CN108424971A - 一种凡纳滨对虾c239t单核苷酸多态性标记候选序列的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的是一种凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记序列的筛选方法，包括以下步骤：（1）筛选候选序列（2）筛选候选SNP位点（3）设计特异性引物。本发明可以在没有已知的凡纳滨对虾基因组DNA单核苷酸多态性位点的信息下，通过转录组混合样测序，筛选出候选序列及候选SNP位点，为凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记的筛选及检测打下基础，在这个基础上利用生物信息学分析筛选C239T单核苷酸多态性位点；并采用PAMSA（PCR amplification of multiple specific alleles）方法设计特异性引物，不仅可便捷的通过聚丙酰胺凝胶电泳完成凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性检测、验证及基因分型，而且筛选检测费用低、操作简便快速。

Description

一种凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记候选序列的筛选 方法

技术领域

本发明属于凡纳滨对虾DNA分子遗传标记技术，涉及的是一种凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记序列的筛选方法。

背景技术

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是对虾属种世界养殖产量最高的物种，俗称南美白对虾(White pacific shrimp)，其原产于中南美洲沿岸海域，我国早在1988年就从美国夏威夷引种并开展人工育苗的研究。由于凡纳滨对虾对白斑病毒(WSSV)具有较好的抵抗力，所以2000年后我国的凡纳滨对虾产量呈爆发式增长，在2016年我国的养殖总产量已达93万吨，占对虾养殖总产量的73％以上，是我国最重要对虾养殖品种。在我国，伴随着凡纳滨对虾产业的快速发展，对苗种的需求逐年增长，海外进口亲虾和虾苗已经无法满足日益增长的需求了，开展凡纳滨对虾的遗传改良和品种选育，开发自主知识产权的品种迫在眉睫。目前我国凡纳滨对虾的遗传选育还是以传统选育为主，采用家系选育策略，结合家系内个体选择开展性状改良工作，其改良周期需累积多个选育世代。为了弥补传统选育成本高，耗时长，工作量大的缺点，研究人员提出采用分子标记辅助育种，全基因选择育种等技术提高凡纳滨对虾性状选育效率。然而，由于凡纳滨对虾全基因DNA信息尚未完成公开发布，与大西洋鲑鱼等海水养殖鱼类相比，目前凡纳滨对虾分子标记开发的数量和质量还不能满足其分子育种的需求。

作为新一代的DNA分子标记，单核苷酸多态性标记是基因组中含量最丰富的分子标记，并且遗传稳定性高、分型准确，易于实现高通量、自动化的检测，是当前凡纳滨对虾选育群体遗传背景调查、个体选育、家系系谱鉴定和高密度遗传连锁图谱构建的首选DNA分子标记之一。但凡纳滨对虾全基因组DNA信息匮乏，有关其单核苷酸多态性标记开发、应用的研究报道不多。Yu等人报道了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的SNP标记筛选和检测，所采用的分型方法是常规的Sangerc测序分型。该方法SNP标记检测和应用的成本较高。而凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的SNP标记筛选的检测分型的过程中，最关键的是凡纳滨对虾单核苷酸多态性标记候选序列的筛选方法和候选SNP位点筛选方法，筛选出了多态性标记候选序列及候选SNP位点，就可以实现对凡纳滨对虾单核苷酸多态性标记的筛选及检测，从而实现对凡纳滨对虾单核苷酸多态性标记验证及基因分型，有利于斑节虾系谱鉴定、遗传连锁图谱构建等研究开展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记序列的筛选方法,在凡纳滨对虾基因组DNA信息匮乏的背景下,实现对凡纳滨对虾单核苷酸多态性标记的筛选及检测，从而实现对凡纳滨对虾单核苷酸多态性标记验证及基因分型，为凡纳滨对虾育种项目中的遗传背景调查和家系系谱鉴定服务。

为实现上述目的,本发明采取了下述技术方案,一种凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记序列的筛选方法，包括下述具体技术步骤：

(1)筛选候选序列：提取15个凡纳滨对虾个体的头胸甲总RNA，混合样品进行转录组测序，拼接凡纳滨对虾头胸甲参考转录本，比对定位测序读端(reads)到参考转录本筛查单核苷酸多态性位点，并筛选比对质量分数大于40、次要等位基因频数在200以上，及次要等位基因频率高于20％的位点为候选序列；

(2)筛选候选SNP位点：

其候选comp39413的基因序列为：

其中加粗、加下划线的碱基为候选C239T_SNP位点；

(3)设计特异性引物

采用PAMSA(PCR amplification of multiple specific alleles)方法设计特异性引物，其正链引物一：5’-TAAAAGGTCACCAGACTTCATCC-3’；正链引物二：5’-TTTTCCCCTAAAAGGTCACCAGACTTCCGCT-3’，负链引物：5’-GGCAAACATACGACCACC-3’。

采取上述措施的本发明，可以在没有已知的凡纳滨对虾基因组DNA单核苷酸多态性位点的信息下，通过转录组混合样测序，筛选出候选序列及候选SNP位点，为凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记的筛选及检测打下基础，在这个基础上利用生物信息学分析筛选C239T单核苷酸多态性位点；并采用PAMSA(PCR amplification of multiple specificalleles)方法设计特异性引物，不仅可便捷的通过聚丙酰胺凝胶电泳完成凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性检测、验证及基因分型，而且筛选检测费用低、操作简便快速。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的单核苷酸多态位点C239T_SNP对凡纳滨对虾24个个体的检测图谱。

具体实施方式

下面通过实施例详细叙述本发明。

如图1所示，编号1-24是凡纳滨对虾24个个体，CC、CT、TT是不同个体的基因型，Marker是DNA长度分子标准。

(1)利用生物信息学分析，获得含有候选单核苷酸多态位点的拼接序列，具体过程如下：首先进行混合样品的凡纳滨对虾头胸甲的转录组测序，并使用trinity软件按默认参数拼接头胸甲参考转录本，使用BWA软件按默认参数比对定位转录组测序读端(reads)到参考转录本，使用GATK软件筛选比对质量分数大于40、次要等位基因频数在200以上，及次要等位基因频率高于20％的位点为候选位点；

(2)筛选comp39413拼接序列用于引物设计，其序列为：

其中加粗、加下划线的碱基为候选C239T_SNP位点；

(3)根据获得的上述序列，采用PAMSA(PCR amplification of multiplespecific alleles)方法来设计的C239T_SNP位点引物序列为：

正链引物一：5’-TAAAAGGTCACCAGACTTCATCC-3’；

正链引物二：5’-TTTTCCCCTAAAAGGTCACCAGACTTCCGCT-3’；

负链引物：5’-GGCAAACATACGACCACC-3’。

根据上述获取的候选序列，还可以进一步对凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记的筛选及检测，具体技术步骤如下：

(1)提取凡纳滨对虾背部肌肉基因组DNA，将其稀释到50ng/ul,PCR反应体系为30ul，包括50ng/ul凡纳滨对虾基因组DNA溶液1ul，10×PCR buffer 3ul，2.5mM dNTP Mixs2.4ul，25mM MgCl₂ 4ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.15ul，10uM正链引物一、正链引物二及反链引物各0.5ul，加ddH2O至30ul；PCR反应程序为：94℃变性10min；94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，40个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

(2)分别取步骤3获得的不同个体的PCR产物10ul，在70W的恒定功率下，进行6％变性聚丙酰胺凝胶电泳2h，银染显色，在凝胶成像系统下拍照记录结果，根据PCR产物片段大小的不同区分个体间的基因型(参见图1)，统计不同个体的基因型，获得凡纳滨对虾单核苷酸多态位点C239T_SNP的遗传变异图谱。

为了适应计算机的读取，由计算机生成了下述序列：

序列表

<110> 广西壮族自治区海洋研究所

<120> 一种凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记候选序列的筛选方法

<130> 2017

<140> 2018100116769

<141> 2018-01-05

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2589

<212> DNA

<213> Litopenaeus vannamei

<400> 1

gttcgtcgtc gtgagaactt caatcaactc tattagctag taaaatggcc accacgtgct 60

gccgccctct tgtgggcgtg tacgaggcag gcgcgcccac aaagagccgc gtgtccctgc 120

cagcggtgtt ccgagcccca atcaggccag atgtggtgaa cttcgtgcat gaccagatgg 180

ccaagaacac acgccaaccc tatgctgtca acaaggatgc tggtcaccag acttcagccg 240

agtcttgggg tactggtcgt gctgtggccc gtatcccccg tgtccgtggt ggtggtactc 300

accgctctgg tcagggtgcc tttggtaaca tgtgccgtgg tggtcgtatg tttgccccaa 360

ctaagatctg gcgccgctgg caccgccgtg ttggtgttaa ccagaaacgt tacgccatgt 420

gctcagccat tgctgcctca agcattccag ctcttgttat gtcaaagggc cacatgatcc 480

aggaagtgcc tgaggtaccc ctggttgtta gcaacaaggc ccaggagctg acaaagacca 540

aggaggctgt tgctctcttg agacagcacc atgcctggac tgatgttctt aaggtgtaca 600

agagccagag gttccgtgct ggtaggggta agatgcgcaa ccgccgtcgc atccagagga 660

agggacctct ggttatctac aataatgacc agggcctgac cagagccttc cgcaacgtac 720

ctggtgttga gaccatctgt gttgacaagc tgaatctgct gaagcttgct cctggtggcc 780

atgtgggaag attctgtatc tggactgagg atgcattccg taagttggat gctctctatg 840

gaacatggcg caaggaggct aagaacaaga agggatataa tctaccggtg tcaaaaatga 900

ccaacaccga tttgtccagg ctcctgaagt cagatgaaat caagtctgtc attaggaagc 960

caaacaagac cattgttcgt agcaaggtga agccaaaccc actgaccaac taccaagcca 1020

tgctggaact taaccccttc caccgtgttg agaagaaatt ggcccaagct gttgaagcaa 1080

agcacatcga ggctaagaag tccggaaagc ctaaggttgt aaagcctgca aagaaagaaa 1140

agcaaagaaa gaagaagact accaagaaga ctgtgaagag gctgaggaag cagcacccaa 1200

ggagccattc tggcaagaag ggcaaggctg ctgcaaagta aagcaaacca ggcaatgctt 1260

tggtaaaaaa taaaccgtgc aagaaacttt tgttttcttt atccgaaatt taatattgaa 1320

tttgaattcc ctgtagatca tactcaactt tgggtaagta ttttgagtat acaatttttt 1380

attttctgca gcaatttagt acagaaggct tctccttggg ttggtttagt tgtcttttta 1440

gtacttgagg taagaattct caatcttaac cattcctgct gggtaaaaag tttggcaagt 1500

ggatgtatta ataataggca cctaatttca tagaactcaa taagaaaccg taccccaaaa 1560

gacttgacac aattattaaa aattgttagt aatattcttt taaagcagtc aaatgtaatg 1620

tttagtcact caattttcct tgcatagtct acatccagat tggtttcaaa attggtagat 1680

gtgcacttag acaagttttg ttgacaacct aattttattt gcatttaaat tcaaggaatg 1740

gtaggtcttt tatttacatg taatatattg agtgcacctt ttttaagtgt catttcccag 1800

gtttcgtggc aaataaattt tgaacaagta cttgcatctt gccctacagc taggtactgg 1860

tccaagaata aatgttaacc ttttcttttc aggtgtcctg tagccaaagt ttaagcatat 1920

aataatgacg taacgtttgc ccgaatgctt ggtgcagtgt tgaaaatcct ccactttaga 1980

atagaatgaa ggtacaaggt ggcatcaagt gacatgattt ggtgatctat caaagtgaat 2040

cttgcagaat cgagaaatgt tcaagcccaa tcaggagaat ggtaaagatg ttggtagcag 2100

gaagtttatt ttgtagccta gattaataag cagatggatg gagaatggaa gcatcaccat 2160

tcttagtatt aaagtaggcg acaaaattga acgtaatgat gttgaagaca ggtttcttag 2220

tcttagcttg cagtagataa aaaaaaatcc tgattgtgtc agcattgaaa tggacaataa 2280

aaaattacta acccctttca cttgttcaca tcaaattgaa gggaaagatg gtaggattgt 2340

ttgctcttag tattttgtca aaaccttttt aaggggaccg tccctgaaga acaaaatatc 2400

agatttacta tttttgcttt gaaatagaaa acggtcttac agattttcat gaaatttaag 2460

tagacggaag aataccaata ttttttactt tgaccatagg gaatttctga tgtgacatcc 2520

tgagttgtgg ggtaccaaat gtaaagaaaa ataaatatat aaatgacaaa aaaaaaaaaa 2580

aaaaaaaaa 2675

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> rengongxulie

<400> 2

taaaaggtca ccagacttca tcc 23

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> rengongxulie

<400> 3

ttttccccta aaaggtcacc agacttccgc t 31

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> rengongxulie

<400> 4

ggcaaacata cgaccacc 18

Claims (1)

1.一种凡纳滨对虾C239T单核苷酸多态性标记候选序列的筛选方法，其特征在于所述方法包括下述具体技术步骤：

（1）筛选候选序列

提取15尾凡纳滨对虾的头胸甲总RNA，混合样品进行转录组测序，拼接凡纳滨对虾头胸甲参考转录本，比对定位测序读端（reads）到参考转录本筛查单核苷酸多态性位点，并筛选比对质量分数大于40、次要等位基因频数在200以上，以及次要等位基因频率高于20%的位点为候选序列；

（2）筛选候选SNP位点

其候选comp39413的基因序列为：

GTTCGTCGTCGTGAGAACTTCAATCAACTCTATTAGCTAGTAAAATGGCCACCACGTGCTGCCGCCCTCTTGTGGGCGTGTACGAGGCAGGCGCGCCCACAAAGAGCCGCGTGTCCCTGCCAGCGGTGTTCCGAGCCCCAATCAGGCCAGATGTGGTGAACTTCGTGCATGACCAGATGGCCAAGAACACACGCCAACCCTATGCTGTCAACAAGGATGCTGGTCACCAGACTTCAGCCGAGTCTTGGGGTACTGGTCGTGCTGTGGCCCGTATCCCCCGTGTCCGTGGTGGTGGTACTCACCGCTCTGGTCAGGGTGCCTTTGGTAACATGTGCCGTGGTGGTCGTATGTTTGCCCCAACTAAGATCTGGCGCCGCTGGCACCGCCGTGTTGGTGTTAACCAGAAACGTTACGCCATGTGCTCAGCCATTGCTGCCTCAAGCATTCCAGCTCTTGTTATGTCAAAGGGCCACATGATCCAGGAAGTGCCTGAGGTACCCCTGGTTGTTAGCAACAAGGCCCAGGAGCTGACAAAGACCAAGGAGGCTGTTGCTCTCTTGAGACAGCACCATGCCTGGACTGATGTTCTTAAGGTGTACAAGAGCCAGAGGTTCCGTGCTGGTAGGGGTAAGATGCGCAACCGCCGTCGCATCCAGAGGAAGGGACCTCTGGTTATCTACAATAATGACCAGGGCCTGACCAGAGCCTTCCGCAACGTACCTGGTGTTGAGACCATCTGTGTTGACAAGCTGAATCTGCTGAAGCTTGCTCCTGGTGGCCATGTGGGAAGATTCTGTATCTGGACTGAGGATGCATTCCGTAAGTTGGATGCTCTCTATGGAACATGGCGCAAGGAGGCTAAGAACAAGAAGGGATATAATCTACCGGTGTCAAAAATGACCAACACCGATTTGTCCAGGCTCCTGAAGTCAGATGAAATCAAGTCTGTCATTAGGAAGCCAAACAAGACCATTGTTCGTAGCAAGGTGAAGCCAAACCCACTGACCAACTACCAAGCCATGCTGGAACTTAACCCCTTCCACCGTGTTGAGAAGAAATTGGCCCAAGCTGTTGAAGCAAAGCACATCGAGGCTAAGAAGTCCGGAAAGCCTAAGGTTGTAAAGCCTGCAAAGAAAGAAAAGCAAAGAAAGAAGAAGACTACCAAGAAGACTGTGAAGAGGCTGAGGAAGCAGCACCCAAGGAGCCATTCTGGCAAGAAGGGCAAGGCTGCTGCAAAGTAAAGCAAACCAGGCAATGCTTTGGTAAAAAATAAACCGTGCAAGAAACTTTTGTTTTCTTTATCCGAAATTTAATATTGAATTTGAATTCCCTGTAGATCATACTCAACTTTGGGTAAGTATTTTGAGTATACAATTTTTTATTTTCTGCAGCAATTTAGTACAGAAGGCTTCTCCTTGGGTTGGTTTAGTTGTCTTTTTAGTACTTGAGGTAAGAATTCTCAATCTTAACCATTCCTGCTGGGTAAAAAGTTTGGCAAGTGGATGTATTAATAATAGGCACCTAATTTCATAGAACTCAATAAGAAACCGTACCCCAAAAGACTTGACACAATTATTAAAAATTGTTAGTAATATTCTTTTAAAGCAGTCAAATGTAATGTTTAGTCACTCAATTTTCCTTGCATAGTCTACATCCAGATTGGTTTCAAAATTGGTAGATGTGCACTTAGACAAGTTTTGTTGACAACCTAATTTTATTTGCATTTAAATTCAAGGAATGGTAGGTCTTTTATTTACATGTAATATATTGAGTGCACCTTTTTTAAGTGTCATTTCCCAGGTTTCGTGGCAAATAAATTTTGAACAAGTACTTGCATCTTGCCCTACAGCTAGGTACTGGTCCAAGAATAAATGTTAACCTTTTCTTTTCAGGTGTCCTGTAGCCAAAGTTTAAGCATATAATAATGACGTAACGTTTGCCCGAATGCTTGGTGCAGTGTTGAAAATCCTCCACTTTAGAATAGAATGAAGGTACAAGGTGGCATCAAGTGACATGATTTGGTGATCTATCAAAGTGAATCTTGCAGAATCGAGAAATGTTCAAGCCCAATCAGGAGAATGGTAAAGATGTTGGTAGCAGGAAGTTTATTTTGTAGCCTAGATTAATAAGCAGATGGATGGAGAATGGAAGCATCACCATTCTTAGTATTAAAGTAGGCGACAAAATTGAACGTAATGATGTTGAAGACAGGTTTCTTAGTCTTAGCTTGCAGTAGATAAAAAAAAATCCTGATTGTGTCAGCATTGAAATGGACAATAAAAAATTACTAACCCCTTTCACTTGTTCACATCAAATTGAAGGGAAAGATGGTAGGATTGTTTGCTCTTAGTATTTTGTCAAAACCTTTTTAAGGGGACCGTCCCTGAAGAACAAAATATCAGATTTACTATTTTTGCTTTGAAATAGAAAACGGTCTTACAGATTTTCATGAAATTTAAGTAGACGGAAGAATACCAATATTTTTTACTTTGACCATAGGGAATTTCTGATGTGACATCCTGAGTTGTGGGGTACCAAATGTAAAGAAAAATAAATATATAAATGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，其中加粗、加下划线的碱基为候选C239T_SNP位点；

（3）设计特异性引物

采用PAMSA方法设计特异性引物，其正链引物一：5’- TAAAAGGTCACCAGACTTCATCC -3’；正链引物二：5’- TTTTCCCCTAAAAGGTCACCAGACTTCCGCT -3’，负链引物：5’-GGCAAACATACGACCACC -3’。