CN107354235A - 马铃薯x病毒鉴定用的引物、试剂盒及鉴定方法 - Google Patents

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CN107354235A CN201710477704.1A CN201710477704A CN107354235A CN 107354235 A CN107354235 A CN 107354235A CN 201710477704 A CN201710477704 A CN 201710477704A CN 107354235 A CN107354235 A CN 107354235A
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Abstract

本发明公开了马铃薯X病毒RT‑LAMP鉴定用的引物、试剂盒及鉴定方法,试剂盒包括有：2×反应液缓冲液、引物FIP、引物BIP、引物F3、引物B3、酶溶液、荧光目视检测试剂、去离子水。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高，马铃薯X病毒RT‑LAMP鉴定用的引物、试剂盒及鉴定方法。

Description

马铃薯X病毒鉴定用的引物、试剂盒及鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种马铃薯X病毒RT-LAMP鉴定用的引物、试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
马铃薯X病毒Potato virus X，PVX又称马铃薯潜隐病毒Potato latent virus或马铃薯轻花叶病毒Potato mild mosaic virus，为马铃薯X病毒属Potexvirus模式成员，是由一条正链RNA组成的线性病毒，RNA长约6.4kbp，病毒粒子呈长杆状，长×宽＝515nm×13nm。自然条件下主要靠寄主植株不同部位、寄主植株之间接触摩擦进行机械传播。PVX单独侵染时症状较轻，与马铃薯Y病毒Potato virus Y，PVY、烟草脉斑驳病毒Tobacco veinmottling virus，TVMV、烟草蚀纹病毒Tobacco etch virus，TEV等马铃薯Y病毒属病毒复合侵染时症状加剧，造成严重经济损失。
所有马铃薯Solanum tuberosum产区均存在PVX发生的现象，但不同栽培品种受PVX侵染情况存在较大差异，有些品种带毒率较高。在田间，PVX侵染马铃薯植株，引起轻型花叶或者潜隐病征，若多年侵染则易引起重花叶或者植株矮化，造成10％-80％减产。PVX常与PVY复合侵染，使症状加剧。PVX主要靠汁液接触传播，也可以由某些昆虫如异黑蝗Melanoplus differentialis和绿丛螽斯Tettigonia viridissima的咀嚼式口器经机械作用传播，菟丝子Cuscuta campestris和集合油壶菌Synchytium endobiotcum也能够传播该病毒，但实生种子不能传毒。PVX寄主范围较广，可侵染16科240种植物，茄科植物是主要的寄主，其诊断寄主有白肋烟White burley及其他烟草Nicotiana tabacum品种。初侵染的叶片通常表现为坏死斑，之后发展为坏死斑驳、褪绿、花叶或脉褪绿。在曼陀罗Daturastramonium上继斑驳之后产生褪绿环，脉褪绿或脉坏死。烟草栽培品种适于作繁殖寄主。千日红Gomphrena globosa是较好的指示植物，除HB株系外都产生局部斑。对于PVX株系的分类还未有统一的标准，但Cockerham的方法认可度较高，该方法根据PVX侵染携带不同抗病基因Nx和Nb的马铃薯植株所表现出的症状，将PVX株系分为4组，分别是X1、X2、X3和X4。X1组如CS35株系在含Nx、Nb基因的马铃薯上均能引起过敏反应Hypersensitive resistance，HR。X2组如CP株系只在含Nb基因的马铃薯上引起HR。X3组如UK3、DX株系只在含有Nx基因的马铃薯上引起HR。X4组如DX4、CP4、HB株系则能完全克服Nx、Nb抗性。许多研究表明，PVX的外壳蛋白Coat protein，CP基因在决定PVX与植物抗病基因互作方面起着重要作用。CP可作为激发子使马铃薯产生HR、ER,极端抗病性extremeresistance，ER反应，CP基因核苷酸序列的变化会导致寄主产生不同的症状类型。因此，PVX的CP基因序列分析也有助于对PVX的分类研究。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高，马铃薯X病毒RT-LAMP鉴定用的引物；
本发明另一个目的是提供一种包含上述引物的用于鉴定马铃薯X病毒的试剂盒；
本发明另一个目的是提供一种采用上述马铃薯X病毒RT-LAMP鉴定方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种马铃薯X病毒RT-LAMP鉴定用的引物，其特征在于包括：
PVX-F3:5’-ACAGGCTGCTTGGGACTT-3’
PVX-B3:5’-GTTAGCAGGTGGACTGTTGT-3’
PVX-FIP:5’-ATGCCGTTGGAATAGGGACCTG-GCTGATGTAGGATCATCCGC-3’
PVX-BIP:5’-AGCAGAGCTAGACTGGCAGCA-CCATACCACTGGGGCATAC-3’。
一种马铃薯X病毒RT-LAMP鉴定用的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：
如上所述的试剂盒，其特征在于所述的2×反应液缓冲液由以下组分组成：
如上所述的试剂盒，其特征在于所述的酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。
如上所述的任一种试剂盒，其特征在于荧光目视检测试剂中含有钙黄绿素荧光染料。
一种马铃薯X病毒鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
A、植物组织总DNA提取；
B、LAMP检测：
采用权利要求2所述的试剂盒配置预反应溶液，在预反应溶液中分别加入待检测的样品的DNA 5μL，使总量达到25μL；其中对照组在预反应溶液加入去离子水5μL；阳性对照在预反应溶液中加入带病毒的DNA 5μL；用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时避免产生气泡；将混合物置于反应孔中，于65℃恒温反应90min，最后80℃下保温5min以结束反应；
C、LAMP结果判断
扩增反应结束后，使用紫外线照射装置，波长240-260nm，350-370nm，从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察，若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性即样品中带有马铃薯X病毒；若与阴性对照一样未发出绿色荧光，则判定样品中没有携带马铃薯X病毒。
如上所述的鉴定方法，其特征在于步骤A中植物组织总DNA提取的具体步骤：
a制样：取0.5g的带毒组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；
b清洗纳米磁珠：取出免疫纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；
c结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；
d清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
e裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；
f取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为病毒RNA；
g核酸浓度的测定
取5μL DNA溶液加ddH2O梯度稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值；RNA的浓度按照以下公式计算获得：
RNA C＝40×N×A
式中：
C——RNA浓度(ng/μL)
A——260nm处的吸光值
N——核酸稀释倍数
1OD260nm＝40μg/mL单链RNA
当OD260/OD280比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增和LAMP检测。
如上所述的鉴定方法，其特征在于所述纳米磁珠通过以下方法制备：
1)Fe3O4磁性纳米粒子制备与氨基化修饰
分别取5.2g FeCl3·6H2O、2.7g FeSO4·7H2O、0.85mL 12.1moL/L的浓盐酸溶解于200mL水中，超声脱氧，后将以上溶液滴入250mL、0.75moL/L NaOH溶液；所有反应在80℃下搅拌，随着反应的进行，反应液中出现黑色的沉淀，反应结束后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，再用去离子水清洗3次，无水乙醇清洗2次，并配成5g/mL的Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，取25mL Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，再用无水乙醇稀释到150mL，超声振荡30min，滴加0.4mL APTES，其中硅烷偶联剂：3-氨基丙基三乙氧基硅烷，室温下搅拌7h，反应完毕，用磁分离器将APTES修饰的Fe3O4磁性纳米粒子从反应介质中分离，并用无水乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5mg/mL的氨基化Fe3O4纳米磁珠无水乙醇溶液；
2)免疫磁珠的制备
取0.5mL氨基化Fe3O4纳米磁珠无水乙醇溶液，用1mL PBS清洗3次，磁分离器弃上清液，加入5％(V/V)戊二醛溶液2mL，室温振荡交联2h，磁分离，弃上清液，用PBS洗涤3次并弃上清液后，分别采用0.5mL不同稀释倍数的相应病毒抗体包被氨基化Fe3O4纳米粒子，室温下振荡固定2h，磁分离，用PBS和超纯水分别洗涤3次，再用PBS定容，4℃冰箱保存备用，到具有最佳吸附量的一病毒抗体免疫磁珠。
本发明中所用到的材料：
1.1毒株
PVX购自美国AGDIA公司。
1.2主要试剂和耗材
(1)PCR反应试剂：10×PCR bμffer、dNTPs、MgCl2、Taq DNA聚合酶以及反转录酶(Reverse Transcriptase M-MLV)均购自宝生物工程(大连)有限公司；
(2)DNA Marker DL1000、6×loading bμffer，宝生物工程(大连)有限公司；
(3)RNA扩增反应试剂盒Loopamp RNA Amplification kit, 荧光目视检测试剂盒,SYBR Green I，Flμorescence Detection Reagent,反应试管均购自于北京蓝谱生物科技有限公司，
(4)Bst DNA polymerase large fragment:购自New England Biolabs公司；
(5)甜菜碱(Betaine)：购自广州威佳生物有限公司；dNTPs、MgCl2，宝生物工程(大连)有限公司；
(6)LAMP引物(正向外引物F3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、反向外引物B3)由宝生物工程(大连)有限公司合成；
(7)纳米磁珠(magnetic nano particles，MNP)试剂盒购自北京金纳科技有限公司；
1.3主要仪器设备
(1)－80℃冷冻冰箱；
(2)Labofμge400R高速冷冻台式离心机；
(3)微量移液器，1000μL、200μL、100μL、10μL，2.5μL，；
(4)分析天平，梅特勒－托利多仪器有限公司；
(5)高温高压灭菌锅；
(6)超纯水系统，Milli－Q Academic，Millipore公司；
(7)日本Shimadzμ公司ΜV-120-02型可见－紫外分光光度计；
(8)超净工作台；
(9)漩涡混合器；
(10)LAMP实时浊度仪，LA－320C，日本荣研生物公司。
本发明与现有技术相比，有益效果是：
一、本发明针对侵染马铃薯的PVM的外壳蛋白基因设计了一组特异性的引物，成功建立了针对这种病毒的LAMP检测方法；
二、本发明检测体系中的镁离子浓度、dNTP浓度、甜菜碱添加量、反应温度、内外引物间比例合适，从而使得
三、本发明中引物特异性较好，灵敏度高；
四、本发明利用LAMP法检测这两种病毒检测约耗时约2小时，比普通ELISA和RT-PCR方法更加快速；
五、本发明LAMP法不需要PCR仪等昂贵、操作复杂的仪器，水浴锅或恒温装置即可完成反应，反应结束后，通过观察是否产生了白色沉淀或加入SYBR显色剂观察颜色变化就可判定反应是否发生，操作简便，适于检验检疫局一线检测实验室推广，具有很好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：
实施例1
一种马铃薯X病毒RT-LAMP鉴定用的试剂盒，该试剂盒包括有：
其中引物序列：
PVX-F3:5’-ACAGGCTGCTTGGGACTT-3’
PVX-B3:5’-GTTAGCAGGTGGACTGTTGT-3’
PVX-FIP:5’-ATGCCGTTGGAATAGGGACCTG-GCTGATGTAGGATCATCCGC-3’
PVX-BIP:5’-AGCAGAGCTAGACTGGCAGCA-CCATACCACTGGGGCATAC-3’。
实施例2
一种马铃薯X病毒RT-LAMP鉴定用的试剂盒，该试剂盒包括有：
其中引物序列：
PVX-F3:5’-ACAGGCTGCTTGGGACTT-3’
PVX-B3:5’-GTTAGCAGGTGGACTGTTGT-3’
PVX-FIP:5’-ATGCCGTTGGAATAGGGACCTG-GCTGATGTAGGATCATCCGC-3’
PVX-BIP:5’-AGCAGAGCTAGACTGGCAGCA-CCATACCACTGGGGCATAC-3’。
本发明中所述的2×反应液缓冲液由以下组分组成：
所述的酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。
荧光目视检测试剂中含有钙黄绿素荧光染料。
实施例3
一种马铃薯X病毒鉴定方法，包括以下步骤：
A、植物组织总DNA提取；
B、LAMP检测：
采用实施例2中所述的试剂盒配置预反应溶液，在预反应溶液中分别加入待检测的样品的DNA 5μL，使总量达到25μL；其中对照组在预反应溶液加入去离子水5μL；阳性对照在预反应溶液中加入带病毒的DNA 5μL；用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时避免产生气泡；将混合物置于反应孔中，于65℃恒温反应90min，最后80℃下保温5min以结束反应；
C、LAMP结果判断
扩增反应结束后，使用紫外线照射装置，波长240-260nm，350-370nm，从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察，若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性即样品中带有马铃薯X病毒；若与阴性对照一样未发出绿色荧光，则判定样品中没有携带马铃薯X病毒。
实施例4
一种马铃薯X病毒鉴定方法，包括以下步骤：
A、植物组织总DNA提取；
步骤A中植物组织总DNA提取的具体步骤：
a制样：取0.5g的带毒组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；
b清洗纳米磁珠：取出免疫纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；
c结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；
d清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
e裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；
f取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为病毒RNA；
g核酸浓度的测定
取5μL DNA溶液加ddH2O梯度稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值；RNA的浓度按照以下公式计算获得：
RNA C＝40×N×A
式中：
C——RNA浓度(ng/μL)
A——260nm处的吸光值
N——核酸稀释倍数
1OD260nm＝40μg/mL单链RNA
当OD260/OD280比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增和LAMP检测。
其中所述纳米磁珠通过以下方法制备：
1)Fe3O4磁性纳米粒子制备与氨基化修饰
分别取5.2g FeCl3·6H2O、2.7g FeSO4·7H2O、0.85mL 12.1moL/L的浓盐酸溶解于200mL水中，超声脱氧，后将以上溶液滴入250mL、0.75moL/L NaOH溶液；所有反应在80℃下搅拌，随着反应的进行，反应液中出现黑色的沉淀，反应结束后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，再用去离子水清洗3次，无水乙醇清洗2次，并配成5g/mL的Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，取25mL Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，再用无水乙醇稀释到150mL，超声振荡30min，滴加0.4mL APTES，其中硅烷偶联剂：3-氨基丙基三乙氧基硅烷，室温下搅拌7h，反应完毕，用磁分离器将APTES修饰的Fe3O4磁性纳米粒子从反应介质中分离，并用无水乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5mg/mL的氨基化Fe3O4纳米磁珠无水乙醇溶液；
2)免疫磁珠的制备
取0.5mL氨基化Fe3O4纳米磁珠无水乙醇溶液，用1mL PBS清洗3次，磁分离器弃上清液，加入5％(V/V)戊二醛溶液2mL，室温振荡交联2h，磁分离，弃上清液，用PBS洗涤3次并弃上清液后，分别采用0.5mL不同稀释倍数的相应病毒抗体包被氨基化Fe3O4纳米粒子，室温下振荡固定2h，磁分离，用PBS和超纯水分别洗涤3次，再用PBS定容，4℃冰箱保存备用，到具有最佳吸附量的一病毒抗体免疫磁珠。
B、LAMP检测：
采用实施例2中所述的试剂盒配置预反应溶液，在预反应溶液中分别加入待检测的样品的DNA 5μL，使总量达到25μL；其中对照组在预反应溶液加入去离子水5μL；阳性对照在预反应溶液中加入带病毒的DNA 5μL；用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时避免产生气泡；将混合物置于反应孔中，于65℃恒温反应90min，最后80℃下保温5min以结束反应；
C、LAMP结果判断
扩增反应结束后，使用紫外线照射装置，波长240-260nm，350-370nm，从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察，若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性即样品中带有马铃薯X病毒；若与阴性对照一样未发出绿色荧光，则判定样品中没有携带马铃薯X病毒。
实施例5
一种马铃薯X病毒RT-LAMP鉴定用的试剂盒，该试剂盒包括有：
其中引物序列：
PVX-F3:5’-ACAGGCTGCTTGGGACTT-3’
PVX-B3:5’-GTTAGCAGGTGGACTGTTGT-3’
PVX-FIP:5’-ATGCCGTTGGAATAGGGACCTG-GCTGATGTAGGATCATCCGC-3’
PVX-BIP:5’-AGCAGAGCTAGACTGGCAGCA-CCATACCACTGGGGCATAC-3’。
本发明中所述的2×反应液缓冲液由以下组分组成：
所述的酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。
荧光目视检测试剂中含有钙黄绿素荧光染料。
SEQUENCE LISTING
<110> 陈, 定虎
<120> 马铃薯X病毒鉴定用的引物、试剂盒及鉴定方法
<130> 马铃薯X病毒鉴定用的引物、试剂盒及鉴定方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Potato virus X
<400> 1
acaggctgct tgggactt 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Potato virus X
<400> 2
gttagcaggt ggactgttgt 20
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> Potato virus X
<400> 3
atgccgttgg aatagggacc tggctgatgt aggatcatcc gc 42
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Potato virus X
<400> 4
agcagagcta gactggcagc accataccac tggggcatac 40

Claims (8)

1.一种马铃薯X病毒鉴定用的引物，其特征在于包括：
PVX-F3:5’-ACAGGCTGCTTGGGACTT-3’
PVX-B3:5’-GTTAGCAGGTGGACTGTTGT-3’
PVX-FIP:5’-ATGCCGTTGGAATAGGGACCTG-GCTGATGTAGGATCATCCGC-3’
PVX-BIP:5’-AGCAGAGCTAGACTGGCAGCA-CCATACCACTGGGGCATAC-3’。
2.一种马铃薯X病毒鉴定用的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的2×反应液缓冲液由以下组分组成：
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。
5.根据权利要求2至4所述的任一种试剂盒，其特征在于荧光目视检测试剂中含有钙黄绿素荧光染料。
6.一种马铃薯X病毒鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
A、植物组织总DNA提取；
B、LAMP检测：
采用权利要求2所述的试剂盒配置预反应溶液，在预反应溶液中分别加入待检测的样品的DNA 5μL，使总量达到25μL；其中对照组在预反应溶液加入去离子水5μL；阳性对照在预反应溶液中加入带病毒的DNA 5μL；用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时避免产生气泡；将混合物置于反应孔中，于65℃恒温反应90min，最后80℃下保温5min以结束反应；
C、LAMP结果判断
扩增反应结束后，使用紫外线照射装置，波长240-260nm，350-370nm，从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察，若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性即样品中带有马铃薯X病毒；若与阴性对照一样未发出绿色荧光，则判定样品中没有携带马铃薯X病毒。
7.根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于步骤A中植物组织总DNA提取的具体步骤：
a制样：取0.5g的带毒组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；
b清洗纳米磁珠：取出免疫纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；
c结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；
d清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
e裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；
f取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为病毒RNA；
g核酸浓度的测定
取5μL DNA溶液加ddH2O梯度稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值；RNA的浓度按照以下公式计算获得：
RNA C＝40×N×A
式中：
C——RNA浓度(ng/μL)
A——260nm处的吸光值
N——核酸稀释倍数
1OD260nm＝40μg/mL单链RNA
当OD260/OD280比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增和LAMP检测。
8.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于所述纳米磁珠通过以下方法制备：
1)Fe3O4磁性纳米粒子制备与氨基化修饰
分别取5.2g FeCl3·6H2O、2.7g FeSO4·7H2O、0.85mL 12.1moL/L的浓盐酸溶解于200mL水中，超声脱氧，后将以上溶液滴入250mL、0.75moL/L NaOH溶液；所有反应在80℃下搅拌，随着反应的进行，反应液中出现黑色的沉淀，反应结束后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，再用去离子水清洗3次，无水乙醇清洗2次，并配成5g/mL的Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，取25mL Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，再用无水乙醇稀释到150mL，超声振荡30min，滴加0.4mL APTES，其中硅烷偶联剂：3-氨基丙基三乙氧基硅烷，室温下搅拌7h，反应完毕，用磁分离器将APTES修饰的Fe3O4磁性纳米粒子从反应介质中分离，并用无水乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5mg/mL的氨基化Fe3O4纳米磁珠无水乙醇溶液；
2)免疫磁珠的制备
取0.5mL氨基化Fe3O4纳米磁珠无水乙醇溶液，用1mL PBS清洗3次，磁分离器弃上清液，加入5％(V/V)戊二醛溶液2mL，室温振荡交联2h，磁分离，弃上清液，用PBS洗涤3次并弃上清液后，分别采用0.5mL不同稀释倍数的相应病毒抗体包被氨基化Fe3O4纳米粒子，室温下振荡固定2h，磁分离，用PBS和超纯水分别洗涤3次，再用PBS定容，4℃冰箱保存备用，到具有最佳吸附量的一病毒抗体免疫磁珠。
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