CN106119418A - 香蕉束顶病毒lamp引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了香蕉束顶病毒LAMP引物、试剂盒及检测方法，其中所述引物包括：正向外引物F3，反向外引物B3，正向内引物FIP，和反向内引物BIP。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种香蕉束顶病毒LAMP引物；本发明的另一个目的是提供一种包含上述引物的试剂盒；本发明的另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测香蕉束顶病毒的方法，该检测方法具有：引物特异性强，设备简单，快速、检测灵敏度高、闭管检测、操作简单、结果直接可以判读等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种香蕉束顶病毒LAMP引物、本发明还涉及一种包括上述引物的试剂盒；本发明还涉及一种采用上述试剂盒检测香蕉束顶病毒的方法。
背景技术
香蕉束顶病是世界香蕉生产上的一种危害十分严重的病害,广泛分别于亚太地区和非洲盛产香蕉的国家，在我国,此病在50年代开始发生,现在南方各省香蕉产区发生流行.一般发病率为20％～30％,重者达70％～80％,以致蕉园毁灭.香蕉束顶病主要是通过吸芽和组培苗带毒,以及香蕉交脉蚜Pentatonia nigronervosa来传播,但是病毒不能在昆虫介体内复制,不能通过机械传播。香蕉束顶病病原病毒Banana bunchy top virus,BBTV是单链环状DNA病毒,属于矮缩病毒属Nanovirus，虽然从1920年就开始展开对此病毒的研究,但由于香蕉植株体内病毒浓度极低,到1988年才得以提纯到病毒,病毒粒体球状,直径为18～20nm，基因组至少含有6个环状单链DNA组份。该病毒只侵染芭蕉科植物，所有被侵染的植物均严重矮化，有些植物产生卷叶、退绿甚至整株死亡。
当前,防治BBTV的方法是种植无毒香蕉苗和及时铲除田间病株，该方法的成功与否完全有赖于建立灵敏、快速和可靠的病毒检测方法，而目前对BBTV的检测方法主要有生物学、血清学和分子生物学三种，生物学方法就是用病毒指示植物来检测病毒的存在与否，一般需要7-10天；血清学方法是根据抗原抗体的特异性结合来检测病毒，一般只需要4-6小时左右，但是它需要特异性的抗血清，而且检测灵敏度不高，还存在有非特异性问题；分子生物学方法主要是指PCR方法，该方法快且准确性也比较高，但是需要昂贵的检测仪器和相关设备，而且对于像BBTV这个病毒，由于BBTV在植株体内浓度非常低，故需要灵敏度非常高的检测方法才能将潜在的BBTV检测出来，以上三种方法灵敏度都难以达到，这样必将存在漏检的可能，所以急需研究新的检测方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种香蕉束顶病毒LAMP引物；
本发明的另一个目的是提供一种包含上述引物的试剂盒；
本发明的另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测香蕉束顶病毒的方法，该检测方法具有：引物特异性强，设备简单，快速、检测灵敏度高、闭管检测、操作简单、结果直接可以判读等特点。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种香蕉束顶病毒LAMP引物，其特征在于包括：
正向外引物F3：5’GGCGATGAATAGCTGGAA3’；
反向外引物B3：5’CCTGGAGAATAAAACGCATT3’；
正向内引物FIP：
5’CAAATTATCCTTCGATGACATGGCT-GACAACCTTCAGTACATGGAC3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5’CAAATTATCCTTCGATGACATGGCT3’；
F2：5’GACAACCTTCAGTACATGGAC3’；
反向内引物BIP：
5’GGTCTACGGCCCAAATGGAG-TCGTCTTCATTAAATGTTTTGC3’；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’GGTCTACGGCCCAAATGGAG3’；
B2:5’TCGTCTTCATTAAATGTTTTGC3’。
本发明一种香蕉束顶病毒LAMP试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：
其中所述引物包括：
正向外引物F3：5’GGCGATGAATAGCTGGAA3’；
反向外引物B3：5’CCTGGAGAATAAAACGCATT3’；
正向内引物FIP：
5’CAAATTATCCTTCGATGACATGGCT-GACAACCTTCAGTACATGGAC3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5’CAAATTATCCTTCGATGACATGGCT3’；
F2：5’GACAACCTTCAGTACATGGAC3’；
反向内引物BIP：
5’GGTCTACGGCCCAAATGGAG-TCGTCTTCATTAAATGTTTTGC3’；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’GGTCTACGGCCCAAATGGAG3’；
B2:5’TCGTCTTCATTAAATGTTTTGC3’；
其中该试剂盒的产品规格：40次。
如上所述的香蕉束顶病毒LAMP试剂盒，其特征在于所述的LAMP反应液缓冲液由以下组分组成：
如上所述的香蕉束顶病毒LAMP试剂盒，其特征在于所述荧光染料为钙黄绿素；所述酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。
本发明一种香蕉束顶病毒LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤：
A、提取样品DNA；
B、建立LAMP反应体系：
按检测所需的反应量从权利要求2所述的试剂盒中分别取各种试剂，放入灭菌试管中，在冰上配制预混液；轻弹击灭菌试管使其混匀，瞬时离心数秒使溶液集中在灭菌试管底部；20μL LAMP反应体包括：
C、加样：
在三个装有20μL LAMP反应体的灭菌试管中分别加入待检测的待检测样品RNA、阴性对照反应样品、阳性对照反应样品各5μL，使各自的总量达到25μL，盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在灭菌试管底部；其中阴性对照反应使用去离子水作为样品，阳性对照反应使用带有BBTV DNA的阳性对照，
D、扩增：
将步骤C中的灭菌试管放置在恒温器中，在60-65℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；
E、检测：
使用紫外线照射装置从灭菌试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查；如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性。
如上所述的香蕉束顶病毒LAMP检测方法，其特征在于步骤A中所述提取样品RNA，具体按以下步骤提取：
a1、取0.1g的BBTV和BSV感病组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；
a2、清洗纳米磁珠：取出纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；
a3、结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；
a4、清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
a5、裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；
a6、取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为PNRSV和PPV的RNA。
如上所述的香蕉束顶病毒LAMP检测方法，其特征在于步骤E中紫外线照射装置的紫外线范围：波长240－260nm或350-370nm。
如上所述的香蕉束顶病毒LAMP检测方法，其特征在于所述引物中外引物与内引物的比例为l:2-1:10。
如上所述的香蕉束顶病毒LAMP检测方法，其特征在于所述引物包括1.6μl正向外引物F3，1.6μl反向外引物B3，0.2μl正向内引物FIP、0.2μl反向内引物BIP。
如上所述的香蕉束顶病毒LAMP检测方法，其特征在于步骤D中扩增温度优选为63℃。
综上所述，本发明相对于现有技术其有益效果是：
本发明采用磁珠法提取BBTV的总核酸并根据BBTV主要株系的外壳蛋白编码基因设计了检测BBTV外壳蛋白的LAMP扩增的通用型引物，且建立了BBTV LAMP检测的体系，通过本体系可以在一个小时内高灵敏度的检测出BBTV病毒的存在，检测灵敏度达到10fg，比普通PCR要高出一千倍，且具有较好的特异性。另外本方法不要昂贵的仪器和设备，只需要一个保温箱即可，操作简单，检测结果可以直接通过颜色的反应来判读，非常适合基层一线的使用，在种苗、花卉等繁殖材料病毒检测方面具有广阔的应用前景和非常好的实用价值。
本发明引物特异性较好，灵敏度高；本发明检测方法耗时短。需要昂贵的检测仪器，检测成本低。操作简便
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述：
本发明以下实施例中所采用材料：
1.材料
1.1香蕉束顶病毒(BBTV)、香蕉线条病毒(Banana streak virus,BSV)购自美国AGDIA公司。
1.2主要试剂和耗材
(1)RNA扩增反应试剂盒Loopamp RNA Amplification kit；
(2)朗報荧光目视检测试剂盒；
(3)Fluorescence Detection Reagent；
(4)朗報反应试管等均购置于北京蓝谱生物科技有限公司；
1.3主要仪器设备
(1)－80℃冷冻冰箱；
(2)Labofuge400R高速冷冻台式离心机；
(3)微量移液器，1000μL、200μL、100μL、10μL，2.5μL，；
(4)超纯水系统，Milli－Q Academic，Millipore公司；
(5)超净工作台；
(6)漩涡混合器；
(7)LAMP实时浊度仪，LA－320C，日本荣研生物公司。
实施例1
本发明一种香蕉束顶病毒LAMP引物，包括：
正向外引物F3：5’GGCGATGAATAGCTGGAA3’；
反向外引物B3：5’CCTGGAGAATAAAACGCATT3’；
正向内引物FIP：
5’CAAATTATCCTTCGATGACATGGCT-GACAACCTTCAGTACATGGAC3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5’CAAATTATCCTTCGATGACATGGCT3’；
F2：5’GACAACCTTCAGTACATGGAC3’；
反向内引物BIP：
5’GGTCTACGGCCCAAATGGAG-TCGTCTTCATTAAATGTTTTGC3’；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’GGTCTACGGCCCAAATGGAG3’；
B2:5’TCGTCTTCATTAAATGTTTTGC3’。
实施例2
本发明一种香蕉束顶病毒LAMP试剂盒，该试剂盒包括有：
其中所述引物包括：
正向外引物F3：5’GGCGATGAATAGCTGGAA3’；
反向外引物B3：5’CCTGGAGAATAAAACGCATT3’；
正向内引物FIP：
5’CAAATTATCCTTCGATGACATGGCT-GACAACCTTCAGTACATGGAC3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5’CAAATTATCCTTCGATGACATGGCT3’；
F2：5’GACAACCTTCAGTACATGGAC3’；
反向内引物BIP：
5’GGTCTACGGCCCAAATGGAG-TCGTCTTCATTAAATGTTTTGC3’；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’GGTCTACGGCCCAAATGGAG3’；
B2:5’TCGTCTTCATTAAATGTTTTGC3’；
其中该试剂盒的产品规格：40次。
其中所述引物包括1.6μl正向外引物F3，1.6μl反向外引物B3，0.2μl正向内引物FIP、0.2μl反向内引物BIP。
所述的LAMP反应液缓冲液由以下组分组成：
所述荧光染料为钙黄绿素；所述酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。
实施例3
本发明一种香蕉束顶病毒LAMP检测方法，包括以下步骤：
A、提取样品DNA；
B、建立LAMP反应体系：
按检测所需的反应量试剂盒中分别取各种试剂，放入灭菌试管中，在冰上配制预混液；轻弹击灭菌试管使其混匀，瞬时离心数秒使溶液集中在灭菌试管底部；20μL LAMP反应体包括：
C、加样：
在三个装有20μL LAMP反应体的灭菌试管中分别加入待检测的待检测样品RNA、阴性对照反应样品、阳性对照反应样品各5μL，使各自的总量达到25μL，盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在灭菌试管底部；其中阴性对照反应使用去离子水作为样品，阳性对照反应使用带有BBTV DNA的阳性对照，
D、扩增：
将步骤C中的灭菌试管放置在恒温器中，在60-65℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；
E、检测：
使用紫外线照射装置从灭菌试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查；如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性。
实施例4
本发明一种香蕉束顶病毒LAMP检测方法，包括以下步骤：
A、提取样品DNA；
a1、取0.1g的BBTV和BSV感病组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；
a2、清洗纳米磁珠：取出纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；
a3、结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；
a4、清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
a5、裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；
a6、取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为PNRSV和PPV的RNA；
B、建立LAMP反应体系：
取-20℃下保存的试剂盒中国各种试剂在室温下解冻，解冻后立即置于冰上保存；
按检测所需的反应量试剂盒中分别取各种试剂，放入灭菌试管中，在冰上配制预混液；轻弹击灭菌试管使其混匀，瞬时离心数秒使溶液集中在灭菌试管底部；20μL LAMP反应体包括：
其中所述引物包括1.6μl正向外引物F3，1.6μl反向外引物B3，0.2μl正向内引物FIP、0.2μl反向内引物BIP。
所述的LAMP反应液缓冲液由以下组分组成：
所述荧光染料为钙黄绿素；所述酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。
所述引物序列：
正向外引物F3：5’GGCGATGAATAGCTGGAA3’；
反向外引物B3：5’CCTGGAGAATAAAACGCATT3’；
正向内引物FIP：
5’CAAATTATCCTTCGATGACATGGCT-GACAACCTTCAGTACATGGAC3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5’CAAATTATCCTTCGATGACATGGCT3’；
F2：5’GACAACCTTCAGTACATGGAC3’；
反向内引物BIP：
5’GGTCTACGGCCCAAATGGAG-TCGTCTTCATTAAATGTTTTGC3’；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’GGTCTACGGCCCAAATGGAG3’；
B2:5’TCGTCTTCATTAAATGTTTTGC3’；
C、加样：
在三个装有20μL LAMP反应体的灭菌试管中分别加入待检测的待检测样品RNA、阴性对照反应样品、阳性对照反应样品各5μL，使各自的总量达到25μL，盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在灭菌试管底部；其中阴性对照反应使用去离子水作为样品，阳性对照反应使用带有BBTV DNA的阳性对照，
D、扩增：
将步骤C中的灭菌试管放置在恒温器中，在60℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；
E、检测：
使用紫外线照射装置从灭菌试管底部向上进行照射，波长240－260nm或350-370nm。佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查；如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性。
实施例5
本发明一种香蕉束顶病毒LAMP检测方法，包括以下步骤：
A、提取样品DNA；
a1、取0.1g的BBTV和BSV感病组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；
a2、清洗纳米磁珠：取出纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；
a3、结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；
a4、清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
a5、裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；
a6、取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为PNRSV和PPV的RNA；
B、建立LAMP反应体系：
取-20℃下保存的试剂盒中国各种试剂在室温下解冻，解冻后立即置于冰上保存；
按检测所需的反应量试剂盒中分别取各种试剂，放入灭菌试管中，在冰上配制预混液；轻弹击灭菌试管使其混匀，瞬时离心数秒使溶液集中在灭菌试管底部；20μL LAMP反应体包括：
其中所述引物包括1.6μl正向外引物F3，1.6μl反向外引物B3，0.2μl正向内引物FIP、0.2μl反向内引物BIP。
所述的LAMP反应液缓冲液由以下组分组成：
所述荧光染料为钙黄绿素；所述酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。
所述引物序列：
正向外引物F3：5’GGCGATGAATAGCTGGAA3’；
反向外引物B3：5’CCTGGAGAATAAAACGCATT3’；
正向内引物FIP：
5’CAAATTATCCTTCGATGACATGGCT-GACAACCTTCAGTACATGGAC3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5’CAAATTATCCTTCGATGACATGGCT3’；
F2：5’GACAACCTTCAGTACATGGAC3’；
反向内引物BIP：
5’GGTCTACGGCCCAAATGGAG-TCGTCTTCATTAAATGTTTTGC3’；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’GGTCTACGGCCCAAATGGAG3’；
B2:5’TCGTCTTCATTAAATGTTTTGC3’；
C、加样：
在三个装有20μL LAMP反应体的灭菌试管中分别加入待检测的待检测样品RNA、阴性对照反应样品、阳性对照反应样品各5μL，使各自的总量达到25μL，盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在灭菌试管底部；其中阴性对照反应使用去离子水作为样品，阳性对照反应使用带有BBTV DNA的阳性对照，
D、扩增：
将步骤C中的灭菌试管放置在恒温器中，在65℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；
E、检测：
使用紫外线照射装置从灭菌试管底部向上进行照射，波长240－260nm或350-370nm。佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查；如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性。
实施例6
本发明一种香蕉束顶病毒LAMP检测方法，包括以下步骤：
A、提取样品DNA；
a1、取0.1g的BBTV和BSV感病组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；
a2、清洗纳米磁珠：取出纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；
a3、结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；
a4、清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
a5、裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；
a6、取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为PNRSV和PPV的RNA；
B、建立LAMP反应体系：
取-20℃下保存的试剂盒中国各种试剂在室温下解冻，解冻后立即置于冰上保存；
按检测所需的反应量试剂盒中分别取各种试剂，放入灭菌试管中，在冰上配制预混液；轻弹击灭菌试管使其混匀，瞬时离心数秒使溶液集中在灭菌试管底部；20μL LAMP反应体包括：
其中所述引物包括1.6μl正向外引物F3，1.6μl反向外引物B3，0.2μl正向内引物FIP、0.2μl反向内引物BIP。
所述的LAMP反应液缓冲液由以下组分组成：
所述荧光染料为钙黄绿素；所述酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。
所述引物序列：
正向外引物F3：5’GGCGATGAATAGCTGGAA3’；
反向外引物B3：5’CCTGGAGAATAAAACGCATT3’；
正向内引物FIP：
5’CAAATTATCCTTCGATGACATGGCT-GACAACCTTCAGTACATGGAC3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5’CAAATTATCCTTCGATGACATGGCT3’；
F2：5’GACAACCTTCAGTACATGGAC3’；
反向内引物BIP：
5’GGTCTACGGCCCAAATGGAG-TCGTCTTCATTAAATGTTTTGC3’；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’GGTCTACGGCCCAAATGGAG3’；
B2:5’TCGTCTTCATTAAATGTTTTGC3’；
C、加样：
在三个装有20μL LAMP反应体的灭菌试管中分别加入待检测的待检测样品RNA、阴性对照反应样品、阳性对照反应样品各5μL，使各自的总量达到25μL，盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在灭菌试管底部；其中阴性对照反应使用去离子水作为样品，阳性对照反应使用带有BBTV DNA的阳性对照，
D、扩增：
将步骤C中的灭菌试管放置在恒温器中，在63℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；
E、检测：
使用紫外线照射装置从灭菌试管底部向上进行照射，波长240－260nm或350-370nm。佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查；如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种香蕉束顶病毒LAMP引物，其特征在于包括：
正向外引物F3：5’GGCGATGAATAGCTGGAA3’；
反向外引物B3：5’CCTGGAGAATAAAACGCATT3’；
正向内引物FIP：
5’CAAATTATCCTTCGATGACATGGCT-GACAACCTTCAGTACATGGAC3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5’CAAATTATCCTTCGATGACATGGCT3’；
F2：5’GACAACCTTCAGTACATGGAC3’；
反向内引物BIP：
5’GGTCTACGGCCCAAATGGAG-TCGTCTTCATTAAATGTTTTGC3’；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’GGTCTACGGCCCAAATGGAG3’；
B2:5’TCGTCTTCATTAAATGTTTTGC3’。
2.一种香蕉束顶病毒LAMP试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：
其中所述引物包括：
正向外引物F3：5’GGCGATGAATAGCTGGAA3’；
反向外引物B3：5’CCTGGAGAATAAAACGCATT3’；
正向内引物FIP：
5’CAAATTATCCTTCGATGACATGGCT-GACAACCTTCAGTACATGGAC3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5’CAAATTATCCTTCGATGACATGGCT3’；
F2：5’GACAACCTTCAGTACATGGAC3’；
反向内引物BIP：
5’GGTCTACGGCCCAAATGGAG-TCGTCTTCATTAAATGTTTTGC3’；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’GGTCTACGGCCCAAATGGAG3’；
B2:5’TCGTCTTCATTAAATGTTTTGC3’；
其中该试剂盒的产品规格：40次。
3.根据权利要求2所述的香蕉束顶病毒LAMP试剂盒，其特征在于所述的LAMP反应液缓冲液由以下组分组成：
4.根据权利要求2所述的香蕉束顶病毒LAMP试剂盒，其特征在于所述荧光染料为钙黄绿素；所述酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。
5.一种香蕉束顶病毒LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤：
A、提取样品RNA；
B、建立LAMP反应体系：
按检测所需的反应量从权利要求2所述的试剂盒中分别取各种试剂，放入灭菌试管中，在冰上配制预混液；轻弹击灭菌试管使其混匀，瞬时离心数秒使溶液集中在灭菌试管底部；20μL LAMP反应体包括：
C、加样：
在三个装有20μL LAMP反应体的灭菌试管中分别加入待检测的待检测样品RNA、阴性对照反应样品、阳性对照反应样品各5μL，使各自的总量达到25μL，盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在灭菌试管底部；其中阴性对照反应使用去离子水作为样品，阳性对照反应使用带有BBTV DNA的阳性对照，
D、扩增：
将步骤C中的灭菌试管放置在恒温器中，在60-65℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；
E、检测：
使用紫外线照射装置从灭菌试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查；如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性。
6.根据权利要求5所述的香蕉束顶病毒LAMP检测方法，其特征在于步骤A中所述提取样品DNA，具体按以下步骤提取：
a1、取0.1g的BBTV和BSV感病组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；
a2、清洗纳米磁珠：取出纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；
a3、结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；
a4、清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
a5、裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；
a6、取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为PNRSV和PPV的RNA。
7.根据权利要求5所述的香蕉束顶病毒LAMP检测方法，其特征在于步骤E中紫外线照射装置的紫外线范围：波长240－260nm或350-370nm。
8.根据权利要求5所述的香蕉束顶病毒LAMP检测方法，其特征在于所述引物中外引物与内引物的比例为l:2-1:10。
9.根据权利要求5所述的香蕉束顶病毒LAMP检测方法，其特征在于所述引物包括1.6μl正向外引物F3，1.6μl反向外引物B3，0.2μl正向内引物FIP、0.2μl反向内引物BIP。
10.根据权利要求5所述的香蕉束顶病毒LAMP检测方法，其特征在于步骤D中扩增温度优选为63℃。
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