CN114369658A - Nlrp3相关自身炎症性疾病相关基因nlrp3的突变形式的应用 - Google Patents

Nlrp3相关自身炎症性疾病相关基因nlrp3的突变形式的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了NLRP3相关自身炎症性疾病相关基因NLRP3的突变形式的应用。本发明提供了一种突变蛋白，是将人NLRP3蛋白的第829位氨基酸残基由赖氨酸突变为苏氨酸得到的蛋白质。本发明还提供了一种突变基因，是将NLRP3基因进行突变得到的基因；所述NLRP3基因为人基因组中编码NLRP3蛋白的基因；所述突变为将编码NLRP3蛋白的第829位氨基酸残基的密码子由编码赖氨酸的密码子突变为编码苏氨酸的密码子。所述突变蛋白或所述突变基因可以作为靶标物开发用于诊断NLRP3相关自身炎症性疾病的试剂或试剂盒，也可以作为靶标物开发用于治疗NLRP3相关自身炎症性疾病的试剂或试剂盒。本发明为自身炎症性疾病临床诊断和治疗提供了新的方向。

Description

NLRP3相关自身炎症性疾病相关基因NLRP3的突变形式的应用
技术领域
本发明属于分子生物医学领域，涉及NLRP3相关自身炎症性疾病相关基因NLRP3的突变形式的应用。
背景技术
自身炎症性疾病(systemic autoinflammatory diseases,SAIDs)是由固有免疫异常所引起的一组以全身炎症反复发作为特征的疾病，主要表现为原因不明的反复发热、皮疹、关节炎等。自身炎症性疾病属于罕见风湿免疫疾病，可以分为单基因自身炎症性疾病和多基因自身炎症性疾病。单基因自身炎症性疾病主要由临床表现与基因检测相结合诊断。中国第一批罕见病目录中包括单基因自身炎症性疾病谱中最常见的家族性地中海热。中国罕见病注册系统(https://www.nrdrs.org.cn/app/rare/index.html)中的已注册疾病目录中即包含自身炎症性疾病(根据病例数实时更新，查询时共有171条记录，自身炎症性疾病是第63条记录)，因此自身炎症性疾病属于中国定义的罕见病范畴。
NLRP3相关自身炎症性疾病(NLRP3-associated autoinflammatory disease,NLRP3-AID)，又称冷炎素相关周期性综合征(cryopyrin-associated periodic syndrome,CAPS)，是一种单基因自身炎症性疾病，是由NLRP3基因的功能获得性突变所致常染色体显性遗传性疾病。NLRP3相关自身炎症性疾病依据临床表型分为家族性寒冷性自身炎症综合征(FCAS)、Muckle-Wells综合征(MWS)和慢性婴儿神经皮肤关节综合征(CINCA，又称新生儿起病的多系统炎性疾病，NOMID)。NLRP3基因位于染色体1q44，该基因突变可以引起NLPR3炎症小体异常装配，引起下游炎症因子释放。目前NLRP3相关自身炎症性疾病的临床诊断标准主要依据炎症标志物(血沉和C-反应蛋白)的升高以及大于等于两种典型体征/症状[六种典型体征/症状分别为荨麻疹样皮疹、寒冷/压力引起的发作、感音神经性耳聋、肌肉骨骼症状(关节痛/关节炎/肌痛)、慢性无菌性脑膜炎、骨骼异常(骨骺过度生长/额部隆起)]。存在NLRP3基因的突变可以证实疾病的存在。参考文献：Kuemmerle-Deschner J B,Ozen S,Tyrrell P N,et al.Diagnostic criteria for cryopyrin-associated periodicsyndrome(CAPS)[J].Annals of the rheumatic diseases,2017,76(6):942-947。
NLRP3相关自身炎症性疾病治疗的药物主要为白介素(interleukin，IL)-1抑制剂，包括IL-1受体拮抗剂和受体融合蛋白以及IL-1β单克隆抗体。但IL-1抑制剂价格昂贵且目前国内暂无法获得，同时使用者存在感染等风险。最近有学者提出炎症小体上游通路将成为潜在治疗靶点，而如何设计这种靶点应用的药物仍是较大难点。
发明内容
本发明的目的是提供NLRP3相关自身炎症性疾病相关基因NLRP3的突变形式的应用。
本发明提供了用于检测特异突变的物质在制备试剂盒中的应用；
所述特异突变为：人基因组中的NLRP3基因中发生的突变，该突变引起形成转录本的cDNA发生变化，从而使翻译得到的蛋白质由序列表的序列2所示的蛋白质突变为序列表的序列4所示的蛋白质。
具体的，形成转录本的cDNA发生的变化为：由序列表的序列1所示的DNA分子突变为序列表的序列3所示的DNA分子。
本发明还提供了一种试剂盒，包括用于检测特异突变的物质；
所述特异突变为：人基因组中的NLRP3基因中发生的突变，该突变引起形成转录本的cDNA发生变化，从而使翻译得到的蛋白质由序列表的序列2所示的蛋白质突变为序列表的序列4所示的蛋白质。
具体的，形成转录本的cDNA发生的变化为：由序列表的序列1所示的DNA分子突变为序列表的序列3所示的DNA分子。
以上任一所述试剂盒的功能为如下(c1)、(c2)或(c3)：
(c1)NLRP3相关自身炎症性疾病的患者筛查；
(c2)NLRP3相关自身炎症性疾病的胚胎筛查；
(c3)诊断NLRP3相关自身炎症性疾病的患者。
以上任一所述用于检测特异突变的物质为特异引物对，由序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子组成。
本发明还提供了一种突变蛋白，是将人NLRP3蛋白的第829位氨基酸残基由赖氨酸突变为苏氨酸得到的蛋白质。
具体的，所述突变蛋白如序列表的序列4所示。
本发明还提供了一种突变基因，是将NLRP3基因进行突变得到的基因；
所述NLRP3基因为人基因组中编码NLRP3蛋白的基因；
所述突变为将编码NLRP3蛋白的第829位氨基酸残基的密码子由编码赖氨酸的密码子突变为编码苏氨酸的密码子。
具体的，所述突变基因如序列表的序列3所示。
本发明还提供了所述突变蛋白作为靶标物在开发用于诊断NLRP3相关自身炎症性疾病的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了所述突变基因作为靶标物在开发用于诊断NLRP3相关自身炎症性疾病的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了所述突变蛋白作为靶标物在开发用于治疗NLRP3相关自身炎症性疾病的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了所述突变基因作为靶标物在开发用于治疗NLRP3相关自身炎症性疾病的试剂或试剂盒中的应用。
以上任一所述NLRP3相关自身炎症性疾病具体可为Muckle-Wells综合征。
本发明通过对先证者进行全外显子组高通量测序，发现了NLRP3相关自身炎症性疾病新的致病基因突变，该突变可以作为NLRP3相关自身炎症性疾病临床诊断的分子标志物和新型药物研发的靶标。本发明的发现为解析自身炎症性疾病的致病机制提供了依据，也为自身炎症性疾病临床诊断和治疗提供了新的方向。
附图说明
图1为实施例1中的靶标位点测序结果。
图2为实施例2中的蛋白质保守序列频率图。
图3为实施例3中的蛋白三维结构预测分析结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。人NLRP3蛋白及其编码基因见GENBANK ACCESSION NO.NM_001243133.1。
实施例1、NLRP3基因的突变形式的发现
一、先证者信息
男性，20岁，反复发热18年，听力下降5年，头晕1年。患者自2岁开始无诱因反复发 热，体温最高38℃，发热每次持续2-3天，间隔数周再发，每年发作超过10次。发热时伴咽痛、咽峡炎、扁桃体肿大化脓，切除扁桃体后症状无改善。偶伴口腔溃疡、颈部淋巴结肿大。幼年时常有皮肤红斑，成年后好转。10岁时曾疑诊脑炎。15岁开始听力下降，佩戴助听器，诊断双侧感音神经性耳聋。19岁开始出现头晕、恶心呕吐、乏力纳差、肌痛。头颅MRI发现颅内钙化、脑白质缺血性改变。腰穿显示脑脊液压力升高，脑脊液常规正常，蛋白轻度升高，细胞学提示以嗜中性粒细胞反应为主，激活单核细胞增多，病原学检查阴性。腰穿结果符合慢性无菌性脑膜炎。眼科检查发现眼底血管炎样改变。发热期时白细胞计数、血沉和C-反应蛋白升 高，发热间期恢复正常。
经临床诊断，该患者为自身炎症性疾病患者，且具有Muckle-Wells综合征的典型表型(先证者信息中的下划线标注部分，均为Muckle-Wells综合征的典型表型)，因此高度怀疑其为NLRP3相关自身炎症性疾病的患者。
二、对先证者进行全基因组测序
1、提取先证者的基因组DNA。
2、取步骤1得到的基因组DNA，进行人全外显子组序列捕获及二代测序。
采用Covaris破碎仪将基因组DNA随机打断，经末端修复反应和3'端加A尾后，将Illumina测序接头分别连接至片段两端，去除未连接接头分子后PCR扩增DNA文库。带有特异index的文库与探针液相杂交后，利用磁珠将捕获基因外显子片段。随后进行文库质检，合格后根据文库有效浓度和产出数据深度，将其加入到Flow cell芯片中进行桥式扩增，利用Illumina HiSeq X sequencer(Illumina,San Diego,CA,USA)测序平台针对患者进行高通量测序，将原始数据进行数据过滤后去除污染和接头序列，以人基因组GRCh37/hg19版本为参考基因组进行BWA比对，然后使用SAMtools进行SNP位点和indel注释，利用CoNIFER软件进行CNV检测。之后使用GnomAD、1000g数据库进行变异频率筛选，关注频率小于0.1％的罕见变异，根据变异性质(筛选非同义变异)以及SIFT、Polyphen、CADD和M-CAP等致病性预测软件结果，选取有两个及以上的软件预测为有害的变异作为候选变异。对于CNV，通过良恶性数据库注释，筛选留下恶性CNV，筛查覆盖或累及NLRP3的CNV。
先证者的全外显子测序中未发现除NLRP3基因以外任何其他可以解释其临床症状的基因突变。示例性的，现有技术中部分已知与自身炎症性疾病相关的基因见表1。
表1
Figure BDA0003510466780000041
Figure BDA0003510466780000051
先证者的NLRP3基因发生了如下突变：NM_001243133.1:c.2486A>C(p.Lys829Thr)，突变类型为杂合型。该突变位于1号染色体，第247,597,569位置(HumanGRCh37/hg19基因组数据库)。即，先证者在NLRP3基因的第6外显子中发生了A→C的单核苷酸突变，从而引起编码的蛋白质中的相应氨基酸残基由赖氨酸突变为苏氨酸。即，先证者的一条染色体中形成正常的NLRP3基因转录本(cDNA如序列表的序列1所示，表达序列表的序列2所示的蛋白质)，另一条染色体中形成突变型NLRP3基因转录本(cDNA如序列表的序列3所示，表达序列表的序列4所示的蛋白质)。
自身炎症性疾病分为单基因自身炎症性疾病和多基因多因素自身炎症性疾病。多基因多因素自身炎症性疾病包括成人still病、白塞病等，病因尚不明确，并非由某种特定致病基因所致。先证者的临床表现与上述多基因多因素自身炎症性疾病不符，并存在NLRP3基因突变，因此可排除多基因多因素自身炎症性疾病。另一方面，单基因自身炎症性疾病的诊断需要结合临床表现和基因检测结果进行确诊。先证者临床表型符合NLRP3相关自身炎症性疾病的临床诊断标准，并且除NLRP3基因c.2486A>C(p.Lys829Thr)杂合突变外未发现其余可以解释患者临床表现的基因突变，该NLRP3基因突变也可以充分解释先证者的临床表型，因此可以排除其余单基因自身炎症性疾病，最终确诊先证者为NLRP3相关自身炎症性疾病。因此，综合步骤一和步骤二，可以判断该患者为NLRP3相关自身炎症性疾病的患者。
三、对先证者的家系成员进行靶标位点测序
供试者：先证者、先证者的父亲、先证者的母亲。
1、取供试者的外周血，提取基因组DNA。采用Nanodrop 2000对提取的基因组DNA进行质检，质检标准：DNA浓度≥20ng/μL。
2、将步骤1得到的基因组DNA作为模板，采用NLRP3_F和NLRP3_R组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物并测序。
NLRP3_F(序列表的序列5)：5'-GCTGCTTCGACATCTCCTTG-3'；
NLRP3_R(序列表的序列6)：5'-CTGACCGCAATGCTAGACAC-3'。
先证者的突变位点及其周边的测序结果见图1A。先证者的父亲的突变位点及其周边的测序结果见图1B。先证者的母亲的突变位点及其周边的测序结果见图1C。
结果表明：先证者的父亲两条染色体上的NLRP3基因并未发生所述突变(先证者的父亲也无自身炎症性疾病相关临床表现)；先证者母亲的两条染色体上的NLRP3基因均未发生所述突变(先证者的母亲也无自身炎症性疾病相关临床表现)；先证者一条染色体NLRP3基因发生所述突变，另一条染色体NLRP3基因未发生所述突变。
先证者的突变属于新生突变，这种突变不是来源于父母，但可以传递给子代，该突变大概率是在胚胎发生过程中产生。因此在父母均无该突变的情况下，先证者存在该种突变并可表现出该常染色体显性遗传的疾病。
实施例2、蛋白质保守序列频率图绘制
使用在线工具NCBI protein数据库下载NLRP3蛋白质20种脊椎动物对应的同源氨基酸序列，对其进行多序列比对分析，并进行蛋白质保守频率的分析。
分析步骤如下：
1、在NCBI网站的protein数据库检索NLRP3，并在Homo sapiens(human)的列表中点击Orthologs。
2、选择同源序列：筛选与人类氨基酸长度相似的氨基酸序列，选择了包括人类在内的20种脊椎动物，点击Protein alignment，进行在线比对分析。
3、将比对后的序列下载后在WebLogo 3(http://weblogo.threeplusone.com)中打开，调整相应参数绘制蛋白质保守序列频率图。
蛋白质保守序列频率图见图2。发现先证者基因突变位点在这二十种脊椎动物中属于保守序列，提示了位点改变可能会致病。
实施例3、蛋白三维结构预测
使用在线软件：swiss-model(https://swissmodel.expasy.org/)对参考序列对应的氨基酸序列(序列表的序列2所示的蛋白质)进行野生模型预测，同时针对变异后的氨基酸序列(序列表的序列4所示的蛋白质)进行突变模型的预测。
预测步骤如下：
1、输入需要预测的蛋白序列，点击Build Model(这可能会等待一段时间)。
2、选择模型：选择模型是要考虑到模型是否覆盖了想要研究的位点即range范围，其次还要看模型的一致性(identify)和相似度(similarity)(推荐值：两者都不要低于30％)
3、将预测好的模型用分子三维结构显示软件Pymol开源版本(https://www.lfd.uci.edu/～gohlke/pythonlibs/#pymol-open-source)打开，并对突变残基位点与周围氨基酸位点进行蛋白作用分析。
分析结果见图3(左图为野生模型，右图为突变模型)，可以预测出突变位点由K变为T，会使此位点与临近位点氨基酸产生新的相互作用力，据此可说明此突变可能使蛋白质功能发生改变，从而导致疾病的发生。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国医学科学院北京协和医院
<120> NLRP3相关自身炎症性疾病相关基因NLRP3的突变形式的应用
<130> GNCYX220371
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3105
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggcaagca cccgctgcaa gctggccagg tacctggagg acctggagga tgtggacttg 60
aagaaattta agatgcactt agaggactat cctccccaga agggctgcat ccccctcccg 120
aggggtcaga cagagaaggc agaccatgtg gatctagcca cgctaatgat cgacttcaat 180
ggggaggaga aggcgtgggc catggccgtg tggatcttcg ctgcgatcaa caggagagac 240
ctttatgaga aagcaaaaag agatgagccg aagtggggtt cagataatgc acgtgtttcg 300
aatcccactg tgatatgcca ggaagacagc attgaagagg agtggatggg tttactggag 360
tacctttcga gaatctctat ttgtaaaatg aagaaagatt accgtaagaa gtacagaaag 420
tacgtgagaa gcagattcca gtgcattgaa gacaggaatg cccgtctggg tgagagtgtg 480
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agggagcagg agcttctggc catcggcaag accaagacgt gtgagagccc cgtgagtccc 600
attaagatgg agttgctgtt tgaccccgat gatgagcatt ctgagcctgt gcacaccgtg 660
gtgttccagg gggcggcagg gattgggaaa acaatcctgg ccaggaagat gatgttggac 720
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gaggtgagcc ttgtgacaca gaggagcctg ggggacctga tcatgagctg ctgccccgac 840
ccaaacccac ccatccacaa gatcgtgaga aaaccctcca gaatcctctt cctcatggac 900
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ttcaagtact tctctgatga ggcccaagcc agggcagcct tcagtctgat tcaggagaac 1200
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ctgtttgagg agtccgacct caggaatcat ggactgcaga aggcggatgt gtctgctttc 1500
ctgaggatga acctgttcca aaaggaagtg gactgcgaga agttctacag cttcatccac 1560
atgactttcc aggagttctt tgccgccatg tactacctgc tggaagagga aaaggaagga 1620
aggacgaacg ttccagggag tcgtttgaag cttcccagcc gagacgtgac agtccttctg 1680
gaaaactatg gcaaattcga aaaggggtat ttgatttttg ttgtacgttt cctctttggc 1740
ctggtaaacc aggagaggac ctcctacttg gagaagaaat taagttgcaa gatctctcag 1800
caaatcaggc tggagctgct gaaatggatt gaagtgaaag ccaaagctaa aaagctgcag 1860
atccagccca gccagctgga attgttctac tgtttgtacg agatgcagga ggaggacttc 1920
gtgcaaaggg ccatggacta tttccccaag attgagatca atctctccac cagaatggac 1980
cacatggttt cttccttttg cattgagaac tgtcatcggg tggagtcact gtccctgggg 2040
tttctccata acatgcccaa ggaggaagag gaggaggaaa aggaaggccg acaccttgat 2100
atggtgcagt gtgtcctccc aagctcctct catgctgcct gttctcatgg attggtgaac 2160
agccacctca cttccagttt ttgccggggc ctcttttcag ttctgagcac cagccagagt 2220
ctaactgaat tggacctcag tgacaattct ctgggggacc cagggatgag agtgttgtgt 2280
gaaacgctcc agcatcctgg ctgtaacatt cggagattgt ggttggggcg ctgtggcctc 2340
tcgcatgagt gctgcttcga catctccttg gtcctcagca gcaaccagaa gctggtggag 2400
ctggacctga gtgacaacgc cctcggtgac ttcggaatca gacttctgtg tgtgggactg 2460
aagcacctgt tgtgcaatct gaagaagctc tggttggtca gctgctgcct cacatcagca 2520
tgttgtcagg atcttgcatc agtattgagc accagccatt ccctgaccag actctatgtg 2580
ggggagaatg ccttgggaga ctcaggagtc gcaattttat gtgaaaaagc caagaatcca 2640
cagtgtaacc tgcagaaact ggggttggtg aattctggcc ttacgtcagt ctgttgttca 2700
gctttgtcct cggtactcag cactaatcag aatctcacgc acctttacct gcgaggcaac 2760
actctcggag acaaggggat caaactactc tgtgagggac tcttgcaccc cgactgcaag 2820
cttcaggtgt tggaattaga caactgcaac ctcacgtcac actgctgctg ggatctttcc 2880
acacttctga cctccagcca gagcctgcga aagctgagcc tgggcaacaa tgacctgggc 2940
gacctggggg tcatgatgtt ctgtgaagtg ctgaaacagc agagctgcct cctgcagaac 3000
ctggggttgt ctgaaatgta tttcaattat gagacaaaaa gtgcgttaga aacacttcaa 3060
gaagaaaagc ctgagctgac cgtcgtcttt gagccttctt ggtag 3105
<210> 2
<211> 1034
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ala Ser Thr Arg Cys Lys Leu Ala Arg Tyr Leu Glu Asp Leu Glu
1 5 10 15
Asp Val Asp Leu Lys Lys Phe Lys Met His Leu Glu Asp Tyr Pro Pro
20 25 30
Gln Lys Gly Cys Ile Pro Leu Pro Arg Gly Gln Thr Glu Lys Ala Asp
35 40 45
His Val Asp Leu Ala Thr Leu Met Ile Asp Phe Asn Gly Glu Glu Lys
50 55 60
Ala Trp Ala Met Ala Val Trp Ile Phe Ala Ala Ile Asn Arg Arg Asp
65 70 75 80
Leu Tyr Glu Lys Ala Lys Arg Asp Glu Pro Lys Trp Gly Ser Asp Asn
85 90 95
Ala Arg Val Ser Asn Pro Thr Val Ile Cys Gln Glu Asp Ser Ile Glu
100 105 110
Glu Glu Trp Met Gly Leu Leu Glu Tyr Leu Ser Arg Ile Ser Ile Cys
115 120 125
Lys Met Lys Lys Asp Tyr Arg Lys Lys Tyr Arg Lys Tyr Val Arg Ser
130 135 140
Arg Phe Gln Cys Ile Glu Asp Arg Asn Ala Arg Leu Gly Glu Ser Val
145 150 155 160
Ser Leu Asn Lys Arg Tyr Thr Arg Leu Arg Leu Ile Lys Glu His Arg
165 170 175
Ser Gln Gln Glu Arg Glu Gln Glu Leu Leu Ala Ile Gly Lys Thr Lys
180 185 190
Thr Cys Glu Ser Pro Val Ser Pro Ile Lys Met Glu Leu Leu Phe Asp
195 200 205
Pro Asp Asp Glu His Ser Glu Pro Val His Thr Val Val Phe Gln Gly
210 215 220
Ala Ala Gly Ile Gly Lys Thr Ile Leu Ala Arg Lys Met Met Leu Asp
225 230 235 240
Trp Ala Ser Gly Thr Leu Tyr Gln Asp Arg Phe Asp Tyr Leu Phe Tyr
245 250 255
Ile His Cys Arg Glu Val Ser Leu Val Thr Gln Arg Ser Leu Gly Asp
260 265 270
Leu Ile Met Ser Cys Cys Pro Asp Pro Asn Pro Pro Ile His Lys Ile
275 280 285
Val Arg Lys Pro Ser Arg Ile Leu Phe Leu Met Asp Gly Phe Asp Glu
290 295 300
Leu Gln Gly Ala Phe Asp Glu His Ile Gly Pro Leu Cys Thr Asp Trp
305 310 315 320
Gln Lys Ala Glu Arg Gly Asp Ile Leu Leu Ser Ser Leu Ile Arg Lys
325 330 335
Lys Leu Leu Pro Glu Ala Ser Leu Leu Ile Thr Thr Arg Pro Val Ala
340 345 350
Leu Glu Lys Leu Gln His Leu Leu Asp His Pro Arg His Val Glu Ile
355 360 365
Leu Gly Phe Ser Glu Ala Lys Arg Lys Glu Tyr Phe Phe Lys Tyr Phe
370 375 380
Ser Asp Glu Ala Gln Ala Arg Ala Ala Phe Ser Leu Ile Gln Glu Asn
385 390 395 400
Glu Val Leu Phe Thr Met Cys Phe Ile Pro Leu Val Cys Trp Ile Val
405 410 415
Cys Thr Gly Leu Lys Gln Gln Met Glu Ser Gly Lys Ser Leu Ala Gln
420 425 430
Thr Ser Lys Thr Thr Thr Ala Val Tyr Val Phe Phe Leu Ser Ser Leu
435 440 445
Leu Gln Pro Arg Gly Gly Ser Gln Glu His Gly Leu Cys Ala His Leu
450 455 460
Trp Gly Leu Cys Ser Leu Ala Ala Asp Gly Ile Trp Asn Gln Lys Ile
465 470 475 480
Leu Phe Glu Glu Ser Asp Leu Arg Asn His Gly Leu Gln Lys Ala Asp
485 490 495
Val Ser Ala Phe Leu Arg Met Asn Leu Phe Gln Lys Glu Val Asp Cys
500 505 510
Glu Lys Phe Tyr Ser Phe Ile His Met Thr Phe Gln Glu Phe Phe Ala
515 520 525
Ala Met Tyr Tyr Leu Leu Glu Glu Glu Lys Glu Gly Arg Thr Asn Val
530 535 540
Pro Gly Ser Arg Leu Lys Leu Pro Ser Arg Asp Val Thr Val Leu Leu
545 550 555 560
Glu Asn Tyr Gly Lys Phe Glu Lys Gly Tyr Leu Ile Phe Val Val Arg
565 570 575
Phe Leu Phe Gly Leu Val Asn Gln Glu Arg Thr Ser Tyr Leu Glu Lys
580 585 590
Lys Leu Ser Cys Lys Ile Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Leu Leu Lys
595 600 605
Trp Ile Glu Val Lys Ala Lys Ala Lys Lys Leu Gln Ile Gln Pro Ser
610 615 620
Gln Leu Glu Leu Phe Tyr Cys Leu Tyr Glu Met Gln Glu Glu Asp Phe
625 630 635 640
Val Gln Arg Ala Met Asp Tyr Phe Pro Lys Ile Glu Ile Asn Leu Ser
645 650 655
Thr Arg Met Asp His Met Val Ser Ser Phe Cys Ile Glu Asn Cys His
660 665 670
Arg Val Glu Ser Leu Ser Leu Gly Phe Leu His Asn Met Pro Lys Glu
675 680 685
Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Gly Arg His Leu Asp Met Val Gln Cys
690 695 700
Val Leu Pro Ser Ser Ser His Ala Ala Cys Ser His Gly Leu Val Asn
705 710 715 720
Ser His Leu Thr Ser Ser Phe Cys Arg Gly Leu Phe Ser Val Leu Ser
725 730 735
Thr Ser Gln Ser Leu Thr Glu Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ser Leu Gly
740 745 750
Asp Pro Gly Met Arg Val Leu Cys Glu Thr Leu Gln His Pro Gly Cys
755 760 765
Asn Ile Arg Arg Leu Trp Leu Gly Arg Cys Gly Leu Ser His Glu Cys
770 775 780
Cys Phe Asp Ile Ser Leu Val Leu Ser Ser Asn Gln Lys Leu Val Glu
785 790 795 800
Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ala Leu Gly Asp Phe Gly Ile Arg Leu Leu
805 810 815
Cys Val Gly Leu Lys His Leu Leu Cys Asn Leu Lys Lys Leu Trp Leu
820 825 830
Val Ser Cys Cys Leu Thr Ser Ala Cys Cys Gln Asp Leu Ala Ser Val
835 840 845
Leu Ser Thr Ser His Ser Leu Thr Arg Leu Tyr Val Gly Glu Asn Ala
850 855 860
Leu Gly Asp Ser Gly Val Ala Ile Leu Cys Glu Lys Ala Lys Asn Pro
865 870 875 880
Gln Cys Asn Leu Gln Lys Leu Gly Leu Val Asn Ser Gly Leu Thr Ser
885 890 895
Val Cys Cys Ser Ala Leu Ser Ser Val Leu Ser Thr Asn Gln Asn Leu
900 905 910
Thr His Leu Tyr Leu Arg Gly Asn Thr Leu Gly Asp Lys Gly Ile Lys
915 920 925
Leu Leu Cys Glu Gly Leu Leu His Pro Asp Cys Lys Leu Gln Val Leu
930 935 940
Glu Leu Asp Asn Cys Asn Leu Thr Ser His Cys Cys Trp Asp Leu Ser
945 950 955 960
Thr Leu Leu Thr Ser Ser Gln Ser Leu Arg Lys Leu Ser Leu Gly Asn
965 970 975
Asn Asp Leu Gly Asp Leu Gly Val Met Met Phe Cys Glu Val Leu Lys
980 985 990
Gln Gln Ser Cys Leu Leu Gln Asn Leu Gly Leu Ser Glu Met Tyr Phe
995 1000 1005
Asn Tyr Glu Thr Lys Ser Ala Leu Glu Thr Leu Gln Glu Glu Lys Pro
1010 1015 1020
Glu Leu Thr Val Val Phe Glu Pro Ser Trp
1025 1030
<210> 3
<211> 3105
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
atggcaagca cccgctgcaa gctggccagg tacctggagg acctggagga tgtggacttg 60
aagaaattta agatgcactt agaggactat cctccccaga agggctgcat ccccctcccg 120
aggggtcaga cagagaaggc agaccatgtg gatctagcca cgctaatgat cgacttcaat 180
ggggaggaga aggcgtgggc catggccgtg tggatcttcg ctgcgatcaa caggagagac 240
ctttatgaga aagcaaaaag agatgagccg aagtggggtt cagataatgc acgtgtttcg 300
aatcccactg tgatatgcca ggaagacagc attgaagagg agtggatggg tttactggag 360
tacctttcga gaatctctat ttgtaaaatg aagaaagatt accgtaagaa gtacagaaag 420
tacgtgagaa gcagattcca gtgcattgaa gacaggaatg cccgtctggg tgagagtgtg 480
agcctcaaca aacgctacac acgactgcgt ctcatcaagg agcaccggag ccagcaggag 540
agggagcagg agcttctggc catcggcaag accaagacgt gtgagagccc cgtgagtccc 600
attaagatgg agttgctgtt tgaccccgat gatgagcatt ctgagcctgt gcacaccgtg 660
gtgttccagg gggcggcagg gattgggaaa acaatcctgg ccaggaagat gatgttggac 720
tgggcgtcgg ggacactcta ccaagacagg tttgactatc tgttctatat ccactgtcgg 780
gaggtgagcc ttgtgacaca gaggagcctg ggggacctga tcatgagctg ctgccccgac 840
ccaaacccac ccatccacaa gatcgtgaga aaaccctcca gaatcctctt cctcatggac 900
ggcttcgatg agctgcaagg tgcctttgac gagcacatag gaccgctctg cactgactgg 960
cagaaggccg agcggggaga cattctcctg agcagcctca tcagaaagaa gctgcttccc 1020
gaggcctctc tgctcatcac cacgagacct gtggccctgg agaaactgca gcacttgctg 1080
gaccatcctc ggcatgtgga gatcctgggt ttctccgagg ccaaaaggaa agagtacttc 1140
ttcaagtact tctctgatga ggcccaagcc agggcagcct tcagtctgat tcaggagaac 1200
gaggtcctct tcaccatgtg cttcatcccc ctggtctgct ggatcgtgtg cactggactg 1260
aaacagcaga tggagagtgg caagagcctt gcccagacat ccaagaccac caccgcggtg 1320
tacgtcttct tcctttccag tttgctgcag ccccggggag ggagccagga gcacggcctc 1380
tgcgcccacc tctgggggct ctgctctttg gctgcagatg gaatctggaa ccagaaaatc 1440
ctgtttgagg agtccgacct caggaatcat ggactgcaga aggcggatgt gtctgctttc 1500
ctgaggatga acctgttcca aaaggaagtg gactgcgaga agttctacag cttcatccac 1560
atgactttcc aggagttctt tgccgccatg tactacctgc tggaagagga aaaggaagga 1620
aggacgaacg ttccagggag tcgtttgaag cttcccagcc gagacgtgac agtccttctg 1680
gaaaactatg gcaaattcga aaaggggtat ttgatttttg ttgtacgttt cctctttggc 1740
ctggtaaacc aggagaggac ctcctacttg gagaagaaat taagttgcaa gatctctcag 1800
caaatcaggc tggagctgct gaaatggatt gaagtgaaag ccaaagctaa aaagctgcag 1860
atccagccca gccagctgga attgttctac tgtttgtacg agatgcagga ggaggacttc 1920
gtgcaaaggg ccatggacta tttccccaag attgagatca atctctccac cagaatggac 1980
cacatggttt cttccttttg cattgagaac tgtcatcggg tggagtcact gtccctgggg 2040
tttctccata acatgcccaa ggaggaagag gaggaggaaa aggaaggccg acaccttgat 2100
atggtgcagt gtgtcctccc aagctcctct catgctgcct gttctcatgg attggtgaac 2160
agccacctca cttccagttt ttgccggggc ctcttttcag ttctgagcac cagccagagt 2220
ctaactgaat tggacctcag tgacaattct ctgggggacc cagggatgag agtgttgtgt 2280
gaaacgctcc agcatcctgg ctgtaacatt cggagattgt ggttggggcg ctgtggcctc 2340
tcgcatgagt gctgcttcga catctccttg gtcctcagca gcaaccagaa gctggtggag 2400
ctggacctga gtgacaacgc cctcggtgac ttcggaatca gacttctgtg tgtgggactg 2460
aagcacctgt tgtgcaatct gaagacgctc tggttggtca gctgctgcct cacatcagca 2520
tgttgtcagg atcttgcatc agtattgagc accagccatt ccctgaccag actctatgtg 2580
ggggagaatg ccttgggaga ctcaggagtc gcaattttat gtgaaaaagc caagaatcca 2640
cagtgtaacc tgcagaaact ggggttggtg aattctggcc ttacgtcagt ctgttgttca 2700
gctttgtcct cggtactcag cactaatcag aatctcacgc acctttacct gcgaggcaac 2760
actctcggag acaaggggat caaactactc tgtgagggac tcttgcaccc cgactgcaag 2820
cttcaggtgt tggaattaga caactgcaac ctcacgtcac actgctgctg ggatctttcc 2880
acacttctga cctccagcca gagcctgcga aagctgagcc tgggcaacaa tgacctgggc 2940
gacctggggg tcatgatgtt ctgtgaagtg ctgaaacagc agagctgcct cctgcagaac 3000
ctggggttgt ctgaaatgta tttcaattat gagacaaaaa gtgcgttaga aacacttcaa 3060
gaagaaaagc ctgagctgac cgtcgtcttt gagccttctt ggtag 3105
<210> 4
<211> 1034
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Ala Ser Thr Arg Cys Lys Leu Ala Arg Tyr Leu Glu Asp Leu Glu
1 5 10 15
Asp Val Asp Leu Lys Lys Phe Lys Met His Leu Glu Asp Tyr Pro Pro
20 25 30
Gln Lys Gly Cys Ile Pro Leu Pro Arg Gly Gln Thr Glu Lys Ala Asp
35 40 45
His Val Asp Leu Ala Thr Leu Met Ile Asp Phe Asn Gly Glu Glu Lys
50 55 60
Ala Trp Ala Met Ala Val Trp Ile Phe Ala Ala Ile Asn Arg Arg Asp
65 70 75 80
Leu Tyr Glu Lys Ala Lys Arg Asp Glu Pro Lys Trp Gly Ser Asp Asn
85 90 95
Ala Arg Val Ser Asn Pro Thr Val Ile Cys Gln Glu Asp Ser Ile Glu
100 105 110
Glu Glu Trp Met Gly Leu Leu Glu Tyr Leu Ser Arg Ile Ser Ile Cys
115 120 125
Lys Met Lys Lys Asp Tyr Arg Lys Lys Tyr Arg Lys Tyr Val Arg Ser
130 135 140
Arg Phe Gln Cys Ile Glu Asp Arg Asn Ala Arg Leu Gly Glu Ser Val
145 150 155 160
Ser Leu Asn Lys Arg Tyr Thr Arg Leu Arg Leu Ile Lys Glu His Arg
165 170 175
Ser Gln Gln Glu Arg Glu Gln Glu Leu Leu Ala Ile Gly Lys Thr Lys
180 185 190
Thr Cys Glu Ser Pro Val Ser Pro Ile Lys Met Glu Leu Leu Phe Asp
195 200 205
Pro Asp Asp Glu His Ser Glu Pro Val His Thr Val Val Phe Gln Gly
210 215 220
Ala Ala Gly Ile Gly Lys Thr Ile Leu Ala Arg Lys Met Met Leu Asp
225 230 235 240
Trp Ala Ser Gly Thr Leu Tyr Gln Asp Arg Phe Asp Tyr Leu Phe Tyr
245 250 255
Ile His Cys Arg Glu Val Ser Leu Val Thr Gln Arg Ser Leu Gly Asp
260 265 270
Leu Ile Met Ser Cys Cys Pro Asp Pro Asn Pro Pro Ile His Lys Ile
275 280 285
Val Arg Lys Pro Ser Arg Ile Leu Phe Leu Met Asp Gly Phe Asp Glu
290 295 300
Leu Gln Gly Ala Phe Asp Glu His Ile Gly Pro Leu Cys Thr Asp Trp
305 310 315 320
Gln Lys Ala Glu Arg Gly Asp Ile Leu Leu Ser Ser Leu Ile Arg Lys
325 330 335
Lys Leu Leu Pro Glu Ala Ser Leu Leu Ile Thr Thr Arg Pro Val Ala
340 345 350
Leu Glu Lys Leu Gln His Leu Leu Asp His Pro Arg His Val Glu Ile
355 360 365
Leu Gly Phe Ser Glu Ala Lys Arg Lys Glu Tyr Phe Phe Lys Tyr Phe
370 375 380
Ser Asp Glu Ala Gln Ala Arg Ala Ala Phe Ser Leu Ile Gln Glu Asn
385 390 395 400
Glu Val Leu Phe Thr Met Cys Phe Ile Pro Leu Val Cys Trp Ile Val
405 410 415
Cys Thr Gly Leu Lys Gln Gln Met Glu Ser Gly Lys Ser Leu Ala Gln
420 425 430
Thr Ser Lys Thr Thr Thr Ala Val Tyr Val Phe Phe Leu Ser Ser Leu
435 440 445
Leu Gln Pro Arg Gly Gly Ser Gln Glu His Gly Leu Cys Ala His Leu
450 455 460
Trp Gly Leu Cys Ser Leu Ala Ala Asp Gly Ile Trp Asn Gln Lys Ile
465 470 475 480
Leu Phe Glu Glu Ser Asp Leu Arg Asn His Gly Leu Gln Lys Ala Asp
485 490 495
Val Ser Ala Phe Leu Arg Met Asn Leu Phe Gln Lys Glu Val Asp Cys
500 505 510
Glu Lys Phe Tyr Ser Phe Ile His Met Thr Phe Gln Glu Phe Phe Ala
515 520 525
Ala Met Tyr Tyr Leu Leu Glu Glu Glu Lys Glu Gly Arg Thr Asn Val
530 535 540
Pro Gly Ser Arg Leu Lys Leu Pro Ser Arg Asp Val Thr Val Leu Leu
545 550 555 560
Glu Asn Tyr Gly Lys Phe Glu Lys Gly Tyr Leu Ile Phe Val Val Arg
565 570 575
Phe Leu Phe Gly Leu Val Asn Gln Glu Arg Thr Ser Tyr Leu Glu Lys
580 585 590
Lys Leu Ser Cys Lys Ile Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Leu Leu Lys
595 600 605
Trp Ile Glu Val Lys Ala Lys Ala Lys Lys Leu Gln Ile Gln Pro Ser
610 615 620
Gln Leu Glu Leu Phe Tyr Cys Leu Tyr Glu Met Gln Glu Glu Asp Phe
625 630 635 640
Val Gln Arg Ala Met Asp Tyr Phe Pro Lys Ile Glu Ile Asn Leu Ser
645 650 655
Thr Arg Met Asp His Met Val Ser Ser Phe Cys Ile Glu Asn Cys His
660 665 670
Arg Val Glu Ser Leu Ser Leu Gly Phe Leu His Asn Met Pro Lys Glu
675 680 685
Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Gly Arg His Leu Asp Met Val Gln Cys
690 695 700
Val Leu Pro Ser Ser Ser His Ala Ala Cys Ser His Gly Leu Val Asn
705 710 715 720
Ser His Leu Thr Ser Ser Phe Cys Arg Gly Leu Phe Ser Val Leu Ser
725 730 735
Thr Ser Gln Ser Leu Thr Glu Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ser Leu Gly
740 745 750
Asp Pro Gly Met Arg Val Leu Cys Glu Thr Leu Gln His Pro Gly Cys
755 760 765
Asn Ile Arg Arg Leu Trp Leu Gly Arg Cys Gly Leu Ser His Glu Cys
770 775 780
Cys Phe Asp Ile Ser Leu Val Leu Ser Ser Asn Gln Lys Leu Val Glu
785 790 795 800
Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ala Leu Gly Asp Phe Gly Ile Arg Leu Leu
805 810 815
Cys Val Gly Leu Lys His Leu Leu Cys Asn Leu Lys Thr Leu Trp Leu
820 825 830
Val Ser Cys Cys Leu Thr Ser Ala Cys Cys Gln Asp Leu Ala Ser Val
835 840 845
Leu Ser Thr Ser His Ser Leu Thr Arg Leu Tyr Val Gly Glu Asn Ala
850 855 860
Leu Gly Asp Ser Gly Val Ala Ile Leu Cys Glu Lys Ala Lys Asn Pro
865 870 875 880
Gln Cys Asn Leu Gln Lys Leu Gly Leu Val Asn Ser Gly Leu Thr Ser
885 890 895
Val Cys Cys Ser Ala Leu Ser Ser Val Leu Ser Thr Asn Gln Asn Leu
900 905 910
Thr His Leu Tyr Leu Arg Gly Asn Thr Leu Gly Asp Lys Gly Ile Lys
915 920 925
Leu Leu Cys Glu Gly Leu Leu His Pro Asp Cys Lys Leu Gln Val Leu
930 935 940
Glu Leu Asp Asn Cys Asn Leu Thr Ser His Cys Cys Trp Asp Leu Ser
945 950 955 960
Thr Leu Leu Thr Ser Ser Gln Ser Leu Arg Lys Leu Ser Leu Gly Asn
965 970 975
Asn Asp Leu Gly Asp Leu Gly Val Met Met Phe Cys Glu Val Leu Lys
980 985 990
Gln Gln Ser Cys Leu Leu Gln Asn Leu Gly Leu Ser Glu Met Tyr Phe
995 1000 1005
Asn Tyr Glu Thr Lys Ser Ala Leu Glu Thr Leu Gln Glu Glu Lys Pro
1010 1015 1020
Glu Leu Thr Val Val Phe Glu Pro Ser Trp
1025 1030
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctgcttcga catctccttg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgaccgcaa tgctagacac 20

Claims (10)

1.用于检测特异突变的物质在制备试剂盒中的应用；所述特异突变为：人基因组中的NLRP3基因中发生的突变，该突变引起形成转录本的cDNA发生变化，从而使翻译得到的蛋白质由序列表的序列2所示的蛋白质突变为序列表的序列4所示的蛋白质；
所述试剂盒的功能为如下(c1)、(c2)或(c3)：
(c1)NLRP3相关自身炎症性疾病的患者筛查；
(c2)NLRP3相关自身炎症性疾病的胚胎筛查；
(c3)诊断NLRP3相关自身炎症性疾病的患者。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：形成转录本的cDNA发生的变化为：由序列表的序列1所示的DNA分子突变为序列表的序列3所示的DNA分子。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：用于检测特异突变的物质为特异引物对，由序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子组成。
4.一种试剂盒，包括用于检测特异突变的物质；所述特异突变为：人基因组中的NLRP3基因中发生的突变，该突变引起形成转录本的cDNA发生变化，从而使翻译得到的蛋白质由序列表的序列2所示的蛋白质突变为序列表的序列4所示的蛋白质；
所述试剂盒的功能为如下(c1)、(c2)或(c3)：
(c1)NLRP3相关自身炎症性疾病的患者筛查；
(c2)NLRP3相关自身炎症性疾病的胚胎筛查；
(c3)诊断NLRP3相关自身炎症性疾病的患者。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：形成转录本的cDNA发生的变化为：由序列表的序列1所示的DNA分子突变为序列表的序列3所示的DNA分子。
6.如权利要求4或5所述的应试剂盒，其特征在于：用于检测特异突变的物质为特异引物对，由序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子组成。
7.一种突变蛋白，是将人NLRP3蛋白的第829位氨基酸残基由赖氨酸突变为苏氨酸得到的蛋白质。
8.一种突变基因，是将NLRP3基因进行突变得到的基因；所述NLRP3基因为人基因组中编码NLRP3蛋白的基因；所述突变为将编码NLRP3蛋白的第829位氨基酸残基的密码子由编码赖氨酸的密码子突变为编码苏氨酸的密码子。
9.权利要求7所述突变蛋白或权利要求8所述突变基因作为靶标物在开发用于诊断NLRP3相关自身炎症性疾病的试剂或试剂盒中的应用。
10.权利要求7所述突变蛋白或权利要求8所述突变基因作为靶标物在开发用于治疗NLRP3相关自身炎症性疾病的试剂或试剂盒中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN109371123A (zh) * 2018-12-24 2019-02-22 中国医学科学院北京协和医院 用于检测自身炎症性疾病致病基因的探针组及试剂盒
CN112725368A (zh) * 2019-10-28 2021-04-30 深圳市儿童医院 自身炎症性疾病相关基因tnfaip3的突变基因及其应用

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