DE2708985A1 - Ermittlung von haeparin in blutplasma - Google Patents

Ermittlung von haeparin in blutplasma

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DE2708985A1
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Description

Br/Sb/7 TERGAU & POHL
PAT ENlA N W Ä LT E HEFNERüPL 3 · POSTF. 9347
eeOO NÜRNBERG
Leuven Research & Development V/.Z.iil., Löwen, Belgien. Ermittlung von Häparin in Blutplasma.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ermitteln von Häparin in Blutplasma.
Häparin ist ein (flukopolysaccharic! mit einem Molekulargewicht von durchschnittlich 18.000, das im pharmakotherapeutischen Bereich als Antiblutkoagulationsniittel angewandt wird. Nach parentaraler Anwendung hat es eine sofortige Antithrombin-Jirkung, wodurch die Verwandlung von Fibrogen in Fibrin gehemmt iuird und es wird deshalb häufig in der klinischen Praxis angewandt.
Zum Ermitteln von Häparin im Blut sind bereits biologische Verfahren bekannt, die schnell durchführbar sind und gute Resultate geben. Nichtsdestoweniger besteht noch Bedarf an anderen Ermittlungsverfahren, die in Fällen, vuo das biologische Verfahren lusniger empfindlich ist (z.B. bei niedrigen Häparindosen), oder in Sonderfällen, z.B. wenn man feststellen mill, aus welchem Grunde das Häparin nicht richtig wirkt, oder wie die Distribution von Häparin über Antithrombin III und anderen Plasmaproteinen bsi einem Patienten verläuft, Anwendung finden können.
Bei Proben, die zur Erfindung führten, hat man nun überraschend festgestellt, dasz bei Anwesenheit von Häparin im Blutplasma bei Zusammenbringung mit Antistoffen gegen Thrombin-Antithrombin III-Komplex eine positive Reaktion entsteht. Es uar schon
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bekannt, dasz daii Häparin mit Anti thrombin III, einem bekannten Inhibitor des Blutkoagulationssystems, einen Komplex bildete. Anscheinend kommen dabei antigene Strukturen zum Vorschein, die wenigstens teilweise mit den antigenen Strukturen von Thrombin-Antithrombin III-Komplex übereinstimmen, so dasz der Häparin-Antithrombin HI-Komplex mit den Antistcffen gegen den Thrombin-Antithrombin III-Komplex reagieren kann. Aufgrund dieser Erfahrungen konnte ein neues Verfahren zum Ermitteln won Häparin in Blutplasma entworfen werden.
Die Erfindung verschafft nun ein Verfahren zur Ermittlung von Häparin in 81utplasma, das dadurch gekennzeichnet ist, dasz man auf immunochemischem Uege die Anwesenheit von Häparin-Antithrombin III-Komplex im zu untersuchenaen Blutplasma feststellt. Vorzugsweise stellt man diese Anwesenheit fest mittels Antistoffen gegen Thrombin-Antithrombin III-Komplex. In dieser UJeise kann man ziemlich einfach den Häparingehalt im Blutplasma und damit auch das Antikoagulationsniveau im Blutplasma ermitteln.
Es wird bemerkt, dasz sowohl Thrombin wie Antithrombin III bekannte Bestandteile des Blutkoagulationssystems sind. Hingegen ist der Thrombin-Antithrombin III-Koirplex nur noch vor kurzer Zeit entdeckt worden. Dieser Thrombin-Antithrombin III-Komplex, sowie seine Isolierung aus aktiviertem Blutplasma, und die Aufbereitung eines Antiserums dagegen, werden beschrieben in deutscher Patentanmeldung P. 2641840.6. In genannter Patentanmeldung wird auch die Möglichkeit angegeben, mit Hilfe des Antiserums oder von Antistoffen daraus die Anwesenheit des in Rede stehenden T-AT-Komplexes in Blutplasma auf immunochemischem üJege aufzuweisen. Es wird jedoch nachdrücklich
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darauf hingeiuieson, dasz das Antiserum und die Antistoffe im qsnannten älteren Fall nur zur Ermittlung der Anwassnheit von Thrombin-Antithrombin III-Komplex dienten, während die vorliegendes Erfindung sich gerade auf die Ermittlung des Häparin-Antithrombin IH-Xomplexsf? in Blutplasma richtet.
Das Ermittlungsv/erfahrun gemäsz der Erfindung kann im Prinzip in diversen Weisen durchgeführt werden.
Vorzugsweise wird das Ermittlungsverfahren jedoch dadurch durchgeführt, dasz man das zu untersuchende Blutplasma zusammenbringt mit einem Latex uon Kunstharzteilchen oder einer Suspansion von Blutkörperchen, uielche Teilchen oder welche Körperchen Antistoffe gegen den Thrombin-Antithrombin 111-Komplex an dar Oberfläche tragen, und man dann beobachtet ob Agglutination ujohl oder nicht auftritt (direkter Agglutinationstast). In der Praxis wird man diversa Verdünnungen des zu untersuchenden Blutplasmas aufbereiten und dann beobachten, bei welcher Verdünnung noch gerade Agglutination auftritt. Aus der gefundenen Verdünnung uiird ein gßuiüzer Zahl erhalten, der der Titer des Blutplasmas genannt uiird. Hieraus kann man die Häparinmenge im Blutplasma berechnen durch Vergleich Vergleichung mit den Titern von Blutplasma, dem bekannte Häparinmengan hinzugefügt ujurden. Falls die Antistoffe der angewandten Reagenz im Voraus gut gesäubert uiurden, kann eine grosze Differenz zu/ischen dan Titern bei ι positiven und negativem Ergebnis und damit ein u/ohl anwendbares Ermittlungsverfahren erzielt uierden.
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Selbstverständlich mardsn die Antistoffe der angewandten Reaganz ohne Anwesenheit von Häpnrin aufbereitet und gesäubert sain liiüszen, ueil anders dss Vermögen zur Reaktion mit Häparin-Antithrombin 111-Komplex verloren gehen könntB.
Bei Proben mit dem Ermittlungswerfahren gemäsz der Erfindung hat es sich herausgestellt, dasz in geiuiszen Fällen ein falsches positives Ergebnis erzielt wurde, nämlich wenn das zu untersuchende Blutplasma Thrombin-Antithrombin III-Komplex enthielt. Die Erklärung ist, dasz sowohl der T-AT-Komplex wie der Häp-AT-Komplex mit den Antistoffen gsgen T-AT-Konplex reagieren können, wodurch Störung der erwünschten Reaktion auttreten kann.
Dieses falsche positive Ergebnis kann jedoch dadurch vorkommen werden, dasz zusätzlich der Ermittlungsprobe ansich eine Kontroliprobe durchgeführt wird, wobei das zu untersuchende Blutplasma mit einem Latex von Kunstharzteilchen oder einer Suspension von Blutkörperchen zusammengebracht wird, welche Teilchen oder Körperchen Antistoffe gegen den Thronbin-Antithrombin III-Komplux an der Oberfläche tragen, und man dann beobachtet, ob Agglutination u/ohl oder nicht auftritt. Der Unterschied ist hier, dasz die Antistoffe für die Kontrollprobe in Anwesenheit von HMparin aufbereitet und gesäubert wurden, d.h. inkubiert mit Häparin-AT-Komplex, wodurch das Vermögen, später noch in einem Agglutinationstest mit Häp-AT-Komplex zu reagieren, verloren gegangen ist. Die mit Häparin behandelten Antistoffe können bei der Kontrollprobe noch u/ohl mit T-AT-Komplex reagieren und wenn man deshalb während der Kontrollprobe ein positives Ergebnis findet mit ungefähr dem gleichen Titer
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uiie bei der eigentlichen Ermittlungsprobe, so ist es deutlich, dasz der Test nur Anwesenheit von T-AT-Komplex im Blutplasma aftueist. Findet man hingegen uiährend der Kontrollprobe ein negatives Ergebnis, uiährend die richtige Ermittlungsprobe ein positives Ergebnis gab, so uiar geuiisz HSparin im Blutplasma anwesend.
Auch hat es sich herausgestellt, dasz Blutplasma eines Patienten mit Rheumafaktor im Blut ein falsches positives Ergebnis aufweisen kann. Durch Behandlung des zu untersuchenden Blutplasmas mit insolubilisierten menschlichen Gamma-Globulinen kann dieser Rheumafaktor jedoch vollständig aus dem Blutplasma entfernt werden, uonach das restliche Plasma sich zur Durchführung des Ermittlungsverfahrens eignet.
Das Ermittlungsverfahren gamäsz der Erfindung kann nicht nur dienen zur qualitativen Ermittlung von Häparin in Blutplasma, sondern in gemiszem Sinne auch zu einer quantitativen Ermittlung desselben. Wie nämlich aus den Beispielen hervorgehen uiird, nimmt bei steigenden Häparin-Konzentrationen der Titer des Blutpltsnas proportional zu mit der Zunahme der Konzentration.
Zum Durchführen des Diagnosetests gemäsz der Erfindung benötigt man eine spezielle Latex- oder Biutkörperchenreagenz. Diese kann aufbereitet werden dadurch, dasz man einen Latex von Kunstharzteilcnen oder eine Suspension von roten Blutkörperchen mit einem gegen Thrombin-Antithrombin III-Komplex gezeugtes Antiserum zusammenbringt, so dasz die Antistoffa aus diesem Antiserum sich an die Oberfläche der Kunstharzteilchen oder Blutkörperchen heften.
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Das benötigte Antiserum gegen Thrombin-Antithrombih III-Koniplax kann in der üblichen lileioe aufbereitet uerden durch Einspritzung des in Rede stehenden Komplexes bei Kaninchen, regelmäszige Blutabnahme von den Kaninchen und Sammlung des Blutserums aus dsm abgenommenen Blut. Das Antiserum kann dann gesäubert werden, zu welchem Zueck verschiedene Verfahren zur Verfügung stehen, wie Chromatographie über insolubilisiertes Blutplasma (wobei das Filtrat weiter angewandt wird). Vorzugsweise wird das Antiserum jedoch gesäubert durch Immunopräzipitation mit frischem menschlichem Blutplasma, aufgefolgt durch Chromatographie über einen insolubilisierten Thrombin-Antithrombin ΙΙΙ-Komplex, wodurch ein Serum, da3 längere Zeit stabil bleibt, erhalten wird.
Die Säuberung des Antiserums kann sowohl in Anwesenheit wie in Abwesenheit von Häparin stattfinden, um nachher Antistoffe für den Kontrolltest, bzw. den eigentlichen Ermittlungstest zu erhalten. Dieses Häparin wird dann z.B. dem menschlichen Blutplasma während der Imniunopräzipitation im vorzugsweise angewandten Säuberungsverfahren hinzugefügt.
Der benötigte Thrombin-Antithrombin ΙΙΙ-Komplex kann erhalten werden durch Isolierung aus Blutplasma, dessen Koagulationsmechanismus aktiviert ist. Diese Isolierung geschieht z.B. durch Affinitätschromatographie auf Häparin-Sephadex und Gelfiltrierung auf Ultrogel AcA 22.
Uebrigens wird bemerkt, dasz die Verfahren zur Aufbereitung und Säuberung des T-AT-Komplexes, des Antiserums und der
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Latex- oder aiutkörperchenraagenz ansich kein Teil der vorliegenchin Erfindung ausmachen. Oiesa Vorfahren und ihre Resultate iaarden anderweitig beansprucht.
In nachfolgenden Beispielen wird das Errnittlungsverfahren durch Beispiele über die Aufbereitung, Isolierung und Säuberung der benötigten Reagenz und der dazu benötigten Stoffe vorangegangen, um ein vollständiges Bild der fööglichkeiten zu geben. Es wird jedoch klar sein, dasz diese Beispiele nicht als erschöpfend zu betrachten sind.
Beispiel I. Isolierung von Thrombin-Antithrombin III-Komplex aus Blutplasma.
Der Thrombin-Antithrombin III-Komplex laurde isoliert aus mit Reptilase defibriniertem Blutplasma, dessen Koagulationsmechanismus auf intrinsikem Wege aktiviert uar. Die Isolierung geschah durch AffinitStschromatographie auf Häparin-Sepharose und Gelfiltration auf Ultrogel AcA 22.
Rohstoffe. Als Ausgangsrnaterial diente Blutbankplaama won normalen Spendern, aufgefangen auf ACÜ-Antikoagulanz. Zum Defibrinieren wurde Reptilase (Defibrass von Pentapharm, Basel) angewandt, mährend zur Aktivierung des Koagulationssystems Kalziumchlorid und Phospholipid (Thrombofax von Ortho Pharmaceutical Company) angewandt uurds. Weiter gelangte radioaktiv markierter Prothrombin, erhalten durch Markierung von gesäubertem menschli-
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ehern Prothrombin in der üeise von (ficFarlane mit I, zur Anwendung (s. Nature, (London) 132, b3 195).
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Aktiviarsn. Portionen von 2 1 Blutplasma wurde Dsfibrase in einor I:1emj9 von 1 ml pro liter hinzugefügt, wonach man das Plasma uährand 4 Stunden bei 37 U und einer Nacht in einem kalten Zimmer koagulieren liesz. Das geDildete Fibrin wurde allmählig durch Aufrollen auf einen Glasstab entfernt. Dem defibrinierten Plasma wurde
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eine Spurenmenge I-Prothrombin hinzugefügt, uionach das Koagulationssystem durch Hinzufügung von 28 ml 1 ft! CaCl und 40 ml Thrombofax per liter defibriniertes Plasma aktiviert iuurde. Die Aktivierung des Koagulationssystems wurde anhand dar Verringerung des anlesenden Prothrombins beobachtet. Nach etuia 1 Stunde war die Restmenge Prothrombin weniger als 5 %.
Isolieren. Für die Affinitätschromatographie wurde Häparin-Sepharose, das mit 0,1 IKl tris-HCl, 15 frt NaCl, 0,01 ΠΙ Zitratpuffer von pH 7,5 gewaschen und equilibriert wurde, angewandt. 150 ItIl dieses Häparin-Sepharose (Volumen nach Sedimentierung) wurde während 2 Stunden bei Zimmertemperatur mit 2000 ml des in obiger 'dJeise def ibrinierten und aktivierten Blutplasmas gemischt. Dann wurde das Gel auf einem Buchner Trichter mit 3 1 Equilibrationspuffer gewaschen und in eine Säule gegoszen. Das absorbierte Material wurde eluiert mit einem Salzgradient aus 500 ml 0,01 Ifl tris-HCl, 0,15 Rt NaCl, 0,01 IN Zitrat, pH=7,5, als Eingangspuffer und 0,01 Ifl tris-HCl, 1 W NaCl, 0,01 IKI Zitrat, pH=7,5, als Ausgangspuffer. Es wurden dabei drei verschiedene Fraktionen erhalten: (1) Lipoproteine, die besonders am Beginn des Gradientes eluierten und deren Mengen von Präparat zu Präparat wechselten; (2) einen Thrombin-Antithrombin III-Komplex, aufgewiesen durch gleichzeitige
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Elution von I und einem Antithrombin III verwandten Antigen bei einer Salzkonzentration von etwa 0,4 IKI, und (3) restliches Antithrombin III, eluiert nach der Spitze der vorigen Fraktion.
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Die Thrombin-Antithrorabin I II-Fraktionen aus div/arssn Proben wurden zusammengefügt und durch Ultrafiltration konzentriert. In diesem Stadium uar das Präparat verunreinigt mit Lipoproteinen, uie hervorging aus seiner Turbidität in Lösung und aus seiner geringen Mobilität in einem Polyacrylamidegel. Deshalb wurde das Präparat uieitar gesäubert durch Gelfiltration auf einer Säule Ultrogcl AcA 22 won 2,5 χ 45 cm, äquilibriert mit einem Puffer von 0,1 i! NaCl, 0,05 fil Phosphat, 0,02 % Azid, pH=7,5. Hierbei eluierten die Lipoproteine in der Nähe des lueren l/oluraens der Säule. Der Thrombin-Antithrcnbin-Komplex (nachstehend angedeutet mit T-AT), der nach Säuberung eine Tendenz zur Aggregatbildung aufwies, eluierte in einar breiten Spitze.
Das freie Antithrombin III eluierte spätnr. Die T-AT-Fraktionsn aus
125 diversen Proben, lokalisiert durch messung von I und aus einem Antithrombin III verwandtes Antigen wurden zusammengefügt und durch Uakuradialyse konzentriert. Der Durchschnittsertrag von 4 Isolierungsproben, jeweils ausgehend von 2 1 Blutplasma, belief sich auf 25 Einheiten optische Dichtigkeit pro Liter Plasma.
Identifizierung. Bei Elektrophorese von T-AT auf einem SD3-Polyakrylamidgel wurde ein scharfes Proteinband nit einem filolekulargeuicht von ungefähr 65.000 (freies Antithrombin III) erhalten, sowie verschwommene Bänder mit trägerer migration. Nach Reduzierung mit DTT wurden drei scharfe Bänder festgestellt mit Molekulargewichten zwischen 65.000 und 95.000, darunter Bänder von Antithrombin III und von ThTombin-Antithrombin III.
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Beispiel II Aufbsreitunq v/on Antiserum
Aufbereitung. Kaninchen wurden mit Thrombin-Antithrombin 111-Kornplex immunisiert (4 Kaninchen). Zu diesem Ziueck luurde der Komplex in eine 0,15 f?! Küchensalzlosung bis zu einer Konzentration won 0,2 mg pro ml gelöst und mit 1 ml komplette Freund Adjuvanz gemischt. Von dieser Mischung wurde 1 ml pro Kaninchen eingespritzt, vertfiilt über die Fuszsohlen, das subkutane Gewebe und die Schenkelmuskel. Dreimal nachdem, jeweils mit einer Zwischenpause von 1 oder 2 Wochen, wurde eine gleiche Menge Antigen eingespritzt, gemischt mit inkompletter Freund Adjuvanz und verteilt über den subkutanen und intramuskulären üJsg. Anfangend eine 'JJoche nach der vierten Injektion, wurde zweimal per Woche 30-80 ml Blut abgenommen durch Punktion der Ohrarterien. Das Serum von 3 oder 4 aufeinanderfolgenden Blutabnahmen wurde jeweils zusammengefügt und gasammentlich weiter verarbeitet. Der Titer des Antiserums wurde durch eine Hämagglutinationsprobe ermittelt. In einer Frist von 3 iflonaten wurde wohl 500 ml Antiserum per Kaninchen erhalten.
Ermittlung des Titers. Zur Durchführung des Agglutinationstests wurde eine Spazialreagenz aufbereitet, bestehend aus roten Blutkörperchen, die gesäuberten Komplex des T-AT-Typus an der Oberfläche trugen. Diese Reagenz wurde gemacht durch Gerbung von menschlichen roten Blutkörperchen der Q-Cruppe, die dann mit dem gesäuberten Komplex zusammengebracht wurden in der Weise, die von IDerskey et al für Fibrinogen-Abbauprodukte beschrieben wurde (s. Proc.Soc.Exp.Biol.lfied. 131,871,1969). Es wurden 2 Einheiten
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optische Dichtigkeit das T-AT-Komplex in 1ÜQ ml Zitrat-Phosphatpuffer gelöst. Die Reagenz iuurde bei 4 C beuahrt und innornalb einem fr'.onat angewandt.
Aus dem Antiserurrt uturden diverse Verdünnungen gemacht, wonach jeda eine der Verdünnungen mit einer angepasztsn Reagenz zusammengebracht wurde, wonach das wohl oder nicht Auftreten von Hämagglutination beobachtet wurde. Die höchste Verdünnung, bei der noch deutlich sichtbare Hämagglutination auftrat, wurde ais Titer das Antiserums genommen. Die erhaltenen üJerte stellten sich als stark auseinandsrlaurend heraus, abhängig von den angewandten Versuchstieren und vom Moment der Blutabnahme.
Beispiel III Säuberung von Antiserum
Ein Antiserum gegen Thrombin-Antithrombin III-Komplex uiurde gesäubert durch Immunopräzipitation von nicht spezifischen Antistoffen mit Hilfe von frischen menschlichem Blutplasma, aufgafolgt durch Chromatographie über eine Säule aus insolubilisiertom Thrombin-Antithrombin III-Komplex.
Rohstoffe. Als Ausgangsmaterial diente ein gemäsz Beispiel II orhaltenes Antiserum. In der ersten Stufe wurde frisches menschliches Blutplasma angewandt, nämlich Slutbankplasma normaler Spender, aufgefangen auf ACD-Antikoagulanz, und uieitar der Stoff Para-Nitrophenyl-Para-Guanidobenzoat (p-NGB von Cyclochemical Comp.). Bei der Chromatographie uiurde eine Säule aus insolubilisiorten gesäubertem T-AT-Komplex, dessen Aufbereitung nachstehend angegeben uiird, angouiandt. Der dazu benötigte T-AT-Komplex uiurde goraäsz Baispiel I aufbereitet.
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Imnunopr'Jzipitation von nicht-spezifJGchen Antistoffen. 5 ml Antiserum ujurde p-f-)G3 hinzugefügt bis einer Endkonzentration von 10-5 fti und dann wurde 2 ml frisches menschliches Blutplasma hinzugefügt. Nach 3G Minuten rühren bei Zimmertemperatur wurde das erhaltene Präzipitat durch schleudern entfernt. Die rastliche Flüszigkeit u/urde für die Säulenchromatagraphie angewandt.
Aufbereitung von insolubilisiertem Thrombin-Antithrombin-III-Komplex. 30 ml Agarose (sedimentiertes Volumen), aktiviert mit 3 gr CNBr, uiurde gemischt mit 70 ml Kupplungspuffer (0,1 m NaHL03-0,5 Kl NaCl, pH=9,0) und 20 Einheiten O.D. (bei 280 nm) das Thrombin-Antithrombin II I-Kornplexas. Ungefähr 75 % des Proteinkomplexes uiurde an die Agarose gebunden. Aus diesem Produkt wurde eine Chromatographiersäule von 0,9 χ 15 cm aufgebaut.
Chromatographie. Die restliche Flüszigkeit des Antiserums uiurde mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/cm2/Stunde uber sine Säule des obigen aufbereiteten Thrombin-Antithrombin III-Komplexes geführt, welche Säule mit einem NaCl-Phosphatpuffer (0,1 Rl NaCl-0,05 Hl Na2HP04, pH=7,5) äquilibriert wurde. Die nicht-absorbierten Proteine wurden sorgfältig mit Aequilibrierungspuffer ausgewaschen. Demnächst wurden die gebundenen Antistoffe mit 3 M NH4SCN aluiert. Die gesammelten Eluate wurden dialysiert gegen den Aequilibrierungspuffer und konzentriert durch V/akuumdialyse.
Schliaszlich uiurde 3,5 ml gesäubertes Antiserum (Lösung von. spezifischen Antistoffen gegen Thrombin-Antithrombin III-Komplax) mit einer optischen Densität von 1,75 bei 280 nm erhalten. Dieses Antiserum wies bei Geldiffusion keine deutliche Reaktion mit frischem häparinfreiem Blutplasma auf, sondern wohl deutliche Präzipitinlinien
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mit frischem Blutserum. Es eignete sich als Antiserum für dis Anwendung eines Agglutinationshemmungstests.
Beispiel IU Säuberung von Antiserum
Oas Verfahren gemäsz Beispiel III uurde uiiederholt, mit dem Unterschied, dasz bei der Immunopräzipitation frisches menschliches Blutplasma, dem vorher Häparin hinzugefügt wurde, angewandt wurde. Dieses Häparin (Liquemine von Hoffmann-La Roch9, eine Lösung mit 50QQ IE pro ml) wurde in einer Wange von 3 IE pro ml Blutplasma angewandt. Nach Entfernung des erhaltenen Präzipitats wurde die restliche FlQszigkeit in derselben UeisB vuie in Beispiel III Säulenchromatographie unterzogen. Es wurde schlieszlich 3,5 ml gesäubertes Antiaerum mit einer optischen Densität von 175 bei 200 nm erhalten. Diese Lösung wies bei Geldiffusion keine deutliche Reaktion mit frischem Blutplasma auf, sondern uiohl deutliche PrSzipitinlinien mit frischem Blutserum.
Beispiel M Latexreagenz für den Diaqnosetest
Eine Spezialreagenz für die Durchführung.des klinischen Diagnosetests wurde dadurch aufbereitet, dasz Kunstharzteilchen an der Oberfläche mit spezifischen Antistoffen gegen T-AT-Kamplex versehen wurden.
Ein Latex von Kunstharzteilchen (Bacto-Latex von Difco Laboratories, Detroit, Hiich. USA) wurde zweimal mit einer Pufferlösung (0,02 M Giyzin, 0,03 ta NaCl, pH=9,0) gewaschen, wonach die Teilchen abgeschleudert (Sorvall RC2, 10.000 rpm, 5 Minuten) und
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in derselben Pufferlösung u/iedersuspendiert (1,6-mal das Ausgangsvolumen). Per milliliter buspension uiurde 0,1 ml gesäubertes Antiserum, erhalten gemäsz Beispiel III und 60 füinuten bei Zimmertemperatur gemischt, hinzugefügt. Die verkleideten Kunstharzteilchen wurden abgeschleudert, gewaschen mit einer Pufferlösung (0,02 f!l Glyzin, U,03 fü NaCl, pH = 9,0) und iuiedersuspendiert in einer anderen Pufferlösung (0,1 W Glyzin, 0,15 tu NaCl, pH = 9,0), der 1 % Kuh-Albumin (Pov/ite, Amsterdam) und 0,1 % Matriumazid hinzugefügt iuurde. Die erlangte Reagenz eignete sich zur Durchführung eines direkten Agglutinationstests.
Beispiel VI Latexreaqanz für Diaqnosetest
Das '«/erfahren gemäsz Beispiel V wurde wiederholt, mit dem Unterschied, dasz diesmal für die Aufbereitung ein Antiserum, gesäubert gemäsz Beispiel IU, angewandt uiurde. Die erhaltene Latexreagenz eignete sich zur Durchführung eines direkten Agglutinationstests.
Beispiel V/11
Durchführung das Diagnosstests
Bei der Durchführung des Diagnosetests wurden stets zuiei Proben gemacht, nämlich die eigentliche Ermittlungsprobe mit einer Latexreagenz gemäsz Beispiel V, und eine Kontrollprobe mit einer Latexreagenz gemäsz Beispiel UI. In beiden Fällen wurden diverse Verdünnungen des zu untersuchenden Blutplasmamusters in einer Pufferlösung (0,1 M Glyzin, 0,15 flil NaCl, 1 % Albumin, pH = 9,0) gemacht.
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Auf einam schwärzen Plättchen uiurda 2Ü mikroliter jedereinbr dar Verdünnungen oder der Pufferlösung allein (Blankoprobe) mit 20 ml der betreffenden Latexreagenz gemischt. Oie Suspension luurde kontinuierlich durch hin und her Neigen des Plättchens durcheinander gemischt und die Agglutination uiurde nach 3 Minuten (+ oder -) und nach 5 Minuten (+ oder -) abgelesen. Nachdem uiurden die Erini ttlungsprobe und die Kontrollprobd miteinander verglichen.
Beispiel VIII Resultate des Diaqnosetests
A. Frisches Blutplasma van 40 gesunden Personen agglutinierte die Latexteilchen von Beispiel U und UI in Verdünnungen von 1/2 bis 1/8, so dasz der Titer 2 bis θ uiar. Hingegen mies ein gesäuberter T-AT-Komplex (in einer Konzentration von 10 mg pro 100 ml) einen Titer von 160-320 auf. Im Serum von frischem Blut, aufgefangen in ein Glasrohr und inkubiert bei Zimmertemperatur, entstand, progressiv und parallel an der Abnahme der Prothrombin-Konzentration verlaufend, eine agglutinierende Aktivität, die nach 90 Minuten einen Titer von 320-640 erreicht hatte.
B. Bei Anwesenheit von Thrombin-Antithrombin III-Komplex im zu untersuchenden Blutplasma uiurde ein falsches positives Ergebnis erhalten, die aufgrund des Kontrolltests als solches aufgewiesen werden konnte. So ergab das Blutplasma von drei Krankenhauspatienten, die gemäsz der HSmostase-Probe eine träge intrauasculäre Agglutination aufwiesen, bsi der Ermittlungsprobe mit der Latexreagonz von Beispiel V eine agglutinierende Aktivität mit einam Titer von bzui. 32, 64 und 95. Bei der Kontrollprobe mit der Latexrea^anz
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von Beispiel UI wurde oinselbes Erganis erhalten, uias unzweideutig auf dia Anwesenheit von T-AT-Komplex im Blutplasma hiniuaist.
C. Frisches Blutplasma eines Patienten mit RheumaFaktor im Serum uies auch die Zeugung der Agglutination der Latexteilchen und somit eines hohen Titers auf. Durch Behandlung des Blutplasmas mit insolubilisierten menschlichen Gammaglobulinen konnte diese agglutinierende Wirkung jedoch, im Gegensatz zu der durch Koagulation das Blutes gezeugten 'Uirkung, entfernt u/erden.
D. lüurds dam frischen Blutplasma HMparin hinzugefügt, su wurde ein deutliches positives Ergenis erhalten, dadurch dasz der Ermittlungstest mit der Latexreagenz von Beispiel M einen erhöhten Titer, und der Kontrolltest mit der Latexreagenz von Beispiel V/I keine Erhöhung des Titers aufu/ies. Der Titer im eigentlichen Ermittlungstest, der anfangs 2-8 war, stieg proportional mit der Häparinkonzentration im Blutplasma und erreichte ein Maximum von 150 bei einer Konzentration von 2-10 IE Häparin per ml Blutplasma. Bei höheren Häparinkonzentrationen (10-50 IE per ml) nahm der Titer mieder ab. Dies gibt eine Möglichkeit zur quantitativen Ermittlung. . : - - -
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Claims (1)

  1. PATF ■! T A H S P R ü C H E
    1 J Verfahren zur Ermittlung won Hliparin in Blutplasma, dadurch gekennzeichnet, dasz man auf iirünunochßmischero 'Jegs dia Anwesenheit von Häparin-Antithrombin III-Komplex im zu untersuchondsn Blutplasma ermittelt.
    2. Verfahren gemäsz Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dasz man die Anwesenheit des Häparin-Antithrombin 111-Komplexas mit Hilfe won Antistoffen gegen Thrombin-Antithrombin III-Komplex ermittelt.
    Verfahren gernäsz Anspruch 1 und 2, dadurch ncj
    dasz man das zu untersuchende Blutplasma mit einem Latex won Kunstharzteilchen oder einer Suspension von Blutkörperchen zusammenbringt, welche Teilchen odar welche Körperchan Äntistoffe gegen den Thrombin-Anti thrombin 111-Koinpiex an der Oberfläche traqnn, und dann beobachtet, oD Agglutination uiohl oder nicht auftritt.
    4. Verfahren gemäsz Anspruch 3, dadurch gnkennzpichnat, dasz die Antistoffe für die eigentliche Errnittlungsprobe ohne Anwesenheit von Häparin aufbereitet und gesäubert uurden.
    5. Verfahren gemäsz Anspruch Ii und 4, dadurch gekennzeichr,et, dasz man zuzüglich der eigentlichen Ermittlungsproba einun Knncrolltest durchführt, dadurch dasz man das zu untersuchende Blutplasma zusammenbringt mit einem Latex von Kunstharzteilchen oder einer Suspension von Blutkörperchen, uielch= Teilchan oder Körpnrchen
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    L1 grigan den Thrombin-Anti thrombin III-Komplex an der Oberfläche tragen, dann beobachtet, ob Agglutination wohl oder nicht auftritt, unter der Bedingung, dasz die Antistoffe für den Kontrolltest in Anwesenheit von Häparin aufbereitet und gesäubert u/u r den.
    G. l/erfahren gemäsz Ansprucn 3-5, dadurch gekennzeichnet, dasz die Antistoffe aufbereitet wurden durch Säuberung eines Antiserums, gezeugt gegen Thrombin-Antithrombin III-Komplex, durch Immunopräzipitation mit frischem menschlicham Blutplasma, aufgefolgt durch Chromatographie über einen insolubilisierten Thrombin-Antithrombin III-Komplex.
    7. Verfahran gemäsz Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dasz man die Anwesenheit von Häparin-Antithrombin III-Komplex ermittalt mit Hilfe von ansich bekannten immunologischen V/erfahren, wie Immunodiffusion, Elektroimmuno-Assay, oder Radioimmuno-Assay.
    8. Verfahren gernäsz Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, dasz die Häparin-Ermittlung zur Ermittlung des Antikoahulationsnivaaus in menschlichem Qlutplasma angewandt. uiird.
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