CN111235280B

CN111235280B - 一种与肉鸡生长性状相关的分子标记选育肉鸡的方法及其应用

Info

Publication number: CN111235280B
Application number: CN201811442721.2A
Authority: CN
Inventors: 饶友生; 王樟凤; 盛文涛; 柴学文
Original assignee: Nanchang Normal University
Current assignee: Nanchang Normal University
Priority date: 2018-11-29
Filing date: 2018-11-29
Publication date: 2023-02-03
Anticipated expiration: 2038-11-29
Also published as: CN111235280A

Abstract

本发明属于生物分子标记技术领域，具体涉及一种与肉鸡生长性状相关的分子标记选育肉鸡的方法及其应用，该方法具体的为：(1)提取被检肉鸡血液DNA；(2)以被检肉鸡的基因组DNA为模板，根据目的基因引物SMOX和内参基因引物VIM进行实时荧光定量PCR；(3)计算被检个体的△Ct值，△Ct＝Ct(VIM)‑Ct(SMOX)，根据△Ct范围进行选育。本发明方法针对具有优势基因型的个体进行直接选择，较之传统的表型选择更加的精确，选择后相应的位点不会出现分离的情况，对于选育体重性状优异的肉鸡具有重要的价值。

Description

一种与肉鸡生长性状相关的分子标记选育肉鸡的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物分子标记技术领域，具体涉及一种与肉鸡生长性状相关的分子标记选育肉鸡的方法及其应用。

背景技术

生长性状是肉鸡生产中的重要经济性状之一，是受微效多基因控制的。传统的育种手段是通过表型对生长性状进行选择，由于传统的表型选育方法不是直接针对于控制生长性状的基因位点进行选择，所以选择的准确性会相对较低，且后代容易分离。如果直接针对相关的位点进行分子标记辅助选择，可一次性准确选育出优势个体，加快育种进展。

发明内容

本发明主要提供了一种与肉鸡生长性状相关的分子标记选育肉鸡的方法及其应用，该方法针对具有优势基因型的个体进行直接选择，较之传统的表型选择更加的精确，选择后相应的位点不会出现分离的情况，对于选育体重性状优异的肉鸡具有重要的价值。其技术方案如下：

申报人前期使用Illumina chicken 60K SNP芯片(共57,636个标记)对杏花鸡与隐性白洛克鸡全同胞家系F2代资源群(554个个体)进行全基因组扫描。扫描结果发现鸡基因组4号染色体上一个CNV存在单拷贝缺失(GGA4:88972112-89031935)。NCBI查询发现，该区域存在SMOX基因。关联分析结果显示该拷贝数变异和肉鸡各阶段的生长速度极显著相关。该变异是第一次鉴定到，且是第一次鉴定到其与肉鸡生长性状极显著相关。具体方案如下：

一种与肉鸡生长性状相关的分子标记选育肉鸡的方法，包括以下步骤：

(1)提取被检肉鸡血液DNA；

(2)以被检肉鸡的基因组DNA为模板，进行实时荧光定量PCR，目的基因引物SMOX序列为：

正向引物F:5’-TGGACAAGTCCTGGAAGCATCT-3’，如序列SEQ ID NO：1所示，

反向引物R:5’-CAAGGGGTTGGACCAGAGACC-3’，如序列SEQ ID NO：2所示；

内参基因引物VIM序列为：

正向引物F:5’-GAGCGCCAGATGCGTGAAAT-3’，如序列SEQ ID NO：4所示，

反向引物R:5’-GCAGGTCCTGGTACTCACG-3’，如序列SEQ ID NO：5所示；

(3)计算被检个体的△Ct值，△Ct＝Ct(VIM)-Ct(SMOX)；

(4)将△Ct<0.5的个体判定为CNV1型，将△Ct>0.8个体判定为CNV2型，0.8≥△Ct≤0.5个体不予判定基因型，最终选育CNV2型的肉鸡。

优选的，步骤(2)中PCR反应体系包括：SYBR Premix Ex Taq、ROX Reference Dye(50x)、目的基因引物、内参基因引物、DNA模板、ddH₂O。

优选的，步骤(2)中PCR反应程序为：94℃变性5s，94℃5s，58℃5s，72℃5s，32次循环；72℃延伸10min，得到PCR扩增产物。

优选的，步骤(1)中采用苯酚-氯仿抽提法提取被检肉鸡血液DNA。

采用上述方案，本发明具有以下优点：

本发明针对具有优势基因型的个体进行直接选择，较之传统的表型选择更加的精确，选择后相应的位点不会出现分离的情况，对于选育体重性状优异的肉鸡具有重要的价值。

具体实施方式

以下实施例中的实验方法如无特殊规定，均为常规方法，所涉及的实验试剂及材料如无特殊规定均为常规生化试剂和材料。

实施例1

利用F2资源群体验证变异与生长性状相关

1.样本采集

采用一次性注射器从鸡翅下静脉中抽取约1mL血液，注入经高压灭菌并装有约200μL2％无菌EDTA抗凝剂的1.5mL离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-20℃保存备用。

2.DNA提取

基因组DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法(奥斯泊F等，1998)，具体步骤如下：

(1)取全血30μL置于1.5mL离心管，分别加入470μL1×SET缓冲液、12.5μL20％SDS和6μL10mg/mL蛋白酶K，混合均匀后放于55℃水浴过夜；

(2)取出样本于1.5mL离心管，加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；

(3)取上清，再次加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；

(4)取上清，加入500μL氯仿-异戊醇(23：1)轻摇20min，10,000rpm离心10min；

(5)取上清，加入1mL冰无水乙醇(-20℃)，来回摇摆以沉淀DNA，10,000rpm离心10min后倒出乙醇；

(6)用1mL75％乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱内烘干；

(7)待DNA完全干燥后加入300μL灭菌后的双蒸水溶解，50℃水浴锅中过夜以溶解DNA；

(8)存放于-20℃冰箱中保存备用。

3.测定被检个体的DNA浓度，并且将之稀释至80nmol/μL。

4.实时荧光定量PCR

利用Bio-rAd CFX96进行实时荧光定量PCR，每个样本的Control和Break设置3个重复。定量试剂采用Bio-rAd SYBR Green荧光定量PCR Mix。

扩增体系20μL，具体如下：

PCR MIX：10μL；双蒸水:7.6μL；

DNA模板：2μL(被检个体的DNA模板)；

引物0.4μL，其中：

目的基因引物SMOX序列为：

反向引物R:5’-CAAGGGGTTGGACCAGAGACC-3’，如序列SEQ ID NO：2所示，

扩增序列：

TGGACAAGTCCTGGAAGCATCTCAGATCACACACTAATCACTTCTGACATGTCTTTCAGCATATACCATCAATATACAGATATACTCACATATCTTAGAATCACTGAACTCTTTAGGTTAAAGGTCTCTGGTCCAACCCCTTG，如序列SEQ ID NO：3所示。

内参基因引物VIM序列为：

正向引物F:5’-GAGCGCCAGATGCGTGAAAT-3’，如序列SEQ ID NO：4所示，

反向引物R:5’-GCAGGTCCTGGTACTCACG-3’，如序列SEQ ID NO：5所示，

扩增序列：

GAGCGCCAGATGCGTGAAATGGAGGAGAATTTTGCTGTTGAAGCTGCTAACTACCAGGACACTATTGGCCGCCTGCAGGATGAGATTCAGAACATGAAGGAAGAAATGGCTCGCCATCTTCGTGAGTACCAGGACCTGC，如序列SEQ ID NO：6所示；

扩增程序：PCR反应扩增程序为：94℃变性5s，32次循环(94℃5s，58℃5s，72℃5s)72℃延伸10min，得到PCR扩增产物；

5.基因型判定

(1)计算被检个体△Ct值，△Ct＝Ct(VIM)-Ct(SMOX)；

(2)基因型判定:将△Ct<0.5的个体判定为CNV1型，将△Ct>0.8个体判定为CNV2型，0.8≥△Ct≤0.5个体不予判定基因型。6.统计分析

从表1中可以看出，CNV2基因型群体在从2-12周的体重极显著高于CNV1基因型群体，第8(56天龄)和第10周(70天龄)除外，但是CNV2型群体第8周和第10周的体重分别大于CNV1型群体140g和197g。结果说明CNV2型个体为体重性状的优势基因型。

表1.SMOX基因缺失对生长的影响

注：表中“()”内数字表示个体数目。

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 南昌师范学院

<120> 一种与肉鸡生长性状相关的分子标记选育肉鸡的方法及其应用

<130> 2018

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tggacaagtc ctggaagcat ct 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caaggggttg gaccagagac c 21

<210> 3

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggacaagtc ctggaagcat ctcagatcac acactaatca cttctgacat gtctttcagc 60

atataccatc aatatacaga tatactcaca tatcttagaa tcactgaact ctttaggtta 120

aaggtctctg gtccaacccc ttg 143

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagcgccaga tgcgtgaaat 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcaggtcctg gtactcacg 19

<210> 6

<211> 139

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagcgccaga tgcgtgaaat ggaggagaat tttgctgttg aagctgctaa ctaccaggac 60

actattggcc gcctgcagga tgagattcag aacatgaagg aagaaatggc tcgccatctt 120

cgtgagtacc aggacctgc 139

Claims

1.一种与肉鸡生长性状相关的分子标记选育肉鸡的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)提取被检肉鸡血液DNA；

反向引物R:5’-CAAGGGGTTGGACCAGAGACC-3’，如序列SEQ ID NO：2所示；

内参基因引物VIM序列为：

正向引物F:5’-GAGCGCCAGATGCGTGAAAT-3’，如序列SEQ ID NO：4所示，

反向引物R:5’-GCAGGTCCTGGTACTCACG-3’，如序列SEQ ID NO：5所示；

(3)计算被检个体的△Ct值，△Ct＝Ct(VIM)-Ct(SMOX)；

(4)将△Ct<0.5的个体判定为CNV1型，将△Ct>0.8个体判定为CNV2型，0.8≥△Ct≤0.5个体不予判定基因型，最终选育个体为体重性状的优势基因型的肉鸡。

2.根据权利要求1所述的选育肉鸡的方法，其特征在于：步骤(2)中PCR反应体系包括：SYBR Premix Ex Taq、

ROX Reference Dye(50x)、目的基因引物、内参基因引物、DNA模板、ddH₂O。

3.根据权利要求1所述的选育肉鸡的方法，其特征在于：步骤(2)中PCR反应程序为：94℃变性5s，94℃5s，58℃5s，72℃5s，32次循环；72℃延伸10min，得到PCR扩增产物。

4.根据权利要求1所述的选育肉鸡的方法，其特征在于：步骤(1)中采用苯酚-氯仿抽提法提取被检肉鸡血液DNA。

5.权利要求1所述的方法在选育体重性状优异肉鸡中的应用。