JP2003510341A - 細胞ターゲッティング組成物及びそれらを使用する方法 - Google Patents

細胞ターゲッティング組成物及びそれらを使用する方法

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cells
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キム，ジヨング・ジエイ
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ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア
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Abstract

(57)【要約】 薬剤送達組成物及び特定の細胞タイプに化合物を送達する方法が開示される。ワクチン及び個体を免疫する方法が開示される。遺伝子治療を包含する薬剤送達のための組成物及びそのような組成物を用いて個体を処置する方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、薬剤送達組成物、特定の細胞タイプに化合物を送達する方法、改善
されたワクチン、個体を免疫する方法、遺伝子治療を包含する薬剤送達のための
組成物及びそのような組成物を用いて個体を処置する方法に関する。 本発明の要約及び好ましい態様 本発明の一つの態様は、共刺激分子を発現する細胞に化合物を送達するために
該化合物及び共刺激リガンドを含んでなる非細胞性粒子が特に有用であるという
発見から生じる。従って、本発明の一つの態様は、共刺激分子を発現する細胞に
化合物を導入する方法に関する。当該方法は、化合物及び共刺激リガンドを含ん
でなる非細胞性粒子と該細胞とを接触させることを含んでなる。ある態様として
、化合物は核酸分子もしくはタンパク質である。ある態様として、化合物はＤＮ
Ａであり；ある態様として、好ましくはプラスミドＤＮＡである。ある態様とし
て、化合物は、細胞において機能する調節要素に操作可能に連結されたタンパク
質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡである。あるそのような態
様として、タンパク質は免疫原性タンパク質であり、好ましくは、ある態様とし
て、免疫原性病原体タンパク質である。別のそのような態様として、化合物は、
細胞において機能する調節要素に操作可能に連結された非免疫原性タンパク質を
コードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡである。ある態様として、化合
物はウイルスタンパク質である。ある態様として、共刺激分子を発現する細胞は
樹状細胞であり；ある態様として、それはマクロファージ細胞である。ある態様
として、共刺激リガンドは、共刺激分子の抗体もしくは天然のリガンドである。
ある態様として、共刺激リガンドは、共刺激リガンド部分及びウイルスタンパク
質部分を含む融合タンパク質である。ある態様として、粒子は、ウイルス粒子、
タンパク質複合体、リポソーム及び陽イオン両親媒性物質／ＤＮＡ複合体よりな
る群から選択される。ある態様として、粒子は非複製ウイルス粒子である。
【０００２】 本発明のある態様によれば、化合物及び融合タンパク質を含んでなる粒子と細
胞とを接触させることを含んでなる細胞に化合物を導入する方法が提供される。
融合タンパク質は、ＣＤ２８の細胞外領域並びにＨＩＶ−１ ｇｐ４１の膜貫通
及び細胞質領域を含んでなる。融合タンパク質は、化合物の送達のための細胞を
標的とする有効な手段を提供する。
【０００３】 本発明のある態様によれば、共刺激リガンド及び治療タンパク質もしくは治療
タンパク質をコードする核酸分子を含んでなる粒子は、細胞に治療タンパク質を
送達するために用いられる。本発明は、治療タンパク質もしくは治療タンパク質
をコードする核酸分子、及び共刺激リガンドを含んでなる粒子を個体の体上のあ
る部位で該個体の組織に投与するという工程を含んでなる治療タンパク質を個体
に送達する方法を提供する。ある態様として、治療タンパク質は、増殖因子もし
くはサイトカインのような非免疫原性治療タンパク質である。該タンパク質もし
くは該タンパク質をコードするＤＮＡは、粒子の一部として／内部で与えられる
。ある態様として、粒子の一部として／内部で与えられるＤＮＡはプラスミドＤ
ＮＡである。ある態様として、粒子は、ウイルス粒子、タンパク質複合体、リポ
ソーム及び陽イオン両親媒性物質／ＤＮＡ複合体よりなる群から選択される。あ
る態様として、粒子は非複製ウイルス粒子である。
【０００４】 本発明のある態様は、共刺激リガンドをコードする組換え発現ベクターを含ん
でなる癌細胞を個体に投与することを含んでなる癌に対する免疫方法を提供する
。本発明のある態様は、共刺激リガンドをコードする組換え発現ベクターを含ん
でなる癌細胞に関する。
【０００５】 本発明のある態様によれば、化合物及び共刺激リガンドを含んでなる粒子が提
供される。ある態様として、共刺激リガンドは、ＣＤ２８の細胞外領域並びにＨ
ＩＶ−１ ｇｐ４１の膜貫通及び細胞質領域を含んでなる融合タンパク質である
。ある態様として、化合物は核酸もしくはタンパク質である。ある態様として、
化合物はＤＮＡである。ある態様として、化合物はプラスミドＤＮＡである。あ
る態様として、化合物は、細胞において機能する調節要素に操作可能に連結され
たタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡである。ある態
様として、化合物は、細胞において機能する調節要素に操作可能に連結された免
疫原性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡである。あ
る態様として、化合物は、細胞において機能する調節要素に操作可能に連結され
た免疫原性病原体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ
である。ある態様として、化合物は、細胞において機能する調節要素に操作可能
に連結された非免疫原性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる
ＤＮＡである。ある態様として、粒子は、ウイルス粒子、タンパク質複合体、リ
ポソーム及び陽イオン両親媒性物質／ＤＮＡ複合体よりなる群から選択される。
ある態様として、粒子は非複製ウイルス粒子である。
【０００６】 本発明のさらなる態様は、個体を免疫する方法に関する。そのようなものは、
調節要素に操作可能に連結された免疫原性タンパク質をコードするヌクレオチド
配列を含んでなるＤＮＡ分子を個体の体上のある部位で該個体の組織に投与する
という工程を含んでなる。続いて、免疫原性タンパク質を含んでなる粒子を個体
に投与する。ある態様として、粒子は化合物をさらに含んでなることができる。
ある態様として、化合物は核酸分子であることができる。ある態様として、化合
物はＤＮＡである。ある態様として、化合物はプラスミドＤＮＡである。ある態
様として、化合物は、細胞において機能する調節要素に操作可能に連結された免
疫原性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡである。あ
る態様として、化合物は、細胞において機能する調節要素に操作可能に連結され
た免疫原性病原体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ
である。ある態様として、化合物は、細胞において機能する調節要素に操作可能
に連結された非免疫原性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる
ＤＮＡである。ある態様として、粒子はウイルス粒子である。ある態様として、
粒子は非複製ウイルス粒子である。ある態様として、粒子はタンパク質複合体で
ある。 本発明の好ましい態様の記述定義 本明細書において用いる場合、「化合物」という用語は、ＤＮＡもしくはＲＮ
Ａのような核酸分子、またはペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質のよう
なタンパク様分子を包含するが、これらに限定されるものではない任意の分子を
さすものとする。
【０００７】 本明細書において用いる場合、「共刺激分子を発現する細胞」という語句は、
１種もしくはそれ以上の共刺激分子を発現する任意の細胞をさすものとする。そ
のような細胞は、一般に、マクロファージ、顆粒球、樹状細胞、単球もしくはＢ
細胞のような抗原提示細胞である。共刺激分子の例は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｃ
Ｄ４０、ＩＣＯＳＬ、ＩＣＡＭ−１、４１ＢＢ、Ｍ−ＣＳＦＲ、ＦＬＴ３、ＣＣ
Ｒ−５、ＣＣＲ−３及びＣＣＲ−２である。
【０００８】 本明細書において用いる場合、「非細胞性粒子」という用語は、細胞を除く任
意の粒状構造をさすものとする。
【０００９】 本明細書において用いる場合、「共刺激リガンド」という語句は、共刺激分子
に特異的に結合する分子をさすものとする。共刺激リガンドは、好ましくはタン
パク質、より好ましくは抗−共刺激分子抗体、共刺激分子に特異的な天然のリガ
ンド、そのフラグメントもしくは共刺激分子に特異的に結合する部分を含む融合
タンパク質である。ある態様として、共刺激分子に特異的に結合する融合タンパ
ク質の部分は、抗−共刺激分子抗体、共刺激分子に特異的な天然のリガンドもし
くはそのフラグメントである。融合タンパク質は、他の機能を果たす部分をさら
に含んでなることができる。
【００１０】 本明細書において用いる場合、「抗体」という用語は、抗体、並びにＦＡｂ及
びＦ（Ａｂ）2フラグメントのような抗体フラグメントをさすものとする。抗体
は、ある好ましい態様として、モノクローナル抗体、プライスタイズされた（ｐ
ｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体もしくはヒト化抗体であることができる。抗体は、あ
る好ましい態様として、マウスもしくはヒト抗体であることができる。
【００１１】 本明細書において用いる場合、「共刺激分子に特異的な天然のリガンド」とい
う用語は、別の細胞上に存在する共刺激分子に結合する細胞上に存在する細胞タ
ンパク質をさすものとする。例えば、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４は両方ともＣＤ
８０の天然のリガンドであり、ＣＤ２８はまたＣＤ８６の天然のリガンドでもあ
り、ＣＤ４０の天然のリガンドはＣＤ４０Ｌであり、ＩＣＯＳＬの天然のリガン
ドはＩＣＯＳであり、ＩＣＡＭ−１の天然のリガンドはＬＦＡ−３であり、４１
ＢＢの天然のリガンドは４１ＢＢＬであり、ＭＣＳＦＲの天然のリガンドはＭＣ
ＳＦであり、ＦＴ３の天然のリガンドはＦＬ３Ｌであり、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３及
びＣＣＲ５の天然のリガンドはＭＣＰ−３及びＲＡＮＴＥＳである。
【００１２】 本明細書において用いる場合、「陽イオン両親媒性物質／ＤＮＡ複合体」とい
う用語は、ＤＮＡ及び１種もしくはそれ以上の陽イオン両親媒性物質の混合物か
ら生じる複合体をさすものとする。
【００１３】 本明細書において用いる場合、「所望のタンパク質」という用語は、免疫応答
の標的タンパク質または遺伝子治療処方計画における治療もしくは補償（ｃｏｍ
ｐｅｎｓａｔｉｎｇ）タンパク質のいずれかの役割を果たす本発明の遺伝子構築
物によりコードされるペプチド及びタンパク質をさすものとする。
【００１４】 本明細書において用いる場合、「遺伝子治療剤（ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｈｅｒａ
ｐｅｕｔｉｃ）」という用語は、治療もしくは代償タンパク質をコードするヌク
レオチド配列を含んでなる遺伝子構築物を含んでなる製薬学的調製物をさす。
【００１５】 本明細書において用いる場合、「治療タンパク質」という用語は、その存在が
個体に治療利益を与えるタンパク質をさすものとする。
【００１６】 本明細書において用いる場合、「代償タンパク質」という用語は、欠けた、欠
損のある、機能しないもしくは部分的に機能する内因性遺伝子に帰因する完全に
機能する内因的に生産されるタンパク質の欠如をその存在が補うタンパク質をさ
すものとする。 細胞への化合物の送達、免疫及び治療因子の送達方法 本発明は、共刺激分子を発現する細胞に化合物を導入する方法及びそのような
方法において有用な非細胞性粒子に関する。本発明の方法によれば、共刺激分子
を発現する細胞を、共刺激リガンドと組み合わせて化合物を含んでなる非細胞性
粒子と接触させる。粒子の共刺激リガンド成分は、共刺激分子を発現する細胞を
特異的に標的とする。粒子は細胞に結合し、それらにより取り込まれ、従って、
細胞中に化合物を送達する。
【００１７】 本発明のある態様によれば、個体を免疫する方法が提供される。そのような方
法は、免疫原性タンパク質もしくは免疫原性タンパク質をコードする核酸分子を
含んでなる非細胞性粒子を個体の体上のある部位で該個体の組織に投与するとい
う工程を含んでなる。粒子は共刺激リガンドをさらに含んでなる。粒子は細胞に
結合し、そしてそれらにより取り込まれ、従って、細胞中に免疫原性タンパク質
もしくは免疫原性タンパク質をコードする核酸分子を送達する。細胞に送達され
た免疫原性タンパク質に対して、もしくは免疫原性タンパク質をコードしそして
細胞により取り込まれそして細胞において発現される核酸分子の発現産物に対し
て免疫応答が起こる。
【００１８】 本発明は、ウイルス、原核生物及び病原性真核生物、例えば単細胞病原性生物
及び多細胞寄生虫のような全ての病原体に対して個体を免疫するために用いるこ
とができる。
【００１９】 本発明の別の態様は、過剰増殖性（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）
疾患に特有の過剰増殖細胞に対する広範囲に基づく（ｂｒｏａｄ ｂａｓｅｄ）
防御免疫応答を与える方法及び過剰増殖性疾患を患っている個体を処置する方法
を提供する。本明細書において用いる場合、「過剰増殖性疾患」という用語は、
細胞の過剰増殖を特徴とする疾患及び疾病をさすものとする。過剰増殖性疾患の
例には、全ての形態の癌及び乾癬が包含される。本発明は、過剰増殖性疾患を患
っている個体を処置する方法を提供する。そのような方法において、化合物は、
過剰増殖細胞により発現されるタンパク質に特異的な免疫応答に対する標的タン
パク質を提供する。本発明は、癌の数形態のうちの１つもしくはそれ以上に対し
て個体を免疫するために用いることができるが、本発明は、特定の癌を発症する
素因があるかもしくは癌にかかったことがあり従って再発しやすい個体を予防的
に免疫するために特に有用である。遺伝学及び技術並びに疫学における発展によ
り、個体における癌の発症の確率及び危険度評価の決定が可能である。遺伝子ス
クリーニング及び／もしくは家族の健康歴を用いて、数タイプの癌のうちいずれ
か一つを発症することに対して特定の個体が有する確率を予測することが可能で
ある。同様に、すでに癌を発症したことがある個体及び癌を取り除くために処置
されているかもしくはそうでなければ寛解期である個体は特にぶり返し及び再発
をしやすい。処置処方計画の一部として、そのような個体は、再発と闘うために
彼らがかかったと診断されている癌に対して免疫することができる。従って、個
体があるタイプの癌にかかっておりそして再発の危険にさらされていることがい
ったん分かれば、癌のあらゆる将来の出現と闘うように彼らの免疫系を準備する
ために免疫することができる。
【００２０】 本発明は、細胞受容体及び「自己」に向けられる抗体を産生する細胞を包含す
る自己免疫性と関連する標的に対する広範囲に基づく防御免疫応答を与えること
により自己免疫疾患及び疾病を患っている個体を処置する方法を提供する。
【００２１】 本発明のある態様によれば、個体に治療化合物を送達する方法が提供される。
そのような方法によれば、化合物は治療化合物である。ある態様として、化合物
は、治療タンパク質もしくは治療タンパク質をコードする核酸分子である。当該
方法は、治療タンパク質もしくは治療タンパク質をコードする核酸分子を含んで
なる非細胞性粒子を個体の体上のある部位で該個体の組織に投与するという工程
を含んでなる。粒子は共刺激リガンドをさらに含んでなる。粒子は細胞に結合し
、そしてそれらにより取り込まれ、従って、治療タンパク質もしくは治療タンパ
ク質をコードする核酸分子を細胞中に送達する。従って、治療タンパク質は細胞
に直接送達されるか、もしくはそれをコードしそして細胞に取り込まれる核酸分
子により細胞において生産される。
【００２２】 本発明のある態様は、遺伝子治療；すなわち、個体における欠損のある、欠け
た、機能しないもしくは部分的に機能する遺伝子に対応するか、または治療タン
パク質、すなわち、個体におけるその存在が個体における欠損を除きそして／も
しくはその存在が個体に治療効果を与えるタンパク質をコードするいずれかの遺
伝子の外来コピーの核酸分子を個体の細胞に導入し、それによりタンパク質投与
と別の手段によりタンパク質を送達する手段を与える組成物及び方法に関する。 化合物 本発明の方法により細胞に送達することができる化合物は任意の分子であるこ
とができる。ある態様として、化合物はＤＮＡもしくはＲＮＡのような核酸分子
である。ある態様として、化合物はペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質
のようなタンパク様分子である。
【００２３】 ある態様として、化合物はタンパク質分子である。ある態様として、化合物は
免疫原性タンパク質である。ある態様として、化合物は非免疫原性タンパク質分
子である。
【００２４】 免疫原性タンパク質の例には、病原体、抗原、タンパク様アレルゲン、癌細胞
と関連する免疫原性タンパク質及び自己免疫疾患に関与する細胞と関連する免疫
原性タンパク質が包含される。
【００２５】 病原体抗原は、ウイルス、原核生物及び病原性真核生物、例えば単細胞病原性
生物及び多細胞寄生虫のような全ての病原体から得ることができる。本発明は、
細胞に感染するそしてウイルス及び原核生物、例えば淋病、リステリア菌及び赤
痢菌のような包膜化されない病原体に対して個体を免疫するために特に有用であ
る。さらに、本発明はまた、細胞内病原体である生活周期の時期を含む原生動物
病原体に対して個体を免疫するためにも有用である。本明細書において用いる場
合、「細胞内病原体」という用語は、その生殖もしくは生活周期の少なくとも一
部で、宿主細胞内に存在しそしてその中で病原体タンパク質を生産するかもしく
は生産されるようにするウイルスもしくは病原性生物をさすものとする。表１は
、本発明によるワクチンを作ることができるウイルスの科及び属のいくつかのリ
ストを与える。表に記載する抗原のような病原体抗原上に展示されるエピトープ
と同一であるかもしくは実質的に同様である少なくとも一つのエピトープを含ん
でなるペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ構築物は、ワクチン
において有用である。さらに、本発明はまた、表２に記載するもののような原核
生物及び真核生物の原生動物病原体並びに多細胞寄生虫を包含する他の病原体に
対して個体を免疫するためにも有用である。表１及び２は、それらによる感染か
ら個体を防御するために遺伝子ワクチンを製造することができる病原性因子及び
生物のいくつかのリストを含む。ある好ましい態様として、病原体に対して個体
を免疫する方法は、ＨＩＶ、ＨＴＬＶもしくはＨＢＶに対して向けられる。
【００２６】 本明細書において用いる場合、「過剰増殖性関連タンパク質」という用語は、
過剰増殖性疾患と関連するタンパク質をさすものとする。過剰増殖性疾患に対し
て免疫するために、「過剰増殖性関連タンパク質」もしくは過剰増殖性疾患と関
連するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を、個体に
投与する粒子中の化合物として含む。過剰増殖性関連タンパク質が有効な免疫原
性標的であるためには、それは、正常な細胞と比較した場合に過剰増殖性細胞に
おいてのみもしくはより高いレベルで生産されるタンパク質でなければならない
。標的抗原には、そのようなタンパク質、そのフラグメント及びそのようなタン
パク質上に存在する少なくとも一つのエピトープを含んでなるペプチドが包含さ
れる。ある場合には、過剰増殖性関連タンパク質は、タンパク質をコードする遺
伝子の突然変異の産物である。突然変異した遺伝子は、それが正常なタンパク質
上に存在しない異なるエピトープをもたらすわずかに異なるアミノ酸配列を有す
ることを除いて、正常なタンパク質とほぼ同一であるタンパク質をコードする。
そのような標的タンパク質には、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎのような癌遺伝子並び
に転座遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋ及びＥ
ＧＲＦによりコードされるタンパク質であるものが包含される。標的抗原として
癌遺伝子産物に加えて、抗癌処置及び防御処方計画の標的タンパク質には、Ｂ細
胞リンパ腫により作られる抗体の可変領域及びＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の
可変領域が包含され、これらはまた、ある態様として、自己免疫疾患の標的抗原
としても用いられる。モノクローナル抗体１７−１Ａにより認識されるタンパク
質及び葉酸結合タンパク質（ｆｏｌａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
）を包含する腫瘍細胞により高いレベルで存在するタンパク質のような他の腫瘍
関連タンパク質を標的タンパク質として用いることができる。
【００２７】 Ｔ細胞性自己免疫疾患には、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ
）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インシュリン依存型糖尿病（ＩＤ
ＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋
炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ウェゲナー肉芽腫症、クローン病及び潰瘍性大腸
炎が包含される。これらの疾患の各々は、内因性抗原に結合しそして自己免疫疾
患と関連する炎症カスケードを開始するＴ細胞受容体を特徴とする。Ｔ細胞の可
変領域に対するワクチン接種は、これらのＴ細胞を除くためにＣＴＬを包含する
免疫応答を引き出すと思われる。
【００２８】 ＲＡでは、疾患に関与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のいくつかの特定の可変領
域が特性化されている。これらのＴＣＲには、Ｖβ−３、Ｖβ−１４、Ｖβ−１
７及びＶα−１７が包含される。従って、これらのタンパク質の一つもしくはこ
れらのタンパク質の少なくとも一つをコードするＤＮＡ構築物を化合物として含
有する粒子でのワクチン接種は、ＲＡに関与するＴ細胞を標的とする免疫応答の
発生をもたらす。Ｈｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０９２１−１０９２５；Ｐａ
ｌｉａｒｄ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３２５
−３２９；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｗ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：３２６−３３３を参照：これらの各々は、引用すること
により本明細書に組み込まれる。
【００２９】 ＭＳでは、疾患に関与するＴＣＲのいくつかの特定の可変領域が特性化されて
いる。これらのＴＣＲには、Ｖβ−７及びＶα−１０が包含される。従って、こ
れらのタンパク質の一つもしくはこれらのタンパク質の少なくとも一つをコード
するＤＮＡ構築物を化合物として含有する粒子でのワクチン接種は、ＭＳに関与
するＴ細胞を標的とする免疫応答の発生をもたらす。Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉ
ｇ，Ｋ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１０１６−
１０１９；Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎａｔｕ
ｒｅ ３４５：３４４−３４６を参照；これらの各々は、引用することにより本
明細書に組み込まれる。
【００３０】 強皮症では、疾患に関与するＴＣＲのいくつかの特定の可変領域が特性化され
ている。これらのＴＣＲには、Ｖβ−６、Ｖβ−８、Ｖβ−１４及びＶα−１６
、Ｖα−３Ｃ、Ｖα−７、Ｖα−１４、Ｖα−１５、Ｖα−１６、Ｖα−２８及
びＶα−１２が包含される。従って、これらのタンパク質の一つもしくはこれら
のタンパク質の少なくとも一つをコードするＤＮＡ構築物を化合物として含有す
る粒子でのワクチン接種は、強皮症に関与するＴ細胞を標的とする免疫応答の発
生をもたらす。
【００３１】 Ｔ細胞性自己免疫疾患、特にＴＣＲの可変領域がこれから特性化されなければ
ならないものを患っている患者を処置するために、滑液生検を行うことができる
。存在するＴ細胞のサンプルを採取し、そしてそれらのＴＣＲの可変領域を標準
的な技術を用いて同定することができる。この情報を用いて、疾患に対して免疫
するために有用な粒子を製造することができる。
【００３２】 Ｂ細胞性自己免疫疾患には、狼瘡（ＳＬＥ）、グレーブス病、重症筋無力症、
自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、喘息、クリオグロブリン血症
、原発性胆汁性硬化症及び悪性貧血が包含される。これらの疾患の各々は、内因
性抗原に結合しそして自己免疫疾患と関連する炎症カスケードを開始する抗体を
特徴とする。抗体の可変領域に対するワクチン接種は、該抗体を産生するＢ細胞
を除くためにＣＴＬを包含する免疫応答を引き出すと思われる。
【００３３】 Ｂ細胞性自己免疫疾患を患っている患者を処置するためには、自己免疫活性に
関与する抗体の可変領域を同定しなければならない。生検を行うことができ、そ
して炎症の部位に存在する抗体のサンプルを採取することができる。それらの抗
体の可変領域は、標準的な技術を用いて同定することができる。この情報を用い
て、そのような疾患に対して免疫するために有用な粒子を製造することができる
。
【００３４】 ＳＬＥの場合、一つの抗原はＤＮＡであると考えられる。従って、ＳＬＥに対
して免疫する患者において、それらの血清を抗−ＤＮＡ抗体についてスクリーニ
ングすることができ、そしてそれらの抗体の可変領域もしくは血清に存在するそ
のような抗−ＤＮＡ抗体の可変領域をコードするＤＮＡ構築物を含むワクチンを
製造することができる。
【００３５】 ＴＣＲ及び抗体の両方の可変領域間の共通の構造的特徴は周知である。特定の
ＴＣＲもしくは抗体をコードするＤＮＡ配列は、一般に、引用することにより本
明細書に組み込まれるＫａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．１９８７ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓ
ｔ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ
Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤに記述されているもののような周
知の方法に従って見出すことができる。さらに、抗体からの機能性可変領域をク
ローン化する一般法は、引用することにより本明細書に組み込まれるＣｈａｕｄ
ｈａｒｙ，Ｖ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１０６６に見出すことができる。
【００３６】 ある態様として、粒子中の化合物は、欠損のある、欠けたもしくは機能しない
遺伝子と関連する疾患を患っている個体における代償タンパク質として働くこと
ができる非免疫原性タンパク質である。あるいはまた、非免疫原性タンパク質は
治療タンパク質であることができる。ある態様として、粒子中の化合物は、１）
欠損のある、欠けたもしくは機能しない遺伝子の代償コピー；２）治療タンパク
質の遺伝子鋳型；３）アンチセンス分子の遺伝子鋳型；または４）リボザイムの
遺伝子鋳型として働く核酸分子である。タンパク質をコードする核酸分子の場合
、核酸分子は、好ましくは、動物の細胞における転写及び翻訳のために必要な調
節配列を含んでなる。アンチセンス分子及びリボザイムの鋳型として働く核酸分
子の場合、そのような核酸分子は、好ましくは、それによりそれぞれコードされ
るアンチセンス及びリボザイム分子の十分なコピーの生産のために必要な調節要
素に連結される。核酸分子はレトロウイルス粒子を含まず、そして好ましくはプ
ラスミドの形態のＤＮＡとして与えられる。
【００３７】 遺伝子治療に関する本発明の態様のあるものとして、遺伝子構築物は、代償遺
伝子もしくは治療タンパク質をコードする遺伝子のいずれかを含有する。代償遺
伝子の例には、ジストロフィンもしくは機能性フラグメントをコードする遺伝子
、嚢胞性繊維症を患っている患者における欠損遺伝子を補う遺伝子、インシュリ
ン、ＡＤＡを患っている患者における欠損遺伝子を補う遺伝子及び第ＶＩＩＩ因
子をコードする遺伝子が包含される。さらに、有毒物質に特異的に結合する一本
鎖抗体成分のような抗体をコードする遺伝子構築物を投与することができる。あ
る態様として、そのような細胞において発現される抗体を分泌することができる
。ある好ましい態様として、ジストロフィン遺伝子をミニ遺伝子の一部として与
え、そして筋ジストロフィーを患っている個体を処置するために用いる。ある好
ましい態様として、部分ジストロフィンタンパク質のコーディング配列を含有す
るミニ遺伝子を与える。ジストロフィン異常は、より軽いベッカー筋ジストロフ
ィー（ＢＭＤ）及び重いデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の両方を招く
。ＢＭＤでは、ジストロフィンは作られるが、それは大きさ及び／もしくは量の
いずれかが異常である。患者は、軽くないし適度に弱い。ＤＭＤでは、タンパク
質は作られず、患者は１３歳までに歩けなくなり、そして通常は２０歳までに死
亡する。ある患者、特にＢＭＤを患っているものでは、本発明により送達される
ミニ遺伝子の発現により生産される部分ジストロフィンタンパク質が改善された
筋肉機能を与えることができる。
【００３８】 治療タンパク質の例には、タンパク質自体並びにサイトカイン、増殖因子、ケ
モカイン及び毒素のような活性タンパク質をコードする遺伝子が包含される。あ
る態様として、タンパク質はエリスロポエチン、インターフェロン、ＬＤＬ受容
体、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４もしくはＴＮＦである。治療タンパク質
もしくは治療タンパク質をコードする核酸分子は、細胞に送達する化合物として
粒子に含むことができる。毒素またはそうでなければ細胞に対して有毒もしくは
細胞増殖抑制性である治療タンパク質は、例えば、リンパ球増殖性疾患（ｌｙｍ
ｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）にかかっている患者における抗原提示細胞
に送達する場合有用である。毒素に加えて、他の抗増殖性タンパク質は抗体、Ｈ
ＩＶ Ｖｐｒ及びＴＧＦβである。ＡＰＣ数を増やす治療タンパク質には、ＥＰ
Ｏ、ＣＳＦ及びＧＣＳＦのような増殖因子が包含される。免疫応答を調節するタ
ンパク質は、個体における免疫応答を調節するためにこのように細胞に送達する
ことができる。
【００３９】 アンチセンス分子及びリボザイムもまた、そのような活性因子のコピーの鋳型
として働く遺伝子物質を導入することにより個体の細胞に送達することができる
。これらの因子は、存在が有害であるタンパク質をコードする遺伝子の発現を不
活性化するかもしくはそうでなければ妨げる。アンチセンス分子をコードする配
列を含有する構築物は、細胞内のタンパク質の生産を阻害するかもしくは妨げる
ために用いることができる。従って、癌遺伝子産物のような生産タンパク質を除
くかもしくは減らすことができる。同様に、リボザイムは、メッセンジャーＲＮ
Ａがタンパク質に翻訳される前にそれを選択的に壊すことにより遺伝子発現を破
壊することができる。ある態様として、他の治療剤の投与及び処置を含む治療処
方計画の一部としてアンチセンスもしくはリボザイムをコードする構築物を用い
て本発明に従って細胞を処理する。アンチセンス分子及びリボザイムをコードす
る遺伝子構築物は、タンパク質へのＲＮＡの翻訳を開始するための開始コドンを
コーディング配列が含有しないことを除いて、タンパク質生産が所望される場合
に用いるものと同様のベクターを使用する。
【００４０】 リボザイムは、自己切断もしくは別のＲＮＡ分子の切断をすることができる触
媒性ＲＮＡである。ハンマーヘッド、ヘアピン、テトラヒメナＩ群イントロン、
アクスヘッド（ａｘｈｅａｄ）及びＲＮアーゼＰのようないくつかの異なるタイ
プのリボザイムが当該技術分野において既知である。（Ｓ．Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ
，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９２ １０，２５６−２６２。）ハンマー
ヘッドリボザイムは、４０ヌクレオチド未満のコアに位置付けられている触媒部
位を有する。植物ウイロイド及びサテライトＲＮＡにおけるいくつかのリボザイ
ムは、共通の二次構造及びある種の保存されたヌクレオチドを共有する。これら
のリボザイムは生来それら自体の基質として働くが、保存された切断部位に隣接
する配列との塩基対合により別のＲＮＡ基質に酵素ドメインを向けることができ
る。このようにリボザイムをあつらえて設計できることは、それらを配列特異的
ＲＮＡ切断に用いることを可能にしている（Ｇ．Ｐａｏｌｅｌｌａ ｅｔ ａｌ
．，ＥＭＢＯ １９９２，１９１３−１９１９）。従って、ハンマーヘッド触媒
配列のような様々なタイプのリボザイムから異なる触媒配列を使用しそして本明
細書において開示するようにそれらを設計することは当業者にとって可能である
。リボザイムは、病原体ヌクレオチド配列及び腫瘍形成配列を包含する様々な標
的に対して設計することができる。本発明のある好ましい態様は、切断反応の効
率を保ちながらａｂｌ−ｂｃｒ融合転写産物を特異的に標的とするために十分な
相補性を含む。
【００４１】 ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、天然の供給源から単離するか、合
成するかもしくは組換え方法論により製造することができる。
【００４２】 本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる組換え発現ベ
クターは、慣例的に製造することができる。本明細書において用いる場合、「組
換え発現ベクター」という用語は、適切な宿主に導入する場合にコーディング配
列の発現を導くために必要な遺伝子要素を含有するプラスミド、ファージ、ウイ
ルス粒子もしくは他のベクターをさすものとする。当業者は、標準的な技術及び
容易に入手できる出発原料を用いて、本発明のタンパク質をコードする核酸分子
を単離もしくは合成し、そしてそれを発現ベクターに挿入することができる。コ
ーディング配列は、必要な調節配列に操作可能に連結される。発現ベクターは周
知であり、そして容易に入手できる。発現ベクターの例には、プラスミド、ファ
ージ、ウイルスベクター及び他の核酸分子もしくは宿主細胞を形質転換しそして
コーディング配列の発現を促進するために有用な核酸分子含有媒体が包含される
。本発明の組換え発現ベクターは、宿主を形質転換するために有用である。
【００４３】 組換え発現ベクターを含んでなる宿主細胞は、タンパク質を製造するために用
いることができる。タンパク質の製造のための周知の組換え発現系において使用
する宿主細胞は周知であり、そして容易に入手できる。宿主細胞の例には、エシ
ェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞、サッカロミセス・セレビシ
エ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母細胞、スポドプテラ・フルギペル
ダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のような昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵
巣（ＣＨＯ）細胞のような非ヒト哺乳動物組織培養細胞及びＨｅＬａ細胞のよう
なヒト組織培養細胞が包含される。
【００４４】 ある態様として、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、周知の発現系にお
いて使用する市販されている発現ベクターにＤＮＡ分子を挿入することができる
。例えば、市販されているプラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓ
ａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、エシェリキア・コリにおけるＣＤ８０ΔＣ突然変
異体タンパク質の製造に用いることができる。市販されているプラスミドｐＹＥ
Ｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、例えば、酵母の
サッカロミセス・セレビシエ株における製造に用いることができる。市販されて
いるＭＡＸＢＡＣTM完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、例えば、昆虫細胞における製造に用いることができ
る。市販されているプラスミドｐｃＤＮＡ１もしくはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、例えば、チャイニーズハムスター
卵巣細胞のような哺乳動物細胞における製造に用いることができる。当業者は、
慣例的技術及び容易に入手できる出発原料を用いて本発明のタンパク質を製造
するためにこれらの市販されている発現ベクター及び系等を用いることができる
。（例えば、引用することにより本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照）。従って、所望のタンパク質を原核生物及び
真核生物の両方の系において製造し、多様なプロセシングされた形態のタンパク
質をもたらすことができる。
【００４５】 当業者は、他の市販されている発現ベクター及び系を用いるかもしくは周知の
方法及び容易に入手できる出発原料を用いてベクターを製造することができる。
プロモーター及びポリアデニル化シグナル及び好ましくはエンハンサーのような
必要な制御配列を含有する発現系は、容易に入手でき、そして様々な宿主につい
て当該技術分野において既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．
，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓ
ｓ（１９８９）を参照。
【００４６】 タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを用いて適合する宿主を形
質転換し、次にこれを外来ＤＮＡの発現が起こる条件下で培養し、維持する。こ
のようにして製造する本発明のタンパク質は、適宜そして当業者に既知であるよ
うに細胞を溶解することによるかもしくは培養培地からのいずれかで培養物から
回収する。当業者は、周知の技術を用いて、そのような発現系を用いて製造され
る本発明のタンパク質を単離することができる。そのようなタンパク質に特異的
に結合する抗体を用いて天然の供給源から本発明のタンパク質を精製する方法は
、そのような抗体を作製する方法と同様に慣例的である（引用することにより本
明細書に組み込まれるＨａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｅ．，Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８８，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照）。そ
のような抗体は、組換えＤＮＡ方法論もしくは天然の供給源により生産されるタ
ンパク質を精製するために用いることができる。
【００４７】 遺伝子構築物の例は、本発明のタンパク質をコードしそして構築物をトランス
フェクションする細胞系において機能するプロモーターに操作可能に連結される
コーディング配列を含む。構成的プロモーターの例には、サイトメガロウイルス
もしくはＳＶ４０からのプロモーターが包含される。誘導性プロモーターの例に
は、マウス乳腺白血病ウイルスもしくはメタロチオネインプロモーターが包含さ
れる。当業者は、容易に入手できる出発原料から本発明のタンパク質をコードす
るＤＮＡで細胞をトランスフェクションするために有用な遺伝子構築物を容易に
製造することができる。
【００４８】 また、組換え技術により本発明のタンパク質を製造することに加えて、本発明
のタンパク質を製造するために自動ペプチド合成機を用いることもできる。その
ような技術は当業者に周知であり、そして置換を有する誘導体が、ＤＮＡにより
コードされるタンパク質製造において与えられない場合に有用である。
【００４９】 本発明のタンパク質は、以下の既知の技術のいずれかにより製造することがで
きる。都合よく、本発明のタンパク質は、引用することにより本明細書に組み込
まれるＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄによりＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１５：２１
４９−２１５４（１９６３）に最初に記述されている固相合成技術を用いて製造
することができる。他のタンパク質合成技術は、例えば、引用することにより本
明細書に組み込まれるＭ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ｅｔ ａｌ．，（１９７６）Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２
ｄ Ｅｄ．；引用することにより本明細書に組み込まれるＫｅｎｔ ａｎｄ Ｃ
ｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐ．２９５−３５８，ｅｄｓ．Ａｌｉｔ
ａｌｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（Ａｍｓ
ｔｅｒｄａｍ，１９８５）；並びに当業者に既知である他の参考文献研究に見出
すことができる。合成技術の要約は、引用することにより本明細書に組み込まれ
るＪ．Ｓｔｕａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｌｉａ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８４）に見出すことができる。引用
することにより本明細書に組み込まれるＴｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．Ｉ
Ｉ，３ｒｄ Ｅｄ．，ｐ．１０５−２３７，Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．
，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９７
６）に記述されているような、溶液法による合成もまた用いることができる。そ
のような合成において使用する適切な保護基は、上記の指定図書並びに引用する
ことにより本明細書に組み込まれるＪ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔ
ｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅｎ
ｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９７３）に見出される。
【００５０】 一般に、これらの合成方法は、生長するペプチド鎖への１個もしくはそれ以上
のアミノ酸残基もしくは適当な保護されたアミノ酸残基の順次付加を含む。通常
、一番目のアミノ酸残基のアミノもしくはカルボキシル基のいずれかを適当な選
択的に除去できる保護基により保護する。リシンのような反応性側基を含有する
アミノ酸には、異なる選択的に除去できる保護基を利用する。
【００５１】 例として固相合成を用いて、保護もしくは誘導化されたアミノ酸をその保護さ
れていないカルボキシルもしくはアミノ基により不活性固体支持体に連結する。
次いでアミノもしくはカルボキシル基の保護基を選択的に取り除き、そして適当
に保護された相補的（アミノもしくはカルボキシル）基を有する配列の次のアミ
ノ酸を混合し、そして固体支持体にすでに連結している残基と反応させる。次い
でこの新たに付加したアミノ酸残基からアミノもしくはカルボキシル基の保護基
を取り除き、そして次いで（適当に保護された）次のアミノ酸を付加する、等々
。全ての所望のアミノ酸が適切な配列で連結された後、あらゆる残っている末端
及び側基保護基（及び固体支持体）を順次もしくは同時に取り除いて、最終ペプ
チドを与える。本発明のペプチドは、好ましくは、ベンジル化もしくはメチルベ
ンジル化アミノ酸を有さない。そのような保護基部分は、合成の間に用いること
ができるが、それらはペプチドを用いる前に取り除かれる。分子内結合を形成し
て構造を拘束するためには、他の所で記述されているように、追加の反応が必要
であり得る。
【００５２】 ある態様として、タンパク質はトランスジェニック動物において製造すること
ができる。組換えタンパク質を製造するために有用なトランスジェニック非ヒト
哺乳動物は、必要な発現ベクター及びトランスジェニック動物を作製する技術と
同様に周知である。一般に、トランスジェニック動物は、タンパク質をコードす
るヌクレオチド配列が乳腺細胞特異的プロモーターに操作可能に連結される組換
え発現ベクターを含んでなり、それによりコーディング配列は乳腺細胞において
のみ発現され、そしてそのように発現される組換えタンパク質は動物の乳汁から
回収される。当業者は、両方とも引用することにより本明細書に組み込まれる、
Ｗａｇｎｅｒに１９８９年１０月１０日に発行された米国特許第４，８７３，１
９１号及びＬｅｄｅｒに１９８８年４月１２日に発行された米国特許第４，７３
６，８６６号に教示されているもののような標準的な技術を用いて、所望のタン
パク質を生産するトランスジェニック動物を製造することができる。好ましい動
物はヤギ及びげっ歯類、特にラット及びマウスである。
【００５３】 ある態様として、化合物は核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子である。ある態様
として、核酸分子はアンチセンス分子であり、これは細胞により取り込まれると
、細胞における遺伝子の発現を妨げるかもしくはそうでなければ阻害する。ある
態様として、核酸分子は、細胞における核酸分子の遺伝子発現のために必要な調
節要素に操作可能に連結されたコーディング配列を含有する遺伝子構築物である
。
【００５４】 コーディング配列に加えて、遺伝子構築物の要素には、プロモーター、開始コ
ドン、終止コドン及びポリアデニル化シグナルが包含される。さらに、タンパク
質をコードする配列の遺伝子発現にはたいていエンハンサーが必要とされる。こ
れらの要素は所望のタンパク質をコードする配列に操作可能に連結されること及
び調節要素はそれらを投与する個体において操作可能であることが必要である。
【００５５】 開始コドン及び終止コドンは、一般に、所望のタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列の一部であると考えられる。しかしながら、これらの要素は、遺伝子
構築物を投与する個体において機能することが必要である。開始及び終止コドン
は、コーディング配列とインフレームでなければならない。
【００５６】 使用するプロモーター及びポリアデニル化シグナルは、個体の細胞内で機能し
なければならない。
【００５７】 特にヒトの遺伝子ワクチンの製造において、本発明を実施するために有用なプ
ロモーターの例には、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺癌ウイル
ス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の長い末端反復
（ＬＴＲ）プロモーターのようなＨＩＶ、モロニーウイルス、ＡＬＶ、サイトメ
ガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターのようなＣＭＶ、エプスタイン・バ
ーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）からのプロモーター並び
にヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びヒ
トメタロチオネインのようなヒト遺伝子からのプロモーターが包含されるがこれ
らに限定されるものではない。
【００５８】 特にヒトの遺伝子ワクチンの製造において、本発明を実施するために有用なポ
リアデニル化シグナルの例には、ヒト及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグ
ナ ル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びＬＴＲポリアデニル化シグナルが
包含されるがこれらに限定されるものではない。特に、ＳＶ４０ポリアデニル化
シグナルと呼ばれる、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中であるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを用いる。
【００５９】 ＤＮＡ発現のために必要とされる調節要素に加えて、他の要素もまたＤＮＡ分
子中に含むことができる。そのような追加の要素には、エンハンサーが包含され
る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋
肉クレアチン並びにＣＭＶ、ＲＳＶ及びＥＢＶからのもののようなウイルスエン
ハンサーが包含されるがこれらに限定されるものではない群から選択することが
できる。
【００６０】 本発明の遺伝子構築物には、細胞において構築物を染色体外で維持しそして構
築物の多数のコピーを生産するために哺乳動物の複製起点を与えることができる
。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのプラスミドｐＣＥ
Ｐ４及びｐＲＥＰ４は、エプスタイン・バーウイルス複製起点及び組込みなしに
高コピーエピソーム複製を起こす核抗原ＥＢＮＡ−１コーディング領域を含有す
る。
【００６１】 免疫用途に関するある好ましい態様として、免疫原性タンパク質及びさらにそ
のような標的タンパク質に対する免疫応答をさらに高めるタンパク質の遺伝子を
コードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（一つもしくは複数）を送達する。
そのような遺伝子の例は、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小
板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＧＣ−ＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、上皮増殖因
子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１
０、ＩＬ−１２及びＢ７．２のようなサイトカイン及びリンホカインをコードす
るものである。
【００６２】 タンパク質生産を最大にするために、構築物を投与する細胞における遺伝子発
現のためによく適している調節配列を選択することができる。さらに、細胞にお
いて最も効率よく転写されるコドンを選択することができる。当業者は、細胞に
おいて機能するＤＮＡ構築物を製造することができる。
【００６３】 ある態様として、化合物はＤＮＡ分子である。ある態様として、化合物は、プ
ラスミドであるＤＮＡ分子である。ある態様として、化合物は、細胞において機
能する調節要素に操作可能に連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配
列を含んでなるＤＮＡ分子である。ある態様として、化合物は、細胞において機
能する調節要素に操作可能に連結された免疫原性タンパク質を含んでなるＤＮＡ
分子である。ある態様として、化合物は、細胞において機能する調節要素に操作
可能に連結された免疫原性病原体タンパク質を含んでなるＤＮＡ分子である。あ
る態様として、化合物は、細胞において機能する調節要素に操作可能に連結され
た非免疫原性タンパク質を含んでなるＤＮＡ分子である。
【００６４】 ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５９３，９７２号、米国特許第５，５８９
，４６６号、ＰＣＴ／ＵＳ９０／０１５１５、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０２３３８、
ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４８１３１及びＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９、並びにこ
れらの特許及び公開特許出願の各々の中に引用される優先出願に記述されており
、これらは各々が引用することにより本明細書に組み込まれる。これらの出願に
記述されている送達プロトコルに加えて、ＤＮＡを送達する別の方法は米国特許
第４，９４５，０５０号及び第５，０３６，００６号に記述されており、これら
は両方とも引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００６５】 ある態様によれば、化合物は、化合物をウイルス粒子中にパッケージングする
ために働くウイルス配列を含むタンパク質である。ある態様として、ウイルス配
列はウイルスタンパク質である。ある態様として、ウイルス配列は、ウイルス粒
子の組み立てにおいて他のウイルスタンパク質と複合体を形成する能力を保持す
るウイルスタンパク質のフラグメントである。ある態様として、粒子はＨＩＶ粒
子であり、そして化合物はＨＩＶ Ｖｐｒタンパク質の配列を含む融合タンパク
質である。ＨＩＶ Ｖｐｒタンパク質の配列を含む融合タンパク質は、ＨＩＶ粒
子中にパッケージングされる。非細胞性粒子 本発明のこれらの態様による非細胞性粒子には、ウイルス粒子、タンパク質複
合体、リポソーム及び陽イオン両親媒性物質／ＤＮＡ複合体が包含されるがこれ
らに限定されるものではない。本発明によれば、そのような非細胞性粒子は、粒
子により展示される共刺激分子リガンドもしくは融合タンパク質に結合する共刺
激分子を展示する細胞に粒子を向けるために共刺激分子リガンドもしくは共刺激
分子リガンド部分を含む融合タンパク質を含む。共刺激分子を展示する細胞への
局在のために細胞に粒子を送達することに加えて、共刺激分子を展示する細胞に
送達されそして局在する本発明による粒子は、細胞により取り込まれることが見
出されている。
【００６６】 本発明のある態様によれば、粒子はウイルス粒子である。好ましい態様として
、粒子は非複製ウイルス粒子である。引用することにより本明細書に組み込まれ
る米国特許第５，７１４，３１６号は、ウイルス粒子エンベロープ上に異種起源
のタンパク質配列を展示するウイルス粒子の設計及び製造を記述している。本発
明は、異種起源のタンパク質として共刺激分子リガンドもしくは共刺激分子リガ
ンド部分を含む融合タンパク質のいずれかを与えることによりこの技術に改善を
もたらす。ある態様として、粒子は、好ましくは複製しない、ＨＩＶ、ＨＳＶ、
ＨＣＶもしくはパピローマウイルス粒子である。
【００６７】 本発明によるウイルス粒子の例には、非複製ＨＩＶ粒子、アデノウイルス粒子
及びアデノウイルス様粒子が包含される。非複製ウイルスは、パッケージング細
胞系を用いて製造される。パッケージング系は、引用することにより本明細書に
組み込まれる以下の米国特許の各々に記述されている：５，９３２，４６７、５
，９５２，２２５、５，９３２，４６７、５，９２８，９１３、５，９１９，６
７６、５，９１２，３３８、５，８８８，７６７、５，８７２，００５、５，８
６６，４１１、５，８４３，７２３、５，８３４，２５６、５，７５３，５００
、５，７３９，０１８、５，７３６，３８７、５，７２３，２８７、５，７１６
，８３２、５，７１０，０３７、５，６９３，５３１、５，６７２，５１０、５
，６６５，５７７、５，６２２，８５６、５，５８７，３０８及び５，５８５，
２５４。
【００６８】 ある態様によれば、粒子は、共刺激分子を発現する細胞を標的とするために共
刺激リガンドを与えることにより改善される弱毒化ワクチンである。前臨床もし
くは臨床の前市場試験を受けているもののような現在調べられているものを包含
する市販されている弱毒化ワクチンのいずれも本発明により改善することができ
る。
【００６９】 本発明のある態様によれば、粒子はリポソーム粒子である。引用することによ
り本明細書に組み込まれる米国特許第４，８７３，０８９号、第５，２２７，４
７０号及び第５，２５８，４９９号は、リポソームの表面上のタンパク質に特異
的に結合する細胞タンパク質を表面上に有する細胞にリポソームを向けるために
表面上に展示されるタンパク質を含有するリポソームを製造する方法を記述して
いる。本発明は、受容体リガンドとして共刺激分子リガンドもしくは共刺激分子
リガンド部分を含む融合タンパク質のいずれかを与えることによりこの技術の特
定の用途を提供する。リポソームには、正荷電を有する、負荷電を有する及び荷
電していないリポソームが包含される。
【００７０】 本発明のある態様によれば、粒子は陽イオン両親媒性物質／ＤＮＡ複合体であ
る。引用することにより各々が本明細書に組み込まれる米国特許第５，８３７，
５３３号、第５，４５９，１２７号及びＢｅｈｒ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１
９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６９８２−６
９８６は、正に荷電した親油性化合物に受容体リガンドを与える、受容体を標的
とする陽イオン両親媒性物質／ＤＮＡ複合体の設計及び製造を記述している。陽
イオン両親媒性物質化合物は、陽イオン両親媒性物質をＤＮＡと混合すると生じ
る複合体の表面上に展示される受容体リガンド部分を含有する。そのような教示
はまた、引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許第５，９５５，３
６５号、第５，９４８，７６７号、第５，９４５，４００号、第５，９３９，４
０１号、第５，９３５，９３６号、第５，９３２，２４１号、第５，９２５，６
２８号、第５，９１６，８０３号、第５，９１０，４８８号、第５，９０８，６
３５号、第５，８９１，４６８号、第５，８８５，６１３号、第５，８３０，４
３０号、第５，８２７，７０３号、第５，７８３，５６５号及び第５，７６７，
０９９号に記述されているもののような陽イオン脂質／ＤＮＡ複合体に適用する
こともできる。ある態様として、受容体リガンド部分はいかなる分子にも連結さ
れないかもしくは荷電していない脂質に連結され、それらは陽イオン両親媒性物
質及びＤＮＡと混合され、そしてそれにより生じる任意の複合体に導入される。
本発明によれば、共刺激分子リガンドである受容体リガンドを陽イオン両親媒性
物質／ＤＮＡ複合体に与える。そのような複合体は、共刺激分子を展示する細胞
に向かう。複合体はそれらの細胞に局在し、そしてそれらにより取り込まれる。
【００７１】 本発明のある態様によれば、粒子は、２つもしくはそれ以上のタンパク質分子
を含んでなるタンパク質複合体である。タンパク質複合体は、送達する化合物及
び共刺激リガンドを含んでなる。細胞 本発明は、共刺激分子を発現する細胞に化合物を送達する方法を提供する。典
型的には、共刺激分子を発現する細胞は抗原提示細胞である。ある態様として、
当該方法は、樹状細胞である共刺激分子を発現する細胞に化合物を送達すること
に関する。ある態様として、当該方法は、マクロファージ細胞である共刺激分子
を発現する細胞に化合物を送達することに関する。
【００７２】 これらの細胞に免疫原を送達することにより、免疫応答を起こすことができる
。これらの細胞に免疫応答を調節する治療タンパク質を送達することにより、免
疫応答を調節することができる。これらの細胞に毒素を送達することにより、免
疫応答を減らすことができる。これらの細胞に増殖因子を送達することにより、
免疫応答を高めることができる。リガンド 共刺激リガンドは、共刺激分子に特異的に結合する分子である。ある態様とし
て、共刺激リガンドはタンパク質、好ましくは抗−共刺激分子抗体、共刺激分子
に特異的な天然のリガンド、または抗−共刺激分子抗体、天然のリガンドもしく
はその機能性フラグメントのいずれかを含んでなる融合タンパク質である。
【００７３】 抗−共刺激分子抗体は、慣例的技術を用いて容易に入手できる出発原料から製
造することができる。ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＩＣＯＳＬ、ＩＣＡＭ−
１、４１ＢＢ、ＭＣＳＦＲ、ＦＬＴ３、ＣＣＲ−５、ＣＣＲ−３及びＣＣＲ−２
に対する抗体は、それぞれＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＩＣＯＳＬ、ＩＣＡ
Ｍ−１、４１ＢＢ、ＭＣＳＦＲ、ＦＬＴ３、ＣＣＲ−５、ＣＣＲ−３及びＣＣＲ
−２を発現する細胞に粒子を向けるために本発明の粒子において用いることがで
きる。
【００７４】 あるいはまた、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＩＣＯＳＬ、ＩＣＡＭ−１、
４１ＢＢ、ＭＣＳＦＲ、ＦＬＴ３、ＣＣＲ−５、ＣＣＲ−３及びＣＣＲ−２の天
然のリガンドは、それぞれＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＩＣＯＳＬ、ＩＣＡ
Ｍ−１、４１ＢＢ、ＭＣＳＦＲ、ＦＴ３、ＣＣＲ−５、ＣＣＲ−３及びＣＣＲ−
２を発現する細胞に粒子を向けるために共刺激リガンドとして与えることができ
る。天然のリガンドには：両方ともＣＤ８０の天然のリガンドであるＣＤ２８及
びＣＴＬＡ−４；ＣＤ８６の天然のリガンド、ＣＤ２８；ＣＤ４０の天然のリガ
ンド、ＣＤ４０Ｌ；ＩＣＯＳＬの天然のリガンド、ＩＣＯＳ；ＩＣＡＭ−１の天
然のリガンド、ＬＦＡ−３；４１ＢＢの天然のリガンド、４１ＢＢＬ；ＭＣＳＦ
Ｒの天然のリガンド、ＭＣＳＦ；ＦＬＴ３の天然のリガンド、ＦＬ３Ｌ；ＣＣＲ
−５、ＣＣＲ−３及びＣＣＲ−２の天然のリガンド、ＭＣＰ３及びＲＡＮＴＥＳ
が包含される。これらのタンパク質を製造するかもしくはそうでなければ得る方
法は周知である。
【００７５】 ある態様として、共刺激リガンドは、共刺激リガンド部分を含む融合タンパク
質である。ある態様として、共刺激リガンド部分は抗−共刺激分子抗体である。
ある態様として、共刺激リガンド部分は完全な天然の共刺激リガンド分子である
。ある態様として、共刺激リガンド部分は、共刺激分子に結合する能力を保持す
る天然の共刺激リガンド分子のフラグメントである。
【００７６】 ある態様として、共刺激リガンドは、粒子の組立てにおいて機能を果たすかも
しくは粒子上に融合タンパク質を局在化することに関与するアミノ酸配列を含ん
でなる融合タンパク質である。例えば、ある態様として、融合タンパク質はさら
に、融合タンパク質がウイルス粒子の一部になるように粒子の組立てにおいて機
能を果たすウイルスタンパク質配列を含んでなる。ある態様として、共刺激リガ
ンドは、共刺激リガンド部分及びウイルスタンパク質部分を含む融合タンパク質
である。ある態様として、ウイルスタンパク質部分は完全なウイルスタンパク質
分子である。ある態様として、ウイルスタンパク質部分は、ウイルスタンパク質
のフラグメントである。ある態様として、ウイルスタンパク質部分は、機能性共
刺激リガンド部分に連結されたウイルスタンパク質の内部ドメイン及び膜貫通領
域を含んでなるウイルスタンパク質のフラグメントである。ある態様として、融
合タンパク質は、細胞へのウイルス侵入を招くウイルスタンパク質の部分からな
る。ある態様として、融合タンパク質は、共刺激分子の天然のリガンドの細胞外
領域に連結されたウイルスタンパク質の内部ドメイン、膜貫通領域及び５−２０
アミノ酸の外部領域からなる。
【００７７】 ある態様として、ウイルスタンパク質部分は、ＨＩＶのようなレンチウイルス
から、黄熱病ウイルス、Ｃ型肝炎、ＪＥＶ、西ナイル川ウイルスもしくはＥ型肝
炎のようなフラビウイルスから、アビポックス、鶏痘、ワクシニア、ＭＶＡもし
くはＷＲのようなポックスウイルスから得られる。ある態様として、ウイルスタ
ンパク質部分は、インフルエンザ、ロタウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬
病ウイルスから得られる。ある態様として、ウイルスタンパク質部分は、ＨＩＶ
ｇｐ４１、ＨＳＶ ｇＤ、ＨＳＶ ｇＣ、ＨＳＶ ｇＩ、ＨＣＶ Ｅ１、パピロー
マウイルスＬ１及びパピローマウイルスＬ２よりなる群から選択される。ある態
様として、ウイルスタンパク質部分は、フラビウイルスＥもしくはＭタンパク質
、ポックスウイルスＥもしくはＭタンパク質、ロタウイルスＧタンパク質、狂犬
病ウイルスＧタンパク質、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質及びＣＭＶ
ＧＢタンパク質よりなる群から選択される。重要なことには、ウイルスタンパク
質部分は、粒子が組み立てられる場合にウイルス粒子内で組み立てられるために
十分なウイルス配列を含有しなければならない。融合タンパク質のウイルス配列
は、ウイルス粒子中に含まれるようになるようにウイルスタンパク質と相互作用
する。
【００７８】 ある態様として、ウイルス粒子は、融合タンパク質及び野生型エンベロープタ
ンパク質の両方を含有する。ある態様として、ウイルス粒子は野生型エンベロー
プタンパク質を含まない。
【００７９】 ある態様として、融合タンパク質は、１５−３０アミノ酸、好ましくは約２２
アミノ酸のリンカーにより連結される２つの共刺激リガンド部分を含む２つもし
くはそれ以上の共刺激リガンド部分を含んでなる。そのような融合タンパク質は
、標的設定（ｔａｒｇｅｔｅｄ）リポソームを製造することにおいて特に有用で
ある。重複する共刺激リガンド部分は、Ｎ末端〜Ｃ末端、リンカー、Ｎ末端〜Ｃ
末端を続けることができ、これは、融合タンパク質を組換え手段により製造する
ことを可能にするので特に有用である。ある態様として、方式はＮ末端〜Ｃ末端
、リンカー、Ｃ末端〜Ｎ末端である。ある態様として、方式はＣ末端〜Ｎ末端、
リンカー、Ｎ末端〜Ｃ末端である。ある態様として、方式はＣ末端〜Ｎ末端、リ
ンカー、Ｃ末端〜Ｎ末端である。
【００８０】 ある態様として、融合タンパク質は、疎水性尾部に連結された１つもしくはそ
れ以上の共刺激リガンド部分を含んでなる。
【００８１】 ある態様として、融合タンパク質は、ポリリシン尾部のようなポリカチオン性
尾部に連結された１つもしくはそれ以上の共刺激リガンド部分を含んでなる。
【００８２】 ある態様として、融合タンパク質は、送達するタンパク質と複合体を形成する
第二の部分に連結された共刺激リガンド部分を含んでなる。そのような態様とし
て、共刺激リガンド部分は化合物と直接複合体を形成する。方法論及び組成物 本発明の方法は、個体の組織に非細胞性粒子を投与するという工程を含んでな
る。ある好ましい態様として、非細胞性粒子は、筋肉内、鼻内、腹腔内、皮下、
皮内、静脈内、肺組織へのエアロゾル投与により、または膣、直腸、尿道、頬及
び舌下よりなる群から選択される粘膜組織に局所的にもしくは洗浄により投与さ
れる。
【００８３】 本発明の一つの態様は、本発明の方法において有用な製薬学的組成物に関する
。製薬学的組成物は、化合物及び共刺激分子もしくは融合タンパク質を含んでな
る非細胞性粒子を含んでなる。製薬学的組成物はさらに、製薬学的に許容しうる
担体もしくは希釈剤を含んでなる。「製薬」という用語は周知であり、そして当
業者により一般に理解される。本明細書において用いる場合、「製薬学的組成物
」及び「注入可能な製薬学的組成物」という用語は、当業者により理解されるよ
うなそれらの通常の意味を有するものとする。製薬学的組成物は、滅菌、発熱物
質、粒状物質並びに等張性及びｐＨに関する特定の基準を満たすことが必要とさ
れる。例えば、注入可能な製薬は、無菌でありそして発熱物質を含まない。
【００８４】 本発明による製薬学的組成物が、化合物として核酸分子を含む非細胞性粒子を
含んでなる態様として、組織に約１ｎｇ〜約１０，０００μｇの核酸を導入する
ために十分な量の非細胞性粒子を投与する。ある好ましい態様として、製薬学的
組成物は、約２０００μｇ、３０００μｇ、４０００μｇもしくは５０００μｇ
のＤＮＡを含有する。ある好ましい態様として、製薬学的組成物は約１０００μ
ｇのＤＮＡを含有する。ある好ましい態様として、製薬学的組成物は約１０ｎｇ
〜約８００μｇのＤＮＡを含有する。ある好ましい態様として、製薬学的組成物
は約０．１〜約５００μｇのＤＮＡを含有する。ある好ましい態様として、製薬
学的組成物は約１〜約３５０μｇのＤＮＡを含有する。ある好ましい態様として
、製薬学的組成物は約２５〜約２５０μｇのＤＮＡを含有する。ある好ましい態
様として、製薬学的組成物は約１００μｇのＤＮＡを含有する。
【００８５】 本発明による製薬学的組成物は、用いる投与の形態に従って調合される。当業
者は、遺伝子構築物を含んでなるワクチンもしくは非免疫原性治療剤を容易に調
合することができる。筋肉注射が選択した投与形態である場合、好ましくは等張
製剤を用いる。一般に、等張性のための添加剤には、塩化ナトリウム、デキスト
ロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを包含することができる。
ある場合には、リン酸緩衝食塩水のような等張溶液が好ましい、安定剤には、ゼ
ラチン及びアルブミンが包含される。ある態様として、血管収縮剤を製剤に加え
る。本発明による製薬学的調製物は、無菌であり且つ発熱物質を含まずに提供さ
れる。本発明による製薬学的組成物は、例えば食塩水のような製薬学的に許容し
うる担体もしくは賦形剤をさらに含んでなる核酸分子と組み合わせて送達成分を
含む。核酸の成功した送達を可能にする任意の媒質を用いることができる。当業
者は、本発明において用いることができる多数の製薬学的に許容しうる媒質を容
易に理解する。適当な製薬学的担体は、引用することにより本明細書に組み込ま
れる、この分野における標準的な参考指定図書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌに記述されて
いる。
【００８６】 本発明の製薬学的組成物は、活性因子が哺乳動物の体における該因子の作用部
位に到達することを可能にする任意の手段により投与することができる。本発明
の製薬学的組成物は、局所もしくは全身処置が所望されるかどうか及び処置する
部位により多数の方法で投与することができる。投与は、局所（眼、膣、直腸、
鼻内、経皮を包含する）、経口もしくは非経口であることができる。ペプチドは
経口的に投与すると消化を受けるので、経口製剤は、活性因子を溶腸的に被覆す
るかもしくはそうでなければ（前中和（ｐｒｅｎｕｅｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）
のような）胃における分解からそれを保護するように調合する。非経口投与には
、静脈内点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉注射、例えば吸入もしくはガス注入に
よる肺投与、または鞘内もしくは室内投与が包含される。好ましい態様として、
非経口投与、すなわち、静脈内、皮下、経皮、筋肉内は、通常、吸収を最適にす
るために用いる。静脈内投与は、注入ポンプの助けをかりて成し遂げることがで
きる。本発明の製薬学的組成物は、乳剤として調合することができる。
【００８７】 当業者は、本発明において用いることができる多数の製薬学的に許容しうる媒
質を容易に理解する。適当な製薬学的担体は、引用することにより本明細書に組
み込まれる、この分野における標準的な参考指定図書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ
’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌに記述
されている。局所投与のための製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリ
ーム、ゲル、滴薬、座薬、スプレー、液体及び粉末を包含することができる。通
常の製薬学的担体、水性、粉末もしくは油状の基剤、増粘剤等は、必要であるか
もしくは望ましいことがある。経口投与のための組成物には、散剤もしくは顆粒
剤、水もしくは非水性媒質中の懸濁剤もしくは液剤、カプセル剤、サッシェまた
は錠剤が包含される。増粘剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散助剤もしくは結合剤
が望ましいことがある。非経口、静脈内、鞘内もしくは室内投与投与のための組
成物には、バッファー、希釈剤及び他の適当な添加剤もまた含有することができ
そして好ましくは無菌であり且つ発熱物質を含まない滅菌した水溶液を包含する
ことができる。本発明による静脈内投与のために適当な製薬学的組成物は無菌で
あり且つ発熱物質を含まない。非経口投与には、例えば、本発明のペプチドを製
薬学的に許容しうる非経口賦形剤と会合した液剤、懸濁剤、乳剤もしくは凍結乾
燥粉末として調合することができる。そのような賦形剤の例は、水、食塩水、リ
ンガー溶液、デキストロース溶液及び５％ヒト血清アルブミンである。リポソー
ム及び不揮発性油のような非水性の賦形剤もまた用いることができる。賦形剤も
しくは凍結乾燥粉末は、等張性（例えば塩化ナトリウム、マンニトール）及び化
学的安定性（例えばバッファー及び防腐剤）を保つ添加剤を含有することができ
る。製剤は、一般に使用される技術により滅菌する。例えば、注射による投与の
ために適当な非経口組成物は、０．９％塩化ナトリウム溶液に１．５重量％の有
効成分を溶解することにより製造する。
【００８８】 本発明による製薬学的組成物は、単一用量としてもしくは複数用量で投与する
ことができる。本発明の製薬学的組成物は、個々の治療薬としてもしくは他の治
療薬と組み合わせたいずれかで投与することができる。本発明の処置は、通常の
治療と組み合わせることができ、それらを順次もしくは同時に投与することがで
きる。
【００８９】 用量は、特定の因子の薬力学的特性、並びにその投与形態及び経路；レシピエ
ントの年齢、健康状態及び体重；症状の性質及び程度、同時処置の種類、処置の
頻度、並びに所望の効果のような既知の因子により変わる。治療組成物の調合及
びそれらのその後の投与は、当業者の技術の範囲内であると考えられる。通常、
ペプチドの投薬量は、５０ｋｇの体重当たり約１〜３０００ｍｇ；好ましくは５
０ｋｇの体重当たり１０〜１０００ｍｇ；より好ましくは５０ｋｇの体重当たり
２５〜８００ｍｇであることができる。通常、８〜８００ｍｇを１日当たり個体
に１日につき１〜６回分割用量でもしくは徐放性形態で投与し、所望の結果を得
るために有効である。好ましい成分 ある態様として、共刺激リガンドは、ＨＩＶ ｇｐ４１の部分に連結されたＣ
Ｄ２８の細胞外部分を含んでなる融合タンパク質である。ＨＩＶ ｇｐ４１部分
は、好ましくは非複製粒子であるＨＩＶ粒子中にパッケージングされる融合タン
パク質をもたらす。ＣＤ２８の細胞外部分は、ＣＤ８０及びＣＤ８６を発現する
細胞にウイルス粒子を向ける。ＨＩＶウイルス粒子が局在するこれらの細胞は、
ウイルス粒子を取り込む。ある態様として、ウイルス粒子には、ウイルス粒子へ
の組立てをもたらすＶｐｒ配列を含む融合タンパク質を与える。ある態様として
、化合物は核酸分子である。 ＩＩ−粘膜ターゲッティング 本発明の別の態様は、粘膜細胞を標的とするための組成物及び方法に関する。
上記の記述は、共刺激リガンドの代わりに、粘膜細胞により特異的に展示される
タンパク質に結合するリガンドを代用することにより上記の粒子のいずれかを用
いて上記の化合物のいずれかの送達のために適用することができる。粘膜細胞に
より特異的に展示されるタンパク質には、ＰＣＡＭｓ及びＰセレクチンが包含さ
れる。リガンド部分を含む融合タンパク質を包含するＰＣＡＭｓ及びＰセレクチ
ンに対するリガンドは、上記のように粒子に含むことができる。 ＩＩＩ−粒子ブースター（ｂｏｏｓｔ） 本発明の別の態様は、ワクチンブースターとしての非細胞性粒子の使用に関す
る。本発明のこの態様によれば、免疫原に対する個体の最初の免疫後に、最初の
免疫において含まれる免疫原を含んでなる非細胞性粒子を個体にブースター投与
する（ｂｏｏｓｔｅｄ）。非細胞性粒子ブースターは、最初の免疫後に特に有効
なブースターを提供する。
【００９０】 ある態様として、最初の免疫はＤＮＡワクチンを用いて行う。ある態様として
、最初の免疫は組換えウイルスワクチンを用いて行う。ある態様として、最初の
免疫はタンパク質サブユニットワクチンを用いて行う。ある態様として、最初の
免疫は弱毒化ワクチンを用いて行う。ある態様として、最初の免疫は殺した／不
活性化ワクチンを用いて行う。
【００９１】 ある態様として、粒子は共刺激リガンドを含んでなる非細胞性粒子である。
【００９２】 ある態様として、粒子は、最初の免疫においてあらかじめ送達したタンパク質
免疫原を含んでなる非細胞性粒子である。
【００９３】 ある態様として、粒子は、最初の免疫においてあらかじめ送達したタンパク質
免疫原をコードする核酸分子含んでなる非細胞性粒子である ある態様として、粒子は、共刺激リガンド並びに最初の免疫においてあらかじ
め送達したタンパク質免疫原及び／もしくは最初の免疫においてあらかじめ送達
したタンパク質免疫原をコードする核酸分子のいずれかを含んでなる非細胞性粒
子である。 ＩＩＩ−組換え細胞に基づく癌ワクチン 本発明の別の態様は、癌ワクチンとしての組換え癌細胞の使用に関する。癌ワ
クチンとしての組換え癌細胞の使用は、引用することにより本明細書に組み込ま
れる米国特許第５，９３５，５６９号に記述されている。本発明のこの態様によ
れば、癌細胞により発現される組換え遺伝子は共刺激リガンドである。癌ワクチ
ンは、共刺激リガンドをコードする配列を含んでなる発現ベクターでトランスフ
ェクションした自己由来の癌細胞である。共刺激リガンドを発現する癌細胞は、
共刺激分子を発現する細胞に向けられ、そして癌細胞に対する免疫応答が高めら
れる。好ましい態様として、共刺激リガンドをコードする配列を含んでなる組換
え発現ベクターをエクスビボで癌細胞にトランスフェクションし、そしてトラン
スフェクションした細胞を次に患者に戻す。
【００９４】 ある態様として、トランスフェクションした癌細胞にはさらに、細胞死誘導領
域受容体もしくは細胞死誘導領域シグナルまたは毒素をコードするヌクレオチド
配列を含む発現ベクターを与える。細胞死誘導領域受容体には；Ａｐｏ−１（Ｏ
ｅｈｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７（１５）
，１０７０９−１５；受託番号Ｘ６３７１７）；Ｆａｓ（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ
．，Ｃｅｌｌ，１９９１，６６（２），２３３−４３；受託番号Ｍ６７４５４）
；ＴＮＦＲ−１（Ｎｏｐｈａｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９０，９
（１０），３２６９−７８；受託番号Ｍ６７４５４）；ｐ５５（Ｌｏｅｔｓｃｈ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９０，６１，３５１−３５９；受託番号Ｍ
５８２８６，Ｍ３３４８０）；ＷＳＬ−１（Ｋｉｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔｕｒｅ，１９９６，３８４（６６０７），３７２−５；受託番号Ｙ０９３９２
）；ＤＲ３（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６
，２７４（５８２９），９９０−２；受託番号Ｕ７２７６３）；ＴＲＡＭＰ（Ｂ
ｏｄｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９７，６（１），７９−８
８；受託番号Ｕ７５３８１）；Ａｐｏ−３（Ｍａｒｓｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，
Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１９９６，６（１２），１６６９−７６；受託番号Ｕ７
４６１１）；ＡＩＲ（Ｄｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔｉ ｅｔ ａｌ．，直接付託、
受託番号Ｕ７８０２９）；ＬＡＲＤ（Ｓｃｒｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７，９４（９），４６１５−
１９；受託番号Ｕ９４５１２）；ＮＧＲＦ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃ
ｅｌｌ，１９８６，４７（４），５４５−５５４；受託番号Ｍ１４７６４）；Ｄ
Ｒ４（Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７６（５３０９）
１１１−１１３；受託番号Ｕ９０８７５）；ＤＲ５（Ｓｈｅｒｉｄａｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７７（５３２７），８１８−８２１；受
託番号ＡＦ０１２５３５）；ＫＩＬＬＥＲ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，印刷中）；ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＭａｃＦａｒｌａｎｅ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，印刷中；受託番号ＡＦ０２
０５０１）；ＴＲＩＣＫ２（Ｓｃｒｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉ
ｏｌ．，１９９７，印刷中；受託番号ＡＦ０１８６５７）；ＤＲ６（Ｐａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，未公開；受託番号ＡＦ０６８８６８）が包含されるがこれらに限定
されるものではない。細胞死誘導シグナル、すなわち、細胞死誘導領域受容体と
相互作用するタンパク質には；ＦＡＤＤ（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ ｅｔ ａｌ．
，Ｃｅｌｌ，１９９５，８１（４），５０２−１２；受託番号Ｕ２４２３１）；
ＦＡＰ−１（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２６８（５
２０９），４１１−１５；受託番号Ｌ３４５８３）；ＴＲＡＤＤ（Ｈｓｕ ｅｔ
ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９５，８１（４），４９５−５０４；受託番号Ｌ４１
６９０）；ＲＩＰ（Ｓｔａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９５，８１
（４），５１３−２３；受託番号Ｕ２５９９４）；及びＦＬＩＣＥ（Ｍｕｚｉｏ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９６，８５（６）；８１７−２７；受託番号Ｕ
５８１４３）；ＲＡＩＤＤ（Ｌｅｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，
１９９６，３３（１），１５１−２；受託番号Ｕ７９１１５）が包含されるがこ
れらに限定されるものではない。細胞死誘導シグナルにはまた、細胞死誘導領域
受容体に結合しそしてアポトーシスを開始するリガンドも包含され；ＦＡＳ−Ｌ
（Ａｌｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９５，１８１
（１），７１−７；受託番号Ｕ０８１３７）及びＴＮＦが包含されるがこれらに
限定されるものではなく、そして細胞死誘導領域受容体と相互作用するメディエ
ーターには；ＦＡＤＤ（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９
９５，８１（４），５０５−１２；受託番号Ｕ２４２３１）；ＭＯＲＴ１（Ｂｏ
ｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，２７０（１４）
，７７９５−８；受託番号Ｘ８４７０９）；ＣＲＡＤＤ（Ａｈｍａｄ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９７，５７（４），６１５−９；受託番号
Ｕ８４３８８）；及びＭｙＤ８８（Ｂｏｎｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌ
ｅｔｔ．，１９９７，４０２（１），８１−４；受託番号Ｕ８４４０８）が包含
されるがこれらに限定されるものではない。毒素には、細胞を殺すタンパク質が
包含される。毒素には、昆虫及びヘビ毒、シュードモナス内毒素のような細菌内
毒素、一本鎖毒素を包含するリシンのような二本鎖リボソーム不活性化タンパク
質、並びにゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）が包含されるがこれらに限定されるもの
ではない。
【００９５】 本発明の方法は、ヒト及び獣医学の両方の分野において有用である。従って、
本発明は、哺乳動物、鳥類及び魚類の遺伝子免疫に関する。本発明の方法は、ヒ
ト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ及びネコ種を包含する哺乳動物種に特に有
用であることができる。
【００９６】 以下に記述する実施例は、本発明の態様の代表的実施例を含む。これらの実施
例は、本発明の範囲を限定するものではなく、むしろ例示の目的にかなう。さら
に、本発明の様々な態様を以下の記述により要約することができる。しかしなが
ら、この記述は、本発明の範囲を限定するものではなく、むしろ本発明の様々な
態様を強調するものである。当業者は、本発明のさらなる特徴及び態様を容易に
理解することができる。 実施例 実施例１ 受託番号及び参考文献により同定される以下の配列は、引用することにより本
明細書に組み込まれる マクロファージコロニー刺激因子 受託番号ＡＡＡ５９５７２ Ｃｅｒｒｅｔｔｉ，Ｄ．Ｐ．ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（８），７６１−７７０（１９８８） 受託番号ＡＡＢ５１２３５ Ｖｉｓｖａｄｅｒ，Ｊ．ａｎｄ Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ． Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９（３）１３３６−１３４１（１９８９） 受託番号Ｐ０９６０３ Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５（４７９５）１５０４−１５０８（１９８７） Ｃｅｒｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（８）７６１−７７０（１９８８） Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０（４７２３）２９１−２９６（１９８５） ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５ 受託番号４５０２６３９ Ｒａｐｏｒｔ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（２９），１７１６１−１７１６６（１９９６
） 単球誘引物質タンパク質（ＭＣＰ−３） 受託番号ＣＡＡ５０４０７ Ｍｉｎｔｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．４（２），９９−１１０（１９９３） 受託番号ＡＡＣ０３５３８ ｐＦＬＴ３ ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３ 受託番号４７５８３９６ Ｓｍａｌｌ，Ｄ．ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，４５９−４６３（
１９９４） 受託番号Ｐ３６８８８ Ｓｍａｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，４５９−４６３（
１９９４） ｐＦＬＴ３ＬＧ ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド 受託番号４５０３７５１ ４−１ＢＢ 受託番号ＡＡＡ５３１３３ Ａｌｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（９），２２１９−２２２７（１９９４） ４−１ＢＢＬ 受託番号Ｐ４１２７３ Ａｌｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（９）２２１９−２２２７（１９９４） ＲＡＮＴＥＳ 受託番号ＢＡＡ７６９３９ Ｌｉｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（８），４５８１−４５８５（１９９９） 受託番号１０６５０１８ ＣＣＲ１／ＭＩＰ１Ｒ 受託番号Ｐ３２２４６ Ｎｅｏｔｅ，Ｋ．ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ７２（３）４１５−４２５（１９９３） Ｇａｏ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７（５）１４２１−１４２７（１９９３） Ｎｏｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（１０）１２３９−１２４９（１９９３） ＣＣＲ５ 受託番号Ｐ５６４９３ Ｋｕｈｍａｎｎ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（１１）８６４２−８６５６（１９９７） Ｍｕｒａｙａｍａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ． ＣＣＲ２ 受託番号Ｐ４１５９７ Ｃｈａｒｏ，Ｉ．Ｆ．ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９１（７）２７５２−２７５６（１９９４） Ｙａｍａｇａｍｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０２（２）１１５
６−１１６２（１９９４） Ｗｏｎｇ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２）１０３８−１０４５（１９９７） ＣＣＲ３ 受託番号Ｐ５１６７７ Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２８）１６４９１−１６４９４（１９９５） Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０ ３０２３５（１９９５） Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３（５）２３４９−２３５４（１９９６） ＣＤ４０リガンド 受託番号Ｐ２９９６５ Ｇｒａｆ，Ｄ．ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（１２）３１９１−３１９４（１９９２） Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ，Ｄ．ｅｔ ａｌ． Ｅｍｂｏ．Ｊ．１１（１２）４３１３−４３２１（１９９２） Ｓｐｒｉｇｇｓ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ７２ ２９１−３００（１９９３） Ｓｐｒｉｇｇｓ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６（６）１５４３−１５５０（１９９２） Ｇａｕｃｈａｔ ｅｔ ａｌ． Ｆｅｂｓ．Ｌｅｔｔ．３１５（３）２５９−２６６（１９９３） ＣＤ８６ 受託番号５９０１９２０ Ａｚｕｍａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３６６（６４５０）７６−７９（１９９３） Ｒｅｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ８（８）５８１−５８２（１９９７） ＣＤ８０ 受託番号４８８５１２３ Ｓｅｌｖａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ３６（３）１７５−１８１（１９９２） Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ７９（２）４８９−４９４（１９９２） ＣＤ４０ 受託番号４５０７５８１ Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ． Ｅｍｂｏ．Ｊ．８（５）１４０３−１４１０（１９８９） ＬＦＡ−３ 受託番号ＢＡＡ０５９２２ ＩＣＡＭ１ 受託番号ＡＡＢ５１１４５ ＣＤ２８ 受託番号５４５３６１１ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５（１）３４４−３５２（１９９０） 実施例２ 複数成分ＤＮＡ免疫は、霊長類における免疫応答を調節し、そして免
疫不全ウイルス攻撃に対する有意な免疫を与えることができる。
【００９７】 非ヒト霊長類は、ＨＩＶワクチン研究の最も適切な攻撃モデルに相当する。げ
っ歯類における研究は、ワクチンの一部としてＴｈ１もしくはＴｈ２サイトカイ
ンをコードする遺伝子を含むことによりＤＮＡワクチンの効能を調節できること
を立証している。我々は、アカゲザルにおいてそのような方法の免疫調節効果を
評価しようと試みた。ＨＩＶ ｅｎｖ／ｒｅｖ及びＳＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌのみの
ＤＮＡワクチンをそれらの免疫原性について評価し、そしてＩＬ−２もしくはＩ
ＦＮ−γ（Ｔｈ１）またはＩＬ−４（Ｔｈ２）サイトカインｃＤＮＡ構築物も含
むこれらのワクチンと比較した。これらのサイトカインは、ワクチンにより誘導
されるセロコンバージョンを劇的に高め、そしてより適度にではあるが、細胞性
応答も同様に調節するようであった。ワクチン接種した動物をＳＨＩＶ ＩＩＩ
Ｂで静脈内に攻撃した。ワクチンもしくはワクチン＋Ｔｈ１サイトカイン群の動
物の半分は、高感度の限界希釈共培養に基づく感染からの防御を示し、試験した
ワクチンのウイルス複製に対する劇的な効果を実証した。防御された動物にＳＩ
Ｖ ＤＮＡワクチン（ＳＩＶ及びサイトカイン構築物）を再ブースター投与し、
そして病原性ＳＩＶmac239でｉ．ｖ．再攻撃した。全てのワクチン接種した動物
は、ウイルス共培養及び抗原血について陰性であった。それに反して、コントロ
ール動物は、攻撃後２週までに抗原血を示し、そして限界希釈共培養において１
０ｌｏｇより大きいウイルス／１０6細胞を示した。コントロール動物は、ＣＤ
４細胞低下を示し、そして高ウイルス負荷の１４週以内にＳＩＶ関連消耗を発症
し、続いて成長することができなかった。ワクチン接種した動物はウイルス陰性
であり、健康なままであった。防御の正確な相関物は細胞性応答を含み得るが、
中和抗体応答はこれらの研究におけるウイルス複製及び感染の制御と相関関係が
ないようである。これらの研究は、複数成分ＤＮＡワクチンが非常に病原性の攻
撃系においてウイルス複製及び疾患に直接影響を与え、従って、潜在的にＨＩＶ
に対する我々の免疫学的防御手段を広げることができることを立証する。 導入 核酸もしくはＤＮＡ接種は、特定の免疫原をコードするＤＮＡ構築物を宿主に
直接送達する重要なワクチン接種技術である1-8。これらの発現カセットは宿主
細胞をトランスフェクションし、それらは抗原の生産のためのインビボタンパク
質源になる。次いで、この抗原は、生じる免疫応答の焦点である。核酸免疫は、
ＨＩＶを包含する様々な感染症に対する免疫方法として検討されている1-8。ヒ
トにおけるこのワクチン技術の最終的使用に裏付けを与えるためには、小動物系
において最初に認められる結果を霊長類モデルにおける成功に転化することが重
要であり得る9。
【００９８】 霊長類は、ＨＩＶワクチン評価の最も適切な攻撃系に相当する。詳細には、現
在、ＨＩＶワクチン研究のための３つの異なる霊長類モデルがある。それらには
、チンパンジーにおけるＨＩＶ攻撃モデル並びにマカクにおけるＳＩＶ及びキメ
ラＳＩＶ／ＨＩＶ−１（ＳＨＩＶ−１）攻撃モデルが包含される。チンパンジー
は、ヒトからのＨＩＶ単離株により感染させることができるが、しかしながら、
それらはめったに疾患を発症しない。それに反して、ＳＩＶ攻撃モデルは、マカ
クにおいて高レベルまで複製しそしてＨＩＶ様疾患を引き起こすＳＩＶウイルス
を使用する。攻撃が疾患を引き起こすことができる動物モデルにおいてＨＩＶエ
ンベロープ免疫原を試験しようと努めて、ＳＩＶエンベロープ遺伝子を特定のＨ
ＩＶ−１エンベロープ遺伝子で置換することによりＳＨＩＶウイルスを構築した 10 。ＳＨＩＶウイルスはマカクにおいて複製し、そしてＨＩＶ−１エンベロープ
に基づくワクチンの感染性攻撃モデルに相当し、そしてＳＨＩＶ ８９．６Ｐの
ようなある種のＳＨＩＶ株は病原性である。
【００９９】 現在まで、霊長類において防御免疫を誘導するためのＤＮＡワクチンの使用は
、様々な結果を有している。株ＭＮからのＨＩＶエンベロープ及びｇａｇ／ｐｏ
ｌタンパク質をコードする構築物を接種した２匹のチンパンジーのうち２匹とも
、高用量（２５０チンパンジーＩＤ50）の異種起源のストックのＨＩＶ−１ Ｓ
Ｆ２でのｉ．ｖ．攻撃から防御された11。一方、ｅｎｖ ＤＮＡ構築物のみは、
マカクにおけるＳＨＩＶモデルで不確かな有用性を示している12。多用量のＨＩ
Ｖ−１ ｇｐ１２０ＤＮＡワクチン構築物で特発しそしてｇｐ１６０タンパク質
をブースター投与した２匹のアカゲザルのうち２匹とも、２５ＴＣＩＤ50のＳＨ
ＩＶ−１ ＨＸＢ２でのｉ．ｖ．攻撃から防御された12。しかしながら、タンパ
ク質ワクチンのみはこのモデルにおいてタイプ特異的に防御することができ、そ
して防御は、タイプ特異的な中和抗体応答を高めるタンパク質の能力に基づく。
従って、ＤＮＡワクチンのみの役割は、このモデルにおいて不確かな有用性のも
のである。
【０１００】 ＳＩＶ攻撃モデルにおけるＤＮＡワクチン構築物の防御効果は、かなり希望が
少ない。７匹のアカゲザルをＳＩＶのエンベロープ（４つの異なるプラスミド）
及びｇａｇ（１つのプラスミド）遺伝子の両方をコードするＤＮＡワクチンで免
疫し、そしてそれらの６回目の免疫後に病原性ＳＩＶmac251で攻撃した。ワクチ
ンは陽性応答を誘導したが、ワクチン接種した動物のいずれも感染もしくは疾患
から防御されなかった13。実際、現在まで病原性ＳＩＶ攻撃から霊長類を防御す
ることが確信して示されている唯一のワクチン接種方法は生きている弱毒化した
ＳＩＶワクチンであるので14これはＤＮＡワクチンのみの限界ではない。生きて
いる複製するＨＩＶ−１もしくはＳＩＶを使わずにＤＮＡワクチンのような追加
の免疫方法で防御を得ることが奨励される。しかしながら、現在までこれはとら
えにくい目標である。
【０１０１】 ＤＮＡ免疫原により誘導される免疫応答を高めそして調節する方法として分子
アジュバントの使用が調べられている。ＤＮＡワクチン構築物と共刺激分子（Ｃ
Ｄ８０及びＣＤ８６）、前炎症性サイトカイン（ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α及びＴ
ＮＦ−β）、Ｔｈ１サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５及びＩＬ
−１８）、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１０）及びＧＭ
−ＣＳＦを包含する免疫学的に関連する分子をコードする発現プラスミドからな
るこれらの分子アジュバントとの共送達は、マウスにおいて誘導される免疫応答
の大きさ及び方向（体液性もしくは細胞性）の調節を導いた5,15-17。現在まで
この方法が霊長類における応答を操作できることは報告されていない。
【０１０２】 このパイロット研究において、我々は、霊長類におけるサイトカイン遺伝子共
送達による体液性及び細胞性免疫応答の増大を調べた。ＨＩＶ ｅｎｖ／ｒｅｖ
（ｐＣＥｎｖ）及びＳＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌ（ｐＣＳＧａｇ／ｐｏｌ）タンパク
質をコードするＤＮＡワクチン構築物と一緒にＴｈ１（ＩＬ−２及びＩＦＮ−γ
）もしくはＴｈ２−タイプ（ＩＬ−４）サイトカインをコードする発現プラスミ
ドでアカゲザル（マカカ・ムラッタ（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ））を共免
疫した。ＳＨＩＶ及びＳＩＶモデル系の両方における免疫応答及び防御に対する
この調節の効果を調べた。 マウスにおける免疫応答の調節 サイトカインは、免疫応答の発生において重要な調節及びシグナリングの役割
を果たす。リンパ球に作用するサイトカインは、免疫系の細胞を調節することに
おけるそれらの役割のために特に興味深い。例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及び
ＩＬ−１２の存在は、Ｔｈ０前駆細胞をＴｈ１炎症性Ｔ細胞になるように活性化
する18。一方、ＩＬ−４、ＩＬ−５もしくはＩＬ−１０の放出は、強化された（
ａｒｍｅｄ）Ｔｈ２ヘルパー細胞になるＴｈ０前駆体をもたらす18。ＩＬ−２は
、主として刺激されたＴ細胞により生産され、そして抗原特異的Ｔ細胞の増殖及
びクローン増殖のために重要である19。ＩＬ−４は、体液性免疫応答の誘導にお
いて重要な役割を果たす顕著なＴｈ２サイトカインである20。
【０１０３】 ＤＮＡワクチンにより誘導される応答に対するＩＬ−２、ＩＦＮ−γもしくは
ＩＬ−４サイトカイン遺伝子の共送達の効果を分析した。免疫したマウスからの
抗血清を集め、そしてＥＬＩＳＡによりＨＩＶ−１ ｇｐ１２０タンパク質に対
する特異的抗体応答について分析した。ＤＮＡ免疫後０、２、４、６及び８週で
集めた血清からｇｐ−１２０特異的抗体力価についてデータを作製した。１：１
２８の希釈で、ｐＣＥｎｖ＋ＩＬ−２、ｐＣＥｎｖ＋ＩＦＮ−γ及びｐＣＥｎｖ
＋ＩＬ−４で免疫した群からの血清は、ｐＣＥｎｖのみで免疫した群のものより
有意に大きいｇｐ１２０タンパク質に対する抗体応答を示した。同様の結果が、
ｐＣＧａｇ／ｐｏｌで免疫した群で認められた。ＤＮＡで免疫したマウスのリン
パ球増殖応答を測定した。ＨＩＶ−１免疫原（ｐＣＥｎｖもしくはｐＣＧａｇ／
ｐｏｌ）とのＩＬ−２共投与は、劇的なレベルの抗原特異的Ｔヘルパー細胞増殖
応答をもたらした。ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４ ｃＤＮＡとの共投与もまた、Ｔ細
胞増殖応答の増大をもたらした。 アカゲザルにおけるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４発現カセットの共送達 ヒトにおけるこのワクチン技術の最終的使用のために重要であるのは、マウス
系において最初に認められた結果を霊長類モデルに転化することである。以前に
、霊長類は、筋肉への直接遺伝子接種によりＤＮＡワクチンによりコードされる
タンパク質を生産する能力が限られている可能性があることが報告されている21 。より詳細には、霊長類におけるＤＮＡ免疫のみでは高レベルの抗原特異的抗体
応答を起こすために十分ではないことが報告されている。例えば、アカゲザルに
おける多用量（２ｍｇのＤＮＡを４週間隔で８回与える）を用いるＨＩＶ−１
ｇｐ１２０ ＤＮＡワクチン構築物のＩＭ免疫は、低レベルの抗原特異的結合の
みを引き出し、そして検出可能な中和抗体を引き出さなかった12。これらの結果
は、非ヒト霊長類におけるＤＮＡワクチンの減少した免疫原性を示し、潜在的に
それらの有用性を限定する。
【０１０４】 我々は、サイトカイン遺伝子との共免疫でマウスにおいて認められた免疫応答
の増大をアカゲザルにおいても達成できるかどうか調べた。各々２匹のアカゲザ
ルの４群を様々なＤＮＡワクチン構築物で免疫した。第一群は、ＨＩＶ ｅｎｖ
／ｒｅｖ（ｐＣＥｎｖ）及びＳＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌ（ｐＣＳＧａｇ／ｐｏｌ）
構築物で免疫した。第二群は、ｐＣＥｎｖ＋ｐＣＳＧａｇ／ｐｏｌ＋ＩＬ−２構
築物で免疫した。第三及び第四群は、それぞれ、ｐＣＥｎｖ＋ｐＣＳＧａｇ／ｐ
ｏｌ＋ＩＬ−４及びｐＣＥｎｖ＋ｐＣＳＧａｇ／ｐｏｌ＋ＩＦＮ−γで免疫した
。これらのサルは、２００μｇの各ＤＮＡで０、６及び１２週に免疫し、そして
５００μｇの各ＤＮＡを２８及び４９週にブースター投与した。これらの構築物
は、注入の前に混合した。 Ｔｈ１もしくはＴｈ２サイトカイン遺伝子共免疫での体液性応答の調節 免疫したサルからの免疫前及び後血清サンプルの両方を集め、そして組換えＨ
ＩＶ−１ ｇｐ１２０エンベロープ及びＳＩＶ ｐ２７ ｇａｇタンパク質に対す
る結合反応性をＥＬＩＳＡにより決定した。サイトカインなしにｐＣＥｎｖ＋ｐ
ＣＳＧａｇ／ｐｏｌで免疫したサルは、免疫後のいずれの時点でも最小レベルの
抗−ｇｐ１２０もしくは抗−ｐ２７抗体を有した。しかしながら、ｐＣＥｎｖ＋
ｐＣＳＧａｇ／ｐｏｌ＋ＩＬ−２で免疫した動物では抗−ｇｐ１２０もしくは抗
−ｐ２７抗体のレベルの有意な増大が認められた。サルにおけるＩＬ−２共送達
での抗体応答増大の大きさは、マウスにおいて認められた結果より劇的に大きか
った（マカクにおける２０倍の増加と比較してマウスでは終点力価の４倍の増加
）。ＩＬ−４共免疫もまた、抗原特異的抗体応答を正に調節した。ｐＣＥｎｖ＋
ｐＣＳＧａｇ／ｐｏｌ＋ＩＬ−４で免疫した群は、高レベルの抗−ｇｐ１２０抗
体を発生した。一方、ｐＣＥｎｖ＋ｐＣＳＧａｇ／ｐｏｌ＋ＩＦＮ−γで免疫し
たマカクは、ｇｐ１２０及びｐ２７タンパク質に対するもっと適度であるがそれ
でもなお高められた応答を有した。
【０１０５】 さらに、免疫したサルからのこれらの抗原反応性血清は、ウェスタンブロット
分析により陽性であった。免疫後３６週でサルから集めた血清をウェスタンブロ
ット分析により分析した。ウェスタンブロットアッセイは、タンパク質ＥＬＩＳ
Ａより厳しい規準である。各サルの免疫前血清は反応性を示さなかった。さらに
、ｐＣＥｎｖ＋ｐＣＳＧａｇ／ｐｏｌで免疫した動物は、ウェスタンブロット細
片にいかなる反応も示さなかった。それに反して、ｐＣＥｎｖ＋ｐＣＳＧａｇ／
ｐｏｌ＋ＩＬ−２で免疫した群は、ｇｐ４１及びｐ２７タンパク質の両方にウェ
スタンブロットにおいて反応性を示した。さらに、ＩＬ−４共免疫は、ｇｐ１６
０タンパク質に対する反応性をもたらし、一方、ＩＦＮ−γ共免疫は、ｇｐ４１
及びｐ１８タンパク質に対する反応性をもたらした。特定のバンドに対する反応
性の強さは、コントロールＳＨＩＶ感染血清レーンの反応性と同様であった。こ
れらの結果は、アカゲザルにおけるサイトカイン遺伝子アジュバントの使用によ
り抗原特異的抗体応答をいっそう高いそしておそらくいっそう望ましいレベルに
工学設計できることを示す。
【０１０６】 我々は、同一源のＨＩＶ−１ＭＮ及び異種起源のＨＩＶ ＩＩＩＢウイルスを
中和する免疫したサルからの抗体の能力を調べた（表１）。ＩＬ−２共免疫群は
高レベルの血清抗体応答を示したが、ＩＬ−４共免疫群の動物は、同一源のＨＩ
Ｖ−１ＭＮ単離株に対するいっそう大きいレベルの中和抗体を示した。一方、血
清抗体のいずれもＨＩＶ ＩＩＩＢウイルスを中和することができなかった。こ
れらの動物のさらなるブースターは体液性免疫応答を広げたかもしれない可能性
がある。 Ｔｈ１もしくはＴｈ２サイトカイン遺伝子共免疫での細胞性免疫の調節 ＨＩＶ感染個体のウイルス負荷を制御することにおけるＨＩＶ特異的ＣＤ４＋
Ｔｈ細胞及びＣＤ８＋ ＣＴＬ応答の両方の重要性は、詳細な研究中である22-2 8 。マカクにおける抗原特異的Ｔｈ細胞増殖応答及びＣＴＬ応答に対するＤＮＡ
免疫の効果もまた調べた。表２に示すように、ｇｐ１２０及びｐ２７タンパク質
に対する抗原特異的Ｔｈ細胞増殖応答の誘導が認められた。ｐＣＥｎｖ＋ｐＣＳ
Ｇａｇ／ｐｏｌ構築物で免疫した群並びにＴｈ１サイトカインＩＬ−２及びＩＦ
Ｎ−γと共免疫したものは、Ｔｈ２サイトカインＩＬ−４と共免疫した群より頻
繁なそして高レベルの増殖応答を有するようであった。一方、免疫応答における
Ｔｈ１シフトに対するＴｈ１サイトカイン遺伝子共送達（ＩＬ−２及びＩＦＮ−
γ）の効果は、マウス系における結果と比較した場合にこれらの動物ではあまり
明らかではなかった。さらに、各群内の動物は、異なるＴｈ増殖応答プロフィー
ルを有した。例えば、サル＃１はα−ｅｎｖ及びｇａｇ／ｐｏｌ Ｔｈ応答を有
した。それに反して、サル＃２は、同じ期間にわたるＴｈ増殖応答の最も低いレ
ベルの一つを示した。
【０１０７】 また、不死化した自己由来の細胞系を用いてＨＩＶ ＥｎｖもしくはＳＩＶ ｇ
ａｇ／ｐｏｌを発現する標的に対するＣＴＬ応答も評価した。表３に示すように
、ｐＣＥｎｖ＋ｐＣＳＧａｇ／ｐｏｌもしくはｐＣＥｎｖ＋ｐＣＳＧａｇ／ｐｏ
ｌ＋ＩＬ−４で免疫した群では１０％溶解を超える特異的ＣＴＬ応答は認められ
なかった。一方、ｐＣＥｎｖ＋ｐＣＳＧａｇ／ｐｏｌ＋ＩＬ−２で免疫した群は
、ＳＨＩＶ攻撃の前の３時点のうち２つでｅｎｖを発現する標的に対する１０％
より大きいｅｎｖ特異的ＣＴＬ溶解を有した。同様に、ｐＣＥｎｖ＋ｐＣＳＧａ
ｇ／ｐｏｌ＋ＩＦＮ−γで免疫したサルは、５０週で１０％より大きいｅｎｖ及
びｇａｇ／ｐｏｌ特異的ＣＴＬ溶解を有した。
【０１０８】 さらに、各動物から単離した刺激されたＴリンパ球から放出されるサイトカイ
ンのレベルを分析することにより免疫により誘導される細胞性免疫応答を調べた
。サイトカインは、免疫応答の発生中の免疫細胞の誘導及びターゲッティングに
おいて重要な役割を果たす。例えば、ＩＦＮ−γはＴｈ１及びＣＤ８＋ Ｔ細胞
により生産され、そして抗−ウイルスＴ細胞性免疫応答の調節もしくは発生に複
雑に関与する22,29。それに反して、ＩＬ−１０は、推定のＴｈ２リンパ球を包
含する多数の細胞タイプにより生産され、そして強力なＴｈ２タイプサイトカイ
ンであることが示されている30,31。従って、刺激されたＴ細胞により分泌され
るこれらのサイトカインの分析は、免疫後の細胞性応答の程度を解明することに
おいて重要であり得る24。分泌されるＩＦＮ−γのレベルは、コントロール群の
ものよりｐＣＥｎｖ＋ｐＣＳＧａｇ／ｐｏｌで免疫した群において高いことが認
められた。また、ＩＦＮ−γプラスミドとの共投与は、刺激された細胞によるＩ
ＦＮ−γ生産のレベルを高め、一方、ＩＬ−４プラスミドとの共注入は、ＩＦＮ
−γのレベルを下げることも認められた。それに反して、ＩＬ−２との共免疫は
、検出されるＩＦＮ−γ生産のレベルに影響を与えなかった。一方、各群により
生産されるＩＬ−１０のレベルは同様であった。 ＳＨＩＶ ＩＩＩＢ攻撃からの防御 免疫応答の分析後に、８匹のアカゲザル並びに２匹のコントロールのサルを５
３週（最後の免疫後４週）で１０動物感染用量（ＡＩＤ50）の無細胞ＳＨＩＶ
ＩＩＩＢでｉ．ｖ．経路により攻撃した。次に攻撃後２、３、４週で動物から瀉
血し、そして標準的な高感度の限界希釈共培養分析を用いて感染からの防御につ
いて評価した14。予想されるように、両方のコントロールのサルは、ウイルス攻
撃の２週以内に感染した。さらに、Ｔｈ２サイトカインＩＬ−４と共免疫した両
方の動物は感染した（感染後２週で３及び７．５ｌｏｇのウイルス／１０6細胞
）。それに反して、ｐＣＥｎｖ＋ｐＣＳＧａｇ／ｐｏｌで免疫した動物またはＩ
Ｌ−２もしくはＩＦＮ−γと共免疫したものの５０％は、ｉ．ｖ．攻撃によるウ
イルス感染を制御することができ、そして限界希釈共培養アッセイにおいて検出
可能なウイルスを示さなかった。
【０１０９】 また、攻撃前の個々の動物からのサイトカイン発現プロフィールも分析した。
防御されるアカゲザルからの刺激されたＴ細胞は、防御されない動物（コントロ
ールもしくは免疫した両方）より高レベルのＩＦＮ−γを生産した。一方、防御
されるもしくは防御されない群のいずれかにより生産されるＩＬ−１０のレベル
は同様であった。
【０１１０】 さらに、攻撃の直前の５３週で免疫した動物からのβ−ケモカイン（ＭＩＰ−
１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−１）の発現プロフィールを調べ
た。β−ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＲＡＮＴＥＳは、マクロフ
ァージ向性であるがＴ細胞向性ではないウイルスに対してＣＤ８+ Ｔ細胞により
生産される主要なＨＩＶ抑制因子である32-37。ＭＣＰ−１はＨＩＶ抑制因子の
一つではないが、それは末梢における細胞性免疫増殖において重要な役割を果た
すことが示されている38。防御されるアカゲザルからの刺激されたＴ細胞は、防
御されない動物より（それぞれ、０．０５及び０．０２のｐ値で）有意に高いレ
ベルのＭＩＰ−１β及びＲＡＮＴＥＳを生産した。それに反して、２群によるＭ
ＩＰ−１α及びＭＣＰ−１生産のレベルは、有意に異ならなかった。 病原性ＳＩＶ攻撃に対するＤＮＡ免疫の分析 ＳＨＩＶ ＩＩＩＢ攻撃及びそれに続く分析後に、ＳＨＩＶ ＩＩＩＢから防御
される３匹のサルに追加のＤＮＡ構築物を２回ブースター投与した。マウスにお
ける以前の結果6に基づきＨＩＶ−２及びＳＩＶ ｅｎｖの組み合わせを用いた。
サル＃１にはＳＩＶ ｅｎｖ（ｐＣＳＥｎｖ）、ＳＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌ（ｐＣＳ
Ｇａｇ／ｐｏｌ）及びＨＩＶ−２ ｅｎｖ（ｐＣＨ２Ｅｎｖ）をブースター投与
した。サル＃３にはＳＩＶ ｅｎｖ（ｐＣＳＥｎｖ）、ＳＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌ（
ｐＣＳＧａｇ／ｐｏｌ）、ＨＩＶ−２ ｅｎｖ（ｐＣＨ２Ｅｎｖ）及びＩＬ−２
をブースター投与した。同様に、サル＃５にはＳＩＶ ｅｎｖ（ｐＣＳＥｎｖ）
、ＳＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌ（ｐＣＳＧａｇ／ｐｏｌ）、ＨＩＶ−２ ｅｎｖ（ｐＣ
Ｈ２Ｅｎｖ）及びＩＦＮ−γをブースター投与した。これらのサルは、８１及び
８５週に１ｍｇの各ＤＮＡで免疫した。
【０１１１】 ＳＩＶ ｇｐ１３０及びＨＩＶ−２ ｇｐ１０５タンパク質に対する抗原特異的
Ｔヘルパー細胞増殖応答のレベルを調べた（表４）。（８１及び８５週での）２
回のブースター免疫後に、ｐＣＳＥｎｖ＋ｐＣＳＧａｇ／ｐｏｌ＋ｐＣＨ２Ｅｎ
ｖで免疫したサルは、正の増殖応答を示さなかった。ＩＬ−２もしくはＩＦＮ−
γと共免疫した動物は、ｇｐ１３０及びｇｐ１０５タンパク質に対する正の増殖
応答を有した。
【０１１２】 ８９週で、これらの動物並びに１匹のコントロールのマカクを１０ＡＩＤ50の
病原性ＳＩＶmac239でｉ．ｖ．経路により攻撃した。ＳＩＶmac239での攻撃後に
、攻撃の２及び４週前、そして攻撃後０、１、２、３、４、８及び１２週で動物
から瀉血した。ＳＩＶmac239での感染は、血漿抗原血アッセイ及び限界希釈共培
養分析の両方により評価した。血漿抗原血アッセイを用いて、コントロール動物
の血漿では攻撃後２週で高レベルのｐ２７抗原が認められ、一方、３匹のワクチ
ンレシピエントではｐ２７抗原は検出されなかった。これらの結果は、限界希釈
共培養分析により立証された。コントロール動物は、攻撃の１週以内にウイルス
が容易に検出されたので感染しており、そしてウイルス負荷は分析期間を通して
高いままであり（１０ｌｏｇより大きいウイルス／１０6細胞）、一方、免疫し
たマカクの１００％では攻撃後１２週を通して限界共培養法によりアッセイした
場合にウイルス負荷がないことが示された。
【０１１３】 チンパンジーにおけるＤＮＡワクチン攻撃の我々の以前の研究では、防御され
る動物は、防御されない動物と異なり、ウイルス抗原血がないこと、共培養陽性
ウイルスの欠如及び分枝鎖陽性ウイルスの欠如を示すことが認められた11。しか
しながら、高い感度のＤＮＡアッセイを用いたサンプルの検査により、このアッ
セイにおいて一時的な低レベルを検出できることが示され、ＤＮＡワクチンのみ
によるウイルス複製の制御はこの系において無菌にしていないことを示唆する。
従って、高い感度のＰＣＲアッセイを用いてＳＨＩＶ並びにＳＩＶ攻撃から防御
される動物からのサンプルを再評価した。ＳＨＩＶデータは、チンパンジー系に
おける結果と再び同様であった。３匹の防御される動物のうち２匹は、一時的な
陽性シグナルを示し、これらの動物において防御が無菌にしていないことを示す
（表５）。追跡分析は、共培養もしくはＰＣＲ技術による検出可能なウイルスを
示さなかった。結果は、ＳＩＶ攻撃において驚くほど異なった。感染して急速に
疾患に進行したコントロール動物と異なり、３匹の防御される動物は、高い感度
の技術での共培養によりいかなるウイルスも示していない。従って、感染がたと
え一時的に起こっても、それは非常に低いレベルであると思われる。
【０１１４】 ＳＩＶ攻撃後１４週程度の早期に、コントロール動物上のＣＤ４及びＣＤｗ２
９細胞パーセンテージは減少し始め、一方、感染していない動物はＣＤ４及びＣ
Ｄｗ２９細胞パーセンテージの正常なレベルを維持した（表６）。１８週までに
、感染したコントロール動物は、ＳＩＶにより引き起こされる疾患と一致する、
体重低下、嗜眠、乱れた毛及び下痢のようないくつかの不都合な臨床症状を示し
た。実際、コントロール動物の健康状態は絶えず悪化し、そして攻撃後３０週ま
でに動物を安楽死させた。全てのワクチン接種した動物は健康なままであった。
説明 ＨＩＶ−１に対するワクチンの開発における主要な障害の一つは、防御の正確
な免疫相関物に関する不確実さである39。ＨＩＶ感染個体の長期非進行者群の研
究において、ＨＩＶ−１に対する防御の相関物は、免疫応答の体液性、細胞性、
もしくはさらに両方の防御手段により与えられ得るという考えが証拠により裏付
けられる40,41。いくつかの同一源の攻撃モデルにおいて防御される霊長類では
高レベルのタイプ特異的中和抗体が認められている42-45。中和抗体は、ＨＩＶ
−１エンベロープの抗原性の多様性によるウイルスのごまかしを受けやすく、そ
してウイルス病因を防ぐ中和抗体の能力は、依然としてかなり研究中である46,4 7 。
【０１１５】 ＨＩＶ−１疾患進行の特徴の一つは、細胞性免疫機能の低下であり、そして強
い細胞性応答の存在は、ウイルス複製の制御と相関関係があるかもしれない。数
人の研究者により研究された急性ＨＩＶ−１感染の場合、ウイルスのクリアラン
スは各場合で特定のＣＴＬ活性と関連した25,26。さらに、感染しなかった職業
的にリスクを伴うヘルスケアワーカーの一組（２０人のうち７人）は、一時的な
ＨＩＶ−１特異的ＣＴＬ応答を有した48。ＨＩＶ−１特異的ＣＴＬはまた、ＨＩ
Ｖ−１の感染にかからないままであるガンビアの多数の慢性的にリスクを伴う売
春婦においても認められた27。感染に対する免疫を与えることにおける中和抗体
及びＣＴＬｓの役割を裏付けるこれらの研究にもかかわらず、中和抗体及びＣＴ
Ｌ応答の両方を示すあるワクチン接種した霊長類は、病原性ＳＩＶモデルにおい
て後のウイルス攻撃から防御されなかった49。
【０１１６】 本研究では、抗原特異的体液性及び細胞性免疫応答をサイトカイン分子アジュ
バントの共送達により調節できることが認められた。第一に、抗原特異的抗体応
答は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の遺伝子の共送達により高めることが
できる。これは、いくつかの理由で重要な発見であった。マウスにおけるＩＬ−
２及びＩＬ−４ ＤＮＡ構築物の体液性応答増大効果の結果は、アサゲザルにお
ける正の調節効果になった。実際、サルにおけるＩＬ−２もしくはＩＬ−４共送
達での抗体応答増大の大きさは、マウスにおいて認められた結果よりさらに大き
かった。さらに、ＩＬ−４共免疫サルからの血清は、同一源のＨＩＶ−１ ＭＮ
に対する最高レベルの中和活性を有した。これらの結果は、抗体応答を高めるた
めの分子アジュバント（特にＩＬ−２もしくはＩＬ−４）の使用が、防御免疫を
与えるために抗体の生成が重要であり且つ十分であるＢ型肝炎のような疾患モデ
ルにおいて重要であり得ることを示す。しかしながら、霊長類のＨＩＶ攻撃モデ
ルにおいて、抗体応答の大きさ並びにかなりの中和抗体の誘導が、この研究にお
ける防御免疫と明らかには相関しないことが認められた。むしろ、この研究から
の結果は、細胞性免疫がアカゲザルにおけるＳＨＩＶ攻撃に対する防御ではいっ
そう重要であり得ることを示唆する。
【０１１７】 一般に、抗原特異的細胞性免疫応答は、Ｔｈ２タイプサイトカイン分子アジュ
バントではなくＴｈ１の共送達により高められるようであった。例えば、正のＣ
ＴＬ応答の割合は、Ｔｈ１タイプ（ＩＬ−２及びＩＦＮ−γ）サイトカイン共送
達で増加した（０／６から２／６に）。さらに、ＩＦＮ−γを発現する構築物で
の共免疫は、刺激されたＴ細胞によるいっそう大きいレベルのＩＦＮ−γ生産を
誘導した。一方、この方法を用いたＴｈ増殖応答の調節の大きさは、確信が低か
った。これに関して、ｅｎｖ及びｇａｇ／ｐｏｌ構築物で認められるＴｈ応答は
、最初の一組の免疫中にサイトカインを共送達した動物のいずれかにおいて認め
られた細胞性応答と同様であった。これらのデータは、この方法が霊長類におけ
る免疫応答に対して大きい効果を有することができることを裏付ける。さらに、
特に細胞性応答を導く他のアジュバントを調べるべきである。この点は、ＩＬ−
４で共免疫した群からの結果によりいくらか裏付けられる。この群の動物は、全
体的な最低レベルの細胞性応答を有し、そして全ての動物は培養可能なウイルス
を有した。小さい群サイズに基づくので、この重要な問題を明らかにするために
は追加研究が必要である。
【０１１８】 データは、一般に、防御免疫におけるＴｈ１サイトカイン及びケモカインの重
要性を裏付ける。実際、防御されたサルのリンパ球から検出されるＩＦＮ−γの
レベルは、防御されないコントロール動物もしくは防御されないワクチン接種し
た動物のものより有意に大きかった。防御されるアカゲザルはまた、防御されな
い動物より有意に高いレベルのＭＩＰ−１β及びＲＡＮＴＥＳも生産した。これ
らの結果は、免疫によるこれら２つのβ−ケモカインの誘導が防御に関して重要
であり得ることを裏付ける。しかしながら、よりよい攻撃結果と関連する免疫活
性化のマーカーとしてそのような機構の有用性を識別するためには追加研究が必
要である。
【０１１９】 これらの研究は、霊長類において防御免疫を生じる複数成分ＤＮＡワクチン方
法の能力を高め、裏付ける11。Ｔｈ１表現型がＳＨＩＶモデルにおいて５０％の
総合的防御をもたらしたことに注目するのは興味深い。ＤＮＡ構築物のみはＴｈ
１偏向であるので動物＃１及び＃２をこのカテゴリーに含む場合、Ｔｈ１群の６
匹のワクチンレシピエントのうち３匹が防御された。サル＃１は、高レベルのα
−ｅｎｖ及びｇａｇ／ｐｏｌ Ｔ細胞増殖応答を有し、一方、サル＃２は、期間
にわたって最低レベルのＴリンパ球増殖応答を示した。また、サル＃１は防御さ
れ、一方、＃２は防御されなかったことも興味深い。本研究における一つのＴｈ
２偏向群、ＩＬ−４では、２匹の動物のうち０匹がウイルス複製の制御を示す。
従って、一つの可能な相関物は、以前に研究されている理論である50、Ｔｈ１表
現型に向かって応答を導くことであるようである。本研究は、他の研究12,13に
おける用量と比較した場合に低用量の免疫プロトコルを試験した。各プラスミド
の総用量は１．６ｍｇであった。わずかにより攻撃的な用量を試み、そしてより
多数の動物において防御を再試験することが重要である。Ｔｈ１群における今回
の攻撃結果は、ＨＩＶゲノムのより大きい割合をコードする組み合わせワクチン
がより優れた攻撃結果をもたらすと思われることを示唆し、そしてこの防御にお
けるｇａｇ／ｐｏｌ免疫原の重要な役割を示唆する。
【０１２０】 後続のＤＮＡ免疫方法は、３匹の免疫したアカゲザルのうち３匹において病原
性ＳＩＶmac239攻撃からの防御免疫を与えることができる。組換えもしくはサブ
ユニットタンパク質、ウイルスベクター及び特発ブースター投与方法に基づくワ
クチンは、病原性ＳＩＶmac239もしくはＳＩＶmac251に対する安定したレベルの
防御を与えていない。病原性ＳＩＶ ｉ．ｖ．攻撃に対する最も優れた防御を与
えている方法は、補助遺伝子を除去した遺伝子的に弱毒化したＳＩＶでの感染で
あり、そしてそのようなワクチンの安全性を向上することは明らかに重要な目標
である。本パイロット研究において、我々が用いたＤＮＡワクチン接種スキーム
は、全ての免疫したサルに抗原血、ウイルス検出並びに最も重要なことには疾患
及び死からの防御を与えることが認められ、この分野における追加研究を強く支
持する。これらの結果は、中和抗体がこれらの重要な結果を得るための唯一の機
構ではないことを立証するので重要である。しかしながら、これらの研究は、ど
の細胞性防御手段かがこれらのモデルにおけるウイルス制御を招くことを裏付け
るだけであり、明確には立証していない。むしろ、これらは、Ｔｈ１タイプ表現
型に向かって応答を導くことがいくらか重要であり得ることを示す。
【０１２１】 ＳＩＶ攻撃からの防御が完全にＤＮＡワクチンのみのためであるかもしくはＤ
ＮＡとＳＨＩＶ攻撃のためであるかはさらに研究すべきである。ＳＨＩＶ攻撃の
役割を本研究におけるｇａｇ特異的細胞性応答のブースター因子として考えるこ
とは、追跡免疫応答は必ずしもそのようなブースターを裏付けなかったが、重要
である。しかしながら、これらの結果は、ワクチンの安全性の悩みの種である51 、有効なワクチン接種のために複製の閾値レベルに達するウイルス複製なしに病
原性攻撃からの防御を達成できることを明らかに示す。さらに、ウイルスのセッ
トポイントに関する顕著な制御並びにＣＤ４低下、疾患及び死亡の予防を、免疫
法によりＨＩＶの複数の非ヒト霊長類モデルにおいて達成できる。これは、設計
するのが概念的に簡単でありそして投与するのが安全であると思われるワクチン
接種技術の組み合わせでウイルスのセットポイントを制御できることを意味する
ので、ＨＩＶ−１の予防的ワクチンのさらなる開発にとって励みになる。しかし
ながら、結局、ヒト集団における効果を予測するための霊長類モデルの使用は、
かなり論争の余地がある。 方法 ＤＮＡプラスミド． ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｐＣＥｎｖ）及びｇ
ａｇ／ｐｏｌタンパク質（ｐＣＧａｇ／Ｐｏｌ）を発現するＤＮＡワクチン構築
物並びにＳＩＶエンベロープタンパク質（ｐＣＳＥｎｖ）及びｇａｇ／ｐｏｌタ
ンパク質（ｐＣＳＧａｇ／Ｐｏｌ）及びＨＩＶ−２桿状エンベロープ（ｐＣＨ２
Ｅｎｖ）を発現するものは、以前に記述されているように製造した6,52,53。サ
イトカイン遺伝子は、以前に記述されているようにｐＣＤＮＡ３発現ベクター（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にクローン化し
た15,16。 マウス研究． ６〜８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａ
ｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）は、Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａで収容した。マウスの注射
及び免疫学プロトコルは、以前に記述されているように行った15,16,38。 マカク． アカゲザル（マカカ・ムラッタ）は、Ｐｒｉｍｅｄｉｃａ Ｍａｓｏ
ｎ Ｌａｂｓ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）で個々に収容した。全ての動物の世
話及び使用方法は、改訂されたＰｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ
Ｐｏｌｉｃｙ ｏｎ Ｈｕｍａｎｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに従った。動物は、全ての技術処置のためにケ
タミンＨＣＬで麻酔をかけた。 免疫及び攻撃ウイルス接種． サルは、多くの場合でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ
）及び０．２５％ブピバカイン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ
）中に調合したＤＮＡ調製物で大腿四頭筋において筋肉内（ＩＭ）に免疫した15 ,16。研究の５３週で、全てのサルを１０ ＡＩＤ50のＳＨＩＶ ＩＩＩＢ（Ｙｉ
ｃｈｅｎ Ｌｕ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより提
供された）で静脈内（ｉ．ｖ．）に攻撃した。８９週に、ＳＨＩＶ攻撃後のウイ
ルス回収について陰性であった一組の動物を１０ ＡＩＤ50のＳＩＶmac239（Ｒ
ｏｎａｌｄ Ｃ．Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｒｅｇｉｏ
ｎａｌ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒにより提供された）
でＩＶ攻撃した。各攻撃時点で生来のコントロール動物を含んだ。 ＥＬＩＳＡ． 組換えＨＩＶ−１エンベロープ及びＳＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌタン
パク質に対する血清抗体反応性は、以前に記述されているようにＥＬＩＳＡによ
り分析した11。簡潔に言えば、組換えＨＩＶ ｇｐ１２０もしくはＳＩＶ ｐ２７
タンパク質（ＩｍｍｕｎｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ
，ＭＡ）をＰＢＳに０．５μｇ／ｍｌの濃度に再懸濁した。５０μｌ（２５ｎｇ
）の各タンパク質調製物をＥＬＩＳＡウェルの各々において４℃で一晩インキュ
ベーションした。次にプレートを洗浄バッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２
０を含有する脱イオン水中０．４５％のＮａＣｌ）ですすぎ、そしてブロッキン
グバッファー（１％ ＢＳＡ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中５
％の脱脂粉乳）で３７℃で２時間ブロックした。次に血清サンプルを適切な希釈
で希釈バッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中５％の脱脂粉
乳）に希釈し、そして組換えタンパク質を被覆したウェルにおいて二重反復もし
くは三重反復で３７℃で１時間インキュベーションし、洗浄し、そして次に製造
業者により勧められる濃度で希釈バッファーに希釈したヤギ抗−ヒトＩｇ−西洋
ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と３７℃で１時間インキュベーションした。徹底的
に洗浄した後にプレートを３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンジヒド
ロクロリド（ＴＭＢ）基質（１００μｇ／ｍｌ）で発色させ、反応を２Ｎ Ｈ2Ｓ
Ｏ4で止め、そして発色を４５０ｎｍで定量した。ＢＳＡを被覆したウェルをこ
れらのアッセイにおける陰性結合コントロールウェルとして用いた。特異的結合
（４５０ｎｍでの吸光度）は、ｇｐ１２０；すなわち、実験ウェルに結合した血
清サンプルからのＡ450値からＢＳＡ（すなわち、コントロール）に結合した血
清サンプルからのＡ450値を引くことにより計算した（Ａ450実験−Ａ450コント
ロール）。 中和アッセイ． インビトロでウイルス感染を中和する血清の能力は、記述され
ている方法に従って評価した54。１００ＴＣＩＤ50のＨＩＶ−１ ＭＮもしくは
ＩＩＩＢ株を含有する上清５０μｌを実験もしくはコントロールサル血清の連続
希釈５０μｌとプレインキュベーションし、そして３ｘ１０4 ＭＴ−２標的細胞
（１００μｌ）に加えた。細胞の感染は、４８時間のインキュベーション後のｐ
２７抗原の存在により決定した。 Ｔヘルパー細胞増殖アッセイ．末梢血リンパ球は、以前に記述されているように
調製した11。単離した細胞懸濁物は、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ
）を含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ
，ＮＹ）からなる培地に５ｘ１０5細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。５ｘ１０5細
胞を含有する１００μｌのアリコートを９６ウェルマイクロタイター丸底プレー
トの各ウェルにすぐに加えた。５μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌの最終濃度の組換
えｐ２７もしくはｇｐ１２０タンパク質をウェルに三重反復で加えた。細胞を５
％ ＣＯ2中３７℃で３日間インキュベーションした。１μＣｉのトリチウム化チ
ミジンを各ウェルに加え、そして細胞を３７℃で１２〜１８時間インキュベーシ
ョンした。プレートを採取し、そして取り込まれたトリチウム化チミジンの量を
Ｂｅｔａ Ｐｌａｔｅ読み取り装置（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎ
ｄ）において測定した。刺激指数は、式： 刺激指数（ＳＩ）＝（実験計数／自発計数） から決定した。自発計数ウェル（培地のみ）は、無関係のタンパク質コントロー
ルとして用いる１０％ウシ胎仔血清を含む。細胞が健康であったことを保証する
ために、コンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ）をポリクローナル刺激物質陽性コント
ロールとして用いた。 細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ． 標準的な５時間51Ｃｒ放出ＣＴＬアッセイを
以前に記述されているように接種した及びコントロールのサルからのＰＢＭＣに
対して行った11。Ｔ細胞のインビトロ刺激のための細胞は、ＨＩＶ−１エンベロ
ープ（ｖＭＮ４６２）もしくはＳＩＶ ｇａｇタンパク質を発現する組換えワク
シニアウイルスを自己由来でトランスフォーメーションしたＢリンパ芽球様細胞
系（ＬＣＬｓ）に感染させることにより製造した。使用前に感染細胞を０．１％
グルタルアルデヒドで固定し、そして０．１ｍＭグルタミン溶液でブロックした
。固定した細胞をＣＴＬ刺激物質培地（ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲ
Ｌ），１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）及び組換えＩＬ−２（４０Ｕ
／ｍｌ）（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ，Ｐｕｒｃｈａｓｅ，ＮＹ））において刺激のため
に単離したＰＢＭＣ（エフェクター）と３週間インキュベーションした。特定の
組換えワクシニアウイルスもしくはβ−ガラクトシダーゼを発現するコントロー
ル組換えワクシニアウイルス（ｖＳＣ８）を感染させたＬＣＬもまた標的細胞と
して用いた。コントロールワクシニアとインキュベーションした細胞は、溶解の
バックグラウンドレベルを与えるために標的として用いた。 サイトカイン発現分析． ＣＴＬアッセイのために刺激したエフェクターからの
上清を集め、そしてＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０のＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｏ
ｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ
）を用いてサイトカインプロフィールについて試験した。ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ
−１β、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−１の発現は、ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｔｅｒ
ｇｅｎ）を用いて分析した。 限界希釈共培養による細胞関連ウイルス負荷． ウイルス負荷は、以前に記述さ
れている方法14を用いてＣＥＭｘ１７４標的細胞と単離したＰＢＭＣとの限界希
釈共培養により決定した。１０6細胞から開始するＰＢＭＣの１２の連続１：３
希釈物を２４ウェルプレートにおいてウェル当たり１０5 ＣＥＭｘ１７４細胞と
二重反復で共培養した。２１日の培養後に上清サンプルを集め、そしてＣｏｕｌ
ｔｅｒ ｐ２７抗原アッセイキットでのｐ２７抗原の分析まで−７０℃で凍結し
て保存した。 血漿抗原血． 血漿ｐ２７レベルを決定するためにＳＩＶ ｍａｃ２３９での攻
撃の２週後に血漿サンプルを分析した。アッセイは、Ｃｏｕｌｔｅｒ ｐ２７抗
原キットを用いて行った。 血漿ＲＮＡ． クエン酸ナトリウム中に集めた全血からの血漿サンプルを、Ｃｈ
ｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡにより開発さ
れた分枝ＤＮＡアッセイ（ｂＤＮＡ）を用いてｍｌ当たりのＳＩＶ ＲＮＡコピ
ーについて分析した。 フローサイトメトリー． ＥＤＴＡ中に集めた全血を、以前に記述されている方
法14を用いて赤血球溶解後にリンパ球の一組ＣＤ４（ＯＫＴ４ａ（Ｏｒｔｈｏ）
及び抗−Ｌｅｕ３ａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））、ＣＤ８（抗−Ｌ
ｅｕ２ａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））及びＣＤｗ２９（４Ｂ４）（
Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）について分析した。簡潔に言えば、抗
体（容量は抗体により決まる）を１００μＬの全血に加え、そして暗所で１０分
間インキュベーションした。溶解溶液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を
加え、そしてサンプルを室温で１０分間インキュベーションした。染色した細胞
を０．５％パラホルムアルデヒドで固定した。サンプルをＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎ血球計算器上で分析した。 参考文献、これらは引用することにより各々が本明細書に組み込まれる。
【０１２２】 表１ ピコルナウイルス科 属：ライノウイウス：（医学的）感冒の〜５０％の症例の原因である。
【０１２３】 エンテロウイルス：（医学的）ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、
エコーウイルス、及びＡ型肝炎ウイルスのようなヒトエンテロウイルスを含む。
【０１２４】 アフトウイルス：（獣医学的）これらは口蹄疫ウイルスである。
【０１２５】 標的抗原：ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰＧ カリシウイルス科 属：ノーウォークグループのウイルス：（医学的）これらのウイルスは、流行
性胃腸炎の重要な原因因子である。 トガウイルス科 属：アルファウイルス：（医学的及び獣医学的）例には、シンドビスウイルス
、ロス川ウイルス並びに東部及び西部ウマ脳炎が包含される。
【０１２６】 ルビウイルス：（医学的）風疹ウイウス フラリウイルス科 例には：（医学的）デング熱、黄熱病、日本脳炎、セントル
イス脳炎及びダニ媒介脳炎ウイルスが包含される。 Ｃ型肝炎ウイルス：（医学的）これらのウイルスは科に属さないが、トガウイル
スもしくはフラビウイルスのいずれかであると考えられる。最大の類似性はトガ
ウイルス科とである。 コロナウイルス科：（医学的及び獣医学的） 伝染性気管支炎ウイルス（家禽） ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ブタ） ブタ赤血球凝集脳脊髄炎ウイルス（ブタ） ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ） ネコ腸コロナウイルス（ネコ） イヌコロナウイルス（イヌ） ヒト呼吸器コロナウイルスは、感冒の〜４０の症例の原因となる。ＥＸ．２２
４Ｅ，０Ｃ４３ 備考−コロナウイルスは、非Ａ，ＢもしくはＣ型肝炎の原因となる可能性があ
る。 標的抗原：Ｅ１−Ｍもしくはマトリックスタンパク質とも呼ばれる Ｅ２−Ｓもしくはスパイクタンパク質とも呼ばれる Ｅ３−ＨＥもしくは赤血球凝集素−エルテローズ（ｅｌｔｅｒｏｓｅ
）糖タンパク質とも呼ばれる （全てのコロナウイルスに存在するわけではない） Ｎ−ヌクレオカプシド ラブドウイルス科 属：ベシクロウイルス：水疱性口内炎ウイルス リッサウイルス：（医学的及び獣医学的）狂犬病 標的抗原：Ｇタンパク質 Ｎタンパク質 フィロウイルス科：（医学的） マルブルク及びエボラウイルスのような出血熱ウイルス パラミクソウイルス科： 属：パラインフルエンザウイルス１型 パラインフルエンザウイルス３型 ウシパラインフルエンザウイルス３型 ルブラウイルス（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）（医学的及び獣医学的） 流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエン
ザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリにおける重要な病原体） モルビリウイルス：（医学的及び獣医学的） 麻疹、イヌジステンパー 肺炎ウイルス：（医学的及び獣医学的） ＲＳウイルス オルトミクソウイルス科（医学的） インフルエンザウイルス ブンヤウイルス科 属：ブンヤウイルス：（医学的）カリフォルニア脳炎、ラ・クロス フレボウイルス：（医学的）リフトバレー熱 ハンタウイルス：プレマラ（Ｐｕｒｅｍａｌａ）は出血熱（ｈｅｍａｈａ
ｇｉｎ ｆｅｖｅｒ）ウイルスである。
【０１２７】 ナイロウイルス（獣医学的）ナイロビヒツジ病 さらに、多数の特定されていないブンガウイルス アレナウイルス科（医学的） ＬＣＭ、ラッサ熱ウイルス レオウイルス科 属：レオウイルス：可能性があるヒト病原体 ロタウイルス：子供における急性胃腸炎 オルビウイルス：（医学的及び獣医学的） カルチウイルス（Ｃｕｌｔｉｖｉｒｕｓ）：コロラドダニ熱、レボンボ（
Ｌｅｂｏｍｂｏ）（ヒト）ウマ脳症、ブルータング レトロウイルス科 亜科：オンコウイルス：（獣医学的）（医学的）ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬ
ＶＩ及びＨＴＬＶＩＩ レンチウイルス：（医学的及び獣医学的）ＨＩＶ、ネコ免疫不全ウイルス
、ウマ感染、貧血ウイルス スプマウイルス パポバウイルス科 亜科：ポリオーマウイルス：（医学的）ＢＫＵ及びＪＣＵウイルス 亜科：パピローマウイルス：（医学的）癌もしくは乳頭腫の悪性進行と関連す
る多数のウイルスタイプ。 アデノウイルス（医学的） ＥＸ ＡＤ７，ＡＲＤ．，Ｏ．Ｂ．−呼吸器疾患の原因となる−２７５のよう
ないくつかのアデノウイルスは腸炎の原因となる。 パルボウイルス科（獣医学的） ネコパルボウイルス：ネコ腸炎の原因となる。
【０１２８】 ネコ汎白血球減少症ウイルス イヌパルボウイルス ブタパルボウイルス ヘルペスウイルス科 亜科：アルファヘルペスウイルス 属：単純ウイルス（医学的） ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ バリセロウイルス：（医学的−獣医学的）仮性狂犬病−水痘帯状疱疹 亜科−ベータヘルペスウイルス 属：サイトメガロウイルス（医学的） ＨＣＭＶ ムロメガロウイルス（Ｍｕｒｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ） 亜科：ガンマヘルペスウイルス 属：リンホクリプトウイルス（Ｌｙｍｐｈｏｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ）（医学
的） ＥＢＶ−（バーキットリンパ腫） ラジノウイルス（Ｒｈａｄｉｎｏｖｉｒｕｓ） ポックスウイルス科 亜科：コルドポックスウイルス（医学的−獣医学的） 属：オルトポックスウイルス 痘瘡（痘瘡） ワクシニア（牛痘） パラポックスウイルス−獣医学的 アビポックスウイルス−獣医学的 カプリポックスウイルス レポリポックスウイルス スイポックスウイルス 亜科：エンテモポックスウイルス ヘパドナウイルス科：Ｂ型肝炎ウイルス 未分類：デルタ肝炎ウイルス 表２ 細菌病原体 病原性グラム陽性球菌には：肺炎双球菌；ブドウ球菌；及びストレプトコッカ
スが包含される。病原性グラム陰性球菌には：髄膜炎菌及び淋菌が包含される。
【０１２９】 病原性腸内グラム陰性杆菌には：腸内細菌科；シュードモナス、アシネトバク
テリア及びエイケネラ（ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）；類鼻疽；サルモネラ；細菌性赤
痢；ヘモフィルス；モラクセラ；軟性下疳；ブルセラ症；ツラレミア；エルジニ
ア（パスツレラ）；連鎖杆菌属モニリフォルミス及びスピリルム；リステリア菌
；豚丹毒菌；ジフテリア；コレラ；炭疽；ドノヴァン症（鼡径部肉芽腫）；並び
にバルトネラ症が包含される。
【０１３０】 病原性嫌気性細菌には：破傷風；ボツリヌス中毒；他のクロストリジウム属；
結核；らい病；及び他のマイコバクテリウム属が包含される。病原性スピロヘー
タ病には：梅毒；トレポネーマ症：フランベジア、ピンタ及び性行為外の梅毒；
並びにレプトスピラ症が包含される。
【０１３１】 高等病原体細菌及び病原性真菌により引き起こされる他の感染には：放線菌症
；ノカルジア症；クリプトコックス症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症及
びコクシジオイデス真菌症；カンジダ症、アスペルギルス症及びムコール菌症；
スポロトリクス症；パラコクシジオイドミコーシス、ペトリエリジオーシス（ｐ
ｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｏｓｉｓ）、トルロプシス症、菌腫及びクロモミコーシス
；並びに皮膚糸状菌症が包含される。
【０１３２】 リケッチア感染には、リケッチア及びリケッチア症が包含される。 マイコプラズマ及びクラミジア感染の例には：マイコプラズマ肺炎；性病性リン
パ肉芽腫；オウム病；及び周産期クラミジア感染が包含される。 病原性真核生物 病原性原生動物及び蠕虫並びにそれによる感染には：アメーバ症；マラリア；
リーシュマニア症；トリパノソーマ症；トキソプラソマ症；ニューニシスティス
；バベシア症；ジアルジア鞭毛虫症；旋毛虫症；フィラリア症；住吸血虫症；線
虫；吸虫（ｔｒｅｍａｔｏｄｅｓ）もしくは吸虫（ｆｌｕｋｅｓ）；及び条虫（
サナダムシ）感染が包含される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/385 Ａ６１Ｋ 39/385 ４Ｈ０４５ 39/395 39/395 Ｔ Ａ６１Ｐ 1/04 Ａ６１Ｐ 1/04 3/10 3/10 5/50 5/50 17/00 17/00 17/06 17/06 25/00 25/00 29/00 １０１ 29/00 １０１ 35/00 35/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ０７Ｋ 14/16 15/09 14/28 // Ｃ０７Ｋ 14/16 19/00 14/28 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 19/00 15/00 Ａ (72)発明者 ツアング，ドングイ アメリカ合衆国ペンシルベニア州19143フ イラデルフイア・アパートメントビー３・ パインストリート4730 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 BA36 CA02 DA02 GA12 HA17 4B065 AA90X AB01 CA24 CA45 4C084 AA01 AA13 CA01 CA53 CA56 DA01 DB52 NA14 ZA02 ZA68 ZA89 ZA94 ZA96 ZB15 ZB26 ZC35 ZC55 4C085 AA03 AA14 BA51 BB01 BB11 BB17 CC01 CC08 CC21 CC23 4C086 AA01 AA02 EA16 NA14 ZA02 ZA68 ZA89 ZA94 ZA96 ZB15 ZC35 4H045 AA10 AA30 BA41 CA05 DA01 DA86 EA28

Claims (31)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 共刺激（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）分子を発現する細胞
    に化合物を導入する方法であって、該化合物及び共刺激リガンドを含んでなる非
    細胞性粒子と該細胞とを接触させることを含んでなる方法。
  2. 【請求項２】 化合物が核酸分子もしくはタンパク質である請求項１の方法
    。
  3. 【請求項３】 化合物がＤＮＡである請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 化合物が、細胞において機能する調節要素に操作可能に連結
    されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡである請求
    項１の方法。
  5. 【請求項５】 化合物が、細胞において機能する調節要素に操作可能に連結
    された免疫原性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡで
    ある請求項１の方法。
  6. 【請求項６】 化合物が、細胞において機能する調節要素に操作可能に連結
    された非免疫原性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ
    である請求項１の方法。
  7. 【請求項７】 化合物がウイルスタンパク質である請求項１の方法。
  8. 【請求項８】 共刺激分子を発現する細胞が樹状細胞もしくはマクロファー
    ジ細胞である請求項１の方法。
  9. 【請求項９】 共刺激リガンドが、共刺激分子の抗体もしくは天然のリガン
    ドである請求項１の方法。
  10. 【請求項１０】 共刺激リガンドが、共刺激リガンド部分及びウイルスタン
    パク質部分を含む融合タンパク質である請求項１の方法。
  11. 【請求項１１】 粒子が、ウイルス粒子、タンパク質複合体、リポソームも
    しくは陽イオン両親媒性物質／ＤＮＡ複合体である請求項１の方法。
  12. 【請求項１２】 化合物及び融合タンパク質を含んでなる粒子と細胞とを接
    触させることを含んでなる細胞に化合物を導入する方法であって、融合タンパク
    質はＣＤ２８の細胞外領域並びにＨＩＶ−１ ｇｐ４１の膜貫通及び細胞質領域
    を含んでなる方法。
  13. 【請求項１３】 治療タンパク質もしくは治療タンパク質をコードする核酸
    分子、及び共刺激リガンドを含んでなる粒子を個体の体上のある部位で該個体の
    組織に投与するという工程を含んでなる治療タンパク質を個体に送達する方法。
  14. 【請求項１４】 粒子が、非免疫原性治療タンパク質もしくは非免疫原性治
    療タンパク質をコードするＤＮＡ分子を含有する請求項１３の方法。
  15. 【請求項１５】 粒子が、増殖因子もしくはサイトカインまたは増殖因子も
    しくはサイトカインをコードするＤＮＡ分子を含有する請求項１３の方法。
  16. 【請求項１６】 粒子が、ウイルス粒子、タンパク質複合体、リポソームも
    しくは陽イオン両親媒性物質／ＤＮＡ複合体である請求項１３の方法。
  17. 【請求項１７】 共刺激リガンドをコードする組換え発現ベクターを含んで
    なる癌細胞を個体に投与することを含んでなる癌に対する免疫方法。
  18. 【請求項１８】 化合物及び共刺激リガンドを含んでなる粒子。
  19. 【請求項１９】 共刺激リガンドが、ＣＤ２８の細胞外領域並びにＨＩＶ−
    １ ｇｐ４１の膜貫通及び細胞質領域を含んでなる融合タンパク質である請求項
    １８の粒子。
  20. 【請求項２０】 化合物が核酸もしくはタンパク質である請求項１８の粒子
    。
  21. 【請求項２１】 化合物がＤＮＡである請求項１８の粒子。
  22. 【請求項２２】 化合物が、細胞において機能する調節要素に操作可能に連
    結された免疫原性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ
    である請求項１８の粒子。
  23. 【請求項２３】 化合物が、細胞において機能する調節要素に操作可能に連
    結された非免疫原性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮ
    Ａである請求項１８の粒子。
  24. 【請求項２４】 粒子が、ウイルス粒子、タンパク質複合体、リポソームも
    しくは陽イオン両親媒性物質／ＤＮＡ複合体である請求項１８の粒子。
  25. 【請求項２５】 共刺激リガンドをコードする組換え発現ベクターを含んで
    なる癌細胞。
  26. 【請求項２６】 調節要素に操作可能に連結された免疫原性タンパク質をコ
    ードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ分子を個体の体上のある部位で該
    個体の組織に投与し、続いて免疫原性タンパク質を含んでなる粒子を該個体に投
    与するという工程を含んでなる個体を免疫する方法。
  27. 【請求項２７】 該粒子が化合物をさらに含んでなる請求項２６の方法。
  28. 【請求項２８】 化合物が核酸分子である請求項２７の方法。
  29. 【請求項２９】 化合物がＤＮＡである請求項２８の方法。
  30. 【請求項３０】 化合物が、細胞において機能する調節要素に操作可能に連
    結された免疫原性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ
    である請求項２９の方法。
  31. 【請求項３１】 粒子がウイルス粒子もしくはタンパク質複合体である請求
    項２６の方法。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8216585B2 (en) 2001-05-25 2012-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeted particles and methods of using the same
DE60327948D1 (de) * 2002-12-24 2009-07-23 Immunofrontier Inc Polynukleotidhaltige impfstoffe
US8354110B2 (en) 2007-03-07 2013-01-15 Uti Limited Partnership Compositions and methods for the prevention and treatment of autoimmune conditions
US9511151B2 (en) * 2010-11-12 2016-12-06 Uti Limited Partnership Compositions and methods for the prevention and treatment of cancer
US10988516B2 (en) 2012-03-26 2021-04-27 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating inflammation
US9603948B2 (en) 2012-10-11 2017-03-28 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating multiple sclerosis and related disorders
EP3065771B1 (en) 2013-11-04 2019-03-20 UTI Limited Partnership Methods and compositions for sustained immunotherapy
US12011480B2 (en) 2015-05-06 2024-06-18 Uti Limited Partnership Nanoparticle compositions for sustained therapy

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993000103A1 (en) * 1991-06-21 1993-01-07 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Chimeric envelope proteins for viral targeting
WO1996019495A1 (en) * 1994-12-20 1996-06-27 Duke University Methods and compositions for inhibition of membrane fusion-associated events, including hiv transmission

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5631154A (en) * 1988-06-10 1997-05-20 Therion Biologics, Incorporated Self assembled, defective, non-self-propagating lentivirus particles
US6015686A (en) * 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
DK0784483T3 (da) * 1994-10-03 2001-03-26 Us Gov Health & Human Serv Præparat indeholdende et rekombinant virus, der udtrykker et antigen, og et rekombinant virus, der udtrykker et immunstimul
US6348450B1 (en) * 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
EP1073759B1 (en) * 1998-05-01 2011-06-01 Schering-Plough Ltd. Recombinant virus expressing foreign dna encoding feline cd80, feline cd28, feline ctla-4 or feline cd86 and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993000103A1 (en) * 1991-06-21 1993-01-07 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Chimeric envelope proteins for viral targeting
WO1996019495A1 (en) * 1994-12-20 1996-06-27 Duke University Methods and compositions for inhibition of membrane fusion-associated events, including hiv transmission

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