CN113913535A - 一种用于鉴别蓝孔雀白羽性状的因果基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鉴别蓝孔雀白羽性状的因果基因及其应用，属于分子遗传育种领域。本发明公开的蓝孔雀白羽性状的因果基因为PMEL基因，PMEL低表达鉴别为孔雀白羽性状。与蓝孔雀相比，白孔雀中PMEL基因在mRNA水平上的表达显著降低(P＝0.013)，PMEL在白羽孔雀中几乎不表达的结果，说明孔雀白羽性状的形成与PMEL的低表达有关，通过白羽因果基因的PMEL表达量来鉴别是否为白羽。本发明白孔雀因果基因的鉴别在全球范围内尚属首次，尽管关于蓝孔雀白羽性状的经典遗传研究已有报道，但是鉴别影响白羽性状因果基因尚属首次，填补了该技术领域的空白，这为白羽孔雀的因果基因位点的分子选育技术提供了科学依据。

Description

一种用于鉴别蓝孔雀白羽性状的因果基因及其应用

技术领域

本发明涉及分子遗传育种领域，特别是涉及一种用于鉴别蓝孔雀白羽性状的因果基因及其应用。

背景技术

孔雀被视为“百鸟之王”，属于鸟纲、鸡形目、雉科、孔雀属，是最美丽的观赏鸟，有特殊的观赏价值，羽毛用来制作各种工艺品。按照传统的生物学分类，世界上共有2种孔雀，即绿孔雀(Pavo muticus)和蓝孔雀(P.cristatus)。此外，蓝孔雀全身都可以做为药材原料，具有很好的药用价值，加上其丰富绚丽的羽毛，常作为装饰品。蓝孔雀作为动物园和公园等场所的重要活体景观，具有重要的参观赏析的经济价值。

蓝孔雀的羽色类型丰富，存在有多个颜色突变表型，如野生型蓝孔雀、白羽蓝孔雀，即白孔雀、黑孔雀、杂色孔雀等。其中白孔雀作为蓝孔雀众多突变种中的一个羽色稀有变种，因其独特的白羽外形、羽毛如同丝绸般质地柔软细滑以及高贵华丽的白羽孔雀标本颇受人们青睐，正是如此，白孔雀的雏鸟、成鸟还是标本制品的售价均显著优于其他蓝孔雀，同时白孔雀能够具有正常的交配繁殖能力以及饲养模式和成本与蓝孔雀并无差异，因此其市场潜力巨大。但在正常情况下，孔雀的繁育过程中出现白孔雀的概率不足千分之一，加之白孔雀雏鸟普遍体质偏弱，大大限制了白孔雀种用性能及种苗供应。到目前为止，孔雀白羽形成的分子遗传机制尚不可知，造成白孔雀的因果基因尚无任何报道，这对培育纯种白孔雀繁殖群体造成了很大的不便，继而影响了白孔雀观赏产业价值的发挥。

在此背景下，为使蓝孔雀的白羽色资源特性得以持续保护和保存，亟需通过分子技术鉴别到与蓝孔雀白羽相关的因果基因及其因果突变，进而构建标记辅助选择技术加快并巩固白孔雀种用群体的扩群效果。目前关于蓝孔雀白羽形成的因果基因尚未可知，更没有任何关于蓝孔雀白羽性状分子鉴别技术。因此本技术通过成功鉴别蓝孔雀白羽性状因果基因并建立检测技术对于快速准确选育白孔雀种群具有重要的科学意义和经济价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴别蓝孔雀白羽性状的因果基因及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该因果基因PMEL在白羽孔雀中几乎不表达的结果，说明孔雀白羽性状的形成与PMEL的低表达有关，通过白羽因果基因的PMEL表达量来鉴别是否为白羽，这为快速选育白孔雀种群提供了科学依据。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种蓝孔雀白羽性状的因果基因在选育白孔雀种群中的应用，所述因果基因为PMEL基因。

优选的是，所述PMEL低表达鉴别为孔雀白羽性状。

本发明还提供一种蓝孔雀白羽性状的因果基因的检测方法，包括利用荧光定量PCR反应鉴别PMEL基因表达量的步骤。

优选的是，扩增引物为：

上游引物：5’-GGTGGTTTATCACTACCG-3’；

下游引物：5’-GTCGGTGATGCTGAACTG-3’。

优选的是，扩增反应体系为：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，2×SYBR Taq Mix 5μL，50×Rox Reference Dye 0.3μL，双蒸水2.7μL，cDNA1μL。

优选的是，扩增程序为：95℃10min，95℃15s，60℃30s，共40个循环。

本发明还提供一种鉴别蓝孔雀白羽性状的因果基因的方法，包括以下步骤：

步骤1：采用二代测序、三代测序辅以10×Genomics测序，对蓝孔雀基因组DNA进行测序、组装和和注释，构建蓝孔雀基因组草图；

步骤2：对蓝孔雀不同羽色的血液DNA进行混池重测序，并与构建的蓝孔雀基因组草图进行基因差异分析，得到羽色相关基因；

步骤3：对蓝孔雀不同羽色新生羽根样品转录组测序，并将转录本与与构建的蓝孔雀基因组草图进行比对，进行羽色相关基因的差异分析，获取与羽色相关基因的候选基因；

步骤4：对候选基因通过实时荧光定量PCR鉴别蓝孔雀白羽性状的因果基因。

优选的是，所述混池重测序包括SNP分型及质控、基因频率差异分析、差异位点基因注释以及差异表达基因等位基因频率分析。

优选的是，所述转录组测序包括差异表达基因分析、差异表达功能富集分析以及可变转录本分析。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本技术中蓝孔雀白羽基因的鉴别采用的研究技术先进，特别是采用了目前最先进的第三代测序技术来进行蓝孔雀基因组组装，保证了结果的精度和准度，为蓝孔雀白羽因果基因鉴别奠定扎实基础。

(2)白孔雀因果基因的鉴别在全球范围内尚属首次。尽管关于蓝孔雀白羽性状的经典遗传研究已有报道，但是鉴别影响白羽性状因果基因尚属首次，填补了该技术领域的空白。

(3)建立基于白羽因果基因的荧光定量检测分子手段即可靠、准确又便捷。在蓝孔雀白羽因果基因鉴别的基础上，优化建立基于白羽因果基因位点的荧光定量检测手段，相较于蓝孔雀白羽常规选育技术而言，白羽孔雀的因果基因位点的分子选育技术更精准，快速。

(4)本发明中所需检测的样品获取容易，仅需从待测孔雀的翅部静脉采血，对动物几乎无损伤，同时利用成熟的传统方法即可获取RNA样本，为本技术的实施提供便利。

(5)研究对象具有独特的观赏和经济价值。白孔雀是印度蓝孔雀的一个重要品变种，具有独特的观赏价值，研究白孔雀形成机制具有重大科学意义，极大丰富鸟类羽色研究。

(6)本发明验证了与蓝孔雀相比，白孔雀中PMEL基因在mRNA水平上的表达显著降低(P＝0.013)，PMEL在白羽孔雀中几乎不表达的结果，说明孔雀白羽性状的形成与PMEL的低表达有关，通过白羽因果基因的PMEL表达量来鉴别是否为白羽。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为蓝孔雀白羽性状因果基因的鉴别技术路线图；

图2为基因集证据支持统计；

图3为蓝白羽孔雀的等位基因频率差异；

图4为蓝白羽孔雀中差异表达基因及其功能富集分析；a：蓝白羽孔雀的转录组筛选差异表达基因变化情况；b：与黑色素沉积有关的基因；

图5为蓝白羽孔雀中影响白羽性状的潜在的因果基因；a：EDNRB在蓝孔雀和白羽孔雀羽根中表达情况；b：PMEL在蓝孔雀和白羽孔雀中表达情况；c：在mRNA水平上验证白孔雀中PMEL基因的表达情况。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1蓝孔雀白羽性状因果基因鉴别方法

1、蓝孔雀基因组de novo测序、组装和注释

1)实验动物和样品采集和样品制备

本技术中用于蓝孔雀基因组组装的样本源自江西省乐平市森泰特种养殖有限公司的一只外观完全符合蓝孔雀特征的雌孔雀，对受试个体翼部翅静脉采集全血约0.2mL并放于含EDTA抗凝剂的真空采血管中暂存，转运至实验室后保存于-20℃冰箱。采集了用于辅助基因组组装的全长转录本测序RNA肝脏和胸肌组织样各2份快速置于液氮中，后续转移到-80℃保存。采用苯酚/氯仿法提取蓝孔雀血液基因组DNA，采用Trizol法提取蓝孔雀肝脏和胸肌组织样RNA，并对DNA和RNA样品进行质量控制、浓度检测和标准化。

2)蓝孔雀全基因组de novo测序

将提取的质量合格的雌性蓝孔雀基因组DNA进行全基因组从头测序，本研究采用二代测序、三代测序辅以10X Genomics测序的方法进行高深度测序。将基因组DNA 100ng按照Illumina TruSeq Nano测序流程构建350bp的插入片段文库，用Nextera Mate PairSample Preparation Kit(Illumina)试剂盒制备Mate-pair文库，使用Illumina NovaSeq6000平台进行测序，得到原始数据；对于三代PacBio测序，基因组DNA由g-TUBE(Covaris)设备设置的对20kb以上的片段进行剪切，经末端修复和加A尾后，再在片段两端分别连接接头，制备20kb的单分子实时测序库，然后在PacBio RS-II平台上完成单分子测序；对于10XGenomics测序，每个GEM通过聚合酶链反应扩增，并添加P7测序接头用于Illumina测序。

3)蓝孔雀基因组组装

第一步，利用测序原始数据，用Megablast v2.2.26软件去除序列接头、被污染的和低质量的序列。

第二步，利用PacBio测序来控制和纠正错误。通过falcon软件组装已校正的数据，使用Overlap-Layout-Consensus的算法获得一致性序列，然后通过quvier软件进行校正。结合第二代测序数据，使用pilon软件重新校准一致性序列以提高准确性，获得高质量的一致性序列。

第三步，我们使用10X Genomics测序来辅助基因组组装。

第四步，利用Chicago测序数据辅助组装绘制基因组组装草图；最后，使用BWA软件将Illumina reads比对到基因组草图，使用pilon软件根据比对的结果纠正组装错误，最终获得基因组组装序列。利用BUSCO和CEGMA软件评估组装的完整性和测序的均匀性。

4)蓝孔雀基因组注释

蓝孔雀基因组的注释包括重复序列的注释、基因注释(包括基因结构和基因功能注释)和非编码RNA注释。

2、蓝孔雀白羽性状因果基因的鉴别

1)实验动物和样品采集和分子样品制备

采集了35只蓝孔雀和16只白羽孔雀血样用于全基因组混池重测序(采样方法同上)。此外，还采集了8只野生型羽色表型的蓝孔雀的RNA新生羽根样(公母各半)和8只白羽蓝孔雀的RNA新生羽根样(公母各半)，总计共16份(采样方法同上)。采用苯酚/氯仿法提取蓝孔雀血液基因组DNA，采用Trizol法提取蓝孔雀肝脏和胸肌组织样RNA，并对DNA和RNA样品进行质量控制、浓度检测和标准化。

2)全基因组混池重测序

将1)中提取的质量合格的蓝、白羽孔雀的血液基因组DNA样各为一池，使用TruseqNano DNA HT Sample preparation Kit(Illumina USA)试剂盒将每个池1.5μg的DNA用于构建测序文库。每池DNA通过超声破碎到350bp大小，进行末端修复、A-尾、用全长接头连接，用于Illumina测序和进一步的聚合酶链反应扩增。在Agilent 2100生物分析仪上纯化聚合酶链反应扩增的测序文库(AMPure XP系统)，分析序列大小分布，并使用实时聚合酶链反应进行定量。上述构建的文库在Illumina NovaSeq平台上测序，产生150bp的双末端序列，插入片段大小约为350bp。

①数据过滤：混池测序原始数据通过以下步骤进行过滤：(1)过滤掉含有接头序列的reads；(2)当单端测序read中含有的低质量(≤5)碱基数超过该条read长度比例的50％时，需要去除此对paired reads；(3)当单端测序read中N的含量超过该条read长度比例的10％时，需要去除此对paired reads；(4)保留Q20高于90％测序过程中碱基正确识别率在99％以上)和Q30高于85％以上(测序过程中碱基正确识别率在99.9％以上)的reads。

②SNP分型及质控：使用BWA参数“mem-T 4-k 32-M-R”，将clean reads比对到组装好的蓝孔雀参考基因组上，使用SAMtools软件(Li et al.,2009)将校准文件转换为BAM文件(参数设置为-bS-t)，使用SAMtools命令“rmdup”去除PCR扩增产生的重复序列。单核苷酸多态性(SNPs)和插入/缺失(Indels)(<50bp)通过基因组变异检测软件GATK v4.0进行检测，获得蓝白羽孔雀的SNP变异信息，再利用Plink v1.9软件过滤次等位基因(MAF)小于0.01和群体基因型检出率小于90％的SNPs，最终得到全基因组SNP变异信息数据集，用于后续孔雀白羽性状的遗传机理分析。

③基因频率差异分析

将野生型羽色和全白蓝孔雀全基因组混池重测序数据做为输入文件，利用SAMtools命令中的“mpileup”将两个池的clean data与蓝孔雀基因组进行比对，然后使用Population2软件计算蓝白羽孔雀等位基因频率差异，过滤掉覆盖度小于1％(12X)和大于99％(99X)的位点和次等位基因频数(MAF)小于8的位点。等位基因频率差异的显著性由Fisher精确检验估计，并用R包manhattan构建曼哈顿图。此外，利用snpEff软件对-log10(P-value)大于30的点上下游50kb进行基因注释，以作为候选基因。

3)蓝孔雀不同羽色新生羽根样品转录组测序

①RNA测序：将所提取的蓝白羽孔雀羽根组织总RNA送诺禾致源公司(天津)进行转录组测序。检测合格的RNA样用于进行Iso-Seq文库构建，根据文库的有效浓度及数据产出需求运用PacBio Sequel平台进行测序。

②转录组数据质控及分析

测序完成后对原始下机数据进行去接头和低质量(长度小于50bp)的reads，采用软件SMRTlink v5.1对输出进行过滤和处理，获得Subreads序列，对Subreads序列进行自我纠错形成环形一致性序列(CCS)，获取含有5'primer，3'primer和PolyA尾的全长非嵌合序列(FLNC)，使用ICE算法将同一转录本的FLNC序列进行聚类，得到cluster consensus序列，并采用非全长的序列对得到的consensus序列进行校正(polishing)，最终获得高质量的Polished consensus序列进行后续分析。利用LoRDEC软件基于二代高质量数据对三代reads进行测序错误校正，使用GMAP软件将Polished consensus序列比对到蓝孔雀的参考基因组。

③基因结构和差异富集分析

根据Polishied consensus序列和参考基因组的比对结果，使用TAPIS软件对Polishied consensus序列进行进一步的校正、聚类去冗余得到最终的高质量的isoforms，然后进行转录本特征、可变剪接(AS)、多聚腺苷酸化(APA)、新基因和新转录本鉴定、新基因数据库注释、转录因子分析、LncRNA预测等分析。开展基因和转录本表达水平分析、差异转录本分析、差异可变剪接(DAS)分析及差异基因的GO、KEGG富集分析和聚类分析。

④羽色相关基因的差异表达分析

使用STAR v2.5.3a将转录组clean reads与蓝孔雀的参考基因组进行比对，然后利用Subread软件中的featureCounts程序和StringTie v1.3.3软件对蓝白羽孔雀基因组进行有参转录组组装和基因表达水平分析。在设定fold change>2和P<0.01的条件下，通过DESeq2鉴定蓝羽和白羽之间的差异表达基因(Differentially expressed genes，DEGs)。随后，通过GO和KEGG数据库对DEGs进行注释和功能富集分析。

4)EDNRB和PMEL可变转录本分析

利用SAMtools软件中的“view”命令提取蓝白羽孔雀RNA-seq数据中EDNRB和PMEL基因区域，使用IGV v2.8.0软件可视化提取的reads区域。

5)白羽候选因果基因表达量的实时荧光定量PCR验证

使用Trizol法从16份蓝白羽孔雀羽根样中提取总RNA。利用PrimeScript^TM RTreagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa Bio.Inc,Dalian,China)试剂盒反转录RNA，按照说明书进行。针对目的基因PMEL用Primer5设计引物，β-actin做为内参基因，所用引物序列见表1。

表1RT-qPCR中PMEL基因序列引物

实时荧光定量PCR的操作步骤如下：

(1)每份反转录RNA吸取1μL放入同一无菌无酶200μL的离心管中，混匀，然后将混合液进行逐级稀释至1x、10x、100x、1000x、10000x，用于做标准曲线。

(2)PMEL基因PCR扩增

采用10μL扩增体系，包括上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，SYBR Taq Mix(2x)5μL，Rox Reference Dye(50x)0.3μL，双蒸水2.7μL，cDNA1μL；PCR扩增程序为95℃10min，95℃15s，60℃30s，共40个循环，在7900HT RT-qPCR仪(ABI)上进行扩增。每个个体做3次重复，采用2^-△△CT法计算目的基因相对于内参基因的表达量，使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析。

上述蓝孔雀白羽性状因果基因的鉴别技术路线图见图1。

3、结果与分析

(1)蓝孔雀基因组de novo测序组装结果

采用了第三代PacBio单分子实时测序技术、第二代Illumina测序技术和10XGenomics测序技术结合的方法组装了蓝孔雀基因组。共构建了2个文库，总测序量为164.03Gb。蓝孔雀基因组大小为1.05Gb；10X Genomics测序平台获得总测序量112.57Gb，覆盖深度为92×；同时采用PacBio平台进行测序，总测序量为110.74Gb，覆盖深度为103×。从三种测序方法中共获得了387.34Gb的测序数据和362×的总测序深度，所有上机测序产生的数据统计结果见表2。

本研究中，我们组装得到的蓝孔雀全基因组草图contig N50长度达6.2Mb，scaffold N50长度达11.4Mb。共获得1 198条contig，726条scaffold，最长的contig长度约为23.77Mb，最长的scaffold长度约为38.78Mb。

表2蓝孔雀基因组测序原始数据统计

序列一致性评估结果表明，全部小片段reads比对到基因组的比对率约为98.05％，覆盖率约为99.87％，说明reads和组装得到的基因组有很好的一致性。组装基因组的完整性评估结果表明，从6个真核模式生物中筛选出的248个核心基因中组装出了220个基因(88.71％)，说明组装结果较完整。利用BUSCO数据库预测出97.4％的完整基因，包括96.8％的完整单拷贝基因，从Aves数据集中的2586个直系同源单拷贝基因中组装出2519个(97.4％)完整单拷贝基因(表3)，说明组装结果较完整。

表3蓝孔雀基因组BUSCOs评估结果

(2)蓝孔雀基因组注释结果

1)重复序列注释：重复序列可分为串联重复序列(Tandem repeat)和散在重复序列(Interspersed repeat)两大类。其中串联重复序列包括有微卫星序列，小卫星序列等；散在重复序列又称转座子元件，包括以DNA-DNA方式转座的DNA转座子和反转录转座子(Retrotransposon)。常见的反转录转座子类别有LTR，LINE和SINE等。结果显示蓝孔雀基因组中含有159Mb的重复序列，占整个基因组的15.20％，其中，包括1.27％的串联重复序列、14.12％的转座元件和7.34％的转座元件蛋白。

2)基因结构注释：从头预测、同源预测和转录本信息三种方式对蓝孔雀基因组基因结构进行预测，从图2中可以得知de novo共预测出17098个编码基因，同源预测共预测出14461个编码基因，转录组测序共预测出17128个编码基因，三种预测方式同时支持的基因有12167个基因，结合三种预测方式共得到19465个编码基因，这表明蓝孔雀基因组基因结构预测的可靠性。

3)基因功能注释：预测的基因集最后通过6个公共数据库注释，包括NR、Swissprot、KEGG、InterPro、GO和Pfam进行功能注释，其中有15766个基因被注释出来，占总基因的81％。其中，NR、Swissprot、KEGG和InterPro四个公共数据库共同预测出的基因有13372个。

4)非编码RNA注释：通过与已知ncRNA库进行比对，我们注释到了354个微小核糖核酸、308个转移核糖核酸、151个核糖体核糖核酸和334个miRNA，308个tRNA，151个rRNA和334个snRNA。

(3)蓝孔雀白羽性状因果基因的鉴别

1)野生型羽色和白羽蓝雀基因频率差异和差异表达基因分析：使用SAMtools软件中的“mpileup”命令将两个重新测序的clean data与蓝孔雀基因组进行比对，利Population2软件进行过滤以计算等位基因频率差异，显著性由Fisher精确检验估计。我们提取了-log10(P-value)大于30的点上游和下游50kb序列进行基因注释和基因功能富集分析。结果发现，Scaffold196中的EDNRB和Scaffold 144中的PMEL基因与羽毛色素沉积显著相关(图3)。

2)蓝白羽孔雀的转录组筛选差异表达基因：共检测到69个下调基因和52个上调基因(图4a)，其基因功能富集分析发现有10个上调基因(TRYP1、TYR、PMEL、EDNRB、OCA2、SLC24A5、SOX10、MC1R、SLC45A2和TRPM1)与黑色素沉积有关，且EDNRB、OCA2、PMEL、SOX10、TYR和TYRP1显著富集在黑色素合成过程中，P值达到1E-12(图4b)。

为了进一步分析DEGs的等位基因频率差异位点，我们计算了蓝孔雀和白孔雀中10个与色素沉积相关的基因等位基因频率，使用snpEff软件注释了这些位点的变异类型。我们发现有两个差异位点位于PMEL上，一个位点位于EDNRB上，但没有一个差异位点是明显的功能突变，如错义突变、剪接突变或无义突变(表4)。

表4蓝白羽孔雀差异表达基因的等位基因频率

注：B：蓝孔雀，W：白孔雀。

3)蓝孔雀白羽性状因果基因的鉴定和验证:为了进一步验证孔雀中白羽的形成与PMEL和EDNRB的差异表达有关，我们RNA-seq数据提取了PMEL和EDNRB的转录本，并用IGV进行可视化。结果发现，EDNRB在蓝孔雀和白羽孔雀羽根中正常表达(图5a)，而PMEL在蓝孔雀中表达正常，在白羽孔雀中几乎没有表达(图5b)，这表明孔雀中白羽的形成很可能与PMEL的低表达有关。为了进一步验证PMEL在白羽孔雀中的表达情况，我们利用蓝孔雀和白孔雀的羽根组织cDNA对PMEL进行了RT-qPCR检测。结果表明，与蓝孔雀相比，白孔雀中PMEL基因在mRNA水平上的表达显著降低(P＝0.013)，这进一步验证了PMEL在白羽孔雀中几乎不表达的结果(图5c)。综合以上结果，我们得出白羽性状的形成与PMEL的低表达有关。

实施例2蓝孔雀白羽性状因果基因分子检测和应用

利用上述表1中PMEL基因序列引物，开展荧光定量PCR反应(RT-qPCR)，具体反应体系和条件为：采用10μL扩增体系，包括上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，SYBR Taq Mix(2x)5μL，Rox Reference Dye(50x)0.3μL，双蒸水2.7μL，cDNA 1μL；PCR扩增程序为95℃10min，95℃15s，60℃30s，共40个循环，在7900HT RT-qPCR仪(ABI)上进行扩增。每个个体做3次重复，采用2^-△△CT法计算目的基因相对于内参基因的表达量，使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，进而通过白羽因果基因的PMEL表达量来鉴别是否为白羽。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 江西农业大学

<120> 一种用于鉴别蓝孔雀白羽性状的因果基因及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtggtttat cactaccg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcggtgatg ctgaactg 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acacggtatt gtcaccaact 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taacaccatc accagagtcc 20

Claims (9)

1.一种蓝孔雀白羽性状的因果基因在选育白孔雀种群中的应用，其特征在于，所述因果基因为PMEL基因。

2.如权利要求1的应用，其特征在于，所述PMEL低表达鉴别为孔雀白羽性状。

3.一种蓝孔雀白羽性状的因果基因的检测方法，其特征在于，包括利用荧光定量PCR反应鉴别PMEL基因表达量的步骤。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，扩增引物为：

上游引物：5’-GGTGGTTTATCACTACCG-3’；

下游引物：5’-GTCGGTGATGCTGAACTG-3’。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，扩增反应体系为：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，2×SYBR Taq Mix 5μL，50×Rox Reference Dye 0.3μL，双蒸水2.7μL，cDNA 1μL。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，扩增程序为：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃30s，共40个循环。

7.一种鉴别蓝孔雀白羽性状的因果基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：采用二代测序、三代测序辅以10×Genomics测序，对蓝孔雀基因组DNA进行测序、组装和和注释，构建蓝孔雀基因组草图；

步骤2：对蓝孔雀不同羽色的血液DNA进行混池重测序，并与构建的蓝孔雀基因组草图进行基因差异分析，得到羽色相关基因；

步骤3：对蓝孔雀不同羽色新生羽根样品转录组测序，并将转录本与与构建的蓝孔雀基因组草图进行比对，进行羽色相关基因的差异分析，获取与羽色相关基因的候选基因；

步骤4：对候选基因通过实时荧光定量PCR鉴别蓝孔雀白羽性状的因果基因。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述混池重测序包括SNP分型及质控、基因频率差异分析、差异位点基因注释以及差异表达基因等位基因频率分析。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述转录组测序包括差异表达基因分析、差异表达功能富集分析以及可变转录本分析。

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