JP2003534016A - 天然ウイルス感染を模倣し、病原体に対する持続的な免疫を誘発する遺伝子ワクチン - Google Patents

天然ウイルス感染を模倣し、病原体に対する持続的な免疫を誘発する遺伝子ワクチン

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Abstract

(57)【要約】 ヒトのような宿主の1つ以上の病原体に対する免疫を高める遺伝子ワクチン及び方法が提供される。一の実施態様において、組換え良性ウイルスは遺伝子ワクチンとして提供される。組換えウイルスは病原性ウイルス由来のウイルス抗原をコードする組換えウイルスと非相同的である抗原配列及び宿主における発現が該ウイルス抗原の免疫原性を高める免疫賦活剤をコードする組換えウイルスと非相同的である免疫賦活剤配列を含み、該ウイルス抗原の発現は該ウイルス抗原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに感染したときに細胞は宿主において該ウイルス抗原を発現する。組換えウイルスは複製能力がなく、宿主において該病原性ウイルスに本来的に関連した悪性を生じない。遺伝子ワクチンはHIV、エボラウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、病原性細菌及び寄生虫のような広範な病原体に対して宿主を免疫するために使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、ヒト及びその他の宿主の免疫応答を刺激するワクチンに関し、特に
、エボラウイルス、HIV、肝炎ウイルス及びインフルエンザウイルスのような病
原性ウイルスの異種抗原を発現する組換えウイルスに関する。
【０００２】発明の背景 ワクチン開発に関する現在の技術は、変性ウイルス又は細菌から作られる精製
ウイルスタンパク質を用いる概念に、大部分は基づいている。これらのタイプの
ワクチンは、病原菌の限られたメンバーについてのみ効果を有することができ、
保護率は制限される。 エボラウイルス及びHIVウイルスを含めた、膜（エンベロープ）糖タンパク質
（GPs）を含むウイルスについて、変性ウイルス又は精製ウイルスタンパク質の
使用は、しばしば満足に作用しない。これに関して、幾つかの理由を挙げること
ができる。第一に、これらのウイルスのGPsが変性手順に対して敏感であるため
、タンパク質のエピトープが変性プロセスにより変化する。第二に、GPsの糖質
部分は、抗体を中和するのに重要な抗原決定基である。相対的に、細菌で作られ
るタンパク質は適切にグリコシル化されておらず、天然ウイルスタンパク質のも
のと異なる抗原性を有することができる少し違う構造に折り畳まれる可能性があ
る。さらに、弱毒又は変性ウイルスに基づく多くのワクチンは、免疫原性が低い
抗原に対して弱い免疫応答を与える。さらに、ワクチン製剤は、しばしば限られ
た保護のみを与え、要望どおりの一生の免疫を与えない。
【０００３】 裸のDNA又はDNAワクチン技術と呼ばれるその他のワクチンアプローチは、体に
直接注入されるプラスミドによって抗原を発現する。これらの方法は、インビボ
で細胞にプラスミドを移入することによる、抗原コード遺伝子を有するDNAプラ
スミドの慎重な導入に関連する。そのプラスミドは、免疫応答を引き起こす抗原
を発現する。DNAワクチンによって刺激される免疫応答は、おそらく低いレベル
のプラスミドの取り込み及び細胞における低いレベルの抗原発現のために、非常
に非効率的であるかもしれない。また、DNAワクチンは、ベクターの分解のため
に、非常に短い抗原発現期間によっても特徴付けられる。さらに、DNAワクチン
は、大量に生成するには、難しく、高価である。 また、複製能力がある、生ワクチンウイルスもB型肝炎（HBV）、ヒト免疫不全
ウイルス（HIV）、インフルエンザ及びマラリア抗原の遺伝子の発現のために修
飾されている。もっとも、ある場合には、組換えワクチンの免疫応答は、しばし
ば限られた性質及び大きさのものである。このように、例えば、ワクシニアイン
フルエンザ組換え体による末梢免疫化は、下気道感染に対してよい保護を与える
が、上気道における免疫を誘導できない。一方、組換えワクチンによる末梢免疫
化は、全身性免疫よりも局所免疫が必要とされる場合、例えば胃腸管などで効果
がないことがわかっている。
【０００４】 モルモットの部分的な保護を与えるために、エボラウイルスGPを発現する組換
えワクシニアウイルスによるワクチン接種が試みられている（Gilligan, K.J.ら
, Vaccines, 97:87-92 (1997)）。GP又はヌクレオキャプシドタンパク質（NP）
のいずれかを発現するDNA構造物によるワクチン接種は、エボラウイルスによる
致死的攻撃からマウスを保護する（Vanderzanden, L.ら, Virology, 246(1):134
-44 (1998)）。しかしながら、これらの各アプローチは、ヒトにおけるエボラウ
イルスワクチンについて決して理想的な選択ではないようにする、それぞれの組
の制限を有する。例えば、ワクシニアウイルスはベクター感染した細胞を素早く
死滅させる。その結果、ワクチン抗原はほんの短い時間発現される。しかし、こ
のタイプのアプローチの主な制限は、ワクシニアウイルスの複製が免疫システム
を引き起こして、主としてワクシニアタンパク質に反応することであり、免疫応
答のごく一部が病原性ウイルスの抗原を標的にする。この現象は“抗原希釈”と
呼ばれている。 ポックスウイルスのような強いプロモーターを有するウイルスによるワクチン
抗原の発現を含む、これらの欠陥を治療するための従前の試みは、意義深い成功
に遭遇していない。 今のところ、ワクチンはHIV感染に対する保護を与えるのに効果的ではない。
ワクチンを開発する試みは、今のところ失敗している。HIVと反応するある特定
の抗体、特に抗GP160/120は、HIV感染の無症候及び症候フェーズの両方にまたが
って高いレベルで存在し、保護の役割を果たすよりも、そのような抗体が、実際
にウイルスの宿主細胞への付着及び浸透を促進するかもしれないことを示唆する
。さらに重要なことに、現在のワクチンは、感染細胞、新しく放出されたビリオ
ンの源に対して効果的な細胞応答を誘導しない。
【０００５】 発明の概要 遺伝子ウイルスワクチンが提供される。これらのワクチンは、ヒト、家畜及び
その他の哺乳動物のような免疫される宿主において病原性ウイルスと本来的に関
連した疾病を引き起こすことなしに病原性ウイルスの自然感染を模倣するように
設計される。 ワクチンは複製欠陥又は能力のない組換え良性ウイルスである。良性ウイルス
は、ウイルス、細菌及び寄生虫のような広範囲の病原体由来の抗原を発現するよ
うに設計し、これらの抗原を天然に発現するこの広範囲のウイルス、細菌、及び
寄生虫を処理するために使用してもよい。良性ウイルスの感染は、宿主細胞が病
原性ウイルスの抗原を発現するようにし、まるでその細胞が病原性ウイルスに感
染し、宿主において強く持続的な免疫応答を引き起こすように、その天然のコン
ホメーション及び経路に抗原を提示する。
【０００６】 一の実施態様において、組換え良性ウイルスはそのウイルスに感染した宿主に
おいて免疫応答を誘導するために提供される。組換えウイルスは、病原性ウイル
ス由来のウイルス抗原をコードする良性ウイルスと非相同的である抗原配列、及
び宿主における発現が該ウイルス抗原の免疫原性を高める免疫賦活剤をコードす
る良性ウイルスと非相同的である免疫賦活剤配列を含み、該ウイルス抗原の発現
は該病原性ウイルスに向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに感
染したときに細胞は宿主において該ウイルス抗原を発現する。組換えウイルスは
複製能力がなく、宿主において該病原性ウイルスに関連した疾病を生じない。 この実施態様の多様性において、組換え良性ウイルスはアデノウイルス、アデ
ノ随伴ウイルス、SV40ウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス又はワ
クシニアウイルスのような複製能力のないウイルスであってもよい。好ましくは
、良性ウイルスはその感染力を保持するが、その良性ウイルスの未変性前駆体の
病理的領域を有さない。
【０００７】 好ましい実施態様において、良性ウイルスは複製能力のないアデノウイルスで
あり、より好ましくはアデノウイルスタイプ5である。非相同的抗原配列はアデ
ノウイルスのE1、E3又はE4領域に位置してもよい。免疫賦活剤配列はアデノウイ
ルスのE4、E3又はE1領域に位置してもよい。 好ましい実施態様の多様性において、非相同的抗原配列及び免疫賦活剤配列は
アデノウイルスのE1、E3又はE4領域に位置し、非相同的抗原配列及び免疫賦活剤
配列は内部リボソーム侵入部位（internal ribosomal entry site）又はスプラ
イシングドナー-アクセプターメカニズム（splicing donor-acceptor mechanism
）を経てプロモーターからビシストロン的に（bicistronically）発現される。 ウイルス抗原又は免疫賦活剤の発現は組換えウイルスの未変性前駆体と相同的
であるプロモーターによって制御してもよい。あるいは、ウイルス抗原の発現は
組換えウイルスの未変性前駆体と非相同的であるプロモーターによって制御して
もよい。例えば、組換えウイルスの未変性前駆体と非相同的であるプロモーター
はインシュリンプロモーター、ヒトのサイトメガロウイルス（CMV）プロモータ
ー及びその初期プロモーター、サルのウイルスSV40プロモーター、ラウス肉腫ウ
イルスLTRプロモーター／エンハンサー、ニワトリの細胞質β-アクチンプロモー
ターのような真核生物のプロモーター、及びテトラサイクリン誘発性プロモータ
ーのような誘発性プロモーターであってもよい。 病原性ウイルスはヒト又はその他の動物の発病効果又は疾病を生じる任意の病
原性ウイルスであってもよい。このように、組換え良性ウイルスは病原性ウイル
スの感染から宿主を保護するためにワクチンとして使用することができる。
【０００８】 多様性において、病原性ウイルスはHIV-1及びHIV-2のようなヒト免疫不全ウイ
ルス（HIV）の種々の菌株であってもよい。ウイルス抗原はHIV GP120及びGP41の
ようなHIV糖タンパク質（又は表面抗原）、又はHIV P24タンパク質のようなキャ
プシドタンパク質（又は構造タンパク質）であってもよい。 他の多様性において、病原性ウイルスはエボラウイルスであってもよい。ウイ
ルス抗原はエボラGP1又はGP2タンパク質のようなエボラ糖タンパク質又は表面抗
原であってもよい。 さらに別の多様性において、病原性ウイルスはA型、B型、C型、D型又はE型肝
炎ウイルスのような肝炎ウイルスであってもよい。例えば、ウイルス抗原はスモ
ールB型肝炎表面抗原（SHBsAg）（オーストラリア抗原としても参照される）、
ミドルB型肝炎表面抗原（MHBsAg）及びラージB型肝炎表面抗原（LHBsAg）のよう
なB型肝炎ウイルスの表面抗原又はコアタンパク質であってもよい。ウイルス抗
原はNS3、NS4及びNS5抗原のようなC型肝炎ウイルスの表面抗原又はコアタンパク
質であってもよい。 さらに別の多様性において、病原性ウイルスは呼吸器合胞体ウイルス（RSV）
であってもよい。例えば、RSVウイルス抗原はRSVの糖タンパク質（G-タンパク質
）又は融合タンパク質（F-タンパク質）であってもよく、その配列はGenBankか
ら入手できる。 さらに別の多様性において、病原性ウイルスはHSV-1及びHSV-2のような単純ヘ
ルペスウイルス（HSV）であってもよい。例えば、HSVウイルス抗原はHSV-2由来
の糖タンパク質Dであってもよい。 さらに別の多様性において、ウイルス抗原は乳癌細胞のHer2及びリンパ腫細胞
のCD20のような腫瘍抗原、ヒトの乳頭腫ウイルスのE6及びE7のようなウイルスの
癌遺伝子、又は突然変異したrasのような細胞由来癌遺伝子であってもよい。
【０００９】 その他のウイルス関連タンパク質又は抗原が当業者にとって容易に入手可能で
あることが知られている。病原性ウイルス及び病原性ウイルスに関連するウイル
ス抗原の選択は本発明の制限因子ではない。 また、組換えウイルスは免疫賦活剤を発現し、ウイルス感染による宿主細胞の
サイトカイン放出応答を模倣し、さらに組換えウイルスから同時発現されるウイ
ルス抗原に対する免疫応答を増大する。免疫賦活剤は、好ましくはサイトカイン
であってもよい。サイトカインの例としては、インターロイキン-2、インターロ
イキン-8、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン
、γ-インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、及び顆粒球マクロ
ファージコロニー刺激因子（GM-CSF）が挙げられるが、これらに限定されない。 ウイルス抗原は全長抗原性ウイルスタンパク質又は支配的抗原、中和抗原又は
病原性ウイルスのエピトープを含む抗原性ウイルスタンパク質の一部であっても
よい。あるいは、ウイルス抗原は病原性ウイルスの少なくとも2つの菌株の糖タ
ンパク質の定常領域を含む。 多様性において、ウイルス抗原はウイルス抗原がその抗原性を保持するがウイ
ルス成分として機能しないような病原性ウイルスの糖タンパク質から突然変異し
た変性抗原であってもよい。ウイルス抗原のそのような変性としては、糖タンパ
ク質のタンパク質分解切断部位における欠失、及び糖タンパク質の免疫抑制ペプ
チド領域の複製及び再配列が挙げられる。
【００１０】 他の実施態様において、組換えウイルスはそのウイルスに感染した宿主の免疫
応答を誘発するために提供される。組換えウイルスは病原性ウイルス由来のウイ
ルス抗原をコードする組換えウイルスと非相同的である抗原配列を含み、該ウイ
ルス抗原の発現は該ウイルス抗原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換え
ウイルスに感染したときに細胞が宿主において該ウイルス抗原を発現する。 この実施態様によれば、組換えウイルスは、好ましくは複製能力のないアデノ
随伴ウイルス、SV40ウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス及びワク
シニアウイルスである。組換えウイルスは宿主に感染することができ、好ましく
は、組換えウイルスの未変性前駆体由来の病理的領域を含まない。 必要により、組換えウイルスは宿主における発現がウイルス抗原の免疫原性を
高める免疫賦活剤をコードする組換えウイルスと非相同的である免疫賦活剤配列
を含んでもよい。 また、本発明は、未変性の病原性ウイルスの自然感染をさらに模倣する宿主に
対する複数の抗原を提示し、宿主において病原性ウイルスの種々の菌株又はタイ
プに対して強く持続的な免疫応答を誘発するウイルスワクチンを提供する。
【００１１】 一の実施態様において、組換えウイルスはそのウイルスに感染した宿主におけ
る免疫応答を誘発するためのウイルスワクチンとして提供される。組換えウイル
スは、組換えウイルスと非相同的である複数の抗原配列を含み、それぞれは同じ
病原性ウイルス、病原性ウイルスの異なる菌株、又は異なる種類の病原性ウイル
ス由来のウイルス抗原をコードし、複数の抗原配列の発現は該ウイルス抗原に向
いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに感染したときに細胞が宿主
において該ウイルス抗原を発現する。好ましくは、該組換えウイルスは複製能力
がなくてもよく、宿主において病原性ウイルスと本来的に関連した悪性を生じな
くてもよい。 本実施態様によれば、該組換えウイルスは任意のウイルスであってもよく、好
ましくは複製能力のないアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、SV40ウイルス、
レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス又はワクシニアウイルスである。また、
良性ウイルスは、好ましくは、その感染力を保持するが、良性ウイルスの未変性
前駆体の病理的領域を欠失させてもよい。
【００１２】 また、本実施態様によれば、複数の抗原配列は同じ抗原配列の複数のコピー又
は互いに異なる多数の抗原配列であってもよい。 本実施態様の多様性において、複数の抗原配列の少なくとも2つは内部リボソ
ームの侵入部位又はスプライシングドナー-アクセプターメカニズムを経てプロ
モーターからビシストロン的に発現される。 必要により、複数の抗原配列の少なくとも2つはプロモーターから発現されて
融合タンパク質を形成してもよい。 また、本実施態様によれば、ウイルスゲノムは、さらに、複数の抗原配列の少
なくとも2つの発現を制御する組換えウイルスの未変性前駆体と非相同的である
少なくとも1つのプロモーターを含む。組換えウイルスの未変性前駆体と非相同
的であるプロモーターの例としては、インシュリンプロモーター、CMVプロモー
ター及びその初期プロモーター、SV40プロモーター、レトロウイルスLTRプロモ
ーター／エンハンサー、ニワトリの細胞質β-アクチンプロモーター、及びテト
ラサイクリン誘発性プロモーターのような誘発性プロモーターが挙げられるが、
これらに限定されない。
【００１３】 また、本実施態様によれば、複数の抗原配列は病原性ウイルスの少なくとも2
つの菌株由来の抗原の組み合わせであってもよい。 必要により、複数の抗原配列は少なくとも2つの異なる病原性ウイルス由来の
抗原の組み合わせであってもよい。例えば、複数の抗原配列はHIV-1、HIV-2、単
純ヘルペスウイルスタイプ1、単純ヘルペスウイルスタイプ2、エボラウイルス、
マールブルク病ウイルス、及びA型、B型、C型、D型、及びE型肝炎ウイルス由来
の抗原の組み合わせであってもよい。 本実施態様の多様性において、組換えウイルスは、さらに、良性ウイルスと非
相同的である1つ以上の免疫賦活剤配列を含でもよく、宿主における発現が該ウ
イルス抗原の免疫原性を高める免疫賦活剤をコードする。例えば、免疫賦活剤は
サイトカインであってもよい。サイトカインの例としては、インターロイキン-2
、インターロイキン-4、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-イン
ターフェロン、γ-インターフェロン、G-CSF、及びGM-CSFが挙げられるが、これ
らに限定されない。 本多様性によれば、1つ以上の免疫賦活剤配列は同じ免疫賦活剤配列の複数の
コピー又は互いに異なる複数の免疫賦活剤配列であってもよい。 必要により、免疫賦活剤配列の少なくとも2つは内部リボソームの侵入部位又
はスプライシングドナー-アクセプターメカニズムを経てプロモーターからビシ
ストロン的に発現されてもよい。あるいは、免疫賦活剤配列の少なくとも2つは
プロモーターから発現されて融合タンパク質を形成してもよい。
【００１４】 また、本発明は病原性細菌に対して強く持続的な免疫応答を誘発する遺伝子ワ
クチンを提供する。一の実施態様において、組換えウイルスは組換えウイルスに
感染した宿主における免疫応答を誘発するための遺伝子細菌ワクチンとして提供
される。組換えウイルスは組換えウイルスと非相同的である複数の抗原配列を含
み、それぞれは病原性細菌由来の細菌性抗原をコードし、複数の細菌性抗原配列
の発現は該細菌性抗原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに
感染したときに細胞が宿主において該細菌性抗原を発現する。組換えウイルスは
、好ましくは、複製能力がなくてもよく、宿主において病原性細菌と本来的に関
連した悪性を生じなくてもよい。 病原性細菌は、バチルス・チューバキュロウセス（bacillus tuberculoses）
、炭疽菌、及び動物においてライム病を引き起こすスピロヘータ・ボレリア・ブ
ルグドルフェリーのような宿主において発病効果又は疾病を生じる任意の病原性
細菌であってもよい。複数の抗原配列は致死因子、防御抗原、病原性細菌の浮腫
因子、又はそれらの組み合わせをコードしてもよい。
【００１５】 また、本発明は病原性寄生虫に対する強く持続的な免疫応答を誘発する寄生虫
に対するワクチンを提供する。一の実施態様において、組換えウイルスは組換え
ウイルスに感染した宿主において免疫応答を誘発するための寄生虫ワクチンとし
て提供される。組換えウイルスは良性ウイルスと非相同的である複数の抗原配列
を含み、それぞれは病原性寄生虫由来の寄生虫抗原をコードし、複数の寄生虫抗
原配列の発現は該寄生虫抗原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイ
ルスに感染したときに細胞が宿主において該寄生虫抗原を発現する。組換えウイ
ルスは、好ましくは、複製能力がなくてもよく、宿主において該病原性寄生虫と
本来的に関連した悪性を生じなくてもよい。 病原性寄生虫は、マラリア及びクリプトスポリジウム属、アイメリア属、ヒス
トモナス属（Histomonas）、ロイコチトゾーン属、プラスモジウム属（Plasmodi
um）、トキソプラズマ属、トリコモナス属、リーシュマニア属、トリパノソーマ
属、ジアルディア属、バベシア属、及びタイレリア属のような原生動物のような
、宿主において発病効果又は疾病を生じる任意の病原性寄生虫であってもよい。
複数の抗原配列は病原性寄生虫のコートタンパク質、病原性寄生虫の付着タンパ
ク質（attachment protein）、又はそれらの組み合わせをコードしてもよい。
【００１６】 また、本発明は本発明のウイルスワクチンを含む医薬組成物を提供する。医薬
組成物は上述の組換えウイルスのいずれかと医薬的に許容される担体又は希釈剤
を含んでもよい。 また、医薬組成物は組換えウイルスから発現されるウイルス抗原に対する免疫
応答を増大するためのアジュバントを含んでもよい。アジュバントの例としては
、カルメットーゲラン菌、エンドトキシンリポ多糖類、キーホールリンペットヘ
モシニアン、インターロイキン-2、GM-CSF、及びサイトキサン（cytoxan）が挙
げられるが、これらに限定されない。 また、本発明はキットに関する。これらのキットは宿主にワクチンを与えるた
めの組成物及び／又は宿主にワクチンを与えるためのシリンジのような器具と組
み合わせて本発明の任意の1つ以上のワクチンを含んでもよい。
【００１７】 また、本発明は上述の組換えウイルスにより宿主の免疫を高めるための方法を
提供する。 一の実施態様において、該方法は免疫応答を誘発するのに有効な量の組換えウ
イルスを宿主に投与することを含む。該組換えウイルスは病原性ウイルス由来の
ウイルス抗原をコードする組換えウイルスと非相同的である抗原配列、及び宿主
における発現が該ウイルス抗原の免疫原性を高める免疫賦活剤をコードする良性
ウイルスと非相同的である免疫賦活剤配列を含み、該抗原の発現は該ウイルス抗
原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに感染したときに細胞
が宿主において該ウイルス抗原を発現する。組換えウイルスは、好ましくは、複
製能力がなくてもよく、宿主において該病原性ウイルスと本来的に関連した悪性
を生じなくてもよい。 組換えウイルスは医薬的に許容される任意の投与経路を経て宿主に投与しても
よい。組換えウイルスは筋肉内、気管内、皮下、鼻腔内、皮内、直腸的、経口的
及び親の投与経路を経て宿主に投与してもよい。
【００１８】 別の実施態様において、複数の抗原を有する病原性ウイルスに対する宿主の免
疫を高める方法が提供される。該方法は免疫応答を誘発するのに有効な量の組換
えウイルスを宿主に投与することを含む。組換えウイルスは良性ウイルスと非相
同的である複数の抗原配列を含み、それぞれは病原性ウイルス由来のウイルス抗
原をコードし、複数の抗原配列の発現は該ウイルス抗原に向いている免疫応答を
誘発し、宿主が組換えウイルスに感染したときに細胞が宿主において該ウイルス
抗原を発現する。組換えウイルスは、好ましくは、複製能力がなくてもよく、宿
主において該病原性ウイルスと本来的に関連した悪性を生じなくてもよい。 必要により、組換えウイルスは、さらに、宿主における発現が該ウイルス抗原
の免疫原性を高める免疫賦活剤をコードする組換えウイルスと非相同的である1
つ以上の免疫賦活剤配列を含んでもよい。
【００１９】 さらに別の実施態様において、複数の組換えウイルスワクチン（又はウイルス
）を用いて病原性ウイルスに対する宿主の免疫を高める方法が提供される。複数
の組換えウイルスは各組換えウイルスにおいて異なる抗原を有してもよい。複数
の組換えウイルスは同時に、又は段階的に宿主に投与してもよい。 該方法は免疫応答を誘発するのに有効な量の第一及び第二組換えウイルスを宿
主に投与する。第一組換えウイルスは病原性ウイルス由来のウイルス抗原をコー
ドする第一組換えウイルスと非相同的である抗原配列を含み、該ウイルス抗原の
発現は該ウイルス抗原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が第一組換えウイル
スに感染したときに細胞が宿主において該ウイルス抗原を発現する。第二組換え
ウイルスは宿主における発現が該ウイルス抗原の免疫原性を高める免疫賦活剤を
コードする組換えウイルスと非相同的である免疫賦活剤配列を含む。第一及び第
二組換えウイルスは、好ましくは、複製能力がなくてもよく、宿主における該病
原性ウイルスと本来的に関連した悪性を生じなくてもよい。 本実施態様によれば、第一及び第二組換えウイルスは複製能力のないアデノウ
イルス、アデノ随伴ウイルス、SV40ウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウ
イルス及びワクシニアウイルスのような任意の良性ウイルスであってもよい。必
要により、第一及び第二組換えウイルスの両方は複製能力のないアデノウイルス
であってもよい。また、必要により、第一及び第二組換えウイルスの一方が組換
えアデノウイルスであり、他方が組換えワクシニアウイルスであってもよい。
【００２０】 さらに別の実施態様において、病原体に対する宿主の免疫を高める方法が提供
される。該方法は組換えウイルス及び1つ以上の免疫賦活剤を宿主に投与するこ
とを含む。組換えウイルスは上述の組換えウイルスのいずれであってもよい。特
に、組換えウイルスは該病原体由来の1つ以上の抗原をコードする組換えウイル
スと非相同的である1つ以上の抗原配列を含む。該抗原の発現は該抗原に向いて
いる免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに感染したときに細胞が宿主にお
いて該抗原を発現する。組換えウイルスは、好ましくは、複製能力がなく、宿主
において該病原体と本来的に関連した悪性を生じない。該病原体はHIV、肝炎ウ
イルス及びエボラウイルスのような病原性ウイルス、病原性細菌又は寄生虫であ
ってもよい。
【００２１】 この実施態様によれば、免疫賦活剤は組換えウイルスに感染した細胞によって
発現される抗原の免疫原性を高める任意の分子であってもよい。好ましくは、免
疫賦活剤はサイトカインであり、インターロイキン-2、インターロイキン-8、イ
ンターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-インター
フェロン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、
及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。サイトカイン
は単独で、又は1つ以上の医薬的に許容される賦形剤と共に処方されて精製され
たタンパク質の形態で宿主に投与してもよい。あるいは、サイトカインはサイト
カインのコード配列を発現する発現ベクターの形態で宿主の細胞に形質移入し、
又は形質導入して投与してもよい。
【００２２】 発明の詳細な説明 本発明は遺伝子ワクチン、該ワクチンを含む医薬組成物及び広範囲の病原性ウ
イルス、細菌及び寄生虫の感染に対して宿主を免疫する方法を提供する。遺伝子
ワクチンは、複製欠陥があり、かつ、免疫される宿主において悪性を生じない組
換え良性ウイルスである。遺伝子ワクチンに感染した細胞によって発現される抗
原がその天然コンホメーションにおける免疫システムを宿主に与えるという点で
、及びワクチンとして変性タンパク質又はウイルスを用いるワクチン接種の従来
の“アウトサイド・イン”アプローチと比較して“インサイド・アウト”メカニ
ズムによって、本発明の遺伝子ワクチンを用いるワクチン接種は未変性ウイルス
感染を模倣する。さらに、また、遺伝子ワクチンに感染した細胞は高レベルのサ
イトカインを放出し、その結果、ウイルス感染によって誘発されるストレス下で
細胞の自然応答を模倣するが、細胞への発病効果を生じない。そのような“病原
性ウイルス感染のシグナル”によって間違えられると、宿主の免疫システムは感
染した細胞によって提示される抗原に対する強い免疫防御が高まる。従って、あ
る意味では、本発明の遺伝子ワクチンは“狼の皮を着た羊”のように振る舞い、
強い免疫応答を誘発するウイルス抗原を提示するが、病原体が宿主で生じる有害
な効果を生じない。
【００２３】 一の実施態様において、組換えウイルスは該ウイルスに感染した宿主の免疫応
答を誘発するために提供される。組換えウイルスは病原性ウイルス由来のウイル
ス抗原をコードする組換えウイルスと非相同的である抗原配列及び宿主における
発現が該ウイルス抗原の免疫原性を高める免疫賦活剤をコードする組換えウイル
スと非相同的である免疫賦活剤配列を含み、該ウイルス抗原の発現は該ウイルス
抗原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに感染したときに細
胞が宿主において該ウイルス抗原を発現する。組換えウイルスは複製能力がなく
、宿主において該病原性ウイルスに本来的に関連した悪性を生じない。 別の実施態様において、組換えウイルスは該ウイルスに感染した宿主において
複数の抗原に対する免疫応答を誘発するウイルスワクチンとして提供される。組
換えウイルスは良性ウイルスと非相同的である複数の抗原配列を含み、それぞれ
は1つ以上の病原性ウイルス由来の異なるウイルス抗原をコードし、複数の抗原
配列の発現は該ウイルス抗原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイ
ルスに感染したときに細胞が宿主において該ウイルス抗原を発現する。組換えウ
イルスは、好ましくは、複製能力がなくてもよく、宿主において該病原性ウイル
スと本来的に関連した悪性を生じなくてもよい。
【００２４】 本発明のワクチンは、HIV-1、HIV-2、単純ヘルペスウイルスタイプ1、単純ヘ
ルペスウイルスタイプ2、エボラウイルス、及びA型、B型、C型、D型、及びE型肝
炎ウイルスのような病原性ウイルス、又はバチルス・チューバキュロウセス及び
炭疽菌のような病原性細菌の広範囲の異なる菌株に対して宿主を免疫するために
使用できる。 本発明の組換えワクチンはウイルスゲノムにおける1つ以上のウイルス抗原を
コードする核酸配列を含む組換えウイルスである。宿主が組換えワクチンによっ
て免疫される、すなわち組換えウイルスに感染する場合、宿主細胞における該ウ
イルスの感染は感染した細胞の表面に存在するウイルス抗原の発現を生じる。該
ウイルス抗原の発現は強いプロモーターによって促進されるために、発現は高い
レベルで維持できる。細胞表面の多量のウイルス抗原を認識することによって、
宿主の免疫システムはウイルス抗原に対する強い防御を高め、その結果、ウイル
ス抗原が由来する病原性ウイルスに対する持続的な免疫を達成する。
【００２５】 細菌、酵母又は昆虫の細胞によって発現された単離タンパク質であるワクチン
による免疫化と比較して、本発明の組換えウイルスから発現されるウイルス抗原
はその構造及び機能により未変性ウイルス抗原をよりよく模倣する。単離された
タンパク質ワクチンは未変性ウイルス抗原の本来のコンホメーションをとらず、
細菌、酵母又は昆虫の細胞において適切にグリコシル化されない場合がある。そ
のような単離されたタンパク質ワクチンが宿主に注入される場合、この抗原は宿
主細胞の外側から提示される。この従来の“アウトサイド・イン”アプローチは
、おそらくワクチンの変性した抗原性及び免疫除去細胞によるタンパク質ワクチ
ンの素早い排除のために、しばしば強く、持続的な免疫応答を生成しない。 対照的に、本発明の遺伝子ワクチン、すなわち、組換えウイルスは“インサイ
ド・アウト”メカニズムによってウイルス抗原を提示する。該ウイルス抗原は宿
主細胞における組換えウイルスの感染後発現される。これは、未変性生成物及び
病原性ウイルスによるウイルス抗原の存在をよりよく模倣する。
【００２６】 初期感染細胞以外に広がるこができない複製能力のないウイルスを使用するこ
とにより、本発明は複製能力を有する生ウイルスを用いることにより発生する可
能性のある副作用のリスクを劇的に低減する。例えば、生ワクシニアウイルスに
基づくワクチンは宿主細胞において複製でき、宿主細胞に高レベルのストレスを
加え、最終的に細胞死をもたらすことができる。 さらに、ワクチンとして弱毒化又は不活性ウイルスを用いるアプローチと比較
して、本発明の遺伝子ワクチンの生産方法ははるかに安全である。多数の人々又
は動物のワクチン接種は多量のワクチンを要求する。エボラウイルス及びHIVの
ような病原性ウイルスについて、生ウイルスからの弱毒化又は不活性ウイルスの
大規模生産は環境及び生ウイルスを取り扱う人々に対して大きな危険をもたらす
場合がある。
【００２７】 本発明の組換えウイルスは同じウイルスベクターから同時に複数の抗原配列を
発現するために使用できる。このように、組換えウイルスは病原性ウイルスの同
じ菌株、同じ病原性ウイルスの異なる菌株、又は異なる種類のウイルス、細菌又
は寄生虫由来の異なる抗原由来の複数の抗原をコードしてもよい。これは、本発
明のワクチンを広範囲のウイルス及びその他の病原菌に対して免疫するために利
用できるようにする。これらの複数の抗原配列は組換えウイルスゲノムにおいて
再配列されるため、病原性ウイルスを産生するかもしれないこれらのウイルス配
列の組換えの可能性のリスクを実質的に排除する。 また、本発明の遺伝子ワクチンはサイトカインのような多量の免疫賦活剤を発
現するのが好ましい。ウイルス感染の自然なプロセスにおいて、ウイルス感染し
た細胞はMHC-I受容体との関係でその表面にウイルス抗原を示すが、ウイルス粒
子はMHC-II受容体と関連した抗原を示す専門の抗原提示細胞によって消化される
。ウイルス感染に対する応答において、すべてのサイトカイン及びインターフェ
ロンが産生され、ウイルス抗原に対する強い体液及び細胞応答を生じる。同様に
、多量の記憶細胞は任意の新しい感染を無効にし続ける。単離されたタンパク質
ワクチンを用いるワクチン接種において、タンパク質は免疫除去細胞によって素
早く排除される。このプロセスの際、MHC-II抗原提示のみが生じ、サイトカイン
放出応答はなくなるか、かなり減少する。結果として、小さい細胞応答が生じ、
少ない“記憶”細胞が産生する。
【００２８】 相対的に、ウイルス抗原及び本発明の組換えウイルス由来のサイトカインの同
時発現は、感染し、産生する多量の免疫調節サイトカインの表面に抗原を提示す
ることによってウイルス感染に対する宿主細胞の自然応答を効果的に模倣する。
遺伝子ワクチンに感染した宿主細胞から発現される高レベルのサイトカインによ
り、宿主の免疫システムはワクチンに対して強い応答を高めるように“欺かれ”
、その結果、持続的な免疫を生じるであろう。 さらに、遺伝子ワクチンによるワクチン接種は病原性ウイルスの未変性ウイル
ス感染を模倣するが、ワクチン自身は病原性ウイルスの有害な影響を有さない良
性ウイルスである。例えば、HIV、インフルエンザウイルス及びエボラウイルス
のような病原性ウイルスの感染は、おそらくウイルスの糖タンパク質の免疫抑制
機能により、宿主に意味深い免疫抑制効果を有する。本発明によれば、遺伝子ワ
クチンによって運ばれるウイルス抗原配列は、その病原性又は免疫抑制領域が欠
如していることが好ましい。ある意味では、本発明の遺伝子ワクチンは“狼の皮
を着た羊”のように振る舞い、強い免疫応答を誘発するウイルス抗原を提示する
が、宿主に有害な効果を生じない。
【００２９】 １．本発明の遺伝子ワクチン 本発明は、未変性病原性ウイルスの特徴を模倣するが、免疫抑制及び病原性を
誘発しないで宿主における効果的な防御を高め、実際に感染する危険のないワク
チンに関する。この遺伝子ワクチンは、1つ以上のウイルス抗原をコードする1つ
以上のDNA配列がその感染力に本質的でないウイルスゲノムの領域に挿入される
複製能力のない、又は複製欠陥のあるウイルスである。組換えウイルスはウイル
ス抗原を発現し、該抗原に向いているインビボの細胞性免疫応答を誘発し、細胞
は該抗原を発現する。 一の実施態様において、組換えウイルスは該ウイルスに感染した宿主の免疫応
答を誘発するために提供される。組換えウイルスは病原性ウイルス由来のウイル
ス抗原をコードする組換えウイルスと非相同的である抗原配列及び宿主における
発現が該ウイルス抗原の免疫原性を高める免疫賦活剤をコードする組換えウイル
スと非相同的である免疫賦活剤配列とを含み、該ウイルス抗原の発現は該ウイル
ス抗原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに感染したときに
細胞は宿主において該ウイルス抗原を発現する。組換えウイルスは複製能力がな
く、宿主において該病原性ウイルスに本来的に関連した悪性を生じない。
【００３０】 組換えウイルスは、未変性前駆体が複製能力のないようにされる限り、任意の
ウイルスから構築されてもよい。例えば、複製能力のないアデノウイルス、アデ
ノ随伴ウイルス、SV40ウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス又はワ
クシニアウイルスを使用して、組換えウイルスの感染力に本質的でない領域内に
ウイルス抗原を挿入することによって組換えウイルスを生成してもよい。従って
、組換えウイルスは良性ウイルスの未変性前駆体の病理的領域を有さないが、宿
主への感染力を保持することが好ましい。 好ましい実施態様において、組換えウイルスは複製能力のないアデノウイルス
である。
【００３１】 本発明の組換えアデノウイルスは免疫システムの強い刺激を与える高レベルの
抗原発現に向けられる。アデノウイルスに感染した細胞によって発現される抗原
は処理され、病原体感染細胞を模倣するように感染した細胞に示される。このフ
ェーズは感染した細胞に対する細胞性免疫の誘発において非常に重要であると考
えられ、従来のワクチン接種アプローチが使用される場合、完全に失われる。さ
らに、組換えアデノウイルスは非常に強い抗原提示細胞である樹状細胞を感染し
てもよい。さらに、また、組換えアデノウイルスは免疫促進サイトカインをコー
ドする遺伝子を有して、さらに免疫性を高めてもよい。さらに、組換えアデノウ
イルスはヒトの気道及び腸上皮細胞に自然に感染してもよく、従ってワクチンは
点鼻薬又は経口摂取により与えられてもよい。さらに、本発明の組換えアデノウ
イルスは、複製能力がないために安全であろう。
【００３２】 非相同的抗原配列はアデノウイルスのE1、E3又はE4領域に位置してもよい。免
疫賦活剤配列はアデノウイルスのE1、E3又はE4領域に位置してもよい。 好ましい実施態様の多様性において、非相同的抗原配列及び免疫賦活剤配列は
アデノウイルスのE1、E3又はE4領域に位置し、非相同的抗原配列及び免疫賦活剤
配列は内部リボソーム侵入部位又はスプライシングドナー-アクセプターメカニ
ズムを経てプロモーターからビシストロン的に（bicistronically）発現される
。 ウイルス抗原又は免疫賦活剤の発現は、組換えウイルスの未変性前駆体と相同
的であるプロモーターによって制御されてもよい。あるいは、ウイルス抗原の発
現は組換えウイルスの未変性前駆体と非相同的であるプロモーターによって制御
されてもよい。例えば、組換えウイルスの未変性前駆体と非相同的であプロモー
ターは、インシュリンプロモーター、ヒトのサイトメガロウイルス（CMV）プロ
モーター及びその初期プロモーター、シミアン・ウイルスSV40プロモーター、ラ
ウス肉腫ウイルスLTRプロモーター／エンハンサー、ニワトリの細胞質β-アクチ
ンプロモーターのような真核生物のプロモーター、及びテトラサイクリン誘発性
プロモーターのような誘発性プロモーターであってもよい。
【００３３】 病原性ウイルスはヒト、家畜又はその他の哺乳動物のような宿主における発病
効果又は疾病を生じる任意の病原性ウイルスであってもよい。このように、組換
えウイルスは病原性ウイルスの感染から宿主を保護するためにワクチンとして使
用することができる。 多様性において、病原性ウイルスはHIV-1及びHIV-2のようなヒト免疫不全ウイ
ルス（HIV）の種々の菌株であってもよい。ウイルス抗原はHIV GP120及びGP41の
ようなHIV糖タンパク質（又は表面抗原）、HIV P24タンパク質のようなキャプシ
ドタンパク質（又は構造タンパク質）、又はTat、Vif及びRevタンパク質のよう
なその他のHIV調節タンパク質であってもよい。 別の多様性において、病原性ウイルスはインフルエンザウイルスであってもよ
い。ウイルス抗原はインフルエンザHA1、HA2及びNAのようなインフルエンザ糖タ
ンパク質であってもよい。 別の多様性において、病原性ウイルスはエボラウイルスであってもよい。ウイ
ルス抗原はエボラGP1又はGP2タンパク質のようなエボラ糖タンパク質又は表面抗
原であってもよい。
【００３４】 さらに別の多様性において、病原性ウイルスはA型、B型、C型、D型又はE型肝
炎ウイルスのような肝炎ウイルスであってもよい。ウイルス抗原はA型、B型、C
型、D型又はE型肝炎ウイルスの表面抗原又はコアタンパク質であってもよい。例
えば、ウイルス抗原はスモールB型肝炎表面抗原（SHBsAg）（オーストラリア抗
原としても参照される）、ミドルB型肝炎表面抗原（MHBsAg）及びラージB型肝炎
表面抗原（LHBsAg）のようなB型肝炎ウイルスの表面抗原又はコアタンパク質で
あってもよい。また、ウイルス抗原はNS3、NS4及びNS5抗原のようなC型肝炎ウイ
ルスの表面抗原又はコアタンパク質であってもよい。 さらに別の多様性において、病原性ウイルスは呼吸器合胞体ウイルス（RSV）
であってもよい。例えば、RSVウイルス抗原はRSVの糖タンパク質（G-タンパク質
）又は融合タンパク質（F-タンパク質）であってもよく、その配列はGenBankか
ら入手できる。 さらに別の多様性において、病原性ウイルスはHSV-1及びHSV-2のような単純ヘ
ルペスウイルス（HSV）であってもよい。例えば、HSVウイルス抗原はHSV-2由来
の糖タンパク質Dであってもよい。 さらに別の多様性において、ウイルス抗原は、ヒト乳頭腫ウイルスのE6及びE7
のような腫瘍抗原又はウイルスの癌遺伝子、又は変異ras又はp53のような細胞由
来癌遺伝子であってもよい。
【００３５】 その他のウイルス関連タンパク質又は抗原が当業者にとって容易に入手可能で
あることが知られている。病原性ウイルス及びウイルス抗原の選択は本発明の制
限因子ではない。 ウイルス抗原は、全長抗原性ウイルスタンパク質又は支配的抗原、中和抗原、
又は病原性ウイルスのエピトープを含む抗原性ウイルスタンパク質の一部であっ
てもよい。あるいは、ウイルス抗原は同じ病原性ウイルスの少なくとも2つの菌
株間で糖タンパク質の保存された領域を含む。 多様性において、ウイルス抗原は、ウイルス抗原がその抗原性を保持するがウ
イルス成分として機能しないような病原性ウイルスの糖タンパク質から突然変異
した変性抗原であってもよい。そのようなウイルス抗原の変性としては、糖タン
パク質のタンパク質分解切断部位における欠失、及び糖タンパク質の免疫抑制ペ
プチド領域の複製及び再配列が挙げられる。 また、組換えウイルスは免疫賦活剤を発現して、ウイルス感染による宿主細胞
のサイトカイン放出応答を模倣し、さらに組換えウイルスから同時発現されるウ
イルス抗原に対する免疫応答を増大する。免疫賦活剤は、好ましくはサイトカイ
ンであってもよい。サイトカインの例としては、インターロイキン-2、インター
ロイキン-4、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロ
ン、γ-インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、及び顆粒球マク
ロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）が挙げられるが、これらに限定されない
。
【００３６】 別の実施態様において、組換えウイルスは、該ウイルスに感染した宿主の免疫
応答を誘発するために提供される。組換えウイルスは病原性ウイルス由来のウイ
ルス抗原をコードする組換えウイルスと非相同的である抗原配列を含み、該ウイ
ルス抗原の発現は該ウイルス抗原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換え
ウイルスに感染したときに細胞が宿主において該ウイルス抗原を発現する。 この実施態様によれば、組換えウイルスは、好ましくは複製能力のないアデノ
随伴ウイルス、SV40ウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス及びワク
シニアウイルスである。良性ウイルスは、好ましくは良性ウイルスの未変性前駆
体の病理的領域を欠失させてもよいが、宿主に対する感染力を保持する。 必要により、組換えウイルスは宿主における発現がウイルス抗原の免疫原性を
高める免疫賦活剤をコードする組換えウイルスと非相同的である免疫賦活剤配列
を含んでもよい。
【００３７】 また、本発明は、病原性細菌に対する強く、持続的な免疫応答を誘発する遺伝
子ワクチンを提供する。一の実施態様において、組換えウイルスは組換えウイル
スに感染した宿主の免疫応答を誘発する遺伝子細菌ワクチンとして提供される。
組換えウイルスのウイルスゲノムは組換えウイルスと非相同的である複数の抗原
配列を含み、それぞれは病原性細菌由来の細菌性抗原をコードし、複数の細菌性
抗原配列の発現は該細菌性抗原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウ
イルスに感染したときに細胞が宿主において該細菌性抗原を発現する。組換えウ
イルスは、好ましくは、複製能力がなくてもよく、宿主において該病原性細菌と
本来的に関連した悪性を生じなくてもよい。 病原性細菌はバチルス・チューバキュロウセス、炭疽菌、及び動物においてラ
イム病を引き起こすスピロヘータ・ボレリア・ブルグドルフェリーのような宿主
における発病効果又は疾病を生じる任意の病原性細菌であってもよい。複数の抗
原配列は致死因子、防御抗原、病原性細菌の浮腫因子、又はそれらの組み合わせ
をコードしてもよい。
【００３８】 また、本発明は病原性寄生虫に対する強く、持続的な免疫応答を誘発する寄生
虫ワクチンを提供する。一の実施態様において、組換えウイルスは良性ウイルス
に感染した宿主の免疫応答を誘発する寄生虫ワクチンとして提供される。組換え
ウイルスは組換えウイルスと非相同的である複数の抗原配列を含み、それぞれは
病原性寄生虫由来の寄生虫抗原をコードし、複数の寄生虫抗原配列の発現は該寄
生虫抗原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに感染したとき
に、細胞は宿主において該寄生虫抗原を発現する。組換えウイルスは、好ましく
は、複製能力がなくてもよく、宿主において該病原性寄生虫と本来的に関連した
悪性を生じなくてもよい。 病原性寄生虫はマラリア及びクリプトスポリジウム属、アイメリア属、ヒスト
モナス属、ロイコチトゾーン属、プラスモジウム属、トキソプラズマ属、トリコ
モナス属、リーシュマニア属、トリパノソーマ属、ジアルディア属、バベシア属
、及びタイレリア属のような原生動物のような、宿主において発病効果又は疾病
を引き起こす任意の病原性寄生虫であってもよい。複数の抗原配列は、病原性寄
生虫のコートタンパク質、付着タンパク質、又はそれらの組み合わせをコードし
てもよい。
【００３９】 また、本発明は、宿主に複数の抗原を提示してさらに未変性病原性ウイルスの
自然感染を模倣し、宿主において病原性ウイルスの種々の菌株又はタイプに対し
て強く、持続的な免疫応答を誘発するウイルスワクチンを提供する。 一の実施態様において、組換えウイルスは、該ウイルスに感染した宿主の免疫
応答を誘発するためのウイルスワクチンとして提供される。組換えウイルスは組
換えウイルスと非相同的である複数の抗原配列を含み、それぞれは病原性ウイル
ス由来のウイルス抗原をコードし、複数の抗原配列の発現は該ウイルス抗原に向
いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに感染したときに細胞が宿主
において該ウイルス抗原を発現する。組換えウイルスは、好ましくは、複製能力
がなくてもよく、宿主において病原性ウイルスと本来的に関連した悪性を生じな
くてもよい。 本実施態様によれば、組換えウイルスは任意のウイルスであってもよく、好ま
しくは複製能力のないアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、SV40ウイルス、レ
トロウイルス、単純ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスである。また、組
換えウイルスは、好ましくは、良性ウイルスの未変性前駆体の病理的領域を欠失
させてもよいが、宿主に対するその感染力を保持する。
【００４０】 また、本実施態様によれば、複数の抗原配列は同じ抗原配列の複数のコピー又
は互いに異なる複数の抗原配列であってもよい。 本実施態様の多様性において、複数の抗原配列の少なくとも2つは内部リボソ
ームの侵入部位又はスプライシングドナー-アクセプターメカニズムを経てプロ
モーターからビシストロン的に発現される。 あるいは、複数の抗原配列の少なくとも2つはプロモーターから発現されて融
合タンパク質を形成する。 また、本実施態様によれば、組換えウイルスは、さらに、複数の抗原配列の少
なくとも2つの発現を制御する組換えウイルスの未変性前駆体と非相同的である
少なくとも1つのプロモーターを含む。組換えウイルスの未変性前駆体と非相同
的であるプロモーターの例としては、インシュリンプロモーター、CMVプロモー
ター及びその初期プロモーター、SV40プロモーター、ラウス肉腫ウイルスLTRプ
ロモーター／エンハンサー、ニワトリの細胞質β-アクチンプロモーター、及び
テトラサイクリン誘発性プロモーターのような誘発性プロモーターが挙げられる
が、これらに限定されない。 また、本実施態様によれば、複数の抗原配列は病原性ウイルスの少なくとも2
つの菌株由来の抗原の組み合わせであってもよい。 必要により、複数の抗原配列は少なくとも2つの異なる病原性ウイルス由来の
抗原の組み合わせであってもよい。例えば、複数の抗原配列はHIV-1、HIV-2、単
純ヘルペスウイルスタイプ1、単純ヘルペスウイルスタイプ2、インフルエンザウ
イルス、マールブルク病ウイルス、エボラウイルス、及びA型、B型、C型、D型、
及びE型肝炎ウイルス由来の抗原の組み合わせであってもよい。
【００４１】 本実施態様の多様性において、組換えウイルスのウイルスゲノムは、さらに、
組換えウイルスと非相同的であり、、宿主における発現がウイルス抗原の免疫原
性を高める免疫賦活剤をコードする1つ以上の免疫賦活剤配列を含でもよい。例
えば、免疫賦活剤はサイトカインであってもよい。サイトカインの例としては、
インターロイキン-2、インターロイキン-4、インターロイキン-12、β-インター
フェロン、λ-インターフェロン、γ-インターフェロン、G-CSF、及びGM-CSFが
挙げられるが、これらに限定されない。 本多様性によれば、1つ以上の免疫賦活剤配列は同じ免疫賦活剤配列の複数の
コピー又は互いに異なる複数の免疫賦活剤配列であってもよい。 必要により、免疫賦活剤配列の少なくとも2つは内部リボソームの侵入部位又
はスプライシングドナー-アクセプターメカニズムを経てプロモーターからビシ
ストロン的に発現されてもよい。あるいは、免疫賦活剤配列の少なくとも2つは
プロモーターから発現されて融合タンパク質を形成してもよい。
【００４２】 ウイルス抗原をコードするDNA配列は複製欠陥のあるウイルスの任意の本質的
でない領域に挿入される。例えば、アデノウイルスの場合に、核酸は、好ましく
は、アデノウイルスのE1、E3及び／又はE4領域に挿入され、最も好ましくはE4領
域に挿入される。E1、E3及びE4領域は挿入部位として利用可能であるので、また
、本発明は1つよりも多いコード配列の分離挿入も考慮する。 本発明の組換えウイルスベクターワクチンにおいて、ウイルス抗原の選択され
たヌクレオチド配列は、インビボで被験者のその転写又は発現に関する成分を制
御するために操作しやすいように結合されている。相同的又は非相同的ウイルス
制御配列が使用できる。有用な非相同的制御配列は、一般に宿主（hostian）又
はウイルス遺伝子をコードする配列に由来するものを含む。例としては、CMV最
初期プロモーター領域（CMVie）のようなサイトメガロウイルス（CMV）プロモー
ター、SV40初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウ
イルス主要後期（major late）プロモーター（AdMLP）、単純ヘルペスウイルス
プロモーター、及びレトロウイルスLTRプロモーターが挙げられるが、これらに
限定されない。好ましくは、任意の強い構成プロモーターはウイルス抗原又はサ
イトカインと操作しやすいように結合されていてもよい。より好ましくはウイル
スプロモーターはCMV最初期プロモーター（CMVie）である。
【００４３】 図１Ａ−１Ｃは、本発明の遺伝子ワクチンとして組換えアデノウイルスベクタ
ーを構築する方法を示す。本発明の組換えアデノウイルスベクターは、複数の抗
原遺伝子及び複数のサイトカイン遺伝子を有するシャトルプラスミド又はベクタ
ーを用いて構築される。 図１Ａは2つの抗原遺伝子、抗原1及び抗原2を含むシャトルプラスミド（pLAd.
抗原）を示す。シャトルプラスミドpLAd.抗原は左方向に長い末端反復L-TRを含
むアデノウイルスゲノムの左末端、及びアデノウイルスパッケージングシグナル
（Ψ）を含む。アデノウイルスのE1領域は複数の遺伝子発現カセット及びCMVie
プロモーターにより置換されている。 抗原1及び抗原2をコードする遺伝子は、SD及びSA部位でのスプライシングメカ
ニズムによるCMVieプロモーターの転写制御下で配置される。また、プラスミドp
LAd.抗原は、SV40ポリアデニル化部位を含み、同様に原核生物の複製開始点及び
細菌におけるDNA伝播のためのアンピシリン耐性遺伝子を含む。
【００４４】 図１ＢはIL-2、INF、及びIL-8のような複数のサイトカイン遺伝子を含む別の
シャトルプラスミド（pRAd.サイトカイン）を示す。シャトルプラスミドpRAd.サ
イトカインは右方向に長い末端反復R-TRを含むアデノウイルスゲノムの右末端を
含む。E4領域のほとんどは（orf6を除く）、サイトカイン遺伝子によって置換さ
れている。サイトカイン遺伝子の発現は、内部リボソームの侵入部位（IRES）を
経たCMVieプロモーターの転写制御下で、SD及びSA部位でのスプライシングメカ
ニズムによる。また、プラスミドpRAd.サイトカインは、ウシ成長ホルモン（BGH
）ポリアデニル化部位を含み、同様に原核生物の複製開始点及び細菌におけるDN
A伝播のためのアンピシリン耐性遺伝子を含む。 組換えアデノウイルスゲノムは、それぞれアデノウイルスゲノムの左末端及び
右末端を有する2つのシャトルプラスミド、pLAd.抗原及びpRAd.サイトカインか
ら構築される。シャトルプラスミドpLAd.抗原及びpRAd.サイトカインは、それぞ
れXbal及びEcoRIのような制限酵素によって消化される。
【００４５】 図１Ｃに示されるように、これらの2つのシャトルプラスミド、pLAd.抗原及び
pRAd.サイトカイン由来のアデノウイルスの左末端及び右末端に対応するフラグ
メントは、単離され、アデノウイルスゲノムのミドルセクション（アデノウイル
スバックボーン）と結合される。 次いで、結合ベクターゲノムDNAはアデノウイルスのE1タンパク質を発現する2
93HK細胞内に形質移入される。E1タンパク質の存在下で、E1が欠失されているベ
クターゲノムは複製でき、ウイルス粒子内にパッケージされ、すなわち本発明の
遺伝子ワクチンとして使用できる組換えアデノウイルスベクターを生成する。未
変性アデノウイルスゲノムに保存されているが、組換えウイルスゲノムから除去
されるE1領域は、組換えウイルスの未変性前駆体：野生型アデノウイルスに由来
する病原性領域の例である。 図５は上述の方法を用いて構築された遺伝子ワクチンの例を示す。複製欠陥の
あるアデノウイルス、タイプ5は、ウイルス抗原及びサイトカインがE1領域に挿
入されるベクターバックボーンである。ウイルス抗原はCMVieプロモーターを用
いて発現される。ウイルス抗原の遺伝子はINF-γ及びGM-CSFをコードする遺伝子
を伴い、単一のmRNA由来の3つのタンパク質の発現を達成するために2つのIRES配
列を利用する。IL2及びIL4はビシストロン的カセットとして第二CMVieプロモー
ターによって制御され、E4領域のIL12の2つのサブユニットを発現する第二ビシ
ストロン的カセットを伴う。当業者は、本発明が上記構造に制限されないが、代
替サイトカインが単独で、又はこれらのサイトカイン及び／又はその他のサイト
カインと組み合わせて使用してもよいことを理解するであろう。これらのサイト
カインにつての詳細な情報は以下のセクションに記載される。
【００４６】 ２．ウイルス抗原により同時発現されるサイトカイン また、本発明の組換えウイルスは、免疫賦活剤を発現してウイルス感染による
宿主細胞のサイトカイン放出応答を模倣してもよく、さらに組換えウイルスから
同時発現されるウイルス抗原に対する免疫応答を高めてもよい。免疫賦活剤は、
免疫システムをさらに刺激する免疫増強サイトカインであってもよい。組換えウ
イルスは任意の組換えにおいて1つ、又は複数のサイトカインをコードしてもよ
い。あるいは、複数のサイトカインは1つよりも多い組換えウイルスによって発
現されてもよく、裸のDNAプラスミドを経たデリバリ又はサイトカインタンパク
質の注入のようなその他の方法を用いて宿主に与えられてもよい。 サイトカインの例としては、インターロイキン-2、インターロイキン-4、イン
ターロイキン-8、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフ
ェロン、γ-インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、及び顆粒球
マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）が挙げられるが、これらに限定され
ない。 免疫応答の質及び強度を変調及び具体化する多面的な介在物質でるため、サイ
トカインは本発明のワクチンにおいて特に有用である免疫調節性分子である。サ
イトカインは、時折、自己分泌物又は内分泌物であるが、ほとんどはリンパ球及
び単球によって自然に生成されるパラ分泌ホルモンである。
【００４７】 本明細書で使用されるように、用語“サイトカイン”は、免疫システムの細胞
によって生成され、免疫応答を調節又は変調するタンパク質又はペプチドのクラ
スのメンバーを参照する。そのような調節は、免疫応答を媒介する体液又は細胞
内で生じることができ、T細胞、B細胞、NK細胞、マクロファージ、抗原提示細胞
又はその他の免疫システム細胞のエフェクター機能の変調を含む。 サイトカインは、典型的には約30kDa未満の分子量を有する小さなタンパク質
又は糖タンパク質である。本明細書で使用されるように、用語サイトカインはリ
ンパ球及びその他の細胞型（しばしばリンホカインと呼ばれる）によって分泌さ
れるそれらのサイトカイン、同様に単球及びマクロファージ及びその他の細胞型
（しばしばモノカインと呼ばれる）によって分泌されるサイトカインを包含する
。本明細書で使用されるように、用語サイトカインはリンパ球及びその他の細胞
型によって分泌されるそれらのサイトカイン、同様に単球及びマクロファージ及
びその他の細胞型によって分泌されるサイトカインを包含する。用語サイトカイ
ンは、造血幹細胞及び免疫システム細胞の増殖及び分化に主に影響を及ぼす白血
球によって分泌される分子であるIL-2、IL-4、IL-8及びIL-12のようなインター
ロイキンを含む。また、用語サイトカインは造血成長因子、特にコロニー刺激因
子-1、顆粒球コロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のよ
うなコロニー刺激因子を含む。
【００４８】 サイトカインは、自然に生じるサイトカインの配列を有することができ、又は
自然に生じるサイトカインの配列に対して実質的なアミノ酸配列類似性、例えば
60〜95％のアミノ酸配列類似性、好ましくは70〜98％のアミノ酸配列類似性、最
も好ましくは75〜95％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を有すること
ができる。 このように、自然に生じる配列に対して制限された変性がサイトカインの生物
学的な機能を破壊することなしに行い得ることは理解される。例えば、その機能
を破壊しないγインターフェロンのわずかな変性はγインターフェロンの定義に
含まれる。これらの変性は部位特異的変異誘発によるものとして検討され、又は
突然変異によるもののように偶発的であり得る。好ましいサイトカインは、IL-2
、IL-8、IL-12、又はγ-インターフェロン、β-インターフェロン、λ-インター
フェロン、GM-CSF、又はG-CSF又はそれらの組み合わせである。
【００４９】 インターロイキン-2はヘルパーT細胞によって産生されるリンホカインであり
、免疫応答の大きさ及びタイプの制御に関係する（Smith, K. A., Ann. Rev. Im
munol. 2, 319-333 (1984)）。また、その他の機能はNK細胞の活性化（Minato,
N. et al., J. Exp. Med. 154, 750 (1983)）及びラージ顆粒リンパ球及びB細胞
における細胞分裂の活性化を含むIL-2であるとされている（Tsudo, M. et al.,
J. Exp. Med. 160, 612-616 (1984)）。マウス及びヒトにおける研究は、インビ
ボ及びインビトロの両方における不完全な免疫応答性がIL-2により増大され得る
ことを示している。例えば、外因性IL-2はシクロホスファニド誘導免疫抑制マウ
ス（Merluzzi, V. J. et al., Cancer Res. 41, 850-853 (1981)）及び胸腺欠損
（ヌード）マウスにおける免疫応答を回復させることができた（Wagner, H. et
al., Nature 284, 278-80 (1982)）。さらに、IL-2は、ハンセン氏病及び癌のよ
うな種々の免疫不全状態の患者からリンパ球の応答性を回復させることができた
（Vose, B. M. et al., Cancer Immuno. 13, 105-111 (1984)）。ネズミ（Yokot
a, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 68-72 (1985)）及びヒト（Tan
iguchi, T. et al., Nature, 302, 305-307 (1983)）IL-2の遺伝子は複製され、
配列決定されている。
【００５０】 インターロイキン-4は、休止B細胞の誘発因子、B細胞分化因子及びB細胞増殖
因子として作用するT細胞誘発因子である（Sevenusar, E., Eur. J. Immunol. 1
7, 67-72 (1987)）。ヒトIL-4の遺伝子は単離され、配列決定されている（Lee,
F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2061-2065 (1986)）。 IL-12は、75kDaの分子量を有する最近特徴付けられたヘテロダイマーサイトカ
インであり、ジスルフィド結合した40kDa及び35kDaサブユニットで構成される。
それはマクロファージのような抗原提示細胞によって産生され、活性化T、B及び
NK細胞の受容体と結合する（Desai, B. B., et al., J. Immunol., 148:3125-31
32 (1992); Vogel, L. A., et al., Int. Immunol., 8:1955-1962 (1996)）。そ
れは以下を含む幾つかの効果を有する。1）T細胞及びNK細胞の高められた増殖、
2）T細胞、NK細胞、及びマクロファージの増大された細胞溶解性、3）IFN産生の
誘発、及びそれほどではないにせよ、TNF-α及びGM-CSF産生の誘発、4）TH1細胞
の活性化（Trinchieri, G., et al., Blood, 84:4008-4027 (1994)）。IL-12はT
h1クローンの増殖の重要な共刺激剤であることが知られており（Kennedy et al.
, Eur. J. Immunol. 24:22712278 (1994)）、血清のIgG2a抗体の増大した産生を
引き起こす（Morris, S. C., et al., J. Immunol. 152:1047-1056 (1994); Ger
mann, T. M., et al., Eur. J. Immunol., 25:823-829 (1995); Sher, A., et a
l., Ann. N. Y. Acad. Sci., 795:202-207 (1996); Buchanan, J. M., et al.,
Int Immunol., 7:1519-1528 (1995); Metzger, D. W. et al., Eur J. Imunol.,
27:1958-1965 (1997)）。また、IL-12の投与はIgG1抗体の産生を一時的に減少
させることができ（Morris, S. C., et al., J. Immunol. 152:1047-1056 (1994
); McKnight, A. J., J. Immunol. 152:2172-2179 (1994); Buchanan, J. M., e
t al., Int. Immunol., 7:1519-1528 (1995)）、Th2応答の抑制を示す。IL-12の
精製及びクローニングはWO 92/05256及びWO 90/05147、及びEP 322,827（“CLMF
”として同定）に開示される。上記効果のすべては成体動物において観測された
。
【００５１】 インターフェロン（IFNs）は、ウイルス、ポリペプチド、有糸分裂促進物質等
のような種々の誘導物質にさらすことに応答して宿主細胞によって産生される相
対的に小さく、種特異的な単鎖ポリペプチドである。それらは、抗ウイルス性、
抗増殖性及び免疫調節性を示し、従って、癌の制御及びその他の種々の抗ウイル
ス疾患の治療薬として非常に興味がある（J. Desmyter et al., Lancet 11, 64
5-647 (1976); R. Derynck et al., Nature 287, 193 (1980)）。ヒトのインタ
ーフェロンはその細胞起源及び抗原性に基づいて3つのクラス、α-インターフェ
ロン（白血球）、β-インターフェロン（線維芽細胞）及びγ-インターフェロン
（B細胞）にグループ化される。各グループの組換え型は開発され、市販されて
いる。 また、γ-インターフェロンは、免疫応答に重大な影響を有するT細胞派生分子
である。この分子はインターロイキン-2により刺激される活性化B細胞によって
免疫グロブリンの産生を促進する。また、γ-インターフェロンは、細胞傷害性T
細胞を刺激するためにウイルス抗原と関連した細胞の細胞適合性抗原の発現を増
加させる。ヒトのγ-インターフェロンの遺伝子は単離され、配列決定されてい
る（Gray, P. W. et al., Nature 295, 503-508 (1982)）。
【００５２】 ヒトのα-インターフェロン（白血球インターフェロンとしても知られている
）は、約30種のタンパク質のファミリーを含み、少なくとも14の異なる遺伝子及
び約16の対立遺伝子によってコードされる。これらのα-インターフェロンタン
パク質種の幾つかは、抗ウイルス性、抗増殖性及び免疫調節活性を有することが
考えられている（例えば、Pestka et al., Ann. Rev. Biochem., 56:727 (1987)
参照のこと）。ヒトのα-インターフェロンの治療効果はヒトの癌及びウイルス
疾患に対して確立されている。例えば、組換えインターフェロン（IFNα-2a、IF
Nα-2b、IFNα-2c）、細胞株派生インターフェロン（IFNα-n1）及び白血球由来
インターフェロン（IFNα-n3）は、現在尖圭コンジローマ、肝炎の治療（Weck e
t al., Am. J. Med., 85 (Suppl 2A):159 (1988); Korenman et al., Annal. In
tern. Med., 114:629 (1991); Friedman-Kien et al., JAMA, 259:533 (1988)）
、幾つかの悪性の退行（Baron et al., JAMA, 266:1375 (1991)）、AIDS関連カ
ポジ肉腫の治療（Physicians Desk Reference, 47th edit., eds. Medical Econ
omics Data, Montvale, N.J., p.2194 and 2006 (1993)）に使用され、現在、ヒ
トの後天性免疫不全症候群（AIDS）の治療について、単独又はその他の抗ウイル
ス物質と組み合わせることが考えられている（Hirsch, Am. J. Med., 85(Suppl
2A):182 (1988)）。
【００５３】 β-インターフェロンは、その糖質含量の化学的測定により糖タンパク質であ
ると考えられている。それは1つのN-グリコシジル付着部位を有する（E. Knight
, Jr., Proc. Natl. Acad. Sci., 73, 520 (1976); E. Knight, Jr., and D. Fa
hey, J. Interferon Res., 2 (3), 421 (1982)）。β-インターフェロンの糖質
部分を構成する糖質の種類についてはあまり知られていないが、糖質部分がその
抗原性、生物活性又は疎水性に本質的でないと考えられている（T. Taniguchi e
t al., supra; E. Knight, Jr., supra; and E. Knight, Jr. and D. Fahey, su
pra）。β-インターフェロンはウイルス攻撃によって線維芽細胞内に誘発され、
約165のアミノ酸を含む。インターフェロンの配列は知られている（Fiers et al
. Philos. Trnas. R. Soc. Lond., B, Biol. Sci. 299:29-38 (1982)）。 GM-CSFは樹状細胞の成熟及び機能に重要なサイトカインである。それは、受容
体を樹状細胞に結合し、これらの細胞を成熟し、抗原を提示し、未処置のT細胞
を初回抗原刺激するために刺激する。樹状細胞は高効率の抗原提示細胞のシステ
ムを形成する。末梢の抗原を捕捉した後、樹状細胞はリンパ器官に移動し、T細
胞に抗原を提示する。これらの強力な抗原提示細胞は、活性な未処置のT細胞と
相互作用する能力においてユニークである。樹状細胞の強力な抗原提示能力は、
そのユニークなライフサイクル及び主な組織適合性複合体クラスI及びII分子及
び同時刺激分子の高いレベルの発現によるものであってもよい。ヒトのGM-CSFの
配列は知られている（Wong et al., Science 228:810-815 (1985)）。
【００５４】 顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）は造血成長因子の一つであり、コロニー刺
激因子とも呼ばれ、分化する血液細胞のコロニーを増殖し、形成するために関連
付けられた前駆細胞を刺激する。G-CSFは、好中球の増殖及び発生を優先的に刺
激し、好中球減少性状態の治療に有用である（Welte et at., PNAS-USA 82:1526
-1530 (1985); Souza et at., Science 232:61-65 (1986)及びGabrilove, J. S
eminars in Hematology 26:(2) 1-14 (1989)）。G-CSFは循環する顆粒球の数を
増加し、敗血症モデルの感染を回復させることが報告されている。また、G-CSF
の投与は、敗血症の際の組織損傷及び拒絶反応に重要な腫瘍壊死因子（TNF）、
サイトカインの放出を示す。例えば、Wendel et al., J. Immunol., 149:918-92
4 (1992)を参照のこと。ヒト（Nagata et al., Nature 319;415, 1986）及びマ
ウス（Tsuchiya et al., PNAS 83, 7633, 1986）のG-CSFのcDNAは単離され、
さらにG-CSFの構造的及び生物学的性質を与える。 ヒトの内在性G-CSFは、血漿において検出できる（Jones et al., Bailliere's
Clinical Hematology 2 (1): 83-111 (1989)）。G-CSFは線維芽細胞、マクロフ
ァージ、T細胞栄養膜、内皮細胞及び上皮細胞によって産生され、染色体17のあ
る4つのエクソン及び5つのイントロンを含む単一のコピー遺伝子の発現生成物で
ある。この部位の転写は差動的に処理されるmRNA種を産生し、G-CSF mRNAの2つ
の形態を生じ、1つのバージョンは177のアミノ酸のタンパク質をコードし、もう
1つのバージョンは174のアミノ酸のタンパク質をコードする（Nagata et at., E
MBO J 5: 575-581 (1986)）。174のアミノ酸を含む形態は最も特異的なインビボ
生物活性を有することが分かった。G-CSFは交差反応種であり、ヒトのG-CSFがマ
ウス、イヌ又はサルのような別の宿主に投与される場合、持続性好中球白血球増
加症（sustained neutrophil leukocytosis）を誘発する（Moore et at. PNAS-U
SA 84: 7134-7138 (1987)）。 本発明は、組換えウイルスの特異的な外来性抗原性ポリペプチドに対する免疫
応答を高めるのに有効な方法を提供する。本発明のワクチンにおいて、任意の外
来性抗原性ポリペプチドを使用できるが、これらのウイルスは宿主の免疫システ
ムに負の効果を有するために、該ワクチンはHIVウイルス及びエボラウイルスに
対するワクチンとして特に有用である。また、該ワクチンはB型及びC型肝炎ウイ
ルスに対する免疫にも非常に有用である。
【００５５】 ３．HIV感染に対する遺伝子ワクチン また、本発明の遺伝子ワクチンはHIVウイルスに対して有効なワクチンの必要
性に対処する。本発明によれば、遺伝子ワクチンは、ウイルスゲノムがHIV糖タ
ンパク質（例えば、GP120及びGP41）又はキャプシドタンパク質（例えば、P24）
のようなHIV由来の1つ以上の抗原を有する組換え良性ウイルスであってもよい。
これらのHIV抗原の配列はHIV糖タンパク質の免疫抑制領域の欠失のように変性さ
れてもよい。 HIVウイルスは後天性免疫不全症候群（AIDS）として知られる疾病を生じる。A
IDSは、1981年の最初の記述から現代の疫病として記述され、60,000人を超える
犠牲者の命を奪い、合衆国単独でも32,000人を超える死者を数える。疾病は免疫
システム及び中枢神経系の進行性の変性を伴う長い無症候性期間によって特徴付
けられる。該ウイルスは、症状が発生する前に5年以上も感染した個体に潜伏し
続け、従って、疾病の本当の影響はまだ感じられない。多くの米国人は、知らず
知らずのうちに感染し、その体液に触れるかもしれない他人を感染させ得る。こ
のように、検査をしない場合、AIDSの個人的、社会的及び経済的影響は莫大であ
ろう。
【００５６】 HIVウイルスはレトロウイルスである。このようにその遺伝物質はRNAであり、
ウイルス複製の情報をコードする。宿主細胞の感染により、RNAは、逆転写酵素
と呼ばれる酵素によって特徴付けられるDNAへの転写の鋳型として作用する。そ
のように生成されたDNAは、プロウイルスとして宿主のDNAに組み込まれる場合に
、細胞核に入る。適切に活性化された場合、レトロウイルス由来DNAは転写及び
翻訳されて、RNA含有ビリオンを産生し、次いで発芽プロセスによって細胞から
放出される。 個体がHIVに感染する場合、ウイルスは優先的に付着し、CD4と呼ばれる細胞表
面マーカーの存在により特徴付けられるT4リンパ球と呼ばれる白血球の特定のク
ラスに入る。これらの白血球は免疫システムにおいて複合的な役割を果たし、体
液及び細胞免疫応答の両方の重要な要素として機能する。HIVの多くの悪影響はT
4細胞の機能低下又は破壊に起因する。
【００５７】 無処置のHIVビリオンはほぼ球状であり、約110nmの直径である。ビリオンは糖
タンパク質gp160/120から構成されるスパイクのような構造に覆われた外膜を有
する。さらに、gp41と呼ばれる膜貫通型タンパク質が存在する。ビリオンの内側
には、リンタンパク質、p17を含む外殻及びリンタンパク質、p24から構成される
内核又は中核の2つの構造タンパク質がある。ウイルスRNAは、RNA鋳型からウイ
ルスDNAの合成に必要である逆転写酵素、p66/51の2つのコピーと一緒に核の内側
に存在する。HIV RNAゲノムは3つの主な構造遺伝子、gag、pol及びenvをコード
し、長い末端反復（LTR）配列によっていずれかの末端に隣接する。gag遺伝子は
、グループ特異的コアタンパク質、p55、p39、p24、p17及びp15をコードする。p
ol遺伝子は、逆転写酵素、p66/p51及びタンパク質分解酵素、p31をコードする。
env遺伝子は、外包膜糖タンパク質、gp120及びその前駆物質、gp160、及び膜貫
通型糖タンパク質、gp41をコードする。遺伝子の幾つか、特にenv遺伝子は、高
度に可変性である。さらに、その他のレトロウイルスと共有しない5つのその他
の遺伝子があり、転写又は翻訳調節に含まれ、又はその他の構造タンパク質をコ
ードする。全HIVゲノムは配列決定された。RatnerらのNature 313：277（1985）
を参照のこと。この文献を本願に引用して援用する。
【００５８】 HIVエンベロープタンパク質は広範囲に記載され、多くのHIVの菌株由来のHIV
エンベロープをコードするアミノ酸及びRNA配列が知られている。Myers, G. et
al., Human Retroviruses and AIDS: A compilation and analysis of nucleic
acid and amino acid sequences, Los Alamos National Laboratory, Los Alamo
s, N. M. (1992)を参照のこと。HIVの種々の菌株のenv遺伝子は850から880のア
ミノ酸のタンパク質をコードすることが予想される。合成の際のEnv前駆タンパ
ク質の広範囲のグリコシル化は、感染した細胞で検出されるenv遺伝子産物の主
な形態でもあるgp160（約160キロダルトン）を産生する。Gp160はホモトリマー
を形成し、ゴルジ体によるグリコシル化を生じる。 gp160の機能領域は、N-末端から開始して、シグナルペプチド、CD4結合部位を
含む可変領域1から5（例えば、Thr257、Trp427、Asp368/Glu370、及びAsp457）
、タンパク質分解プロセシング部位（gp120とgp41の間の切断部位とも呼ばれる
）、融合領域、ロイシンジッパーモチーフ、膜貫通領域、及びレンチウイルス溶
解性ペプチド（LLP）1及び2を含む。gp120のヌクレオチド及びアミノ酸配列及び
HIVの種々の単離物及び菌株由来のそれらの番号付は異なってもよいが、機能領
域をコードする領域はLuciw（1996）の"Fundamental Virology", 3rd ed., eds.
, Fields et al., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Chapter 27,
pp.845-916の教示するところにより直ちに同定され得る。
【００５９】 Env前駆体gp160のN-末端のシグナルペプチドは、新生タンパク質を小胞体に翻
訳するリボソームに向いており、細胞内プロテイナーゼはEnv gp生物発生の際に
このシグナルペプチドを除去する。Env前駆体gp160は、細胞プロテアーゼによっ
てプロセシング部位で切断されてgp120（SUサブユニットと呼ばれる）及びgp41
（TMサブユニットと呼ばれる）を産生する。gp120は、エンベロープ糖タンパク
質複合体の外部の表面曝露した領域のほとんどを含む。gp41は膜貫通領域を含み
、三量体配置に残り、非共有結合性様式でgp120と相互作用する。gp41のサブユ
ニットは、融合ペプチド、ロイシンジッパー様領域、膜貫通領域（TM）、LLP1及
びLLP2を含む。 Gp120サブユニットは5つの可変領域及び6つの保存領域を含む。Gp120の可変（
V）領域及び保存（C）領域は、Modrowら（1987）の"Computer-assisted analysi
s of envelope protein sequences of seven human immunodeficiency virus is
olates: predictions of antigenic epitopes in conserved and variable regi
ons", J. Virol. 61:570-578の命名法に従って特定される。
【００６０】 gp120分子は60,000ダルトンのポリペプチドコアからなり、N-結合グリコシル
化によって広範に変性され、分子の見掛け上の分子量を120,000ダルトンに増大
する。18システインの位置はgp120の主配列に残り、gp120配列の約24のN-結合グ
リコシル化部位の13の位置はすべてのgp120配列に共通する。高頻度可変性領域
は広範なアミノ酸置換、挿入及び欠失を含む。これらの領域における配列の多様
性は、種々のウイルス短離物由来のgp120分子間の全体の配列可変性の30％まで
を生じる。この多様性にもかかわらず、すべてのgp120配列は、ウイルス受容体C
D4と結合し、gp41と相互作用するウイルスの能力を保存して、ウイルス及び宿主
細胞膜の融合を誘発する。 HIVウイルスは、エンベロープ糖タンパク質の細胞表面受容体との相互作用に
より宿主細胞に付着する。HIVがT4細胞に接触する場合、gp120はCD4受容体と相
互作用することが考えられる。最近、HIV-1 gp120（菌株HXB-2、クレードBウイ
ルス）のコア領域の結晶構造は、タンパク質がヒトのCDのフラグメント及びケモ
カイン受容体結合をブロックするウイルス中和抗体由来の抗原結合フラグメント
と複合体をなすことによって解析された（Kwong et al. (1998) "Structure of
an HIV gp120 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and
a neutralizing human antibody", Nature 393:648-659）。これらの研究は、gp
120コアが2つの領域（“内部領域”（gp41に面する）及び“外部”領域（オリゴ
マーエンベロープ糖タンパク質複合体の表面にほとんどさらされる））を含むユ
ニークな分子構造を有することが明らかになった。2つのgp120領域は、いずれの
領域の部分でもない“架橋シート”によって分離される。CD4との結合は、架橋
シートをさらし、互いに関連のある内部及び外部領域を移動させてもよいgp120
のコンホメーションの変化を生じる。また、gp120に加えられたほとんどの糖質
分子は、外部領域に加えられる。これは、ウイルスが糖質分子を使用して、gp12
0の外部抗原エピトープをマスクする理想と一致している。
【００６１】 gp120は、細胞CD4受容体と結合するだけでなく、細胞ケモカイン受容体（例え
ば、CCR5）のようなHIV補助受容体とも結合する。次いで、受容体及び／又は補
助受容体と結合することにより、ウイルスエンベロープは細胞膜と融合し、ウイ
ルスの内部コアは、RNAのDNAプロウイルスへの転写が逆転写酵素によって触媒さ
れる場合に感染した細胞に入る。プロウイルスは、感染した個体が無症候である
間、数ヶ月又は数年間潜伏した状態で細胞内に残る場合がある。しかし、ウイル
スが後で活性化されて、ウイルス複製及び免疫抑制を生じる場合、個体はAIDSに
関連した日和見感染に対して感受性が高い。 本発明のHIVワクチンの一の実施態様において、HIVの感染に対して強い免疫応
答を誘発する組換えウイルスが提供される。組換えウイルスは、ヒト免疫不全ウ
イルス（HIV）由来の抗原をコードする組換えウイルスと非相同的である抗原配
列及び宿主における発現が該HIV抗原の免疫原性を高める免疫賦活剤をコードす
る組換えウイルスと非相同的である免疫賦活剤配列を含み、該HIV抗原の発現は
該HIV抗原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに感染したと
きに細胞は宿主において該HIV抗原を発現する。好ましい実施態様において、組
換えウイルスは複製能力がなく、宿主においてHIVに本来的に関連した悪性を生
じない。組換えウイルスは、HIV感染に対する強く持続的な免疫を誘発（induce
or elicit）するために宿主に投与される遺伝子ワクチンとして使用される。
【００６２】 変性又は弱毒化HIVビリオンを用いるHIVワクチンを開発するためのその他のア
プローチと比較して、本発明のアプローチは安全であり、強い免疫応答を誘発す
るのにより効果的であるが、おそらく宿主に感染する野生型HIVを組換えること
によってHIVの再活性化のリスクを生じない。 本発明によれば、遺伝子ワクチンにより発現されるHIV抗原は、HIV表面、コア
／キャプシド、調節、酵素及びアクセサリータンパク質のようなHIVウイルス由
来の任意の抗原であってもよい。HIV表面タンパク質の例としては、gp120及びgp
41のようなenv遺伝子の産物が挙げられるが、これらに限定されない。HIVキャプ
シドタンパク質の例としては、プロテアーゼPRをコードするウイルスによるPr55gag の切断生成物のようなgag遺伝子の産物、成熟キャプシドタンパク質MA（p17
）、CA（p24）、p2、NC（p7）、p1及びp6が挙げられるが、これらに限定されな
い（Herderson et al. (1992) J. Virol. 66:1856-1865）。ウイルス調節タンパ
ク質の例としては、tat及びrev遺伝子の産物、Tat及びRevが挙げられるが、これ
らに限定されない。ウイルス酵素タンパク質の例としては、pol遺伝子の産物、p
11（プロテアーゼ、すなわちPR）、p51（逆転写酵素、すなわちRT）、及びp32（
インテグラーゼ、すなわちIN）が挙げられるが、これらに限定されない。ウイル
スアクセサリータンパク質としては、vif、vpr、vpx、vpu及びnef遺伝子の産物
、Vif、Vpr、Vpx、Vpu及びNefが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】 一の実施態様において、HIV Nefタンパク質は、本発明の組換えウイルスによ
って発現されるHIV抗原として提供してもよい。例えば、Nefをコードする配列（
例えば、HIVのBH10の菌株の8152〜8523位及びHIVのpNL4-3の菌株の8787〜9407位
のnef配列）はベクターに挿入してもよい。 別の実施態様において、HIV Revタンパク質は、本発明の組換えウイルスによ
って発現されるHIV抗原として提供してもよい。例えば、Revをコードする配列（
例えば、HIVのpNL4-3の菌株の5969〜6044位のrev1配列及び8369〜8643位のrev2
配列）はベクターに挿入してもよい。 さらに、別の実施態様において、全長HIV Gagタンパク質は、本発明の組換え
ウイルスによって発現されるHIV抗原として提供してもよい。例えば、全長Gagを
コードする配列（例えば、HIVのBH10の菌株の112〜1650位及びHIVのpNL4-3の菌
株の790〜2292位のgag配列）はベクターに挿入してもよい。 あるいは、HIV Gagタンパク質由来のキャプシドタンパク質（例えば、p24 CA
）は、本発明の組換えウイルスによって発現されるHIV抗原として提供してもよ
い。例えば、p24CAをコードする配列（例えば、HIVのBH10の菌株の1186〜1878位
及びHIVのpNL4-3の菌株の508〜1200位の配列）はベクターに挿入してもよい。 さらに、別の実施態様において、組換えウイルスによって発現されるHIV抗原
はenv遺伝子産物由来である。例えば、該抗原はEnvタンパク質由来である。
【００６４】 本実施態様によれば、変性又は変異原性は、Envのある特定の領域の欠失又は
変異のために使用して、それを機能しないようにしてもよく、さらにまだ、未変
性の遺伝性（genicity）の中和エピトープを含む。例えば、Envのタンパク質分
解プロセシング部位は欠失又は変異して、gp120及びgp41フラグメントを産生す
る細胞プロテアーゼによる切断に抵抗させてもよい。また、欠失又は変異は、TM
、LLP-1及びLLP-2領域のようなgp41の膜貫通及び細胞質領域で行ってもよい。野
生型Envと比較して、変異したEnvタンパク質は、宿主に感染する野生型HIVに組
み込まれるリスクを低減し、宿主の免疫システムを破壊する目的のその促進にお
いてHIVによって利用されるリスクを低減する。 例えば、野生型HIV Envは以下の方法で変性できる。HIVのBH10由来であり、En
v、Tat、及びRevコード配列を含む野生型gp120配列は、制限酵素EcoRI及びXhoI
によって消化されて、ヌクレオチド5101から始まり、ヌクレオチド8252で終わる
フラグメントを産生することができる。Envのサイトゾル領域は、HIVのBH10の菌
株の7848〜8150位及びpNL4-3の8610〜8785位のコード配列からヌクレオチドを欠
失することによって除去できる。Envの切断部位は、HIV のBH10の菌株の7101〜7
112位、及びpNL4-3の7736〜7747位のアミノ酸配列REKRをコードする12のヌクレ
オチドを欠失することにより除去できる。
【００６５】 また、この実施態様によれば、変性Envタンパク質は中和エピトープを含まな
い領域の欠失させてもよい。例えば、gp120のV1及びV5領域は、gp120の未変性の
抗原性を犠牲にすることなしに欠失してもよい。また、中和エピトープを含まな
いgp120のV2及びV3領域の位置を欠失してもよい。本質的中和領域（princeple n
eutralizing domain: PND）はV3領域に見られるが、また、gp120のV2及びC4領域
は中和エピトープを含むことが分かった。HIVの種々の菌株又はクレードの中で
、中和エピトープのアミノ酸配列は可変であってもよい。しかし、多様性の量は
高く制約されることが分かった。このように、中和エピトープを含まない配列は
容易に決定される。 例えば、EnvのV1領域をコードする配列は、HIVのBH10の菌株の5961〜6032位、
及びpNL4-3の6602〜6673位で欠失できる。EnvのV2領域をコードする配列は、HIV
のBH10の菌株の6060〜6161位、及びpNL4-3の6700〜6796位で欠失できる。必要に
より、EnvのV1及びV2領域の両方をコードする配列は、HIVのBH10の菌株の5961〜
6161位、及びpNL4-3の6602〜6796位で欠失してもよい。
【００６６】 あるいは、組換えウイルスにより発現されるHIV抗原は、1つ以上の選択される
可変（V）及び／又は保存（C）領域を含むgp120のサブユニットであってもよい
。例えば、HIV抗原はV2、V3及びC4領域、又はV3及びC4領域を含むgp120サブユニ
ットであってもよい。V3領域の中和エピトープの位置はよく知られている。V2及
びC4領域の中和エピトープは、それぞれ残基163と200の間及び約420と440の間に
位置することが分かった。さらに、また、抗体結合の残基は、V2領域の残基171
、174、177、181、183、187、188及びC4領域の残基429及び432を含む（Berman e
t al. (1999) Virology 265:1-9; 及びBerman (1998) AIDS Res. Human Retrovi
ruses 15:115-132）。 別の実施態様において、本発明の組換えウイルスによって発現されるHIV抗原
は、グリコシル化部位の欠失及び／又は変異を含む変性Envタンパク質であって
もよい。HIV-1のgp120は、24のN-結合グリコシル化の可能な部位（Asn-X-Ser/Th
r）を含み、24のグリコシル化モチーフの約13は異なるウイルス単離物に保存さ
れる。HIV-1 Env gpタンパク質の分析は、24の可能なグリコシル化部分の17が糖
質側鎖で変性されることを示した（Mizuochi et al. (1990) J. Biol. Chem. 26
5:8519-8524; 及びLeonard et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:10373-10382）
。Env gpタンパク質の広範なグリコシル化のために、gp120のペプチドバックボ
ーンの非常に少ない領域は糖質の集団から出る。グリコシル化部位の幾つかは、
真の中和エピトープに対する免疫を希釈し、又はおとりエピトープとして提供す
る非中和エピトープにあることが分かった。このように、これらのグリコシル化
部位の欠失又は変異は真の中和エピトープを表に出すことによって、抗原の免疫
性を高めてもよい。
【００６７】 別の実施態様において、異なるHIV抗原は本発明の同じ組換えウイルスによっ
て発現されてもよい。例えば、Env、Tat及びRevタンパク質は、レトロウイルス
スプライシングドナー-アクセプターメカニズムを経てCMV初期プロモーターよの
ような同じプロモーターから発現されてもよい。また、必要により、全長又は切
断型又は変性型のHIV Gagタンパク質（例えば、キャプシドタンパク質p24）は、
Env、Tat及びRevのようなその他のHIV抗原と一緒に発現されてもよい。さらに、
これらのHIV抗原は、同じ組換えウイルスベクターによる単一又は複数のコピー
の免疫賦活剤（例えば、IL-2、IL-12、INF-γ、及びGMCSF）と一緒に発現されて
もよい。 例えば、HIV抗原をコードする配列は、アデノウイルスベクターのE1領域内に
挿入され、レトロウイルススプライシングドナー-アクセプターメカニズム又はI
RESメカニズムを経てCMV初期プロモーターから発現されてもよい。免疫賦活剤を
コードする配列は、同じアデノウイルスベクターのE4領域内に挿入され、レトロ
ウイルススプライシングドナー-アクセプターメカニズム又はIRESメカニズムを
経て別のCMV初期プロモーターから発現されてもよい。
【００６８】 さらに別の実施態様において、本発明の組換えウイルスのHIV抗原をコードす
る配列は、HIVウイルスの異なる菌株、単離物及び／又はクレード由来の配列を
含むモザイク抗原である。HIVの菌株は個体から単離され、特徴付けられ、菌株
名（例えば、MN、LAI）が与えられるHIV（単離物）である。HIVの異種遺伝子型
のために、2つの単離物は正確に同じではない。関連したHIV単離物のグループは
、そのエンベロープタンパク質のような遺伝的類似性のその度合いに従ってクラ
ス分けされる。現在、HIV-1の単離物の2つのグループ、M及びOがある。Mグルー
プは少なくとも9のクレード（サブタイプとも呼ばれる）、A〜Iからなる。Oグル
ープは同様の数のクレードからなる場合がある。クレードは遺伝的に異なるが、
すべて感染性である。本発明の遺伝子ワクチンの設計においてモザイクHIV抗原
を使用することにより、産生されるワクチンは、より広範な“野生型”HIV菌株
に対する抗HIV抗体及びHIV特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTLs）の産生を刺激す
る高められた能力を有すると考えられる。
【００６９】 一の実施態様において、組換えウイルスのモザイクHIV抗原は、クレードA（AT
CC No:HIV-1 92UG037WHO.0108HED）、B（ATCC No:pNL4-3）、C（ATCC No:HIV-1
92BR025WHO.109HED）、D（ATCC No:NIV-1 92UG024.2）、E（ATCC No:HIV-1 93TH
976.17）、F（ATCC No:HIV-1 93BR020.17）、及びG（ATCC No:HIV-1 92RU131.9
）を含むHIV-1の複数のクレード由来の抗原を含む。必要により、異なるクレー
ド由来のHIV抗原の制限フラグメントの複数の反復（例えば、Ava Iフラグメント
）は、頭-尾結合して、さらに複合的なモザイクHIV抗原を産生してもよい。 例えば、アデノウイルスベクターはモザイクHIV抗原として複数のクレードのV
3ループにより構成されてもよい。必要により、gp41が複数のクレードから欠失
したHIV抗原をモザイクHIV抗原として提供してもよい。あるいは、V1及びV2ルー
プがクレードB（pNL4-3）から欠失した複数のクレード由来のHIV抗原をモザイク
HIV抗原として提供してもよい。 さらに、必要により、アミノ酸配列SWLLLLLLSLSLLQATDFMSL［SEQ ID NO:9］を
コードするヒトの遺伝子Thy-1 GPAアンカー配列を組換えウイルス構築物に加え
てもよい。
【００７０】 別の実施態様において、モザイクHIV抗原は、HIVウイルスの異なる菌株、単離
物及び／又はクレード由来のgp120の可変及び定常領域を含むEnvタンパク質を含
む。例えば、MグループのクレードB由来のV2領域をOグループのクレードC由来の
V3及びC4領域と混合して、モザイクHIV抗原を産生してもよい。そのようなモザ
イク抗原を有する個体のワクチン接種は、交差クレード活性を有するCTLsを刺激
する場合がある。換言すれば、これらのCTLsは、異なるクレード由来のHIVに感
染した標的細胞を認識し、死滅させることができる。 あるいは、組換えウイルスは、それぞれHIVの異なる菌株、単離物又はクレー
ド由来の抗原である複数のHIV抗原を発現してもよい。例えば、HIVの異なるクレ
ード由来のenv遺伝子は組換えウイルスにクローン化され、宿主細胞のこれらの
クレードから種々のEnvタンパク質を産生するために直列に発現され得る。宿主
細胞におけるHIVの異なる菌株、単離物又はクレード由来の種々のEnvタンパク質
を発現することは、より広範な“野生型”HIV菌株に対する抗HIV抗体及びHIV特
異的細胞傷害性Tリンパ球（CTLs）の産生を刺激する本発明の遺伝子ワクチンの
能力を高めると考えられる。そのようなワクチンを接種された宿主はHIVの種々
の菌株の感染から免疫されることができるであろう。
【００７１】 本発明の遺伝子ワクチンを用いることによって、HIVに感染しない個体もHIVに
対して免疫できる。また、HIV感染した個体について、該ワクチンは、この病原
性ウイルスに対するその免疫応答を高め、攻撃を助けるために使用できる。遺伝
子ワクチンは、高レベルの抗原及び／又は種々のHIV糖タンパク質及びキャプシ
ドタンパク質を同時に発現できるために、ワクチン接種した個体はHIV-1及びHIV
-2のようなHIVの種々の菌株に対して免疫される。さらに、遺伝子ワクチンは自
然なウイルス感染に対する体の応答を模倣して高レベルのサイトカインを発現で
きるために、HIVに対するそのような遺伝子ワクチンに対する体の免疫応答は強
く持続的であり、従って、この致命的なウイルスに対して長期の免疫を達成する
。
【００７２】 ４．肝炎ウイルスに対する遺伝子ワクチン また、本発明の遺伝子ワクチンはA型、B型、C型、D型、及びE型肝炎ウイルス
のような肝炎ウイルスに対する効果的なワクチンの必要性に対処する。本発明に
よれば、該遺伝子ワクチンは、ウイルスゲノムが肝炎ウイルスの糖タンパク質及
びコアタンパク質のような肝炎ウイルス由来の1つ以上の抗原を有する組換え良
性ウイルスであってもよい。これらのHIV抗原の配列は、肝炎糖タンパク質又は
コアタンパク質の病理的領域の欠失のように変性されてもよい。 特に、本発明の組換えウイルスは、B型肝炎感染に対して個体を免疫するワク
チンとして使用できる。ウイルス性B型肝炎はB型肝炎ウイルス（HBV）によって
生じる。HBVは世界中で4億の人々が感染していると見積もられ、HBVを最も一般
的なヒトの病原体の1つにしている。ヒトを苦しめる最も一般的な癌の1つである
肝臓癌（HCC）は、慢性的なHBV感染によって主に生じる。
【００７３】 HBVは、多くはヘパドナ・ウイルス科の二重鎖DNAウイルスである。ビリオンは
おもにDNAを含むが、HBVゲノムはその緻密な形態、重複リーディングフレームの
使用、及び逆転写酵素工程への依存によりウイルスの世界でユニークである。HB
Vゲノムは、それぞれウイルスDNAポリメラーゼ、エンベロープタンパク質、プレ
コアタンパク質（ウイルス性キャプシドに加工される）及びタンパク質Xをコー
ドする4つの遺伝子、pol、env、プレコア（pre-core）及びXを有する。タンパク
質Xの機能は明らかではないが、宿主細胞遺伝子の活性化及び癌の発生に関係す
る場合がある。 HBV感染の診断は、一般的に血清学に基づいて行われる。HBVに感染した実質的
にすべての個体は、検出可能な血清肝炎表面抗原（HBsAg）を有する。HBV感染に
対するワクチンの注目に値する成功にもかかわらず、まだそれは進行中のタスク
である。最近の肝炎ワクチンの総説は、多くの重要な参考文献を含めて、Eddles
ton, The Lancet, p.1142, May 12, 1990で見つけられる。また、Viral Hepatit
is and Liver Disease, Vyas, B. N., Dienstag, J. L., and Hoofnagle, J. H.
, eds., Grune and Stratton, Inc. (1984) and Viral Hepatitis and Liver Di
sease, Proceedings of the 1990 International Symposium, eds F. B. Hollin
ger, S. M. Lemon and H. Margolis, published by Williams and Wilkinsも参
照のこと。本発明によれば、ウイルス抗原は、スモールB型肝炎表面抗原（SHBsA
g）（また、オーストラリア抗原とも参照される）、ミドルB型肝炎表面抗原（MH
BsAg）及びラージB型肝炎表面抗原（LHBsAg）のようなB型肝炎ウイルスの表面抗
原又はコアタンパク質であってもよい。
【００７４】 アジアタイプC及びアメリカタイプAのようなHBVの異なるタイプの抗原を組換
えウイルスにより発現させて、HBVのこれらのタイプに対する免疫応答を誘発し
てもよい。HBV表面抗原（HBsAg）又はコア抗原（HBcAg）は、別々に、又は一緒
に（HBsAg＋HBcAg）、本発明の組換えウイルスにより発現してもよい。 例えば、複数のHBV抗原をコードする配列をアデノウイルスベクターのE1又はE
4領域に挿入してもよく、レトロウイルススプライシングドナー-アクセプターメ
カニズム又はIRESメカニズムを経てCMV初期プロモーターから発現してもよい。
さらに、これらのHBV抗原を単一又は複数のコピーのIL-2、IFN-γ及びGMCSFのよ
うな1つ以上の免疫賦活剤と組み合わせて発現させてもよい。抗原配列によって
占有されず、レトロウイルススプライシングドナー-アクセプターメカニズム又
はIRESメカニズムを経て別のCMV初期プロモーターから発現されるE1又はE4領域
に、これらのサイトカインをコードする配列を挿入してもよい。 挿入の特異的な組み合わせとしては、 HBsAg＋HBcAg、HBsAg＋HBcAg＋IL-2、HBsAg＋HBcAg＋IFN-y＋GMCSF、及びHBsAg
＋IFN-y＋IFN-y＋GMCSFが挙げられるが、これらに限定されない。 免疫賦活剤をコードする配列を同じアデノウイルスベクターのE4領域に挿入し
てもよく、レトロウイルススプライシングドナー-アクセプターメカニズム又はI
RESメカニズムを経て別のCMV初期プロモーターから発現されてもよい。
【００７５】 また、本発明によれば、ウイルス抗原は、NS3、NS4及びNS5抗原のようなC型肝
炎ウイルスの表面抗原又はコアタンパク質であってもよい。 例えば、HCV抗原をコードする配列をアデノウイルスベクターのE1又はE4領域
に挿入してもよく、別々に、又は単一又は複数のコピーのIL-2、IL-12、IFN-γ
及びGMCSFのような1つ以上の免疫賦活剤と組み合わせて発現されてもよい。 特定の組み合わせとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されな
い。 （１）HCV野生型E2＋野生型E1、 （２）HCVコア、 （３）HCV E2＋E1＋コア、 （４）HCV E2＋E1＋コア＋IL-2、 （５）HCV E2＋E1＋コア＋IL-2＋IFN-γ＋GMCSF、及び （６）HCV E2＋E1＋コア＋IL-2＋IFN-γ＋IL-12。
【００７６】 別の実施態様において、HCV E1及びE2の高頻度可変領域（HVR）の複数コピー
、例えば、HVRの5つのコピー（5xHVR）は、組換えウイルスにおけるウイルス抗
原として提供され、単独で、又は単一又は複数のコピーのIL-2、IL-12、IFN-γ
及びGMCSFのような1つ以上の免疫賦活剤と組み合わせて発現させてもよい。 特定の組み合わせとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されな
い。 （１）E2-5xHVR＋E1、 （２）E2-5xHVR＋E1＋IL-2、 （３）E2-5xHVR＋E1＋コア＋IL-2、 （４）E2-5xHVR＋E1＋コア＋IL-2＋IFN-γ＋GMCSF、及び （５）E2-5xHVR＋E1＋コア＋IL-2＋IL-12。
【００７７】 本発明の遺伝子ワクチンを用いることによって、肝炎に感染していない個体は
肝炎ウイルスに対して免疫され得る。また、肝炎ウイルスに感染した個体につい
て、該ワクチンは、その免疫応答を追加免疫するために使用され、肝炎ウイルス
に対する攻撃を助けるために使用され得る。遺伝子ワクチンは、高レベルの抗原
及び／又は種々の肝炎糖タンパク質及びコアタンパク質を同時に発現できるため
に、ワクチン接種された個体は、A型、B型、C型、D型、及びE型肝炎ウイルスの
ような肝炎ウイルスの種々の菌株及び／又はタイプに対して免疫される。さらに
、遺伝子ワクチンは、自然なウイルス感染に対する体の応答を模倣して高レベル
のサイトカインを発現できるために、肝炎に対するそのような遺伝子ワクチンに
対する体の免疫応答は、強く持続的であり、その結果、肝炎ウイルスに対する長
期の免疫を達成する。
【００７８】 ５．エボラウイルスに対する遺伝子ワクチン また、本発明の遺伝子ワクチンは、致命的なウイルス、エボラウイルスに対す
る有効なワクチンの必要性にも対処する。本発明によれば、遺伝子ワクチンは、
ウイルスゲノムがエボラウイルスの糖タンパク質（例えば、GP1及びGP2）のよう
なエボラ肝炎由来の1つ以上の抗原を有する組換え良性ウイルスであってもよい
。これらのエボラ抗原の配列は、エボラウイルスの免疫抑制領域及び／又はその
他の病原性領域の欠失のように変性されてもよい。 エボラウイルスは、90％までの死亡率により人類に知られている最も致命的な
ウイルスの1つである（Johnson, K. M., Ann Intern Med 91 (1):117-9 (1979)
）。エボラウイルス感染の犠牲者は、数日のうちに命を奪う恐ろしい出血性疾患
にさらされる。感染の病原性の特質のために、該ウイルスの天然貯蔵所は依然と
して不明である。該ウイルスは、マクロファージのように、肝細胞及び細網内皮
系の細胞に対する非常に特異的親和性を有する。肝臓の広範囲の破壊は該疾病の
顕著な特徴である。
【００７９】 エボラウイルス感染はまれであるが、エボラウイルスがヒトの接触によって容
易に伝染し、非常に感染しやすいため、世界的な流行性となる疾病の可能性につ
いて、公衆衛生担当官は関心を持っている。最近、アフリカにおいて生じたもの
のような激増は、現代の旅行の高速かつ広範囲の特徴により先進工業国において
生じる可能性があった。アフリカにおけるエボラウイルス感染の最近のケースは
、この非常に危険な感染症の激増のために準備されるべきであると、強い警告を
送る。さらに、エボラウイルスは、テロリスト国家又は組織によって生物兵器と
して使用された場合、恐ろしい可能性を有する。ウイルス感染のたいていの場合
、エボラウイルスの激増を防ぐための最も良いアプローチはワクチン接種による
ものである。しかし、現在、エボラウイルス感染に対して有効なワクチン又は有
用な治療法はない。 エボラウイルスは、フィロウイルス科に属する包まれた、負鎖RNAウイルスで
ある。フィロウイルスには3つの菌株、エボラ、マールブルク及びレストンがあ
る。エボラウイルスは浮遊微小粒子に乗って伝わり、傷口のような皮膚の任意の
開口部を通って体内に入ることができるために、エボラウイルスは、空気が取り
込まれる開口部のような多くの異なる方法により体内に入ることができる。
【００８０】 エボラウイルスは、すべてのウイルス構造タンパク質（核タンパク質、基質タ
ンパク質VP24及びVP40）、非構造タンパク質（VP30、VP35）及びウイルスポリメ
ラーゼをコードする非セグメント化RNAゲノムを有する（Peters, C. J., West J
Med 164(1):36-8 (1996)）。ウイルスタンパク質の中で、エンベロープ糖タン
パク質（GP）は、2つの形態、転写編集により産生される分泌性タンパク質（50-
70kDa）及び膜貫通型糖タンパク質（130-170kDa）が存在する（Sanchez, A. et
al., Proc Natl Acad Sci U.S.A., 93(8):3602-7 (1996)）。GPの2つの形態は29
5のアミノ酸相同性を共有するが、それらは別の結合特異性を有し、ウイルス感
染の過程において異なる役割を果たすことが示唆される。分泌性糖タンパク質（
sGP）は、感染した細胞によって合成され、分泌される支配的な形態である。そ
れは宿主の免疫システムの抑制においてある役割を果たし（Yang, Z., et al.,
Science 279 (5353):1034-7 (1998)）、GPsの2つの形態はその抗原性を部分的に
共有するため、中和抗体から逃れるためにウイルス粒子を与えるおとりとしての
機能を果たしてもよい。エボラウイルスザイール感染のヒトの生存者のモノクロ
ーナル抗体の分析により、その大部分がsGPに特異的であり、GPと非常に弱く結
合していることが明らかになった（Maruyama, T., et al., J Infect Dis, 179
Suppl 1:S235-9 (1999), Maruyama, T., et al., J Virol, 73(7):6024-30 (199
9)）。SGPが免疫システムを抑制する正確なメカニズムは明確に理解されている
わけではないが、おそらく、感染の初期フェーズにおいて合成される多量のsGP
が感染部位の好中球浸潤の抑制（Yang, Z., et al., Science 279(5353):1034-7
(1998)）及びエボラウイルス感染患者におけるヒトの免疫応答の欠如の原因で
あろう（Baize, S., et al., Nat Med, 5(4):423-6 (1999)）。また、このタン
パク質は、免疫システムの多量の血管内アポトーシス本来の停止を導くことがで
きる多くのタイプの免疫細胞を過度に活性化するために作用してもよい（Baize,
S., et al., Nat Med, 5(4):423-6 (1999)）。また、エボラウイルスライフサ
イクルに対するsGPの重要性は、これまで、それが試験されるすべてのエボラウ
イルスの菌株に存在する事実により示唆される（Feldmann, H., et al., Arch V
irol Suppl, 15:159-69 (1999)）。
【００８１】 膜糖タンパク質は、受容体結合及びウイルス細胞膜融合を媒介することによる
ビリオンのターゲット細胞への付着及び浸透の原因である（Wool-Lewis, et al.
, J. Virol, 72(4):3155-60 (1998), Ito H., et al., J. Virol, 73(10):8907-
12 (1999)）。それらは、単一のペプチド前駆体として合成され、2つの天然型、
GP1及びGP2の細胞酵素（フリン（furin）又はカテプシンB）によって切断される
。2つのGPsは、ジスルフィド結合連鎖により関連付けられ、膜貫通（TM）領域に
よってウイルス膜に固着される（Ito H., et al., J. Virol, 73(10):8907-12 (
1999); Malashkevich, V. N., et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A., 96(6):266
2-7 (1999)）。タンパク質分解切断部位は、レトロウイルス、インフルエンザ、
及びパラキミソウイルスのGPsにおいて見られるものと同様である4-5の塩基性ア
ミノ酸残基を含む（Garten, W., et al., Biochimie, 76(3-4):217-25 (1994)）
。切断現象はウイルス感染力に本質的であり、おそらくレトロウイルス又はイン
フルエンザウイルスのGPsを切断する同じ酵素によって行われるであろう（Garte
n, W., et al., Biochimie, 76(3-4):217-25 (1994); Volchkov, V.E., et al.,
Virology, 245(1):110-9 (1994)）。さらに、エボラウイルスGPは、レトロウイ
ルス及びインフルエンザ糖タンパク質によるウイルス感染を媒介する一般的なメ
カニズムを共有してもよい（Weissenhorn, W., et al., Mol Membr Biol, 16(1)
:3-9 (1999)）。膜結合型GPsは、ウイルス感染の開始に重要な役割を果たし、ま
た、ビリオンの表面にさらされる支配的なタンパク質であるため、それらはウイ
ルスに対する中和抗体の主なターゲットである。
【００８２】 宿主にとって致命的であるエボラウイルスの特性の1つは、宿主の免疫システ
ムを抑制する能力である。エボラウイルス感染が死因である患者の血清学的分析
は、体液又は細胞免疫応答の徴候を示さなかった（Baize, S., et al., Nat Med
, 5(4):423-6 (1999)）。対照的に、ウイルスタンパク質に対する抗体及びウイ
ルス特異的T細胞活性は少ない生存者において検出された（Baize, S., et al.,
Nat Med, 5(4):423-6 (1999)）。免疫抑制メカニズムは、まだ理解されていない
が、おそらく高レベルのsGP及びGPの免疫抑制ペプチドにより、エボラウイルス
感染した患者における体液及び細胞免疫応答の欠如によるものであろう。 エボラウイルスの初期感染の原因であるタンパク質はウイルス糖タンパク質で
ある。従って、それらは中和抗体のターゲットである。しかし、感染から回復す
るには遅すぎる程度、エボラウイルスは、宿主の免疫応答を抑制又は遅延するた
めに“トリック（tricks）”を進化させた。エボラウイルスに対するワクチンを
生成するための従来のアプローチは、以下の理由で、おそらく効果的ではない。
（１）細菌、酵母又は昆虫の細胞において産生されるウイルス糖タンパク質は適
切にグリコシル化されず、従って、ウイルスタンパク質の真の抗原性を有さない
。 （２）エボラウイルスはあまりに危険であるため、不活性化ウイルスワクチンの
ように多量に産生できない。 （３）ウイルスを不活性化する方法は、しばしばタンパク質のコンホメーション
を破壊し、従って、その抗原性を変化させる。
【００８３】 本発明の好ましい実施態様は、エボラウイルスの1つ以上の抗原をコードする
核酸を有する組換えウイルスワクチンである。ザイールの菌株を含むエボラウイ
ルスの制限酵素切断地図及び全配列情報は、GenBankから入手可能である。 遺伝子ワクチンは、複製欠陥のある又は複製能力のない組換え良性ウイルスで
あり、従って、最初に感染した細胞以外に伝播できない。例えば、たとえエボラ
ウイルスタンパク質が組換えウイルスの機能に対して機能的に関連がなくても、
本発明の組換えアデノウイルスワクチンは、2週間以上、高レベルのエボラウイ
ルス抗原発現を媒介する。 本発明の別の実施態様において、組換えウイルスは1つ以上の変性エボラウイ
ルス抗原を発現する。変性エボラウイルス抗原は、好ましくはエボラウイルスエ
ンベロープ糖タンパク質及び／又はその免疫的に活性な部分である。好ましくは
、糖タンパク質は変性GP及びsGP糖タンパク質である。エボラウイルスGP及びsGP
糖タンパク質はその病原性及び免疫抑制機能を破壊するように変性されるが、エ
ボラウイルスに増殖性に感染され得る細胞の内部に発現され、折り畳まれ、グリ
コシル化され、細胞膜を標的にされるために、その天然の抗原性のほとんどを保
持する。変性は、制限消化及びポリメラーゼ連鎖反応法のような標準的な分子遺
伝子操作方法を用いて行われる。
【００８４】 エボラウイルスエンベロープ糖タンパク質の好ましい変性は、エボラウイルス
GPの感染機能を破壊することである。エボラウイルスの感染機能を破壊する任意
の変性が使用できるが、好ましくは、変性はGPの切断部位の5つのアミノ酸欠失
である。実施例１を参照のこと。この切断部位はオープンリーディングフレーム
の開始点から501位で、5つの塩基性アミノ酸残基、RRTRRを含む。この欠失は、
技術的によく知られた方法によって行われるPCR増幅を用いてエボラウイルスGP
cDNA内に導入してもよい。 エボラウイルスのウイルスゲノムの別の好ましい変性はsGPの合成を妨げる。
合成を妨げる任意の変性を使用してもよい。好ましくは、変性はRNA編集部位をU
UUUUUUからUUCUUCUUに変えることに関する。実施例１を参照のこと。 本発明のワクチンで使用されるエボラウイルス抗原に対する別の好ましい変性
は、GP2に位置する免疫抑制（IS）ペプチドである。ISペプチドモチーフはアミ
ノ酸585-609に位置する。アミノ酸の590-600の10のアミノ酸欠失はその機能を排
除する。第二に、ISペプチドモチーフの各半分は逆にされ、複製される。図２を
参照のこと。さらに、これは、その機能が破壊され、また、その抗原性をも増大
することを保証する。
【００８５】 さらに、本発明のエボラウイルス抗原をコードするヌクレオチド配列の多様性
又は誘導体が産生され、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変えることは
、当業者に容易に理解される。変化した発現抗原は変化したアミノ酸配列を有し
てもよいが、エボラウイルス抗原と反応する免疫応答を誘発し、機能的に等価で
あると考えられる。さらに、また、全長タンパク質の一部をコードする全長遺伝
子のフラグメントが構築されてもよい。これらのフラグメントはエボラウイルス
抗原と反応する抗体を誘発するタンパク質又はペプチドをコードしてもよく、機
能的に等価であると考えられる。 本発明のワクチンによる個体のワクチン接種は、細胞内へのアデノウイルス粒
子の侵入及びエンベロープ糖タンパク質のようなエボラウイルス抗原、及び免疫
賦活剤サイトカインの発現を生じる。細胞におけるエボラウイルス抗原の発現は
、感染が生じているように、強く持続的な免疫応答を誘発する。遺伝子ワクチン
は、天然ウイルスタンパク質の発現及び持続的抗原刺激を含む自然感染の免疫原
性のすべてを有するが、真のウイルス感染の病原性は有さない。本発明のワクチ
ンにおいて、エボラウイルスの免疫抑制メカニズムは無効にされ、抗原はその未
変性の形態で生じ、細胞膜と関連し、免疫刺激は数週間持続する。この新規のワ
クチンの効果は持続的であり、エボラウイルス感染に対する高い保護率を提供す
る。
【００８６】 また、本発明はエボラウイルス感染に対してヒトを免疫する方法に関し、上記
ワクチンを投与することを含む。これらのワクチンをヒトに投与する方法は、健
康分野の当業者によく知られている。 本発明の遺伝子ワクチンを用いることにより、個体はエボラウイルスに対して
免疫されてもよい。遺伝子治療は高レベルの抗原及び／又は種々の糖タンパク質
を同時に発現できるため、ワクチン接種した個体は種々のエボラウイルスの菌株
に対して免疫される。さらに、該遺伝子ワクチンは自然なウイルス感染に対する
体の応答を模倣するために高レベルのサイトカインを発現できるため、エボラウ
イルスに対するそのような遺伝子ワクチンに対する体の免疫応答は強く持続的で
あり、その結果、エボラウイルスに対する持続的な免疫を達成する。
【００８７】 ５．投与製剤及び経路 また、本発明は、上述のワクチン、及び医薬的に許容される希釈剤、担体、又
は賦形剤を含む医薬組成物に関する。また、さらに、該ワクチンは、水性媒体又
は懸濁を含む水を含んでもよく、しばしば活性及び／又は保存性を増加するため
にその他の成分を混合される。これらの成分は、塩、pH緩衝剤、安定剤（スキム
ミルク又はカゼイン加水分解物のような）、乳化剤、及び防腐剤であってもよい
。 アジュバントは、組換えウイルスから発現されるウイルス抗原に対する免疫応
答を増大するために医薬組成物に含めてもよい。アジュバントの例としては、ム
ラミールジペプチド、水酸化アルミニウム、サポニン、ポリアニオン、両親媒性
物質、カルメット-ゲラン菌（BCG）、エンドトキシンリポ多糖類、キーホールリ
ンペットヘモシニアン（GKLH）、インターロイキン-2（IL-2）、顆粒球マクロフ
ァージコロニー刺激因子（GM-CSF）及びサイトキサン（cytoxan）、低投与量で
与えられる場合に、腫瘍誘導抑制を低減すると考えられている化学療法薬が挙げ
られるが、これらに限定されない。
【００８８】 また、本発明は、病原体に対する宿主の免疫を高めるキットを提供する。これ
らのキットは、ワクチンを宿主及び／又はシリンジのような宿主にワクチンを与
える器具に与えるための組成物と組み合わせて本発明の任意の1つ以上のワクチ
ンを含んでもよい。 本発明のワクチンは従来の能動免疫スキーム：ある意味では、投与製剤と混和
性であり、予防上効果のある量、すなわち病原性エボラウイルス、HIV、A型、B
型、C型、D型、及びE型肝炎ウイルス、及びバチルス・チューバキュロウセスの
ような病原性ウイルス又は細菌による曝露に対するヒトの免疫を誘発する抗原を
発現できる量の免疫抗原又は組換え微生物で、1回又は繰り返しの投与により投
与できる。免疫は、ワクチン接種されていないヒトと比較したワクチン接種後の
有意なレベルの保護の誘発として定義される。
【００８９】 本発明のワクチン、すなわち組換えウイルスは、宿主、好ましくはヒトの被験
者に、任意の医薬的に許容される投与経路を経て投与してもよい。投与経路とし
ては、筋肉内、気管内、皮下、鼻腔内、皮内、直腸的、経口的又は親の投与経路
が挙げられるが、これらに限定されない。所望する場合、投与経路は、免疫され
る病原性ウイルスのタイプ及び保護を必要とする体の部位に応じて組み合わせた
り、調節したりしてもよい。 組換えウイルスの投与又は有効量は、状態、選択されるウイルス又は細菌抗原
、年齢、体重及び宿主の健康状態のような因子に依存し、宿主毎に変えてもよい
。個体に投与される本発明の組換えウイルスの適切な力価は、ウイルス又は細菌
抗原に対する免疫応答を変調できる力価であり、抗原が由来する病原性ウイルス
又は細菌に対する抗体を誘発する。有効な力価は、個体へのワクチンの投与後の
免疫エフェクター細胞の活性を決定するアッセイを用いて決定でき、又はよく知
られたインビボ診断アッセイを用いる治療の有効性のモニタリングによって決定
できる。例えば、本発明の組換えアデノウイルスの予防上有効な量又は投与量は
、約1×104〜1×108プラーク形成単位（pfu）ウイルス/mlの濃度を含む約100μl
〜約10mlの塩類溶液であってもよい。 当業者は、例えば、投与されるウイルス粒子の量が、ワクチンが投与される回
数及び所望の応答のレベルに依存することは理解するであろう。
【００９０】 ６．病原体に対する宿主の免疫を高める方法 また、本発明は、病原体に対する宿主の免疫を上記組換えウイルスにより高め
る方法を提供する。 一の実施態様において、病原性ウイルスに対する宿主の免疫を高める方法が提
供される。該方法は、免疫応答を誘発するのに有効な量の組換えウイルスを宿主
に投与することを含む。組換えウイルスは病原性ウイルス由来のウイルス抗原を
コードする良性ウイルスと非相同的である抗原配列及び宿主における発現が該ウ
イルス抗原の免疫原性を高める免疫賦活剤をコードする良性ウイルスと非相同的
である免疫賦活剤配列を含み、該ウイルス抗原の発現は該ウイルス抗原に向いて
いる免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに感染したときに細胞は宿主にお
いて該ウイルス抗原を発現する。組換えウイルスは、好ましくは、複製能力がな
くてもよく、宿主において該病原性ウイルスと本来的に関連した悪性を生じなく
てもよい。 組換えウイルスは、任意の医薬的に許容される投与経路を経て宿主に投与して
もよい。組換えウイルスは、筋肉内、気管内、皮下、鼻腔内、皮内、直腸的、経
口的又は親の投与経路を経て宿主に投与してもよい。
【００９１】 別の実施態様において、複数の抗原に対する強く持続的な免疫応答を誘発する
複数の抗原により病原性ウイルスに対して宿主を免疫する方法が提供される。該
方法は、免疫応答を誘発するのに有効な量の組換えウイルスを宿主に投与するこ
とを含む。組換えウイルスは、組換えウイルスと非相同的である複数の抗原配列
を含み、それぞれは1つ以上の病原性ウイルス由来の異なるウイルス抗原をコー
ドし、複数の抗原配列の発現は該ウイルス抗原に向いている免疫応答を誘発し、
宿主が組換えウイルスに感染したときに細胞が宿主において該ウイルス抗原を発
現する。組換えウイルスは、好ましくは、複製能力がなくてもよく、宿主におい
て該病原性ウイルスと本来的に関連した悪性を生じなくてもよい。 また、必要により、組換えウイルスは、宿主における発現が該ウイルス抗原の
免疫原性を高める免疫賦活剤をコードする組換えウイルスと非相同的である1つ
以上の免疫賦活剤配列を含んでもよい。
【００９２】 さらに別の実施態様において、複数の遺伝子ワクチン又はウイルスを用いて病
原性ウイルスに対して宿主を免疫する方法が提供される。複数の組換えウイルス
は、各組換えウイルスにおいて異なる抗原を有してもよい。複数の組換えウイル
スは、同時に、又は段階的に宿主に投与してもよい。 該方法は、免疫応答を誘発するのに有効な量の第一及び第二組換えウイルスを
宿主に投与することを含み、抗体が産生される。第一組換え良性ウイルスは、病
原性ウイルス由来のウイルス抗原をコードする第一組換えウイルスと非相同的で
ある抗原配列を含み、該ウイルス抗原の発現は該ウイルス抗原に向いている免疫
応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに感染したときに細胞が宿主において該ウ
イルス抗原を発現する。第二組換えウイルスは、宿主における発現が該ウイルス
抗原の免疫原性を高める免疫賦活剤をコードする第二組換えウイルスと非相同的
である免疫賦活剤配列を含む。第一及び第二組換えウイルスは、好ましくは、複
製能力がなくてもよく、宿主における該病原性ウイルスと本来的に関連した悪性
を生じなくてもよい。 本実施態様によれば、第一及び第二組換えウイルスは、複製能力のないアデノ
ウイルス、アデノ随伴ウイルス、SV40ウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペス
ウイルス及びワクシニアウイルスのような良性ウイルスのいずれかであってもよ
い。必要により、第一及び第二組換えウイルスの両方は、複製能力のないアデノ
ウイルスであってもよい。また、必要により、第一及び第二組換えウイルスの一
方は、組換えアデノウイルスであってもよく、他方は組換えワクシニアウイルス
であってもよい。
【００９３】 さらに別の実施態様において、病原体に対する宿主の免疫を高める方法が提供
される。該方法は、組換えウイルス及び1つ以上の免疫賦活剤を宿主に投与する
ことを含む。組換えウイルスは、上述の組換えウイルスのいずれであってもよい
。特に、組換えウイルスは、病原体由来の1つ以上の抗原をコードする組換えウ
イルスと非相同的である1つ以上の抗原配列を含む。該抗原の発現は、該抗原に
向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに感染したときに細胞が宿
主において該抗原を発現する。組換えウイルスは、好ましくは、複製能力がなく
、宿主において該病原体と本来的に関連した悪性を生じない。該病原体は、HIV
、肝炎ウイルス及びエボラウイルスのような病原性ウイルス、病原性細菌又は寄
生虫であってもよい。 本実施態様によれば、免疫賦活剤は、組換えウイルスに感染した細胞により発
現される抗原の免疫原性を高める任意の分子であってもよい。好ましくは、免疫
賦活剤はサイトカインであり、インターロイキン-2、インターロイキン-8、イン
ターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-インターフ
ェロン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、及
びそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。サイトカインは
純粋なタンパク質の形態で宿主に投与してもよい。あるいは、サイトカインは、
宿主の細胞を形質移入又は形質導入することによりサイトカインのコード配列を
発現する発現ベクターの形態で投与してもよい。
【００９４】 エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション及び電気泳動法の標準方法は、製造
者又は供給者の使用説明書に従って行われる。標準方法は詳細に記載しないが、
当業者によりよく理解されている。 本発明を実施することは、他に示されない限り、ウイルス学、微生物学、分子
生物学及び当業界における技術の範囲内の組換えDNA方法の従来の方法を使用す
る。そのような方法は、文献にすべて説明されている。例えば、Sambrook, et a
l. Molecular Cloning: A laboratory Manual; DNA Cloning: A Practical Appr
oach, vol I & II (D. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Giat, ed
.); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edi
tion); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Curre
nt Edition); Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B. N. Field
s and D. M. Knipe, eds.)を参照のこと。 以下の実施例は本発明を説明するために提供されるが、本発明をそれらに限定
するものではない。
【００９５】 実施例 以下の方法は、種々の病原性ウイルスに対する本発明の遺伝子ワクチンを生成
する方法を示すために記載される。遺伝子ワクチンは、アデノウイルスバックボ
ーンに挿入される病原性ウイルス（例えば、エボラウイルス、B型肝炎ウイルス
及びHIV）由来の変性抗原を有するアデノウイルスベクターに基づく。さらに、
また、組換えアデノウイルスは、種々のサイトカインをコードする複数の遺伝子
も有する。組換えアデノウイルスは複製能力がないが、アデノウイルスの感染力
を保持する。 その他の病原性ウイルス、細菌及び寄生虫に対する遺伝子ワクチンは、以下に
記載される同様の方法により当業者によって構築されてもよいことが知られてい
る。
【００９６】 １．エボラウイルスに対する遺伝子ワクチン エボラウイルスに対する遺伝子ワクチンの実施態様及びその構築方法は以下に
詳細に記載される。 1）エボラウイルスの膜糖タンパク質の遺伝子組換え 組換えは、制限酵素消化及びポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のような標準的な
分子遺伝子操作方法を用いて行われる。 エボラウイルスの糖タンパク質はエボラウイルスワクチンの最適抗原を産生す
るために変性される。GPタンパク質の2つの変性形態は、不活性化された免疫抑
制及び感染メカニズムを有するように構築されるが、野生型の糖タンパク質の完
全な天然の抗原性を保持する。mRNA編集シグナルは、免疫抑制である分泌性糖タ
ンパク質の産生を妨げるために除去され、（２）糖タンパク質前駆体のタンパク
質分解切断部位は、機能的糖タンパク質（GP1及びGP2）の形成を妨げるために除
去される（Sanchez, A., et al., Proc Natl Acad Sci U. S. A. 93(8):3602-7
(1996)）。1つの形態において、免疫抑制ペプチド領域は、その機能を妨げるた
めに除去され、他の形態において、免疫抑制ペプチドモチーフは、その機能を破
壊するために分割されるが、その免疫原性を保持する。これらの工程は、ワクチ
ンに有効で、安全な抗原を産生する。 エボラウイルスのエンベロープ糖タンパク質（GP）は、単一の前駆体タンパク
質として合成され、輸送の際に細胞酵素（フリン）によって2つのサブユニット
（GP1及びGP2）に分割される（Volchkov, V. E., et al., Proc Natl Acad Sci
U.S.A., 95(10):5762-7 (1998)）。このタンパク質分解切断は、成熟糖タンパク
質の形成及び切断部位のC末端にある融合ペプチドの放出に必須である。成熟糖
タンパク質は、三量体としてビリオン内に組込まれる（各モノマーはジスルフィ
ド結合によって結合したGP1及びGP2のへテロダイマーである）（Sanchez, A., e
t al., J. Virol 72(8):6442-7 (1998)）。エボラウイルスの糖タンパク質はウ
イルス膜表面にさらされる主要なタンパク質であり、開始ウイルスが宿主細胞内
に入る原因である。従って、それらは中和抗体の主要なターゲットである。
【００９７】 糖タンパク質切断部位は、オープンリーディングフレームの開始部位から501
位の5つの塩基性アミノ酸残基（RRTRR［SEQ ID NO:10］）を含む。エボラウイル
ス糖タンパク質切断部位は、例えばRSV又はMuLVのエンベロープタンパク質にお
けるその他のウイルスの糖タンパク質において見られる保存配列と同様である。
以前、われわれは、3つの塩基性アミノ酸残基の欠失又は点変異が切断をブロッ
クでき、糖タンパク質をRSVにおいて機能しないようにすることを示した（Dong,
J. Y, et al., J. Virol 66(2):865-74 (1992)）。 エボラウイルス糖タンパク質の感染機能を破壊するために、切断部位の5つの
塩基性アミノ酸残基が除去される。この除去は、PCR増幅を用いてエボラウイル
スGP cDNAに導入される。あるいは、切断部位は、例えば切断の排除を生じる部
位特異的変異によって変えてもよい。
【００９８】 エボラウイルスの別の重要な特徴は、糖タンパク質の2つの形態、分泌型（sGP
）及び膜結合型（GP）が単一の遺伝子から合成されることである。2つの形態は
、すべての4つのエボラウイルスサブユニットの中で高く保存されている7つのウ
リジンの配列（開始部位から1020-1028位）での変化するRNA編集現象の結果とし
て生成される（Sanchez, A., et al., Proc NatlAcad Sci U.S.A. 93(8):3602-7
(1996)）。sGPは編集されないmRNAから合成され、おそらく免疫抑制機能を有す
る。GPは編集されたmRNAから合成され、おそらく免疫抑制機能を有する。GPは、
7つのウリジンの1つの挿入により編集されたmRNAから合成される。このRNA編集
はフレームシフトを生じ、完全な膜貫通型糖タンパク質（GP2）をコードする第
二リーディングフレームの翻訳を生じる。 sGPの合成を妨げるために、RNA編集部位がUUUUUUU［SEQ ID NO:2］からUUCUUC
UU［SEQ ID NO:3］へ組換えられる。cDNAにおいて、等価な配列は、それぞれAAA
AAAA［SEQ ID NO:4］及びAAGAAGAA［SEQ ID NO:5］である。この組換えは、（１
）すべてのmRNAがGPのみをコードする（-1フレームシフトにより編集型と等価で
ある）及び（２）UUUUUU［SEQ ID NO:6］はUUCUUC［SEQ ID NO:7］と同じアミノ
酸残基をコードするが、6つのウリジンの伸長での別のポリメラーゼ分裂の可能
性を防ぐことを達成する。追加の編集は、さらに1つのウリジンの欠失及びさら
なる（-2）フレームシフトを生じる。この組換えのメカニズムは図２に図示され
る。
【００９９】 第三の組換えは、GP2にある免疫抑制（IS）ペプチドの欠失に関して、エボラ
ウイルス糖タンパク質に導入してもよい。ISペプチドモチーフ（開始部位からア
ミノ酸585-609）は、フィロウイルスに高く保存され、免疫抑制であることを示
している腫瘍形成レトロウイルスの糖タンパク質におけるモチーフと相同性の程
度が高い（Volchkov, V. E., et al., FEBS Lett 305(3):181-4 (1992); Will,
C., et al., J. Virol 67(3):1203-10 (1993); Mitani, M., et al., Proc Natl
Acad Sci U.S.A. 84(1):237-40 (1987); Gatot, J. S., et al., J. Biol Chem
273(21):12870-80 (1998); Denner, J., et al., J Acquir Immune Defic Synd
r Hum Retrovirol 12(5):442-50 (1996)）。第一に、10のアミノ酸の欠失は、モ
チーフ（アミノ酸590-600）のコア領域に導入されて、その機能を排除する。第
二に、モチーフの各半分は逆さにされ、機能を破壊するために複製され、抗原性
を増大する。ISペプチドに対する抗体が、感染の際にエボラウイルスの免疫抑制
機能を抑制してもよいと考えられる。この組換えの基本的な戦略を図３Ａ〜３Ｃ
に図示される。 図３Ａ〜３Ｃに図示されるように、免疫抑制ペプチド（IS）の組換えはGP2遺
伝子で行われる。図３Ａは野生型GPを示す。図３ＢはISペプチドの10のアミノ酸
が除かれたGPを示す。図３Ｃは、分割され、逆さにされ、複製されたISペプチド
を示す。
【０１００】 これらの組換えにより、機能せず、免疫抑制しないが、GPの天然の病原性を保
持するエボラウイルス糖タンパク質が産生される。これらの組換えGP配列を使用
して、エボラウイルスに対する本発明のワクチンにおける抗原を産生する。 得られた変化したGP遺伝子のDNA配列は配列分析により確認される。次いで、
組換えGP配列は、宿主細胞のこれらのGPsの効果的な発現に必要なDNA成分を含む
プラスミドベクター内にクローン化される。細胞膜への発現及び正しい局在化は
、それぞれ、過剰免疫されたウマの血清由来のポリクローナル抗体及びわさびの
ペルオキシダーゼ（HRP）又は蛍光タグによって標識された抗ウマの第二抗体を
用いて、HeLa又は293細胞の過渡的なトランスフェクションによって決定され、
ウエスタンブロット及びFACSにより分析される。
【０１０１】 ２．変性エボラウイルスGPsの高レベルの発現を媒介する一連の複製欠陥アデノ
ウイルスワクチンの構築 本発明のワクチンは、エボラウイルスの変性抗原を有し、宿主をだましてエボ
ラウイルスに対する強い免疫防御を高めるために組換え良性ウイルスを利用する
。好ましい良性ウイルスは、複製欠陥のあるアデノウイルスである。これらのベ
クターは、幾つかの理由で、ワクチン発現の素晴らしい選択である。第一に、ア
デノウイルスベクターは、免疫システムの強い刺激を与える高レベルの抗原発現
に関する。第二に、それらが発現する抗原は加工されて、病原体感染細胞を模倣
するように形質導入された細胞において示される。このフェーズは、感染した細
胞に対する細胞免疫を誘発するのに非常に重要であると考えられ、従来のワクチ
ンアプローチが使用される場合、完全に欠けている。第三に、アデノウイルスは
、非常に強力な抗原提示細胞である樹状細胞を感染させる（Diao, J. et al., G
ene Ther 6(5):845-53 (1999); Zhong, L., et al., Eur J Immunol 29(3):964-
72 (1999); Wan, Y., et al., Int J Oncol 14(4):771-6 (1999); Wan, Y., et
al., Hum Gene Ther 8(11):1355-63 (1997)）。第四に、これらのベクターは、
免疫増強サイトカイン遺伝子を有するために操作されて、さらに免疫を高めるこ
とができる。第五に、アデノウイルスは、本来ヒトの気道及び腸の上皮細胞をお
かし、従って、ワクチンは点鼻薬及び経口摂取により与えられてもよい。最後に
、本発明のアデノウイルスベクターは、複製欠陥があり、遺伝子治療の研究のた
めの臨床試験において高い投与量（109〜1012i.p./1回の服用）で使用されるた
め、安全である（Gahery-Segard, H., et al., J. Clin Invest 100(9):2218-26
(1997); Bellon, G., et al., Hum Gene Ther 8(1):15-25 (1997); Boucher, R
. C., et al., Hum Gene Ther 5(5):61539 (1994)）。実際、生ウイルスでも、
風邪を防ぐために、新兵に安全に使用されている。
【０１０２】 また、このベクター構築システムは、複数の遺伝子又は調節メカニズムを発現
する複合ベクターを確立するために使用される。例えば、ベクター構築物は、単
一の複合ベクターのエボラGP抗原とともに複数のサイトカインを発現するために
使用され、さらに免疫の誘発を高める。あるいは、抗原及びサイトカインは、別
々のベクターに置かれる。これは、2又は3つのベクターによる同時形質導入（感
染）によってサイトカイン及び抗原の異なる組み合わせの操作を可能にする。 アデノウイルスベクターの構築を図４に図示する。変性GP(s)をコードするcDN
Aは、シャトルベクターpLAd（図４Ａ、左側）を用いるアデノウイルスゲノムの
左末端（E1領域）にクローン化され、シャトルベクターpLAd/EBO-GPを生じる。p
LAd/EBO-GPベクターは、長い左末端反復L-TR及びアデノウイルスパッケージング
シグナルΨを含むアデノウイルスゲノムの左末端を含む。IL-2及びIL-4のような
サイトカインをコードする遺伝子は、シャトルベクターpRAd（図４Ａ、右側）を
用いるアデノウイルスベクターのE4領域に挿入され、シャトルベクターpRAdIL2,
4を生じる。PRAdIL2,4は、長い右末端反復R-TRを含むアデノウイルスゲノムの右
末端を含む。
【０１０３】 GP遺伝子のみを有するアデノウイルスベクターを構築するために、シャトルベ
クターpLAd/EBO-GPは、XbaIのような適切な制限酵素により消化される。GP遺伝
子を含むフラグメントは、アデノウイルスバックボーン及びpRAdベクターと結合
される。 E1領域にgp遺伝子を有し、E4領域にサイトカイン遺伝子を有するアデノウイル
スベクターを構築するために、pLAd/EBO-GP及びpRAdIL2,4の両方は直線化され、
アデノウイルスのバックボーンと結合される（図４Ｂ）。 組換えアデノウイルスベクターを産生するために、結合したベクターゲノムは
、2つのアデノウイルス末端反復を有する正確に結合したゲノムのみが複製でき
、感染性ウイルス粒子を産生できる293細胞に形質移入される。受入番号CRL1573
でATCCから入手できるヒトの293細胞（Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59-
72 (1977)）は、そのゲノムに安定に組み込まれたアデノウイルスE1a及びE1b遺
伝子を有する。293細胞は、ベクターバックボーンから除去されているアデノウ
イルスの必須E1遺伝子を補う。最終ベクターは、E1、E3及び除去された部分的な
E4を有し、293細胞においてのみ複製できるが、ターゲット細胞において複製で
きない。アデノウイルスベクターは293細胞において増幅され、塩化セシウム勾
配における遠心力により精製される。ベクターの力価は、293細胞の感染後、感
染性粒子（ip）の段階希釈及び測定によって決定される。
【０１０４】 3）遺伝子ワクチンに対する免疫応答の決定 インビトロアッセイは、ワクチンに応じて発生した中和抗体の量を定量化する
ために使用される。該アッセイは、モロニーマウス白血病ウイルスシステムに基
づくレトロウイルスベクターシステムに基づく。GAG及びPOLタンパク質を発現す
るベクター及びパッケージング細胞は、広範に特徴付けられ、市販されている。
レポーターとしてβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を有するパッケージングベクター
構築物が使用される。エボラウイルスGPの膜型を発現する新規ベクター構築物は
、β-Galレポーターベクターによって同時形質移入され、その元のエンベロープ
タンパク質の代わりにエボラウイルスGPを有するレトロウイルスベクター粒子を
産生するGAG-POLパッケージング細胞株を生じる。
【０１０５】 4）動物モデルにおける中和抗体のよりよい産生を与える変性GP抗原の決定 2つのGP変異体を有するアデノウイルスワクチンベクターは、CD-1マウスのエ
ボラウイルスGPに対する免疫応答を誘発するその能力で試験される（チャールズ
リバーラボラトリー；ロックフェラー研究所のスイスマウスの異系交配したスト
ック）。具体的に、ISモチーフのある、及びないGP変異体によって誘発されるエ
ボラウイルスGP抗原に対する中和抗体価及び細胞溶解性T-リンパ球（CTL）活性
が比較される。30匹の8週齢のマウスの3つのグループは、それぞれGP変異体1（I
Sペプチドが除去された）、GP変異体2（ISペプチドを分裂し、反転させた）及び
β-ガラクトシダーゼ（コントロールベクター）を発現する105ipのアデノウイル
スベクターにより皮下に注入される。各グループからの6匹のマウスは、ワクチ
ン接種後1、2、4、8及び16週で屠殺され（CO2窒息及び頚部脱臼）、その血液及
び脾臓は収集される。さらに、6匹のマウスは塩水溶液でニセのワクチン接種さ
れ、2日後屠殺されて、予備免疫コントロールを提供する。 コントロールβ-Galベクターを注入したマウスから、ベクター注入の部位から
の組織切片が得られ、固定され、X-gal溶液により染色されて、感染後の種々の
時間でベクターを形質導入された細胞の数及びタイプを決定する。さらに、溶血
素染色は、ベクターデリバリの部位で種々の免疫細胞（好中球、マクロファージ
、単球等）の侵入の度合いを決定するために行われる。 ワクチン接種された動物由来の血清は、記載されている（Van Ginkel, F. W.,
et al., Hum Gene Ther 6(7):895-903 (1995); Van Ginkel, F. W., et al., J
Immunol 159(2):685-93 (1997)）標準的な96ウエルプレートELISAプロトコール
を用いて全GP結合抗体について検査される。血清の中和活性は、ベクターが種々
の血清濃度でインキュベートされた後HeLa細胞のエボラウイルスGP-偽型レトロ
ウイルスベクター（Wool Lewis, et al., J. Virol, 72(4):3155-60 (1998)）の感染性をモニターするこ
とによって分析される。感染した細胞可溶化物におけるβ-ガラクトシダーゼの
発現は、血清の中和活性の指標として役立ち（より低いβ-gal活性、よりよいEB
O-β-Galベクターは中和される）、非常に感度の高い蛍光発生物質（ガラクト-
ライトキットJ）及び蛍光プレートリーダーを用いて測定される。抗GP血清中和
感染率は、血清の非存在下及びGP活性化されていない血清の存在下の感染率と比
較される。
【０１０６】 細胞傷害性リンパ球（CTLs）は、以前に記載されたマウスの脾臓から抽出され
る（Van Ginkel, F. W., et al., Hum Gene Ther 1995;6(7):895-903; Dong, J.
Y., et al., Hum Gene Ther 1996;7(3):319-31）。それらは、変性されていな
いエボラウイルスGPタンパク質を有するアデノウイルスベクターにより形質導入
された孤立した一定数のLnCaP細胞（上皮の前立腺癌細胞の起源）と混合される
。10:1、3:1、及び1:1のエフェクター：ターゲット細胞の比が使用される。細胞
は、96ウエルプレートに播種され、24時間後にすべての未結合細胞（エフェクタ
ーCTLs及び死んだ、又は瀕死のLnCaP細胞のすべてを含む）が除去され、残って
いる生存可能な（接着性）細胞は、MTT（3-(4,5-ジメチルチアゾール-20-イル)2
,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）切断アッセイにより定量化される。こ
のアッセイは、リンパ球の細胞傷害性を検出するのに使用され（Ni, J., et al.
, J Clin Lab Anal 1996;10(1):42-52）、感度、信頼性及び速度の点で放射性ア
ッセイと有利に比較される。
【０１０７】 5）複数のサイトカインの免疫増強機能及び遺伝子ワクチンの有効性への影響 ワクチンの効果を高めるために、IL2、IL4、IL12、INF-γ、及びGM-CSFのよう
な免疫増強サイトカインを発現するためにベクター媒介遺伝子導入が使用される
。最初に、各サイトカインは別々にクローン化され、又はサイトカインはウイル
ス抗原をコードするベクター由来のアデノウイルスベクター分離物への種々の組
み合わせでクローン化される。個々のサイトカイン又はそれらの組み合わせの免
疫増強効果は、サイトカインをコードするベクター及び抗原を有するベクターに
よる同時感染によって研究される。血清抗体の力価が比較され、同様に異なるサ
イトカイン発現ベクターと組み合わせてワクチンを接種された動物において、効
率的な力価に達するには、時間がかかる。これらの実験は、免疫増強サイトカイ
ンがより高いレベルの抗体、短縮された誘導時間、及びエボラウイルスに対する
免疫の延長を誘発するかどうかの決定を与える。
【０１０８】 最も優れた変性GP変異体の決定後、それによって高められた免疫応答が種々の
サイトカインを有するベクターの免疫化部位の同時送達によって高められる範囲
が分析される。インターロイキン-2は、それ自身で、又はIL-4又はIL-12と組み
合わせて、細胞傷害性T-細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞及びB-細胞の活性及
び増殖を強く高めるために示される（Michael, B. N., et al., Cell Immunol 1
994;158(1);105-15; Bruserud, O., et al., EurJ. Haematol 1992;48(4);221-7
; Jacobsen, S. E., et al., Res Immunol 1995;146(7-8):506-14; Wolf, S. F.
, et al., Res Immunol 1995;146(7-8);486-9; Tepper, R. I., Res Immunol 19
93;144(8):633-7; O'Garra A., et al., Res Immunol 1993;144(8):620-5; Ohe,
Y., et al., Int J Cancer 1993;53(3):432-7; Delespesse, G., et al., Res
Immunol 1995;146(7-8):461-6. [36-43]）。INF-γは、ヒトの免疫応答を刺激し
、その分泌部位で血管壁の浸透性を増加するが（Chensue, S. W., et al., J Im
munol 154(11):5969-76 (1995); Szente, B. E., et al., Biochem Biophys Res
Commun 203(3):1645-54 (1994); Adams, R. B., et al., J. Immunol 150(6):2
356-63 (1993)）、Gm-CSFは活性化し、マクロファージ及びその他のAPCsを感染
部位に引きつける（Bober, L. A., et al., Immunopharmacology 29(2):111-9 (
1995); Dale, D. C., et al., Am J. Hematol 57(1):7-15 (1998); Zhao, Y., e
t al., Chung Hua I Hsueh Tsa Chih 77(10):32-6 (1997)）。
【０１０９】 30匹の8週齢のマウスの6つのグループは、5×104ipの選択されたGP変異体ベク
ター及び5×104ipの以下のベクター：Ad-β-Gal、Ad-IL2、Ad-IL2/IL4、Ad-IL2/
IL12、Ad-IFN-γ及びAd-GM-CSFの1つの混合物によって皮下に注入される。 各グループからの6つのマウスは、実施例４に記載されるように1、2、4、8及
び16週で屠殺され、分析される。全IgGの分析はELISAを用いて行われ、中和活性
はEBO-GP偽型レトロウイルスベクターのHeLa細胞をおかす能力との干渉として検
査され、抗GP CLT活性は、実施例４に記載されるように脾臓抽出CTLsをAd-EBO-G
P構築物により形質導入されたターゲットLnCaP細胞と混合することによって行わ
れる。また、血清中の種々のサイトカインのレベルは、市販のアッセイを用いる
ELISAによって定量化される。ある特定の場合に、これらのアッセイは、同じサ
イトカインのヒト及びマウスのバージョンを識別し、アデノウイルスベクターを
用いて送達されるサイトカインの発現レベル及びそれらが免疫応答の発生とどの
ように関係するかの情報を直接与える。 個々のサイトカインが分析された後、最も機能したものは組み合わせにおいて
試験される。30匹の8週齢のマウスの4つのグループは、5×104i.p.の選択された
GP変異体ベクター及び5×104i.p.の最大3つの選択されたサイトカイン発現ベク
ター（3つよりも少ないサイトカインベクターが使用される場合、i.p.濃度はAd-
β-Galベクターからなる）の混合物によって皮下に注入される。各グループから
の6匹のマウスは、1、2、4、8及び16週で屠殺され、上述のように分析される。
【０１１０】 異なる種におけるGPベクター及び複数のサイトカインに対する免疫応答の強さ
及び再現性を検証するために、上述の実験がウサギにおいて再現される。6匹の
ホワイトニュージーランドウサギ5つのグループは、以下のベクターの組み合わ
せ：Ad-β-Galベクター（106ip）、選択されたGPベクター（2.5×105ipプラス7.
5×105ipのAd-β-Gal）、及び上述の3つのサイトカインベクターの組み合わせ（
2.5×105の各サイトカインベクター）プラスGPベクター（2.5×105ip）の1つに
よって腿部の筋肉に注入される。動物はワクチン接種の2日前に採血され（免疫
前の採血）、次いで上述のスケジュールに従う。5〜10mlの血液はセッション毎
に抽出される。分析はマウスと同様の方法で行われる（上記参照のこと）。 ヒトのサイトカインをコードする遺伝子は、マウス及びウサギのモデルにおい
て使用されるため、それらの免疫システムは、それらのタンパク質に対する同一
でない（ヒトと）応答を有する。しかし、高い相同性は、ヒト及びマウスのサイ
トカインの間、及びそれらの受容体の間に存在し、マウスにおいてヒト又はその
他の宿主のサイトカインを用いる実験の発表された報告は、高いレベルの同一性
を示す。必要に応じて、これらのサイトカインの種特異的バージョンが得られ、
種ターゲットサイトカイン活性の研究のために本発明のアデノウイルスベクター
にクローン化される。
【０１１１】 6）ワクチンの投与の効率及び比率の最適化及び非霊長類及び霊長類の動物モデ
ルにおける安全性及び病原体曝露研究の実施 サイトカイン及び抗原の最もよい組み合わせを決定した後、ワクチンベクター
の最終バージョンが構築される。これらの複合組換えアデノウイルスベクターは
、単一のベクターを用いてサイトカイン及び抗原の組み合わせをターゲット細胞
に運ぶ。マウス及びウサギにおける用量力価分析は、免疫応答の最大レベルを生
成するように要求される最も低い服用量を同定するために行われる。筋肉内及び
静脈内注入、経口摂取及び点鼻薬のようなワクチン投与の異なる経路が比較され
る。安全性の研究のために、マウス及びウサギにおける服用量の段階的な増大実
験は、毒性が観測されるまで、又は有効量の10倍のレベルに達するまで行われる
。最後に、追加の安全性及び病原体曝露実験が霊長類において行われる。
【０１１２】 ２．HIVに対する遺伝子ワクチン HIVに対する遺伝子ワクチンの実施態様及びそれらの構築方法が以下に詳しく
記載される。 1）HIVに対する複製欠陥のあるアデノウイルスワクチンの構築 a）Ad.tat.env.IL2 同じベクター内にEnv、Tat、及びRevタンパク質等の複数のHIV抗原及びインタ
ーロイキン-2（IL-2）のコード配列を有するようにアデノウイルスベクター、Ad
.tat.env.IL2を構築した。HIV抗原及びIL-2の発現は、アデノウイルスベクター
の異なる領域に置かれるプロモーターによって別個に制御される。この設計は、
ウイルス抗原及び免疫賦活剤IL-2の両方の高レベルの発現を保証し、アデノウイ
ルスワクチンの免疫原性を高めることができると考えられる。次のセクションで
提示される実験データで示されるように、このアデノウイルスベクターは、HIV
抗原に対する動物における強い体液免疫応答を誘発することができる。 上記で詳細に記載されるエボラウイルスに対するアデノウイルスワクチンを構
築するためのものと同様の戦略を用いてアデノウイルスベクター、Ad.tat.env.I
L2を構築した。簡単に、全長gp160、全長Tat及び全長RevをコードするHIV-1の菌
株BH10由来のEcoRI/XhoI制限フラグメントをシャトルベクターpLAdを用いてアデ
ノウイルスゲノムの左末端（E1領域）に挿入し（図４Ａ、左側）、シャトルベク
ターpLAd-CMV-Env-Tat-Revを得た。 IL-2（Xba I部位の欠失により生じた沈黙突然変異を有する）をコードする配
列をシャトルベクターpRAdを用いてアデノウイルスゲノムのE4領域に挿入し（図
４Ａ、右側）、シャトルベクターpRAd-CMV-IL2を得た。 pLAd-CMV-Env-Tat-Rev及びpRAd-CMV-IL2の両方をXba I及びEcoRIのような適切
な制限酵素を用いて直線化し、アデノウイルスのバックボーンと結合して（図４
Ｂ）、組換えアデノウイルスベクターAd.tat.env.IL2を得た。
【０１１３】 b）Ad.3C.env.gag 同じベクター内に変性Env（切断部位（REKR［SEQ ID NO:11］）及び長さが33
のアミノ酸の細胞質領域が欠失したgp160）及びGagタンパク質等の複数のHIV抗
原及び3つの異なるサイトカイン（XbaI部位、INF-γ、及びGMCSFを破壊するよう
な沈黙突然変異を有するIL-2）のためのコード配列を有するように別のアデノウ
イルスベクター、Ad.3C.env.gagを構築した。HIV抗原及びサイトカインの発現は
、アデノウイルスベクターの異なる領域に置かれるプロモーターによって別個に
制御される。この設計は、ウイルス抗原及び免疫賦活剤の両方の高レベルの発現
を保証することができ、アデノウイルスワクチンの免疫原性を高めることができ
ると考えられる。次のセクションで提示される実験データで示されるように、こ
のアデノウイルスベクターは、HIV抗原に対する動物における強い体液免疫応答
を誘発することができる。
【０１１４】 アデノウイルスベクター、Ad.env.gag.3Cを上記で詳細に記載されるエボラウ
イルスに対するアデノウイルスワクチンを構築するためのものと同様の戦略を用
いて構築された。簡単に、Env/gp160をコードするHIV-1の菌株BH10由来の配列を
、切断部位（REKR部位）及び長さが99のヌクレオチドの細胞質領域をコードする
配列を除去するように変性し、次いで、全長Gagをコードする配列と共に、シャ
トルベクターpLAdを用いてアデノウイルスゲノムの左末端（E1領域）に挿入した
（図４Ａ、左側）。 これらの2つのHIV抗原は、3つのスプライシング受容体部位、SA1、及びSA2で
レトロウイルススプライシングドナー（SD）及びアクセプター（SA）メカニズム
を経てCMVプロモーターから個別に発現される。生成されるシャトルベクターは
、pLAd-CMV-SD/SA1-Env-SA2-Gagと命名される。
【０１１５】 IL-2（Xba I部位の欠失により生じる沈黙突然変異を有する）、INF-γ、及びG
MCSF等の複数の免疫賦活剤をコードする配列を、シャトルベクターpRAdを用いて
アデノウイルスゲノムのE4領域に挿入した（図４Ａ、右側）。これらの3つの免
疫賦活剤は、3つのスプライシング受容体部位、SA1、SA2、及びSA3でレトロウイ
ルススプライシングドナー（SD）及びアクセプター（SA）メカニズムを経て別の
CMVプロモーターから個別に発現される。生成されるシャトルベクターは、pRAd-
CMV-SD/SA1-IL2-SA2-INFγ-SA3-GMCSFと命名される。 pLAd-CMV-SD/SA1-Env-SA2-Gag及びpRAd-CMV-SD/SA1-IL2-SA2-INFγ-SA3-GMCSF
の両方を、Xba I及びEcoRIのような適切な制限酵素を用いて直線化し、アデノウ
イルスのバックボーンと結合して（図４Ｂ）、組換えアデノウイルスベクターAd
.3C.env.gagを得た。
【０１１６】 3）Ad.3C.env.rev.gag 同じベクター内に変性Env（切断部位（REKR［SEQ ID NO:11］）及び長さが33
のアミノ酸の細胞質領域が欠失したgp160）、全長Rev及びGagタンパク質等の複
数のHIV抗原及び3つの異なるサイトカイン（XbaI部位、INF-γ、及びGMCSFを破
壊するような沈黙突然変異を有するIL-2）のためのコード配列を有するように別
のアデノウイルスベクター、Ad.env.rev.gag.3Cを構築した。HIV抗原及びサイト
カインの発現は、アデノウイルスベクターの異なる領域に置かれるプロモーター
によって別個に制御される。この設計は、ウイルス抗原及び免疫賦活剤の両方の
高レベルの発現を保証することができ、アデノウイルスワクチンの免疫原性を高
めることができると考えられる。次のセクションで提示される実験データで示さ
れるように、このアデノウイルスベクターは、HIV抗原に対する動物における強
い体液免疫応答を誘発することができる。
【０１１７】 アデノウイルスベクター、Ad.3C.env.rev.gagを、上記で詳細に記載されるエ
ボラウイルスに対するアデノウイルスワクチンを構築するためのものと同様の戦
略を用いて構築した。簡単に、Env/gp160をコードするHIV-1の菌株BH10由来の配
列を、切断部位（REKR部位）及び長さが99のヌクレオチドの細胞質領域をコード
する配列を除去するように変性し、次いで、全長Gag及び全長Revをコードする配
列と共に、シャトルベクターpLAdを用いてアデノウイルスゲノムの左末端（E1領
域）に挿入した（図４Ａ、左側）。 これらの3つのHIV抗原は、3つのスプライシング受容体部位、SA1、SA2、及びS
A3でレトロウイルススプライシングドナー（SD）及びアクセプター（SA）メカニ
ズムを経てCMVプロモーターから個別に発現される。生成されるシャトルベクタ
ーは、pLAd-CMV-SD/SA1-Env-SA2-Gag-SA3-Revと命名される。
【０１１８】 IL-2（Xba I部位の欠失により生じる沈黙突然変異を有する）、INF-γ、及びG
MCSF等の複数の免疫賦活剤をコードする配列を、シャトルベクターpRAdを用いて
アデノウイルスゲノムのE4領域に挿入した（図４Ａ、右側）。これらの3つの免
疫賦活剤は、3つのスプライシング受容体部位、SA1、SA2、及びSA3でレトロウイ
ルススプライシングドナー（SD）及びアクセプター（SA）メカニズムを経て別の
CMVプロモーターから個別に発現される。生成されるシャトルベクターは、pRAd-
CMV-SD/SA1-IL2-SA2-INFγ-SA3-GMCSFと命名される。 pLAd-CMV-SD/SA1-Env-SA2-Gag-SA3-Rev及びpRAd-CMV-SD/SA1-IL2-SA2-INFγ-S
A3-GMCSFの両方を、Xba I及びEcoRIのような適切な制限酵素を用いて直線化し、
アデノウイルスのバックボーンと結合して（図４Ｂ）、組換えアデノウイルスベ
クターAd.3C.env.rev.gagを得た。
【０１１９】 2）HIV抗原に対するアデノウイルスワクチンに対する動物の免疫応答 実験マウスに、上記で構築されたアデノウイルスワクチン、Sd.tat.env.IL2を
接種し、このベクターによって発現されるHIV抗原に対する免疫応答を誘発した
。アデノウイルスベクターの免疫原性は、HIV tat及びenvに対する抗体価を測定
することによって決定した。 図６及び７は、それぞれ2グループのマウスにおけるHIV Envタンパク質に対す
るAd.tat.env.IL2の免疫原性を示す。C57BL/6マウス（チャールズリバーラボラ
トリー（ウィルミントン、MA）により供給される）のこれらのグループは、図に
示されるように異なる日付で107pfuのAd.tat.env.IL2を筋肉内に注入した。血液
（各動物について約150〜500μl）を接種後2週間毎に4匹の動物から収集し、血
清を調製した。接種後77日で、これらのマウスを、さらに107pfuのAd.tat.env.I
L2を再接種した。血液を、2回目の接種後毎日、3匹の動物から収集した。HIV ta
t及びenvに対して誘発された抗体価を、Ad.tat.env.IL2に感染したHeLa細胞可溶
化物に対するELISAによって決定した。
【０１２０】 簡単に、Ad.tat.env.IL2を感染させたHeLa細胞可溶化物は以下のように調製さ
れた。HeLa細胞は、20の感染効率（MOI）でAd.tat.env.IL2を感染させた。感染
の48時間後、HeLa細胞を収集し、1％トリトンX-100を含む緩衝剤に懸濁した。ポ
スト核上澄みを15,000×gで5分間可溶化物を遠心分離して得た。可溶化物をELIS
Aプレートのコーティングウエルで10μg/mlに希釈した。標準のELISAアッセイを
行って血清のOD450を測定し、HIV tat及びenvタンパク質に対する抗体の相対的
力価をマウスの予備免疫血清のCD450の平均に対する規格化により計算した。 図６に示すように、このグループの3匹のマウスは、アデノウイルスベクターA
d.tat.env.IL2によって発現されるHIV抗原に対する強い免疫応答を有し、接種後
約42日で達したHIV抗原に対する抗体の最も高い力価でを有した。Ad.tat.env.IL
2による2回目の接種は再び免疫応答を高め、非常に高い力価が2回目の接種の約5
日以内に達成された。 また、図７に示すように、このグループの3匹のマウスは、アデノウイルスベ
クターAd.tat.env.IL2によって発現されるHIV抗原に対する強い免疫応答を有し
、接種後約70日で達したHIV抗原に対する抗体の最も高い力価を有した。Ad.tat.
env.IL2による2回目の接種は再び免疫応答を高め、非常に高い力価が2回目の接
種の約5日以内に達成された。
【０１２１】 図１２、１３及び１４は、それぞれHIV抗原gp120、Gag及びRevに対する組換え
アデノウイルスベクターAd.3C.env.gag及びAd.3C.env.gag.revの免疫原性を示す
。C57BL/6マウスには、107pfuのAd.3C.env.gag又はAd.3C.env.gag.revを筋肉内
に注入した。接種の6週間後、これらのマウスの相対的抗体価を精製した組換えg
p120、Gag、又はRevタンパク質（NIH AIDSリサーチ及びReference Reagent Prog
ram、Bethesda、MDから得た）に対するELISAによって決定した。血清を1:250に
希釈した。各値は、4匹の個々のマウスの平均を示す。バックグラウンド吸収を
差し引いた。 図１２及び１３に示すように、Ad.3C.env.gag又はAd.3C.env.gag.revを接種し
たマウスは、免疫されていないマウスと比較して、HIV抗原gp120及びGagに対す
る強い免疫応答を有した。
【０１２２】 3）HIV抗原に対するアデノウイルスワクチンの免疫化による細胞傷害性Tリンパ
球（CTL）の活性 HIV抗原に対するアデノウイルスワクチンの免疫化による細胞傷害性Tリンパ球
（CTL）の活性は、2つの独立したアッセイ：IFNγアッセイ及びグランザイムAア
ッセイを用いて測定した。IFNγ及びグランザイムアッセイをT細胞の抗原特異的
活性を検出するために設計した。IFNγは細胞免疫経路に特異的に機能する活性
化されたCTL及びTH1ヘルパーT細胞によって分泌される。また、グランザイムAは
活性化されたCTLによって分泌される。基本的なアプローチは、所望の抗原を発
現し、IFNγ又はグランザイムAの媒体への分泌を期待するターゲット細胞により
脾細胞をインキュベートすることである。
【０１２３】 a）IFNγアッセイ このアッセイは、ターゲット細胞が脾細胞によるインキュベーション前に放射
標識されないことを除いて、標準の51Cr放出溶菌アッセイ（Current Protocols
in Immunology, Coligan et al., eds.）の改良である。このアッセイの詳細な
手順は、Di Fabio et al. (1994) "Quantitation of human influenza virus-sp
ecific cytotoxic T lymphocytes: correlation of cytotoxicity and increase
d numbers of IFN-gamma-(or IFNy-) producing CD8+ T cells" Int. immunol.
6:11-9に記載されている。簡単に、約1×105の脾細胞を100μlの合計容積で105
のターゲット細胞（例えば、ターゲット抗原を有する適切なウイルスに感染した
）によりインキュベートした。細胞を4時間37℃でインキュベートした。IFNγは
25μlの培地からELISAによって測定した。 HIV抗原に対するアデノウイルスワクチンにより接種されたマウスのCTLの活性
を上述のIFNγアッセイを用いて決定した。簡単に、12匹のC57BL/6マウスには、
107pfuのAd.tat.env.IL2を筋肉内に注入した。脾臓を4匹の接種したマウスから
図８Ａ−Ｃに示した時間で収集した。Ad.tat.env.IL2を感染させたB16-F1細胞（
C57BL/6、ATCC No:CRL-6323由来のメラノーマ細胞株）でインキュベートするこ
とにより脾細胞を活性化した。刺激後7日で、示したウイルスを感染させたB16-F
1細胞と活性化した脾細胞を混合した。培地へのIFNγ分泌をELISA（R＆D System
s、Minneapolis、MN）により決定した。
【０１２４】 図８Ａ−Ｃは、接種後4〜8週間にわたって培地に分泌されたIFNγの量の％増
加を示す。図８Ａに示すように、IFNγの分泌は、Ad.tat.env.IL2の接種後4週で
収集した4匹のマウスの脾細胞において明らかに増加した。対照的に、非特異的
タンパク質β-Gal（Ad.lacZ）を発現するアデノウイルスベクターを感染させたB
16-F1細胞又は感染していないB16-F1細胞により脾細胞をインキュベートした場
合、IFNγの分泌の増加はわずかであった。 図８Ｂに示すように、IFNγの分泌は、接種後6週で収集したマウスの脾細胞に
おいてより増加した。マウス5の脾細胞におけるIFNγの分泌の100％近い増加が
目立っている（図８Ｂ）。 図８Ｃに示すように、IFNγの分泌は、接種後8週で収集したマウスの脾細胞に
おいてより劇的に増加した。マウス11の脾細胞において、IFNγの分泌の増加は3
00％を超えた（図８Ｃ）。
【０１２５】 これらの結果は、高い力価の抗体の誘発及びHIV抗原を特異的にターゲットと
するCTLの活性のようなHIVに対する強い体液免疫応答がHIVウイルス抗原及びIL-
2のような免疫賦活剤の両方を発現するアデノウイルスワクチンを動物に接種す
ることによって達成されることを示す。免疫応答は、ウイルス感染症の回復中の
ものに似ている。これらの結果は、未変性ウイルスの感染を模倣する本発明の遺
伝子ワクチンがHIVに対するヒトの効果的なワクチンとして大いに有望であるこ
とを示している。
【０１２６】 b）グランザイムAアッセイ グランザイムAアッセイは、Deitz et al. (2000) "MHC l-dependent antigen
presentation is inhibited by poliovirus protein 3A" Proc. Natl. Acad. Sc
i. 97:13790-13795に記載されるものから改良されたプロトコールを用いて行っ
た。Deitzらにより記載されたグランザイムAアッセイは、Kane et al. (1989) "
Cytolytic Tlymphocyte response to isolated class I H-2 proteins and infl
uenza peptides" Nature (London) 340:157-159に記載されるプロトコールの改
良であった。 グランザイムAアッセイは、以下の例外を含むIFNγアッセイに関するものと同
様の方法により行った。培地へのグランザイムAの分泌は、酵素アッセイによっ
て決定される。グランザイムAのユニットは、反応の線形フェーズの際の活性の
傾きを計算することによって決定した。グランザイムAの1つのユニットは、基質
を1時間に1OD405に変えるのに必要な酵素の量として定義される。 簡単に、IFNγアッセイに関する限りは、約1×105の活性化された脾細胞及び
約1×105のターゲット細胞を一緒にインキュベートした。グランザイムA活性は
、96ウエルプレートで20μlの培地を180μlの反応混合物（0.2mMのBLT（N-α-ベ
ンジルオキシカルボニル-L-リジンチオベンジルエステル、Sigma、St. Lous、MO
）、0.22mMのDTNB（5,5'-ジチオ-ビス(2-ニトロ安息香酸、Sigma、St. Louis、M
O)）と併用すること及び室温でインキュベートすることによって決定した。405n
mでの吸収を数時間にわたってモニターした。酵素活性の傾きを反応の線形フェ
ーズについて決定し、酵素の単位に変換した。
【０１２７】 図９には、接種後8週間で収集したマウスの脾細胞について、培地に分泌され
たグランザイムAの量の増加を示す。図９に示すように、グランザイムAの分泌は
、Ad.tat.env.IL2の接種後8週間で収集した4匹のマウスの脾細胞において明らか
に増加した。対照的に、非特異的タンパク質β-Gal（Ad.lacZ）を発現するアデ
ノウイルスベクター、B型肝炎表面抗原及びIL-2（Ad.HBsAg/IL2）の両方を発現
するアデノウイルスベクターに感染したB16-F1細胞又は感染していないB16-F1細
胞により脾細胞をインキュベートした場合、グランザイムA分泌はほんのわずか
増加した。同様に、ターゲット細胞によりインキュベートされないこれらの脾細
胞における自発的なグランザイムA分泌は少ない。 IFNγアッセイとは無関係のグランザイムAアッセイを用いて得られるこれらの
結果は、再度、HIV抗原を特異的なターゲットとするCTLの強い活性がHIVウイル
ス抗原及びIL-2のような免疫賦活剤の両方を発現するアデノウイルスワクチンを
マウスに接種することによって誘発されることを示す。また、これらの結果は、
本発明によって提供される遺伝子ワクチンがHIVに対するヒトの効果的なワクチ
ンとして大いに有望であることの確信を支持する。
【０１２８】 c）ELISPOTアッセイ ELISPOTアッセイは、組換えアデノウイルスベクター、Ad.3C.env.gag及びAd.3
C.env.gag.revを接種したマウスにおけるCTL活性化を決定するために行った。C5
7BL/6マウスに107fpuのAd.3C.env.gag又はAd.3C.env.gag.revを接種した。マウ
スを2週間の間隔で屠殺し、脾細胞を用意した（Current Protocols in Immunolo
gy、Coligan et al. eds.を参照のこと）。11週で、マウスに107pfuのAd.3C.env
.gag又はAd.3C.env.gag.revの2回目の服用を接種した。96ウエル、マウスIFNγ
、ELISPOTプレート（R&D Systems、Minneapolis、MN）において30時間、Env、Ga
g、又はRevのいずれかを発現するワクチンウイルスに感染させた4×104のMC57G
細胞（ATCC ＃CRL-2295）により2×105の脾細胞をインキュベートした。非特異
的活性化は、抗原発現細胞の代わりに4μg/mlのPHA（Sigma、St. Louis、MO）の
添加した後モニターした。IFNγスポットをキットの指示に従って、可視化し、
カウントした。野生型及び組換えワクチンウイルスをNIH AIDS Research及びRef
erence Reagent Program（Bethesda、MD）から得た。 図１５Ａ−Ｃは、それぞれ接種後4週、接種後8週、及び1回目の接種後12週及
び2回目の接種後1週での上記のELISPOTアッセイの結果を示す。これらの図に示
すように、本発明の遺伝子ワクチンによるマウスの免疫化は、特異的なHIV抗原
に対するCTLの強い活性化を誘発した。
【０１２９】 ３．B型肝炎ウイルスに対する遺伝子ワクチン B型肝炎ウイルスに対する遺伝子ワクチンの実施態様及びその構築方法が以下
に詳細に記載される。 1）B型肝炎ウイルスに対する複製欠陥のあるアデノウイルスワクチンの構築 それぞれB型肝炎表面抗原（HBsAg）及びHBVコア抗原（HBcAg）のコード配列を
有するように2つのアデノウイルスベクター、Ad.HBsAg.IL2及びAd.HBcAg.IL2を
構築した。また、同じベクターにおいて、インターロイキン-2（IL-2）をコード
するDNA配列を含み、ウイルス抗原を発現するものと異なるプロモーターによっ
て発現した。この設計は、ウイルス抗原及び免疫賦活剤IL-2の両方の高レベルの
発現を保証することができ、アデノウイルスワクチンの免疫原性を高めることが
できると考えられる。次のセクションで提示される実験データで示されるように
、これらの2つのアデノウイルスベクターの両方は、B型肝炎抗原に対する動物の
強く持続的な免疫応答を誘発することができる。 これらの2つのアデノウイルスベクター、Ad.HBsAd.IL2及びAd.HBcAg.IL2は、
上記で詳細に記載されるエボラウイルスに対するアデノウイルスワクチンを構築
するためのものと同様の戦略を用いて構築した。
【０１３０】 a）Ad.HBsAg.IL2 簡単に、シャトルベクターpLAdを用いて、全長HBsAg（Xba I部位の欠失により
生じた沈黙突然変異を有する）をアデノウイルスゲノムの左末端（E1領域）に挿
入し（図４Ａ、左側）、シャトルベクターpLAd-CMV-HBsAgを得た。 シャトルベクターpRAdを用いて、IL-2（Xba I部位の欠失により生じた沈黙突
然変異を有する）をコードする配列をアデノウイルスゲノムのE4領域に挿入し（
図４Ａ、右側）、シャトルベクターpRAd-CMV-IL2を得た。 Xba I及びEcoRIのような適切な制限酵素を用いて、pLAd-CMV-HBsAg及びpRAd-C
MV-IL2の両方を直線化し、アデノウイルスのバックボーンと結合して（図４Ｂ）
、Ad.HBsAg.IL2と命名される組換えアデノウイルスベクターを得た。
【０１３１】 a）Ad.HbcAg.IL2 簡単に、シャトルベクターpLAdを用いて、全長HBsAg（Xba I部位の欠失により
生じた沈黙突然変異を有する）及び全長HBcAgをコードする配列をアデノウイル
スゲノムの左末端（E1領域）に挿入した（図４Ａ、左側）。HBsAg及びHBcAgは、
2つのスプライシング受容体部位、SA1及びSA2でレトロウイルススプライシング
ドナー（SD）及びアクセプター（SA）メカニズムを経て別のCMVプロモーターか
ら個別に発現される。生成されるシャトルベクターは、pLAd-CMV-SD/SA1-HBsAg-
SA2-HbcAgと命名される。 シャトルベクターpLAdを用いて、IL-2（Xba I部位の欠失により生じた沈黙突
然変異を有する）、INF-γ、及びGMCSF等の複数の免疫賦活剤をコードする配列
をアデノウイルスゲノムのE4領域に挿入した（図４Ａ、右側）。これらの3つの
免疫賦活剤は、3つのスプライシング受容体部位、SA1、SA2、及びSA3でレトロウ
イルススプライシングドナー（SD）及びアクセプター（SA）メカニズムを経て別
のCMVプロモーターから個別に発現される。生成されるシャトルベクターは、pLA
d-CMV-SD/SA1-IL2-SA2-INFγ-SA3-GMCSFと命名される。 Xba I及びEcoRIのような適切な制限酵素を用いて、pLAd-CMV-SD/SA1-HBsAg-SA2 -HbcAg及びpLAd-CMV-SD/SA1-IL2-SA2-INFγ-SA3-GMCSFの両方を直線化し、アデ
ノウイルスのバックボーンと結合して（図４Ｂ）、Ad.HBcAg.IL2と命名される組
換えアデノウイルスベクターを得た。
【０１３２】 2）HBV抗原に対するアデノウイルスワクチンに対する動物の免疫応答 実験マウスに上記で構築されたアデノウイルスワクチン、Ad.HBsAg.IL2及びAd
.HBcAg.IL2を接種し、それぞれ、これらの２つのベクターによって発現されるB
型肝炎表面抗原及びコア抗原に対する免疫応答を誘発した。これらのアデノウイ
ルスベクターの免疫原性を、それぞれHBsAg及びHbcAgに対する抗体価を測定する
ことによって決定した。
【０１３３】 a）HBV表面抗原（HBsAg）抗体価 CD-1マウス（Charles River Laboratories、Wilmington、MA）の筋肉内に、幾
つかの異なる濃度のAd.HBsAg.IL2：100、1×106、1×107、1×108、5×105、5×
106、及び5×107pfuのウイルスで注入した。図１０Ａは、1×105及び5×105pfu
を接種したマウスから収集した血清について測定した相対的な抗HBsAg抗体価を
示す。各測定において、血清を1:500に希釈した。図１０Ａは、1×107及び1×108 pfuを接種したマウスから収集した血清について測定した相対的な抗HbsAg抗体
価を示す。各測定において、血清を1:1500に希釈した。 Ad.HBsAg.IL2によって誘発された抗HbsAg抗体の相対的力価を測定するために
、各動物の血液（約150〜500μl）を2週間毎に免疫したマウスから収集し、血清
を用意した。血液を室温で2〜3時間インキュベートして凝固させた。次いで、血
液を一晩4℃で冷却して凝血塊を小さくした（shrink）。凝固していない液体を
きれいなチューブに移し、2000×gで5分間遠心分離した。上澄みを別のきれいな
チューブに移した。アジ化ナトリウム（NaN3）を保存のために0.05％加えた。少
量を4℃で短期間保存した。-80℃で長期間保存した。
【０１３４】 相対的な抗HBsAgの力価を酵母（Aldevron（LLC、Fargo、ND）由来）から精製
した組換えHBsAgに対するELISAにより決定した。図１０Ａに示すように、グルー
プ1のマウスは、接種後8週以内に、アデノウイルスベクター、Ad.HBsAg.IL2によ
って発現されるHBsAgに対するさらに強い免疫応答を有した。5×105pfuと同じく
らい低い力価を有するこのベクターは、HBsAgに対する高レベルの抗体を特異的
に誘発するのに十分であった。 図１０Ｂは、より高い力価をもつAd.HBsAg.IL2の免疫原性を示す。図１０Ｂに
示すように、Ad.HBsAg.IL2の免疫原性は、アデノウイルスベクターの力価が1×1
07pfu〜1×108pfuまで増加するにつれて、劇的に増加した。 これらの結果は、B型肝炎表面抗原及びIL-2の両方を発現するアデノウイルス
ベクターがこのベクターを接種したマウスのウイルス抗原を特異的にターゲット
とする強い免疫応答を誘発できることを示す。また、これらの結果は、本発明に
よって提供される遺伝子ワクチンがB型肝炎ウイルスに対するヒトの効果的なワ
クチンとして大いに有望であることの確信を支持する。
【０１３５】 b）HBVコア抗原（HBcAg）抗体価 C57BL/6マウス（Charles River Laboratories、Wilmington、MA）のグループ
の筋肉内に、異なる日に1×107pfuのAd.HBcAg.IL2を注入した。血液を4匹の動物
から接種後2週間毎に収集し、血清を用意した。接種後91日（グループ3、図１１
Ａ）又は84日（グループ4、図１１Ｂ）で、マウスに、さらに1×107pfuのウイル
スを再接種した。血液を3匹の動物から2回目の接種後毎日収集した。抗体価をE.
coli（Chemicon International, Inc.（Temecula, CA）から入手）から精製した
組換えHBcAgに対するELISAによって決定した。 図１１Ａに示すように、グループ3のマウスは、接種後約28日で達したHBcAgに
対する最も高い抗体価を有するアデノウイルスベクターAd.HBcAg.IL2によって発
現される肝炎コア抗原HBcAgに対して強い免疫応答を有した。Ad.HBcAg.IL2によ
る2回目の接種は、再度免疫応答を高め、2回目の接種の約3日以内に非常に高い
力価を達成した。 また、図１１Ｂに示すように、グループ4のマウスは、接種後約34日で達したH
BcAgに対する高い抗体価を有するアデノウイルスベクターAd.HBcAg.IL2によって
発現される肝炎コア抗原HBcAgに対して強い免疫応答を有した。Ad.HBcAg.IL2に
よる2回目の接種は、再度免疫応答を高め、2回目の接種の約3日以内に非常に高
い力価を達成した。 これらの結果は、B型肝炎コア抗原及びIL-2の両方を発現するアデノウイルス
ベクターもこのベクターを接種したマウスのウイルス抗原を特異的にターゲット
とする強い免疫応答を誘発できることを示す。同様に、これらの結果は、本発明
によって提供される遺伝子ワクチンがB型肝炎ウイルスに対するヒトの効果的な
ワクチンとして大いに有望であることの確信を支持する。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】本発明の遺伝子ワクチンの構築方法の例を示す。SD及びSA部位で
のスプライシングドナー-アクセプターメカニズムを経てCMVieプロモーターから
ビシストロン的に発現され得る抗原1及び抗原2のような複数の抗原遺伝子を有す
るシャトルベクターpLAd.抗原の例を示す。
【図１Ｂ】本発明の遺伝子ワクチンの構築方法の例を示す。内部リボソーム
の侵入部位IRES及びSD及びSA部位でのスプライシングドナー-アクセプターメカ
ニズムを経てCMVieプロモーターからビシストロン的に発現され得るIL-2、INF、
及びIL-8遺伝子のような複数のサイトカイン遺伝子を有するシャトルベクターpR
Ad.サイトカインの例を示す。
【図１Ｃ】本発明の遺伝子ワクチンの構築方法の例を示す。シャトルベクタ
ーpLAd.抗原由来であり、複数の抗原遺伝子を含むフラグメントとシャトルベク
ターpRAd.サイトカイン由来であり、複数のサイトカイン遺伝子を含むフラグメ
ントを有するアデノウイルスバックボーンで連結することによって遺伝子ワクチ
ンを構築する例を示す。
【図２】糖タンパク質の2つの形態（sGP及びGP）をコードし、編集されてい
ない及び編集されたmRNAを生じるRNA編集シグナルを含む野生型GP遺伝子を示す
。sGPは編集されていないmRNAから合成され、GPは編集されたmRNA（7つのウリジ
ンの1つの挿入を有する）から合成される。また、図２はsGPの合成を妨げるRNA
を形成する変性を示す。RNA編集部位はUUU UUU UからUUC UUC UUに変性される。
この変性は編集シグナルを取り除き、GPのみをコードするmRNAを生じる。
【図３Ａ】GP2に位置する免疫抑制ペプチド（IS）の変性を示す。図３Ａは
野生型GPを示す。 略語：FP、融合ペプチド；IS、免疫抑制ペプチド；TM、膜貫通領域。
【図３Ｂ】GP2に位置する免疫抑制ペプチド（IS）の変性を示す。図３ＢはI
Sペプチドの10個のアミノ酸が欠失したGPを示す。 略語：FP、融合ペプチド；IS、免疫抑制ペプチド；TM、膜貫通領域。
【図３Ｃ】GP2に位置する免疫抑制ペプチド（IS）の変性を示す。図３Ｃは
分割、逆転及び複製されたISペプチドを示す。 略語：FP、融合ペプチド；IS、免疫抑制ペプチド；TM、膜貫通領域。
【図４Ａ】エボラウイルス抗原のGP遺伝子を有するシャトルベクターpLAd/E
BO-GP、及びIL-2及びIL-4遺伝子を有するシャトルベクターpRAdIL2,4を示す。
【図４Ｂ】組換えアデノウイルスベクターをエボラウイルスに対する遺伝子
ワクチンとして生成するために使用される手順を示す。シャトルベクターpLAd/E
BO-GP由来であり、GP遺伝子を含むフラグメント及びシャトルベクターpRAdIL2,4
由来であり、IL-2及びIL-4遺伝子を含むフラグメントによりアデノウイルスバッ
クボーンを結合することによる組換えアデノウイルスベクターの構築を示す。
【図５】本発明の遺伝子ワクチンの例として複合アデノウイルスベクターを
示す。エボラウイルスGP遺伝子はE1領域のCMVieプロモーターによって発現され
る。GP遺伝子は2つのIRES配列によって発現されるINF-γ及びGM-CSFを伴う。こ
の配置は単一のmRNA由来の3つのタンパク質の発現を与える。IL-2及びIL-4の発
現はビシストロン的カセットとして第二CMVieプロモーターによって制御され、S
V40初期プロモーターによってE4領域のIL12の2つのサブユニットを発現する第二
ビシストロン的カセットを伴う。
【図６】マウスのグループにおけるHIV抗原に対する相対的抗体価を示す。
【図７】マウスの別のグループにおけるHIV抗原に対する相対的抗体価を示
す。
【図８Ａ】アデノウイルスベクターを接種したマウスから収集した、ターゲ
ット細胞刺激に応答した活性化脾細胞由来のINF-γ分泌を示す。
【図８Ｂ】アデノウイルスベクターを接種したマウスから収集した、ターゲ
ット細胞刺激に応答した活性化脾細胞由来のINF-γ分泌を示す。
【図８Ｃ】アデノウイルスベクターを接種したマウスから収集した、ターゲ
ット細胞刺激に応答した活性化脾細胞由来のINF-γ分泌を示す。
【図９】アデノウイルスベクターを接種したマウスから収集した、ターゲッ
ト細胞刺激に応答した活性化脾細胞由来のグランザイムA分泌を示す。
【図１０Ａ】マウスのグループにおけるHBV表面抗原に対する相対的抗体価
を示す。
【図１０Ｂ】マウスの別のグループにおけるHBV表面抗原に対する相対的抗
体価を示す。
【図１１Ａ】マウスのグループにおけるHBVコア抗原に対する相対的抗体価
を示す。
【図１１Ｂ】マウスの別のグループにおけるHBVコア抗原に対する相対的抗
体価を示す。
【図１２】マウスにおけるHIV抗原gp120に対する相対的抗体価を示す。
【図１３】マウスにおけるHIV抗原Gagに対する相対的抗体価を示す。
【図１４】マウスにおけるHIV抗原Revに対する相対的抗体価を示す。
【図１５Ａ】アデノウイルスベクターを接種したマウスから収集した（接種
後4週間）、ターゲット細胞刺激に応答した活性化脾細胞由来のINF-γ分泌を示
す。
【図１５Ｂ】アデノウイルスベクターを接種したマウスから収集した（接種
後8週間）、ターゲット細胞刺激に応答した活性化脾細胞由来のINF-γ分泌を示
す。
【図１５Ｃ】アデノウイルスベクターを接種したマウスから収集した（第一
接種後12週間及び第二接種後1週間）、ターゲット細胞刺激に応答した活性化脾
細胞由来のINF-γ分泌を示す。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/235 Ａ６１Ｋ 39/245 39/245 Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 31/12 31/12 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 BA35 EA02 FA02 GA11 HA17 4B065 AA95X AA95Y AA97Y AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA45 4C085 AA03 BA55 BA65 BA76 BA77 BA78 BA85 BA87 CC02 CC23 DD62 EE01 GG03 GG04 GG08 GG10

Claims (154)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 病原性ウイルス由来のウイルス抗原をコードする組換えウイ
    ルスと非相同的である抗原配列及び宿主における発現が該ウイルス抗原の免疫原
    性を高める免疫賦活剤をコードする組換えウイルスと非相同的である免疫賦活剤
    配列を含み、該ウイルス抗原の発現が該ウイルス抗原に向いている免疫応答を誘
    発し、宿主が組換えウイルスに感染したときに細胞が宿主において該ウイルス抗
    原を発現する組換えウイルスであって、 複製能力がなく、宿主において該病原性ウイルスに本来的に関連した悪性を生じ
    ない前記組換えウイルス。
  2. 【請求項２】 アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、SV40ウイルス、レト
    ロウイルス、単純ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択
    される複製能力のないウイルスである請求項１に記載の組換えウイルス。
  3. 【請求項３】 宿主に感染することができ、組換えウイルスの未変性前駆体
    由来の病理的領域を含まない請求項１に記載の組換えウイルス。
  4. 【請求項４】 複製能力のないアデノウイルスである請求項３に記載の組換
    えウイルス。
  5. 【請求項５】 アデノウイルスがアデノウイルスタイプ5である、請求項４
    に記載の組換えウイルス。
  6. 【請求項６】 非相同的抗原配列がアデノウイルスのE1、E3又はE4領域に位
    置する、請求項４に記載の組換えウイルス。
  7. 【請求項７】 免疫賦活剤配列がアデノウイルスのE4、E3又はE1領域に位置
    する、請求項４に記載の組換えウイルス。
  8. 【請求項８】 非相同的抗原配列及び免疫賦活剤配列がアデノウイルスのE1
    又はE3領域に位置し、 非相同的抗原配列及び免疫賦活剤配列が内部リボソーム侵入部位又はスプライシ
    ングドナー-アクセプターメカニズムを経てプロモーターからビシストロン的に
    発現される請求項４に記載の組換えウイルス。
  9. 【請求項９】 非相同的抗原配列及び免疫賦活剤配列がアデノウイルスのE4
    領域に位置し、 非相同的抗原配列及び免疫賦活剤配列が内部リボソーム侵入部位又はスプライシ
    ングドナー-アクセプターメカニズムによりプロモーターからビシストロン的に
    発現される請求項４に記載の組換えウイルス。
  10. 【請求項１０】 ウイルス抗原又は免疫賦活剤の発現が組換えウイルスの未
    変性前駆体と相同的であるプロモーターによって制御される、請求項１に記載の
    組換えウイルス。
  11. 【請求項１１】 ウイルス抗原の発現が組換えウイルスの未変性前駆体と非
    相同的であるプロモーターによって制御される、請求項１に記載の組換えウイル
    ス。
  12. 【請求項１２】 プロモーターが組換えウイルスの未変性前駆体と非相同的
    であり、CMVプロモーター、SV40プロモーター、レトロウイルスLTRプロモーター
    及びニワトリの細胞質β-アクチンプロモーターからなる群から選択されるプロ
    モーターである、請求項１１に記載の組換えウイルス。
  13. 【請求項１３】 病原性ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである、請求項１
    に記載の組換えウイルス。
  14. 【請求項１４】 ウイルス抗原がHIV糖タンパク質又はキャプシドタンパク
    質である、請求項１３に記載の組換えウイルス。
  15. 【請求項１５】 ウイルス抗原がHIV GP120、GP41、P24、Tat、Vif及びRev
    タンパク質からなる群から選択される、請求項１３に記載の組換えウイルス。
  16. 【請求項１６】 病原性ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項
    １に記載の組換えウイルス。
  17. 【請求項１７】 ウイルス抗原がインフルエンザウイルスの糖タンパク質で
    ある、請求項１６に記載の組換えウイルス。
  18. 【請求項１８】 ウイルス抗原がインフルエンザ糖タンパク質HA1、HA2又は
    NAである、請求項１７に記載の組換えウイルス。
  19. 【請求項１９】 病原性ウイルスがエボラウイルスである、請求項１に記載
    の組換えウイルス。
  20. 【請求項２０】 ウイルス抗原がエボラ糖タンパク質である、請求項１９に
    記載の組換えウイルス。
  21. 【請求項２１】 ウイルス抗原がエボラGP1又はGP2タンパク質である、請求
    項２０に記載の組換えウイルス。
  22. 【請求項２２】 病原性ウイルスが肝炎ウイルスである、請求項１に記載の
    組換えウイルス。
  23. 【請求項２３】 肝炎ウイルスがA型、B型、C型、D型又はE型肝炎ウイルス
    である、請求項２２に記載の組換えウイルス。
  24. 【請求項２４】 ウイルス抗原がB型肝炎ウイルスの表面抗原又はコアタン
    パク質である、請求項２２に記載の組換えウイルス。
  25. 【請求項２５】 ウイルス抗原がB型肝炎ウイルスのSHBsAg、MHBsAg又はLHB
    sAgである、請求項２４に記載の組換えウイルス。
  26. 【請求項２６】 ウイルス抗原がC型肝炎ウイルスの表面抗原又はコアタン
    パク質である、請求項２２に記載の組換えウイルス。
  27. 【請求項２７】 ウイルス抗原がC型肝炎ウイルスのNS3、NS4又はNS5抗原で
    ある、請求項２６に記載の組換えウイルス。
  28. 【請求項２８】 病原性ウイルスが呼吸器合胞体ウイルスである、請求項１
    に記載の組換えウイルス。
  29. 【請求項２９】 ウイルス抗原が呼吸器合胞体ウイルスの糖タンパク質又は
    融合タンパク質である、請求項２８に記載の組換えウイルス。
  30. 【請求項３０】 病原性ウイルスが単純ヘルペスウイルスである、請求項１
    に記載の組換えウイルス。
  31. 【請求項３１】 病原性ウイルスが単純ヘルペスウイルスタイプ-1又はタイ
    プ-2である、請求項３０に記載の組換えウイルス。
  32. 【請求項３２】 ウイルス抗原が単純ヘルペスウイルスタイプ-2由来の糖タ
    ンパク質Dである、請求項３０に記載の組換えウイルス。
  33. 【請求項３３】 病原性ウイルスがヒト乳頭腫ウイルスである、請求項１に
    記載の組換えウイルス。
  34. 【請求項３４】 ウイルス抗原がヒト乳頭腫ウイルスのE6又はE7である、請
    求項３３に記載の組換えウイルス。
  35. 【請求項３５】 免疫賦活剤がサイトカインである、請求項１に記載の組換
    えウイルス。
  36. 【請求項３６】 サイトカインがインターロイキン-2、インターロイキン-4
    、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-イン
    ターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、及び顆粒球マクロファージコロニー刺
    激因子からなる群から選択される、請求項３５に記載の組換えウイルス。
  37. 【請求項３７】 ウイルス抗原が、全長抗原性ウイルスタンパク質又は支配
    的抗原、中和抗原、又は病原性ウイルスのエピトープを含む抗原性ウイルスタン
    パク質の一部である、請求項１に記載の組換えウイルス。
  38. 【請求項３８】 ウイルス抗原が病原性ウイルスの少なくとも2つの菌株の
    糖タンパク質の間で保存されている領域を含む、請求項１に記載の組換えウイル
    ス。
  39. 【請求項３９】 ウイルス抗原が、その抗原性を保持するがウイルス成分と
    して機能しないような病原性ウイルスの糖タンパク質から突然変異された変性抗
    原である、請求項１に記載の組換えウイルス。
  40. 【請求項４０】 ウイルス抗原の変性が糖タンパク質のタンパク質分解切断
    部位における欠失、及び糖タンパク質の免疫抑制ペプチド領域の複製及び再配列
    を含む、請求項１に記載の組換えウイルス。
  41. 【請求項４１】 病原性ウイルス由来のウイルス抗原をコードする組換えウ
    イルスと非相同的である抗原配列を含み、該ウイルス抗原の発現が該ウイルス抗
    原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに感染したときに細胞
    が宿主において該ウイルス抗原を発現する組換えウイルスであって、 アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、SV40ウイルス、レトロウイルス、単純ヘ
    ルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択される良性の複製能
    力のないウイルスである前記組換えウイルス。
  42. 【請求項４２】 宿主に感染することができ、組換えウイルスの未変性前駆
    体由来の病理的領域を含まない請求項４１に記載の組換えウイルス。
  43. 【請求項４３】 さらに、宿主における発現がウイルス抗原の免疫原性を高
    める免疫賦活剤をコードする組換えウイルスと非相同的である免疫賦活剤配列を
    含む請求項４２に記載の組換えウイルス。
  44. 【請求項４４】 病原性ウイルス由来のウイルス抗原をコードし、組換えア
    デノウイルスの第一プロモーターによって発現される組換えアデノウイルスの未
    変性前駆体と非相同的である抗原配列及び宿主における発現が該ウイルス抗原の
    免疫原性を高める免疫賦活剤をコードし、該ウイルス抗原を発現する第一プロモ
    ーターの位置と異なる組換えアデノウイルスのゲノムの領域に位置する第二プロ
    モーターによって発現される組換えウイルスの未変性前駆体と非相同的である免
    疫賦活剤配列を含む組換えアデノウイルスであって、 該ウイルス抗原の発現が該ウイルス抗原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が
    組換えウイルスに感染したときに細胞が宿主において該ウイルス抗原を発現し、
    複製能力がなく、宿主における病原性ウイルスと本来的に関連した悪性を生じな
    い前記組換えアデノウイルス。
  45. 【請求項４５】 非相同的抗原配列が組換えアデノウイルスの未変性前駆体
    のE1、E3又はE4領域に位置する、請求項４４に記載の組換えアデノウイルス。
  46. 【請求項４６】 免疫賦活剤配列が、非相同的抗原配列によって占有されな
    い組換えアデノウイルスの未変性前駆体のE4、E3、又はE1領域に位置する、請求
    項４４に記載の組換えアデノウイルス。
  47. 【請求項４７】 非相同的抗原配列及び免疫賦活剤配列が、それぞれ組換え
    アデノウイルスの未変性前駆体のE1及びE3領域に位置する、請求項４４に記載の
    組換えアデノウイルス。
  48. 【請求項４８】 非相同的抗原配列又は免疫賦活剤配列が組換えアデノウイ
    ルスの未変性前駆体のE4領域に位置する、請求項４４に記載の組換えアデノウイ
    ルス。
  49. 【請求項４９】 第一プロモーター又は第二プロモーターが組換えウイルス
    の未変性前駆体と非相同的なプロモーターである、請求項４４に記載の組換えア
    デノウイルス。
  50. 【請求項５０】 非相同的プロモーターがCMVプロモーター、SV40プロモー
    ター、レトロウイルスLTRプロモーター、及びニワトリの細胞質β-アクチンプロ
    モーターからなる群から選択されるプロモーターである、請求項４９に記載の組
    換えアデノウイルス。
  51. 【請求項５１】 さらに、組換えアデノウイルスの未変性前駆体と非相同的
    であり、第一プロモーターによってビシストロン的に発現される第二抗原配列を
    含む請求項４４に記載の組換えアデノウイルス。
  52. 【請求項５２】 第二抗原配列が内部リボソームの侵入部位又はスプライシ
    ングドナー-アクセプターメカニズムを経て第一プロモーターからビシストロン
    的に発現される、請求項５１に記載の組換えアデノウイルス。
  53. 【請求項５３】 さらに、組換えアデノウイルスの未変性前駆体と非相同的
    であり、第二プロモーターによってビシストロン的に発現される第二免疫賦活剤
    配列を含む請求項４４に記載の組換えアデノウイルス。
  54. 【請求項５４】 第二抗原配列が内部リボソームの侵入部位又はスプライシ
    ングドナー-アクセプターメカニズムを経て第二プロモーターからビシストロン
    的に発現される、請求項５３に記載の組換えアデノウイルス。
  55. 【請求項５５】 組換えウイルスと非相同的である複数の抗原配列を含み、
    各抗原配列が病原性ウイルス由来のウイルス抗原をコードし、複数の抗原配列の
    発現が該ウイルス抗原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに
    感染したときに細胞が宿主において該ウイルス抗原を発現する組換えウイルスで
    あって、 複製能力がなく、宿主において該病原性ウイルスと本来的に関連した悪性を生じ
    ない前記組換えウイルス。
  56. 【請求項５６】 アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、SV40ウイルス、レ
    トロウイルス、単純ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選
    択される複製能力のないウイルスである請求項５５に記載の組換えウイルス。
  57. 【請求項５７】 宿主に感染でき、組換えウイルスの未変性前駆体由来の病
    原性領域を含まない請求項５５に記載の組換えウイルス。
  58. 【請求項５８】 複数の抗原配列が同じ病原性ウイルス由来の異なる抗原、
    該病原性ウイルスの異なる菌株由来の抗原、又は病原性ウイルス、細菌及び寄生
    虫からなる群から選択される異なる種類の病原体由来の抗原である、請求項５５
    に記載の組換えウイルス。
  59. 【請求項５９】 複数の抗原配列の少なくとも2つが内部リボソームの侵入
    部位又はスプライシングドナー-アクセプターメカニズムを経てプロモーターか
    らビシストロン的に発現される、請求項５５に記載の組換えウイルス。
  60. 【請求項６０】 複数の抗原配列の少なくとも2つがプロモーターから発現
    されて融合タンパク質を形成する、請求項５５に記載の組換えウイルス。
  61. 【請求項６１】 さらに、複数の抗原配列の少なくとも2つの発現を制御す
    る組換えウイルスの未変性前駆体と非相同的である少なくとも1つのプロモータ
    ーを含む請求項５５に記載の組換えウイルス。
  62. 【請求項６２】 非相同的プロモーターがCMV又はSV40プロモーターである
    、請求項６１に記載の組換えウイルス。
  63. 【請求項６３】 複数の抗原配列が病原性ウイルスの少なくとも2つの菌株
    由来の抗原の組み合わせである、請求項５５に記載の組換えウイルス。
  64. 【請求項６４】 複数の抗原配列が少なくとも2つの異なる病原性ウイルス
    由来の抗原の組み合わせである、請求項５５に記載の組換えウイルス。
  65. 【請求項６５】 複数の抗原配列がHIVタイプ1、HIVタイプ2、単純ヘルペス
    ウイルスタイプ1、単純ヘルペスウイルスタイプ2、エボラウイルス、マールブル
    ク病ウイルス、エボラウイルス、及びA型、B型、C型、D型、及びE型肝炎ウイル
    スからなる群から選択される少なくとも2つの異なる病原性ウイルス由来の抗原
    の組み合わせである、請求項５５に記載の組換えウイルス。
  66. 【請求項６６】 さらに、宿主における発現がウイルス抗原の免疫原性を高
    める免疫賦活剤をコードする組換えウイルスと非相同的である1つ以上の免疫賦
    活剤配列を含む請求項５５に記載の組換えウイルス。
  67. 【請求項６７】 免疫賦活剤がサイトカインである、請求項５５に記載の組
    換えウイルス。
  68. 【請求項６８】 サイトカインがインターロイキン-2、インターロイキン-8
    、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-イン
    ターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因
    子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６７に記載の組
    換えウイルス。
  69. 【請求項６９】 免疫賦活剤の少なくとも2つが内部リボソームの侵入部位
    又はスプライシングドナー-アクセプターメカニズムを経てプロモーターからビ
    シストロン的に発現される、請求項６７に記載の組換えウイルス。
  70. 【請求項７０】 免疫賦活剤の少なくとも2つがプロモーターから発現され
    て融合タンパク質を形成する、請求項６６に記載の組換えウイルス。
  71. 【請求項７１】 組換えウイルスと非相同的である複数の抗原配列を含み、
    各抗原配列が病原性細菌由来の細菌性抗原をコードし、複数の細菌性抗原配列の
    発現が該細菌性抗原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに感
    染したときに細胞が宿主において該細菌性抗原を発現する組換えウイルスであっ
    て、 複製能力がなく、宿主において該病原性細菌と本来的に関連した悪性を生じない
    前記組換えウイルス。
  72. 【請求項７２】 病原性細菌がバチルス・チューバキュロウセス、炭疽菌、
    又は動物においてライム病を引き起こすスピロヘータ・ボレリア・ブルグドルフ
    ェリーである、請求項７１に記載の組換えウイルス。
  73. 【請求項７３】 複数の抗原配列が致死因子、防御抗原、病原性細菌の浮腫
    因子及びそれらの組み合わせからなる群の1つ以上をコードする、請求項７１に
    記載の組換えウイルス。
  74. 【請求項７４】 さらに、宿主における発現がウイルス抗原の免疫原性を高
    める免疫賦活剤をコードする組換えウイルスと非相同的である1つ以上の免疫賦
    活剤配列を含む請求項７１に記載の組換えウイルス。
  75. 【請求項７５】 免疫賦活剤がサイトカインである、請求項７４に記載の組
    換えウイルス。
  76. 【請求項７６】 サイトカインがインターロイキン-2、インターロイキン-8
    、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-イン
    ターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因
    子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７５に記載の組
    換えウイルス。
  77. 【請求項７７】 組換えウイルスと非相同的である複数の抗原配列を含み、
    各抗原配列が病原性寄生虫由来の寄生虫抗原をコードし、複数の寄生虫抗原配列
    の発現が該寄生虫抗原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに
    感染したときに細胞が宿主において該寄生虫抗原を発現する組換えウイルスであ
    って、 複製能力がなく、宿主において該病原性寄生虫と本来的に関連した悪性を生じな
    い前記組換えウイルス。
  78. 【請求項７８】 病原性寄生虫がマラリア、クリプトスポリジウム属、アイ
    メリア属、ヒストモナス属、ロイコチトゾーン属、プラスモジウム属、トキソプ
    ラズマ属、トリコモナス属、リーシュマニア属、トリパノソーマ属、ジアルディ
    ア属、バベシア属、及びタイレリア属からなる群から選択される、請求項７７に
    記載の組換えウイルス。
  79. 【請求項７９】 複数の抗原配列が病原性寄生虫のコートタンパク質、病原
    性寄生虫の付着タンパク質、及びそれらの組み合わせからなる群の1つ以上をコ
    ードする、請求項７７に記載の組換えウイルス。
  80. 【請求項８０】 さらに、宿主における発現がウイルス抗原の免疫原性を高
    める免疫賦活剤をコードする組換えウイルスと非相同的である1つ以上の免疫賦
    活剤配列を含む請求項７７に記載の組換えウイルス。
  81. 【請求項８１】 免疫賦活剤がサイトカインである、請求項８０に記載の組
    換えウイルス。
  82. 【請求項８２】 サイトカインがインターロイキン-2、インターロイキン-8
    、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-イン
    ターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因
    子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８１に記載の組
    換えウイルス。
  83. 【請求項８３】 宿主に組換えウイルスを投与することを含む病原体に対す
    る宿主の免疫を高める方法であって、 前記組換えウイルスは該病原体由来の抗原をコードする組換えウイルスと非相同
    的である抗原配列及び宿主における発現が該抗原の免疫原性を高める免疫賦活剤
    をコードする組換えウイルスと非相同的である免疫賦活剤配列を含み、 該抗原の発現が該抗原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに
    感染したときに細胞が宿主において該抗原を発現し、 さらに、前記組換えウイルスは複製能力がなく、宿主において該病原体と本来的
    に関連した悪性を生じない、前記方法。
  84. 【請求項８４】 組換えウイルスの宿主への投与が筋肉内、気管内、皮下、
    鼻腔内、皮内、直腸的、経口的又は親への投与により行われる、請求項８３に記
    載の方法。
  85. 【請求項８５】 宿主に組換えウイルスを投与することを含む1つ以上の病
    原体に対する宿主の免疫を高める方法であって、 前記組換えウイルスは組換えウイルスと非相同的である複数の抗原配列を含み、
    各抗原配列が病原体由来の抗原をコードし、複数の抗原配列の発現が該抗原に向
    いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに感染したときに細胞が宿主
    において該抗原を発現し、 さらに、前記組換えウイルスは複製能力がなく、宿主において該病原体と本来的
    に関連した悪性を生じない、前記方法。
  86. 【請求項８６】 さらに、組換えウイルスが、宿主における発現がウイルス
    抗原の免疫原性を高める免疫賦活剤をコードする組換えウイルスと非相同的であ
    る1つ以上の免疫賦活剤配列を含む、請求項８５に記載の方法。
  87. 【請求項８７】 病原体が病原性ウイルス、細菌又は寄生虫である、請求項
    ８５に記載の方法。
  88. 【請求項８８】 宿主に第一及び第二組換えウイルスを投与することを含む
    1つ以上の病原体に対する宿主の免疫を高める方法であって、 第一組換えウイルスは病原体由来の抗原をコードする第一組換えウイルスと非相
    同的である抗原配列を含み、該抗原の発現が該抗原に向いている免疫応答を誘発
    し、宿主が第一組換えウイルスに感染したときに細胞が宿主において該抗原を発
    現するものであり、 第二組換えウイルスは宿主における発現が該抗原の免疫原性を高める免疫賦活剤
    をコードする第二組換えウイルスと非相同的である免疫賦活剤配列を含むもので
    あり、 第一及び第二組換えウイルスは複製能力がなく、宿主において該病原体と関連し
    た悪性を生じない、前記方法。
  89. 【請求項８９】 第一及び第二組換えウイルスのそれぞれが複製能力のない
    アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、SV40ウイルス、レトロウイルス、単純ヘ
    ルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択される、請求項８８
    に記載の方法。
  90. 【請求項９０】 第一及び第二組換えウイルスの両方が複製能力のないアデ
    ノウイルスである、請求項８９に記載の方法。
  91. 【請求項９１】 第一及び第二組換えウイルスの一方が複製能力のないアデ
    ノウイルスであり、他方が複製能力のないワクシニアウイルスである、請求項９
    ０に記載の方法。
  92. 【請求項９２】 病原体が病原性ウイルス、細菌又は寄生虫である、請求項
    ９０に記載の方法。
  93. 【請求項９３】 病原体に対する宿主の免疫を高める方法であって、 該病原体由来の1つ以上の抗原をコードする組換えウイルスと非相同的である1つ
    以上の抗原配列を含む組換えウイルスと、 組換えウイルスに感染した細胞によって発現される抗原の免疫原性を高める1つ
    以上の免疫賦活剤とを宿主に投与することを含み、 該抗原の発現が該抗原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに
    感染したときに細胞が宿主において該抗原を発現し、前記組換えウイルスは複製
    能力がなく、宿主において該病原体と本来的に関連した悪性を生じない、前記方
    法。
  94. 【請求項９４】 免疫賦活剤がサイトカインである、請求項９３に記載の方
    法。
  95. 【請求項９５】 サイトカインがインターロイキン-2、インターロイキン-8
    、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-イン
    ターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因
    子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９４に記載の方
    法。
  96. 【請求項９６】 病原体が病原性ウイルス、細菌又は寄生虫である、請求項
    ９３に記載の方法。
  97. 【請求項９７】 HIV抗原をコードする組換えウイルスと非相同的である抗
    原配列及び宿主における発現が該HIV抗原の免疫原性を高める免疫賦活剤をコー
    ドする組換えウイルスと非相同的である免疫賦活剤配列を含む組換えウイルスで
    あって、 該HIV抗原の発現が該HIV抗原に向いている免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイ
    ルスに感染したときに細胞が該HIV抗原を発現する、前記組換えウイルス。
  98. 【請求項９８】 複製能力のない請求項９７に記載の組換えウイルス。
  99. 【請求項９９】 アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、SV40ウイルス、レ
    トロウイルス、単純ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選
    択される請求項９８に記載の組換えウイルス。
  100. 【請求項１００】 宿主に感染でき、組換えウイルスの未変性前駆体由来の
    病理的領域を含まない請求項９８に記載の組換えウイルス。
  101. 【請求項１０１】 複製能力のないアデノウイルスである請求項９８に記載
    の組換えウイルス。
  102. 【請求項１０２】 アデノウイルスがアデノウイルスタイプ5である、請求
    項１０１に記載の組換えウイルス。
  103. 【請求項１０３】 非相同的抗原配列がアデノウイルスのE1、E3又はE4領域
    に位置する、請求項１０１に記載の組換えウイルス。
  104. 【請求項１０４】 免疫賦活剤配列がアデノウイルスのE4、E3、又はE1領域
    に位置する、請求項１０１に記載の組換えウイルス。
  105. 【請求項１０５】 非相同的抗原配列及び免疫賦活剤配列がアデノウイルス
    のE1、又はE3領域に位置し、 非相同的抗原配列及び免疫賦活剤配列が内部リボソームの侵入部位又はスプライ
    シングドナー-アクセプターメカニズムを経てプロモーターからビシストロン的
    に発現される、請求項１０１に記載の組換えウイルス。
  106. 【請求項１０６】 非相同的抗原配列及び免疫賦活剤配列がアデノウイルス
    のE4領域に位置し、 非相同的抗原配列及び免疫賦活剤配列が内部リボソームの侵入部位又はスプライ
    シングドナー-アクセプターメカニズムを経てプロモーターからビシストロン的
    に発現される、請求項１０１に記載の組換えウイルス。
  107. 【請求項１０７】 ウイルス抗原又は免疫賦活剤の発現が組換えウイルスの
    未変性前駆体と相同的であるプロモーターによって制御される、請求項９７に記
    載の組換えウイルス。
  108. 【請求項１０８】 ウイルス抗原の発現が組換えウイルスの未変性前駆体と
    非相同的であるプロモーターによって制御される、請求項９７に記載の組換えウ
    イルス。
  109. 【請求項１０９】 プロモーターが組換えウイルスの未変性前駆体と非相同
    的であり、CMVプロモーター、SV40プロモーター、レトロウイルスLTRプロモータ
    ー、及びニワトリの細胞質β-アクチンプロモーターからなる群から選択される
    、請求項１０９に記載の組換えウイルス。
  110. 【請求項１１０】 HIV抗原がHIV表面、キャプシド、調節、酵素又はアクセ
    サリータンパク質である、請求項９７に記載の組換えウイルス。
  111. 【請求項１１１】 HIV抗原がHIV表面タンパク質である、請求項９７に記載
    の組換えウイルス。
  112. 【請求項１１２】 HIV表面タンパク質がHIVのenv遺伝子によってコードさ
    れる、請求項１１１に記載の組換えウイルス。
  113. 【請求項１１３】 HIV表面タンパク質がHIV gp120又はgp41である、請求項
    １１１に記載の組換えウイルス。
  114. 【請求項１１４】 HIV抗原がV1又はV2領域のないHIV gp120である、請求項
    ９７に記載の組換えウイルス。
  115. 【請求項１１５】 HIV抗原がV1及びV2領域のないHIV gp120である、請求項
    ９７に記載の組換えウイルス。
  116. 【請求項１１６】 HIV抗原がHIVのV3領域を含むポリペプチドである、請求
    項９７に記載の組換えウイルス。
  117. 【請求項１１７】 HIV抗原がHIVのV2及びV3領域を含むポリペプチドである
    、請求項９７に記載の組換えウイルス。
  118. 【請求項１１８】 HIV抗原がHIVのV2、V3、及びC4領域を含むポリペプチド
    である、請求項９７に記載の組換えウイルス。
  119. 【請求項１１９】 HIV抗原がgp120とgp41との間のタンパク質分解プロセシ
    ング部位に変異を含む変性HIV gp160である、請求項９７に記載の組換えウイル
    ス。
  120. 【請求項１２０】 HIV抗原が細胞質領域の欠失を有する変性HIV gp160であ
    る、請求項９７に記載の組換えウイルス。
  121. 【請求項１２１】 HIV抗原が1つ以上のグリコシル化部位に変異を含む変性
    HIV gp120である、請求項９７に記載の組換えウイルス。
  122. 【請求項１２２】 HIV抗原がHIV Gagタンパク質である、請求項９７に記載
    の組換えウイルス。
  123. 【請求項１２３】 HIV抗原がHIVのp17、p24、p2、p7及びp6からなる群から
    選択されるHIVキャプシドタンパク質である、請求項９７に記載の組換えウイル
    ス。
  124. 【請求項１２４】 HIV抗原が異なるHIVタンパク質の組み合わせである、請
    求項９７に記載の組換えウイルス。
  125. 【請求項１２５】 異なるHIVタンパク質の組み合わせが同じプロモーター
    から発現されるが、IRESメカニズム又はレトロウイルススプライシングドナー／
    アクセプターメカニズムを経て別々のタンパク質として発現される、請求項１２
    ４に記載の組換えウイルス。
  126. 【請求項１２６】 HIV抗原が異なる菌株由来のHIVの可変及び保存領域、HI
    Vの単離物又はクレードを含むHIVモザイク抗原である、請求項９７に記載の組換
    えウイルス。
  127. 【請求項１２７】 HIVモザイク抗原がグループM HIVの少なくとも2つのク
    レード由来の1つ以上の領域を含む、請求項１２６に記載の組換えウイルス。
  128. 【請求項１２８】 HIVモザイク抗原がグループO HIVの少なくとも2つのク
    レード由来の1つ以上の領域を含む、請求項１２６に記載の組換えウイルス。
  129. 【請求項１２９】 HIVモザイク抗原がグループM HIVの少なくとも1つのク
    レード由来の1つ以上の領域及びグループO HIVの少なくとも1つのクレード由来
    の1つ以上の領域を含む、請求項１２６に記載の組換えウイルス。
  130. 【請求項１３０】 HIV抗原がHIVの少なくとも2つの菌株の糖タンパク質間
    で保存された領域を含む、請求項９７に記載の組換えウイルス。
  131. 【請求項１３１】 免疫賦活剤がサイトカインである、請求項９７に記載の
    組換えウイルス。
  132. 【請求項１３２】 サイトカインがインターロイキン-2、インターロイキン
    -4、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-イ
    ンターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、及び顆粒球マクロファージコロニー
    刺激因子からなる群から選択される、請求項１３１に記載の方法。
  133. 【請求項１３３】 免疫賦活剤が異なるサイトカインの組み合わせである、
    請求項９７に記載の組換えウイルス。
  134. 【請求項１３４】 サイトカインの組み合わせが同じプロモーターから発現
    されるが、IRESメカニズム又はレトロウイルススプライシングドナー／アクセプ
    ターメカニズムを経て別々のタンパク質として発現される、請求項１３１に記載
    の方法。
  135. 【請求項１３５】 組換えウイルスと非相同的である複数の抗原配列を含み
    、各抗原配列がHIV抗原をコードし、複数の抗原配列の発現が該HIV抗原に向いて
    いる免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに感染したときに細胞が宿主にお
    いて該HIV抗原を発現する複製能力のない組換えウイルス。
  136. 【請求項１３６】 アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、SV40ウイルス、
    レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から
    選択される複製能力のないウイルスである請求項１３５に記載の組換えウイルス
    。
  137. 【請求項１３７】 宿主を感染でき、組換えウイルスの未変性前駆体由来の
    病理的領域を含まない請求項１３５に記載の組換えウイルス。
  138. 【請求項１３８】 複数の抗原配列がHIVの異なるクレード由来の異なる抗
    原配列である、請求項１３５に記載の組換えウイルス。
  139. 【請求項１３９】 複数の抗原配列がグループM HIVの少なくとも2つのクレ
    ード由来である、請求項１３８に記載の組換えウイルス。
  140. 【請求項１４０】 複数の抗原配列がグループO HIVの少なくとも2つのクレ
    ード由来である、請求項１３８に記載の組換えウイルス。
  141. 【請求項１４１】 複数の抗原配列がグループM HIVの少なくとも1つのクレ
    ード及びグループO HIVの少なくとも1つのクレード由来である、請求項１３８に
    記載の組換えウイルス。
  142. 【請求項１４２】 複数の抗原配列の少なくとも2つが内部リボソームの侵
    入部位又はスプライシングドナー-アクセプターメカニズムを経てプロモーター
    からビシストロン的に発現される、請求項１３５に記載の組換えウイルス。
  143. 【請求項１４３】 複数の抗原配列の少なくとも2つがプロモーターから発
    現されて融合タンパク質を形成する、請求項１３５に記載の組換えウイルス。
  144. 【請求項１４４】 さらに、複数の抗原配列の少なくとも2つの発現を制御
    する組換えウイルスの未変性前駆体と非相同的である少なくとも1つのプロモー
    ターを含む、請求項１３５に記載の組換えウイルス。
  145. 【請求項１４５】 非相同的プロモーターがCMV又はSV40プロモーターであ
    る、請求項１４４に記載の組換えウイルス。
  146. 【請求項１４６】 さらに、宿主における発現がHIV抗原の免疫原性を高め
    る免疫賦活剤をコードする組換えウイルスと非相同的である1つ以上の免疫賦活
    剤配列を含む、請求項１３５に記載の組換えウイルス。
  147. 【請求項１４７】 免疫賦活剤がサイトカインである、請求項１４６に記載
    の組換えウイルス。
  148. 【請求項１４８】 サイトカインがインターロイキン-2、インターロイキン
    -8、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-イ
    ンターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激
    因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４７に記載
    の組換えウイルス。
  149. 【請求項１４９】 免疫賦活剤配列の少なくとも2が内部リボソームの侵入
    部位又はスプライシングドナー-アクセプターメカニズムを経てプロモーターか
    らビシストロン的に発現される、請求項１４６に記載の組換えウイルス。
  150. 【請求項１５０】 免疫賦活剤配列の少なくとも2つがプロモーターから発
    現されて融合タンパク質を形成する、請求項１４６に記載の組換えウイルス。
  151. 【請求項１５１】 HIV感染に対する宿主の免疫を高める方法であって、 HIV抗原をコードする組換えウイルスと非相同的である抗原配列及び宿主におけ
    る発現が該HIV抗原の免疫原性を高める免疫賦活剤をコードする組換えウイルス
    と非相同的である免疫賦活剤配列を含み、該HIV抗原の発現が該HIV抗原に向いて
    いる免疫応答を誘発し、宿主が組換えウイルスに感染したときに細胞が宿主にお
    いて該HIV抗原を発現する組換えウイルスを宿主に投与することを含む前記方法
    。
  152. 【請求項１５２】 宿主への組換えウイルスの投与が筋肉内、気管内、皮下
    、鼻腔内、皮内、直腸的、経口的又は親への投与により行われる、請求項１５１
    に記載の方法。
  153. 【請求項１５３】 1つ以上の病原体に対する宿主の免疫を高める方法であ
    って、 組換えウイルスと非相同的である複数の抗原配列を含み、各抗原配列がHIV抗原
    をコードし、複数の抗原配列の発現が該HIV抗原に向いている免疫応答を誘発し
    、宿主が組換えウイルスに感染したときに細胞が宿主において該HIV抗原を発現
    する複製能力のない組換えウイルスを宿主に投与することを含む前記方法。
  154. 【請求項１５４】 さらに、組換えウイルスが、宿主における発現がHIV抗
    原の免疫原性を高める免疫賦活剤をコードする組換えウイルスと非相同的である
    1つ以上の免疫賦活剤配列を含む、請求項１５３に記載の方法。
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