CN116286846A - 鱼类低氧适应基因型及检测方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了决定鱼类低氧适应表型的核苷酸序列，碱基序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还公开了鱼类低氧适应基因型的检测方法，包括：提取待测鱼类的基因组DNA；以基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO:3和4的引物对进行PCR扩增；若检测到PCR扩增产物中有符合第一检测值大小的产物存在，则判定待测个体为低氧适应基因型，若检测到PCR扩增产物中仅有符合第二检测值大小的产物存在，则判定待测个体低氧敏感基因型。本发明还公开了决定鱼类低氧适应表型的核苷酸序列或所述的检测引物对于鱼类耐低氧品种检测、鉴定和培育中的用途。本发明可用于育种候选亲本的早期筛选和亲本配组设计，操作简单，检测成本低。

Description

鱼类低氧适应基因型及检测方法和用途

技术领域

本发明属于鱼类遗传育种技术领域，涉及鱼类低氧适应基因型及检测方法和用途。

背景技术

水产养殖是当前全球范围内增速最快的食物生产部门，为保障人类粮食安全和营养安全发挥了重要作用。与作物和畜禽相比，水产养殖物种通常被认为处于家养驯化的初期阶段，种内遗传多样性丰富，具有良好的育种潜力，但对调控重要经济性状的基因及其相关分子标记掌握不足，成为限制水产品种遗传改良、以及进一步分子设计育种的瓶颈。

在水生环境中，氧饱和浓度仅为同体积空气中的1/30，且扩散速度缓慢，空间分布不均匀。个体暴露于低氧环境后,通过调动一系列代偿性低氧调节反应，恢复稳态，维持机体的生存能力，称为“低氧习服”。而经过多代的自然选择或者人工选择，将有利于抵御低氧胁迫的基因型在基因组中固定下来，形成可以遗传的低氧耐受表型，称为“低氧适应”。低氧适应表型具备可遗传性，拥有对应的序列差异或表观修饰特征，即低氧适应的基因型，可作为耐低氧品种选育的遗传基础。

为适应聚集性养殖条件下的氧供应不足，低氧成为水产养殖中的高强度环境压力之一。在养殖鱼类育种计划中，发掘适用于分子设计育种的优异等位基因和单倍型，对候选亲本群体进行低氧适应基因型检测，无需直接开展低氧胁迫性状测试，能够有效避免对候选亲本造成致死性损伤，提前筛选具有低氧适应表型的亲本个体，也便于结合其他重要经济性状开展育种值计算，制定亲本配组计划，从而培育低氧适应性状优良的养殖品种。

但是，在基因组序列层面开展的低氧适应基因型和分子标记筛查工作仍处于起步阶段，能够解释较高表型变异的序列和结构变异信息非常有限，例如中山大学夏军红教授课题组通过QTL-seq和ddRAD-seq在罗非鱼中定位到两个低氧相关位点，分别位于GPR132(Gprotein coupled receptor 132)和ABCG4(ATP binding cassette subfamily G member4)基因，美国奥本大学刘占江教授课题组利用高通量单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)芯片在不同家系中开展全基因组关联分析，定位到多个低氧相关位点，并聚焦于VEGF、mTOR、PI3K-AKT、DNA损伤检验点、P53介导的细胞凋亡以及MAPK等6个通路。鲤(Cyprinus carpio)是原产我国的土著鱼类，在中国具有8000多年的养殖历史，如今已发展成为世界性的养殖种，养殖地域遍布欧亚大陆，年产量达418.95万吨，而目前对鲤鱼低氧适应基因型和分子标记的掌握几乎是空白状态。

鱼类低氧适应基因型及其检测技术开发，将对实现“资源节约、环境广适”的水产养殖遗传改良目标，应对陆基水产养殖空间不断压缩的现实挑战，推动水生粮食系统绿色转型具有重要意义。

综上所述，亟待获取一批可靠的鱼类低氧适应基因型，并开发简便高效的检测方法，将其应用于耐低氧养殖品种培育。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种决定鱼类低氧适应表型的核苷酸序列和决定养殖鱼类低氧敏感表型的核苷酸序列。

本发明另有一个目的是提供一种用于鱼类低氧适应基因型的检测引物对。

本发明还有一个目的是提供一种鱼类低氧适应基因型的检测方法。

本发明另有一个目的是提供一种用于鱼类低氧适应基因型的检测试剂盒。

本发明还有一个目的是提供所述的核苷酸序列或所述的检测引物对于鱼类耐低氧品种检测、鉴定和培育中的用途。

为此，本发明提供的技术方案为：

决定鱼类低氧适应表型的核苷酸序列，包含如SEQ ID NO：1所示的碱基序列。如SEQ ID NO：1所示的碱基序列的杂合子和纯合子都表现为低氧适应。

决定养殖鱼类低氧敏感表型的核苷酸序列，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示。

用于鱼类低氧适应基因型的检测引物对，所述引物对为：如SEQ ID NO：3所示的碱基序列和如SEQ ID NO：4所示的碱基序列。

一种鱼类低氧适应基因型的检测方法，包括如下步骤：

1)提取待测鱼类的基因组DNA；

2)以步骤1)中的基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的一对引物对进行PCR扩增；

3)对步骤2)中得到的PCR扩增产物进行产物长度判定，若检测到PCR扩增产物中有符合第一检测值大小的产物存在，则判定该模板基因组DNA的待测个体为低氧适应基因型，如SEQ ID NO：1所示的碱基序列的杂合子和纯合子都表现为低氧适应。若检测到PCR扩增产物中仅有符合第二检测值大小的产物存在，则判定该模板基因组DNA的待测个体低氧敏感基因型，其中，所述第一检测值大于所述第二检测值。

优选的是，所述的鱼类低氧适应基因型的检测方法中，所述鱼类为鲤鱼。

优选的是，所述的鱼类低氧适应基因型的检测方法中，步骤1)中，所述待测鱼类处于幼鱼时期。

优选的是，所述的鱼类低氧适应基因型的检测方法中，步骤1)中，取所述待测鱼类的鳍条或血液样本提取基因组DNA。

优选的是，所述的鱼类低氧适应基因型的检测方法中，步骤3)中，所述第一检测值为358bp，所述第二检测值为179bp。

一种用于鱼类低氧适应基因型的检测试剂盒，其包含所述的引物对。

所述的核苷酸序列或所述的检测引物对于鱼类耐低氧品种检测、鉴定和培育中的用途。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明提供的低氧适应基因型来源于大规模全基因组关联分析(Genome WideAssociation Study,GWAS)的显著性关联位点，位于鲤鱼2号染色体上的calsequestrin-2-like基因中，该基因编码一种肌钙集蛋白样蛋白，在心肌和骨骼肌中表达，具有钙离子浓度调控功能，在低氧信号转导中发挥重要功能。

本发明提供的核苷酸序列差异位于calsequestrin-2-like基因上游启动子区域，包含启动子区长达179bp的插入/缺失突变，直接决定calsequestrin-2-like基因转录水平，与鲤鱼低氧适应性状的表型关联度高，且在其他养殖鱼类中具有一定通用性。

本发明提供的低氧适应基因型检测方法可使用鳍条或血液样本，不损害鱼体健康，有效避免了通过低氧胁迫实验测定鱼类个体低氧适应表型造成的健康损伤和致死性后果。

本发明提供的低氧适应基因型检测方法在幼鱼期即能有效判别候选个体的低氧适应表型，无需生长至商品规格或性成熟，可用于育种候选亲本的早期筛选和亲本配组设计。

本发明提供的低氧适应基因型检测方法基于长片段插入/缺失的序列差异，在其保守侧翼序列设计PCR引物，通过简单的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳即可判读结果，操作简单，检测成本低。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明实施例中鲤鱼低氧适应基因型与低氧敏感基因型的DNA序列比对图，其中，HR-cis1_Resistant_C.Carpio表示低氧适应基因型，HS-cis2_Sensitive_C.Carpio表示低氧敏感基因型。

图2为本发明实施例中低氧适应基因型检测方法的琼脂糖凝胶电泳图，其中，样品1为DNA分子量标准，样品2、3分别为两个低氧敏感个体的PCR扩增产物，产物长度为179bp，样品4、5分别为两个低氧适应个体的PCR扩增产物，产物长度为358bp。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供的低氧适应基因型来源于大规模全基因组关联分析(Genome WideAssociation Study,GWAS)的显著性关联位点，位于鲤鱼2号染色体上的calsequestrin-2-like基因中，该基因编码一种肌钙集蛋白样蛋白，在心肌和骨骼肌中表达，具有钙离子浓度调控功能，在低氧信号转导中发挥重要功能。

本发明提供决定鱼类低氧适应表型的核苷酸序列，包含如SEQ ID NO：1所示的碱基序列，如SEQ ID NO：1所示的碱基序列的杂合子和纯合子都表现为低氧适应。

本发明还公开了决定养殖鱼类低氧敏感表型的核苷酸序列，其碱基序列如SEQ IDNO:2所示。

本发明提供的核苷酸序列差异位于calsequestrin-2-like基因上游启动子区域，包含启动子区长达179bp的插入/缺失突变，直接决定calsequestrin-2-like基因转录水平，与鲤鱼低氧适应性状的表型关联度高，且在其他养殖鱼类中具有一定通用性。

本发明还提供用于鱼类低氧适应基因型的检测引物对，所述引物对为：如SEQ IDNO：3所示的碱基序列和如SEQ ID NO：4所示的碱基序列。

本发明中，SEQ ID NO：1表示鲤鱼(Cyprinus carpio)低氧适应基因型的核苷酸序列，SEQ ID NO：2表示鲤鱼(Cyprinus carpio)低氧敏感基因型的核苷酸序列，二者序列相似性比对结果如图1所示，其中本发明提供的低氧适应基因型检测方法的检测对象位于SEQID NO：1的323-503位碱基，对应SEQ ID NO：2的323-324位碱基，检测上游引物位于SEQ IDNO：1和2的199-220位碱基，检测下游引物位于SEQ ID NO：1的536-556位碱基和SEQ ID NO：2的357-377位碱基。

本发明还提供一种鱼类低氧适应基因型的检测方法，包括如下步骤：

1)提取待测鱼类的基因组DNA；

2)以步骤1)中的基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的一对引物对进行PCR扩增；

3)对步骤2)中得到的PCR扩增产物进行产物长度判定，若检测到PCR扩增产物中有符合第一检测值大小的产物存在，则判定该模板基因组DNA的待测个体为低氧适应基因型，如SEQ ID NO：1所示的碱基序列的杂合子和纯合子都表现为低氧适应。若检测到PCR扩增产物中仅有符合第二检测值大小的产物存在，则判定该模板基因组DNA的待测个体低氧敏感基因型，其中，所述第一检测值大于所述第二检测值。

在上述方案中，作为优选，所述鱼类为鲤鱼。

在上述方案中，作为优选，步骤1)中，所述待测鱼类处于幼鱼时期。

在上述方案中，作为优选，步骤1)中，取所述待测鱼类的鳍条或血液样本提取基因组DNA。

在上述方案中，作为优选，步骤3)中，所述第一检测值为358bp，所述第二检测值为179bp。

具体地，包括如下步骤：

采集待测鲤鱼个体的组织样本，分别提取基因组DNA；所述组织样本为鳍条或血液。将所述基因组DNA溶于Tris-EDTA缓冲液配置成浓度约100ng/μL的溶液保存。

以所述基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列作为上游引物，以如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列作为下游引物，进行聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction,PCR)扩增反应，获得PCR产物。

所述PCR扩增反应的反应体系为20μL：即为在PCR反应管中加入0.1μL浓度为2,500units/mL的Taq DNA聚合酶，2.0μL10×buffer PCR缓冲液，2.0μL浓度为10μM的dNTPs，1.2μL25mM MgCl₂，2.0μL所述基因组DNA，0.5μL浓度为10μM的所述上游引物，0.5μL浓度为10μM的所述下游引物和11.7μL无菌水。

所述PCR扩增反应的反应条件为94℃预变性5min，然后94℃预热变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，从预热、退火到延伸共反应30个循环，然后72℃延伸10min，反应完成后4℃保存。

对所述PCR产物进行产物长度判定，鉴别个体低氧适应基因型，若PCR产物条带为358bp，表明所述待测个体为低氧适应基因型，若PCR产物条带为179bp，表明所述待测个体为低氧敏感基因型。

所述产物长度判定采用琼脂糖凝胶电泳检测法进行。

本发明还提供一种用于鱼类低氧适应基因型的检测试剂盒，其包含所述的引物对。

本发明还提供所述的核苷酸序列或所述的检测引物对于鱼类耐低氧品种检测、鉴定和培育中的用途。所述核苷酸序列的碱基序列如SEQ ID NO：1或2所示。

实施例

鲤鱼育种候选亲本的低氧适应基因型测定

1.样本采集

选取30日龄鲤鱼幼鱼，每尾剪鳍条约0.5cm用于基因组DNA提取，幼鱼剪鳍后放归养殖池，鳍条样本55℃烘干后常温保存。

2.鲤鱼组织样品基因组DNA提取

使用海洋动物基因组DNA提取试剂盒(天根DP324-03)，按照说明书步骤提取基因组DNA，溶于100μL Tris-EDTA缓冲液，紫外分光光度计测定浓度。

3.PCR扩增

待测样品扩增反应体系如下：

将装有上述扩增反应体系的PCR管放入PCR仪中进行扩增，反应条件为94℃预变性5min，然后94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，变性、退火、延伸共30个循环，72℃延伸10min，反应完成后，将体系温度降至4℃保存备用

4.琼脂糖凝胶电泳检测

配制浓度为2.0％的琼脂糖电泳胶，使用溴化乙锭染料，80V电压电泳30min，电泳结果使用凝胶成像仪拍照，结果如图2所示。图中样本1为分子量标准，条带大小自上而下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、200bp和100bp；样本2和3扩增产物条带小于200bp，判定为低氧敏感基因型；样本4和5扩增产物条带大于200bp，判定为低氧适应基因型。

5.低氧适应表型测定

采样后幼鱼正常饲养至3月龄，进行低氧胁迫实验测试。测试个体移入室内暂养缸中，气泵充氧使溶解氧浓度控制在约6.0mg/L，25℃暂养7d使之适应环境。禁食24h后停止充氧，使溶解氧浓度持续自然下降，记录个体缺氧昏迷时间及溶氧值。个体2和3在低氧胁迫3h，溶氧值为0.96mg/mL时失去平衡漂浮于水面。个体4和5在低氧胁迫24h，溶氧值为0.64mg/mL时仍维持正常游泳状态。低氧适应表型测定结果与前述低氧适应基因型检测结果相符。

本发明公开了一种决定养殖鱼类低氧适应表型的核苷酸序列，所述核苷酸序列的碱基序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。该低氧适应基因型来源于全基因组关联分析的显著性关联位点，位于鲤鱼2号染色体上的calsequestrin-2-like基因上游区域，包含启动子区长达179bp的插入/缺失突变，直接决定一种肌钙集蛋白样蛋白编码基因的转录水平，与鲤鱼低氧信号转导通路高度相关，且在其他养殖鱼类中具有一定通用性。本发明还公开了该低氧适应基因型的检测方法，以基因组DNA为模板，使用一对位于长片段插入/缺失突变两侧保守序列的扩增引物，通过PCR扩增和产物长度判别，进行基因型分型。本发明还公开了该低氧适应基因型及其检测方法用于养殖鱼类耐低氧品种培育中的用途。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (10)

1.决定鱼类低氧适应表型的核苷酸序列，其特征在于，包含如SEQ ID NO：1所示的碱基序列。

2.决定养殖鱼类低氧敏感表型的核苷酸序列，其特征在于，其碱基序列如SEQ IDNO:2所示。

3.用于鱼类低氧适应基因型的检测引物对，其特征在于，所述引物对为：如SEQ IDNO：3所示的碱基序列和如SEQ ID NO：4所示的碱基序列。

4.一种鱼类低氧适应基因型的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取待测鱼类的基因组DNA；

2)以步骤1)中的基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的一对引物对进行PCR扩增；

3)对步骤2)中得到的PCR扩增产物进行产物长度判定，若检测到PCR扩增产物中有符合第一检测值大小的产物存在，则判定该模板基因组DNA的待测个体为低氧适应基因型，若检测到PCR扩增产物中仅有符合第二检测值大小的产物存在，则判定该模板基因组DNA的待测个体低氧敏感基因型，其中，所述第一检测值大于所述第二检测值。

5.如权利要求4所述的鱼类低氧适应基因型的检测方法，其特征在于，所述鱼类为鲤鱼。

6.如权利要求4所述的鱼类低氧适应基因型的检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述待测鱼类处于幼鱼时期。

7.如权利要求4所述的鱼类低氧适应基因型的检测方法，其特征在于，步骤1)中，取所述待测鱼类的鳍条或血液样本提取基因组DNA。

8.如权利要求4所述的鱼类低氧适应基因型的检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述第一检测值为358bp，所述第二检测值为179bp。

9.一种用于鱼类低氧适应基因型的检测试剂盒，其包含如权利要求4所述的引物对。

10.如权利要求1或2所述的核苷酸序列或权利要求4所述的检测引物对于鱼类耐低氧品种检测、鉴定和培育中的用途。

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