CN102260752B - 检测轮状病毒a组的组合物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测轮状病毒A组的组合物，属于生物技术领域，包括下述引物5’-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCC-3’和5’-AAYTGYGGTATATTCAATACCATACA-3’还包括探针：5’-荧光报告基团AARGAGCTAWCCGYTAGCCAGACGG-荧光淬灭基团-3’，还公开了包含上述引物和探针的试剂盒及应用其检测轮状病毒A组的方法，利用本发明的组合物、试剂盒和/或方法对轮状病毒A组进行检测时，检测范围为108～101拷贝基因组当量/反应体系，该检测快速简便，整个反应在3小时内完成，并且特异性高，准确度高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种特异性检测病毒的组合物、试剂盒和检测方法。
背景技术
轮状病毒主要感染人体小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻，病程一般为一周左右，发热持续3天，呕吐2～3天，腹泻5天，严重者出现脱水症状。引起小儿秋冬腹泻的轮状病毒主要属A组，成人轮状病毒多为B组，A、B组形态上无法区分。全世界每年因轮状病毒A组感染导致的婴幼儿死亡的人数大约为90万人，其中大多数发生在发展中国家。在我国， 2岁以内的婴幼儿约为4000万人，每年大约1000万婴幼儿患轮状病毒感染性胃肠炎，占婴幼儿人数的1/4，是引起婴幼儿严重腹泻的最主要病原。
轮状病毒为双链RNA病毒，球形颗粒，直径70nm，结构稳定，耐热，耐酸碱，表面有血凝素，培养较困难。轮状病毒是由粪口路径传播，也有可能经由呼吸路径传染。受感染者每毫克粪便中可以包含上亿个有传染性的病毒颗粒，其中只要10个到100个病毒颗粒就可以具备传播和感染能力。轮状病毒A组在20℃左右活跃，其流行有明显的季节性。儿童多集中在每年10月至12月期间感染轮状病毒，秋冬交接时期尤其要注意谨防小儿感染轮状病毒。
人一生中感染轮状病毒A组的经过大致为：第一次感染通常会产生症状，感染后，免疫系统产生部分的保护机制，故下一次感染通常无症状。童年获得的免疫力使大部分的成人对轮状病毒A组并不易感。两岁以下儿童的感染症状发生比例最高。虽然新生儿感染的机会很常见，但是通常症状温和或是无症状；六个月到两岁的小孩及存在免疫缺陷的小孩的症状最为严重。
轮状病毒A组在婴幼儿之间有很强的传染性和致病性，为了有效的保护患儿和易感儿童，应做到早发现、早隔离、 早诊断、早治疗，这使轮状病毒A组的早期诊断方法显得尤为重要。由于该病毒血清型较多，病毒分离或培养繁杂费时，且费用高，实验条件高，使以往的病原学诊断受到限制。抗原金标法检测敏感度低，假阴性高，细胞培养费时费力，不利于快速检测，并且涉及活的病毒培养，对于操作人员来说具备一定的危险性。近年来针对病毒核酸序列的PCR反应快速检测技术开始出现。对于PCR检测来说，引物的选择至关重要，直接影响检测的特异性。如果引物特异性不够，则可能导致检测的假阳性结果或者假阴性结果的出现。目前，发明一种能特异性检测轮状病毒A组的物质和方法非常紧迫，但是还没有相关报道。
发明内容
本发明的目的之一在于针对上述存在的问题，提供一种能特异性检测轮状病毒A组的组合物。
本发明采用的技术方案是这样的：一种检测轮状病毒A组的组合物，包括下述引物：
P1：5’- GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCC -3’，
P2：5’- AAYTGYGGTATATTCAATACCATACA -3’，其中，Y为C或T。
作为优先：还包括下述探针：
Probe：5’-荧光报告基团AARGAGCTAWCCGYTAGCCAGACGG -荧光淬灭基团-3’，其中 R为A或G，Y为C或T，W为 A或T。发明人针对病毒特异的靶序列设计Taqman探针，用于检测病毒时很大程度上保证了结果的特异性
进一步的：其中所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为ECLIPSE。
本发明的目的之二在于：提供一种能特异性检测轮状病毒A组的试剂盒。
采用的技术方案为：一种检测轮状病毒A组的试剂盒，包括病毒RNA逆转录反应体系、PCR反应体系和上述的组合物。
作为优选：所述PCR反应体系为实时荧光PCR反应体系。
本发明的发明目的之三在于：提供一种能特异性检测轮状病毒A组的方法。
采用的技术方案为：一种检测轮状病毒A组的方法，依次包括以下步骤：
1) 提取样品中的病毒RNA；
2) 使用权利要求1-3中所述的组合物和使用权利要求4或5所述的试剂盒，用PCR法扩增所述病毒相应核酸序列；
3) 反应的结果进行分析：上述步骤（2）实时荧光 PCR反应的结果进行分析，得出检测结论。
作为优选：所述的PCR法为实时荧光PCR法。
进一步的：所述实时荧光PCR反应体系为：反应体系为20μl,包括： 5×PCR缓冲液4 ??l、10mmol/L dNTP 0.8??l、20??mol/L引物各0.4 ??l、10??mol/L 探针各0.4 ??l、QIAGEN逆转录酶和聚合酶混合物0.8??l、模板2ul，加灭菌水至终体系20 ??l。
作为优选：所述PCR法的循环参数为：
50℃，逆转录30min；95℃，10min; 进入循环阶段：95℃变性15s，56℃退火延伸1min，共反应40个循环，退火延伸阶段采集荧光信号。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：本检测体系所检测标本无活病毒，在样品处理的第一步RNA提取的裂解过程中就可使活病毒迅速死亡，减少了对操作人员的生物危害。本方法无需培养，整个反应在3小时内完成，大大节省了人力与时间，可用于快速检测轮状病毒A组。
在更加优选的实施方式中，采用本发明所述的特异性探针，利用TaqMan实时荧光PCR技术进行检测，该方法由于自动化程度高，无需开盖检测PCR产物，减少了产物污染的机会。
利用本发明的组合物、试剂盒和/或方法对轮状病毒A组进行检测时，检测范围为108～101拷贝基因组当量/反应体系，该检测快速简便，整个反应在3小时内完成，并且特异性高，准确度高。
附图说明
图1实时荧光PCR检测体系检测轮状病毒RNA的灵敏度对比图（图中106～101为轮状病毒RNA的拷贝数）；
图2实时荧光PCR检测体系对轮状病毒A组RNA的检测特异性对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细的说明。需要指出的是，这里列出的实施例仅仅为示例性说明的目的，而不应将其解释为对本发明范围的任何限制。其中使用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人员可根据需要选择其他公司的相应试剂以实现本发明的目的。
为了特异性检测轮状病毒A组，发明人选择了其基因组特异性序列作为靶标序列，针对该序列设计了特异性引物，并通过大量实验选择了最具有特异性的一对引物（P1和P2，见下表1）用于本发明中。
在本发明的一个实施方式中，选择P1和P2作为特异性引物，用RT-PCR方法检测样品中轮状病毒A组的RNA的存在。使用该方法，可特异性检测样品中轮状病毒A组的RNA，进而特异性检测样品中轮状病毒A组的存在，并且在检测初期就要求裂解使病毒死亡，不会对实验操作人员造成威胁。优选使用荧光实时PCR法检测，同时整个检测过程中无需对检测物开盖取出进行普通PCR的凝胶电泳，减少了污染，节约了时间，使检测和分析更加简便，缩短了检测的时间；使用TaqMan技术标记的荧光实时PCR法，该探针为针对该靶标序列特异性探针，增强了检测的特异性。本发明中荧光报告基团和荧光淬灭基团可以分别是FAM和Eclipse。
引物和TaqMan探针的设计与合成
利用Genbank的Blast工具对轮状病毒A组基因组进行分析，选择其稳定的保守区域作为检测靶标序列，并针对检测靶标序列设计引物和探针（见表1）。引物和探针均由日本TaKaRa大连宝生物公司合成，其中检测探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记Eclipse荧光淬灭基团。
表1 引物及探针序列
检测前的准备
用PBS将轮状病毒粪便标本稀释10倍，置于漩涡震荡器混匀，室温静置10min，室温下≥2000rpm离心5min，取上清，分装保存于-80℃冰箱。
病毒RNA的提取
采用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒RNA，提取步骤如下:
1) 取标本上清液140μL加入560μL lysis buffer（AVL），在旋涡混合器上震荡15秒混匀，室温静置10分钟。
2) 加入560μL无水乙醇终止反应，在旋涡混合器上震荡15秒混匀。
3) 裂解后的液体分兩次移入管中，每次8000rpm离心1分钟，此时病毒RNA会吸附在管柱底部的膜上。
4) 加500μL洗液（AW1）至管柱上，8000 rpm离心1分钟，弃去AW1。
5) 加500μL洗液（AW2）至管柱上，14000 rpm离心3分钟，弃去AW2。进一步离心14000rpm 1分钟以彻底去除残留在膜上乙醇。
6) 加入60μL洗脱液（AVE），室温静置1分钟。
7) 将管柱置于1.5mL离心管上，4℃离心8000rpm 1分钟，得到的RNA即可进行实时荧光RT-PCR检测。
标准品的构建与制备
提取轮状病毒RNA，采用紫外分光光度法定量的方法计算基因组拷贝数，将准确定量的轮状病毒RNA作为标准品，采用无RNase 水作10倍系列稀释。
实时荧光PCR反应体系：
反应体系为20μl,包括 5×PCR缓冲液4 ??l、10mmol/L dNTP 0.8??l、20??mol/L引物各0.4 ??l、10??mol/L 探针各0.4 ??l、QIAGEN逆转录酶和聚合酶混合物0.8??l、模板2ul，加灭菌水至终体系20 ??l。
PCR循环参数: 50℃，逆转录30min；95℃，10min; 进入循环阶段：95℃变性15s，56℃退火延伸1min，共反应40个循环，退火延伸阶段采集荧光信号。在扩增结束后按同一条件分析数据，确定各样品的Ct值。
检测敏感度的评价
采用制备的轮状病毒RNA标准品稀释液（1×106～101拷贝基因组当量/μl）为模板，对TaqMan实时荧光PCR反应体系进行了灵敏度评价，结果如图1，结果显示，采用本检测体系的最低检测限为1×101拷贝基因组当量/反应体系。
检测特异性的评价
以7种其他致腹泻病毒或肠道中常见的病毒RNA为模板评价了TaqMan实时荧光PCR反应体系的特异性，这7种对照病毒分别为诺如病毒Ⅰ型、诺如病毒Ⅱ型、脊髓灰质炎病毒（sabin株）Ⅰ型、脊髓灰质炎病毒（sabin株）Ⅱ型、脊髓灰质炎病毒（sabin株）Ⅲ型、腺病毒、肠道病毒71型。
利用实施范例中所述的体系对轮状病毒A组RNA进行检测时可见明确的扩增曲线，对上述7种其他致腹泻病毒或肠道中常见的病毒的 5×105 pg每反应体系进行检测时均未产生阳性扩增曲线，说明我们使用的探针和引物与我们选定的7种其他致腹泻病毒或肠道中常见的病毒之间不存在交叉反应，结果见图2，图2中阳性扩增曲线为轮状病毒A组的荧光检测信号，水平信号线分别为阴性对照和7种对照病毒的荧光检测信号。
尽管上文中以优选的方式，通过具体实施例示例性说明了本发明的某些实施方式，但是本领域技术人员应了解，本发明并不限于上面所公开的实施方式，而是可以根据本发明所属技术领域的知识对其进行修改，所作修改不会超出本发明要求保护的范围。例如，本发明所使用的荧光实时RT-PCR也可以根据需要采用说明书中所列出的实施例中指出的荧光报告基团和荧光淬灭基团以外的标记物质，如Tet、FAM、HEX、TAMRA、ROX 、Cy3、TxRd、JOE等标记物；或使用Taqman技术之外的其它标记体系，例如MGB探针、分子信标MB探针、蝎形探针、荧光双杂交探针等荧光探针标记技术；或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不饱和染料与LC Green等饱和染料，只要其使用了本发明所述的特异性引物序列，即可定性或定量检测目的基因的存在，进而特异性地检测轮状病毒A组的存在。所以，这些本领域技术人员所了解的改变和惯用手段的替换也落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围应由所附的权利要求书所限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都新基因格生物科技有限公司
<120> 检测轮状病毒A组的组合物、试剂盒及方法
<130> 201108
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggctttaaaa gagagaattt cc 22
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaytgyggta tattcaatac cataca 26
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aargagctaw ccgytagcca gacgg 25
Claims (4)
1.一种检测轮状病毒A组的组合物，其特征在于：包括下述引物：
P1：5’- GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCC -3’，
P2：5’- AAYTGYGGTATATTCAATACCATACA -3’，其中，Y为C或T，所述的组合物中还包括下述探针：
Probe：5’-荧光报告基团AARGAGCTAWCCGYTAGCCAGACGG -荧光淬灭基团-3’，其中 R为A或G，Y为C或T，W为 A或T。
2.根据权利要求1所述的检测轮状病毒A组的组合物，其特征在于：其中所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为Eclipse。
3.一种检测轮状病毒A组的试剂盒，其特征在于：包括病毒RNA逆转录反应体系、PCR反应体系和权利要求1或2所述的组合物。
4.根据权利要求3所述的检测轮状病毒A组的试剂盒，其特征在于：所述PCR反应体系为实时荧光PCR反应体系。
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