CN103805692B - 一种检测牛pnpla3基因单核苷酸多态性的方法与应用 - Google Patents

一种检测牛pnpla3基因单核苷酸多态性的方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测秦川牛PNPLA3基因单核苷酸多态性（SNP）的RFLP方法，以包含PNPLA3基因的待测牛全基因组DNA为模板，以人为设计的引物对P1、P2、P3、P4、P5为引物，PCR扩增牛PNPLA3基因，发现27个SNP位点；从中挑选错义突变位点4个并分别设计引物对P2‑BglI、P2‑RsaI、P3‑BmgT120I和P3‑MspI。用这4对引物进行PCR扩增，并用上述四种限制性内切酶分别酶切该PCR扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，电泳结果显示秦川牛基因PNPLA3基因第2062位、第2078位、第35800位和第35932位的单核苷酸多态性。由于PNPLA3基因涉及体重、日增重等生长性状，PNPLA3蛋白具有脂肪酶和酰基转移酶的活性而且在维持能量平衡方面也具有重要的作用，本发明所述检测方法可用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择（MAS）育种，有利于快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

一种检测牛PNPLA3基因单核苷酸多态性的方法与应用
技术领域
本发明属于动物分子育种领域，具体涉及一种快速检测类磷脂酶插入域3马铃薯糖蛋白3(the patatin like phospholipase domaincontaining3，PNPLA3)基因单核苷酸多态性（SNP）的RFLP（限制性片段长度多态性）方法，具体的说，是一种利用限制性内切酶对包含该单核苷酸多态性位点的基因序列进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳对其进行片段大小分离，利用凝胶成像系统分析片段大小，从而确定其SNP的基因型，由于它与秦川体重和日增重存在显著关联，可以作为黄牛分子育种的分子标记。
背景技术
单核苷酸多态性（SNP）就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A/T/C/G）的替换而引起的多态性。
牛是人类的重要家畜物种资源之一，它在各国社会经济和人们生活中扮演着重要角色。随着我国经济的发展和人们生活水平的提高，社会对牛产品的需求不断加强，期望牛育种专家尽快培育出更早、更好、更快地获得牛产品的优良品种。在高产、优质和高效的牛育种目标上，牛育种专家一直关注生长发育性状，但现在的问题是仅靠传统育种手段不断改良并提高这些性状，显然是不行的，还需要标记辅助选择(MAS)介导的现代分子育种技术的介入。
在众多探寻分子遗传标记的方法中，PCR-RFLP是其中一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，就能准确的鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA 测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。
PNPLA3蛋白具有脂肪酶和酰基转移酶的活性，人和鼠源PNPLA3蛋白N端都具有patatin结构域，patatin中核心模体是(GxsxG)和(DGG)。具有该结构域的脂酶具有水解磷脂，中性脂质和酰基转移酶活性。不同细胞中超表达人和鼠的PNPLA3，分级分离PNPLA3蛋白检测发现PNPLA3具有甘油三酯脂酶活性。细胞中超表达人和鼠的PNPLA3，检测产物发现甘油三酯含量并没有降低，不能降低细胞内源甘油三酯水平。同时，在人HEK293细胞中超表达PNPLA3发现甘油三酯水平还有上升的趋势。以往针对PNPLA3基因的功能和多态性研究主要集中在人和小鼠上，对牛PNPLA3基因的研究报道很少，因此对牛PNPLA3基因的研究是具有重要的意义。
国内外未见关于牛PNPLA3基因的遗传变异研究，该基因位点的功能研究及其遗传变异与经济性状（如体重等）关联研究仍是空白。由于PNPLA3基因功能涉及体重等生长性状，本发明提供的检测方法为PNPLA3基因的SNP与中国秦川牛生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
主要参考文献
BAULANDE,S.,LASNIER,F.,LUCAS,M.&PAIRAULT,J.(2001)Adiponutrin,atransmembrane protein corresponding to a novel dietary-and obesity-linkedmRNA specifically expressed in the adipose lineage.Journal of BiologicalChemistry,276:33336–33344.
JENKINS,C.M.,MANCUSO,D.J.,YAN,W.,SIMS,H.F.,GIBSON,B.&GROSS,R.W.(2004)Identification,cloning,expression,and purification of three novel humancalcium-independent phospholipase A2family members possessing triacylglycerollipase and acylglycerol transacylase activities.Journal of BiologicalChemistry,279:48968–48975
KERSHAW,E.E.,HAMM,J.K.,VERHAGEN,L.A.,PERONI,O.,KATIC,M.&FLIER,J.S.(2006)Adipose triglyceride lipase:function,regulation by insulin,andcomparison with adiponutrin.Diabetes,55:148–157.
LAKE,A.C.,SUN,Y.,LI,J.L.,KIM,J.E.,JOHNSON,J.W.,LI,D.,REVETT,T.,SHIH,H.H.,
L.SU,S.H.WANG,R.L.HAN,G.R.SUN,Y.C.BAI,S.J.LV AND X.T.KANG(2012)Polymorphisms of the PNPLA3gene and their associations with chicken growthand carcass traits.British Poultry Science,53:453—459.
WILSON,P.A.,GARDNER,S.D.,LAMBIE,N.M.,COMMANS,S.A.&CROWTHER,D.J.(2006)Characterization of the human patatin-like phospholipase family.Journal ofLipid Research,47:1940–1949.
发明内容
本发明解决的问题在于利用PCR-RFLP方法检测牛PNPLA3基因的多态性，并与其生长性状的关联性，作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育的速度，为中国黄牛品种的改良提供一定的指导作用。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种快速检测牛PNPLA3基因SNP的RFLP方法，以包含PNPLA3基因的待测牛全基因组DNA为模板，以人为设计的引物对P1、P2、P3、P4、P5为引物，PCR扩增牛PNPLA3基因，发现27个SNP位点；从中挑选错义突变位点4个并分别设计引物对P2-BglI、P2-RsaI、P3-BmgT120I和P3-MspI。用这4对引物进行PCR扩增，并用上述四种限制性内切酶分别酶切该PCR扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，电泳结果显示秦川牛基因PNPLA3基因第2062位、第2078位、第35800位和第35932位的单核苷酸多态性。
所述的引物对P1为：
上游引物：5'-CTTCACAAGCCAGACCCT-3'
下游引物：5'-GCTGTATGATAGCCCCTA-3’
所述的引物对P2为：
上游引物：5'-GACCATTTCTCGTTACCA-3'
下游引物：5'-AGGATGAAGACCCCACTG-3’
所述的引物对P3为：
上游引物：5'-GCATGTGGCAGTCCTGAG-3'
下游引物：5'-TGTTGCTGTTGGTCCGTC-3’
所述的引物对P4为：
上游引物：5'-TTTGTCACGAGCGGAATG-3'
下游引物：5'-GGAAAGGAGACAGAGCAA-3’
所述的引物对P5为：
上游引物：5'-ATTCCTTCCCTGCTGACT-3'
下游引物：5'-AAACCTGAGGGAGCAATG-3’
所述的引物对P2-BglI为：
上游引物F1：5'-CTCCTGGATGACATTTGGGGGCCGT-3'
下游引物R1：5'-TCTGTGCCTGGAGGCTGACATGAAG-3’
所述的引物对P2-RsaI为：
上游引物F1：5'-CTCCTGGATGACATTTGGGGGCCGT-3'
下游引物R1：5'-TCTGTGCCTGGAGGCTGACATGAAG-3’
所述的引物对P3-BmgT120I为：
上游引物F2：5'-CTCTATCCCTAATCTGAAGCA-3'
下游引物R2：5'-ACCTTGACATCTGGTGGG-3’
所述的引物对P3-MspI为：
上游引物F2：5'-CTCTATCCCTAATCTGAAGCA-3'
下游引物R2：5'-ACCTTGACATCTGGTGGG-3’
用限制性内切酶BglI、RsaI、BmgT120I和MspI酶切上述PCR扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的片段，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定牛PNPLA3基因第2062位、第2078位、第35800位和第35932位的单 核苷酸多态性。
所述的PCR扩增反应程序为：
引物对P2-BglI：
95℃预变性5min；34个循环95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸20s；72℃延伸10min。
引物对P2-RsaI：
95℃预变性5min；34个循环95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸20s；72℃延伸10min。
引物对P3-BmgT120I：
95℃预变性5min；34个循环95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸20s；72℃延伸10min。
引物对P3-MspI：
95℃预变性5min；34个循环95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸20s；72℃延伸10min。
所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.0%。
所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定牛PNPLA3基因第2062位的单核苷酸多态性为：AA基因型表现为326bp的条带，GG基因型表现为299bp和27bp的条带，AG基因型表现为326bp、299bp和27bp的条带；第2078位的单核苷酸多态性为：AA基因型表现为326bp的条带，AT基因型表现为326bp、281bp和45bp的条带；第35800位的单核苷酸多态性为：AA基因型表现为298bp的条带，GG基因型表现为158bp和140bp的条带，AG基因型表现为298bp、158bp和140bp的条带；第35932位的单核苷 酸多态性为：AA基因型表现为298bp的条带，GG基因型表现为270bp和28bp的条带，AG基因型表现为298bp、270bp和28bp的条带。
本发明根据PNPLA3基因的序列设计引物，采用DNA池测序技术，共发现27个SNP多态性。
针对上述SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的引物PCR扩增，特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。
本发明对秦川牛的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述4个SNP位点与秦川牛部分生长性状（如体重等）进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛体重和日增重性状的分子标记。
附图说明
图1为牛PNPLA3基因外显子SNP多态性测序图，其中双峰为SNP位点。
图2为牛PNPLA3基因内含子SNP多态性测序图，其中双峰为SNP位点。
图3为牛PNPLA3基因g.A2062G位点Forced PCR-RFLP分型。DNA经3%琼脂糖凝胶检测电泳后EB染色成像检测。泳道6为Marker I;泳道1为AA基因型;泳道2,3为AG基因型;泳道4,5为GG基因型。
图4为牛PNPLA3基因g.A2078T位点Forced PCR-RFLP分型。DNA经3%琼脂糖凝胶检测电泳后EB染色成像检测。泳道5为Marker I;泳道1,2为AA基因型;泳道3,4为AT基因型。
图5为牛PNPLA3基因g.A35800G位点Forced PCR-RFLP分型。DNA经3%琼脂糖凝胶检测电泳后EB染色成像检测。泳道7为Marker I;泳道1,2为AA基因型;泳道3,4为AG基因型;泳道5,6为GG基因型。
图6为牛PNPLA3基因g.G35932A位点Forced PCR-RFLP分型。DNA经3%琼脂糖凝胶检测电泳后EB染色成像检测。泳道7为Marker I;泳道1,2为AA基因型;泳道3,4为AG基因型;泳道5,6为GG基因型。
具体实施方案
本发明利用PCR-RFLP方法对牛PNPLA3基因第2062位、第2078位、第35800位和第35932位的单核苷酸多态性进行检测，下面结合对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定的。
一、牛PNPLA3基因CDS区DNA序列的克隆及其多态性的检测
1、牛血液样品采集
本发明具体以秦川牛共计519头牛个体为检测对象，具体采集样本见表1：
表1样本采集信息表
品种 样本数 样品来源 采样方式
秦川牛 519 陕西省秦川牛良种繁育中心 颈静脉采血
2、血样基因组DNA的提取及纯化
（1）、冷冻血样在室温下解冻后，转移500μL至1.5mL Eppendorf离心管，加入等体积PBS溶液，充分混匀，12000r/min,4℃,离心10min,弃去上清，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；
（2）、在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动混匀，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，在37℃水浴1h;
加3μL（20mg/mL）蛋白酶K混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，补加 1μL蛋白酶K混匀后继续消化至澄清；
（4）、将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，轻轻摇动离心管20min，充分混匀；4℃，12000r/min离心10min,将上清液转入另一个1.5mL离心管中，重复一次；
（5）、加入500μL氯仿，充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上清转入另一1.5mL离心管中；
（6）、加入500μL氯仿和异戊醇混合液（24:1），充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上清转入另一1.5mL离心管中；
（7）、加入0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；
（8）、4℃，12000r/min离心10min，弃去上清，70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；
（9）、4℃，12000r/min离心10min，弃去上清，室温下使乙醇挥发干净；
（10）、将干燥后的DNA溶于80～100μL的TE溶液，4℃保存直至DNA完全溶解，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存；
（11）、500μL的DNA溶液中加入10%SDS使其最终浓度为0.1%，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL,5℃保温10h左右；
(12)、用等体积的苯酚、氯仿、异戊醇（25：24:1）和氯仿分别抽提一次；
（13）、4℃，12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；
（14）、加入1/10体积的3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；
（15）、轻轻倒掉液体，用70%乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，检测后4℃储存。
3、DNA池的构建
用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD260/OD280的比值，DNA浓度（ng/μL）=50×OD260值×稀释倍数。如果OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；如果比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从秦川牛群体中随机选择100个浓度为50ng/μLDNA样品中取10μL混合构建DNA池。
4、扩增引物设计
设计牛PNPLA3基因的PCR引物
利用数据库（GenBank accession number AC_000162.1）中所提供的牛PNPLA3基因序列，利用Primer5.0软件设计引物，由南京金斯瑞公司合成牛PNPLA3基因的CDS区5对引物P1～P5，如下：
所述的引物对P1为：
上游引物：5'-CTTCACAAGCCAGACCCT-3'
下游引物：5'-GCTGTATGATAGCCCCTA-3’
所述的引物对P2为：
上游引物：5'-GACCATTTCTCGTTACCA-3'
下游引物：5'-AGGATGAAGACCCCACTG-3’
所述的引物对P3为：
上游引物：5'-GCATGTGGCAGTCCTGAG-3'
下游引物：5'-TGTTGCTGTTGGTCCGTC-3’
所述的引物对P4为：
上游引物：5'-TTTGTCACGAGCGGAATG-3'
下游引物：5'-GGAAAGGAGACAGAGCAA-3’
所述的引物对P5为：
上游引物：5'-ATTCCTTCCCTGCTGACT-3'
下游引物：5'-AAACCTGAGGGAGCAATG-3’
5、PCR扩增
PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需要的各种组分的数量和1次反映所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，然后分装到0.2mLEppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，轻轻吹打混匀后进行PCR扩增；分秦川牛DNA池为模板，用上述设计的引物对进行PCR扩增，PCR总反应体系为25μL
PCR反应体系见表2：
表2PCR反应体系
体系成分 体积（μL）
2×Mix 12.5
上游引物（10pmol/L） 1.0
下游引物（10pmol/L） 1.0
Taq DNA聚合酶（2.5U/μL） 0.2
DNA模板（100ng/μL） 0.5
灭菌超纯水（H2O） 9.8
总体积 25.0
PCR反应程序：95℃预变性5min；34个循环95℃变性30s，50℃（P1）/51℃(P2)/54℃(P3、P4、P5)退火30s，72℃延伸50s；72℃延伸10min。6、PCR产物测序
将用以上混合的DNA池为模板的PCR产物送南京金斯瑞有限公司进行双向测序。对牛PNPLA3基因目的片段的测序峰图进行分析，其中在同 一位点有两个不同的峰是发生了单核苷酸突变，最终经过序列分析本发明共筛查到了牛PNPLA3基因的27个SNP多态性，如下表：
表3多态位点分布情况
位点 SNP 突变位点 密码子变化 氨基酸变化
M1 g.A408G IVS2+408A>G
g.G495A IVS2+495G>A
g.G586A IVS3+586G>A
g.C642T IVS3+642C>T
M2 g.C1795T IVS3+1795C>T
g.A1950C IVS3+1950A>C
g.A2062G EX4_2062A>G AGC/GGC p.S106G
g.A2078T EX4_2078A>T GAA/GTA p.E111V
g.G2232A IVS4+2232G>A
M3 g.A35687G IVS7+35687A>G
g.A35800G EX8_35800A>G AAG/AGG p.K272R
g.G35932A EX8_35932G>A CGG/CAG p.R316Q
g.G36094A IVS8+36094G>A
M4 g.A41718G EX10_41718A>G CAT/CGT p.H347R
g.G41734A EX10_41734G>A CCG/CCA p.P352P
g.C41760T EX10_41760C>T TCG/TTG p.S361L
g.A41763C EX10_41763A>C GAG/GCG p.E362A
g.G41764A EX10_41764G>A GAG/GAA p.E362E
g.G41768A EX10_41768G>A GGG/AGG p.G364R
g.C41974G IVS10+41974C>G
M5 g.C43654G IVS10+43655C>G
g.A43684G IVS10+43685A>G
g.A43729T IVS10+43730A>T
g.T43772G IVS10+43773T>G
g.T43780C IVS10+43781T>C
g.G43855C EX11_43856G>C GGG/GGC p.G420G
g.C43927T EX11_43928C>T CCC/CCT p.P444P
7、基因型分型引物设计以及PCR扩增
以引物对P2-BglI、P2-RsaI、P3-BmgT120I和P3-MspI进行PCR扩增待测牛的PNPLA3基因片段。
所述的引物对P2-BglI为：
上游引物F1：5'-CTCCTGGATGACATTTGGGGGCCGT-3'
下游引物R1：5'-TCTGTGCCTGGAGGCTGACATGAAG-3’
所述的引物对P2-RsaI为：
上游引物F1：5'-CTCCTGGATGACATTTGGGGGCCGT-3'
下游引物R1：5'-TCTGTGCCTGGAGGCTGACATGAAG-3’
所述的引物对P3-BmgT120I为：
上游引物F2：5'-CTCTATCCCTAATCTGAAGCA-3'
下游引物R2：5'-ACCTTGACATCTGGTGGG-3’
所述的引物对P3-MspI为：
上游引物F2：5'-CTCTATCCCTAATCTGAAGCA-3'
下游引物R2：5'-ACCTTGACATCTGGTGGG-3’
在P2-BglI的上游引物3’端起第5位引入错配碱基，从而人为构建了一个BglI的酶切位点；可以使用Forced PCR-RFLP方法进行基因型的判定，PCR产物扩增体系和反应条件如前面所述。
8、用限制性内切酶BglI、RsaI、BmgT120I和MspI分别酶切消化PCR扩增的PNPLA3基因片段
按照表4所确立的酶切体系对对应SNP的Forced PCR产物进行酶切。37℃下酶切11h。于3.0%的琼脂糖凝胶对不同的基因型进行检测和分型，方法是上样10μL，以120V跑1h25min后EB染色大约10min，根据带型判断基因类别。
表4酶切反应体系
体系成分 体积（μL）
10×L 1.0
PCR产物 4.0
酶 0.2
灭菌超纯水（H2O） 4.8
总体积 10
9、根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性
牛PNPLA3基因第2062位的单核苷酸多态性为：AA基因型表现为326bp的条带，GG基因型表现为299bp和27bp的条带，AG基因型表现为326bp、299bp和27bp的条带，由于27bp片段太小，在琼脂糖凝胶中看不到；第2078位的单核苷酸多态性为：AA基因型表现为326bp的条带，AT基因型表现为326bp、281bp和45bp的条带，由于45bp片段太小，在琼脂糖凝胶中看不到；第35800位的单核苷酸多态性为：AA基因型表现为298bp的条带，GG基因型表现为158bp和140bp的条带，AG基因型表现为298bp、158bp和140bp的条带；第35932位的单核苷酸多态性为：AA基因型表现为298bp的条带，GG基因型表现为270bp和28bp的条带，AG基因型表现为298bp、270bp和28bp的条带，由于28bp片段太小，在琼脂糖凝胶中看不到。
二、牛PNPLA3基因SNP位点的频率统计分析
1、基因和基因型频率
基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。PAA＝NAA/N，其中PAA代表某一位点的AA基因型频率；NAA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。
基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：PA=（2NAA＋NAa1＋NAa2＋……＋NAan）/2N。式中，PA表示等位基因A频率，NAA表示群体中具有AA基因型的个体数量，NAai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复 等位基因。
在秦川牛PNPLA3基因4个多态位点中，等位基因频率变化如表5所示：
表5牛PNPLA3基因各位点群体遗传分布
2、牛PNPLA3基因SNP位点基因效应的关联分析
（1）基因型数据：BglI识别的基因型（AA、GG和AG）、RsaI识别的基因型（AA和TT）、BmgT120I识别的基因型（AA、GG和AG）、MspI识别的基因型（AA、GG和AG）。
（2）生产数据：秦川牛2岁的各种生长性状（包括体重、体高、体斜长、胸围和坐骨髋宽）。
（3）关联分析模型：
利用SPSS（16.0）软件分析基因位点的各种基因型和各种年龄对应的生长性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型效应。模型如下：
Yijk=μ+Ai+Gj+Xn+Eijk
其中：Yijk为个体表型记录；μ为群体均值；Ai为年龄效应；Gj为各位点的基因型效应；Xn为年龄和基因型的互作效应；Eijk为随机误差。
结果表明（见表6）：在第2062位，GG基因型的个体体重与胸围高于AG基因型个体，且差异显著（P<0.05）；在第2078位，AA基因型的个体体重与胸围高于AT基因型个体，且差异显著（P<0.05）；在第35800位，GG基因型的个体体重与体长高于AA和AG基因型个体，且差异显著（P<0.05）；在第35932位，AA基因型个体体重与胸围高于AG和GG基因型个体，且差异显著（P<0.05）。其他位点基因型与生长性状关系差异不显著。所以在肉牛分子育种中，可以同时考虑4个位点，选择G1G1A2A2G3G3A4A4的基因型个体，就能形成一个体重、胸围较大、体长较长的优秀黄牛群体。
表6牛PNPLA3基因各位点不同基因型与秦川牛生长性状关联分析
注：Mean±SE：平均值±平均值的标准误；P<0.05代表差异显著；BW代表体重；ADG代表日增重。具有相同字母表示差异不显著（P＞0.05）,字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

Claims (5)

1.一种快速检测秦川牛PNPLA3基因SNP的RFLP方法，其特征在于：以包含PNPLA3基因的待测牛基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3、P4、P5为引物，PCR扩增秦川牛PNPLA3基因，PCR产物经测序，共发现27个多态位点；从中挑选错义突变位点4个，并针对这4个SNP位点设计引物对P2-BglI、P2-RsaI、P3-BmgT120I和P3-MspI，进行PCR扩增待测牛的PNPLA3基因片段，用限制性内切酶BglI、RsaI、BmgT120I和MspI分别酶切对应引物对P2-BglI、P2-RsaI、P3-BmgT120I和P3-MspI的PCR扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定秦川牛PNPLA3基因第2062位、第2078位、第35800位和第35932位的单核苷酸多态性；
所述的引物对P1为：
上游引物：5'-CTTCACAAGCCAGACCCT-3'
下游引物：5'-GCTGTATGATAGCCCCTA-3’
所述的引物对P2为：
上游引物：5'-GACCATTTCTCGTTACCA-3'
下游引物：5'-AGGATGAAGACCCCACTG-3’
所述的引物对P3为：
上游引物：5'-GCATGTGGCAGTCCTGAG-3'
下游引物：5'-TGTTGCTGTTGGTCCGTC-3’
所述的引物对P4为：
上游引物：5'-TTTGTCACGAGCGGAATG-3'
下游引物：5'-GGAAAGGAGACAGAGCAA-3’
所述的引物对P5为：
上游引物：5'-ATTCCTTCCCTGCTGACT-3'
下游引物：5'-AAACCTGAGGGAGCAATG-3’
所述的引物对P2-BglI为：
上游引物F1：5'-CTCCTGGATGACATTTGGGGGCCGT-3'
下游引物R1：5'-TCTGTGCCTGGAGGCTGACATGAAG-3’
所述的引物对P2-RsaI为：
上游引物F1：5'-CTCCTGGATGACATTTGGGGGCCGT-3'
下游引物R1：5'-TCTGTGCCTGGAGGCTGACATGAAG-3’
所述的引物对P3-BmgT120I为：
上游引物F2：5'-CTCTATCCCTAATCTGAAGCA-3'
下游引物R2：5'-ACCTTGACATCTGGTGGG-3’
所述的引物对P3-MspI为：
上游引物F2：5'-CTCTATCCCTAATCTGAAGCA-3'
下游引物R2：5'-ACCTTGACATCTGGTGGG-3’。
2.根据权利要求1所述的快速检测秦川牛PNPLA3基因SNP的RFLP方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：
引物对P2-BglI：
95℃预变性5min；34个循环95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸20s；72℃延伸10min；
引物对P2-RsaI：
95℃预变性5min；34个循环95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸20s；72℃延伸10min；
引物对P3-BmgT120I：
95℃预变性5min；34个循环95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸20s；72℃延伸10min；
引物对P3-MspI：
95℃预变性5min；34个循环95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸20s；72℃延伸10min。
3.根据权利要求1所述的快速检测秦川牛PNPLA3基因SNP的RFLP方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.0％，以120V电泳1.25个小时。
4.根据权利要求1所述的快速检测秦川牛PNPLA3基因SNP的RFLP方法，其特征在于，第2062位的单核苷酸多态性为：AA基因型表现为326bp的条带，GG基因型表现为299bp和27bp的条带，AG基因型表现为326bp、299bp和27bp的条带；第2078位的单核苷酸多态性为：AA基因型表现为326bp的条带，AT基因型表现为326bp、281bp和45bp的条带；第35800位的单核苷酸多态性为：AA基因型表现为298bp的条带，GG基因型表现为158bp和140bp的条带，AG基因型表现为298bp、158bp和140bp的条带；第35932位的单核苷酸多态性为：AA基因型表现为298bp的条带，GG基因型表现为270bp和28bp的条带，AG基因型表现为298bp、270bp和28bp的条带。
5.权利要求1至4中任意一项权利要求所述的快速检测秦川牛PNPLA3基因SNP的RFLP方法在鉴定秦川牛群体遗传多态性和分子育种中应用。
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