DE3650536T2

DE3650536T2 - Mittels rekombinanter DNS-Techniken gebildetes Hepatitis-B-Oberflächenantigen, Impfstoffe, Diagnostika, Zellinien und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE3650536T2
Application number: DE3650536T
Authority: DE
Inventors: Mark L Rohrbaugh; John S Salstrom; Hans A Thoma
Original assignee: SmithKline Beecham Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1985-04-15
Filing date: 1986-04-15
Publication date: 1997-02-27
Anticipated expiration: 2006-04-16
Also published as: ATE139795T1; IE75355B1; ES8802440A1; EP0719863A1; JPS6255088A; FI861417A0; IL78472A; EP0198474A1; AP8600035A0; EP0198474B1; HK1003794A1; DE3650536D1; CN86102640A; ZA862797B; ES553953A0; YU60986A; IE860965L; IL78472A0; SG43220A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft bakterielle Plasmide, die den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich enthalten, denen jedoch die das Hepatitis-B-Kernantigen codierenden Seguenzen fehlen; diese Plasmide werden zur Transfektion eukaryotischer Zellinien für die Herstellung von Partikeln verwendet, die Polypeptide umfassen, die durch den PreS&sub1;- PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden.
Die in letzter Zeit erzielten Fortschritte der Gentechnik ermöglichten die Expression verschiedener Peptide und Proteine in Bakterien, Hefen und auch in Säugerzellen in größeren Mengen. Viele Proteine und Peptide wurden bereits in Bakterien in beträchtlichen Mengen exprimiert, jedoch wird speziell die Expression großer Mengen von Proteinen und Polypeptiden, die in der Humanmedizin eingesetzt werden sollen, in Säugerzeilen gewünscht, wodurch Nachteile vermieden werden können, die durch verunreinigende Produkte aus der Bakterienzelle entstehen oder durch die Expression in Bakterienzellen zustande kommen.
Von besonderem Interesse ist die Expression von Hepatitis-B-Oberflächenantigen-Proteinen in Säugerzellen in größeren Mengen. Die Expressionsrate dieser Polypeptide in Säugerzellen war bisher für eine wirtschaftliche Produktion dieser Polypeptide noch nicht ausreichend.
Das Hepatitis-B-Virus wird von Mensch zu Mensch übertragen und verursacht eine chronische und kraftraubende Infektion, die zu schweren Leberschäden, einem primären Karzimom und sogar zum Tod führen kann. In den meisten Fällen kann eine Hepatitis-B-Infektion vollständig geheilt werden. In vielen afrikanischen und asiatischen Ländern ist die Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus jedoch endemisch. Viele Bewohner dieser Länder sind chronische Träger des Hepatitis-B-Virus und deshalb potentielle Überträger dieser Krankheit.
Die einzige, bisher bekannte Methode zum Schutz gegen das Hepatitis-B-Virus ist die Impfung. Verschiedene Unternehmen (z.B. Merck, Sharp and Dohme, USA, und das Pasteur-Institut, Frankreich) haben kürzlich einen aus Plasma stammenden Impfstoff gegen das Hepatitis-B-Virus eingeführt. Der Impfstoff enthält als Antigen Hepatitis-B-Virus-Proteine, die normalerweise auf der Hülle des Virus-Partikels liegen. Ein solches Antigen wird üblicherweise als Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen bezeichnet (HBsAg), das Virus-Gen, welches das Antigen codiert, wird HBsAg-Gen genannt. Die vorstehend erwähnten Impfstoffe enthalten Oberflächenantigen, das aus dem Plasma von mit Hepatitis-B-Virus infizierten Menschen isoliert wurde. Obwohl das Oberflächenantigen selbst nicht pathogen ist, stimuliert es beim Menschen die Produktion von Antikörpern, die gegen Hepatitis-B-Virus-Partikel gerichtet sind.
Die einzige im Handel verfügbare Quelle von Hepatitis-B-Oberflächenantigen ist das Blut von Menschen, die mit dem Hepatitis-B-Virus infiziert sind. Die Isolierung und Reinigung des Oberflächenantigens aus menschlichem Serum ist ein komplexer, zeitaufwendiger und deshalb ziemlich kostenintensiver Prozess. Solange menschliches Serum die einzige im Handel verfügbare Quelle für Oberflächenantigen ist, ist außerdem die Menge des Oberflächenantigens begrenzt, das für die Verwendung in Impfstoffen zur Verfügung steht.
Für Impfungen in großem Maßstab, insbesondere in Gebieten, wo das Hepatitis-B-Virus endemisch auftritt, ist es besonders wichtig, eine billige und praktisch unbegrenzte Quelle von Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Virus zur Verfügung zu haben. Da bei Gewinnung des Oberflächenantigens aus menschlichem Serum die Gefahr besteht, daß es mit pathogenen Substanzen verunreinigt ist, ist es wünschenswert, kein menschliches Serum mehr als Quelle für Oberflächenantigen zu verwenden. Außerdem ist kein biologisches System, außer Menschen und Schimpansen, bekannt, in welchem das Hepatitis-B-Virus wachsen kann und vermehrt werden kann.
Die in letzter Zeit erzielten Fortschritte der Molekularbiologie ermöglichten die Clonierung der Seguenz des vollständigen Hepatitis-B- Virus-Genoms (Siddiqui, A. et al., Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 76 (1979), 4664; Sninsky, J. J., et al., Nature 279 (1979), 346; und Charnay, P., et al., Nucl. Acids Res. 7 (1979), 335). Außerdem wurden die codierenden Bereiche für die verschiedenen viralen Proteine des Hepatitis-B-Virus identifiziert (vgl. z.B., Europäische Patentanmeldung-Veröffentlichungsnr. 13828, 20251 und 38765; Galibert et al., Nature 281 (1979), 646-650; Pasek et al., Nature 282 (1979), 575-579; und Valenzuela et al., Nature 280 (1979), 815-819).
Mit Hilfe dieser neuen Verfahren wurden mehrere Wirtssysteme getestet, ob sie sich für die Expression dieses Teils des Virus-Genoms, der die Oberflächenantigen-Proteine des Hepatitis-B-Virus codiert, eignen.
Wie gezeigt wurde, können Bakterien in vielen Fällen ein billiges Produktionssystem für bestimmte eukaryotische Produkte bereitstellen Wenn eukaryotische Produkte in Bakterien synthetisiert werden, können jedoch viele Schwierigkeiten auftreten, z.B.:
1) das eukaryotische Strukturgen wird möglicherweise in Bakterien nicht effizient transkribiert, da sich die Codon-Verwendung in Bakterien und die Codon-Verwendung in Eukaryoten voneinander unterscheiden;
2) das eukaryotische Genprodukt kann für die Wirts-Bakterienzelle toxisch sein;
3) die Struktur und die Funktion des eukaryotischen Genproduktes kann von bestimmten post-translationalen Prozessen abhängig sein, wie z.B. Glykosylierung oder spezielle Verknüpfung von Disulfidbrücken, beide Prozesse können vom bakteriellen Wirt nicht durchgeführt werden;
4) nur selten wird das Genprodukt aus der bakteriellen Wirtszelle ausgeschieden;
5) eukaryotische Promotoren arbeiten üblicherweise nicht in Bakterien und müssen durch einen bakteriellen Promotor ersetzt werden, ein solcher Ersatz kann zu einer Modifikation des eukaryotischen Genproduktes führen, d.h., der N-terminale Teil des Produktes ist bakteriellen Ursprungs und umfaßt als erste Aminosäure das N-Formylmethionin, das in Eukaryoten nicht vorkommt und das für das Immunsystem der Säuger möglicherweise eine neue immunogene Determinante darstellt; und
6) während des Reinigungsprozesses können Bestandteile der bakteriellen Zeliwand zusammen mit dem Genprodukt gereinigt werden und in Säugetieren, die das Genprodukt erhalten, schwere allergische Reaktionen auslösen oder zu einem anaphylaktischen Schock führen.
Mit Hepatitis-B-Oberflächenantigen, das in Bakterien hergestellt wurde, sind bereits verschiedene Probleme aufgetreten. Erstens ist die Produktionsrate in Bakterien sehr gering, außerdem muß das Produkt aus einem Bakterienlysat gereinigt werden, da es durch die Bakterienzelle nicht ausgeschieden wird. Ein weiteres Problem besteht in der Tatsache, daß bestimmte post-translationale Prozesse in Bakterien nicht vorliegen, z.B. die Glykosylierung des Oberflächenantigens, wodurch die Stärke und die Spezifität der Immunantwort beeinflußt werden. Aus diesen Gründen ist es wünschenswert, keine Bakterien als Wirte zur Produktion zu verwenden.
Hefezellen, die mit einem geeigneten rekombinanten Vektor, der die Hepatitis-B-Oberflächenantigen-codierende Sequenz enthält, transformiert sind, synthetisieren und akkumulieren das Oberflächenantigen in beträchtlichen Mengen in der Hefekultur. Jedoch gibt es auch bei diesem Wirtssystem einige wichtige Nachteile, d.h., 1) das Oberflächenantigen wird nicht aus den Hefezellen ausgeschieden und muß aus einem Zellysat dieser Zellen isoliert werden, und 2) die Oberflächenantigen-Monomeren in Hefezellen bilden keine kovalent verknüpften Dimeren, wie das bei dem aus Säugerzellen ausgeschiedenen Oberflächenantigen der Fall ist.
In verschiedenen Versuchen wurden bereits Säugerzellinien für die Produktion von Oberflächenantigen eingesetzt. Diese Zellinien stammten von menschlichen hepatocellulären Karzniomen (Alexander, J. J., et al., Afr. Med. J. 50 (1976), 2124) und von Zellen, die mit donierter Hepatitis-B-Virus-DNA transfiziert waren. Außerdem wurden Nierenzellen von Affen mit rekombinanten DNA-Vektoren infiziert, die auf Simian Virus 40 (SV40) basierten und die 40 % des Hepatitis-B-Virus-Genoms enthielten (Laub, 0., et al., J. of Virol. 48 (1983), 271). Ferner wurden Co-Transfektions-Versuche unternommen, um Zellinien zu selektieren, die das Oberflächenantigen exprimieren (Standring, D. N., et al., J. of Virol 50 (1984), 563). Mittels Amplifikation des Gens der Dihydrofolatreductase (DHFR) wurden Säugerzellinien erhalten, die größere Mengen eines Antigens herstellen (Michel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81 (1984), 7708). Außerdem wurden für die Übertragung des Oberflächenantigen-Gens auf Säugerzellen eukaryotische Virus-Vektoren ausgewählt, wobei der transformierte Phänotyp als selektierbarer Marker verwendet wird (Hsiung, N., et al., Molec. and Applied Genetics 2 (1984), 497). In diesen Fällen wurden zur Selektion von Oberflächenantigen-produzierenden Zellinien DNA-Konstruktionen verwendet, die onkogene DNA-Sequenzen oder DNA-Sequenzen von onkogenen Viren enthielten. Die Verwendung einer onkogenen Sequenz als Selektionsmarker birgt jedoch neue Sicherheitsprobleme, wenn das durch diese Zellen hergestellte Oberflächenantigen für eine Impfung verwendet werden soll.
In verschiedenen Beschreibungen wird die Expression von Polypeptiden, die durch die Hepatitis-B-Virus-codierende Sequenz synthetisiert werden, diskutiert.
In der europäischen Patentanmeldung-Veröffentlichungsnr. 013 828-Al (EPA 013 828), veröffentlicht am 8. August 1980, wird berichtet, daß Nucleinsäuresequenzen, die einen Abschnitt von 163 Aminosäuren codieren, (der PreS-codierende Bereich), und unmittelbar vor dem S-Protein-codierenden Bereich im HBV-Genom liegen, auch in die Fragmente eingebaut werden können, die zur Herstellung nützlicher rekombinanter DNA-Moleküle für die Produktion von Polypeptiden, die eine Antigenität für das Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Virus zeigen, eingesetzt werden. Außerdem wird beschrieben, daß Genfragmente, die sowohl die Vorläufer-Sequenz als auch das Strukturgen für HBsAg umfassen, vor oder während der Konstruktion eines Clonierungsvektors ausgeschnitten werden können, indem eine oder mehrere verschiedene Restriktionsendonucleasen verwendet werden. Ferner wird beschrieben, daß der 163 Codon-große Vorläufer, der vor dem HBsAg-codierenden Strukturgen liegt, aus einem Clonierungsvehikel, welches die S-Protein-codierende Sequenz enthält, ausgeschnitten werden sollte, bevor der Vektor für die Transformation verwendet wird.
Die europäische Patentanmeldung-Veröffentlichungsnr. 072 318-82 (EPA 072 318), veröffentlicht am 16. Februar 1983, beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von HBsAg durch Züchtung von Hefezellen, die mit einem Vektor transformiert sind, der ein Hefe-Replicon, einen Hefe-Promotor und ein S-Protein-codierendes DNA-Segment enthält und der spezifisch nicht den 163 Codon-großen Vorläufer enthält, der vor dem HBsAg- codierenden Strukturgen liegt. Außerdem werden ein Impfstoff, umfassend ein HBsAg-Antigen, und ein Verfahren zum Erhalt eines HBsAg-Antikörpers durch Reinigung des Antikörpers aus dem Serum von Tieren beschrieben, die gegen HBsAg immunisiert sind. Ferner wird ein 14 bis 18 nm-großes Antigen-Partikel beschrieben, das fähig ist, mit HBsAg-Antikörpern einen Immunkomplex zu bilden.
In Feitelson et al., Virology 130 (1983), 75-90, wurde beobachtet, daß mehrere Oberflächenantigen-assoziierte Polypeptide innerhalb der PreS-codierenden Sequenz partiell codiert werden können, umfassend 24 000, 28 000, 32 000, 43 000 und 50 000 Dalton-Spezies.
Laub et al., J. Virol. 48, Nr. 1, (1983), 271-280, beschreiben die Konstruktion eines frühen Simian Virus 40 (SV40)-Substitutions-Vektors, der ein HBsAg-codierendes Strukturgen aufweist, umfassend die 163 Codongroße Vorläufer-Sequenz, die unmittelbar vor dem Strukturgen liegt, und die Expression der codierenden Sequenz durch SV40-transformierte CV-1- Zellen (COS-Zellen), die mit einem solchen Vektor transformiert sind. Laub et al. berichten außerdem, daß mehr HBsAg durch COS-Zellen exprimiert wird, die mit einem Vektor transformiert sind, der nur die S-Protein-codierende Sequenz enthält, im Vergleich zu den COS-Zellen, die mit einem Vektor transformiert sind, der den 163 Codon-großen Vorläufer unmittelbar vor dem HBsAg-codierenden Strukturgen enthält.
Takeda Chemical Ind., japanische Patentanmeldung Nr. JS-8194-897-A, veröffentlicht am 12. November 1983, (Takeda 1), beschreibt eine HBV-DNA (adw-Subtyp), die das gesamte PreS-S-Protein-Polypeptid codiert, und einen Vektor, der die DNA enthält, und einen Wirt, der mit der DNA transformiert ist. Takeda Chemical Ind., japanische Patentanmeldung Nr, JS-9080-615-A, veröffentlicht am 10. Mai 1984, (Takeda II), beschreibt eine HBV-DNA (adw-Subtyp), die das gesamte PreS-S-Protein-Polypeptid codiert, außerdem das durch die DNA produzierte Polypeptid und seine Verwendung in einem Impfstoff. Takeda Chemical Ind., japanische Patentanmeldung Nr. J5-9074-985-A, veröffentlicht am 27. April 1984, (Takeda III), beschreibt ein DNA-Fragment, das eine oder mehrere Sequenzen von der gesamten adw-Typ-PreS-S-Protein-codierenden Sequenz, der S-Proteincodierenden Sequenz oder der Hepatitis-B-Virus-Kernantigen (HBCAG)-codierenden Sequenz enthält, einen Vektor, der die DNA enthält, und Wirte, die mit der DNA transformiert sind. In Takeda III wird mitgeteilt, daß das 43 000 Dalton-große Polypeptid, das durch die PreS-S-Protein-codierende Sequenz codiert wird, "als Impfstoffe zur Verhütung einer HBV-Infektion verwendet werden kann". In Takeda III wird die donierung der PreS-S-Protein-codierenden Sequenz in E. coli beschrieben, jedoch wird keine erfolgreiche Expression eines beliebigen HBV-Gens und daher auch nicht des durch diese Sequenz produzierten Polypeptids beschrieben.
Gerlich berichtete in einer Präsentation bei der "European Association of Clinical Microbiology" in Bologna am 18. Oktober 1983, daß vier potentielle Gene von HBV aus der DNA-Sequenz donierter HBV-DNA hergeleitet wurden; daß das Gen für die Oberflächenproteine (S-Gen) von HBV aus einer ununterbrochenen codierenden Sequenz besteht, die mindestens zu drei Polypeptiden translatiert wird; daß die Sequenz des Haupt-Proteins, P24, und seiner glykosylierten Form, GP27, mit dem dritten konservierten Translations-Startsignal des S-Gens beginnt; daß die Neben- Oberflächenproteine, GP35 oder GP36, am zweiten Startsignal beginnen; daß wahrscheinlich nur das P41-Polypeptid von HBV die volle Länge der codierenden Sequenz des S-Gens verwendet; daß P41 eine wichtige antigene Determinante von HBV enthält; und daß es nur in den vollständigen Viruspartikeln vorliegt, nicht jedoch in den 20 nm-großen Partikeln des im Überschuß vorliegenden Oberflächenantigens, aus denen die herkömmlichen Hepatitis-B-Impfstoffe hergeleitet werden. Der Bericht von Gerlich befaßte sich nicht spezifisch mit dem PreS&sub1;-Bereich von P41 oder damit, daß der PreS&sub1;-Bereich spezifisch eine antigene Determinante enthält, die in einem HBV-Impfstoff nützlich sein könnte.
Stibbe et al., Develop. Biol. Standard 54 (1983), 33-43, berichte ten auf dem zweiten WHO/IABS-Symposium in Athen mit dem Thema "Viral Hepatitis": "Standardization in Immunoprophylaxis of Infections by Hepatitis Viruses", Athen, Griechenland, 1982, daß die 20 nm-großen Partikel von HBsAg, die aus Serum von HBV-infizierten Menschen isoliert wurden, mindestens drei Neben-Proteine, GP33, GP36 und P41, enthalten, dies wurde durch SDS-Gelelektrophorese festgestellt. Stibbe et al. folgern daraus, daß GP33 und GP36 wahrscheinlich nicht-essentielle Bestandteile von HBV-Impfstoffen sind. Der Bericht von Stibbe et al. befaßt sich nicht spezifisch mit dem PreS&sub1;-Bereich von P41 oder damit, daß dieser Bereich spezfisch eine antigene Determinante enthält, die in einem HBV- Impfstoff nützlich sein könnte.
Stibbe et al., J. Virol. 46, Nr. 2, (1983), 626-628, offenbaren, daß Neben-Glykoproteine aus dem HBsAg-codierenden Bereich, die GP33 und GP36 genannt werden, durch die PreS&sub2;-S-Protein-codierende Sequenz codiert werden. Der PreS&sub2;-Bereich ist ein Teil des PreS-codierenden Bereichs im Hepatitis-B-Virus-Genom und codiert die ersten 55 Aminosäuren, die unmittelbar vor dem S-Protein liegen.
Neurath et al., Science 224 (1984), 392-394, beschreiben, daß ein Polypeptid mit einer Sequenz, die mit den aminoterminalen 26 Aminosäuren des PreS&sub2;-Bereichs identisch ist, als hochwirksames Immunogen wirkt, und legen nahe, daß die Antikörper, die durch das Immunogen hervorgebracht werden, für diagnostische Tests genutzt werden können. Heerman et al., J. Virol. 52, Nr. 2, (1984), 396-402, beschreiben die gesamte 389-Aminosäuren-codierende Sequenz, umfassend sowohl die 5- Protein-codierende Sequenz als auch die PreS-codierende Sequenz, die ein Polypeptid, P39, codiert, das in natürlichen HBV-Partikeln und in viralen Oberflächenantigen-Filamenten neben seiner glykosylierten Form, GP42, gefunden wurde, und auch die anderen HBV-Oberflächenantigen-assozuerten Polypeptide P24, GP27, GP33 und GP36. Heerman et al. offenbaren auch, daß der einmalige Teil des P39/P42-Proteins, d.h. sein PreS&sub1;-Bereich, monoclonale Antikörper band, die durch Immunisierung mit HBV-Partikeln induziert worden waren. Sie legen nahe, daß dieser PreS&sub1;-Bereich wahrscheinlich hochimmunogen ist. Der PreS&sub1;-Bereich ist derjenige Teil des PreS-codierenden Bereichs, der unmittelbar vor dem PreS&sub2;-Bereich liegt und die codierenden Sequenzen für die Aminosäuren 1 bis 108 (oder 1 bis 122, abhängig vom Virus-Subtyp) umfaßt, dies ist der Abschnitt von Aminosäuren, der unmittelbar vor der PreS&sub2;-codierenden Sequenz liegt. Heerman et al. stellen außerdem fest, daß Sequenzen des PreS-Bereichs bei der Suche nach immunogenen und schützenden Poly- oder Oligopeptiden, die als alternative Impfstoffe gegen HBV geeignet sind, von Interesse sein könnten.
Michel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984), 7708-7712, beschreiben die Synthese von HBsAg, das menschliche Serum-Polyalbumin- Rezeptoren enthält, in Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), die mit einem Plasmid transfiziert sind, das die PreS&sub2;-S-Proteincodierende Sequenz umfaßt.
Cattaneo et al., Nature 305 (1985), 335-338, berichten, daß das 5- Gen des HBV-Genoms die Translation am Anfang des PreS-Bereichs initiiert (d.h., 489 Nucleotide oder 163 Codons stromaufwärts des S-Gens) und daß die MRNA an einer Stelle innerhalb des Kern-Gens prozessiert/polyadenyliert wird.
Persing et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 (1985), 3440-3444 offenbaren, daß Maus-L-Zellen, die mit einer PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Sequenz transformiert sind, drei HBsAg-verwandte Polypeptide mit einem Molekulargewicht von 24 000, 27 000 und 35 000 Dalton produzieren, die alle zu komplexen immunreaktiven HBsAg-Partikeln von 22 nm Durchmesser zusammengebaut werden, die an polymerisiertes menschliches Serum-Albumin (HSA) binden; während Maus-L-Zellen, die mit der PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Sequenz transformiert sind, die eine Leserastermutation ("frame shift mutation") nahe dem 3'-Ende des PreS&sub2;-Bereichs enthält, nur die 24 000 und 27 000 Dalton-großen Polypeptide produzieren, die zu immunreaktiven HBsAg-Partikeln von 22 nm Durchmesser zusammengebaut werden, die nicht an HSA binden können. Persing et al. folgern daraus, daß die PreS&sub2;-S-Protein-codierende Sequenz die 35 000 Dalton-großen Spezies codiert; daß der PreS&sub2;-codierende Teil für die HSA-bindende Aktivität von HBsAg zuständig ist, jedoch nicht für den Zusammenbau und die Sekretion der HBsAg-Partikel erforderlich ist; und daß das dominierende Polypeptid von HBsAg (d.h., die 24 000 Dalton-große Spezies) primär nicht durch Spaltung größerer Vorläufer (d.h., den 27 000 und 35 000 Dalton-großen Spezies), die durch die PreS&sub2;-S-Protein-codierende Sequenz codiert werden, hergeleitet wird.
Milich et al., Science 228 (1985), 1195-1199, offenbaren, daß man mit Hilfe von Impfstoffen, die HBsAg-Partikel mit Aminosäuren von sowohl PreS&sub2; als auch HBsAg enthalten, wobei die Partikel durch Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) ausgeschieden werden, die mit einem Plasmid, das die PreS&sub2;-S-Protein-codierende Sequenz enthält, transfiziert sind, das Nicht-Ansprechen auf die Impfstoffe, die nur HBsAg enthalten, umgehen kann, da die Immunantwort auf HBsAg von der Immunantwort auf PreS&sub2; unabhängig ist; und daß die 26 Aminosäurereste am Aminoterminus des 33 000 Dalton-großen Polypeptids, das durch die PreS&sub2;-S-Proteincodierende Sequenz codiert wird, eine dominante Antikörper-Bindungsstelle auf dem PreS&sub2;-Bereich darstellen.
Neurath et al., Nature 315 (1985), 154-156, berichten, daß der PreS&sub2;-Bereich ein Protein auf der HBV-Hülle codiert, mit Domänen, die spezifisch durch Leberzellen erkannt werden; daß die PreS&sub2;-S-Protein-codierende Sequenz ein Protein codiert, das in HBV-Partikeln vorliegt; daß synthetische Peptide, die dem PreS&sub2;-codierenden Gen entsprechen, hochimmunogen sind; und sie folgern daraus, daß HBV-Impfstoffe PreS&sub2; enthalten sollten.
Valenzuela beschrieb am 15. Mai 1985 beim Bio-Expo-5 Meeting in Boston die Expression der gesamten PreS&sub2;-Protein-codierenden Sequenz in Hefe; daß die Hefezellen ein Partikel synthetisieren, das sowohl HBsAg als auch PreS&sub2;-Peptid enthält und das elektronenmikroskopisch und bezüglich der Sedimentationseigenschaften den Partikeln sehr ähnlich ist, die nur HBsAg enthalten; und daß der PreS&sub2;-Bereich die Fähigkeit zur Erzeugung der 22 nm-großen HBsAg-Partikel nicht stört. Valenzuela berichtet außerdem, daß die Hypothese aufgestellt wurde, daß das HBV in die Leber gelangt, indem es Polyalbumin an seinen Polyalbumin-Rezeptor bindet, das sodann an den Polyalbumin-Rezeptor in den Leberzellen bindet, wodurch das Virus internalisiert wird. Der Polyalbumin-Rezeptor von HBV wird durch den PreS&sub2;-Bereich codiert. Valenzuela folgert daraus, daß ein PreS&sub2;-enthaltender Impfstoff Antikörper hervorrufen könnte, die, zusätzlich zur Inaktivierung von HBV über den normalen Mechanismus, auch den Vorgang stören könnten, mit dem das Virus in die Leberzellen eindringt. Vgl. auch Valenzuela et al., Biotechnology 3 (1985), 317-320.
Valenzuela et al., Biotechnology 3 (1985), 323-327, offenbaren die Verwendung des HBsAg-Polyalbumin-Rezeptors, der durch die PreS&sub2;-codierende Sequenz codiert wird, als Mittel zur Herstellung von polyvalenten Impfstoffen. Valenzuela stellte ein hybrides Partikel aus HBsAg und Herpes simplex 1 Virus Glykoprotein D (HSV1gD) her, indem er die gesamte HSV1gD-PreS&sub2;-S-Protein-codierende Sequenz in Hefe exprimierte.
Neurath et al., europäische Patentanmeldung-Veröffentlichungsnr. 0 154 902-A2, veröffentlicht am 18. September 1985, beschreiben einen Hepatitis-B-Impfstoff, enthaltend ein Peptid mit einer Aminosäurekette von mindestens sechs aufeinanderfolgenden Aminosäuren innerhalb des PreS- Gens, des codierenden Bereichs der Hülle des Hepatitis-B-Virus. Der Impfstoff ist frei von einer Aminosäuresequenz, die den natürlich vorkommenden Hüllproteinen des Hepatitis-B-Virus entspricht, und dem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel Das Peptid ist frei von einem Träger, oder es kann mit einem Träger gekoppelt sein. Die europäische Patentanmeldung von Neurath beansprucht Priorität vor zwei früheren US-Patent-Anmeldungen, US-Serien-Nr. 587 090, angemeldet am 7. März 1984, und US-Serien-Nr. 698 499, angemeldet am 2. Mai 1985.
Kent et al., Pept. Chem. 22 (1984), 167-170, offenbaren, daß ein chemisch synthetisiertes Peptid, das die N-terminalen 26 Aminosäuren des PreS&sub2;-Bereichs umfaßt, ein sehr gutes Antigen ist und gut für einen synthetischen Impfstoff geeignet ist.
Lo et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 129, Nr. 3, (1985), 797-803, zeigen die Charakterisierung der Restriktionsendonuclease-Karte der HBV-DNA in voller Länge für verschiedene Subtypen (adw, adr, avw und adyw) von HBV, umfassend die Charakterisierung der Restriktionsendonuclease-Karte des gesamten PreS-Bereichs. Lo et al. beschreiben außerdem die Clonierung und Expression der HBV-DNA in voller Länge in E. coli unter Verwendung eines pUC8-Expressionsvektors, und sie berichten, daß sie planen, dieses HBV-Genprodukt, das entweder in prokaryotischen oder in eukaryotischen Zellen exprimiert werden kann, als diagnostisches Mittel und zur Herstellung von Impfstoffen zu verwenden.
Wong et al., J. Virology 55, Nr. 1, (1985), 223-231, beschreiben die Identifizierung von zwei HBV-Polypeptiden, die durch den offenen Leseraster des gesamten PreS codiert werden, d.h., 42 und 46 kd-große glykosylierte Polypeptide, enthaltend Determinanten sowohl von HBsAg als auch vom PreS-Berech Wong et al. offenbaren die Expression eines Tribrid-Fusionsproteins, enthaltend 108 Aminosäuren, die den N-terminalen Aminosäuren 27 bis 133 der 174 Aminosäuren des PreS-Bereichs entsprechen (adw&sub2;-Subtyp), außerdem β-Galactosidase- und Chloramphenicol-Acetyltransferase-Sequenzen. Dieses Peptid enthält 15 Aminosäuren aus dem PreS&sub2;-Bereich und 93 aus dem PreS&sub1;-Bereich. Wang et al. beschreiben außerdem, daß (a) polyclonales Antiserum, das gegen das Tribrid-Fusionsprotein hervorgebracht wurde, befähigt war, 42 und 46 kd-große Polypeptide in partiell gereinigten Viruspartikel-Präparaten nachzuweisen, und daß (b) die glykosylierten 42 und 46 kd-großen Polypeptide den 39 und 42 kd großen nicht-glykosylierten Polypeptiden, die in Heerman et al, a.a.O., beschrieben werden, zu entsprechen scheinen.
Offensperger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 7540- 7544, beschreiben die Expression einer donierten DNA-Sequenz, die das PreS&sub2;-Peptid-β-Galactosidase-Fusionsprotein codiert, durch E. coli.
In verschiedenen Beschreibungen werden Plasmide vorgestellt, die den Promotor eines Maus-Metallothionein-Gens enthalten.
Hamer et al., US-Patentanmeldung-Serien-Nr. 452 783, angemeldet am 23. Dezember 1982, und Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 397, beschreiben beide rekombinante Rinderpapillomavirus-Plasmide, die das Gen für menschliches Wachstumshormon (HGH) und einen Promotor des Metallothionein-Gens (MMT) enthalten.
Hofschneider et al., europäische Patentanmeldung Nr. EP 0 105 141 A2, veröffentlicht am 11. April 1984, beschreiben rekombinante Plasmide, welche die S-Protein-codierende Sequenz und entweder DNA des Rinderpapillomavirus Typ 1 oder DNA des Maloney-Maus-Sarkomvirus enthalten. Die von Hofschneider et al. beschriebenen Plasmide verwenden verzugsweise den natürlichen Promotor, der mit der S-Protein-codierenden Sequenz assoziiert ist, im Dokument von Hofschneider wird jedoch mitgeteilt (es wird jedoch kein Beispiel dafür angegeben), daß "[ein] weiteres Beispiel für ein bevorzugtes natürliches eukaryotisches Expressionssignal das Metallothionein-Signal aus Mauszellen ist".
Fogel et al., europäische Patentanmeldung-Veröffentlichungsnr. EP 0 096 491 A2, beschreiben Plasmide, die eine gesamte Metallothionein-Gen- Sequenz, umfassend den Promotor-Bereich, enthalten, wobei diese Plasmide verwendet werden, um eine starke Expression von Genen stromabwärts des MMT-Gens in Säugerwirten, die mit einem solchen Plasmid transformiert sind, zu erhalten.
University-Patent, Inc., PCT Patentanmeldung-Veröffentlichungsnr. WO 83/01783, veröffentlicht am 26. Mai 1983, und Palmiter et al., Cell 29 (1982), 701, beschreiben ein Plasmid, das den Promotor des Maus-MT-1- Gens enthält, der mit einem Strukturgen (vorzugsweise dem Gen für Thymidinkinase aus Herpes simplex-Virus) verknüpft ist, und die Mikroinjektion der Plasmide in Mausembryos, und sie teilen mit, daß die Genexpression des resultierenden fusionierten Polypeptidproduktes in differenzierten Zellen erwachsener Mäuse, die aus den Embryos entstehen, anschließend durch die Verabreichung von Schwermetallionen reguliert werden kann. Palmiter et al. beschreiben außerdem Plasmide, die den Maus- MTL-Promotor enthalten, fusioniert mit Ratten-Wachstumshormon, die Mikroinjektion dieser Plasmide in Mausembryos und die Regulation der Genexpression des resultierenden fusionierten Polypeptidproduktes durch die Verabreichung von Schwermetall Ionen.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen rekombinanten DNA-Vektor, der frei ist von nicht-HBV viralen oder onkogenen Nucleinsäuresequenzen, umfassend den Hepatitis-B-PreS&sub1;- PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich und einen Maus-Metallothionein(MMT)-Promotor. Der Vektor umfaßt vorzugsweise außerdem eine Transkriptions-Terminationsstelle und einen Selektionsmarker, vorzugsweise einen Arzeistoffresistenzmarker. Vorzugsweise ist der Promotor in den Vektor, umfassend die DNA-Sequenz, zusätzlich zu einem natürlichen Hepatitis-B-Promotor oder an dessen Stelle, vorzugsweise unmittelbar stromaufwärts der PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Sequenz, eingebaut.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine transfizierte eukaryotische Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA-Vektor transfiziert ist, der den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich und einen MMT- Promotor umfaßt. Der Vektor umfaßt vorzugsweise außerdem eine Transkriptions-Terminationsstelle und einen Selektionsmarker. Der Wirt ist vorzugsweise eine Säugerzelle.
Die Erfindung betrifft ferner eine eukaryotische Zelle, die mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Vektor, der als der erste rekombinante DNA-Vektor definiert ist, und mit einem zweiten rekombinanten DNA-Vektor, umfassend einen PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich oder einen S-Protein-codierenden Bereich und den Promotor eines Metallothionein-Gens, cotransfiziert ist.
Ferner betrifft die Erfindung eine eukaryotische Zelle, die mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor, der als der erste rekombinante DNA-Vektor definiert ist, und mit einem zweiten rekombinanten DNA-Vektor, umfassend einen PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich, umd mit einem dritten rekombinanten DNA-Vektor, umfassend den Promotor eines Metallothionein-Gens und einen Selektionsmarker, cotransfiziert ist, wobei der Metallothionein-Gen-Promotor im dritten Vektor vorzugsweise unmittelbar stromaufwärts des Selektionsmarkers liegt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Zelle ist der Metallothionein-Gen-Promotor in den zweiten Vektor eingebaut und liegt vorzugsweise unmittelbar stromaufwärts des PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereichs.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Zelle umfassen der zweite und/oder der dritte Vektor eine Transkriptions-Terminationsstelle, wie z.B. den DEF-Bereich des Maus-Globingens, und/oder wobei der zweite Vektor einen Selektionsmarker umfaßt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Zelle umfassen der zweite und/oder der dritte DNA-Vektor keine anderen viralen DNA-Segmente.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Zelle umfassen die DNA-Vektoren verschiedene Selektionsmarker.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Zelle umfassen der erste, der zweite und/oder der dritte Vektor ein Replicon.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Zelle ist die eukaryotische Zelle eine Säugerzelle, wie z.B. eine Ovarzelle des Chinesischen Hamsters, eine Vero-Zelle, eine L-Zelle, eine Maus-Fibroblastenzelle oder eine Ratten-Fibroblastenzelle.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der transfizierten Wirtszelle, umfassend die Transfektion einer eukaryotischen Zelle mit dem rekombinanten DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Partikeln, die mindestens ein Protein enthalten, das durch den gesamten PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert wird, umfassend: a) Züchtung der transfizierten eukaryotischen Wirtszelle der vorliegenden Erfindung unter Kulturmedium-Bedingungen, die den Wirt befähigen, das Protein zu exprimieren; und b) Isolierung der Partikel. Vorzugsweise kann der transfizierte Wirt die Proteine, zusammengesetzt zu den Partikeln, ins Medium ausscheiden. Vorzugsweise umfaßt das Verfahren außerdem die Zugabe von Schwermetallionen oder Steroidhormonen ins Kulturmedium, um die Expression der Proteine zu steigern. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Partikel, die durch das Verfahren hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, der eine immunprotektive Menge der erfindungsgemäßen Partikel enthält.
Die Proteine, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, der im rekombinanten DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung enthalten ist, können in einem Verfahren eingesetzt werden, wobei das Vorliegen von Antikörpern in einer Probe von Säugerblutseren nachgewiesen wird, umfassend:
a) Inkontaktbringen der Probe mit einem festen Substrat, das mit nicht-markierten Partikeln der vorliegenden Erfindung beschichtet ist; Inkubation und Waschen der kontaktierten Probe;
c) Inkontaktbringen der kontaktierten Probe mit markierten Partikeln der vorliegenden Erfindung, wodurch eine markierte kontaktierte Probe erzeugt wird;
d) Inkubation und Waschen der markierten kontaktierten Probe; und
e) Bestimmung des Umfangs des markierten Partikels in der markierten kontaktierten Probe.
Sie können außerdem in einem Verfahren verwendet werden, wobei das Vorliegen von Proteinen, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, in einer Probe von Säugerblutseren nachgewiesen wird, umfassend:
a) Herstellung einer Zusammensetzung, enthaltend einen Antikörper, der durch ein Immunogen hergestellt wurde, das aus den erfindungsgemäßen Partikeln besteht;
Inkontaktbringen der Probe mit einem ersten Teil der Zusammensetzung und dem Immunogen, das markiert wurde, Inkubation und Waschen des ersten Teils;
c) Inkontaktbringen einer antigenfreien Kontrolle mit einem zweiten Teil der Zusammensetzung und dem Immunogen, das markiert wurde, Inkubation und Waschen des zweiten Teils;
d) Zugabe der gleichen Menge von Protein A-enthaltenden Staphylokokken zur Zusammensetzung der vorstehenden Schritte b) und c), Inkubation der beiden Zusammensetzungen und Abtrennung der Flüssigkeit von den Feststoffen; und
e) Bestimmung des Umfangs des markierten Immunogens in der jeweiligen resultierenden Zusammensetzung des vorstehenden Schrittes d) Ferner können sie zur Herstellung eines diagnostischen Kits verwendet werden, mit dem das Vorliegen von Antikörpern gegen Proteine, die durch den PreS&sub1;- PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, in einer Probe von Säugerblutseren nachgewiesen wird, umfassend:
a) unmarkierte Proteine, umfassend das Partikel der vorliegenden Erfindung, angelagert an einen festen Träger; und
b) markierte Antikörper gegen, z.B. menschliches IgG oder IgM.
Die Proteine können ferner zur Herstellung eines diagnostischen Kits verwendet werden, mit dem das Vorliegen von Proteinen, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, in einer Probe von Säugerblutseren nachgewiesen wird, umfassend:
a) Antikörper, die durch die erfindungsgemäßen Partikel hergestellt werden, angelagert an einen festen Träger; und
b) markierte Antikörper, hergestellt durch die erfindungsgemäßen Partikel.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine cotransfizierte eukaryotische Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA-Vektor dieser Erfindung und einem zweiten rekombinanten DNA-Vektor, umfassend den PreS&sub2; S-Protein-codierenden Bereich oder nur den S-Protein-codierenden Bereich und einen MMT-Promotor, cotransfiziert ist. Vorzugsweise umfaßt der zweite rekombinante Vektor zusätzlich eine Transkriptions-Terminationsstelle und gegebenenfalls einen Selektionsmarker. Gegebenenfalls ist der co-transfizierte Wirt mit dem rekombinanten DNA-Vektor dieser Erfindung, dem zweiten rekombinanten DNA-Vektor und einem dritten rekombinanten DNA-Vektor, umfassend einen MMT-Promotor und einen Selektionsmarker, cotransfiziert. Vorzugsweise umfaßt der dritte rekombinante Vektor zusätzlich eine Transkriptions-Terminationsstelle. Außerdem betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer co-transfizierten Wirtszelle, umfassend die Co-Transfektion einer eukaryotischen Zelle mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Vektor, dem vorstehend beschriebenen zweiten rekombinanten DNA-Vektor und gegebenenfalls dem vorstehend beschriebenen dritten rekombinanten DNA-Vektor. Vorzugsweise werden die DNA-Vektoren in paarweisen Kombinationen co-transfiziert, oder sie werden zusammen co-transfiziert, oder sie werden in einer Serie von Schritten transfiziert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Partikeln, die mindestens ein Protein umfassen, das durch den gesamten PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert wird, um- fassend: a) Züchtung der co-transfizierten eukaryotischen Wirtszelle der vorliegenden Erfindung unter Kulturmedium-Bedingungen, die den Wirt befähigen, das Protein zu exprimieren; und b) Isolierung der Partikel Vorzusgweise ist der co-transfizierte Wirt befähigt, die Proteine, zusammengebaut zu Partikeln, ins Medium auszuscheiden. Vorzusgweise umfaßt das Verfahren außerdem den Zusatz von Schwermetallionen oder Steroidhormonen zum Kulturmedium, um die Expression der Proteine zu verstärken Diese Erfindung betrifft außerdem die Partikel, die durch dieses Verfahren hergestellt werden.
Diese Erfindung betrifft ein rekombinantes DNA-Concatamer, umfassend: a) einen Vektor, umfassend den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich, und mindestens einen Vektor, umfassend einen der folgenden codierenden Bereiche: PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich oder PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich oder S-Protein-codierenden Bereich; und b) den MMT-Promotor. Das Concatamer umfaßt vorzugsweise außerdem einen Selektionsmarker und eine Transkriptions-Terminationsstelle. Die Concatamere können nach Techniken hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Diese Erfindung betrifft außerdem eine eukaryotische Wirtszelle, die mit dem erfindungsgemäßen Concatamer transfiziert ist. Der Wirt ist vorzugsweise eine Säugerzelle. Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer mit dem erfindungsgemäßen Concatamer transfizierten Wirtszelle, umfassend die Transfektion einer eukaryotischen Zelle mit dem erfindungsgemäßen Concatamer.
Diese Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Partikels, umfassend mindestens ein Protein, das durch den gesamten PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert wird, umfassend: a) Züchtung des erfindungsgemäßen transfizierten Wirts, der das erfindungsgemäße Concatemer umfaßt, unter Kulturmedium-Bedingungen, die den Wirt befähigen, das Protein zu exprimieren; und b) Isolierung des Partikels. Vorzugsweise kann der transfizierte Wirt die Proteine, zusammengesetzt zu den Partikeln, ins Medium ausscheiden. Vorzugsweise umfaßt das Verfahren außerdem die Zugabe von Schwermetallionen oder Steroidhormonen zum Kulturmedium, wodurch die Expression der Proteine gesteigert wird Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Partikel, die durch das Verfahren hergestellt werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 umfaßt eine partielle Restriktionsendonuclease-Karte von Plasmid pBPV342-12. Figur 1 zeigt auch die Lage der von Plasmid pML2- hergeleiteten DNA, der DNA des Rinder-Papillomavirus (BPV), des MMT-Promotors und des sv-PAS-t-Transkriptions-Terminationsbereichs auf Plasmid pBPV342-12. Figur 1 zeigt außerdem die Spaltung von Plasmid pBPV342-12 mit der Restriktionsendonuclease BamHI.
Figur 2 umfaßt eine partielle Restriktionsendonuclease-Karte von Plasmid pAO1, welches das vollständige Hepatitis-B-Virus-Genom in linearer Form enthält. Figur 2 zeigt außerdem die Spaltung von pA01 mit der Restriktionsendonuclease EcoRI, die Ligierung des EcoRI-linearen HBV- Produktes mit T4-DNA-Ligase zur Erzeugung von Concatameren und die Spaltung des Concatamer-Produktes, die mit der Restriktionsendonuclease BglII durchgeführt wird, zur Erzeugung eines spezifischen DNA-Fragments, enthaltend die intakte codierende DNA-Sequenz für den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich.
Figur 3 umfaßt eine partielle Restriktionsendonuclease-Karte von Plasmid pDM1 und zeigt seine Konstruktion durch Ligierung eines BamHI- DNA-Fragments, umfassend Plasmid pMMT-neo mit einem genomischen BglII- Fragment des Hepatitis-B-Virus, das die PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierende Sequenz codiert.
Die Figuren 4A und 4B umfassen eine partielle Restriktionsendonuclease-Karte von Plasmid pDM2 und zeigen seine Konstruktion durch Ligierung eines BamHI-Restriktionsendonuclease-Fragments und eines BamHI- BglII-Restriktionsendonuclease-Fragments, beide aus Plasmid pDM1.
Figur 5 umfaßt eine partielle Restriktionsendonuclease-Karte von Plasmid pDM3 und zeigt seine Konstruktion aus pDM1 und pMMT-neo.
Figur 6 ist eine graphische Darstellung, die das Elutionsmuster der erfindungsgemäßen Partikel von einer Biorad-A-5m-Säule zeigt.
Figur 7 ist eine graphische Darstellung einer typischen isopyknischen CsCl-Zentrifugation der erfindungsgemäßen Partikel, die aus etwa 30 Fraktionen vom ersten Peak aus der Biorad-A-5m-Säule stammten.
Die Figuren 8A, 8B und 8C sind graphische Darstellungen, die eine seropositive Konversion bei Mäusen zeigen, die durch verschiedene Verdünnungen von gereinigten Partikeln der vorliegenden Erfindung induziert wurde.
Die Figuren 9A und 9B umfassen eine partielle Restriktionsendonuclease-Karte von Plasmid pENDO-1 und zeigen seine in zahlreichen Schritten durchgeführte Konstruktion.
Figur 10 umfaßt eine partielle Restriktionsendonuclease-Karte von Plasmid pENDO-2 und zeigt seine Konstruktion durch Ligierung von Restriktionsendonuclease-DNA-Fragmenten von Plasmid pENDO-1 und Plasmid pDM2.
Figur 11 umfaßt eine partielle Restriktionsendonuclease-Karte von Plasmid pENDO-0 und zeigt seine Konstruktion.
Mit dem Begriff "PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierender Bereich" ist der Bereich des HBV-DNA-Genoms gemeint, der das gesamte Polypeptid codiert, das als PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Polypeptid bekannt ist, umfassend das Codon für den Methioninrest am Anfang bis zum Terminations-Codon (TAA) am Ende, das keinen Aminosäure-Einbau spezifiziert und die Beendigung der Trans lation steuert, oder ein beliebiges funktionelles Derivat eines solchen codierenden Bereichs. Proteine, die durch den Bereich codiert werden, umfassen das PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Polypeptid (389 Aminosäurereste im HBV-Subtyp adw, z.B). Bevorzugte PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierende Bereiche stammen von den folgenden Subtypen: adr, ayw, adyw und adw. Mit dem Begriff "funktionelles Derivat" ist ein beliebiges Derivat des PreS&sub1;- PreS&sub2;-S- Protein-codierenden Bereichs gemeint, der Polypeptide codiert, die, wenn sie zu einem Partikel zusammengesetzt sind, hinsichtlich der immunogenen Fähigkeiten im wesentlichem in gleicher Art und Weise funktionieren wie das Partikel, das beim Zusammenbau von Polypeptiden resultiert, die durch den nativen PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden. Solche Derivate umfassen partielle Sequenzen des PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereichs und außerdem Derivate, die durch Modifikation dieses codierenden Bereichs hergestellt wurden. Techniken zur Modifikation des codierenden Bereichs sind dem Fachmann bekannt und umfassen z.B. die Behandlung mit chemischen oder biologischen Mutagenen, die Bestrahlung oder direkte Gentechnik, wie z.B. durch Insertion, Deletion oder Substitution von Nucleinsäuren unter Verwendung von Enzymen oder anderen Rekombinationstechniken oder molekularbiologischen Verfahren.
Mit dem Begriff "PreS&sub2;-S-Protein-codierende Sequenz" ist der Bereich des HBV-DNA-Genoms gemeint, der das gesamte Polypeptid codiert, das als PreS&sub2;-S-Polypeptid bekannt ist, umfassend das Codon für den Methioninrest am Anfang bis zum Terminations-Codon (TAA) am Ende, das keinen Aminosäure-Einbau spezifiziert, wie vorstehend erläutert, oder ein beliebiges funktionelles Derivat eines solchen codierenden Bereichs. Proteine, die durch den Bereich codiert werden, umfassen das PreS&sub2;-S-Polypeptid (281 Aminosäurereste im HBV-Subtyp adw) und das S-Polypeptid (226 Aminosäurereste im HBV-Subtyp adw, z.B.). Bevorzugte PreS&sub2;-S-Protein-codierende Bereiche stammen von den folgenden HBV-Subtypen adr, ayw, advw und adw. Mit dem Begriff "funktionelles Derivat" ist ein beliebiges Derivat des PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereichs gemeint, das Polypeptide codiert, die, wenn sie zu einem Partikel zusammengesetzt sind, hinsichtlich der immunogenen Fähigkeiten im wesentlichen in gleicher Art und Weise funktionieren wie das Partikel, das beim Zusammenbau von Polypeptiden entsteht, die durch den nativen PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden. Solche Derivate umfassen partielle Sequenzen des PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereichs und außerdem Derivate, die durch Modifikation dieses codierenden Bereichs hergestellt wurden. Techniken, die zur Modifikation des codierenden Bereichs verwendet werden können, sind dem Fachmann bekannt und wurden z.T schon vorstehend angegeben.
Mit dem Begriff "S-Protein-codierende Sequenz" ist der Bereich des HBV-DNA-Genoms gemeint, der das gesamte Polypeptid codiert, das als S- Polypeptid bekannt ist, umfassend das Codon für den Methioninrest am An- fang bis zum Terminations-Codon (TAA) am Ende, das keinen Aminosäure- Einbau spezifiziert, wie vorstehend angegeben, oder ein beliebiges funktionelles Derivat eines solchen codierenden Bereichs. Proteine, die durch den Bereich codiert werden, umfassen das S-Protein (226 Aminosäurereste im HBV-Subtyp adw, z.B). Bevorzugte S-Protein-codierende Bereiche stammen von den folgenden HBV-Subtypen: adr, ayw, adyw und adw. Mit dem Begriff "funktionelles Derivat" ist ein beliebiges Derivat des S- Protein-codierenden Bereichs gemeint, das Polypeptide codiert, die, wenn sie zu einem Partikel zusammengesetzt sind, hinsichtlich der immunogenen Fähigkeiten im wesentlichen in gleicher Art und Weise funktionieren wie das Partikel, das beim Zusammenbau von Polypeptiden entsteht, die durch den nativen S-Protein-codierenden Bereich codiert werden. Solche Derivate umfassen partielle Sequenzen des S-Protein-codierenden Bereichs und außerdem Derivate, die durch Modifikation dieses codierenden Bereichs hergestellt werden. Techniken, die zur Modifikation des codierenden Bereichs verwendet werden können, sind dem Fachmann bekannt und wurden z.T schon vorstehend angegeben.
Mit dem Begriff "Promotor" ist die DNA-Sequenz innerhalb eines DNA- Moleküls stromaufwärts eines Gens gemeint, die den geeigneten Wirtszellen-RNA-Polymerase-Komplex so steuert, daß er sich an einer spezfischen Stelle des DNA-Moleküls an das DNA-Molekül anlagert und richtig positioniert wird, um die Transkription des Gens an einer spezifischen Stelle auf der DNA beginnen zu können, wodurch eine RNA-Kopie eines der DNA- Stränge synthetisiert wird.
Mit dem Begriff "Transkription" ist der Prozeß gemeint, der durch die Biosynthesemaschinene der Wirtszelle durchgeführt wird, umfassend RNA-Polymerase-Komplexe, die unter Verwendung eines der beiden komplementären DNA-Stränge als Matrize Ribonucleotide aufeinanderfolgend, von 5' zu 3' (3' zu 5' hinsichtlich des DNA-Matrizenstrangs), polymerisieren, wodurch eine exakte Kopie eines der DNA-Stränge erhalten wird, die jedoch Ribonucleotide anstelle von Desoxyribonucleotiden enthält.
Mit dem Begriff "Transkriptions-Terminationssequenz" ist der Bereich innerhalb des DNA-Moleküls gemeint, der mit t bezeichnet ist und der dem mit dem Transkriptionsprozeß befaßten RNA-Polymerase-Komplex signalisiert, den Transkriptionsprozeß zu beenden, wodurch ein RNA-Molekül erhalten wird, das richtig prozessiert werden kann, einschließlich Polyadenylierung und Transport, bei solchen RNA-Molekülen, die dazu bestimmt sind, im Wirtszellen-Cytoplasma als Messenger-RNA-Moleküle zu fungieren.
Mit dem Begriff "Polyadenylierung" ist der Prozeß gemeint, bei dem die Biosynthesemaschinene der Wirtszelle eine spezifische Sequenz, üblicherweise 5'-AATAAA-3', die PAS für Polyadenylierungssignal genannt wird, innerhalb des RNA-Moleküls erkennt, die das Anfügen einer nicht- Matrize-bestimmten Polyriboadenylat-Einheit an das 3'-Ende des Moleküls etwa 15 bis 20 Nucleotide stromabwärts (in Richtung zum 3'-Ende) steuert, wobei die Einheit spezifisch durch das Enzym Poly-A-Polymerase angefügt wird.
Mit dem Begriff "Selektionsmarker" ist eine Gendeterminante gemeint, die der Zelle bei Expression eine Reihe spezifischer Eigenschaften verleiht, mit deren Hilfe eine solche Zelle von anderen Zellen, die diese Gendeterminante nicht enthalten oder exprimieren, unterschieden oder selektiert werden kann.
Bevorzugte Selektionsmarker umfassen Arzneistoffresistenzmarker. Mit dem Betriff "Arzneistoffresistenzmarker" ist eine spezifische Klasse von Selektionsmarkern gemeint, die einer Zelle, die den Marker exprimiert, Resistenz gegen die letale Wirkung eines Arzneistoffs oder eines Antibiotikums verleihen, wobei diese Substanzen normalerweise das Wachstum blockieren oder Zellen, die diesen Arzneistoffresistenzmarker nicht enthalten oder exprimieren, getötet werden.
Bevorzugte Arzneistoffresistenzmarker umfassen die codierenden Sequenzen für das Neomycinresistenz-Gen, neo; das Eco-gpt-Gen (Mulligan, R. C., und Berg, P., Science 209 (1980), 1422), das Gen der Dihydrofolatreductase (DHFR) (Ringold, G., et al., J. of Molec. and Appld. Genet. 1 (1981), 165).
Mit dem Begriff "Partikel, die mindestens ein Protein umfassen, das durch den gesamten PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert wird" ist ein Hepatitis B-Partikel ohne Nucleinsäure gemeint, das durch den Zusammenbau innerhalb einer eukaryotischen Zelle oder aus dem Kulturlysat einer eukaryotischen Zelle erzeugt wird, die mit dem gesamten PreS&sub1;-, PreS&sub2;- und S-Bereich transfiziert ist, wobei das Partikel Untereinheiten enthält, die vorwiegend aus dem S-Polypeptid (Dimeren) bestehen, die jedoch auch aus kleineren Mengen der gesamten PreS&sub1;- PreS&sub2;-S-, gegebenenfalls der PreS&sub2;-S-Polypeptide, bestehen.
Diese Erfindung betrifft einen rekombinanten DNA-Vektor, umfassend den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich und einen MMT-Promotor. Der MMT-Promotor kann entweder zusätzlich zum natürlichen Promotor für die DNA-Sequenz (Hepatitis B-Promotor) oder anstelle des Hepatitis B- Promotors in den DNA-Vektor eingebaut werden. Vorzugsweise liegt der MMT-Promotor im DNA-Vektor unmittelbar stromaufwärts des PreS&sub1;-PreS&sub2;-S- Protein-codierenden Bereichs. Der MMT-Promotor ist funktionell verknüpft mit der DNA-Sequenz, das heißt, daß der codierende Bereich unter der Kontrolle des Promotors steht. Vorzugsweise umfaßt der Vektor außerdem eine Transkriptions-Terminationssequenz und einen Selektionsmarker, der vorzugsweise in einer eukaryotischen Zelle wirksam ist. Der Selektionsmarker ist vorzugsweise ein Arzneistoffresistenzmarker, wie z.B. das Neomycin-Gen. Die Transkriptions-Terminationssequenz ist vorzugsweise der DEF-Bereich (mg-PAS-t) des Globingens der Maus. Der DEF-Bereich des Globingens der Maus wird von Falck-Pederson et al., Cell 40 (1985), 897, beschrieben. Der Vektor kann nach herkömmlichen DNA-Rekombinations-Techniken und anderen molekularbiolgischen Verfahren hergestellt werden. Im am meisten bevorzugten Fall, wobei der mg-PAS-t-Bereich verwendet wird, enthält der Vektor keine viralen DNA-Segmente und ist nicht onkogen, d.h., er kann eine beliebige Wirtszelle, in die er eingeführt wird, nicht transformieren (karzinös machen). Wenn der Vektor keine autonome Replikationssequenz (Replicon) enthält, die in einem damit transfizierten Wirt funktionieren kann, integriert er sich bei der Transfektion eines Wirts in das Wirtschromosom und wird passiv mit dem Wirtsgenom repliziert.
Der rekombinante DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung sollte die folgenden Eigenschaften umfassen:
1) Den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich.
2) Einen MMT-Promotor, der unmittelbar stromaufwärts des PreS&sub1;- PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereichs liegt.
3) Der Vektor sollte sich in Bakterien oder einem anderen prokaryotischen Wirt, in die er transformiert wird, replizieren können, um eine Züchtung, Amplifikation und Herstellung großer Mengen des rekombinanten Vektors zu ermöglichen. Somit sollte der Vektor ein bakterielles oder anderes prokaryotisches Replicon umfassen, d.h., ein DNA-Segment, das alle Funktionen enthält, die für eine autonome Replikation und extrachromosomale Erhaltung des Vektors in einer damit transformierten prokaryotischen Wirtszelle, z.B. einer bakteriellen Wirtszelle, erforderlich sind. Solche Replicons sind dem Fachmann bekannt.
4) Das Vektor-Replicon sollte klein sein (d.h., kleiner als 6 bis 8 Kilobasenpaare), um eine einfache genetische und molekularbiologische Handhabung zu ermöglichen.
5) Der Vektor sollte einen Selektionsmarker, vorzugsweise einen Arzneistoffresistenzmarker, wie z.B. Ampicillin, für die Verwendung in damit transformierten bakteriellen Wirtszellen enthalten.
6) Der Vektor sollte einen zweiten Selektionsmarker, vorzugsweise einen Arzneistoffresistenzmarker, wie z.B. Neomycin, für die Verwendung in damit transfizierten eukaryotischen Wirtszellen enthalten.
7) Der Vektor sollte günstige Endonucleaserestriktionsstellen für die Clonierung enthalten.
8) Der Vektor sollte eine Transkriptions-Terminationsstelle und eine Polyadenylierungssequenz enthalten.
Am stärksten bevorzugt umfaßt der erfindungsgemäße Vektor keine autonome Replikationssequenz (Replicon), die in einer damit transfizierten eukaryotischen Wirtszelle funktionieren kann. Ein Hauptgrund für die Verwendung eines nicht-replizierenden Vektorsystems in eukaryotischen Wirtszellen besteht darin, daß alle Vektorsysteme, die zu einer autonomen und extrachromosomalen Replikation in einer damit transfizierten eukaryotischen Säugerwirtszelle befähigt sind, Replicons umfassen, die von onkogenen Viren stammen. Für die Expression von Polypeptiden mit pharmazeutischer Bedeutung, wie z.B. der Proteine, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;- S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, ist es jedoch wünschenswert, Vektoren zu verwenden, die eine DNA umfassen, die nicht von onkogenen Viren stammt.
Der erfindungsgemäße Vektor umfaßt den MMT-Promotor. Der MMT-Promotor ist ein nicht-viraler starker Transkriptions-Promotor. Die codierende Sequenz des MMT-Promotors wird von Pavlakis und Hamer, Proc. Natl. Acad. Sci. 11 (1983), 397, beschrieben. Der MMT-Promotor kann durch Schwermetallionen, wie z.B. Zink und Cadmium, und durch Steroidhormone, wie z.B. Dexamethason, reguliert werden. Eine solche Regulation ist bekannt (vgl. z.B., Yagle und Palmiter, Molecular and Cellular Biol. 5 (1985), 291).
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine transfizierte eukaryotische Wirtszelle, die mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Vektor transformiert ist. Vorzugsweise ist der Wirt ein Säugerwirt, am stärksten bevorzugt eine Zellinie von Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), eine Vero-Zellinie, eine L-Zellinie oder eine Maus- oder Ratten-Fibroblastenzellinie. Der Wirt kann durch Transfektion einer eukaryotischen Zelle mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Vektor nach herkömmlichen Techniken hergestellt werden, z.B. nach dem Verfahren von Graham und van der Eb, Virology 52 (1973), 456, oder Wigler, M., Cell 14 (1978), 725.
Diese Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Partikels, das Proteine umfaßt, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, wobei mindestens eines der Proteine einem Polypeptid entspricht, das durch den gesamten PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert wird, umfassend a) die Züchtung der transfizierten Wirts der vorliegenden Erfindung unter Kulturmedium-Bedingungen, die den Wirt befähigen, die Proteine zu exprimieren, und b) die Isolierung des Partikels. Vorzugsweise kann der co-transfizierte Wirt die Proteine, zusammengebaut zu den Partikeln, ins Medium ausscheiden. Vorzugsweise werden Schwermetallionen oder Steroidhormone, wie z.B. Dexamethason, dem Kulturmedium zugegeben, um den MMT-Promotor zu induzieren und dadurch die Expression des codierenden Bereichs zu steigern. Schwermetallionen, wie z.B. Cadmium oder Zink, sind am stärksten bevorzugt. Die optimale Konzentration der im Medium enthaltenen Schwermetallionen oder Steroidhormon kann durch herkömmliche Techniken bestimmt werden.
Diese Erfindung betrifft außerdem die nach diesem Verfahren hergestellten Partikel. Wenn die transfizierte Wirtszelle der vorliegenden Erfindung die Partikel direkt ins Kulturmedium ausscheidet, können anschließend die Partikel aus dem Kulturmedium des erfindungsgemäßen transfizierten Wirts durch herkömmliche Techniken der Proteinisolierung isoliert werden. Wenn die transfizierte Wirtszelle der vorliegenden Erfindung die Partikel nicht ausscheidet, werden sie aus einem Kulturlysat des Wirts durch herkömmliche Kulturlysat-Techniken erhalten. Die Partikel werden in glykosylierter Form erhalten und sind aus Proteinen zusammengesetzt, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, umfassend mindestens ein Protein, das durch den gesamten PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert wird.
Diese Erfindung betrifft ferner einen Impfstoff, der eine immunprotektive Menge des erfindungsgemäßen Partikels umfaßt. "Immunprotektive Menge" bedeutet die Menge (vorzugsweise 1 bis 20 µg) der erfindungsgemäßen Partikel, die zur Induktion und Erhaltung eines Antikörperspiegels im Wirt erforderlich ist, der ausreichend hoch ist, um das infektiöse Agens zu neutralisieren und die Vermehrung und anschließende Erkrankung durch das infektiöse Agens zu verhindern.
Das erfindungsgemäße Partikel enthält keine viralen DNA-Komponenten und ist daher frei von unerwünschten Nebenwirkungen, die normalerweise bei aus natürlichen Substanzen hergeleiteten Impfstoffen auftreten, wie z.B. ungewollte Infektion mit dem Virus, allergische Reaktionen, Fieber und dergleichen. Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung, der eine immunprotektive Menge der erfindungsgemäßen Partikel umfaßt, kann eingesetzt werden, um die HBV-Immunantwort zu verstärken und das Nicht-Ansprechen auf Hepatitis-B-Virus-Impfstoffe zu umgehen, die keine durch die gesamte PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierende Sequenz codierten Proteine umfassen.
Ein Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch Kombination einer immunprotektiven Menge der erfindungsgemäßen Partikel mit einem geeigneten Puffer, z.B. Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, hergestellt werden. Der Impfstoff kann außerdem ein Adjuvans, wie z.B. Aluminiumhydroxid und dergleichen, umfassen.
In einer anderen Ausführungsform können die in den erfindungsgemäßen Partikeln enthaltenen Polypeptide aus den Partikeln dissoziiert und in einem Lipidvesikel wieder assoziiert werden. Ein Impfstoff gegen das Hepatitis-B-Virus kann unter Verwendung der Lipidvesikel, welche die erfindungsgemäßen Polypeptide umfassen, hergestellt werden. Die Lipidvesikel können in geeigneter Konzentration mit oder ohne Adjuvans, wie z.B. Aluminiumhydroxid, als Impfstoff eingesetzt werden.
Die Partikel des Impfstoffs der vorliegenden Erfindung können zusammen mit einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel (Medium), wie z.B. Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, verwendet werden.
Der erfindungsgemäße Impfstoff, der eine immunprotektive Menge der erfindungsgemäßen Partikel umfaßt, kann nach dem gleichen allgemeinen Verfahren hergestellt und eingesetzt werden, wie in US-Patent 4 118 479 beschrieben, das hiermit durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen ist.
Der Impfstoff kann durch subkutane, intradermale oder intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Der bevorzugte Weg hängt vom jeweiligen Impfstoff ab, im allgemeinen ist jedoch die intramuskuläre Injektion am besten geeignet. Die Häufigkeit der Verabreichung hängt vom Impfstoff ab.
Die Proteine, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, der im rekombinanten DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung enthalten ist, können in einem Verfahren verwendet werden, wobei das Vorliegen von Antikörpern in einer Probe von Säugerblutseren nachgewiesen wird, umfassend:
a) Inkontaktbringen der Probe mit einem festen Substrat, das mit nicht-markierten Partikeln der vorliegenden Erfindung beschichtet ist;
b) Inkubation und Waschen der kontaktierten Probe;
c) Inkontaktbringen der kontaktierten Probe mit markierten Partikeln der vorliegenden Erfindung, wodurch eine markierte, kontaktierte Probe erzeugt wird;
d) Inkubation und Waschen der markierten, kontaktierten Probe; und
e) Bestimmung der Verbreitung des markierten Partikels in der markierten, kontaktierten Probe.
Sie können außerdem in einem Verfahren verwendet werden, wobei das Vorliegen von Proteinen, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, in einer Probe von Säugerblutseren nachgewiesen wird, umfassend:
a) Herstellung einer Zusammensetzung, enthaltend einen Antikörper, der durch ein Immunogen erzeugt wurde, das aus den erfindungsgemäßen Partikeln besteht;
b) Inkontaktbringen der Probe mit einem ersten Teil der Zusammensetzung und dem Immunogen, das markiert wurde, Inkubation und Waschen des ersten Teils;
c) Inkontaktbringen einer antigenfreien Kontrolle mit einem zweiten Teil der Zusammensetzung und dem Immunogen, das markiert wurde, Inkubation und Waschen des zweiten Teils;
d) Zugabe der gleichen Menge von Protein A-enthaltenden Staphylokokken zur Zusammensetzung der vorstehenden Schritte b) und c), Inkubation der beiden Zusammensetzungen und Abtrennung der Flüssigkeit von den Feststoffen; und
e) Bestimmung der Verbreitung des markierten Immunogens in den jeweils aus dem vorstehenden Schritt d) resultierenden Zusammensetzungen.
Die Proteine können ferner zur Herstellung eines diagnostischen Kits verwendet werden, mit dem das Vorliegen von Antikörpern gegen Proteine, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, in einer Probe von Säugerblutseren nachgewiesen wird, umfassend:
a) unmarkierte Proteine, umfassend das erfindungsgemäße Partikel, angelagert an einen festen Träger; und
b) markierte Antikörper gegen z.B. menschliches IgG oder IgM.
Sie können ferner zur Herstellung eines diagnostischen Kits verwendet werden, mit dem das Vorliegen von Proteinen, die durch den PreS&sub1;- PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, in einer Probe von Säugerblutseren nachgewiesen wird, umfassend:
a) Antikörper, die durch die erfindungsgemäßen Partikel hergestellt werden, angelagert an einen festen Träger; und
b) markierte Antikörper, hergestellt durch die erfindungsgemäßen Partikel.
Sie können außerdem zur Entwicklung von diagnostischen Tests zum direkten Nachweis von Hepatitis-B-Oberflächenantigenen und Antikörpern, die gegen solche Antigene hervorgebracht wurden, eingesetzt werden. Radioimmuntest (RIA) oder Enzmymimmuntest (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) werden zum Nachweis von HBV-Antigenen, die Proteine enthalten, die durch die PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereiche codiert werden, in Seren HBV-infizierter Tiere, z.B. Menschen, verwendet. Ein diagnostischer Test umfasst folgendes:
1. Ein festes Substrat, das Bindungsstellen enthält, wie z.B. Polystyrol-Perlen, wird mit Antikörpern gegen Partikel beschichtet, die Aminosäuresequenzen enthalten, die den Sequenzen der PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-enthaltenden Polypeptide entsprechen.
2. Die beschichteten Perlen werden sodann z.B. mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, um überschüssige Antikörper zu entfernen.
3. Die Perlen werden anschließend mit einer Protein-enthaltenden Lösung, wie z.B. Rinderserumalbumin (BSA) oder Gelatine, in Kontakt gebracht, um die Proteinbindungsstellen auf den Perlen zu sättigen (um die unspezifische Bindung zu vermindern). Eine günstige Konzentration einer solchen Protein-enthaltenden Lösung kann verwendet werden, z.B. 1 mg/ml bis 50 mg/ml.
4. Die Perlen werden sodann gewaschen, um überschüssiges BSA oder Gelatine zu entfernen.
5. Die Perlen werden anschließend mit Serumproben inkubiert, von denen man annimmt, daß sie HBV oder HBV-Oberflächenantigene enthalten (normales Serum wird als Kontrolle verwendet).
6. Die Perlen werden sodann mit einer Lösung, wie z.B. Tris-gepufferter Kochsalzlösung, gewaschen und mit einem radioaktiv-markierten Antikörper, z.B. mit ¹²&sup5;I-markiertem Antikörper gegen HBV-Oberflächenantigene, gemischt.
7. Die Perlen werden inkubiert.
8. Die Perlen werden anschließend gewaschen und in einem Gammazähler gezählt.
Partikel der vorliegenden Erfindung, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S- Protein-codierenden Bereich codiert werden, können als diagnostisches Mittel zum Nachweis von Antikörpern gegen die PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Bereiche der HBV-Oberflächenantigen-Proteine in einer bestimmten Probe verwendet werden. Die PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-enthaltenden Partikel werden an ein festes Substrat, das Bindungsstellen enthält, z.B. Polystyrol-Perlen, adsorbiert Sodann wird das Substrat mit einer Substanz, z.B. Gelatine, BSA oder Milchpulver, in Kontakt gebracht, um die unspezifischen Bindungsstellen zu sättigen. Danach wird das Substrat mit einer gepufferten Lösung gewaschen und anschließend der Puffer entfernt. Eine Probe, z.B. menschliches Serum, verdünnt mit tierischem Serum, wird zum Substrat zugegeben Die resultierende Masse wird inkubiert und gewaschen. Anschließend werden radioaktiv markierte, z.B. iodierte (¹²&sup5;I) Antikörper gegen menschliches IgG oder IgM zur Masse zugesetzt. Die resultierende Masse wird inkubiert, sodann gewaschen und gezählt, z.B. im Gammazähler. Sofern das Zählergebnis höher ist als das mit normalem Kontrollserum enthaltene Ergebnis, enthält die Probe Antikörper gegen die PreS&sub1;- PreS&sub2;-S- codierenden Bereiche von HBV.
Das vorstehende Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen Proteine, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich von HBV codiert werden, ist als diagnostisches Mittel zum Nachweis einer Hepatitis-B-Virus-Infektion anwendbar.
Ein diagnostisches Testkit zum Nachweis von Antigenen, die durch die PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereiche des HBV-Genoms codiert werden, in einer Testprobe sollte folgendes umfassen:
1. ein festes Substrat, beschichtet mit Antikörpern gegen ein Partikel, das Aminosäuresequenzen aufweist, die den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Bereichen der HBV-Oberflächenantigen-Partikel der vorliegenden Erfindung entsprechen;
2. eine Protein enthaltende Lösung zur Sättigung der Proteinbindungsstellen auf dem festen Substrat; und
3. eine bestimmte Menge eines radioaktiv-markierten Antikörpers, z.B. eines Antikörpers gegen die HBV-Oberflächenantigen-Polypeptide.
Ein weiteres diagnostisches Testkit zum Nachweis von Antikörpern gegen die Proteine, die durch den PreS&sub1;- PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich des Hepatitis-B-Virus-Genoms codiert werden, in der Testprobe, umfaßt folgendes:
1. ein festes Substrat, an welches Partikel adsorbiert sind, die Aminosäuresequenzen enthalten, die den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-codierenden Bereichen der HBV-Oberflächenantigen-Proteinen der vorliegenden Erfindung entsprechen, wobei das Substrat mit einer Protein enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht wird, um unspezifische Proteinbindungsstellen auf einem festen Substrat zu sättigen; und
2. eine bestimmte Menge radioaktiv markierter Antikörper gegen menschliches IgG oder IgM.
Die in den vorstehenden beschriebenen Testkits verwendeten radioaktiv markierten Antikörper können als Lösung oder in lyophilisierter Form, die für eine Rekonstitution geeignet ist, verpackt werden. Außerdem können anstelle der beschriebenen radioaktiv-markierten Antikörper auch Enzym-gekoppelte oder Fluoreszenz-markierte Antikörper eingesetzt werden.
Das vorstehend beschriebene Testkit und Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen die Polypeptide des PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-codierenden Bereichs des Hepatitis-B-Virus können z.B. zum Nachweis einer HBV-Infektion bei einem Patienten eingesetzt werden, indem dem Patienten Serum abgenommen und der vorstehend beschriebene Test durchgeführt wird oder indem der vorstehend beschriebene Test verwendet wird; und zur Voraussage der Genesung eines Patienten von einer HBV-Infektion, indem einem infizierten Patienten Serum abgenommen wird und die beschriebenen Verfahren zum Nachweis von Antikörper durchgeführt werden.
Die Testverfahren und Testkits zum Nachweis von Antikörpern können verwendet werden, um qualitative Vergleiche zwischen verschiedenen HBV- Impfstoffen anzustellen, indem Serum von geimpften Patienten abgenommen wird und sodann die vorstehend beschriebenen Testverfahren oder Kits zum Antikörpernachweis eingesetzt werden. Im allgemeinen können alle bekannten Immuntests durchgeführt werden, bei denen dieses Antigen als Reagens verwendet wird, wobei die PreS&sub1;-, PreS&sub2;- oder S-enthaltenden Partikel der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Im allgemeinen können alle bekannten Immuntests durchgeführt werden, bei denen Antikörper-enthaltendes Serum oder Reagenzien verwendet werden, wobei Antikörperserum eingesetzt wird, das durch die Verwendung eines durch rekombinante DNA- Techniken erzeugten Peptids der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde. Diese Immuntests umfassen alle Immuntests, die von Langone und Van Vunakis in Methods of Enzymology, Academic Press, in den Bänden 70, 73 und 74, beschrieben werden. Diese Tests, die in den Beschreibungen der folgenden US-Patente: 4 459 359; 4 343 896; 4 331 761; 4 292 403; 4 228 240; 4 157 280; 4 152 411; 4 109 012; 4 016 043; 3 839 153; 3 654 090; und Re. 31 006 und in den Bänden 70, 73 und 74 von Methods of Enzymology, offenbart werden, sind durch Bezugnahme eingeschlossen.
Diese Erfindung betrifft ferner eine co-transfizierte eukaryotische Wirtszelle, die mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor und einem zweiten rekombinanten DNA-Vektor co-transfiziert ist, der den PreS&sub2;-S- Protein-codierenden Bereich oder nur den S-Protein-codierenden Bereich und einen MMT-Promotor umfaßt. Vorzugsweise umfaßt der zweite rekombinante Vektor zusätzlich eine Transkriptions-Terminationsstelle und gegebenenfalls einen Selektionsmarker. Gegebenenfalls ist der co-transfizierte Wirt mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Vektor, dem zweiten rekombinanten DNA-Vektor und einem dritten rekombinanten DNA- Vektor, der einen MMT-Promotor und einen Selektionsmarker umfaßt, cotransfiziert. Vorzugsweise umfaßt der dritte rekombinante Vektor zusätzlich eine Transkriptions-Terminationsstelle. Vorzugsweise enthalten der zweite und der mögliche dritte rekombinante DNA-Vektor außerdem ein Replicon für Wachstum und Amplifikation in einer prokaryotischen Wirtszelle, wie z.B. einer bakteriellen Wirtszelle, wenn ein solcher Wirt mit dem zweiten oder dem möglichen dritten rekombinanten DNA-Vektor transformiert ist.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer solchen co-transfizierten Wirtszelle, umfassend die Co- Transfektion einer eukaryotischen Zelle mit dem rekombinanten DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung, dem vorstehend beschriebenen zweiten rekombinanten DNA-Vektor und gegebenenfalls dem vorstehend beschriebenen dritten rekombinanten DNA-Vektor. Der zweite und der mögliche dritte rekombinante DNA-Vektor, die vorstehend beschrieben werden, können nach herkömmlichen Techniken konstruiert werden. Wenn der mögliche dritte Vektor nicht eingesetzt wird, umfaßt der zweite rekombinante DNA-Vektor vorzugsweise zusätzlich einen Selektionsmarker, z.B. einen Arzneistoffresistenzmarker. Wenn der zweite und/oder der mögliche dritte rekombinante DNA-Vektor eine Transkriptions-Terminationsstelle umfaßt, ist diese Stelle vorzugsweise die mg-PAS-t-Terminationsstelle. Im vorstehend beschriebenen zweiten rekombinanten DNA-Vektor liegt der MMT-Promotor vorzugsweise unmittelbar stromaufwärts des PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereichs. Im vorstehend beschriebenen möglichen dritten rekombinanten DNA-Vektor liegt der MMT-Promotor vorzugsweise unmittelbar stromaufwärts des Selektionsmarkers. Vorzugsweise enthalten weder der vorstehend beschriebene zweite rekombinante Vektor noch der vorstehend beschriebene mögliche dritte rekombinante Vektor nicht-HBV virale DNA-Segmente, und sie sind nicht onkogen. Somit werden die bevorzugten Vektoren bei der Transfektion in einen Wirt ins Wirtschromosom integriert und mit dem Wirtsgenom zusammen passiv repliziert.
Der erfindungsgemäße Vektor, der vorstehend beschriebene zweite rekombinante DNA-Vektor und gegebenenfalls der vorstehend beschriebene dritte rekombinante DNA-Vektor werden in einen eukaryotischen Wirt in paarweisen Kombinationen oder alle drei Vektoren zusammen unter Einsatz herkömmlicher Verfahren co-transfiziert. In einer anderen Ausführungsform werden der erfindungsgemäße Vektor, der zweite rekombinante DNA- Vektor und gegebenenfalls der dritte rekombinante DNA-Vektor in einer Reihe von Schritten in einen eukaryotischen Wirt transfiziert. Zuerst wird der erfindungsgemäße Vektor in einen eukaryotischen Wirt gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren transfiziert, wodurch der transfizierte Wirt der vorliegenden Erfindung hergestellt wird. Anschließend wird der transfizierte Wirt mit dem vorstehend beschriebenen zweiten rekombinanten DNA-Vektor und gegebenenfalls mit dem vorstehend beschriebenen dritten rekombinanten DNA-Vektor gemäß herkömmlichen Verfahren transfiziert, wodurch der co-transfizierte Wirt der vorliegenden Erfindung erzeugt wird.
Vorzugsweise enthalten der erfindungsgemäße Vektor, der zweite rekombinante DNA-Vektor und der mögliche dritte rekombinante DNA-Vektor Selektionsmarker, die voneinander verschieden sind, so daß nach jedem erfolgten Transfektionsschritt die Identifizierung des neuerlich transfizierten Wirts möglich ist, schließlich wird der endgültige transfizierte Wirt der vorliegenden Erfindung erhalten. Solche sekundären Transfektionsschritte werden durchgeführt, um die Gen-Kopienzahl des PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereichs zu erhöhen, der in der mehrfach transfizierten Wirtszelle enthalten ist. Vorzugsweise umfaßt weder der zweite rekombinante Vektor noch der mögliche dritte rekombinante Vektor ein Replicon, das in einer eukaryotischen Zelle funktionieren kann.
Diese Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Partikels, das durch den co-transfizierten Wirt der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, umfassend mindestens ein Protein, das durch den gesamten PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert wird, umfassend: a) Züchtung der co-transfizierten eukaryotischen Wirtszelle der vorliegenden Erfindung unter Kulturmedium-Bedingungen, die den Wirt befähigen, solche Proteine zu exprimieren; und b) Isolierung des Partikels. Vorzugsweise kann der co-transfizierte Wirt die Proteine, zusammengebaut zu den Partikeln, ins Medium ausscheiden. Vorzugsweise umfaßt das Verfahren außerdem die Zugabe von Schwermetallionen oder Steroidhermonon ins Kulturmedium, um die Expression des PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereichs, der in den co-transformierten Vektoren enthalten ist, zu steigern. Schwermetallionen, insbesondere Zink oder Cadmium, sind am stärksten bevorzugt. Die optimale Konzentration der im Medium enthaltenen Schwermetallionen oder Steroidhormonen kann nach herkömmlichen Techniken bestimmt werden. Diese Erfindung betrifft außerdem Partikel, die durch ein solches Verfahren hergestellt werden. Wenn der cotransfizierte Wirt der vorliegenden Erfindung die Partikel direkt ins Kulturmedium ausscheidet, können die Partikel anschließend aus dem Kulturmedium des erfindungsgemäßen co-transformierten Wirts durch herkömmliche Techniken der Proteinisolierung isoliert werden. Wenn der cotransfizierte Wirt die Partikel nicht ins Kulturmedium ausscheidet, werden sie aus einem Kulturlysat des co-transfizierten Wirts durch herkömmliche Kulturlysat-Techniken erhalten. Solche Partikel werden in glykosylierter Form isoliert und sind aus Proteinen zusammengesetzt, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich, den PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich oder den S-Protein-codierenden Bereich codiert werden.
Diese Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, umfassend eine immunprotektive Menge (vorzugsweise 1 bis 20 µg) der Partikel, die durch den co-transfizierten Wirt der vorliegenden Erfindung produziert werden.
Das durch den co-transfizierten Wirt erzeugte Partikel der vorliegenden Erfindung enthält keine viralen DNA-Komponenten und ist somit frei von unerwünschten Nebenwirkungen, die üblicherweise bei von natürlichen Substanzen hergeleiteten Impfstoffen auftreten, wie z.B. einer ungewollten Infektion mit dem Virus, allergischen Reaktionen, Fieber und dergleichen. Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Impfstoff, der eine immunprotektive Menge der Partikel umfaßt, die durch den erfindungsgemäßen co-transfizierten Wirt hergestellt wurden, kann eingesetzt werden, um die HBV-Immunantwort zu verstärken und das Nicht-Ansprechen auf Hepatitis-B-Virus-Impfstoffe zu umgehen, die nicht mindestens ein Protein umfassen, das durch die gesamte PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Proteincodierende Sequenz codiert wird.
Der Impfstoff kann durch Kombination einer immunprotektiven Menge der durch den erfindungsgemäßen co-transfizierten Wirt hergestellten Partikel mit einem geeigneten Puffer, z.B. Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, hergestellt werden. Der Impfstoff kann außerdem ein Adjuvans, wie z.B. Aluminiumhydroxid und dergleichen, umfassen.
In einer anderen Ausführungsform können die Polypeptide, die in den durch den erfindungsgemäßen co-transfizierten Wirt hergestellten Partikeln enthalten sind, aus den Partikeln dissoziiert und in einem Lipidvesikel wieder assoziiert werden. Ein Hepatitis B-Impfstoff kann unter Verwendung der Lipidvesikel, welche die Polypeptide der erfindungsgemäßen Partikel umfassen, hergestellt werden. Der Impfstoff, der die Lipidvesikel umfaßt, kann ferner ein Adjuvans, wie z.B. Aluminiumhydroxid, enthalten.
Die durch den erfindungsgemäßen co-transfizierten Wirt erzeugten Partikel, die im Impfstoff der vorliegenden Erfindung enthalten sind, können zusammen mit einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel (Medium), wie z.B. Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, verwendet werden.
Der erfindungsgemäße Impfstoff, der eine immunprotektive Menge der erfindungsgemäßen Partikel umfaßt, kann nach dem gleichen allgemeinen Verfahren hergestellt und eingesetzt werden, wie in US-Patent 4 118 479 beschrieben.
Der Impfstoff kann durch subkutane, intradermale oder intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Der bevorzugte Weg hängt vom jeweiligen Impfstoff ab, im allgemeinen ist jedoch die intramuskuläre Injektion am besten geeignet. Die Häufigkeit der Verabreichung hängt vom Impfstoff ab.
Die Proteine, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, der im Vektor der vorliegenden Erfindung enthalten ist, können in einem Verfahren verwendet werden, wobei das Vorliegen von Antikörpern in einer Probe von Säugerblutseren nachgewiesen wird, umfassend:
a) Inkontaktbringen der Probe mit einem festen Substrat, das mit nicht-markierten, durch den erfindungsgemäßen co-transfizierten Wirt hergestellten Partikeln beschichtet ist;
b) Inkubation und Waschen der kontaktierten Probe;
c) Inkontaktbringen der kontaktierten Probe mit markierten Partikeln der vorliegenden Erfindung, wodurch eine markierte, kontaktierte Probe erzeugt wird;
d) Inkubation und Waschen der markierten, kontaktierten Probe; und
e) Bestimmung der Verbreitung des markierten Partikels in der markierten, kontaktierten Probe.
Die Proteine können außerdem in einem Verfahren verwendet werden, wobei das Vorliegen von Proteinen, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Proteincodierenden Bereich codiert werden, in einer Probe von Säugerblutseren nachgewiesen wird, umfassend:
a) Herstellung einer Zusammensetzung, enthaltend einen Antikörper, der durch ein Immunogen erzeugt wurde, das aus den erfindungsgemäßen Partikeln besteht;
b) Inkontaktbringen der Probe mit einem ersten Teil der Zusammensetzung und dem Immunogen, das markiert wurde, Inkubation und Waschen des ersten Teils;
c) Inkontaktbringen einer antigenfreien Kontrolle mit einem zweiten Teil der Zusammensetzung und dem Immunogen, das markiert wurde, Inkubation und Waschen des zweiten Teils;
Zugabe der gleichen Menge von Protein A-enthaltenden Staphylokokken zur Zusammensetzung der vorstehenden Schritte b) und c), Inkubation der beiden Zusammensetzungen und Abtrennung der Flüssigkeit von den Feststoffen; und
e) Bestimmung der Verbreitung des markierten Immunogens in den jeweils aus dem vorstehenden Schritt d) resultierenden Zusammensetzungen.
Die Proteine können ferner zur Herstellung eines diagnostischen Kits verwendet werden, mit dem das Vorliegen von Antikörpern gegen Proteine, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, in einer Probe von Säugerblutseren nachgewiesen wird, umfassend:
a) unmarkierte Proteine, umfassend das erfindungsgemäße Partikel, angelagert an einen festen Träger; und
b) markierte Antikörper gegen z.B. menschliches IgG oder IgM.
Außerdem können sie zur Herstellung eines diagnostischen Kits verwendet werden, mit dem das Vorliegen von Proteinen, die durch den PreS&sub1;- PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, in einer Probe von Säugerblutseren nachgewiesen wird, umfassend:
a) Antikörper, die durhc die erfindungsgemäßen Partikel erzeugt wurden, angelagert an einen festen Träger; und
b) markierte Antikörper, erzeugt durch die erfindungsgemäßen Partikel.
Diese Erfindung betrifft ein rekombinantes DNA-Concatamer, umfassend: a) einen Plasmidvektor, der den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich enthält, und mindestens einen weiteren Plasmidvektor, der einen der folgenden codierenden Bereiche umfaßt: PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich oder PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich oder S-Proteincodierenden Bereich; und b) den MMT-Promotor. Das Concatamer umfaßt vorzugsweise außerdem einen Selektionsmarker und eine Transkriptions-Terminationsstelle.
Diese Erfindung betrifft außerdem eine eukaryotische Wirtszelle, die mit dem erfindungsgemäßen Concatamer transfiziert ist. Der Wirt ist vorzugsweise eine Säugerzelle. Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer mit dem erfindungsgemäßen Concatamer transfizierten Wirtszelle, umfassend die Transfektion einer eukaryotischen Zelle mit dem erfindungsgemäßen Concatamer.
Diese Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Partikels, das durch den erfindungsgemäßen transfizierten Wirt hergestellt wird, umfassend mindestens ein Protein, das durch den gesamten PreS&sub2;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert wird, umfassend: a) Züchtung der erfindungsgemäßen transfizierten eukaryotischen Wirtszelle, die das erfindungsgemäße Concatamer umfaßt, unter Kulturmedium-Bedingungen, die den Wirt befähigen, die Proteine zu exprimieren; und b) Isolierung des Partikels. Vorzugsweise kann der co-transfizierte Wirt die Proteine, zusammengebaut zu den Partikeln, ins Medium ausscheiden. Vorzugsweise umfaßt das Verfahren außerdem die Zugabe von Schwermetallionen oder Steroidhormonen ins Kulturmedium, wodurch die Expression des PreS&sub1;- PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereichs, der in den transfizierten Vektoren enthalten ist, gesteigert wird. Schwermetallionen, insbesondere Zink oder Cadmium, sind am stärksten bevorzugt. Die optimale Konzentration der im Medium enthaltenen Schwermetallionen oder Steroidhormonen kann nach herkömmlichen Techniken bestimmt werden. Diese Erfindung betrifft ferner die durch dieses Verfahren hergestellten Partikel. Wenn der mit dem erfindungsgemäßen Concatamer transfizierte Wirt die Partikel direkt ins Kulturmedium ausscheidet, können die Partikel anschließend aus dem Kulturmedium des erfindungsgemäßen transfizierten Wirts durch herkömmliche Techniken der Proteinisolierung isoliert werden. Wenn der transfizierte Wirt die Partikel nicht ins Kulturmedium ausscheidet, können sie aus einem Kulturlysat des transfizierten Wirts durch herkömmliche Kulturlysat-Techniken erhalten werden. Solche Partikel werden in glykosylierter Form isoliert und sind aus Proteinen zusammengesetzt, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich, den PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich und den S-Protein-codierenden Bereich codiert werden
Diese Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, umfassend eine immunprotektive Menge (vorzugsweise 1 bis 20 µg) der Partikel, die durch den mit dem erfindungsgemäßen Concatamer transfizierten Wirt produziert werden.
Das durch den mit dem erfindungsgemäßen Concatamer transfizierten Wirt erzeugte Partikel enthält keine viralen DNA-Komponenten und ist somit frei von unerwünschten Nebenwirkungen, die üblicherweise bei von natürlichen Substanzen hergeleiteten Impfstoffen auftreten, wie z.B. einer ungewollten Infektion mit dem Virus, allergischen Reaktionen, Fieber und dergleichen. Der erfindungsgemäße Impfstoff, der eine immunprotektive Menge der Partikel umfaßt, die durch den mit dem erfindungsgemäßen Concatamer transfizierten Wirt hergestellt wurden, kann eingesetzt werden, um die HBV-Immunantwort zu verstärken und das Nicht-Ansprechen auf Hepatitis B-Virus-Impfstoffe zu umgehen, die nicht mindestens ein Protein umfassen, das durch die gesamte PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierende Sequenz codiert wird.
Der Impfstoff kann durch Kombination einer immunprotektiven Menge der Partikel, die durch den mit dem erfindungsgemäßen Concatamer transfizierten Wirt hergestellt werden, mit einem geeigneten Puffer, z.B. Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, produziert werden. Der Impfstoff kann außerdem ein Adjuvans, wie z.B. Aluminiumhydroxid und dergleichen, umfassen.
In einer anderen Ausführungsform können die Polypeptide, die in den Partikeln, die durch den mit dem erfindungsgemäßen Concatamer transfizierten Wirt hergestellt werden, enthalten sind, aus den Partikeln dissoziiert und in einem Lipidvesikel wieder assoziiert werden. Ein Hepatitis-B-Impfstoff kann unter Verwendung der Lipidvesikel, welche die Polypeptide der erfindungsgemäßen Partikel umfassen, hergestellt werden. Der Impfstoff, der die Lipidvesikel umfaßt, kann ferner ein Adjuvans, wie z.B. Aluminiumhydroxid, enthalten.
Die durch den mit dem erfindungsgemäßen Concatamer transfizierten Wirt erzeugten Partikel, die im Impfstoff der vorliegenden Erfindung enthalten sind, kännen zusammen mit einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel (Medium), wie z.B. Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, verwendet werden.
Der erfindungsgemäße Impfstoff, der eine immunprotektive Menge der erfindungsgemäßen Partikel umfaßt, kann nach dem gleichen allgemeinen Verfahren hergestellt und eingesetzt werden, wie in US-Patent 4 118 479 beschrieben.
Der Impfstoff kann durch subkutane, intradermale oder intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Der bevorzugte Weg hängt vom jeweiligen Impfstoff ab, im allgemeinen ist jedoch die intramuskuläre Injektion am besten geeignet. Die Häufigkeit der Verabreichung hängt vom Impfstoff ab.
Die Proteine, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, der im Vektor der vorliegenden Erfindung enthalten ist, können in einem Verfahren eingesetzt werden, in dem das Vorliegen von Antikörpern in einer Probe von Säugerblutseren nachgewiesen wird, umfassend
a) Inkontaktbringen der Probe mit einem festen Substrat, das mit nicht-markierten Partikeln beschichtet ist, die durch den mit dem erfindungsgemäßen Concatamer transfizierten Wirt erzeugt wurden;
b) Inkubation und Waschen der kontaktierten Probe;
c) Inkontaktbringen der kontaktierten Probe mit markierten Partikeln der vorliegenden Erfindung, wodurch eine markierte, kontaktierte Probe erzeugt wird;
d) Inkubation und Waschen der markierten, kontaktierten Probe; und
e) Bestimmung der Verbreitung des markierten Partikels in der markierten, kontaktierten Probe.
Sie können außerdem in einem Verfahren verwendet werden, wobei das Vorliegen von Proteinen, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, in einer Probe von Säugerblutseren nachgewiesen wird, umfassend:
a) Herstellung einer Zusammensetzung, enthaltend einen Antikörper, der durch ein Immunogen erzeugt wurde, das aus den erfindungsgemäßen Partikeln besteht;
b) Inkontaktbringen der Probe mit einem ersten Teil der Zusammensetzung und dem Immunogen, das markiert wurde, Inkubation und Waschen des ersten Teils;
c) Inkontaktbringen einer antigenfreien Kontrolle mit einem zweiten Teil der Zusammensetzung und dem Immunogen, das markiert wurde, Inkubation und Waschen des zweiten Teils;
d) Zugabe der gleichen Menge von Protein A-enthaltenden Staphylokokken zur Zusammensetzung der vorstehenden Schritte b) und c), Inkubation der beiden Zusammensetzungen und Abtrennung der Flüssigkeit von den Feststoffen; und
e) Bestimmung der Verbreitung des markierten Immunogens in den jeweils aus dem vorstehenden Schritt d) resultierenden Zusammensetzungen.
Ferner können sie zur Herstellung eines diagnostischen Kits verwendet werden, mit dem das Vorliegen von Antikörpern gegen Proteine, die durch den PreS&sub1;- PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, in einer Probe von Säugerblutseren nachgewiesen wird, umfassend: unmarkierte Proteine, umfassend das Partikel der vorliegenden Erfindung, angelagert an einen festen Träger; und
b) markierte Antikörper gegen, z.B., menschliches IgG oder IgM.
Sie können ferner zur Herstellung eines diagnostischen Kits verwendet werden, mit dem das Vorliegen von Proteinen, die durch den PreS&sub1;- PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, in einer Probe von Säugerblutseren nachgewiesen wird, umfassend:
a) Antikörper, induziert durch die erfindungsgemäßen Partikel, angelagert an einen festen Träger; und
b) markierte Antikörper, hergestellt durch die erfindungsgemäßen Partikel.
Als Ausgangsmaterial für die erste bevorzugte Ausführungsform wird ein Vektor konstruiert, der Gensequenzen aus den rekombinanten Plasmiden pBPV342-12 (Law et al., Molecular and Cellular Biol. 3 (1983), 2110) und pAOI (Cummings, I. W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 1842) enthält. Einige genetische Elemente aus diesen Plasmiden werden kombiniert, wodurch ein Vektor erhalten wird, der pDM1 genannt wird (vgl. Fig. 3). Plasmid pDM1, welches das Gensegment, das den PreS&sub1;- PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich umfaßt, unter der Kontrolle des natürlichen Promotorsystems des Protein-codierenden Bereichs, das Neomycinresistenz-Gen, den MMT-Promotor und eine SV40-PAS-t-Region enthält, wird anschließend durch Transfektion in eine eukaryotische Zelle eingeführt, wobei verschiedene eukaryotische Zellen zur Auswahl stehen, wie z.B. Säugerzellen, wodurch eine Expression auf hohem Niveau und vorzugsweise die Sekretion der erfindungsgemäßen Partikel erhalten wird.
Plasmid pBPV342-12 (vgl. Figur 1) enthält Gensequenzen, umfassend den MMT-Promotor, das Neomycinresistenz-Gen, eine SV40-PAS-t-Region und das Genom des Rinder-Papillomavirus (BPV). Bei der Konstruktion von Plasmid pDM1 wird Plasmid pBPV342-12 einer BamHI-Spaltung unterworfen, mit dem Ergebnis, daß das Plasmid in zwei DNA-Fragmente gespalten wird.
Nach Trennung der Fragmente wird das Fragment mit 7,95 Kilobasen (kb), das das gesamte BPV-Genom enthält, verworfen. Die Entfernung der BPV-DNA ist sehr vorteilhaft, denn hierdurch wird das Vorliegen von BPV-DNA oder -Proteinen im erfindungsgemäßen Partikel, das zur Zubereitung eines Impfstoffs verwendet werden soll, vermieden. Das verbliebene BamHI-Fragment (6,65 kb) von pBPV342-12, das die Gensequenzen für den MMT-Promotor, das Neomycinresistenz-Gen und die SV40-PAS-t-Region enthält, wird sodann durch herkömmliche Techniken mit einer DNA-Sequenz verknüpft, die von Plasmid pAOI stammt, die jedoch einen intakten PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich enthält (nachstehend diskutiert; vgl. auch Figur 2).
Plasmid pAOI (vgl. Figur 2), das das gesamte Hepatitis-B-Virus-Genom enthält, wird einer EcoRI-Spaltung unterworfen, wodurch ein 3,2 kbgroßes Fragment erzeugt wird. Das 3,2 kb-große Fragment wird mit sich selbst verknüpft, wodurch zweimal sich wiederholende Sequenzen ("tandem repeats") erhalten werden, die eine lange concatamere DNA-Struktur umfassen, welche Gensequenzen enthält, die sowohl die Kern- als auch die Oberflächenantigene von Hepatitis-B-Virus codieren. Diese Manipulation der Hepatitis-B-Virus-Gensequenzen, die erforderlich ist, um die durch die molekulare Clonierung in Plasmid pAOI verursachte Permutation aufzuheben und eine funktionelle Organisation des PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereichs wiederherzustellen, wird nach dem Verfahren von Cummings et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 1842, durchgeführt. Durch die anschließende BglII-Spaltung wird das Gensegment des HBV-Kernantigens entfernt und ein DNA-Fragment erhalten (2,78 kb), das den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich des Hepatitis-B-Virus-Genoms und das natürliche Promotorsystem (PHB) für diesen Bereich umfaßt.
Das lineare pBPV342-12-BamHI-Fragment (vgl. Figur 1) und das aus pAOI stammende BglII-Fragment (vgl. Figur 2) werden anschließend ligiert, wodurch das rekombinante Plasmid pDM1 (vgl. Figur 3) erzeugt wird, das den natürlichen Promotor (PHB) für den PreS&sub1;- PreS&sub2;-S-Proteincodierenden Bereich enthält.
Anschließend wird der natürliche Promotor in pDM1 durch eine Spaltung mit BglII und BamHI so ausgeschnitten, daß der MMT-Promotor direkt vor dem PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich liegt, wodurch die Transkription dieses codierenden Bereichs durch den MMT-Promotor kontrolliert wird. Nach der Spaltung mit BamHI und BglII werden drei getrennte DNA- Fragmente erhalten (vgl. Figuren 4A und 4B):
1) ein 5,1 kb-großes Fragment, das eine Polyadenylierungsstelle und den MMT-Promotor enthält;
2) ein 3,0 kb-großes Fragment, das das Neomycinresistenz-Gen und den natürlichen Promotor enthält; und
3) ein 1,4 kb-großes Fragment, das den PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich enthält.
Nach der Reinigung werden die 5,1 kb und 1,4 kb großen Fragmente unter Verwendung herkömmlicher Techniken ligiert, wodurch rekombinante Plasmide (6,46 kb) produziert werden, die den PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich enthalten, der jetzt unter der Kontrolle des MMT-Promotors steht. Da die relative Orientierung der beiden ligierten Fragmente jeweils zufällig ist und zwei verschiedene Plasmidtypen erzeugt werden, von denen nur einer die korrekte Transkriptions-Lese-Orientierung von dem MMT-Promotor zu den Oberflächenantigen-Gensequenzen zeigt, wird das korrekte funtionelle Plasmid pDM2 ermittelt, indem die gereinigten Plasmid-Kandidaten mit EcoRI und XbaI gespalten werden. Das Plasmid mit der korrekten Orientierung ergibt nach dieser Spaltung ein 2,1 und ein 4,4 kb-großes Fragment.
Ein Bakterienstamm, HB101, der pDM2 enthält, wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen, Göttingen, am 4. April 1985 unter der Hinterlegungsnummer DSM 3285 hinterlegt.

Dritte bevorzugte Ausfrührungsform

In einer dritten bevorzugten Ausführungsform wird der MMT-Promotor mit einem HBV-Gensegment, das den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich enthält, auf eine Art und Weise gespleißt, daß das natürliche Promotorsystem entfernt und die codierende Sequenz unter die direkte Kontrolle des MMT-Promotors gestellt wird (vgl. Figur 9).

Vierte bevorzugte Ausführungsform

In einer vierten bevorzugten Ausführungform wird der Abschnitt des Maus-Globingens mg-PAS-t, der aus Plasmid pBR322.G2 erhalten wurde, als Polyadenylierungs-Terminationssignal (PAS-t-Signal) anstelle des SV40- PAS-t-Bereichs eingesetzt. Durch die Substitution von mg-PAS-t werden DNA-Transfer-Vektoren ohne irgendwelche genomische Teile von Nicht-HBV- Viren bereitgestellt (vgl. die Figuren 9, 10 und 11).

Fünfte bevorzugte Ausführungsform

Eine fünfte bevorzugte Ausführungsform ist ein Verfahren zur Herstellung von gemischten Plasmid-DNA-Concatameren, wobei die Kopienzahl des Gens amplifiziert wird, indem ein hohes Verhältnis von Plasmiden, die die Genkonstrukte enthalten, welche die PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-, PreS&sub2;-S- oder S-Protein-codierenden Bereiche codieren, mit Plasmiden, die den Arzneistoffresistenzmarker enthalten, verknüpft wird, und diese anschließend in Zellinien transfiziert werden.
Die Plasmide pBR322.G2, POLINK 23456 und pBlg12.8 wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter den Hinterlegungsnummern 67073, 67072 bzw. 67075 am 11. April 1986 hinterlegt.
In den folgenden Beispielen wird die Herstellung der rekombinanten DNA-Vektoren, Wirte und Partikel der vorliegenden Erfindung und außerdem der Einbau in Säugerzellinien genauer beschrieben. Die folgenden Beispiele dienen ausschließlich der Erläuterung und sollen den Umfang der Patentansprüche in keiner Weise einschränken.

BEISPIELE

MATERIAL UND METHODEN

A. URSPRUNG UND BESCHREIBUNG VON SÄUGERZELLINIEN

1. L-ZELLEN

Der NCTC-Clon 929 wurde im März 1948 von K. K. Sanford, W. R. Earle und G. D. Likely (J. Nat. Cancer Inst. 9 (1948), 229) aus dem Elterstamm L hergeleitet, der im Jahre 1940 von W. R. Earle (J. Nat. Cancer Inst. 4 (1943), 165) eingeführt worden war. Der Elterstamm L stammte aus normalem subkutanem Areola- und Fettgewebe einer 100 Tage alten männlichen C3H/An-Maus, der Clon 929 wurde aus der 95. Subkultur-Generation des Elterstammes hergestellt (durch die Kapillartechnik für Einzelzellisolierung).
LM(TK&supmin;), eine Sublinie von Maus-L-Zellen, wurde von D. R. Dubbs und 5. Kit (5. Kit et al., Exp. Cell Res. 31 (1963), 297-312; und D. R. Dubbs und 5. Kit, Exp. Cell Res. 33 (1964), 19) isoliert und ist für Thymidinkinase defizient. Sie kann nicht in HAT-enthaltendem Medium wachsen. In dieser Zellinie wurde keine spontane Reversion der HAT- Resistenz beobachtet, höchstwahrscheinlich hat eine Deletion stattgefunden, die dieses Gen umfaßt.
Anzahl der seriellen Subkulturen aus Ursprungsgewebe:
648; Clon, 553.
Gefriermedium: Kulturmedium, 90 %; DMSO, 10 %; antibiotikafrei.
Lebensfähigkeit: 81 bis 96 % (Farbstoff-Ausschluß).
Kulturmedium: DMEM + 10 % FBS (Dulbeccos und Vogts modifiziertes Eagle- Medium + 10 % FBS)
Wachstumseigenschaften der aufgetauten Zellen: Eine Beimpfung mit 6 bis 8 x 10&sup5; Zellen in 5 ml des vorstehenden Kulturmediums pro T-25-Kolben ergibt eine 500-fache Zunahme innerhalb von 7 Tagen bei 37ºC, vorausgesetzt, das Medium wird zweimal wöchentlich erneuert und der pH-Wert wird mit einem angefeuchteten Gemisch aus 5 % oder 10 % Kohlendioxid in Luft auf 7,3 eingestellt. Subkulturen werden durch Abschaben oder Schütteln hergestellt. Zellen wachsen auch gut in anderen Medien (Waymouth, Eagle, NCTCl35 usw.), die mit 10 bis 30 % Pferdeserum angereichert sind.
Plattierungserfolg: 70 %
Morphologie: Fibroblasten-ähnlich.
Karyologie: Chromosomen-Häufigkeitsverteilung 100 Zellen: 2n = 40.
Langes metazentrisches Chromosom mit sekundärer Einschnürung, festgestellt in 77/100 Zellen.
Sterilität: Tests auf Mycoplasma, Bakterien und Pilze waren negativ.
Arten: Bestätigt als Maus-Zellen durch gemischte Agglutinations- und Hämagglutinations-Tests.
Empfänglichkeit für Viren: Empfänglich für Pseudorabies-Virus und das vesikuläre Stomatitis-Virus (Indiana-Stamm). Wenn die Zellen im vorstehenden Kulturmedium gezüchtet wurden, erzeugten Herpes simplex B-Virus und Vacciniavirus nur in der ersten Passage cytopathische Effekte. Die Empfänglichkeit für bestimmte Viren kann je nach verwendetem Kulturmedium verschieden sein. Nicht empfänglich für Poliovirus Typ 1, Coxsackievirus Typ B-5 und Polyomavirus.
Karzinogenität: Impfmaterial von 1 x 10&sup6; Zellen pro Maus wurde subkutan in nackte Mäuse injiziert. In nicht-bestrahlten Mäusen wurden 0/25 Tumoren erzeugt. In Röntgen-bestrahlten Mäusen (425 r, ganzer Körper) wurden an der Injektionsstelle 11/18 Tumoren (Sarkome) erzeugt.
Reverse Transkriptase: Positiv.
Vorgelegt, zubereitet und charakterisiert durch: American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.

2. Vero-Zellen

Die Vero-Zellinie wurde am 27. März 1962 aus der Niere eines normalen erwachsenen Affen (African Green Monkey) von Y. Yasumuar und Y. Kawakita an der Chiba University in Chiba, Japan, (Nippon Rinsho 21 (1963), 1209), angelegt.
Anzahl der seriellen Subkulturen aus Ursprungsgewebe: 121
Gefriermedium: Minimal-essentielles Medium (Eagle) mit nicht-essentiellen Aminosäuren und Earle-BSS, 85 %; fetales Rinderserum, 5 %; Dimethylsulfoxid (DMSO), 10 %; antibiotikafrei.
Lebensfähigkeit: Etwa 97 % (Farbstoff-Ausschluß).
Kulturmedium: DMEM, 5 % FBS.
Wachstumseigenschaften der aufgetauten Zellen: Eine Beimpfung mit 3 x 10&sup5; lebensfähigen Zellen in 3 ml des vorstehenden Kulturmediums pro T- 25-Kolben ergibt eine 30-fache Zunahme innerhalb von 7 Tagen bei 37ºC, vorausgesetzt, das Medium wird dreimal wöchentlich erneuert und der pH- Wert wird mit einem angefeuchteten Gemisch aus 5 % oder 10 % Kohlendioxid in Luft auf 7,4 eingestellt. Subkulturen werden durch Trypsin- Behandlung hergestellt.
Plattierungserfolg: Etwa 24 % im vorstehenden Kulturmedium.
Morphologie: Epithel-Fibroblasten-ähnlich.
Karyologie: Chromosomen-Häufigkeitsverteilung 50 Zellen: 2n = 60.
Sterilität: Tests auf Mycoplasma, Bakterien und Pilze waren negativ.
Arten: Bestätigt als Affen-Zellen durch Immunfluoreszenz-Test.
Empfänglichkeit für Viren: Empfänglich für Poliovirus Typ 3, Getah-, NNdumu-, Pixuna-, Ross River-, Semliki-, Paramaribo-, Kokobera-, Modoc-, Murutucu-, Germiston-, Guaroa-, Pongola- und Tacaribe-Arboviren. Nicht empfänglich für Stratford-, Apeu-, Caraparu-, Madrid-, Nepuyo- und Ossa- Arboviren.
Reverse Transkriptase: Nicht nachgewiesen.
Vorgelegt, zubereitet und charakterisiert durch: American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.

3. CHO-KI-Zellen

Die CHO-KI-Zellen wurden als Subclon von der Elter-CHO-Zellinie hergeleitet, die ursprünglich aus einer Biopsie eines Ovars eines erwachsenen Chinesischen Hamsters durch T. T. Puck im Jahre 1957 (J. Exp. Med. 108 (1958), 945) angelegt wurde. Die CHO-KI-Zellen sind für Prolin bedürftig und weisen eine modale Chromosomenzahl von 20 auf (Proc. Natl. Acad. Sci. 60 (1968), 1275). Den Zellen fehlt die aktive Genform, die für die Prolinsynthese erforderlich ist, wobei die Blockierung der Biosynthesekette in dem Schritt liegt, in dem Glutaminsäure in Glutaminsäure-gamma-Semialdehyd umgewandelt wird. Die Häufigkeit der Reversion zur Prolin-Unabhängigkeit beträgt etwa 10&supmin;&sup6; (Genetics 55 (1967), 513).
Anzahl der seriellen Subkulturen aus Ursprungsgewebe: Etwa 400; 7 bei ATCC.
Gefriermedium: Kulturmedium, 92 %; Glycerin, 8 %; antibiotikafrei.
Lebensfähigkeit: Etwa 90 % (Farbstoff-Ausschluß).
Kulturmedium: F-12-Medium (Ham), 90 %; fetales Rinderserum, 10 %; antibiotikafrei.
Wachstumseigenschaften der aufgetauten Zellen: Eine Beimpfung mit 10&sup5; lebensfähigen Zellen pro ml des vorstehenden Kulturmediums bei 37ºC ergibt innerhalb von 7 Tagen eine 15- bis 20-fache Zunahme.
Plattierungserfolg: Etwa 90 % im vorstehenden Kulturmedium.
Morphologie: Epithel-ähnlich.
Karyologie: Chromosomen-Häufigkeitsverteilung 50 Zellen: 2n = 22.
Sterilität: Tests auf Mycoplasma, Bakterien und Pilze waren negativ.
Arten: Bestätigt als Zellen des Chinesischen Hamsters durch cytotoxische Antikörper-Farbstoff-Ausschluß-Test und Isoenzym-Analyse.
Empfänglichkeit für Viren: Empfänglich für das vesikuläre Stomatitis-Virus (Indiana-Stamm) und Getah-Arboviren. Nicht empfänglich für Poliovirus Typ 2, Modoc- und Button William-Arboviren.
Reverse Transkriptase: Nicht nachgewiesen.
Spezielle Charakteristika: Die Bezugszellen benötigen Prolin zum Wachstum.
Vorgelegt durch: T. T. Puck, Eleanor Roosevelt Institute for Cancer Research, University of Colorado Medical Center, Denver, Colorado.

4. NIH/3T3-Zellen

Die NIH/3T3-Zellinie ist eine kontinuierliche Zellinie von stark kontaktgehemmten Zellen, die aus NIH-Swiss-Mausembryo-Kulturen in gleicher Art und Weise angelegt wurde wie die ursprüngliche zufällig gezüchtete 3T3-Linie (ATCC CCL 92) und die Inzucht-Linie BALB/c3T3 (ATCC CCL 163). Die angelegte NIH/3T3-Zellinie wurde mehr als 5 seriellen Subclonierungszyklen unterworfen, um einen Subclon mit morphologischen Eigenschaften zu entwickeln, die für Transformationstests bestens geeignet sind. Die frühesten verfügbaren Passagen dieser Subclone liegen bei etwa 120 nach der primären Embryokultur. Die NIH/3T3-Zellinie ist hochempfindlich gegenüber einer Sarkomavirus-Focusbildung und einer Leukämievirus-Vermehrung, außerdem hat sie sich in DNA-Transfektionsstudien als sehr nützlich erwiesen, J. Virol. 4 (1969) , 549-553; Cell 16 (1979), 63-75 und 347-356.

B. MEDIEN, PUFFER UND LÖSUNGEN

1. Für die Säuger-Zellkultur

a. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, Hohe Glucose-Konzentration (DMEM)

Das trockene pulverisierte Medium von GIBCO wird zubereitet und mit folgendem angereichert:
26 mM NaHCO&sub3;
2 mM L-Glutamin (Gibco)
1 mM Natriumpyruvat (Gibco)
60 µg/ml Gentamycin oder 100 Einheiten/ml Penicillin +
100 µg/ml
1 Streptomycin

b. Ham-F12

Das trockene pulverisierte Medium von GIBCO wird zubereitet und mit folgendem angereichert:
14 mM NaHCO&sub3;
60 µg/ml Gentamycin

c. Zell-Gefriermedium

90 % (Vol./Vol.) FBS-DMEM
10 % (Vol./Vol.) Dimethylsulfoxid
Das Gefriermedium wird direkt vor der Verwendung hergestellt. Alle Medien werden mittels Filtration durch 0,45 und 0,2 µm-Filter (Gilman) sterilisiert. Die Sterilität der Medien wird durch einwöchige Inkubation eines Aliquots antibiotikafreien Mediums bei 37ºC bestimmt. Medien, die für eine statische Kultur verwendet werden, werden mit 10 % FBS angereichert. Fetales Rinderserum (FBS) wird 30 Minuten bei 56ºC hitzeinaktiviert. Steriles Medium wird vor der Verwendung bei 40ºC gelagert

d. Trypsin-Lösung

0,5 g/l Trypsin
0,2 g/l Tetranatrium-EDTA in Hanks eingestellter Salzlösung (Hank's Balanced Salt Solution)
Da sich EDTA für Vero-Zellen als giftig erwies, wird bei diesen Zellen eine EDTA-freie Trypsin-Lösung verwendet.
e. PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, GIBCO) 183 mM NaCl
8,6 mM Na&sub2;HPO&sub4;
2,2 mM KH&sub2;PO&sub4;
f. TNE 160 mM NaCl
10 mM Tris, pH 7,5
1 mM EDTA

2. Für die Molekularbiologie

a. Lösungen für SDS-PAGE-Verfahren

Acrylamid (Vorrat) 30 % (Gew./Gew.) Acrylamid (Biorad)
0,8 % (Gew./Gew.) N,N-Methylenbisacrylamid (Biorad)
4 x Puffer für Trenngel 1,5 M Tris-Cl, pH 8,8
0,4 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat (SDS) (Serva)
4 x Puffer für Zwischengel 0,5 M Tris-Cl, pH 6,8
0,4 % (Gew./Vol.) SDS
3 x Probenpuffer 22,3 % (Vol./Vol.) Glycerin
0,03 % (Gew./Vol.) Bromphenolblau
6,7 % (Gew./Vol.) SDS
10 x Elektrodenpuffer 0,25 % M Tris, pH 8,2
1,90 M Glycin
1 % (Gew./Vol.) SDS
b. Lösungen für ( r Ver a en er Silbe irbung
Lösung I 50 % (Vol./Vol,) Methanol
10 % (Vol./Vol.) Essigsäure
Lösung II 10 % (Vol./Vol.) Methanol
5 % (Vol./Vol.) Essigsäure
Lösung III 10 % Glutaraldehyd
Lösung IV 20 % AgNO&sub3; in H&sub2;O (Vorrat)
Lösung V 3 % (Gew./Vol.) Na&sub2;CO&sub3;
0,1 % (Vol./Vol.) Formaldehyd

c. Lösungen für die Nick-Translation

10 x Reaktionspuffer 500 mM Tris-Cl, pH 7,2
100 mM MgSO&sub4;
1 mM DTT
Nucleotidgemisch 100 mM dGTP
100 mM dATP
100 mM dTTP in 10 mM Tris, pH 7,5

d. Lösungen für die Hybridisierung

20 x SSC 3 M NaCl
0,3 M Na&sub3;-Citrat
50 x Denhardt-Losung 1 % (Gew./Gew.) Ficoll 400 (PL-Pharmacia)
1 % (Gew./Gew.) Polyvinylpyrrolidon (Sigma)
1 % (Gew./Gew.) BSA Sterilfiltriert und gelagert bei Prahybridisierungsgemisch -20ºC
50 % (Vol./Vol) Formamid
5 x Denhardt-Lösung
5 x SSC
50 mM Natriumphosphat, pH 7,0
µg/ml denaturierte Lachssperma-DNA
Hybridisierungsgemisch 50 % Formamid
5 x SSC
20 mM Natriumphosphat, pH 7,0
1 x Denhardt-Lösung
100 µg/ml denaturierte Lachssperma-DNA e. Puffer für Restriktionsenzyme Laut Anweisung der Hersteller oder: Restriktionspuffer

f. Medien

1. L-Brühe: 10 g Bactotrypton
5 g Hefeextrakt
10 g NaCl
1 Liter H&sub2;O
2. L-Brühe-Agarplatten: L-Brühe, enthaltend 15 g/l Difco-Agar.
3. L-Brühe-amp-Agarplatten: L-Brühe-Agar, enthaltend 20 bis 50 µg/ml Ampicillin.

C. ENZYME

Die folgenden Enzyme werden verwendet:
1. Desoxyribonuclease 1 (Worthington)
2. DNA-Polymerase 1 ("Klenow-Fragment") (Boehringer Mannheim)
3. T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim)
4. Restriktionsenzyme:
EcoRI, XbaI, BamHI, BglII, BstEII, SpeI, SalI, HpaI, SmaI, PvuI, PstI (Boehringer Mannheim, BRL, New England Biolabs)
5. Lysozym (SIGMA)
6. Pronase

D. ANALYTISCHE UND QUANTITATIVE VERFAHREN

1. Farbstoff-Bindungstest

Die Konzentration des Gesamtproteins in Präparaten der gereinigten erfindungsgemäßen Partikel wird unter Verwendung des Protein-Testkits von Biorad bestimmt. Bei diesem Test wird der Bradford-Test eingesetzt, wobei Proteine, die Coomassie-Blau binden, spektrophotometrisch gemessen werden. Ovalbumin wird als Standard verwendet.

2. Radioimmuntest (RIA)

Im NML RIA 125-1 "Sandwich"-Radioimmuntest werden Perlen, die mit Maus-Antikörper gegen Hepatitis B-Oberflächenantigen (Anti-HBs) beschichtet sind, mit Serum oder Plasma und geeigneten Kontrollen inkubiert. Partikel, die Polypeptide enthalten, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S- Protein-codierenden Bereich codiert werden, werden an den Festphasen-Antikörper gebunden. Nach Aspiration des ungebundenen Materials und Waschen der Perlen läßt man menschliche ¹²&sup5;I-Anti-HBs mit dem Antikörper- Antigen-Komplex auf der Perle reagieren. Anschließend werden die Perlen gewaschen, um ungebundene ¹²&sup5;I-Anti-HBs zu entfernen.
Die auf den Perlen verbliebene Radioaktivität wird in einem Gamma- Szintillationszähler gezählt. Proben mit Zählergebnissen (Counts pro Minute, cpm), die größer als der Ausschlußwert oder gleich dem Ausschlußwert sind, der durch Multiplikation des Mittelwertes der negativen Kontrolle (NCX) mit einem Faktor bestimmt wurde, werden als reaktiv bewertet.

3. Immunfällung

Zellen werden bis zu einer Konfluenz von 100 % in einem T75- Kolben gezüchtet. Anschließend wird das Kulturmedium durch 5 ml Methionin-freies Medium, enthaltend 400 µCi L-[³&sup5;S]-Methionin und 400 µCi L- [³&sup5;S]-Cystein (NEN), ersetzt und über Nacht inkubiert. Das Medium wird durch fraktionierte Fällung mit Polyethylenglykol 10-fach eingeengt Eingeengtes Protein (etwa 10&sup6; cpm) wird mit 10 µl Prä-Immunserum vom Meerschweinchen oder mit 1 und 10 µl Anti-HBsAg-Meerschweinchenserum in 50 µl TBN (10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA, 130 mM NaCl) - 0,5 % Tween 20, eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Das Immunglobulin wird an 20 µl Protein A-Sepharose C1-4B (Pharmacia) eine Stunde bei 37ºC gebunden, einmal mit TEN-Tween 20 und 500 mM LiCl und nochmals mit TEN-Tween 20 gewaschen. Sodann werden die Proben einer Elektrophorese im nachstehend beschriebenen SDS-PAGE-System unterworfen. Die Gele werden 60 Minuten in einer Lösung von 10 % Trichloressigsäure, 10 % Eisessig und 30 % Methanol fixiert und in 30 Minuten Aufklärungslösung ("Enlightning", NEN) inkubiert. Die Gele werden getrocknet und mit KODAK XAR-5-Film autoradiographiert.

4. SDS-POLYACRYLAMID-GEL-ELEKTROPHORESE (PAGE)

Herstellung der Probe und des Gels

Zur Analyse durch PAGE werden Aliquots von gereinigten Partikeln der vorliegenden Erfindung auf 10 µg/ml eingestellt. Von jeder Probe werden 10 µl genommen und mit 10 µl 1 M DTT in 10 % SDS und 10 µl Probenpuffer gemischt. Dieses Gemisch wird direkt vor dem Auftragen 5, 10 oder 15 Minuten gekocht, um die 20 nm-Partikel aufzubrechen und monomere Moleküle zu erzeugen. Nach Zusatz von 10 µl Auftragspuffer wird das Gemisch einer Elektrophorese in einem 0,75 mm-dicken Plattengel (12 x 18 x 0,1 cm) von 12,5 % Polyacrylamid - 0,4 % Bisacrylamid unter Verwendung des Puffersystems von Laemmli (1970) bei 15 mA und 100 V sechs Stunden unterworfen. Proteinbanden werden durch Silberfärbung sichtbar gemacht (vgl. den nachstehenden Abschnitt Silberfärbung)

5. Silberfärbung

Das PAGE-Gel wird gemäß dem Verfahren von Merril et al. (1981) mit Silber gefärbt. Das Protein wird mit einer Lösung von 50 % Methanol und 10 % Essigsäure 30 Minuten im Gel fixiert. Das Gel wird mit einer Lösung von 10 % Methanol und 5 % Essigsäure 30 Minuten gewaschen. Nach 30-minütiger Inkubation in 10 % Glutaraldehyd wird das Gel über Nacht in entionisiertem Wasser gewaschen. Nach 30-minütiger Inkubation in 0,1 % AgNO&sub3; wird das Gel kurz in Wasser gewaschen. Das gefärbte Gel wird in 100 ml 3 % Na&sub2;CO&sub3; und 30 µl Formaldehyd entwickelt und in 1 % Essigsäure fixiert. Das Gel wird in einem Kunststoffbeutel versiegelt und photographiert.

E. GENTECHNISCHE VERFAHREN

1. DNA-Rekombinations-Verfahren

a. Restriktionsendonuclease-Spaltung von gereinigter DNA

Gemäß den Anweisungen des Herstellers der jeweiligen Endonuclease.

b. Isolierung von Plasmid-DNA

Plasmid-Herstellung in großem Maßstab mittels CsCl:
1. 1 Liter der Plasmid enthaltenden Zellen wird in L-Brühe bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,5 gezüchtet und 12 bis 20 Stunden mit 200 µg/ml Chloramphenicol amplifiziert.
2. Das Ganze wird in Sorval RC5b bei 8000 Upm 20 Minuten zentrifugiert.
3. Sodann wird es in 18 ml kalter 25 % Saccharose, 50 mM Tris, pH 8,0, resuspendiert.
4. Die Suspension wird in einen 250 ml Erlenmeyerkolben übertragen und auf Eis gehalten.
5. 6 ml 5 mg/ml Lysozym in 250 mM Tris, pH 8,0, werden zugefügt und 10 bis 15 Minuten stehengelassen.
6. 6 ml 250 mM EDTA, pH 8,0, werden zugefügt und leicht gemischt, sodann 15 Minuten auf Eis inkubiert.
7. 30 ml Detergens-Gemisch werden zugefügt:
0,01 % Triton X-100
60 mM EDTA, pH 8,
50 mM Tris, pH 8,
8. Es folgt eine Inkubation von 30 Minuten auf Eis.
9. Sodann wird bei 25 000 UpM, 90 Minuten, in einem SW28-Rotor bei 4ºC zentrifugiert.
10. Die Überstandsflüssigkeit wird mit Pronase auf 250 µg/ml versetzt und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert.
11. Das Ganze wird einer einmaligen Phenolextraktion mit 1/2 Volumen Phenol, äquilibriert mit TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA), unterworfen.
12. Die flüssige Schicht wird entfernt; Natriumacetat wird auf 300 mM zugefügt; 2 Volumina kaltes 100 % Ethanol werden zugefügt; es wird gründlich gemischt. Das Ganze wird über Nacht bei -20ºC gehalten.
13. Es wird zentrifugiert und in 6 ml TE-10 (10 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert.
14. 9,4 g CsCl, 0,65 ml 6 mg/ml Ethidiumbromid werden zugefügt und das Volumen mit sterilem doppelt-destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt.
15. Hitze-versiegelbare Gradientenröhrahen von Beckman werden gefüllt und 40 Stunden bei 48 000 UpM in einem Ti70.1 Beckman-Rotor zentrifugiert.
16. Plasmidbanden werden mit UV sichtbar gemacht und Plasmid-DNA mit einer Spritze und einer 18-Gauge-Nadel entnommen, indem die Seitenwand des Röhrchens durchstochen wird.
17. Ethidiumbromid wird aus der Plasmidfraktion durch drei aufeinanderfolgende Extraktionen mit gleichen Volumina Isobutanol entfernt.
18. Sodann wird einmal gegen 2 Liter 10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 7,5, 5 mM NaCl zwei Stunden oder länger bei 4ºC dialysiert.
19. Es folgt eine Phenolextraktion mit 1/3 Volumen Phenol, äquilibriert mit TE wie vorstehend.
20. NaAc wird auf 300 mM zugegeben, 2 Volumina 100 % Ethanol werden zugefügt; die Fällung wird über Nacht bei -20 ºC oder 30 Minuten bei -70 ºC durchgeführt.

c. Nick-Translation

Die Nick-Translation wird gemäß Rigby et al. (J. Mol. Biol. 113 (1977), 237-251) durchgeführt. Das Reaktionsgemisch für die ³²P-Markierung der DNA enthält üblicherweise 0,5 µg von z.B. dem EcoRI-XbaI-Fragment von pDM2 in einem Gesamtvolumen von 30 µl mit 50 mM Tris, pH 7,8, 5 mM MgCl&sub2;, 10 mM Mercaptoethanol, 0,1 mM dATP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM dTTP, 50 µCi ³²P-dCTP, 10 Einheiten DNA-Polymerase I, 3 µl einer 2 x 10&supmin;&sup5;-fachen Verdünnung von 1 mg/ml DNase I und wird 90 Minuten bei 15ºC inkubiert, wodurch 3 x 10&sup6; bis 12 x 10&sup6; Gesamt-cpm, d.h. 1 x 10&sup7; bis 5 x 10&sup7; cpm pro µg DNA erhalten werden.

d. Transformation kompetenter Bakterienzellen

Aus einer dichten Übernachtkultur wird 1 ml der Bakterienzellsuspenion entnommen und damit 100 ml Wachstumsmedium (L-Brühe) beimpft. Die Zellen werden bei 37ºC bis zu einer Dichte von OD&sub5;&sub5;&sub0; = 0,7 gezüchtet, diese Dichte wird unter starkem Schütteln in einem 500 ml Erlenmeyerkolben innerhalb von zwei Stunden erreicht. Das Wachstum wird durch 10-minütiges Abschrecken der Kultur auf Eis gestoppt. Aus dieser Kultur werden 3 ml abgenommen, um die exponentiellen Bakterienzellen bei 3000 UpM, 5 Minuten, zu ernten. Die Zellen werden in 1,5 ml 50 mM CaCl&sub2; in 10 mM Tris, pH 8,0, resuspendiert und weitere 15 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen werden nochmals durch fünfminütige Zentrifugation bei 3000 UpM geerntet und in 200 µl 50 mM CaCl&sub2; in 10 mM Tris, pH 8,0, resuspendiert und über Nacht bei 4ºC gehalten.
Danach wurde das Ligierungsgemisch mit 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, auf ein Gesamtvolumen von 70 µl aufgefüllt und zu den 200 µl Bakterienzellsuspension für die DNA-Aufnahme zugegeben.
Das Gemisch wurde 30 Minuten auf Eis inkubiert, anschließend mit 1 ml L-Brühe versetzt und das Gemisch 2 Minuten bei 42 ºC und 40 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen auf Agarplatten, die 50 µg Ampicillin pro ml Agar enthielten, in Mengen von 50 bis 300 µl Zellsuspension pro Platte verteilt. Die Agarplatten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit waren einzelne isolierte Bakterienkolonien entstanden.

e. Southern-Blot-Analyse

Um die Organisation innerhalb des Wirtszellengenoms des Vektors der vorliegenden Erfindung zu charakterisieren, wird chromosomale DNA aus Zellinien, die erfindungsgemäße Partikel produzieren, isoliert, mit dem (den) geeigneten Restriktionsenzym(en) gespalten und durch das Verfahren von Southern (J. Mol. Biol. 98 (1975), 503-515) unter Verwendung einer ³²P-markierten DNA-Sonde analysiert. Nach der Spaltung der chromosomalen DNA (20 µg) mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XbaI werden die resultierenden Fragmente durch Elektrophorese auf einem 0,7 % Agarosegel aufgetrennt. Anschließend wird die DNA denaturiert, indem sie 10 Minuten einem UV-Licht von 366 nm ausgesetzt und 45 Minuten in einer Lösung von 0,5 N NaOH und 1 M NaCl inkubiert wird. Die Gele werden durch 60-minütige Inkubation in 0,5 M Tris, 1,5 M NaCl, pH 7,5, neutralisiert. Die DNA wird aus dem Gel auf einen Nitrocellulose-Filter übertragen, indem das Gel 20 Stunden in 3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat (20 x SSC) eingeweicht und der darauf gelegte Nitrocellulose-Filter mit einem Stapel trockener Papiertücher bedeckt wird. Der Nitrocellulose-Filter wird zwei Stunden in einem Vakuumofen bei 80ºC gehalten.
Die radioaktive DNA-Sonde aus dem EcoRI-XbaI-Fragment des pDM1- Plasmids (4,3 kb) wird durch Nick-Translation hergestellt.
Für die Hybridisierung mit der DNA-Sonde wird der Nitrocellulose- Filter in einem Kunststoffbeutel versiegelt, der 10 ml Prähybridisierungsgemisch enthält: 50 % Formamid, 5 x SSC, 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0, 5 x Denhardt-Lösung, 250 µg/ml denaturierte Lachssperma-DNA. Der Filter wird in diesem Gemisch 4 Stunden bei 45ºC inkubiert, danach wird das Prähybridisierungsgemisch durch das Hybridisierungsgemisch ersetzt: 50 % Formamid, 5 x SSC, 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0, 1 x Denhardt-Lösung, 100 µg/ml denaturierte Lachssperma-DNA, 5 x 10 cpm/ml ³²P-Sonde. Nach Inkubation im Hybridisierungsgemisch für 18 Stunden bei 45ºC wird der Filter dreimal jeweils 5 Minuten in 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, bei 50ºC gewaschen. Der Filter wird 10 Minuten bei 60ºC getrocknet und gegenüber zwei Röntgenfilmen (XAR-5, KODAK) zwischen zwei Verstärkerschirmen exponiert und bei -80ºC gehalten. Der erste Röntgenfilm wird nach dreitägiger Exposition entwickelt; der zweite Film wird nach siebentägiger Exposition entwickelt. Die Hybridisierung der markierten DNA-Sonde an eines der zellulären DNA-Restriktionsfragmente aus Transfektanten, die erfindungsgemäße Partikel produzieren, zeigt, daß die zelluläre DNA tatsächlich den eingebauten Vektor der vorliegenden Erfindung enthält. Da das Restriktionsmuster der zellulären DNA, das mit Hilfe des Southern-Blot-Verfahrens gezeigt wurde, mit dem Muster des ursprünglichen Plasmid-Konstruktes identisch ist, hat somit beim Einbau in die Wirtszellen-DNA keine große Umordnung der Plasmid-DNA stattgefunden.

2. Transfektion von Säuger-Zellinien und Identifizierung von Clonen die erfindungsgemäße Partikel produzieren

Zellen werden transfiziert, wobei das Verfahren der Calciumphosphat-Fällung von Wigler et al. (Cell 14 (1978), 725) eingesetzt wird. Anschließend werden die Zellen 1:6 auf neue Kulturschalen aufgeteilt und die Zellen, die das Arzneistoffresistenzmarker-Gen (neo) aufgenommen haben, durch Wachstum in G418-enthaltendem Medium selektiert. Nach zehn Tagen Wachstum in Selektivmedium werden die arzneistoffresistenten Kolonien in Mikrotiterplatten doniert. Die Spiegel der Expression der erfindungsgemäßen Partikel werden durch die RIA-Technik bestimmt, nachdem die Zellen die Konfluenz erreicht hatten.
Gewebekulturschalen (100 mm Durchmesser) werden mit 5 x 10&sup5; Zellen beimpft und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Vier Stunden vor der Transfektion wird das Kulturmedium durch frisches Medium ersetzt. Die zu transfizierende DNA wird in 1 ml einer Lösung suspendiert, die 250 mM CaCl&sub2;, 140 mM NaCl, 25 mM Hepes, pH 7,1, und 0,75 mM NaHPO&sub4; enthält. Dieser Calciumphosphat-DNA-Niederschlag wird zu den Zellen in der Kultur zugefügt. Nach der Inkubation über Nacht wird frisches Medium zur Zellkultur zugegeben und die Zellen weitere zwei Tage inkubiert.

F. Verfahren für die statische Zellkultur von Säugerzellen

Eine Ampulle von Zellen, die bei -196ºC in flüssigem Stickstoff gehalten wurde, wird rasch aufgetaut, indem die Ampulle 5 Minuten in ein Wasserbad von 37ºC gelegt wird. 1 ml der frisch-aufgetauten Zellsuspension wird durch langsame Zugabe von 10 ml des geeigneten Kulturmediums verdünnt. Danach werden die Zellen abzentrifugiert und in 10 ml Kulturmedium resuspendiert. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert, in 10 ml Kulturmedium resuspendiert, in einen T25-Kulturkolben überführt und in einem Inkubator bei 37ºC und 5 % CO&sub2; gezüchtet. Unter diesen Bedingungen liegt die Verdoppelungszeit für L-Zellen und CHO-Zellen im Bereich von 15 bis 20 Stunden und für Vero-Zellen im Bereich von 30 bis 40 Stunden. L-Zellen und CHO-Zellen können auch am Leben gehalten werden und weiter wachsen, wenn die Konfluenz über 100 % hinausgeht, wohingegen Vero-Zellen bei einer Konfluenz von 100 % passagiert werden.

G. Verfahren für die Züchtung von Säugerzellen in ACUSYST-P und Ernte von erfindungsgemäßen Partikeln

1. Züchtung und Herstellung des Impfmaterials

Zellen werden in T75- oder T150-Kolben gehalten, die DMEM-10 % FBS enthalten. Rollerflaschen (850 cm²) werden mit 10 bis 15 x 10&sup6; der aus den T-Kolben geernteten Zellen beimpft. Nach 3 bis 5 Tagen Wachstum werden aus sechs Rollerflaschen insgesamt etwa 10&sup9; Zellen geerntet und zur Beimpfung von sechs Hohlfaser-Kartuschen (HFCs) in einem ACUSYST-P, hergestellt von Endotronics Inc. of Minneapolis, Minnesota, USA, verwendet.

2. ACUSYST-P-Kultur und Ernte von erfindungsgemäßen Partikeln

Nach der Beimpfung werden die HFCs in das ACUSYST-P-Kultursystem eingebracht und die Durchflußgeschwindigkeit des Mediums durch die Kartuschen auf 50 ml/Stunde eingestellt und auf diesem Wert gehalten. Das Medium wird täglich auf pH-Wert, pO&sub2;-Wert, Glucose und Lactat getestet. Nach zwei bis drei Wochen Wachstum wird aus dem Extrakapillarraum jeder ACUSYST-P-Hohlfaserkartusche zweimal wöchentlich ein Flüssigkeitsvolumen von 600 ml geerntet. Die Produktion von erfindungsgemäßen Partikeln wird durch den Radioimmuntest (RIA) festgestellt. Da das Einfrieren die durch RIA nachweisbare Aktivität zerstört, werden die bei der Ernte erhaltenen Präparate vor der Reinigung bei 4ºC gelagert. Unter diesen Bedingungen läßt sich keine Protease-Aktivität nachweisen, dies wurde durch Azocollsubstrat-Proteolyse (SIGMA) bestimmt.

3. Verfahren der Qualitätskontrolle

a. Tests auf das Vorliegen von Bakterien und Pilzen

Ein Zellpool, der etwa 5 x 10&sup5; Zellen pro ml enthält und in dem Zellkulturmedium suspendiert ist, aus dem die Zellen geerntet wurden, wird auf das Vorliegen von Bakterien und Pilzen getestet. 1 ml der Zellen wird auf Platten mit Trypticase-Soja-Agar (BBL) ausgestrichen, ein weiterer ml wird in Thioglykolat-Medium (DIFCO) geimpft, um das Vorliegen von aeroben und anaeroben Bakterien zu testen. Eine Verunreinigung mit Pilzen wird durch Ausstreichen von 1 ml Zellen auf Sabouraud-Agarplatten (DIFCO) untersucht. Diese Test wurden regelmäßig durchgeführt, um sicherzustellen, daß das Wachstumsmedium steril ist und die Zellkulturen nicht mit Bakterien oder Pilzen verunreinigt sind.

b. Test auf das Vorliegen von Mycoplasma: Fluoreszenz-Färbung

Das Vorliegen von Mycoplasma-DNA im Cytoplasma der Zellen wird durch ein Färbeverfahren unter Verwendung des Fluorochroms Hoechst 33258 bestimmt. Dieser DNA-färbende Farbstoff fluoresziert unter UV-Licht und bildet die Grundlage für einen sehr schnellen und empfindlichen Test auf Mykoplasmen. Das Verfahren umfaßt Deckgläschen-Kulturen der zu testenden Zellen, die verwendet werden, wenn eine Konfluenz von 50 bis 70 % vorliegt. Nach der Fixierung und Färbung werden die Deckgläschen mittels eines Fluoreszenzmikroskops untersucht. Eine Fluoreszenz im Cytoplasma bedeutet ein Vorliegen von Mycoplasma.
Die Vorratslösung der Bisbenzamid-Fluorochromlösung Hoechst 33258 wird hergestellt, indem 5 mg in 100 ml PBS unter Verwendung eines Magnetrührers gelöst werden. Die Lösung wird mittels Filtration durch eine 0,22 µm-Membran sterilisiert, im Dunkeln bei 4ºC gelagert und vor Verwendung tausendfach mit PBS verdünnt. Das Medium der Deckgläschen-Kulturen, die eine Konfluenz von 50 bis 70 % aufweisen, wird von den Zellen abgesaugt, es folgt eine Fixierung mit zweimaligem Austausch von Ethanol:Essigsäure (3:1) bei 4ºC. Nach einer Waschung mit entionisiertem Wasser und 30-minütiger Inkubation bei 37ºC mit verdünntem Bisbenzamid- Fluorochrom (Hoechst 33258) werden die Deckgläschen mit entionisiertem Wasser gespült. Die Deckgläschen werden mit der Zell-Seite nach unten auf einen Objektträger gelegt, wobei eine Glycerin-Auflage verwendet wird (22,2 ml 2,1 % Citronensäure; 1 ml H&sub2;O; 27,8 ml 2,8 % Na&sub2;HPO&sub4;; 50 ml Glycerin, pH 5,5).

c. Tests auf das Vorliegen von Viren

1) Tests in Zellkulturen

Testzellen werden auf normale Morphologie während einer Inkubationszeit von mindestens 14 Tagen nach Beimpfung mit einer Suspension der zu testenden Zellinie untersucht. Außerdem werden an den Tagen 3 bis 5 und nochmals nach dem 12. Tag mindestens 4 % der beimpften Testkulturen gewaschen und auf Hämadsorption getestet, wobei rote Blutkörperchen von Schafen oder Menschen verwendet werden. Die Tests werden abgelesen, nachdem die Kulturen 30 Minuten bei 3 bis 4ºC inkubiert wurden, und nochmals, nachdem die Kulturen 30 Minuten bei 34 bis 37ºC inkubiert wurden. Die Ergebnisse der Tests auf Virus-infizierte Zellen, die Erythrocyten adsorbieren, zeigen, daß keine Verunreinigung mit Viren vorliegt.

2) Tests in Tieren

Die zu testenden Zellen werden in 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na&sub2;HPO&sub4;, pH 7,2, in einer Konzentration von 10&sup6; Zellen pro ml suspendiert und in verschiedene Gruppen von Tieren geimpft. In einer Gruppe werden mindestens 10 Tiere aus mindestens zwei Würfen von Mäusejungen geimpft. Jedes Tier wird mit 0,1 ml Zellen intraperitoneal und 0,01 ml intracerebral beimpft. Die Mäuse werden mindestens 14 Tage lang täglich beobachtet. Jede Maus, die nach den ersten 24 Stunden des Tests verendet oder die wegen Krankheit getötet wird, wird obduziert und auf Zeichen einer Virusinfektion untersucht. Eine solche Untersuchung umfaßt den zusätzlichen Test durch intracerebrale und intraperitoneale Wiederimpfung geeigneter Gewebesuspensionen in eine weitere Gruppe von mindestens fünf Mäusejungen und die anschließende tägliche Beobachtung, 14 Tage lang. Ferner wird mit einem Einzel-Pool des emulgierten Gewebes (minus Haut und Eingeweide) von allen Mäusen, die den ursprunglichen 24-tägigen Test überlebt haben, eine Blindpassage durchgeführt.
In einer anderen Gruppe werden 10 erwachsene Mäuse geimpft. Jedes Tier wird mit 0,5 ml Zellen intraperitoneal und mit 0,03 ml Zellen intracerebral geimpft. Die Tiere werden vier Wochen lang beobachtet und jedes Tier, das krank wird oder Unregelmäßigkeiten zeigt, wird untersucht, um die Ursache der Erkrankung festzustellen. Die Ergebnisse der Tests bei Tieren auf das Vorliegen von Virus-Verunreingungen zeigen, daß keine Verunreinigung mit Viren vorliegt.

d. Test auf Karzinogenität

Ein geeigneter Test auf Karzinogenität, wobei nackte Mäuse (nu/nu) verwendet werden, umfaßt die Impfung von 20 Tieren innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt mit 0,1 ml potentem Serum. Die Injektion wird entweder intramuskulär oder subkutan verabreicht und 2, 7 und 14 Tage nach der Geburt wiederholt. Normalerweise erzeugen eine Million Referenz-Tumorzellen progressiv wachsende Tumoren und Metastasen. Eine Million lebensfähige Zellen der betreffenden Zellinie werden subkutan an einer Stelle geimpft, an der die sich entwickelnden Tumoren tastbar sind (die Extremitäten sind hierfür geeignet). Die Tiere werden 21 Tage beobachtet, ob sich an der Injektionsstelle Knoten bilden, in bestimmten Abständen werden Messungen durchgeführt, wobei festgestellt wird, ob ein progressives Wachstum stattgefunden hat. Am Ende des 21-tägigen Beobachtungszeitraums werden alle Tiere getötet und untersucht, ob an der Injektionsstelle und in anderen Organen, wie z.B. den Lymphknoten, Lungen, Nieren und Leber, ein deutlicher Tumor entstanden ist. Alle tumorähnlichen Läsionen und alle Impfstellen werden histopathologisch untersucht. Außerdem werden die Lungen und die regionalen Lymphknoten aller Tiere histologisch untersucht, da einige Zellinien möglicherweise Metastasen bilden, ohne ein örtliches Tumorwachstum zu zeigen.
Für diesen Test wird ein progressiv wachsender Tumor als ein tastbarer Knoten definiert, der in dem 21-tägigen Beobachtungszeitraum an Größe zunimmt und der bei der histologischen Untersuchung lebensfähige und mitotisch aktive eingeimpfte Zellen zeigt. Das Vorliegen von Zellen, die unter dem Mikroskop lebensfähig sind, die aber aus einem stationären oder zurückgehenden Knoten stammen, wird nicht als progressiv wachsender Tumor beurteilt.

H. Reinigung der erfindungsgemäßen Partikel

1. Fraktionierte Fällung mit Polyethylenglykol (PEG)

Medium aus dem Extrakapillarraum des ACUSYST-P-Systems wird geerntet und zu Volumina von 3000 ml vereinigt. Jedes Volumen wird mit 180 g PEG 8000 (SIGMA) versetzt, das durch 20-minütiges Rühren bei Raumtemperatur gelöst wird, sodann wird weitere drei Stunden bei 4ºC gerührt. Der Niederschlag wird in 500 ml-Flaschen in einem GS 3-Rotor bei 4500 UpM (3000 x g) 30 Minuten bei 10ºC abzentrifugiert. Der Überstand wird gesammelt und nochmals mit 180 g PEG 8000 versetzt, das wie vorstehend beschrieben bei Raumtemperatur gelöst wird. Die Lösung wird weitere drei Stunden bei 4ºC gerührt. Der Niederschlag aus dieser Lösung wird wie vorstehend beschrieben gesammelt, mit der Ausnahme, daß die zentrifugation 60 Minuten bei 9000 UpM (15 000 x g) durchgeführt wird. Das Sediment wird in 20 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert.

2. Gelfiltrations-Chromatographie

Das nach der PEG-Fällung erhaltene und in PBS wiedergelöste Material wird einer Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung von BioRad A-5m-Harz bei 4ºC unterworfen. Die Säule hat eine Größe von 25 x 1000 mm, das Bettvolumen beträgt 480 ml. In einem typischen Fraktionierungslauf werden 1000 µg der PEG-gefällten Partikel der vorliegenden Erfindung in einem Volumen von 10 bis 15 ml aufgetragen und mit PBS oder TNE bei einer Geschwindigkeit von 6 Tropfen pro Minute (18 ml/Stunde) in Fraktionen von 3 ml eluiert. Figur 6 zeigt das Elutionsprofil von Material, das mittels RIA getestet werden kann, eluiert aus einer A-5m- Säule. Die durchgezogene Linie zeigt die Absorption bei 280 nm von jeder Fraktion, die Punkte zeigen die aus den RIA-Ergebnissen berechnete Materialmenge.

3. Isopyknische Zentrifugation in CsCl

Etwa 30 Fraktionen, die den aus der Gelfiltrations-Säulenchromatographie resultierenden ersten Peak abdecken und partiell gereinigte Partikel der vorliegenden Erfindung enthalten, werden vereinigt (etwa 100 ml). Diese Lösung wird mit CsCl auf eine Dichte von 1,30 g/ml eingestellt und anschließend in Nitrocellulose-Röhrchen überführt, die in einen SW 27/28-Rotor (Beckman) passen. Die Gradienten werden hergestellt, indem 4 ml einer CsCl-Lösung von 1,35 g/ml darunter geschichtet werden und 4 ml mit einer Dichte von 1,25 g/ml und 4 ml mit einer Dichte von 1,20 g/ml darüber geschichtet werden. Die Gradienten werden 50 Stunden bei 28 000 UpM bei 10ºC laufengelassen, fraktioniert und die gereinigten Partikel in der Schicht mit einer Dichte von 1,20 g/ml oben auf dem Gradienten (Figur 7) gesammelt. Die gereinigten Partikel sind von der kleinen Menge des verunreinigenden Proteins gut abgetrennt, das in der Mitte des Gradienten als Bande erscheint. Die Lösung wurde durch Dialyse entsalzt, wobei die Dialyse zuerst gegen Wasser und anschließend gegen Kolchsalzlösung mit dreimaligem Austausch in einem Zeitraum von 24 Stunden durchgeführt wurde.
Für eine weitere Qualitätskontrolle wird ein Teil dieses Gradienten-gereinigten Materials einer linearen CsCl-Gradienten-Zentrifugation unterworfen. Ein einzelner Peak von gereinigten Partikeln erscheint wie erwartet bei 1,2 g/ml.

1. Herstellung des Adjuvans der erfindungsgemäßen gereinigten Partikel und Test der Stabilität

Um ein Adjuvans des erfindungsgemäßen Impfstoffs herzustellen, werden 1/10 000 Volumen Thimerosol und 1/10 Volumen Filter-sterilisierte 0,2 M AlK(SO&sub4;)&sub2; : 12 H&sub2;O zu der gewünschten Konzentration von Antigen in steriler Kochsalzlösung zugegeben. Der pH-Wert wird mit steriler 1 N NaOH auf 5,0 eingestellt und die Lösung drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Alaun-gefällte Antigen wird 10 Minuten bei 2000 UpM abzentrifugiert, in steriler normaler Kochsalzlösung, enthaltend 1:10 000 Thimerosol, resuspendiert und unter sterilen Bedingungen in Aliquots aufgeteilt.
Um die Stabilität der Alaun-absorbierten erfindungsgemäßen Partikel zu bestimmen, wurde das Antigen gewonnen, indem das Alaun in 3 % Natriumcitrat wieder gelöst wurde und anschließend aufeinanderfolgende Dialysen gegen 3 % Natriumcitrat und PBS durchgeführt wurden. Die Menge der erfindungsgemäßen Partikel wird sodann durch parallele Radioimmuntests gegen Verdünnungen eines gereinigten HBsAg-Standards in PBS-50 % Serum eines neugeborenen Kalbs bestimmt. Tabelle 1 Parameter des Stabilitätstests

Beispiel 1

Expression von Partikeln die Polypeptide des PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereichs umfassen

A. Herstellung des rekombinanten Plasmids pMMT-neo

Das Plasmid pBPV342-12 wurde mit der Restriktionsendonuclease BamHI gespalten (vgl. Figur 1 und Material und Methoden). Es entstanden zwei DNA-Moleküle: ein Molekül (7,95 kb) umfaßt das gesamte Genom des Rinder- Papillomavirus (BPV) das andere Molekül (6,65 kb) enthält einen Teil des bakteriellen Plasmids pML2 (pBR322, deletiert um die "Giftsequenz" ("poison sequence")), den Maus-Metallothionein-Promotor (pMMT), das Neomycinresistenz-Gen (neo) und SV40 PAS-t (vgl. Figur 1). Wenn dieses Fragment mit sich selbst ligiert (zirkularisiert) wird, erhält man Plasmid pMMT-neo (vgl. auch Figur 5) (ATCC Nr. 67074).
Die Umsetzung wurde in einem Gesamtvolumen von 400 µl Reaktionspuffer (vgl. Material und Methoden) mit einer Endkonzentration von 0,2 µg/µl pBPV342-12-DNA und 80 Einheiten BamHI 4 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Um festzustellen, ob die Spaltung vollständig abgelaufen ist, wurde eine Agarosegel-Elektrophorese in einem 0,7 % Agarosegel durchgeführt (vgl. Material und Methoden). Die Umsetzung wurde durch Zusatz von 40 µl 8 M LiCl beendet, die DNA wurde mit 1 ml Ethanol 30 Minuten bei -80ºC gefällt. Die gefällte DNA wurde in 100 µl 10 mM Tris, pH 7, 8, resuspendiert.

B. Isolierung eines Fragments, das den gesamten PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Proteincodierenden Bereich und dazu noch den natürlichen Promotor für die Transkription enthält

Die Herstellung und Clonierung des HBV-Genoms, Subtyp adw, wird von Cummings, I. W., et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 1842, beschrieben. Das zirkuläre HBV-Genom wurde an der einzigen EcoRI-Stelle linearisiert, sodann die Clonierung im Bakteriophagen Lambda ptWES und die Subclonierung in einem bakteriellen Plasmid durchgeführt, wodurch Plasmid pAO1 erhalten wurde (vgl. Figur 2). Da die EcoRI-Restriktionsstelle innerhalb des PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereichs liegt, ist dieser Bereich in der EcoRI-linearen Form unterbrochen. Um einen intakten PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich wiederherzustellen, wurde die 3,2 kb-große EcoRI-Insertion von pAO1 isoliert und von der Plasmid-DNA abgetrennt, indem 100 µg pAO1 in einem Gesamtvolumen von 400 µl Reaktionspuffer (vgl. Material und Methoden), enthaltend 200 Einheiten EcoRI, vier Stunden bei 37ºC gespalten wurden. Die 3,2 kb- große DNA-Insertion wurde durch präparative 0,7 % Agarosegel-Elektrophorese von der Plasmid-DNA abgetrennt (vgl. Material und Methoden). Die DNA wurde aus dem Agarosegel auf DE 81 Whatman-Ionenaustausch-Filter elektroeluiert, aus welchem die DNA sodann durch eine hochkonzentrierte salzlösung entfernt wurde. Die DNA wurde durch eine Phenol/Chloroform- Extraktion und zwei Ethanol-Fällungen gereinigt. Das gereinigte lineare 3,2 kb-große EcoRI-Fragment, das das gesamte HBV-Genom codiert, wurde sodann einer Selbstligierung bei hoher DNA-Konzentration unterworfen, um die Erzeugung von Concatameren zu begünstigen: 30 µg EcoRI-Fragment-DNA wurden in einem Gesamtvolumen von 50 µl Reaktionspuffer, der 1,8 Einheiten T4-DNA-Ligase und 2 mM ATP enthielt, eine Stunde bei 15ºC und über Nacht bei 4ºC ligiert; danach wurde die DNA durch zwei Phenol/Chloroform-Extraktionen, eine Chloroform-Extraktion und anschließend zwei Ethanol-Fällungen gereinigt. Die gefällte DNA wurde in 20 µl 10 mM Tris, pH 7,8, resuspendiert und mit dem Restriktionsenzym BglII in einem Gesamtvolumen von 50 µl Reaktionspuffer (vgl. Material und Methoden), der 50 Einheiten BglII enthielt, 4 Stunden bei 37ºC gespalten.
Die durch diese Umsetzung erzeugten DNA-Fragmente wurden durch 1,5 % Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt. Das 2,78 kb-große BglII-Fragment, das den intakten PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich und sein natürliches Promotorsystem, das für die Expression der Oberflächenantigen-Polypeptide erforderlich ist, enthielt, wurde aus dem Agarosegel isoliert und gereinigt, wie vorstehend beschrieben (vgl. Figur 2).

C. Insertion des Fragments, das den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich enthält, in das pMMT-neo-Plasmid: Konstruktion von pDM1

Von einer DNA-Lösung, die wie im vorstehenden Abschnitt A beschrieben hergestellt wurde, wurde 1 µl abgenommen und mit 5 µl des 2,78 kb- großen BglII-Fragments (0,25 µg/µl), das im vorstehenden Abschnitt B beschrieben wird, gemischt.
Das Gemisch wurde in einem Gesamtvolumen von 10 µl Reaktionspuffer, enthaltend 0,9 Einheiten T4-DNA-Ligase, eine Stunde bei 15ºC und über Nacht bei 4ºC einer Ligierungsreaktion unterworfen.
Bakterienzellen, vorzugsweise HBLOL, wurden für die Aufnahme von DNA in einer Transformationsreaktion gemäß dem Verfahren kompetent gemacht, das in Material und Methoden beschrieben wird. Das Ligierungsgemisch wurde in einem Gesamtvolumen von 70 µl auf 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, gebracht und zu 200 µl Suspension der für die DNA-Aufnahme kompetenten Bakterienzellen zugefügt.
Das Gemisch wurde 30 Minuten auf Eis inkubiert, anschließend mit 1 ml L-Brühe versetzt und 2 Minuten bei 42ºC und 40 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen auf LB-Agarplatten, die 50 µg Ampicillin pro ml enthielten, ausgestrichen, wobei Volumina von 50 bis 300 µl der Zellsuspension pro Platte eingesetzt wurden. Die Agarplatten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit wurden einzelne isolierte Bakterienkolonien auf das Vorliegen des bakteriellen Plasmids pMMT-neo, das die gewünschte 2,78 kb-große BglII- DNA-Fragment-Insertion enthielt (vgl. Fig. 3), abgesucht.
Das Absuchen wurde vorzugsweise mittels Koloniehybridisierungs-Verfahren durchgeführt. Für dieses Verfahren wurden Einzelkolonien mit einem Zahnstocher aufgenommen und auf eine LB-Ampicillin-enthaltende Agarplatte netzförmig übertragen, so daß die Clone identifiziert werden konnten. Die Platte wurde über Nacht bei 37ºC inkubiert.
Die Kolonien wurden auf einen Nitrocellulose-Filter übertragen, indem der Filter so lange auf die Agaroberfläche aufgelegt wurde, bis er naß war. Der Filter wurde rasch abgezogen und nacheinander auf drei Schichten Whatman 3M-Papier gelegt, von denen jedes entweder in 0,5 M NaOH oder 1 M Tris, pH 7,0; 1,5 M NaCl/0,5 M Tris, pH 7,4, oder 2 x SSC getränkt war. Die Filter wurden während der Lyse der Zellen und der folgenden Neutralisations- und Fixierungsverfahren mit der Kolonienseite nach oben auf das getränkte Papier gelegt.
Nachdem die Filter an der Luft getrocknet waren, wurden sie bei 60ºC im Vakuum erhitzt. Danach wurden die Nitrocellulose-Filter einer DNA-Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten DNA-Sonde unterworfen, die aus dem 2,78 kb-großen BglII-Fragment, das den PreS&sub1;- PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich enthielt, erhalten und, wie im vorstehenden Abschnitt B beschrieben, durch Nick-Translation hergestellt wurde (vgl. Material und Methoden).
Der Nitrocellulose-Filter wurde in einem Prähybridisierungsgemisch inkubiert, das 50 % Formamid, 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,6; 1 x Denhardt-Lösung; 100 µg/ml denaturierte Lachssperma-DNA und 1 x 10&sup7; cpm ³²P-markierte DNA enthielt, die in 0,2 N NaOH 10 Minuten bei 68ºC geschmolzen wurde.
Der Filter wurde in diesem Gemisch 16 Stunden bei 45ºC inkubiert. Danach wurde der Filter zweimal in 2 x SSC, 0,1 % SDS, jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur und zweimal in 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, jeweils 15 Minuten bei 50ºC gewaschen. Die Filter wurden auf einem Röntgenfilm (vorzugsweise 3M) zwischen zwei Schirmen zwei Tage bei -80ºC exponiert.
Kolonien, die das rekombinante Plasmid enthielten, welches das clonierte 2,78 kb-große BglII-Fragment trug, erschienen als schwarze Punkte. Vier von 50 Kolonien wurden identifiziert, die Plasmid-DNA dieser Kolonien wurde in Minipräparaten gemäß Birnboim und Doly, Nucl. Acids Res. 7 (1979), 1513, isoliert und mittels Restriktionsendonuclease-Spaltung durch eine Doppelspaltung mit BglII und XbaI analysiert. Die Analysen bestätigten die gewünschte Konstruktion, die vorstehend erklärt wird (vgl. Figur 3).

D. Substitution des natürlichen Promotors für die PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereiche durch den Metallothionein-Promotor: Konstruktion von pDM2

Das vorstehend beschriebene Plasmid pdml wurde einer vollständigen Spaltung mit den Restriktionsenzymen BglII und BamHI in einem Gesamtvolumen von 100 µl unterworfen, enthaltend 20 µg Plasmid-DNA, wobei die Spaltung zuerst mit 50 Einheiten BglII in Reaktionspuffer, der 6,7 mM Tris, pH 7,8; 6,7 mM MgCl&sub2;; 6,7 mM β-Mercaptoethanol enthielt, 4 Stunden bei 37ºC durchgeführt wurde; anschließend wurde die Salzkonzentration auf 150 mM NaCl erhöht und die Spaltung unter Zusatz von 40 Einheiten BamHI über Nacht bei 37ºC vollständig durchgeführt. Drei Fragmente wurden erzeugt, wobei das große Fragment 5,1 kb, das mittlere Fragment 2,97 kb und das kleine Fragment 1,4 kb aufwies. Diese Fragmente wurden durch präparative 0,7 % Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt, hieraus wurden die (5,1 kb- und 1,4 kb-großen) Fragmente elektrophoretisch unter Verwendung von DE 81 Whatman-Ionenaustausch-Filter isoliert.
Die DNA wurde aus diesem Filter durch Inkubation in einer hohen Salzkonzentration, 4 Stunden bei 4ºC, entfernt und durch eine Phenol/Chloroform-Extraktion und zwei Ethanol-Fällungen gereinigt. Die DNA wurde in 20 µl 10 mM Tris, pH 7,8, resuspendiert. 1 µl wurde durch Agarosegel-Elektrophorese untersucht, wobei die Reinheit geprüft und die Menge abgeschätzt wurde.
Das große (5,1 kb) Fragment, das den Metallothionein-Promotor am BglII-Ende enthielt, wurde mit dem kleinen (1,4 kb) Fragment ligiert, das den PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich, nicht jedoch den natürlichen Promotor oder den PreS&sub1;-Teil dieses Gens enthielt. Das große Fragment umfaßte außerdem das natürliche Terminations-Polyadenylierungs- Signal (hb-PAS-t), das für die Expression des Hepatitis-B-PreS&sub2;-S-protein-codierenden Bereichs erforderlich ist (vgl. auch Figur 4).
Da das große Fragment außerdem das bakterielle Plasmid enthält, ist es möglich, daß es durch Selbstligierung dieses Fragments zur Selbstvermehrung kommt, ohne daß das kleine BamHI-Fragment eingebaut wird. Deshalb wurden 10 µl des gesamten 20-µl-Präparats des großen Fragments einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase unterworfen, indem 28 Einheiten dieses Enzyms zugefügt und 20 Minuten bei 37ºC inkubiert wurden. Die Umsetzung wurde durch Zusatz von 1 µl SO mM EGTA und zehnminütige Inkubation bei 68ºC abgestoppt. Die DNA wurde durch zwei Ethanolfällungen in 0,8 M LiCl gereinigt.
Die gefällte DNA wurde in 10 µl 10 mM Tris, pH 7,8, resuspendiert, von der 5 µl als Kontrolle abgenommen und auf Selbstligierung untersucht wurden, weitere 5 µl wurden mit 5 µl des elektroeluierten kleinen (1,4 kb) BamHI-Fragments gemischt. Die Ligierung jeder Probe wurde in einem Gesamtvolumen von 20 µl durchgeführt, wie vorstehend beschrieben. Die Transformation auf HB101-Bakterienzellen wurde durchgeführt, wie vorstehend beschrieben.
Zwölf Einzelkolonien wurden herausgegriffen und in 2 ml-Kulturen gezüchtet, die Plasmid-DNA wurde gemäß Birnboim und Doly, a.a.O., isoliert. Die Plasmid-DNA wurde auf Insertion und Orientierung des kleinen BamHI-Fragments untersucht, indem eine Doppelspaltung mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XbaI durchgeführt wurde.
Zwei von den zwölf Plasmid-DNAS enthielten das in der gleichen Orientierung wie der Metallothionein-Promotor eingebaute kleine (1,4 kb) BamHI-Fragment.
Diese Plasmid-DNAs werden in Massenkultur gezüchtet und für die Einführung in eukaryotische Zellen mittels Co-Transfektion zubereitet.
In einer anderen Ausführungsform wird das EcoRI/BglII (1,9 kb) Fragment aus Plasmid pMMT-neo, das den Metallothionein-Promotor enthält, als Ersatz für das kurze (32 bp) EcoRI-BamHI-Fragment vor dem PreS&sub2;-S- Protein-codierenden Bereich in pdml verwendet, wodurch Plasmid pDM3 erhalten wird, wie in Figur 5 dargestellt.

E. Einführung der rekombinanten DNA-Vektoren, die in den vorstehenden Abschnitten C und D erhalten wurden, in Säugerzellen und Aufstellung von Zellinien. die die erfindungsgemäßen Partikel produzieren

Die rekombinanten Plasmide pDM1 und pDM2 wurden in Maus-L-Zellen, Vero-Zellen (African Green Monkey), CHO-Zellen und 3T3-Maus-Fibroblasten durch Standard-Transfektionsverfahren co-transfiziert (Graham und van der Eb, Virology 52 (1973), 456, a.a.O.) (vgl. Material und Methoden). Zellen, welche die Plasmid-DNA aufnehmen und behalten, sind gegenüber dem Arzneistoff G418 resistent und überleben in Selektivmedium, das diesen Arzneistoff enthält. Zellen, welche die DNA nicht aufnehmen, können in diesem Selektivmedium nicht überleben. Diese Zellen können als Einzeldone auf der Oberfläche einer Kulturplatte nachgewiesen werden. Die Zellen wurden mit einem Clonierungszylinder abgenommen und zur Zubereitung für die Massenkultur nach herkömmlichen Verfahren in einem gebräuchlichen Nährmedium, z.B. Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, angereichert mit 10 % Kälberserum und 500 µg G418 pro ml vermehrt (vgl. Material und Methoden). Fünf dieser Clone wurden als Zellinien angelegt und mit ENDO-I, -II, -III, -IV und -V bezeichnet, gefrorene Vorräte wurden angelegt (vgl. Material und Methoden). Die Produktionsrate dieser Zellinien in statischer Kultur wurde durch Radioimmuntest (RIA; vgl. Material und Methoden) bestimmt und mit der Produktionsrate bekannter Zellinien verglichen. Im Durchschnitt produzierten die erfindungsgemäßen Zellinien 500 bis 1000 ng des erfindungsgemäßen Partikels pro ml Kulturmedium pro Tag.

F. ACUSYST-P-Kultur von Zellinien, die die erfindungsgemäßen Partikel produzieren

Etwa 10&sup9; Gesamtzellen, gezüchtet in DMEM + 10 % FBS in sechs Rollerflaschen (vgl. Material und Methoden), wurden zur Beimpfung von sechs Hohlfaserkartuschen im ACUSYST-P-Kultursystem verwendet (vgl. Material und Methoden). Etwa 600 ml Flüssigvolumen wurde zweimal wöchentlich aus dem Extrakapillarraum jeder ACUSYST-P-Hohlfaserkartusche geerntet und vor der Reinigung bei 4ºC gelagert. Die Konzentration der erfindungsgemäßen Partikel wurde durch RIA getestet (vgl. Material und Methoden).

G. Reinigung der erfindungsgemäßen Partikel aus ACUSYST-P-Kulturmedium

Partikel, die Proteine enthalten, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, die durch die neuen Zellinien hergestellt wurden, wurden durch Fällung mit Polyethylenglykol (PEG), Gelfiltration und isopyknische Ultrazentrifugation in CsCl-Gradienten gereinigt (vgl. nachstehend).

1. Fraktionierte Fällung mit Polyethylenglykol (PEG)

Medium aus dem Extrakapillarraum wurde aus dem ACUSYST-P-Kultur- System geerntet und zu Volumina von 3000 ml vereinigt. Jedes Volumen wurde mit 180 g PEG 8000 (SIGMA) versetzt, das durch 20-minütiges Rühren bei Raumtemperatur gelöst wurde, das Ganze wurde weitere 3 Stunden bei 4ºC gerührt. Der Niederschlag wurde in 500-ml-Flaschen in einem GS 3-Rotor 30 Minuten bei 4500 UpM (3000 x g) bei 10ºC abzentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und nochmals mit 180 g PEG 8000 versetzt, das bei Raumtemperatur gelöst wurde, wie vorstehend beschrieben. Die Lösung wurde weitere 3 Stunden bei 4ºC gerührt. Der Niederschlag aus dieser Lösung wurde abzentrifugiert, wie vorstehend beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Zentrifugation 60 Minuten bei 9000 UpM (15 000 x g) durchgeführt wurde. Das Sediment wurde in 20 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert.

2. Gelfiltrations-Chromatographie

Das nach der PEG-Fällung erhaltene und in PBS gelöste Material wurde einer Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung von A-5m- Harz von Biorad bei 4ºC unterworfen. Die Abmessungen der Säule waren 25 x 1000 mm, das Bettvolumen betrug 480 ml. In einem typischen Fraktionierungslauf werden 1000 µg der PEG-gefällten Partikel der vorliegenden Erfindung in einem Volumen von 10 bis 15 ml aufgetragen und mit PBS oder TNE bei einer Geschwindigkeit von 6 Tropfen pro Minute (18 ml/Stunde) in Fraktionen von 3 ml eluiert. Figur 6 zeigt das Profil der aus einer A- 5m-Säule eluierten erfindungsgemäßen Partikel. Die durchgezogene Linie gibt die Absorption bei 280 nm jeder Fraktion wieder, die Punkte zeigen die Menge der erfindungsgemäßen Partikel in jeder Fraktion, die durch RIA berechnet wurde. 3. Isopyknische Zentrifugation in CsCl Etwa 30 Fraktionen, die den aus der Gelfiltrations-Säulenchromatographie resultierenden ersten Peak abdecken (vgl. Figur 6) und partiell gereinigte Partikel der vorliegenden Erfindung enthalten, wurden vereinigt (etwa 100 ml). Diese Lösung wurde mit CsCl auf eine Dichte von 1,30 g/ml eingestellt und anschließend in Nitrocellulose- Röhrchen überführt, die in einen SW 27- oder SW 28-Rotor (Beckman) passen. Die Gradienten wurden hergestellt, indem 4 ml einer CsCl-Lösung von 1,35 g/ml darunter geschichtet und 4 ml mit einer Dichte von 1,25 g/ml und 4 ml mit einer Dichte von 1,20 g/ml darüber geschichtet wurden, Die Gradienten wurden 50 Stunden bei 28 000 UpM bei 10ºC laufengelassen, fraktioniert und das gereinigte Antigen in der Schicht mit einer Dichte von 1,20 g/ml oben auf dem Gradienten gesammelt. Die erfindungsgemäßen Partikel wurden von der kleinen Menge des verunreinigenden Proteins gut abgetrennt, das in der Mitte des Gradienten als Bande erscheint (vgl. Figur 7). Die Lösung wurde durch Dialyse gegen Kochsalzlösung mit dreimaligem Austausch in einem Zeitraum von 24 Stunden entsalzt.
Für eine Qualitätskontrolle wurde ein Teil dieses Gradienten-gereinigten Materials einer linearen CsCl-Gradienten-Zentrifugation unterworfen. Ein einzelner Peak der gereinigten Partikel erschien wie erwartet bei 1,2 g/ml.

H. Charakterisierung der durch Zellinien produzierten Partikel der vorliegenden Erfindung

Die Reinheit und physikalische Identität der Polypeptide der erfindungsgemäßen Partikel in Präparaten wird durch herkömmliche Labortechniken festgestellt, wie z.B. Radioimmuntest, Immunfällung und SDS-PAGE (vgl. Material und Methoden).

1. Bestimmung der Reinheit

a. Bestimmung der Spiegel von verunreinigenden Plasmaproteinen

Die Spiegel von verschiedenen Serumproteinen in Präparaten der gereinigten Partikel der vorliegenden Erfindung werden durch Standard- RIA-Techniken bestimmt, wobei spezifische Antikörper gegen Rinderserumalbumin, IgA, IgG, IgM usw. verwendet werden. Die in Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß keine Verunreinigung mit Immunglobulinen nachweisbar war und nur eine sehr geringe Verunreinigung mit Albumin vorlag. Tabelle 2 Bestimmung von verunreinigenden Plasmaproteinen durch RIA

b. Bestimmung der Spiegel von verunreinigenden Wirtszell- oder PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Nucleinsäureseguenzen in gereinigten Präparaten der erfindungsgemäßen Partikel durch das Dot-Blot- Verfahren

Eine Dot-Blot-Hybridisierung wird mit gereinigten Partikeln der vorliegenden Erfindung durchgeführt, um diese auf verunreinigende PreS&sub1;- PreS&sub2;-S-DNA-Sequenzen oder chromosomale DNA-Sequenzen des Wirts zu untersuchen. Für jeden Spot wurde eine Menge von 100 ng der erfindungsgemäßen gereinigten Partikel in 40 µl 0,25 N NaOH 10 Minuten bei 68ºC erhitzt. Als positive Kontrolle wurden 20 pg rekombinante Plasmid-pDM1-DNA der vorliegenden Erfindung in 40 µl 0,25 N NaOH in gleicher Art und Weise behandelt. Unmittelbar nach der Denaturierung in NaOH wird die Lösung auf einen Nitrocellulose-Filter getüpfelt. Die folgende Behandlung des Filters und die Hybridisierungsverfahren entsprechen dem Verfahren, das für die Southern Blot-Methode beschrieben wird, mit der Ausnahme, daß die ³²P-markierte Sonde ein 50:50-Gemisch aus chromosomaler DNA und Plasmid-DNA der vorliegenden Erfindung, enthaltend den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S- Protein-codierenden Bereich, ist. Wie erwartet, ergibt die hybridisierende Sonde mit der erfindungsgemäßen rekombinanten Plasmid-DNA ein starkes Signal, mit dem Präparat der gereinigten Partikel jedoch nur ein schwaches Hintergrund-Signal. Dieses Hybridisierungsmuster zeigt, daß in der Probe keine PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-DNA oder chromosomale DNA vorlag.

2. Immunfällung und SDS-Polvacrylamidgel-Analyse

Um das Muster von PreS&sub1;-Pres&sub2;-S-Polypeptiden, die durch erfindungsgemäße Transfektanten hergestellt werden, zu bestimmen, werden die durch solche Transfektanten hergestellten Proteine biosynthetisch markiert, immungefällt und auf SDS-PAGE-Gelen analysiert (vgl. Material und Methoden). Das Elektrophorese-Muster von Proteinen, die aus dem Kulturmedium isoliert wurden, indem eine Immunfällung mit Antikörpern gegen das natürliche HBV durchgeführt wurde, wurde durch das Silberfärbeverfahren sichtbar gemacht. Zwei Haupt-Proteine entsprechen in der Größe nichtglykosylierten und glykosylierten Polypeptiden, die durch den S-Proteincodierenden Bereich codiert werden (24 kd bzw. 27 kd). Zwei Neben-Proteine mit 33 kd und 36 kd entsprechen in der Größe den zwei Polypeptiden, die durch den PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden. Dieses Verfahren ist nicht empfindlich genug, um die kleinen Mengen der Polypeptide nachweisen zu können, welche die PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Polypeptide enthalten, jedoch wurde das Vorliegen der Proteine, die durch den gesamten PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, durch das Western-Immunblot-Verfahren nachgewiesen (vgl nachstehend). Die schwachen Banden oben auf dem Gel stammen von aggregiertem Protein und sind auch bei natürlichen HBV-Partikeln sichtbar. Somit sezernieren Zellen, die mit dem PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich transfiziert sind, Proteine, die nicht nur mit den Antikörpern gegen das natürliche Produkt reagieren, sondern die auch in der Größe identisch sind. Das Vorliegen von Proteinen, die die gleiche Größe wie die natürlich vorkommenden glykosylierten PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-, PreS&sub2;-S- und S-Polypeptide aus dem Hepatitis-B-Virus aufweisen, legt nahe, daß die Glykosylierungswege in diesen Zellen normal funktionieren.

3. Immunblot (Western-)

Zur Feststellung, ob jede Polypeptid-Spezies, die im Silber-gefärbten SDS-PAGE-Gelsystem zu sehen ist, mit dem spezfischen Anti-HBV-Antikörper reagiert, wurde das Western-Immunblot-Verfahren eingesetzt. Die mittels SDS-PAGE aufgetrennten Proteine werden durch Elektroblotting (Biorad) 3 Stunden bei 4ºC, 100 V, auf einen Nitrocellulose-Filter (Schleicher & Schuell) übertragen. Nach der Übertragung wird der Filter mit Proteinen gesättigt, um eine unspezifische Bindung von Peroxidasemarkierten Antikörpern zu verhindern. Hierfür wird der Filter eine Stunde bei Raumtemperatur in 20 % Serum neugeborener Kälber in PBS inkubiert, sodann werden die Polypeptide der erfindungsgemäßen Partikel durch Peroxidase-konjugierte HBV-spezifische Antikörper sichtbar gemacht. Der Filter wird auf Parafilm gelegt und mit einer Lösung der konjugierten Antikörper bedeckt und 3 Stunden bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer gehalten. Der Filter wird sechsmal mit 0,5 % Tween in 10 mM Tris und 5 mM CaCl gewaschen und anschließend mit dem Chromogen POD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid) in Wasserstoffperoxid (0,3 g/l) in Citrat-Phosphat-Puffer bedeckt. Zum Abstoppen wird eine 0,5 N Schwefelsäure-Lösung verwendet. Alle Proteinbanden, die den sechs Virus-Polypeptiden entsprechen, erscheinen, d.h. alle Proteine, die durch den PreS&sub1;- PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, liegen vor.

4. Aminosäurezusammensetzung der gereinigten Proteine, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, umfassend die erfindungsgemäßen Partikel

Nach der Säurehydrolyse wird die Aminosäurezusammensetzung der gereinigten Proteine, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich codiert werden, bestimmt und mit der Polypeptidzusammensetzung verglichen, die aus der Nucleotidsequenz des S-Protein-codierenden Bereichs, des PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereichs und des PreS&sub1;-PreS&sub2;-S- Protein-codierenden Bereichs berechnet wurde. Die in Tabelle 3 dargestellten Ergebnisse stimmen gut mit den aus der DNA-Sequenz vorausgesagten Werten und auch mit den veröffentlichten Ergebnissen (Shiraishi et al., J. Gen. Virol. 48 (1980), 31) überein. Insbesondere ist der relativ hohe prozentuale Anteil an Serin, Prolin und Leucin für diese Polypeptide charakteristisch. Tabelle 3 Aminosäurezusammensetzung von gereinigten Partikeln der vorliegenden Erfindung Prozentualer Anteil der Reste
* Tryptophan geht im Säurehydrolyse-Verfahren verloren.

I. Elektronenmikroskopie der gereinigten Hepatitis-B-Partikel der vorliegenden Erfindung

Im Elektronenmikroskop wurden die gereinigten Partikel der vorliegenden Erfindung als sphärische 22 nm große Partikel sichtbar gemacht, die den Partikeln ähnlich sind, die typischerweise beim Zusammenbau der Hepatitis-B-S-Protein-Polypeptide gebildet werden.

J. Herstellung des Adjuvans der erfindungsgemäßigen gereinigten Partikel und Stabilitätstest

Zur Herstellung eines Adjuvans des erfindungsgemäßen Impfstoffs werden 1/10 000 Volumen Thimerosol und 1/10 Volumen durch Filtration sterilisierte 0,2 M AlK(SO&sub4;)&sub2; : 12 H&sub2;O zu der gewünschten Antigenkonzentration in steriler Kochsalzlösung zugegeben. Der pH-Wert wird mit steriler 1 N NaOH auf 5,0 eingestellt und die Suspension drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Alaun-gefällte Antigen wird 10 Minuten bei 2000 UpM abzentrifugiert, in steriler normaler Kochsalzlösung, enthaltend 1:10 000 Thimerosol, resuspendiert und unter sterilen Bedingungen in Aliquots aufgeteilt.
Um die Stabilität der Alaun-absorbierten erfindungsgemäßen Partikel zu bestimmen, wurde das Antigen gewonnen, indem das Alaun in 3 % Natriumcitrat wieder gelöst wurde und anschließend aufeinanderfolgende Dialysen gegen 3 % Natriumcitrat und PBS durchgeführt wurden. Die Menge der erfindungsgemäßen Partikel wurde sodann durch parallele Radioimmuntests im Vergleich zu Verdünnungen eines gereinigten Standards in PBS-50 % Serum vom neugeborenen Kalb bestimmt. Die Ergebnisse des Stabilitätstests (Tabelle 4) zeigen, daß die gereinigten Partikel (entweder in der Hauptmenge oder im Alaun-absorbierten Präparat) bei 2 bis 8ºC mindestens 7 Monate stabil sind. Tabelle 4 Stabilitätstest Quantitative Bestimmung durch RIA

K. Serokonversion und ED&sub5;&sub0; der erfindungsgemäßen Partikel

Die Serokonversionstests werden mit fünf Gruppen von jeweils zehn erwachsenen weißen Mäusen durchgeführt (Figuren 8A, 88 und 8C). Mäuse, Gm weiblich 1CR Stamm Swiss, erhalten subkutane Injektionen mit 1 ml Alaun-Adjuvans-Impfstoff, enthaltend die erfindungsgemäßen Partikel in den folgenden Verdünnungen: 1/1 (5,0 µg), 1/4 (1,3 µg), 1/16 (0,31 µg) 1/64 (0,16 µg) und 1/256 (0,078 µg). Den Mäusen wurde nach 28 Tagen Blut entnommen, und der Antikörpertiter wird durch den AUSAB-Test im Vergleich zum HBIG-Standard bestimmt. Die Serumproben aus jedem Tier wurden vierfach seriell verdünnt und in dreifacher Ausführung getestet.
Der prozentuale Anteil der Mäuse, die einen positiven Serotyp zeigten, nahm mit steigender Verdünnung der erfindungsgemäßen Partikel ab. Die Dosis, bei der 50 % der Tiere eine seropositive Antwort zeigen (ED&sub5;&sub0;), beträgt etwa 0,05 bis 0,25 µg des Impfstoffs, der die erfindungsgemäßen Partikel enthält. Im allgemeinen sind die Ergebnisse der Serokonversion, die mit dem erfindungsgemäßen Impfstoff erhalten wurden, nicht von den Ergebnissen zu unterscheiden, die mit dem natürlichhergeleiteten Impfstoff erhalten wurden.

Beispiel 2

A. Herstellung des rekombinanten Plasmids pENDO-1

Gensequenzen aus den rekombinanten Plasmiden pBglII2.8, pBR322.βG2 (ein Plasmid, das durch Subclonierung des 7 kb großen EcoRI-βG2-Fragments aus Plasmid pMB9.βG2, beschrieben von Tilghman, S. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75 (1978), 725, in die EcoRI-Stelle von pBR322 hergestellt wurde), pDM2, POLINK 23456 (vgl. nachstehend) und dem pMMT- neo-Plasmid werden bei der Herstellung von Vektor-Konstruktionen zur Erzeugung rekombinanter Expressionsvektoren verwendet, die keine Nicht- HBV-Virusgenom-Teile aufweisen.
Wie in den Figuren 9A und 9B ersichtlich, enthält das pBglII2.8- Plasmid ein Gensegment (1,34 kb BstEII-HpaI-Fragment), welches den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich umfaßt, und es trägt den natürlichen starken Promotor für die Transkription des PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereichs, ihm fehlt jedoch der natürliche (schwache) Promotor für die Transkription des PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereichs und außerdem die Transkriptions-Terminations-Funktionen und das Polyadenylierungs-Signal. Das Plasmid pBglII2.8 wurde einer Spaltung mit BstEII und HpaI unterworfen, wodurch zwei DNA-Fragmente erhalten wurden. Nach Auftrennung der Fragmente durch 3,5 % Polyacrylamidgel-Elektrophorese wurde ein Fragment davon (1,34 kb), das den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Proteincodierenden Bereich enthielt, gereinigt und zurückbehalten. Das HpaI- Ende ist glatt. Das BstEII-Ende wurde durch Auffüllen in ein glattes Ende umgewandelt (es wurde doppelsträngig gemacht), wobei DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und die vier dNTPs unter Einsatz herkömmlicher Techniken verwendet wurden, wodurch ein DNA-Fragment mit zwei glatten Enden erhalten wurde.
Ein Polylinker-Plasmid, POLINK 23456, das eine Anzahl von Restriktionsstellen aufwies, die innerhalb der Polylinker-Region enthalten waren (nachstehend), wurde eingesetzt.
Der Polylinker-Adapter ist innerhalb des EcoRI-SalI-Rückgrat-Fragments (3,1 kb) von pBR328 enthalten.
POLINK 23456 wird mit HpaI gespalten, wodurch das Plasmid lineansiert wird. Ein solches HpaI-linearisiertes Plasmid enthält zwei glatte Enden. Das lineare Plasmid wird sodann mit dem 1,34 kb-großen DNA-Fragment, das den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich enthält und das aus dem pBglII2.8-Plasmid (vorstehend) erhalten wurde, über glatte Enden ligiert. Da das 1,34 kb-große Fragment in das Polylinker-Plasmid in beiden Orientierungen eingebaut werden kann, wird die korrekte Orientierung (im Uhrzeigersinn, bezüglich der natürlichen Transkriptionsrichtung) bestätigt, indem das Plasmid mit EcoRI gespalten und anschließend die Größe der Fragmente auf 1 % Agarosegelen analysiert wird. Die EcoRI Spaltung des Plasmids, das den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich in der korrekten Orientierung enthält, ergibt zwei Fragmente mit 0,4 kb und 4,1 kb; die falsche Orientierung dagegen ergibt zwei Fragmente von 1,0 kb und 3,5 kb. Das neue Plasmid, das den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich enthält, wird sodann mit HpaI gespalten und mit BamHI "partiell" gespalten. Die kurze (23 bp) Sequenz zwischen den HpaI- und BamHI-Restriktionsstellen wird vom HpaI-BamHI-"partiellen" Rückgrat (5, kb) abgetrennt und zusammen mit den im Reaktionsgemisch vorliegenden Fragmenten, die aus der vollständigen Spaltung resultieren, verworfen.
Das pBR322.βG2-Plasmid wird mit BalI (glattes Ende) und BglII ("klebriges" Ende) gespalten, wodurch eine Gensequenz (1,6 kb) erhalten wird, die die mg-PAS-t-Polyadenylierungs-Terminationssequenz aus dem Globingen der Maus enthält. Das mg-PAS-t-Fragment wird sodann in das vorstehende geöffnete HpaI-BamHI-linearisierte Plasmid BalI-zu-HpaI und BglII-zu-BamHI ligiert ("klebrige Enden" von BglII und BamHI sind identisch und somit kompatibel, sie sind für eine Ligierung untereinander geeignet), wodurch ein neues rekombinantes Plasmid als Zwischenprodukt erhalten wird (6,0 kb), das sowohl den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich als auch die mg-PAS-t-Sequenz jeweils in der korrekten Orientierung und Reihenfolge enthält. Das Plasmid, das den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich und mg-PAS-t enthält, wird sodann mit BglII und Sall gepalten, wodurch das Plasmid in zwei Fragmente gespalten wird (2,95 kb und 3,05 kb), wie durch 1 % Agarosegel-Elektrophorese bestätigt. Nach der Spaltung des 3,05 kb-großen Fragments mit PuvI unter Erzeugung von zwei kleineren Fragmenten (1,08 kb und 1,98 kb), wird das verbliebene 2,95 kb-große BglII-SalI-DNA-Fragment (das keine PvuI-Stelle enthält), das die fusionierten Segmente des PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Proteincodierenden Bereichs und mg-PAS-t umfaßt, gereinigt und zurückbehalten.
Das pMMT-neo-Plasmid, das Plasmid, das durch Ligierung des in Beispiel 1, Abschnitt A, erhaltenen 6,65-Fragments (vgl. Figur 9) erzeugt wurde, wird sodann mit BglII und SalI gespalten, wodurch zwei DNA-Fragmente (4,23 kb und 2,42 kb) erhalten werden. Das 2,42 kb-große Fragment, das den Neomycin-Selektionsmarker und SV40-PAS-t enthält, wird verworten. Das verbliebene 4,23 kb-große Fragment wird unter Verwendung einer 0,8 % Agarosegel-Elektrophorese gereinigt und anschließend mit dem vorstehend erhaltenen 2,95 kb-große BglII-SalI-DNA-Fragment, umfassend den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich und mg-PAS-t, ligiert, wodurch ein 7,15 kb-großes rekombinantes Plasmid erzeugt wird, das die folgenden Teile in der angeführten Reihenfolge enthält: den MMT-Promotor, den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich und die mg-PAS-t-Polyadenylierungs- und Terminationssequenz, das Plasmid wird als pENDO-1 bezeichnet. Das pENDO-1-Plasmid enthält keine Nicht-HBV-Virusgenom-Teile (vgl. Figur 9).

B. Herstellung des rekombinanten Plasmids pENDO-2

Wie in Figur 10 dargestellt, wird pDM2, das den MMT-Promotor, den PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich und den Protein X-codierenden Bereich umfaßt, mit den Restriktionsenzymen SpeI und SalI gespalten. Die SpeI-Restriktionsstelle liegt im S-Protein-Bereich des PreS&sub2;-S-Proteincodierenden Bereichs und kommt in pDM2 einmalig vor, wie auch die SalI- Stelle stromabwärts des Gens. Unter Einsatz dieser beiden Enzyme wird das Plasmid in zwei DNA-Fragmente (1,58 kb und 4,88 kb) gespalten, sodann wird das 1,58 kb-große Fragment, das das Carboxyende des PreS&sub2;-S- Protein-codierenden Bereichs und den Protein X-codierenden Bereich enthält, verworfen und das 4,88 kb-große Plasmid gereinigt und zurückbehalten.
Das pENDO-1-Plasmid wird auch mit SpeI und SalI gespalten, wobei aus dem Plasmid zwei DNA-Fragmente, 1,9 kb und 5,25 kb, erhalten werden. Das 1,9 kb-große Fragment, welches das Carboxyende des S-Protein-Bereichs des PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereichs plus den mg-PAS-t-Bereich enthält, wird gereinigt und zurückbehalten.
Die zwei zurückbehaltenen DNA-Fragmente (1,9 kb und 4,88 kb) werden sodann ligiert, wodurch ein neues, mit pENDO-2 bezeichnetes rekombinantes Plasmid (6,8 kb) erhalten wird, das den MMT-Promotor, den PreS&sub2;-S- Protein-codierenden Bereich und die mg-PAS-t-Sequenz enthält. Plasmid pENDO-2 umfaßt keine Nicht-HBV-Virusgenom-Teile (vgl. Figur 10).

C. Herstellung des rekombinanten Plasmids pENDO-0

Ein drittes neues Plasmid, das mit pENDO-0 bezeichnet wird (vgl. Figur 11) und einen Neomycin-Selektionsmarker enthält, wird hergestellt, indem pMMT-neo, das Plasmid, das durch Ligierung des in Beispiel 1, Abschnitt A, erhaltenen 6,65 kb-großen Fragments erzeugt wurde (vgl. Figur 11), mit den Restriktionsenzymen SmaI (glattes Ende) und BamHI gespalten wird. Das Plasmid wird in zwei DNA-Fragmente (5,5 kb und 1,15 kb) gespalten. Das 5,5 kb-große Fragment, das den MMT-Promotor und den Neomycin-Selektionsmarker aus dem pMMT-neo-Plasmid-Rückgrat umfaßt, wird zurückgehalten. Anschließend wird dieses Fragment mit dem DNA-Fragment (1,6 kb) ligiert, das die BalI-BglII-mg-PAS-t-Sequenz enthält, wie bei der Erzeugung von pENDO-1 beschrieben. Das resultierende 7,2 kb-große rekombinante Plasmid pENDO-0 enthält nun den MMT-Promotor, den Neomycin- Selektionsmarker und die mg-PAS-t-Sequenz, es umfaßt keine viralen DNA- Sequenzen (vgl. Figur 11).

D. Einführung der Plasmidvektoren pENDO-0, pENDO-1 und pENDO-2 in Säugerzellen durch Co-Transfektion

Die rekombinanten Plasmidvektoren pENDO-0, pENDO-1 und pENDO-2 werden in Säugerzellen co-transfiziert, wie z.B. Maus-L-Zellen, Vero-Zellen (African Green Monkey), CHO-Zellen und 3T3-Maus-Fibroblasten, wobei Standardverfahren der Co-Transfektion eingesetzt werden. G418-resistente Transfektanten werden isoliert und unter Verwendung des RIA-Verfahrens durchgemustert, ob sie erfindungsgemäße Partikel herstellen.

E. Herstellung von gemischten Concatameren von pENDO-0-, pENDO-1-, pENDO-2-Plasmid-DNAs für die Transfektion von Zellinien

Jedes der Plasmide pENDO-1, pENDO-2 und pENDO-0 enthält die einmalige Restriktionsstelle PvuI, die innerhalb des Amp-Gens liegt, von der EcoRI-Restriktionsstelle aus in Richtung gegen den Uhrzeigersinn (vgl. die Figuren 9, 10 und 11). Die Plasmide werden jeweils getrennt mit PvuI gespalten, wodurch sie linearisiert werden. Anschließend werden die Plasmide polymerisiert, wodurch gemischte Concatamere mit unterschiedlichen Verhältnissen der verschiedenen Plasmide erzeugt werden. Z.B. kann durch die Polymerisation der linearisierten Plasmide pENDO-1 und pENDO-0 unter Verwendung von Ligase, wie z.B. T4-DNA-Ligase, ein gemischtes Concatamer mit einem Verhältnis von 10:1 von pENDO-1:pENDO-0 erzeugt werden, wenn das Verhältnis der linearisierten Plasmidkomponenten bei der Zugabe von pENDO-1:pENDO-0 10:1 beträgt. Das resultierende gemischte pENDO-1/pENDO-0-Concatamer wird in eine eukaryotische Zelle, wie z.B. eine Säugerzelle, transfiziert und die Zelle einer G418-Selektion unterworfen. Man geht davon aus, daß im Durchschnitt jede G-418-resistente (transfizierte) Zelle etwa 10 Kopien des PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereichs pro eine Kopie des neo-Gens enthalten sollte.
Genauso wird das pENDO-0-Fragment mit dem pENDO-2-Fragment durch Ligase, wie z.B. T4-DNA-Ligase, z.B. in einem Verhältnis von 10:1 von pENDO-2:pENDO-0 polymerisiert, wodurch ein gemischtes pENDO-2/pENDO-0- Concatamer erzeugt wird. Anschließend wird das Concatamer in eine eukaryotische Zelle, z.B. eine Säugerzelle, transfiziert. Die Zellen werden sodann einer G418-Selektion unterworfen, im Durchschnitt sollte jede G418-resistente (transfizierte) Zelle in diesem Beispiel etwa 10 Kopien von pENDO-1 zu pENDO-0 enthalten.
Genauso werden pENDO-1, pENDO-2 und pENDO-0 durch Ligase, wie z.B. T4-DNA-Ligase, polymerisiert, wodurch ein gemischtes Concatamer z.B. in einem Verhältnis von 10:10:1 von pENDO-1:pENDO-2:pENDO-0 erzeugt wird. Das resultierende gemischte Concatamer wird in eine eukaryotische Zelle, z.B. eine Säugerzelle, transfiziert und die Zelle einer G418-Selektion unterworfen. Im Durchschnitt sollten die resistenten (transfizierten) Zellen 10 Kopien von pENDO-1 zu 10 Kopien pENDO-2 zu einer Kopie pENDO-0 enthalten.
Jede der resultierenden resistenten Zellen sollte größere Ausbeuten der Partikel ergeben, die Proteine enthalten, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;- S-Protein-codierenden Bereich codiert werden.

Anwendung von nicht-reµlizierenden Vektoren, umfassend den Maus-Metallothionein-Promotor, für die Expression anderer Proteine in transfizierten eukaryotischen Wirtszellen

Die Erfindung umfaßt außerdem rekombinante DNA-Transfer-Vektoren, umfassend den MMT-Promotor, beliebige funktionelle DNA-Sequenzen und weitere DNA, die keine Virus-DNA ist.
Mit dem Begriff funktionelle DNA-Sequenz ist ein beliebiger umschriebener DNA-Bereich gemeint, der direkt oder indirekt aus einer beliebigen Quelle stammt und der in einer eukaryotischen Wirtszelle, die mit dem erfindungsgemäßen Vektor transfiziert ist, als eine komplette Gen-Expressionseinheit, ein Strukturgen, ein Promotor oder regulatorischer Bereich funktioniert.
Mit dem Begriff komplette Gen-Expressionseinheit sind ein Strukturgen und der Promotor und die für seine Transkription und Translation erforderlichen regulatorischen Bereiche gemeint.
Mit dem Begriff Promotor ist ein beliebiger Bereich stromaufwärts eines Strukturgens gemeint, der die Bindung von RNA-Polymerase und das Ablaufen der Transkription erlaubt.
Mit dem Begriff regulatorischer Bereich ist ein beliebiger Bereich gemeint, der die Transkriptionsrate des Strukturgens reguliert.
Mit dem Begriff Strukturgen ist eine codierende Sequenz gemeint, die als Matrize für die Synthese von messenger-RNA dient.
Bevorzugte Strukturgene umfassen Stukturgene, die Polypeptide von pharmazeutischer Bedeutung codieren, wie z.B. ein Virusantigen, Insulin, Interferon und Lymphokine, Ratten- oder menschliches Wachstumshormon, Gewebe-Plasminogen-Aktivator, Alpha-1-Antitrypsin und dergleichen. Am stärksten bevorzugt ist Ratten- oder menschliches Wachstumshormon.
Diese Erfindung betrifft einen rekombinanten DNA-Vektor, der die funktionelle DNA-Sequenz und einen MMT-Promotor umfaßt. Der MMT-Promotor kann im DNA-Vektor entweder zusätzlich zu dem natürlichen Promotor für die DNA-Sequenz oder anstelle des natürlichen Promotors eingebaut sein. Vorzugsweise liegt der MMT-Promotor im DNA-Vektor unmittelbar stromaufwärts der DNA-Sequenz des Protein-codierenden Bereichs. Vorzugsweise umfaßt ein solcher Vektor außerdem eine Transkriptions-Terminationssequenz und einen Selektionsmarker. Vorzugsweise ist ein solcher Selektionsmarker ein Arzneistoffresistenzmarker, wie z.B. das Neomycin-Gen. Vorzugsweise ist eine solche Transkriptions-Terminationssequenz eine SV40-Terminationsstelle (sv-PAS-t) oder stärker bevorzugt der DEF-Bereich (mg- PAS-t) des Globingens der Maus. Der Vektor kann durch herkömmliche DNA- Rekombinationstechniken oder andere Techniken der Molekularbiologie hergestellt werden. Im am stärksten bevorzugten Fall enthält der Vektor unter Verwendung des mg-PAS-t-Bereichs keine Virus-DNA-Segmente und ist nicht onkogen, d.h. er wird eine beliebige Wirtszelle, in die er eingeführt wird, nicht transformieren (karzinös machen). Wenn der Vektor keine autonome Replikationssequenz (Replicon) enthält, die in dem damit transfizierten Wirt funktioniert, integriert sich der Vektor bei Transfektion in einen Wirt ins Wirtschromosom und wird passiv mit dem Wirtsgenom repliziert.
Vorzugsweise sollte der rekombinante DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung die folgenden Merkmale umfassen:
1) Die betreffende DNA-Sequenz.
2) Einen MMT-Promotor, der unmittelbar stromaufwärts der betreffenden DNA-Sequenz liegt.
3) Der Vektor sollte befähigt sein, sich in Bakterien oder anderen prokaryotischen Wirten, in die er transformiert wird, zu replizieren, so daß Wachstum, Amplifikation und die Herstellung großer Mengen des rekombinanten Vektors stattfinden. Aus diesem Grund sollte der Vektor ein bakterielles oder anderes prokaryotisches Replicon umfassen, d.h. ein DNA-Segment, das alle Funktionen enthält, die für eine autonome Replikation und eine Erhaltung des Vektors außerhalb des Chromosoms einer prokaryotischen Wirtszelle, wie z.B. einer Bakterienzelle, die damit transformiert wird, erforderlich sind. Solche Replicons sind dem Fachmann bekannt.
4) Das Vektor-Replicon sollte klein sein (d.h., möglichst kleiner als 6 bis 8 Kilobasenpaare), um eine einfache genetische und molekularbiologische Handhabung zu ermöglichen.
5) Der Vektor sollte einen Selektionsmarker enthalten, vorzugsweise einen Arzneistoffresistenzmarker, wie z.B. Ampicillin, zur Verwendung in bakteriellen Wirtszellen, die damit transformiert werden.
6) Der Vektor sollte einen zweiten Selektionsmarker enthalten, vorzugsweise einen Arzneistoffresistenzmarker, wie z.B. Neomycin, zur Verwendung in eukaryotischen Wirtszellen, die damit transformiert werden.
7) Der Vektor sollte günstige Endonuclease-Restriktionsstellen für die Clonierung enthalten.
8) Der Vektor sollte eine Transkriptions-Terminations- und Polyadenylierungssequenz enthalten.
9) Die Genexpressionseinheit enthält keine Virus-Segmente und ist nicht onkogen.
Am stärksten bevorzugt umfaßt der erfindungsgemäße Vektor keine autonome Replikationssequenz (Replicon), die in einer damit transfizierten eukaryotischen Wirtszelle funktionieren kann. Ein Hauptgrund, der für die Verwendung eines nicht-replizierenden Vektorsystems in eukaryotischen Wirtszellen spricht, besteht darin, daß alle Vektorsysteme, die zu einer autonomen und extrachromosomalen Replikation in einer damit transfizierten eukaryotischen Säuger-Wirtszelle befähigt sind, Replicons umfassen, die von onkogenen Viren stammen. Für die Expression von DNA-Sequenzen, die Polypeptide mit pharmazeutischer Bedeutung codieren, ist es wünschenswert, Vektoren zu verwenden, die DNA umfassen, die nicht von onkogenen Viren stammt.
Diese Erfindung betrifft außerdem eine transfizierte eukaryotische Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA-Vektor transformiert ist, der die funktionelle DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung umfaßt. Vorzugsweise ist der Wirt eine Säugerzelle, am stärksten bevorzugt eine Ovarzellinie des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellinie), eine Vero-Zellinie, eine L-Zellinie oder eine Maus- oder Ratten-Fibroblastenzellinie. Der Wirt kann hergestellt werden, indem eine eukaryotische Zelle mit einem rekombinanten DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung nach herkömmlichen Techniken transfiziert wird.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Proteine, die durch die betreffenden DNA-Sequenzen codiert werden, umfassend: a) Züchtung des erfindungsgemäßen transfizierten Wirts unter Kulturmedium-Bedingungen, die den Wirt befähigen, die Proteine zu exprimieren; und b) Isolierung der Proteine. Vorzugsweise kann der transfizierte Wirt die Proteine ins Medium ausscheiden. Vorzugsweise werden Schwermetallionen oder Steroidhormone, wie z.B. Dexamethason, zum Kulturmedium zugegeben, wodurch der MMT-Promotor induziert und auf diese Weise die Expression des codierenden Bereichs gesteigert wird. Schwermetallionen, wie z.B. Cadmium oder Zink, sind am stärksten bevorzugt. Die optimale Konzentration von Schwermetallionen oder des Steroidhormons, die im Medium enthalten sind, kann durch herkömmliche Techniken bestimmt werden.
Diese Erfindung betrifft auch die Proteine, die durch dieses Verfahren hergestellt werden. Wenn die transfizierte Wirtszelle der vorliegenden Erfindung die Proteine direkt ins Kulturmedium ausscheidet, können die Proteine anschließend aus dem Kulturmedium des erfindungsgemäßen transfizierten Wirts durch herkömmliche Techniken der Proteinisolierung isoliert werden. Wenn die transfizierte Wirtszelle der vorliegenden Erfindung die Proteine nicht ausscheidet, können sie aus einem Kulturlysat des Wirts durch herkömmliche Kulturlysat-Techniken erhalten werden.

Beispiel 3

Expression von menschlichem Wachstumshormon

Herstellung eines rekombinanten DNA-Vektors, der menschliches Wachstumshormon codiert, wobei der Vektor den Metallothionein-Promotor umfaßt

A. Isolierung eines DNA-Fragments, das das Gen des menschlichen Wachstumshormon ohne den natürlichen Promotor für die Transkription enthält

Das rekombinante Plasmid pBR322, das eine 2 kb-große EcoRI-DNA- Fragment-Insertion enthält, die das Gen des menschlichen Wachstumshormon codiert (in Richtung gegen den Uhrzeigersinn), wird mit der Restriktionsendonuclease BamHI in einem Gesamtvolumen von 500 µl, enthaltend 100 µg Plasmid-DNA, 240 Einheiten BamHI, in BamHI-Puffer (hohe Salzkonzentration) gespalten. Zwei Fragmente werden erhalten, eines weist etwa 5,6 kb und das andere Fragment etwa 0,8 kb auf. Die Fragmente werden durch Elektrophorese in einem 0,8 % präparativen Agarosegel aufgetrennt. Das größere Fragment, das das Strukturgen für das menschliche Wachstumshormon ohne den natürlichen Promotor für das Gen enthält, wird aus dem Gel elektroeluiert und durch zwei Zyklen Phenol/Chloroform-Extraktion, zwei Zyklen Chloroform-Extraktion und zwei Zyklen Ethanol-Fällung gereinigt Die gefällte DNA wird in 20 µl 10 mM Tris, pH 8,0, resuspendiert.

B. Isolierung eines DNA-Fragments, das den Metallothionein-Promotor und das pML2-Vektor-Rückgrat enthält

Das Plasmid pMMT-neo (vgl. Figur 5) wird mit den Restriktionsendonucleasen BglII und BamHI gespalten, wodurch zwei Fragmente erzeugt werden, von denen das eine 4,5 kb aufweist und den MMT-Promotor und das pML2-Vektor-Rückgrat enthält und das andere 2,15 kb aufweist und das neo-Gen, gekoppelt an das sv-PAS-t-Segment, enthält. Um eine Selbstligierung zu verhindern, wird die lineare DNA mit alkalischer Phosphatase in einem Gesamtvolumen von 100 µl, enthaltend 25 µg des DNA-Fragments und 28 Einheiten alkalische Phosphatase, behandelt. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 37ºC inkubiert und die Reaktion durch Zusatz von 10 µl 50 mM EDTA und zehnminütiges Erhitzen auf 68ºC abgestoppt. Die Fragmente werden durch Elektrophorese auf 0,8 % Agarosegel aufgetrennt. Das 4,5 kb-große Fragment wird aus dem Gel elektroeluiert, wie beschrieben, und durch zwei Zyklen Phenol/ Chloroform-Extraktion, zwei Zyklen Chloroform-Extraktion und zwei Zyklen Ethanol-Fällung gereinigt. Die gefällte DNA wird in 20 µl 10 mM Tris, pH 8,0, resuspendiert.

C. Ligierung der in den vorstehenden Abschnitten A und B isolierten DNA-Fragmente

Eine Menge von 1,5 µg des 5,6 kb-großen Fragments aus dem vorstehenden Abschnitt A wird genommen und mit 0,3 µg des Fragments aus dem vorstehenden Abschnitt B in einem Gesamtvolumen von 10 µl, enthaltend 0,9 Einheiten T4-DNA-Ligase und 1 x Ligierungspuffer, plus 100 mM ATP gemischt. Das Gemisch wird eine Stunde bei 15ºC und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Das Ligierungsgemisch wird sodann in den Bakterienstamm HB101 eingeführt, wobei das in Material und Methoden beschriebene Verfahren verwendet wird. Die Zellen aus dem Transformationsgemisch werden auf LB- Ampicillin-Agarplatten verteilt und isolierte Kolonien auf Kolonien abgesucht, die Plasmide mit einer Größe von 10,1 kb enthalten, die mit der Restriktionsendonuclease BamHI linearisiert werden können. Die Orientierung wird durch Spaltung mit EcoRI bestimmt. Plasmide, die die Insertion in der richtigen Orientierung enthalten, ergeben zwei EcoRI-Fragmente, das eine mit 3,5 kb und das andere mit 6,6 kb. Solche Plasmide, die mit pMMT-hGH bezeichnet werden, werden in großem Maßstab gezüchtet und gereinigt, wie beschrieben.

D. Einführung des im vorstehenden Abschnitt C erhaltenen rekombinanten DNA-Vektors in Säugerzellen und Anlegen von Zellinien die menschliches Wachstumshormon produzieren

Der Vektor pMMT-hGH wird sodann durch herkömmliche Co-Transfektions-Techniken in eukaryotische Wirtszellen (Säuger) transfiziert, wodurch Transfektanten erhalten werden, die das menschliche Wachstumshormon-Polypeptid synthetisieren. Solche Transfektanten werden durch die RIA-Technik unter Verwendung von Antikörpern gegen menschliches Wachstumshormon identifiziert. Transfektanten, die menschliches Wachstumshormon ausscheiden, werden als Zellinien angelegt, wobei herkömmliche Techniken verwendet werden.

Beispiel 4

Expression von Ratten-Wachstumshormon

Herstellung eines rekombinanten DNA-Vektors, der das Ratten-Wachstumshormon umfaßt, wobei der Vektor den Metallothionein-Promotor enthält

A. Konversion der BglII-Restriktionsendonuclease-Stelle in pMMT-neo zu XhoI

Eine Menge von 200 µg pMMT-neo wird mit 500 Einheiten der Restriktionsendonuclease BglII in Puffer mit mittlerer Salzkonzentration in einem Gesamt-Reaktionsvolumen von 1000 µl gespalten. Die Enden der 6,65 kb-großen linearen Plasmid-DNA werden zuerst in glatte Enden umgewandelt, indem die BglII-Enden unter Verwendung von DNA-Polymerase 1 (Klenow-Fragment) und den vier dNTPs aufgefüllt werden, wie vorstehend beschrieben, sodann wird das folgende synthetische DNA-Linker-Fragment, das die XhoI-Restriktionsendonuclease-Erkennungs- und -Spaltstelle enthält (von PL Biochemicals, Milwaukee, Wisconsin 53205), angehängt:
5'-CCTCGAGG-3'
3'-GGAGCTCC-5'
Die Auffüllreaktion wird in einem Gesamtvolumen von 30 µl durchgeführt, worin 2,5 µg des 6,65 kb-großen Fragments, 200 mM der vier dNTPs, 3 µl NT-Puffer, 1 µl Klenow-Fragment enthalten sind. Das Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Umsetzung wird durch Zusatz von 2 µl 0,25 M EDTA gestoppt und die DNA einmal mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform und sodann mit einem gleichen Volumen Chloroform alleine gewaschen. Die DNA in der wäßrigen Phase wird weiter durch zwei Ethanol-Fällungen gereinigt. Die gefällte DNA wird in 10 µl 10 mM Tris, pH 8,0, in einer Konzentration von 50 ng/µl resuspendiert.
Das Linker-Fragment wird in 50 µl 10 mM Tris, pH 8,1, in einer Konzentration von 1 pMol/µl gelöst. Das 6,65 kb-große Fragment mit glatten Enden wird mit dem Linker-Fragment in einem Gesamtvolumen von 20 µl, enthaltend 2 pMol des Linker-Fragments, 0,5 µg des 6,65 kb-großen Fragments, 9 Einheiten T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim), 30 µl 2 x Ligierungspuffer für glatte Enden, plus 100 mM ATP, ligiert. Die Ligierung wird eine Stunde bei 15ºC und über Nacht bei 4ºC durchgeführt.
Das Ligierungsgemisch wird zur Transformation des Bakterienstamms HB101 eingesetzt, der kompetent gemacht wird, wie in Material und Methoden beschrieben. Zellen aus dem Transformationsgemisch wurden auf LB-Ampicillin-Agarplatten verteilt. Bakterienkolonien, die auf Ampicillinplatten wuchsen, wurden herausgegriffen und in Kulturen zu 2 ml gezüchtet und zur Herstellung von Plasmiden verwendet, wie vorstehend beschrieben.
Aus 12 Bakteriendonen wurden vier Clone (OK 3, OK 4, OK 11, OK 12) identifiziert, die ein Plasmid aufwiesen, das nach Spaltung mit XhoI alleine oder zusammen mit BamHI und EcoRI die erwartete Größe zeigte. Die Plasmid-DNA aus OK 3 und aus OK 11 wurden in HB101 zur Herstellung von Plasmiden in großem Maßstab vermehrt.

Eine Menge von 100 µg jeweils von OK 3 und OK 11 wurde mit den Restriktionsendonucleasen BamHI und XhoI gespalten, wodurch zwei Fragmente erhalten wurden, das eine (5,8 kb) mit dem MMT-Promotor, der in der Nähe des XhoI-Endes liegt, und dem pML2-Teil am BamHI-Ende und das andere (0,85 kb), das die sv-PAS-t-Sequenz enthält. Die Fragmente wurden durch Elektrophorese in 0,8 % Agarose aufgetrennt. Das 5,8 kb-große Fragment wurde durch Elektroelution und anschließend durch zwei Zyklen Phenol/Chloroform-Extraktion, zwei Zyklen Chloroform-Extraktion und zwei Zyklen Ethanol-Fällung gereinigt. Die gefällte DNA wurde in 50 µl 10 mM Tris, pH 8,0, resuspendiert.

C. Isolierung eines DNA-Fragments, das das Gen des Ratten-Wachstumshormons enthält

Plasmid pBR322.RGH, das eine genomische BamHI-Insertion enthält, die das Gen des Ratten-Wachstumshormons enthält (in Richtung gegen den Uhrzeigersinn), wurde mit BamHI und XhoI gespalten. Das genomische BamHI-XhoI-Fragment, welches das Strukturgen enthält, wurde aus einem 0,8 % präparativen Agarosegel isoliert, wie vorstehend beschrieben.

D. Ligierung der wie in den vorstehenden Abschnitten B und C isolierten Fragmente

Die Fragmente werden miteinander ligiert, so daß der MMT-Promotor über das XhoI-"klebrige" Ende direkt mit dem Strukturgen über sein XhoI- klebriges Ende in der richtigen Orientierung verknüpft wird.
Das Ligierungsgemisch wird für die Transformation des Bakterienstamms HB101 eingesetzt, wie vorstehend beschrieben. Transformanten, die auf LB-Ampicillin-Agarplatten Kolonien bilden, werden herausgegriffen und für eine Plasmid-Herstellung in kleinem Maßstab in 2-ml-Kulturen gezüchtet. Plasmide, die bei Spaltung mit BamHI und XhoI die zwei erwarteten Fragmente ergeben und die mit pMMT-rGH bezeichnet werden, werden sodann in großem Maßstab für die Transfektion in Säugerzellen gezüchtet.

E. Einführung des im vorstehenden Abschnitt D erhaltenen rekombinanten DNA-Vektors in Säugerzellen und Anlegen der Zellinien, die das Ratten-Wachstumshormon produzieren

Der Vektor pMMT-rGH wird sodann durch Standard-Techniken der Co- Transfektion in eukaryotische Wirtszellen (Säuger) transfiziert, wodurch Transfektanten erhalten werden, die das Ratten-Wachstumshormon-Polypeptid synthetisieren. Die Transfektanten werden durch die RIA-Technik unter Verwendung von Antikörpern gegen Ratten-Wachstumshormon identifiziert. Transfektanten, die das Ratten-Wachstumshormon ausscheiden, werden als Zellinien angelegt, wobei herkömmliche Techniken verwendet werden.
Obwohl die vorliegende Erfindung mit Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben wurde, kann der Fachmann erkennen, daß Änderungen in Form und Einzelheiten durchgeführt werden können, ohne daß vom Inhalt und Umfang der Erfindung abgewichen wird.

Claims

1. Rekombinanter DNA-Vektor, der frei ist von viralen oder onkogenen nicht-HBV Nucleinsäuresequenzen, umfassend:

(a) eine DNA-Sequenz, die den Hepatitis B-PreS&sub1;-PreS&sub2;- S-Protein-codierenden Bereich umfaßt; und

(b) einen Promotor, der ein Metallothionein-Gen-Promotor ist und die Expression des codierenden Bereichs (a) in einer Säuger-Wirtszelle kontrollieren kann, so daß das PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-Protein produziert werden kann.

2. Vektor nach Anspruch 1, wobei der Promotor in den Vektor, der die DNA-Sequenz umfaßt, zusätzlich zu einem natürlichen Hepatitis B-Promotor oder an dessen Stelle, vorzugsweise unmittelbar stromaufwärts der PreS&sub1;-PreS&sub2;- S-Protein-Codierenden Bereiche, eingebaut ist.

3. Vektor nach Anspruch 1 oder 2, der ferner einen Selektionsmarker enthält, vorzugsweise einen Arzneistoff resistenzmarker, wie ein Neomycin-Resistenz-Gen, und/oder eine Transkriptions-Terminationsstelle, wie einen DEF-Bereich des Maus-Globin-Gens.

4. Rekombinantes DNA-Concatamer, umfassend den Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als einen ersten Vektor und einen zweiten Vektor, umfassend einen PreS&sub2;-S-Proteincodierenden Bereich oder einen S-Protein-codierenden Bereich eines Hepatitis B-Oberflächenantigens.

5. Concatamer nach Anspruch 4, wobei der Metallothionein- Gen-Promotor in den weiteren Vektor eingebaut ist und vorzugsweise unmittelbar stromaufwärts des PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereichs liegt.

6. Concatamer nach Anspruch 4, wobei der erste und/oder weitere Vektor eine Transkriptions-Terminationsstelle, wie den DEF-Bereich des Maus-Globin-Gens, und/oder einen Selektionsmarker umfaßt.

7 Concatamer nach Anspruch 4, wobei die DNA-Vektoren keine anderen viralen DNA-Segmente enthalten.

8. Eukaryotische Zelle, die mit dem rekombinanten DNA-Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder mit dem Concatamer nach einem der Ansprüche 4 bis 7 transfiziert ist.

9. Eukaryotische Zelle, die mit dem rekombinanten DNA-Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 31 der als der erste rekombinante DNA-Vektor definiert ist, und mit einem zweiten rekombinanten DNA-Vektor, umfassend einen PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich oder einen 5-Protein-codierenden Bereich und den Promotor eines Metallothionein-Gens, co-transfiziert ist.

10. Eukaryotische Zelle, die mit dem rekombinanten Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, der als der erste rekombinante DNA-Vektor definiert ist, und mit einem zweiten rekombinanten DNA-Vektor, umfassend einen PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereich, und mit einem dritten rekombinanten DNA-Vektor, umfassend den Promotor eines Metallothionein-Gens und einen Selektionsmarker, co-transfiziert ist, wobei der Metallothionein- Gen-Promotor im dritten Vektor vorzugsweise unmittelbar stromaufwärts des Selektionsmarkers liegt.

11. Zelle nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Metallothionein-Gen-Promotor in den zweiten Vektor eingebaut ist und vorzugsweise unmittelbar stromaufwärts des PreS&sub2;-S-Protein-codierenden Bereichs liegt.

12. Zelle nach Anspruch 9 oder 10, wobei der zweite und/oder der dritte Vektor eine Transkriptions-Terminationsstelle, wie den DEF-Bereich des Maus-Globin-Gens, umfassen und/oder wobei der zweite Vektor einen Selektionsmarker umfaßt.

13. Zelle nach Anspruch 9 oder 10, wobei der zweite und/oder der dritte DNA-Vektor keine anderen viralen DNA-Segmente enthalten.

14. Zelle nach Anspruch 9 oder 10, wobei die DNA-Vektoren verschiedene Selektionsmarker umfassen.

15. Zelle nach Anspruch 10, wobei der erste, der zweite und/oder der dritte Vektor ein Replicon enthalten.

16. Zelle nach einem der Ansprüche 8 bis 15, wobei die eukaryotische Zelle eine Säugerzelle, wie eine Ovarzelle des Chinesischen Hamsters, eine Vero-Zelle, eine L-Zelle, eine Maus-Fibroblastenzelle oder eine Ratten- Fibroblastenzelle ist.

17. Verfahren zur Herstellung der eukaryotischen Zelle nach Anspruch 8, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

Transfektion einer eukaryotischen Zelle mit dem rekombinanten DNA-Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder mit dem Concatamer nach einem der Ansprüche 4 bis 7.

18. Verfahren zur Herstellung der eukaryotischen Zelle nach Anspruch 9, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

Co-Transfektion einer eukaryotischen Zelle mit dem rekombinanten DNA-Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und mit einem zweiten rekombinanten DNA- Vektor, wie in einem der Ansprüche 9 oder 11 bis 14 definiert.

19. Verfahren zur Herstellung der eukaryotischen Zelle nach Anspruch 11, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

Co-Transfektion einer eukaryotischen Zelle mit dem rekombinanten DNA-Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und mit einem zweiten und dritten rekombinanten DNA-Vektor, wie in einem der Ansprüche 10 bis 15 definiert.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die DNA-Vektoren in paarweisen Kombinationen co-transfiziert werden oder zusammen co-transfiziert werden oder in einer Serie von Schritten transfiziert werden.

21. Verfahren zur Herstellung eines Proteine umfassenden Partikels, die durch den PreS&sub1;-PreS&sub2;-S-codierenden Bereich des Hepatitis B-Oberflächenantigens codiert werden, wobei mindestens eines dieser Proteine einem Polypeptid entspricht, das durch die das gesamte PreS&sub1; PreS&sub2;-S codierenden Bereiche codiert wird, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

a. Züchtung einer transfizierten oder co-transfizierten Wirtszelle nach einem der Ansprüche 8 bis 16 unter Kulturmedium-Bedingungen, so daß die Wirtszelle das Partikel exprimiert; und

b. Isolierung des Partikeis.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei Schwermetalle, wie Cadmium oder Zink, oder Steroidhormone, wie Dexamethason, zur Induktion des Metallothionein-Gen-Promotors dem Kulturmedium zugegeben werden.

23. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Partikel aus einem Kulturlysat der Wirtszelle isoliert werden.

24. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zum Schutz eines Menschen vor einer Infektion mit Hepatitis B-Virus, umfassend ein Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23 und Kombination des erhaltenen Partikels mit einer herkämmlichen Trägersubstanz.