镍柱纯化后的pET21a-HisTag-EKst-ProACTH72蛋白；
泳道5：pET21a-HisTag-EKst-ProACTH80全菌诱导表达，泳道6：镍柱纯化后的HisTag-EKst-ProACTH80蛋白；
泳道7：pET21a-HisTag-EKst-ProACTH141全菌诱导表达，泳道8：镍柱纯化后的HisTag-EKst-ProACTH141蛋白。
图12.纯化后的HisTag-EKst-ProACTH113、HisTag-EKst-ProACTH72、HisTag-EKst-ProACTH80、HisTag-EKst-ProACTH141的Western blot检测结果。HisTag-EKst-ProACTH113、HisTag-EKst-ProACTH72、HisTag-EKst-ProACTH80、HisTag-EKst-ProACTH141经SDS-PAGE(15％Tris-Glycine聚丙烯酰胺凝胶)分离后，转印到NC膜检测，一抗为鼠抗人ACTH特异性抗体，二抗为Alexa488荧光标记羊抗鼠抗体，用Typhoon FLA 9500(GEHealhcare)检测条带荧光强度。M：分子量标记。泳道1：HisTag-EKst-ProACTH113融合蛋白；泳道2：HisTag-EKst-ProACTH72融合蛋白；泳道3：HisTag-EKst-proACTH80融合蛋白；泳道4：HisTag-EKst-proACTH141融合蛋白。
图13.基因重组HisTag-EKst-ProACTH113蛋白经带组蛋白标签的肠激酶酶切分别得到去除标签的ProACTH113的Western blot检测图。SDS-PAGE(15％Tris-Glycine聚丙烯酰胺凝胶)分离后，转印到NC膜检测，一抗为鼠抗人ACTH(Abcam)特异性抗体，二抗为Alexa488荧光标记羊抗鼠抗体(Abcam)，用Typhoon FLA 9500(GE Healhcare)检测荧光条带图。M：分子量标记；泳道1：HisTag-EKst-ProACTH113；泳道2：酶切后用镍柱去除HisTag-EKst和肠激酶后得到的ProACTH113蛋白。
图14.基因重组HisTag-EKst-ProACTH72蛋白经带组蛋白标签的肠激酶酶切分别得到去除标签的ProACTH113的Western blot检测图。SDS-PAGE(15％Tris-Glycine聚丙烯酰胺凝胶)分离后，转印到NC膜检测，一抗为鼠抗人ACTH(Abcam)特异性抗体，二抗为Alexa488荧光标记羊抗鼠抗体(Abcam)，用Typhoon FLA 9500(GE Healhcare)检测荧光条带图。M：分子量标记；泳道1：HisTag-EKst-ProACTH72蛋白；泳道2：酶切后用镍柱去除HisTag-EKst和肠激酶后得到的ProACTH72蛋白。
图15.基因重组HisTag-EKst-ProACTH80蛋白经带组蛋白标签的肠激酶酶切分别得到去除标签的ProACTH113的Western blot检测图。SDS-PAGE(15％Tris-Glycine聚丙烯酰胺凝胶)分离后，转印到NC膜检测，一抗为鼠抗人ACTH(Abcam)特异性抗体，二抗为Alexa488荧光标记羊抗鼠抗体(Abcam)，用Typhoon FLA 9500(GE Healhcare)检测荧光条带图。M：分子量标记；泳道1：HisTag-EKst-ProACTH80蛋白；泳道2：酶切后用镍柱去除HisTag-EKst和肠激酶后得到的ProACTH80蛋白。
图16.基因重组HisTag-EKst-ProACTH141蛋白经带组蛋白标签的肠激酶酶切分别得到去除标签的ProACTH113的Western blot检测图。SDS-PAGE(15％Tris-Glycine聚丙烯酰胺凝胶)分离后，转印到NC膜检测，一抗为鼠抗人ACTH(Abcam)特异性抗体，二抗为Alexa488荧光标记羊抗鼠抗体(Abcam)，用Typhoon FLA 9500(GE Healhcare)检测荧光条带图。M：分子量标记；泳道1：HisTag-EKst-ProACTH141蛋白；泳道2：酶切后用镍柱去除HisTag-EKst和肠激酶后得到的ProACTH141蛋白。
图17.高效液相色谱法测定小鼠尾静脉分别注射生理盐水、ACTH(1-39)、ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80或者ProACTH141，在0、6、12、24、36、48h后小鼠血清中糖皮质激素的水平。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式表达并分离纯化基因重组ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80以及ProACTH141融合蛋白，按以下步骤进行：
一、根据原核表达体系中的密码子偏好性优化设计ProACTH141CDS序列，以适于在大肠杆菌表达菌株BL21-DE3中高效表达。以NdeI和SalI作为融合表达蛋白CDS序列的上下游两端的酶切位点，构建带有His标签和肠激酶酶切位点的融合蛋白原核表达序列NdeI-HisTag-EKst-ProACTH141-SalI。此序列将作为PCR扩增ProACTH113、ProACTH72和ProACTH80序列的模板。具体步骤如下：
引物设计：以上述优化后的NdeI-HisTag-EKst-ProACTH141-SalI序列为模板，设计NdeI-HisTag-EKst-ProACTH113-SalI的上游引物NdeI-HisTag-EKst-ProACTH113-F和下游引物ProACTH113-R、NdeI-HisTag-EKst-ProACTH72-SalI的上游引物NdeI-HisTag-EKst-ProACTH72-F和下游引物ProACTH72-R、NdeI-HisTag-EKst-ProACTH80-SalI上游引物NdeI-HisTag-EKst-ProACTH80-F和下游引物ProACTH80-R、以及NdeI-HisTag-EKst-ProACTH141-SalI的上游引物NdeI-HisTag-EKst-ProACTH141-F和下游引物ProACTH141-R。引物序列参见核苷酸序列表。
采用PCR技术，以人工合成的NdeI-HisTag-EKst-ProACTH141-SalI序列为模板，用引物NdeI-HisTag-EKst-ProACTH113-F和ProACTH113-R扩增出NdeI-HisTag-EKst-ProACTH113-SalI，用引物NdeI-HisTag-EKst-ProACTH72-F和ProACTH72-R扩增出NdeI-HisTag-EKst-ProACTH72-SalI，用引物NdeI-HisTag-EKst-ProACTH80-F和ProACTH80-R扩增出NdeI-HisTag-EKst-ProACTH80-SalI，用引物NdeI-HisTag-EKst-ProACTH141-F和ProACTH141-R扩增出NdeI-HisTag-EKst-ProACTH141-SalI。
二、用NdeI和SalI内切酶分别酶切NdeI-HisTag-EKst-ProACTH113-SalI、NdeI-HisTag-EKst-ProACTH72-SalI、NdeI-HisTag-EKst-ProACTH80-SalI以及NdeI-HisTag-EKst-ProACTH141-SalI质粒以及空白质粒载体pET21a。
三、用T4DNA连接酶连接上述切割后的cDNA片段和pET21a载体，构建HisTag-EKst-ProACTH113-pET21a(图1)、HisTag-EKst-ProACTH72-pET21a(图2)、HisTag-EKst-ProACTH80-pET21a(图3)以及HisTag-EKst-ProACTH141-pET21a(图4)完整质粒。双酶切鉴定结果参见附图5。构建好的上述四种表达质粒测序结果，分别见图6、图7、图8和图9。
四、通过在42℃水浴加热45秒钟分别将以下表达质粒：HisTag-EKst-ProACTH113-pET21a、HisTag-EKst-ProACTH72-pET21a、HisTag-EKst-ProACTH80-pET21a以及HisTag-EKst-ProACTH141-pET21a转入大肠杆菌表达菌株BL21-DE3中，加热后迅速冰浴冷却，37℃恢复菌体1小时，取50μL涂布含有氨苄青霉素的LB培养板，37℃倒置培养16h。分别挑选培养板上的单一克隆，转移到50mL(体积可等倍率放大)液体LB培养基的锥形瓶中，培养基中加有氨苄青霉素，37℃摇菌至OD 600为0.6时，加入终浓度为0.1mM IPTG于180rpm 37℃表达5h。
五、将上述4种工程菌收集在离心管中，以12,000rpm，4℃离心15min，弃去上清。加入非变性裂解液(50mM Tris-HCl、300mM NaCl、10mM咪唑，pH 8.0)柔和洗涤菌体。再以12,000rpm，4℃离心15min，收集沉淀。反复洗涤3次。每克湿重加入8mL非变性裂解液，用旋转混合仪分散菌体。将菌液置于冰上，用超声波破碎仪破碎菌体，破碎功率为400W，破碎3s停5s共破碎200次。于12,000rpm，4℃离心20min，收集上清液用于纯化蛋白质；取少量样品经15％Tris-Glycine聚丙烯酰胺电泳后，用考马斯亮蓝R-250染色将测蛋白质表达情况(图10)。
六、再生好的Ni柱用2倍体积25％乙醇洗过后，用2倍体积的去离子水洗一遍。更换流动相为平衡缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM咪唑,pH 8.0)，平衡5个柱体积。用上述步骤五中收集到的4种上清液分别上样，更换流动相为冲洗缓冲液(50mM NaH2PO4、300mMNaCl、30mM咪唑，pH 8.0)，冲洗40个柱体积。洗脱，更换流动相为洗脱液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mM咪唑，pH 8.0)，分别收集各纯化后的样品(HisTag-EKst-ProACTH113、HisTag-EKst-ProACTH72、HisTag-EKst-ProACTH80以及HisTag-EKst-ProACTH141)的洗脱组分，经15％Tris-Glycine聚丙烯酰胺电泳后，用考马斯亮蓝R-250染色蛋白质条带结果参见图11，Western blot检测结果参见图12。
七、测定各洗脱组分的蛋白质浓度，按照1U肠激酶切割50μg融合蛋白的比例加入合适剂量的带有His标签的肠激酶，酶切缓冲液组成为：25mM Tris-HCl(pH 7.6)、50mMNaCl、2mM CaCl2，25℃温育16小时，以充分切除上述4种ACTH前体融合蛋白中连有的HisTag-EKst多肽链，产生游离的ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80以及ProACTH141。
八、采用与步骤六相同的Ni柱纯化方法，去除步骤七中酶切后的样品液中含有的切下来的HisTag-EKst以及连有His标签的肠激酶，得到纯化的ProACTH113(图13)、ProACTH72(图14)、ProACTH80(图15)以及ProACTH141(图16)，并利用Western blot鉴定蛋白质条带。
九、以ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80以及ProACTH141作为实验组，以生理盐水作为空白对照组，以野生型ACTH、作为样性对照组。SPF级5周龄小白鼠尾静脉静脉注射上述各组蛋白受试样品或对照品溶液，注射剂量为56pmol/g，在0、6、12、24、36以及48h，摘眼球采血。4,000rpm离心10min收集血清，每只动物收集300μL。向每个血清样品中加入800μL乙醚，充分混合，然后以3,800g，4℃离心10min，取有机相，用氮气缓慢吹打有机层直至吹干，用300μL甲醇重悬。用HPLC定量检测血清中的GC浓度(图17)。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是不采用pET21a质粒，而是用pET30a作为表达载体。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是不采用pET30a或pET21a质粒，而是用pET28a作为表达载体。
具体实施方式四：本实施方式所采用的实验方法与具体实施方式一相同，但具体实施方式一的步骤四中的转化后的菌体扩增体积按照50mL的倍数加以放大，后续步骤中的试剂用量也相应增加。
序列表
<110> 海南大学
<120> 一组提高血清糖皮质激素水平的基因重组人促皮质素前体及制备方法
<130> 2019-02-28-ProACTHs
<141> 2019-02-28
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcaccacc accaccacca cgacgacgac gacaaagaag acgtttctgc tggtgaagac 60
tgcggtccgc tgccggaagg tggtccggaa ccgcgttctg acggtgctaa accgggtccg 120
cgtgaaggta aacgttctta ctctatggaa cacttccgtt ggggtaaacc ggttggtaaa 180
aaacgtcgtc cggttaaagt ttacccgaac ggtgctgaag acgaatctgc tgaagctttc 240
ccgctggaat tcaaacgtga actgaccggt cagcgtctgc gtgaaggtga cggtccggac 300
ggtccggctg acgacggtgc tggtgctcag gctgacctgg aacactctct gctggttgct 360
gctgaaaaaa aagactaata ataa 384
<210> 2
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Glu Asp Val Ser
1 5 10 15
Ala Gly Glu Asp Cys Gly Pro Leu Pro Glu Gly Gly Pro Glu Pro Arg
20 25 30
Ser Asp Gly Ala Lys Pro Gly Pro Arg Glu Gly Lys Arg Ser Tyr Ser
35 40 45
Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Lys Arg Arg Pro
50 55 60
Val Lys Val Tyr Pro Asn Gly Ala Glu Asp Glu Ser Ala Glu Ala Phe
65 70 75 80
Pro Leu Glu Phe Lys Arg Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly
85 90 95
Asp Gly Pro Asp Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp
100 105 110
Leu Glu His Ser Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp
115 120 125
<210> 3
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaagacgttt ctgctggtga agactgcggt ccgctgccgg aaggtggtcc ggaaccgcgt 60
tctgacggtg ctaaaccggg tccgcgtgaa ggtaaacgtt cttactctat ggaacacttc 120
cgttggggta aaccggttgg taaaaaacgt cgtccggtta aagtttaccc gaacggtgct 180
gaagacgaat ctgctgaagc tttcccgctg gaattcaaac gtgaactgac cggtcagcgt 240
ctgcgtgaag gtgacggtcc ggacggtccg gctgacgacg gtgctggtgc tcaggctgac 300
ctggaacact ctctgctggt tgctgctgaa aaaaaagac 339
<210> 4
<211> 113
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 4
Glu Asp Val Ser Ala Gly Glu Asp Cys Gly Pro Leu Pro Glu Gly Gly
1 5 10 15
Pro Glu Pro Arg Ser Asp Gly Ala Lys Pro Gly Pro Arg Glu Gly Lys
20 25 30
Arg Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys
35 40 45
Lys Arg Arg Pro Val Lys Val Tyr Pro Asn Gly Ala Glu Asp Glu Ser
50 55 60
Ala Glu Ala Phe Pro Leu Glu Phe Lys Arg Glu Leu Thr Gly Gln Arg
65 70 75 80
Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly
85 90 95
Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys
100 105 110
Asp
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggaattccat atgcaccacc accaccacca cgacgacgac gacaaagaag acgtttc 57
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtcgtcgact tattattagt cttttttt 28
<210> 7
<211> 267
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgcaccacc accaccacca cgacgacgac gacaaagaag acgtttctgc tggtgaagac 60
tgcggtccgc tgccggaagg tggtccggaa ccgcgttctg acggtgctaa accgggtccg 120
cgtgaaggta aacgttctta ctctatggaa cacttccgtt ggggtaaacc ggttggtaaa 180
aaacgtcgtc cggttaaagt ttacccgaac ggtgctgaag acgaatctgc tgaagctttc 240
ccgctggaat tctaataata agtcgac 267
<210> 8
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Glu Asp Val Ser
1 5 10 15
Ala Gly Glu Asp Cys Gly Pro Leu Pro Glu Gly Gly Pro Glu Pro Arg
20 25 30
Ser Asp Gly Ala Lys Pro Gly Pro Arg Glu Gly Lys Arg Ser Tyr Ser
35 40 45
Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Lys Arg Arg Pro
50 55 60
Val Lys Val Tyr Pro Asn Gly Ala Glu Asp Glu Ser Ala Glu Ala Phe
65 70 75 80
Pro Leu Glu Phe
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaagacgttt ctgctggtga agactgcggt ccgctgccgg aaggtggtcc ggaaccgcgt 60
tctgacggtg ctaaaccggg tccgcgtgaa ggtaaacgtt cttactctat ggaacacttc 120
cgttggggta aaccggttgg taaaaaacgt cgtccggtta aagtttaccc gaacggtgct 180
gaagacgaat ctgctgaagc tttcccgctg gaattc 216
<210> 10
<211> 72
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 10
Glu Asp Val Ser Ala Gly Glu Asp Cys Gly Pro Leu Pro Glu Gly Gly
1 5 10 15
Pro Glu Pro Arg Ser Asp Gly Ala Lys Pro Gly Pro Arg Glu Gly Lys
20 25 30
Arg Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys
35 40 45
Lys Arg Arg Pro Val Lys Val Tyr Pro Asn Gly Ala Glu Asp Glu Ser
50 55 60
Ala Glu Ala Phe Pro Leu Glu Phe
65 70
<210> 11
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggaattccat atgcaccacc accaccacca cgacgacgac gacaaagaag acgtttc 57
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gacgtcgact tattattaga attccagcgg gaaagctt 38
<210> 13
<211> 285
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgcaccacc accaccacca cgacgacgac gacaaatctt actctatgga acacttccgt 60
tggggtaaac cggttggtaa aaaacgtcgt ccggttaaag tttacccgaa cggtgctgaa 120
gacgaatctg ctgaagcttt cccgctggaa ttcaaacgtg aactgaccgg tcagcgtctg 180
cgtgaaggtg acggtccgga cggtccggct gacgacggtg ctggtgctca ggctgacctg 240
gaacactctc tgctggttgc tgctgaaaaa aaagactaat aataa 285
<210> 14
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Met His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Ser Tyr Ser Met
1 5 10 15
Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Lys Arg Arg Pro Val
20 25 30
Lys Val Tyr Pro Asn Gly Ala Glu Asp Glu Ser Ala Glu Ala Phe Pro
35 40 45
Leu Glu Phe Lys Arg Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp
50 55 60
Gly Pro Asp Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu
65 70 75 80
Glu His Ser Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp
85 90
<210> 15
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcttactcta tggaacactt ccgttggggt aaaccggttg gtaaaaaacg tcgtccggtt 60
aaagtttacc cgaacggtgc tgaagacgaa tctgctgaag ctttcccgct ggaattcaaa 120
cgtgaactga ccggtcagcg tctgcgtgaa ggtgacggtc cggacggtcc ggctgacgac 180
ggtgctggtg ctcaggctga cctggaacac tctctgctgg ttgctgctga aaaaaaagac 240
<210> 16
<211> 80
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 16
Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Lys
1 5 10 15
Arg Arg Pro Val Lys Val Tyr Pro Asn Gly Ala Glu Asp Glu Ser Ala
20 25 30
Glu Ala Phe Pro Leu Glu Phe Lys Arg Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu
35 40 45
Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala
50 55 60
Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp
65 70 75 80
<210> 17
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggaattccat atgcaccacc accaccacca cgacgacgac gacaaatctt actctatgga 60
acactt 66
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtcgtcgact tattattagt cttttttt 28
<210> 19
<211> 468
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atgcaccacc accaccacca cgacgacgac gacaaatacg ttatgggtca cttccgttgg 60
gaccgtttcg gtcgtcgtaa ctcttcttct tctggttctt ctggtgctgg tcagaaacgt 120
gaagacgttt ctgctggtga agactgcggt ccgctgccgg aaggtggtcc ggaaccgcgt 180
tctgacggtg ctaaaccggg tccgcgtgaa ggtaaacgtt cttactctat ggaacacttc 240
cgttggggta aaccggttgg taaaaaacgt cgtccggtta aagtttaccc gaacggtgct 300
gaagacgaat ctgctgaagc tttcccgctg gaattcaaac gtgaactgac cggtcagcgt 360
ctgcgtgaag gtgacggtcc ggacggtccg gctgacgacg gtgctggtgc tcaggctgac 420
ctggaacact ctctgctggt tgctgctgaa aaaaaagact aataataa 468
<210> 20
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Met His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Tyr Val Met Gly
1 5 10 15
His Phe Arg Trp Asp Arg Phe Gly Arg Arg Asn Ser Ser Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Gly Gln Lys Arg Glu Asp Val Ser Ala Gly Glu Asp
35 40 45
Cys Gly Pro Leu Pro Glu Gly Gly Pro Glu Pro Arg Ser Asp Gly Ala
50 55 60
Lys Pro Gly Pro Arg Glu Gly Lys Arg Ser Tyr Ser Met Glu His Phe
65 70 75 80
Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Lys Arg Arg Pro Val Lys Val Tyr
85 90 95
Pro Asn Gly Ala Glu Asp Glu Ser Ala Glu Ala Phe Pro Leu Glu Phe
100 105 110
Lys Arg Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp
115 120 125
Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser
130 135 140
Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp
145 150
<210> 21
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tacgttatgg gtcacttccg ttgggaccgt ttcggtcgtc gtaactcttc ttcttctggt 60
tcttctggtg ctggtcagaa acgtgaagac gtttctgctg gtgaagactg cggtccgctg 120
ccggaaggtg gtccggaacc gcgttctgac ggtgctaaac cgggtccgcg tgaaggtaaa 180
cgttcttact ctatggaaca cttccgttgg ggtaaaccgg ttggtaaaaa acgtcgtccg 240
gttaaagttt acccgaacgg tgctgaagac gaatctgctg aagctttccc gctggaattc 300
aaacgtgaac tgaccggtca gcgtctgcgt gaaggtgacg gtccggacgg tccggctgac 360
gacggtgctg gtgctcaggc tgacctggaa cactctctgc tggttgctgc tgaaaaaaaa 420
gac 423
<210> 22
<211> 141
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 22
Tyr Val Met Gly His Phe Arg Trp Asp Arg Phe Gly Arg Arg Asn Ser
1 5 10 15
Ser Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ala Gly Gln Lys Arg Glu Asp Val Ser
20 25 30
Ala Gly Glu Asp Cys Gly Pro Leu Pro Glu Gly Gly Pro Glu Pro Arg
35 40 45
Ser Asp Gly Ala Lys Pro Gly Pro Arg Glu Gly Lys Arg Ser Tyr Ser
50 55 60
Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Lys Arg Arg Pro
65 70 75 80
Val Lys Val Tyr Pro Asn Gly Ala Glu Asp Glu Ser Ala Glu Ala Phe
85 90 95
Pro Leu Glu Phe Lys Arg Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly
100 105 110
Asp Gly Pro Asp Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp
115 120 125
Leu Glu His Ser Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp
130 135 140
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggaattccat atgcaccacc accaccacca c 31
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gtcgtcgact tattattagt cttttttt 28
Claims (6)
1.四种利用基因工程方法制备的具有提高血清中糖皮质激素水平作用的基因重组促皮质素前体蛋白ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80以及ProACTH141。具有以下特征：ProACTH113包含阿黑皮素原(Pro-opiomelanocortin，POMC)的第105-217位氨基酸多肽链，ProACTH72包含POMC的第105-176位氨基酸多肽链，ProACTH80包含POMC的第138-217位氨基酸多肽链，ProACTH141包含POMC的第77-217位氨基酸多肽链；这四种ACTH前体蛋白的多肽链中均包含ACTH多肽第1至39位氨基酸序列。这四种蛋白质的一级结构如序列表所示。
2.权利要求1所述的ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80、ProACTH141蛋白的全部或部分经过优化的基因重组核苷酸序列，如序列表所示。
3.用来表达和纯化ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80、ProACTH141蛋白的HisTag-EKst-ProACTH113、HisTag-EKst-ProACTH72、HisTag-EKst-ProACTH80、HisTag-EKst-ProACTH141等四种融合蛋白。具有如下特征：ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80以及ProACTH141的N端连有肠激酶底物序列(EKst)肽段。
4.权利要求3所述的ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80、ProACTH141连有组蛋白标签(HisTag)。
5.权利要求3所述的HisTag-EKst-ProACTH113、HisTag-EKst-ProACTH72、HisTag-EKst-ProACTH80、HisTag-EKst-ProACTH141等四种融合蛋白的全部或部分经过优化的基因重组核苷酸序列，如序列表所示。
6.权利要求1所述的ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80以及ProACTH141蛋白的体外表达方法，其特征在于利用可诱导表达质粒在大肠杆菌中首先表达出HisTag-EKst-ProACTH113、HisTag-EKst-ProACTH72、HisTag-EKst-ProACTH80、HisTag-EKst-ProACTH141等四种融合蛋白；再经过体外肠激酶切割去除连接在ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80以及ProACTH141的N末端的多余片段，得到不含多余氨基酸的ProACTH113、ProACTH72、ProACTH80、ProACTH141蛋白。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN115572329A (zh) * | 2021-06-21 | 2023-01-06 | 王大勇 | 一组活性增强代谢较慢的菲牛蛭基因重组水蛭素及其制备方法 |
| CN117106057A (zh) * | 2022-08-19 | 2023-11-24 | 南京汉欣医药科技有限公司 | 一种高纯的人促肾上腺皮质激素或其类似物及其规模化制备方法 |
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2019
- 2019-02-28 CN CN201910143665.0A patent/CN109824772B/zh active Active
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