CN118441029A - 马口鱼性别鉴定标记、鉴定方法及应用 - Google Patents

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CN118441029A CN202410520916.3A CN202410520916A CN118441029A CN 118441029 A CN118441029 A CN 118441029A CN 202410520916 A CN202410520916 A CN 202410520916A CN 118441029 A CN118441029 A CN 118441029A
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周春花
刘雨鹭
朱忆秋
王蓉蓉
林锋
吴小平
欧阳珊
俞吉波
邓亚菲
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本发明涉及分子生态学领域，具体涉及马口鱼性别鉴定标记、鉴定方法及应用。马口鱼性别鉴定标记，选自Mar26、Mar28、Mar37和Mar38至少一种；其中，Mar26由SEQ ID NO：51所示上游引物和SEQ ID NO：52所示下游引物组成；Mar28由SEQ ID NO：55所示上游引物和SEQ ID NO：56所示下游引物组成；Mar37由SEQ ID NO：73所示上游引物和SEQ ID NO：74所示下游引物组成；Mar38由SEQ ID NO：75所示上游引物和SEQ ID NO：76所示下游引物组成，更进一步地，所述性别鉴定标记为Mar28，所提供的性别鉴定标记能够准确、高效地鉴定出马口鱼的性别，而不受发育时期的影响。本发明建立的马口鱼遗传性别鉴定的方法能够有助于马口鱼单性育种中的应用。

Description

马口鱼性别鉴定标记、鉴定方法及应用
技术领域
本发明涉及分子生态学领域，具体涉及马口鱼性别鉴定标记、鉴定方法及应用。
背景技术
马口鱼是一种重要的淡水养殖鱼类，在体型和体色等方面呈现出性别二态性。雄性马口鱼不仅在生长速度上快于雌性，繁殖期雄鱼的体色会呈现出蓝绿色花纹，具有较高的观赏价值。雌鱼则平淡无奇，不受消费者的青睐。因此实现马口鱼全雄化养殖可有效提高物种产量和经济效益。这些养殖鱼类的性别二态性现象使性别控制育种在水产养殖中的作用日益重要。
在性别鉴定标记的开发方面，邱晴等对马口鱼精巢和卵巢进行RAPD扩增分析，筛选出11对能够扩增出雌雄差异条带的引物。但是在性腺发育早期雌雄鱼没有明显的外部形态差异，因此有必要开发一种快速、高效的性别鉴定标记。
近几十年来，RAPD、SSR、AFLP等方法已成功用于开发多种鱼类的性别鉴定标记。但是这些分子标记存在效率低、重复性差等缺陷。基于高通量测序筛选性别鉴定标记的技术不仅可以降低测序成本，缩短测序周期，并且在标记的普适性和重复性方面存在较大的优势。全基因组重测序是一种基于染色体水平的基因组对物种的全基因组进行重新测序的方法，通过与参考基因组比较，能够检测出全基因组范围内的SNP、Indel等变异信息，从而获得个体或群体的分子遗传信息。与其他测序技术相比，全基因组重测序具有测序成本低、生物信息学分析简单等优势，已成为性别鉴定标记开发的重要手段。BSA是基于全基因组重测序技术发展起来的，它能够快速识别基因组内的特定基因和变异区域，筛选出与表型相关联的标记，是一种简便高效的性状定位技术。
本申请旨在对雌雄马口鱼进行BSA测序，建立了一种快速、准确、以PCR为基础的马口鱼的遗传性别鉴定方法，为马口鱼的性别决定和分化相关研究、性别控制育种和养殖管理奠定基础。
发明内容
基于现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供马口鱼性别鉴定标记、鉴定方法及应用，所提供的性别鉴定标记能够准确、高效地鉴定出马口鱼的性别，而不受发育时期的影响。本发明建立的马口鱼遗传性别鉴定的方法能够有助于马口鱼单性育种中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
本发明目的之一在于提供马口鱼性别鉴定标记，所述性别鉴定标记选自Mar26、Mar28、Mar37和Mar38至少一种；
其中，Mar26由SEQ ID NO：51 所示上游引物和SEQ ID NO：52 所示下游引物组成；
Mar28由SEQ ID NO：55 所示上游引物和SEQ ID NO：56 所示下游引物组成；
Mar37由SEQ ID NO：73 所示上游引物和SEQ ID NO：74 所示下游引物组成；
Mar38由SEQ ID NO：75 所示上游引物和SEQ ID NO：76 所示下游引物组成。
进一步地，所述性别鉴定标记为Mar28。
本发明的另一目的在于提供一种马口鱼性别鉴定方法，所述鉴定方法包括：
采集待测样品；
对待测样品进行DNA提取，得到待测样品的DNA；
利用上述性别鉴定标记对待测样品的DNA进行PCR扩增；
PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测；
利用电泳检测结果对马口鱼的性别进行判断。
进一步地，所述待测样品为马口鱼的肌肉或尾鳍组织。
进一步地，对待测样品进行DNA提取的方法为，将切取的马口鱼肌肉或者尾鳍组织加入裂解液和蛋白酶K中充分匀浆，然后加入RNase A，孵育，转移至全自动核酸提取纯化仪中运行BMGB程序，运行完成后即可获得马口鱼的基因组DNA。
进一步地，还包括对基因组DNA使用NanoDrop One分光光度计检测基因组DNA的浓度和纯度，采用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整度。
进一步地，所述PCR扩增采用的PCR扩增体系包括：
2×Rapid Taq Master Mix12.5 μL；
10 μmol/L上下游引物各1μL；
DNA1μL；
ddH2O9.5 μL。
进一步地，所述PCR扩增采用的PCR扩增程序为：
94 ℃预变性5 min；
94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，30个循环；
72 ℃ 10 min。
进一步地，所述琼脂糖凝胶的浓度为1%。
本发明的又一目的在于提供的上述性别鉴定标记或者上述鉴定方法在马口鱼单性育种中的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：
1. 本发明通过BSA筛选到59637个马口鱼性别相关SNP位点（雄性杂合，雌性纯合），并结合CQ法筛选到45个性别特异性区域，基于性别特异性序列开发出马口鱼性别鉴定标记，建立了基于PCR鉴定马口鱼遗传性别的方法。基于PCR的检测方法是一种准确、快速和经济的遗传性别鉴定工具。对于性成熟的马口鱼，在繁殖季节可通过体表颜色辨别雌雄。但处于发育早期和非繁殖季节的马口鱼个体难以通过体表形态分辨雌雄个体。性别鉴定标记能够准确、高效地鉴定出马口鱼的性别，而不受发育时期的影响。本发明建立的马口鱼遗传性别鉴定的方法将有助于其分子育种工作的开展，特别是在马口鱼单性育种中的应用。
2. 本申请基于CQ法筛选的性别特异性区域片段较长，检测过程方便且成本低，完成引物设计后，只需通过PCR扩增和凝胶电泳即可确定所检测物种的遗传性别。
附图说明
图1为实施例中用于重测序文库构建的马口鱼基因组DNA电泳图 (Marker: 15000bp)；
图2 为实施例中4对引物在6尾马口鱼中的PCR扩增电泳图；
图3 为实施例中Mar28在40尾马口鱼中的PCR扩增电泳图，其中NC为阴性对照，M为DL1000 Marker；
图4为Mar28扩增片段在雌雄马口鱼中的序列比对结果；其中，“-”表示缺失序列，红色表示雌雄序列的碱基差异，蓝色框出部分为引物位置。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐述本发明，而不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所诱导的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
1. 样本采集和DNA提取
实验所用的马口鱼采自江西齐力实业有限公司养殖基地。于2023年6月采集同批次性成熟雌雄鱼各25尾（体长8.20±0.89 cm，体重7.39±2.80 g），用于BSA测序的混池构建。另于2023年9月采集人工养殖群体（雌雄各20尾成鱼：体长12.38±0.90 cm，体重23.60±4.93 g），用于验证性别鉴定标记的通用性。通过表型观察和性腺解剖形态鉴定马口鱼的性别。剪取肌肉和尾鳍立即置于液氮中速冻后转移至-80 ℃保存直至DNA提取。
使用Baypure磁珠法动物组织基因组DNA提取试剂盒（湾区生物，广州）提取马口鱼的基因组DNA。
步骤如下：切取不多于15 mg的肌肉或尾鳍组织，加入200 μL裂解液和20 μL蛋白酶K后充分匀浆，然后加入10 μL RNase A，60 ℃孵育1 h，转移至全自动核酸提取纯化仪(BBEX-32) 中运行“BMGB”程序，运行完成后即可获得马口鱼的基因组DNA。使用NanoDropOne分光光度计 (Thermo Fisher Scientific) 检测基因组DNA的浓度和纯度，采用1% 琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整度。
将提取的雌雄各25尾马口鱼基因组DNA经NanoDrop分光光度计检测，结果显示，DNA平均浓度为275.92 ng/μL，OD260/OD280均在1.8~2.0之间。1%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，DNA条带清晰，无严重降解，结果见图1。表明基因组DNA质量较高，可用于BSA测序的文库构建。
2. 文库构建和BSA测5E8F
将质检合格的雌雄马口鱼基因组DNA分别等量混合，构建雌、雄2个马口鱼基因组DNA混池。使用Covaris超声波破碎仪将DNA样品打断为200-400 bp的短片段，经过末端修复、加ployA尾和测序接头、纯化、PCR扩增，最后进行PCR产物环化，完成文库构建。
文库构建完成后，使用Qubit 3.0（Life Technologies, Carlsbad，美国)测定DNA浓度并对文库进行初步定量。使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent，德国）对文库的插入片段进行检测，使插入片段大小符合预期。使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。最后，基于DNBSEQ平台对混池进行BSA测序，每个混池产生20 Gb数据。
3. 原始数据过滤和质量控制
测序得到的原始图像数据文件经过碱基识别 (Base Calling) 转化为原始测序序列 (Raw reads)，使用fastp (0.20.1) 对原始数据进行质控与过滤得到有效数据(Clean reads)。过滤标准如下：(1) 剔除序列中的接头序列；(2) 去除reads尾部的polyG和polyX（最短长度为10bp）；(3) 以滑窗的方式统计窗口内的碱基并计算平均质量值，剪裁掉低质量的滑窗；(4) 剔除N个数大于5的reads；(5) 剔除质量低于15且碱基占比高于40%的reads；(6) 剔除过滤后长度低于15bp的reads。
使用bwa软件 (0.7.17) 将所有样本的Clean reads与注释的雌性马口鱼参考基因组进行比对。使用samtools软件将比对结果从sam文件转为排序后的bam文件并进行重复去除。使用python脚本统计比对率及覆盖度。
结果：基于BSA测序，马口鱼雄性和雌性混池分别产生21.54 Gb和28.20 Gb的原始数据，经过数据过滤和质量控制，分别获得20.73 Gb和26.98 Gb的有效数据。Q20分别为98.96%和99.03%，Q30分别为95.64%和95.92%，GC含量分别为38.95和38.94%（结果见表1）。
将有效数据去重后，雄性混池和雌性混池分别获得142668885条和186590651条序列。通过与参考基因组比对，分别有141763631条和185468646条序列比对到参考基因组上，比对率分别为99.37%和99.40%，对参考基因组的覆盖度为96.33%和96.44%，平均测序深度为24.22 X和31.46 X（结果见表2）。
表1：BSA测序数据统计
表2：雌雄混池与参考基因组的比对结果统计
4. 性别相关SNP和Indel的鉴定和定位
基于比对结果文件，使用GATK软件 (4.2.5.0) 对样本进行变异检测，并对鉴定到的SNP和Indel进行过滤（过滤掉测序深度低于5X，高于100X的位点），具体过滤标准如下：SNP的过滤参数为“ QD<2.0 || QUAL<30.0 || SOR>3.0 || FS>60.0 || MQ<40.0 ||MQRankSum<-12.5 || ReadPosRankSum<-8.0 ”，Indel的过滤参数为“ QD<2.0 || QUAL<30.0 || FS>200.0 || MQ<40.0 || ReadPosRankSum<-20.0 ”。使用ANNOVAR软件(2020060) 对鉴定到的SNP和Indel进行注释。
筛选出在雄性个体中基因型为杂合、雌性个体中为纯合并位于外显子上的位点，作为与性别相关的差异位点。使用Circos (v0.69) 绘制性别相关的突变在基因组中的分布。计算性别相关位点在每个滑窗 (100 kb) 中的数量，并使用将其在基因组上的分布可视化。
结果如下：
通过GATK软件对样本中的变异进行鉴定和过滤后，在雄性混池中分别获得12004059个SNPs和3213780个Indels，雌性混池中分别获得12178212个SNPs和3304134个Indels。雄性混池中的杂合位点为9079518个，雌性混池中的纯合位点为7488256个（见表3）。
基于变异鉴定结果筛选出59637个性别相关（雄性杂合、雌性纯合且位于外显子上的变异）的SNP和3503个Indel位点。
表3：雌雄混池中的变异统计
5. 性别特异性区域的筛选
参考染色体商法 (Chromosome quotient, CQ) 筛选马口鱼雌性特异性序列区域。计算每个滑窗 (1 kb) 中的CQ值：CQ = Hm/Hf（Hm为雄性混池比对到参考基因组的reads数目；Hf为雌性混池比对到参考基因组的reads数目），筛选出CQ<0.2且Hf>30的雌性特异性区域（即在雄性混池中有reads覆盖，而在雌性混池中无reads覆盖的区域）。基于整合基因组浏览器 (Integrative Genomic Viewer, IGV) 软件查看并确认筛选到的雌性特异性区域。
6. 性别鉴定标记的开发和验证
提取性别特异性区域前后各1 kb的侧翼序列，使用Primer Premier (6.0) 设计普通PCR扩增引物，送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。通过2轮PCR扩增筛选性别特异性区域的引物：首先以雌雄各3尾马口鱼的基因组DNA作为模板，对引物进行初步筛选，针对扩增条带不清晰或无目的条带的引物，设置退火梯度以寻找最适退火温度，直至获得清晰完整的目的条带；对于符合预期的引物，随机使用马口鱼群体（雌雄各20尾）进一步验证引物的性别特异性。
PCR扩增采用25 μL体系，包括2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1μL、DNA 1μL、ddH2O 9.5 μL。同时以ddH2O为模板作为阴性对照。PCR扩增程序包括：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10min，4 ℃保存。PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。
针对性别特异性区域的引物，在验证的马口鱼群体（雌雄各20尾）中均扩增出雌雄差异条带后，PCR扩增产物经纯化处理后与PMD-18载体连接，转入DH5α大肠杆菌感受态细胞，挑选出符合预期的阳性克隆菌落，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，最后使用SnapGene软件 (6.0)进行雌雄序列比对分析。
结果如下：
CQ分析筛选得到45个马口鱼性别特异性区域 (CQ<0.2)，经IGV检查后，基于侧翼序列设计50对引物，对31个性别特异性区域进行验证（表4）。随机选择雌雄各3尾马口鱼对50对引物进行初步筛选，其中4对引物（Mar26、28、37和Mar38）扩增条带具有雌雄差异（图2）。
分别对4对引物进行群体验证，结果显示，Mar28在20尾马口鱼雄性个体中均扩增出两条带（509bp和814bp），而在20尾雌性个体中均扩增出单一条带 (509bp)（图3）。Mar28引物扩增的雌雄序列对比结果见图4。其余3对引物的扩增条带不能在群体中的所有个体中反映出雌雄差异。
表4：马口鱼性别特异性区域引物序列
本发明通过BSA筛选到59637个马口鱼性别相关SNP位点（雄性杂合，雌性纯合），并结合CQ法筛选到45个性别特异性区域，基于性别特异性序列开发出马口鱼性别遗传鉴定标记，建立了基于PCR鉴定马口鱼遗传性别的方法。基于PCR的检测方法是一种准确、快速和经济的遗传性别鉴定工具。对于性成熟的马口鱼，在繁殖季节可通过体表颜色辨别雌雄。但处于发育早期和非繁殖季节的马口鱼个体难以通过体表形态分辨雌雄个体。性别鉴定标记能够准确、高效地鉴定出马口鱼的性别，而不受发育时期的影响。本发明建立的马口鱼遗传性别鉴定的方法将有助于其分子育种工作的开展，特别是在马口鱼单性育种中的应用。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本申请进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本申请的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，其均应涵盖在本申请请求保护的技术方案范围当中。

Claims (10)

1.马口鱼性别鉴定标记，其特征在于，所述性别鉴定标记选自Mar26、Mar28、Mar37和Mar38至少一种；
其中，Mar26由SEQ ID NO：51 所示上游引物和SEQ ID NO：52 所示下游引物组成；
Mar28由SEQ ID NO：55 所示上游引物和SEQ ID NO：56 所示下游引物组成；
Mar37由SEQ ID NO：73 所示上游引物和SEQ ID NO：74 所示下游引物组成；
Mar38由SEQ ID NO：75 所示上游引物和SEQ ID NO：76 所示下游引物组成。
2.根据权利要求1所述的马口鱼性别鉴定标记，其特征在于，所述性别鉴定标记为Mar28。
3.一种马口鱼性别鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括：
采集待测样品；
对待测样品进行DNA提取，得到待测样品的DNA；
利用权利要求1或2中的性别鉴定标记对待测样品的DNA进行PCR扩增；
PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测；
利用电泳检测结果对马口鱼的性别进行判断。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述待测样品为马口鱼的肌肉或尾鳍组织。
5. 根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，对待测样品进行DNA提取的方法为，将切取的马口鱼肌肉或者尾鳍组织加入裂解液和蛋白酶K中充分匀浆，然后加入RNase A，孵育，转移至全自动核酸提取纯化仪中运行BMGB程序，运行完成后即可获得马口鱼的基因组DNA。
6. 根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，还包括对基因组DNA使用NanoDropOne分光光度计检测基因组DNA的浓度和纯度，采用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整度。
7.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增采用的PCR扩增体系包括：
2×Rapid Taq Master Mix12.5 μL；
10 μmol/L上下游引物各1μL；
DNA1μL；
ddH2O9.5 μL。
8.根据权利要求3或7所述的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增采用的PCR扩增程序为：
94 ℃预变性5 min；
94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，30个循环；
72 ℃ 10 min。
9.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶的浓度为1%。
10.权利要求1或2所述的性别鉴定标记或者权利要求3-9任一项所述的鉴定方法在马口鱼单性育种中的应用。
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