CN104928297A - 分离的家族性高甘油三酯血症疾病的lpl新突变致病基因及检测该基因的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学分子生物学领域，具体涉及一种分离的家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变致病基因及检测该基因的试剂盒，所述LPL新突变致病基因的核酸样本的核苷酸序列与编码野生型LPL蛋白的基因，如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列相比，第928位碱基发生C>T的突变，所述LPL突变致病基因的核酸样本为人工分离或合成的单链DNA、双链DNA、RNA或DNA与RNA的聚合物。本发明提供一种分离的家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变致病基因，继续完善现有LPL蛋白突变数据库，进一步了解LPL突变致酶活性下降的机制，从而可为疗效观察、疾病的动态观察提供依据，本发明将在医学治疗及检测领域发挥重要的作用。

Description

分离的家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变致病基因及检测该基因的试剂盒

技术领域

本发明属于医学分子生物学领域，具体涉及一种分离的家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变致病基因及检测该基因的试剂盒。

背景技术

家族性乳糜血综合征(familial chylomicronemia syndrome，FCS，在本文中也可称为高甘油三酯血症)是一种罕见的常染色体隐性遗传性代谢缺陷，表现为患者体内缺乏脂蛋白脂肪酶，使血液中的甘油三酯和乳糜微粒浓度升高。脂蛋白脂酶缺乏病症十分罕见，每百万人中约有一到两例患者，患者体内的血液无法承受任何脂肪颗粒，而且这类患者在饮食方面禁食正常餐饮，因为患者容易出现各种急性胰腺癌病症。其主要特点是：严重的高甘油三酯血症伴随以下一个或多个临床症候群：1.孩童时期伴随腹痛出现的高三酸甘油血症；2、反覆发作的急性胰脏炎；3、皮肤上发疹般的黄色瘤；4、肝脾肿大。

家族性高乳糜微粒血症是起因于脂蛋白脂肪酶(LPL)功能低下或不良，LPL是LPL基因的产物，在染色体上的位置是8p22。LPL对于饮食中长链脂肪酸代谢至关重要。通常，这些长链脂肪酸被包装到甘油三酯中，帮助将脂类从肠运送到其他组织，随后LPL将甘油三酯分解为细胞能够处理的大小。在LPLD患者体内，LPL不能分解甘油三酯。因此，细胞吸收饮食脂肪不良，使其仍然停留在血液中。一般来说，在用餐后，乳糜隔夜就应该会在血浆中廓清。家族性高乳糜微粒血症患者体内，因为血浆中乳糜微粒廓清的功能受到损害，会导致三酸甘油脂堆积在血浆中而使得血浆看起来像牛乳一般。

家族性高甘油三脂血症可在10岁前就发生急性胰腺炎。患者胰腺炎反复发作，非常痛苦，有时通常以少量安全形式分泌的消化酶会一次激活，开始消化胰腺和周围组织，从而危及生命。FCS患者还有着异常高的血脂水平，使得他们易患早发性糖尿病和动脉粥样硬化。

到目前为止，通过测序筛选已经确定了LPL、APOC2、APOA5，GHIHBP1，LMF1等的突变均可导致甘油三酯代谢异常。其中以LPL相关突变位点就已达70余个基因位点。但是尽管现有的关于FCS的致病机理方面的研究已经较前有明显清晰，但仍存在着相当一部分未知致病基因位点。已知对于未知致病基因的研究有利于对家族性乳糜血综合征的诊断提供可靠依据，还有可能作为治疗家族性乳糜血综合征的药物标靶，用于筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的试剂盒以及筛选治疗或预防家族性高甘油三酯血症疾病的药物，因此，对家族性高甘油三酯血症疾病的研究对研发治疗或预防家族性乳糜血综合征的药物具有很重要的作用。

由此可见，能否进一步研究FCS的致病机理，找出分离的家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变致病基因成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提供一种分离的家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变致病基因及检测该基因的试剂盒。本发明通过Sanger法测序验证方法确定的家族性高甘油三酯血症的致病基因上的新突变。LPL基因的多个突变位点已经在其他发表的文章中被证实与FCS相关，但本次发现的突变位点为新的，在现有技术中并未被提到。

本发明的技术方案包括：

一种分离的家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变致病基因，所述LPL新突变致病基因的核酸样本的核苷酸序列与编码野生型LPL蛋白的基因，如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列相比，第928位碱基发生C>T的突变，所述LPL突变致病基因的核酸样本为人工分离或合成的单链DNA、双链DNA、RNA或DNA与RNA的聚合物。

LPL基因的新突变基因与原发性结晶样视网膜变性疾病的发病密切相关，从而通过检测该新突变基因在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感家族性高甘油三酯血症，也可以通过检测这些突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易感家族性高甘油三酯血症。

一种分离的家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变体多肽，其氨基酸序列与SEQ IDNO:2相比，具有p.C310R突变，即343位的Y突变为D。该多肽是由前述分离的编码LPL突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易感家族性高甘油三酯血症，也可以通过检测这些多肽在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易感家族性高甘油三酯血症。

本发明通过Sanger外显子测序和基因突变验证的方法确定了家族性高甘油三酯血症新的致病基因突变(NM_000237.2:c.928C>T NP_000228.1:p.C310R)。LPL基因突变基因，其与SEQ ID NO：1相比，该核酸具有p.C310R突变。在本文中所使用的表达方式“编码LPL突变体的核酸”，是指与编码LPL突变基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与LPL突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。优选地，所述的编码LPL突变基因的核酸样本为DNA。

野生型LPL基因的m RNA序列具有1468nt，翻译后的LPL蛋白质含有475个氨基酸，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。发明人发现的新突变体与SEQ ID NO：1相比，具有p.C310R突变，即相对于野生型LPL蛋白的基因，本发明的LPL基因突变基因的cDNA中第928位的T突变为C，由此，其所编码的产物与野生型LPL蛋白(SEQ ID NO：1)相比，具有p.C310R突变，即343位的Y(酪氨酸)突变为D(天冬氨酸)。

已知，LPL基因所编码全长28.188kp，包含10个外显子，编码产物为475个氨基酸的蛋白质，在脂肪酸代谢中发挥重要作用，基于一些早期的LPL同源模型的分析和体内体外实验证实，很多氨基酸的缺失和替代导致转录蛋白严重的结构变化，酶活性的丧失，影响LPL的活性，使其不能发挥正常的功能。

一种筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的方法，包括以下步骤：从所述生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有p.C310R突变是所述生物样品易感家族性高甘油三酯血症疾病的指示。

所述的生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织中的至少一种。

所述核酸样本为从生物样品中直接提取的全基因组DNA、全基因组中包含LPL编码序列的一部分、从生物样品中提取的总RNA或从生物样品中提取的mRNA中的任一种。

确定所述核酸样本的核酸序列的方法为，先设计引物扩增LPL外显子的特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，然后对得到的扩增产物进行Sanger测序。

LPL外显子特异性引物的序列不受特别限制，根据本发明的优选实施例，这些LPL外显子特异性引物具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列：5'GCCGAGATACAATCTTGGTG-3'/5'GCATGATGAAATAGGACTCC-3'。

一种筛选易感家族性高甘油三酯血症膜变性疾病的生物样品的方法。该筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的方法可以包括以下步骤：生物样品提取核酸样本。生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品LPL是否存在突变的核酸样本即可。生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易感家族性高甘油三酯血症疾病的生物样品的效率。这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中LPL是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含LPL编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息行确定，从而能够提高筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的效率。

针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的效率。

LPL外显子特异性引物的序列不受特别限制，根据本发明的优选实施例，这些LPL外显子特异性引物具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列：5'GCCGAGATACAATCTTGGTG-3'/5'GCATGATGAAATAGGACTCC-3'。

通过采用这些引物，可以在PCR反应体系中显著有效地完成对LPL外显子的扩增。需要说明的是，这些SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。

本发明对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。

一种筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的系统，该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；

核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有p.C310R突变，判断所述生物样品是否家族性高甘油三酯血症。

一种用于检测家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变致病基因的试剂盒，所述的试剂盒包括用于检测上述的LPL新突变致病基因的核酸探针和引物，所述引物序列如下：正向引物：5'GCCGAGATACAATCTTGGTG-3'，反向引物5'GCATGATGAAATAGGACTCC-3'。

所述试剂盒还包括：2×Power Taq PCR MasterMix，双蒸水。所述试剂盒采用普通PCR程序进行扩增，反应程序为：95℃预变性3分钟，然后进入第一个循环，95℃变性30秒，50℃退火复性30秒，72℃延伸40秒，循环35个循环后，72℃延伸10分钟，4℃保存。

需要说明的是，在本文前面筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的系统或者试剂盒，在此不再赘述。

一种筛选治疗或预防家族性高甘油三酯血症疾病的药物的方法，该方法包括：将能够表达LPL新突变致病基因的生物样品在存在候选试剂的情况下进行培养，其中所述LPL新突变致病基因与SEQ ID NO：1相比，具有p.C310R突变；同时将所述能够表达LPL新突变致病基因的生物样品在不存在所述候选试剂的情况下进行培养；确定所述能够表达LPL新突变致病基因的生物样品在存在所述候选试剂和不存在所述候选试剂的情况下，脂肪颗粒大小及代谢速率的变化，其中存在所述候选试剂时，所述代谢速率高于不存在所述候选试剂时的细胞凋亡率，是所述候选试剂作为治疗家族性高甘油三酯血症的药物的指示。

本发明的有益效果包括：本发明提供一种分离的家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变致病基因，继续完善现有LPL(脂蛋白脂肪酶)蛋白突变数据库，进一步了解LPL突变致酶活性下降的机制，同时进一步提供了筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样本的方法、筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的系统，用于筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的试剂盒以及筛选治疗或预防家族性高甘油三酯血症疾病的药物的方法。本发明所提供的试剂盒可用于临床及科研中对LPL新突变致病基因进行检测，不仅为家族性乳糜血综合征的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，而且可进一步提供LPL新突变致病基因与野生LPL蛋白的确切对比，从而可为疗效观察、疾病的动态观察提供依据，本发明将在医学治疗及检测领域发挥重要的作用。

附图说明

图1所示为于山东潍坊诸城收集到1个典型的家族性高甘油三酯血症家系的谱系图。

图2所示为LPL基因结构示意图。

图3所示为实施例2所述的先证者及其女儿正向测序图。

图4所示为验证LPL(exon6928C＞T)杂合突变与FCS之间相关性的正向测序图。

图5所示为多个物种LPL蛋白的序列对比图。

具体实施方式

下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。

实施例1

一种分离的家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变致病基因，所述LPL新突变致病基因的核酸样本的核苷酸序列与编码野生型LPL蛋白的基因，如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列相比，第928位碱基发生C>T的突变，所述LPL突变致病基因的核酸样本为人工分离或合成的单链DNA、双链DNA、RNA或DNA与RNA的聚合物。

LPL基因的新突变基因与原发性结晶样视网膜变性疾病的发病密切相关，从而通过检测该新突变基因在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感家族性高甘油三酯血症，也可以通过检测这些突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易感家族性高甘油三酯血症。

一种分离的家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变体多肽，其氨基酸序列与SEQ IDNO:2相比，具有p.C310R突变，即343位的Y突变为D。该多肽是由前述分离的编码LPL突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易感家族性高甘油三酯血症，也可以通过检测这些多肽在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易感家族性高甘油三酯血症。

本发明通过Sanger外显子测序和基因突变验证的方法确定了家族性高甘油三酯血症新的致病基因突变(NM_000237.2:c.928C>T NP_000228.1:p.C310R)。LPL基因突变基因，其与SEQ ID NO：1相比，该核酸具有p.C310R突变。在本文中所使用的表达方式“编码LPL突变体的核酸”，是指与编码LPL突变基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与LPL突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。优选地，所述的编码LPL突变基因的核酸样本为DNA。

野生型LPL基因的m RNA序列具有1468nt，翻译后的LPL蛋白质含有475个氨基酸，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。发明人发现的新突变体与SEQ ID NO：1相比，具有p.C310R突变，即相对于野生型LPL蛋白的基因，本发明的LPL基因突变基因的cDNA中第928位的T突变为C，由此，其所编码的产物与野生型LPL蛋白(SEQ ID NO：1)相比，具有p.C310R突变，即343位的Y(酪氨酸)突变为D(天冬氨酸)。

已知，LPL基因所编码全长28.188kp，包含10个外显子，编码产物为475个氨基酸的蛋白质，在脂肪酸代谢中发挥重要作用，基于一些早期的LPL同源模型的分析和体内体外实验证实，很多氨基酸的缺失和替代导致转录蛋白严重的结构变化，酶活性的丧失，影响LPL的活性，使其不能发挥正常的功能。

一种筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的方法，包括以下步骤：从所述生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有p.C310R突变是所述生物样品易感家族性高甘油三酯血症疾病的指示。

所述的生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织中的至少一种。

所述核酸样本为从生物样品中直接提取的全基因组DNA、全基因组中包含LPL编码序列的一部分、从生物样品中提取的总RNA或从生物样品中提取的mRNA中的任一种。

确定所述核酸样本的核酸序列的方法为，先设计引物扩增LPL外显子的特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，然后对得到的扩增产物进行Sanger测序。

LPL外显子特异性引物的序列不受特别限制，根据本发明的优选实施例，这些LPL外显子特异性引物具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列：5'GCCGAGATACAATCTTGGTG-3'/5'GCATGATGAAATAGGACTCC-3'。

一种筛选易感家族性高甘油三酯血症膜变性疾病的生物样品的方法。该筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的方法可以包括以下步骤：生物样品提取核酸样本。生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品LPL是否存在突变的核酸样本即可。生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易感家族性高甘油三酯血症疾病的生物样品的效率。这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中LPL是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含LPL编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息行确定，从而能够提高筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的效率。

针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的效率。

LPL外显子特异性引物的序列不受特别限制，根据本发明的优选实施例，这些LPL外显子特异性引物具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列：5'GCCGAGATACAATCTTGGTG-3'/5'GCATGATGAAATAGGACTCC-3'。

通过采用这些引物，可以在PCR反应体系中显著有效地完成对LPL外显子的扩增。需要说明的是，这些SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。

本发明对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。

一种筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的系统，该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；

核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有p.C310R突变，判断所述生物样品是否家族性高甘油三酯血症。

一种用于检测家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变致病基因的试剂盒，所述的试剂盒包括用于检测上述的LPL新突变致病基因的核酸探针和引物，所述引物序列如下：正向引物：5'GCCGAGATACAATCTTGGTG-3'，反向引物5'GCATGATGAAATAGGACTCC-3'。

所述试剂盒还包括：2×Power Taq PCR MasterMix，双蒸水。所述试剂盒采用普通PCR程序进行扩增，反应程序为：95℃预变性3分钟，然后进入第一个循环，95℃变性30秒，50℃退火复性30秒，72℃延伸40秒，循环35个循环后，72℃延伸10分钟，4℃保存。

需要说明的是，在本文前面筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的系统或者试剂盒，在此不再赘述。

一种筛选治疗或预防家族性高甘油三酯血症疾病的药物的方法，该方法包括：将能够表达LPL新突变致病基因的生物样品在存在候选试剂的情况下进行培养，其中所述LPL新突变致病基因与SEQ ID NO：1相比，具有p.C310R突变；同时将所述能够表达LPL新突变致病基因的生物样品在不存在所述候选试剂的情况下进行培养；确定所述能够表达LPL新突变致病基因的生物样品在存在所述候选试剂和不存在所述候选试剂的情况下，脂肪颗粒大小及代谢速率的变化，其中存在所述候选试剂时，所述代谢速率高于不存在所述候选试剂时的细胞凋亡率，是所述候选试剂作为治疗家族性高甘油三酯血症的药物的指示。

实施例2

用Sanger测序方法对表型为高甘油三酯血症患者的外显子组序列进行测序

2014年，于山东潍坊诸城收集到1个典型的家族性高甘油三酯血症家系。参与本发明研究的共5人，其中患者2人，正常成员2人，已去世1人。所有参与本发明研究的家系成员均签署了知情同意书。先证者为29岁女性，近十年反复发生急性胰腺炎，约8-11次/年，化验示TG最高达36mmol/l，血脂平时约20mmol/l。该家系中高甘油三酯血症的表型表现为隐性遗传模式。如图1所示的该案例家族性高甘油三酯血症家系的系谱图。如图2所示为LPL基因结构示意图。

用Sanger测序方法对表型为高甘油三酯血症的患者的外显子组序列进行了测序。扩增LPL基因的九个编码外显子，最终确定LPL基因c.928C>T杂合突变导致LPL蛋白发生C310R错义突变，此基因突变在常染色体隐性遗传高甘油三酯血症家系中与疾病表型共分离，并未在正常对照人群中检出该突变。通过对LPL蛋白在不同物种间保守型的分析，提示该突变位点在物种间高度保守。对LPL p.C310R蛋白结构模拟，提示该突变位于LPL的二硫键形成区域，突变可以导致二硫键缺失，从而影响LPL催化甘油三酯降解为甘油和自由脂肪酸的效率。综上，LPL基因c.928C>T突变为该家系的致病基因。

分别对该家系中高甘油三酯血症患者和100名家系外正常人基因进行检测。其中，针对LPL(Exon6928C>T)序列设计引物，通过PCR扩增，进行Sanger测序，根据序列测定结果判定属于突变型还是野生型，验证该杂合突变与家族性高甘油三酯血症之间的相关性。具体方法步骤如下：

DNA提取：分别对家系中所有成员及100名与家系无血缘关系的人的外周血，利用Bioteke DNA提取试剂盒提取外周血白细胞细胞中的基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本的基因组DNA的OD 260/OD 280均位于1.7-2.0之间，浓度不低于100ng/ul，总量不少于20ug。

引物设计：

PCR反应引物设计参考人类基因组序列，具体见下表1：

表1 PCR反应引物设计

PCR反应体系为20微升，具体反映体系组成见表2。

表2 PCR反应体系

体系组成	体积
		DNA模板(20ng/ul)	2ul
Mix	10ul
		去离子水	6.6ul
引物(100ng/ul)正/反向	各0.7ul

进行PCR扩增反应条件见表3。

表3 PCR扩增反应条件

见表4所示为新突变体引物序列，引物设计及PCR反应：采用目标引物(primer6F/R)和表3给出的PCR扩增反应条件，对所得到的基因组DNA进行PCR扩增。

表4 新突变体引物序列

Sanger法测序验证结果：将所获得的PCR扩增产物直接进行Sanger法测序，如图3所示可知，验证先证者及其女儿携带有NM_000237.2:c.928C>T NP_000228.1:p.C310R基因突变。测序验证LPL(exon6 928C＞T)杂合突变与FCS之间相关性的部分代表性结果如图4所示，如图4可知，其中基因野生型为928T/T纯合，突变型为928T/C杂合型，突变导致LPL蛋白的310位半胱氨酸改变为精氨酸。此外，通过验证发现LPLc.928C→T杂合突变在家系中不表现为疾病表型共分离，即患者均携带该复合杂合突变(2个等位基因)而未受累的家族成员(父母)各自携带致病的单个突变(1个等位基因)。同时，发明人在100个与该BCD家无亲缘关系的正常对照中排查均未发现该突变位点。LPLp.C310R物种保守性分析，使用NCBI数据库对LPL基因的物种同源性进行了比较结果见图5，图5示了多个物种LPL蛋白的序列对比结果。由图5可知LPLC310R在哺乳动物中高度保守，表明LPL蛋白的310位半胱氨酸在物种间是保守的。

本发明提供一种分离的家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变致病基因，继续完善现有LPL(脂蛋白脂肪酶)蛋白突变数据库，进一步了解LPL突变致酶活性下降的机制，同时进一步提供了筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样本的方法、筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的系统，用于筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的试剂盒以及筛选治疗或预防家族性高甘油三酯血症疾病的药物的方法。本发明所提供的试剂盒可用于临床及科研中对LPL新突变致病基因进行检测，不仅为家族性乳糜血综合征的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，而且可进一步提供LPL新突变致病基因与野生LPL蛋白的确切对比，从而可为疗效观察、疾病的动态观察提供依据，本发明将在医学治疗及检测领域发挥重要的作用。

上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。

另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (10)

1.一种分离的家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变致病基因，其特征在于，所述LPL新突变致病基因的核酸样本的核苷酸序列与编码野生型LPL蛋白的基因，如SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列相比，第928位碱基发生C>T的突变，所述LPL突变致病基因的核酸样本为人工分离或合成的单链DNA、双链DNA、RNA或DNA与RNA的聚合物。

2.一种分离的家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变体多肽，其特征在于，其氨基酸序列与SEQ ID NO:2相比，具有p.C310R突变，即343位的Y突变为D。

3.一种用于检测家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变致病基因的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括用于检测权利要求1所述的LPL新突变致病基因的核酸探针和引物，所述引物序列如下：正向引物：5'GCCGAGATACAATCTTGGTG-3'，反向引物5'GCATGATGAAATAGGACTCC-3'。

4.根据权利要求3所述的一种用于检测家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变致病基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：2×Power Taq PCR MasterMix，双蒸水。

5.根据权利要求4所述的一种用于检测家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变致病基因的试剂盒，其特征在于，采用普通PCR程序进行扩增，反应程序为：95℃预变性3分钟，然后进入第一个循环，95℃变性30秒，50℃退火复性30秒，72℃延伸40秒，循环35个循环后，72℃延伸10分钟，4℃保存。

6.一种筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的方法，其特征在于，包括以下步骤：从所述生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有p.C310R突变是所述生物样品易感家族性高甘油三酯血症疾病的指示。

7.根据权利要求6所述的一种筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的方法，其特征在于，所述的生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织中的至少一种。

8.根据权利要求6所述的一种筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的方法，其特征在于，所述核酸样本为从生物样品中直接提取的全基因组DNA、全基因组中包含LPL编码序列的一部分、从生物样品中提取的总RNA或从生物样品中提取的mRNA中的任一种。

9.根据权利要求6所述的一种筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的方法，其特征在于，确定所述核酸样本的核酸序列的方法为，先设计引物扩增LPL外显子的特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，然后对得到的扩增产物进行Sanger测序。

10.根据权利要求9所述的一种筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的方法，其特征在于，所述LPL外显子的特异性引物序列如下：正向引物：5'GCCGAGATACAATCTTGGTG-3'，反向引物5'GCATGATGAAATAGGACTCC-3'。