CN116590371A - 一种降低中华仓鼠卵巢细胞中抗体高甘露糖型的细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种降低中华仓鼠卵巢细胞中抗体高甘露糖型的细胞培养方法，属于生物制药领域。本发明提供的调节抗体高甘露糖型的方法，选用浓缩补料培养工艺，结合培养过程中在降温后调节pH的控制策略，并添加糖型调节剂N‑乙酰葡萄糖胺、Mn2+、尿嘧啶、半乳糖，显著降低高甘露糖型占比。本发明的方法适用于抗体蛋白发酵工艺，具有较强的稳健性，蛋白产量相比于传统的流加培养具有明显提升，且蛋白质量较优。本发明的方法未引入难去除的添加剂，减少了后期的杂质去除工作和杂质检测工作，适合工业化应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种降低中华仓鼠卵巢细胞中抗体高甘露糖型的细胞培养方法，属于生物制药领域。
背景技术
生物制药行业中抗体类药物被广泛研究，并在疾病治疗方面有着出色的表现。抗体结构、活性和功能与抗体的糖基化修饰息息相关。抗体糖基化修饰能够维持抗体的空间构象、稳定抗体的结构，同时一些特定糖型还与抗体的半衰期、免疫原性、抗炎作用、抗体功能密切相关。
高甘露糖型的IgG类抗体蛋白上末端的甘露糖可与甘露糖受体结合，并通过内吞作用导致糖蛋白出现降解，导致抗体的半衰期降低，影响到抗体的药代动力学。含高甘露糖型的IgG类抗体相比于不带有高甘露糖型的IgG类抗体具有显著的免疫原性，形成抗药抗体或中和抗体等。这可能引起严重的免疫反应或药效降低。因此在IgG类抗体药物研发中，高甘露糖型通常被视为产品的关键质量属性（CQA）之一，并需要严格控制高甘露糖型的含量。
在IgG类抗体工艺开发过程中，高甘露糖型含量可能受到工艺参数和培养基组分的影响。为了保障抗体高甘露糖型的含量符合需求且稳定，必须对抗体的高甘露糖型含量进行监控并加以调节和控制。细胞培养工艺优化来调控糖基化的方式通常为添加糖型调节剂、更换培养基、优化工艺参数等方式。
当前常用糖型调节剂主要包括Mn2+、尿嘧啶、半乳糖等等。其中Mn2+在一些研究案例中被发现可用于降低高甘露糖型修饰，但也有研究表明Mn2+的含量较高会产生相应的细胞毒性，进而影响细胞的生长和抗体的质量及糖型。因此Mn2+对甘露糖基化修饰的影响并未明确。
常见的细胞培养工艺参数包括温度、pH、溶氧、渗透压等。细胞培养工艺参数中较低的pH有利于高尔基体进行翻译后修饰，降低高甘露糖型的比例。而且细胞代谢副产物NH4 +浓度提高，可能不利于高尔基体对抗体的翻译后修饰，导致高甘露糖水平的提高。但从细胞培养工艺参数方面并未发现降低NH4 +浓度的有效手段。研究发现用NaCl调节渗透压时，渗透压的增高会导致单抗的高甘露糖糖基化修饰逐渐增高。研究发现较低的培养温度可能提高细胞活力、减少凋亡和促进蛋白表达，但可能导致胞内的UDP-GlcNAc和UDP-GalNc较低，可能导致高甘露糖型的生成。细胞培养工艺参数中的溶氧则暂未发现对高甘露糖型的影响。
基础和补料培养基的替换也是一种有效调控抗体高甘露糖型的手段。但细胞培养工艺参数的改变和培养基的改变可能会同时引起蛋白产量或其他CQA的改变，因此工艺参数的优化通常需要综合多个方面的因素，且工艺参数的优化空间是有限度的。
综上所述，目前在生物制药行业对于抗体高甘露糖型调控已有一定的研究，并初步明确多种糖型调节剂和工艺参数对高甘露糖型的影响。但单一糖型调节剂的作用效果在分批补料的培养模式中并不显著，且不可预期性很强。糖型调节剂的浓度差异和组合使用可能影响细胞生长、蛋白产量和抗体质量。在分批补料的培养模式中工艺参数的改变（较低的降温温度，较低的pH）将显著影响细胞生长、蛋白产量和蛋白质量。因此如何实现更有效且精确的降低IgG类抗体的高甘露糖型含量仍是目前生物制药行业的一个难题。
发明内容
本发明提供了一种降低抗体甘露糖型水平和/或提高蛋白表达量的方法，采用浓缩补料灌流培养工艺培养细胞，并在基础培养基和用于灌流的培养基中加入糖型调节剂；所述糖型调节剂包括N-乙酰葡萄糖胺、Mn2+、尿嘧啶或半乳糖。
在一种实施方式中，所述糖型调节剂为N-乙酰葡萄糖胺、Mn2+、尿嘧啶和半乳糖的组合。
在一种实施方式中，所述N-乙酰葡萄糖胺的浓度为5~15 mM，所述Mn2+的浓度为1~4μM，所述尿嘧啶的浓度为1~4 mM，所述半乳糖的浓度为5~20 mM。
在一种实施方式中，所述浓缩补料培养工艺具体是：控制初始接种密度(1.0 ±0.2) ×106cells/ml，控制初始pH为6.90 ± 0.30，第1~3天培养温度36.5℃ ± 0.5℃，第四天降温至31.0℃ ± 0.5℃,并控制pH为6.80 ± 0.05。
在一种实施方式中，第1~3天灌流速率为0.405VVD，第4~6天灌流速率为0.805VVD，第8~14天灌流速率为1.005 VVD；灌流速率的操作范围为设定值± 5%。
在一种实施方式中，所述灌流通过连续灌流装置进行；所述连续灌流装置采用交替切向流细胞截留系统。
在一种实施方式中，所述截留系统中，中空纤维柱截留孔径为50KD。
在一种实施方式中，所述基础培养基是含有4 mM谷氨酰胺的EdenB600S培养基。
在一种实施方式中，所述灌流培养基包括PM01培养基和PM02培养基；所述PM01培养基含有按体积百分比计90%含4 mM谷氨酰胺的EdenB600S培养基和10% EdenB600aS培养基；所述PM02培养基为EdenB600bS培养基。
在一种实施方式中，所述细胞包括但不限于CHO、CHO K1或CHO-S细胞系。
本发明还提供了所述方法在调控抗体糖基化水平中的应用。
本发明还提供了一种生产抗体蛋白的方法，所述方法以含糖型调节剂的培养基进行细胞培养，采用浓缩补料培养工艺；所述糖型调节剂包括N-乙酰葡萄糖胺、Mn2+、尿嘧啶或半乳糖；所述浓缩补料培养工艺具体是：控制初始接种密度(1.0 ± 0.2) × 106cells/ml，控制初始pH为6.90 ± 0.30，第1~3天培养温度36.5℃ ± 0.5℃，第四天降温至31.0℃± 0.5℃,并控制pH为6.80 ± 0.05。
在一种实施方式中，用于补料的培养基含有糖型调节剂。
在一种实施方式中，所述抗体为IgG类的抗体，包括但不限于单抗、双抗等多种类型抗体。
本发明还要求保护所述方法在制备低甘露糖型抗体中的应用。
在一种实施方式中，所述低甘露糖型抗体是指甘露糖型含量＜5%的抗体。
有益效果：
本发明提供的调节抗体高甘露糖型的方法，选用浓缩补料培养 (CFB,Concentrated Fed-Batch) 的方式，结合在降温后更改培养过程中的pH控制策略，并添加糖型调节剂N-乙酰葡萄糖胺、Mn2+、尿嘧啶、半乳糖，显著降低高甘露糖型占比，尤其是降低Man5含量。
本技术适用于IgG类抗体蛋白发酵工艺，包含单抗、双抗等多种类型抗体，并具有较强的稳健性，包括生长代谢稳定，代谢副产物如NH4 +和乳酸被不断去除，蛋白产量相比于传统的流加培养具有明显提升，且蛋白质量较优。结合糖型调节剂的作用能够显著降低高甘露糖型占比，本发明未引入难去除的添加剂，减少后期的杂质去除工作和杂质检测工作。
附图说明
图1是抗体常见的N-糖型化类型的示意图。
具体实施方式
本发明采用的试剂、设备都是普通的市售和公众可得的。
下述工艺均采用的为Applikon 的ez-Control的3 L反应器进行培养。本发明采用的试剂、设备都是普通的市售和公众可得的。
蛋白表达量检测：蛋白表达量的检测采用CedexBio HT自动化多功能生物化学分析仪，根据设备的使用说明来检测培养14天的细胞上清液中的蛋白质浓度。
实施例1
基础培养基：EdenB600S + 4 mM Gln；
灌流培养基（按质量百分比计）：
PM01：由90%含4 mM谷氨酰胺的EdenB600S和10% EdenB600aS组成；
PM02：EdenB600bS；
采用浓缩补料培养工艺生产单克隆抗体蛋白，初始接种密度(1.0 ± 0.2)×106cells/ml，初始培养重量2.0 kg；控制初始pH为6.90 ± 0.30，第1 ~ 3天培养温度36.5℃ ± 0.5℃，第四天降温至31.0℃ ± 0.5℃,并控制pH策略 6.80 ± 0.05，灌流策略如表1所示。培养14天离心收获细胞进行抗体蛋白纯化。并进行抗体蛋白的糖型检测。结果如表3所示。
表1 ATF控制器及中空纤维柱参数设置
表2 培养基灌流速度设置
注：总灌流速率(VVD) = PM01 (VVD) + PM02 (VVD)；灌流速率的操作范围为 ±5%。
实施例2
具体实施方式同实施例1，区别在于，基础培养基还含有5 mM N-乙酰葡萄糖胺，且灌流培养基PM01含有5 mM N-乙酰葡萄糖胺。
实施例3
具体实施方式同实施例1，区别在于，基础培养基和灌流培养基PM01中均含有糖型调节剂5 mM N-乙酰葡萄糖胺、1 uM Mn2+、1 mM 尿嘧啶、5 mM半乳糖。
实施例4
具体实施方式同实施例1，区别在于，基础培养基和灌流培养基PM01中均含有糖型调节剂10 mM N-乙酰葡萄糖胺、2 uM Mn2+、2 mM 尿嘧啶、10 mM半乳糖。
实施例5
具体实施方式同实施例1，区别在于，基础培养基和灌流培养基PM01中均含有糖型调节剂15 mM N-乙酰葡萄糖胺、4 uM Mn2+、4 mM 尿嘧啶、20 mM半乳糖。
对比例1
采用流加培养工艺，且未添加糖型调节剂。
流加培养工艺：基础培养基为含（按终浓度计）4 mM 谷氨酰胺的EdenB600S培养基，补料培养基为EdenB600aS和EdenB600bS，初始培养温度36.5℃ ± 0.5℃，培养至第4天降温至31.0℃±0.5℃,pH控制为 6.90 ± 0.30，分别在第3、5、7、9、11天补充占初始培养体系质量5.0%的EdenB600aS和补充占初始培养体系质量0.5% 的EdenB600bS，初始培养质量1.4 kg，初始接种密度(1.0 ± 0.2) ×106cells/ml，培养14天离心收获细胞进行抗体蛋白纯化。并进行抗体蛋白的糖型检测。结果如表3所示。
对比例2
采用流加培养工艺，具体实施方式同对比例1，区别在于，基础培养基中还含有糖型调节剂5 mM N-乙酰葡萄糖胺。
对比例3
本对比例采用的是流加培养工艺，具体实施方式同对比例1，区别在于，基础培养基中还含有糖型调节剂5 mM N-乙酰葡萄糖胺、1 uM Mn2+、1 mM 尿嘧啶、5 mM半乳糖。
对比例4
本对比例采用的是流加培养工艺，具体实施方式同对比例1，区别在于，基础培养基中还含有糖型调节剂10 mM N-乙酰葡萄糖胺、2 uM Mn2+、2 mM 尿嘧啶、10 mM半乳糖。
抗体常见的N-糖型化类型示意图，如图1所示。测量对比例与实施例的蛋白表达量，结果如表3所示。测量对比例与实施例的抗体糖型，结果如表4所示。
表3 蛋白表达量
表4 抗体糖型比例
在实施例1的基础上，还分别设置了如表5所示的实验组（实施例6~8）和对照组（对比例5~6）进行糖型调节剂添加量的优化。实施例6~8和对比例5~6的糖型调节剂添加量如表5所示，其余参数条件同实施例1。测定添加不同含量糖型调节剂的抗体糖型及蛋白产量，结果如表6所示。
表5不同实验方案的参数设置
表6抗体糖型比例和蛋白产量
分析蛋白表达量和糖型比例结果，实施例的蛋白表达量显著提高，且均大于12 g/L。实施例相比于对比例的Man5含量显著降低，且蛋白产量显著提高。实施例5的Man5达到4.4%，满足了具有特定功能的抗体在工艺优化中的需求（Man5低于5%）。浓缩补料培养工艺以及糖型添加剂对高甘露糖型均具有调节功能。通过浓缩补料培养工艺与添加糖型添加剂能够显著降低高甘露糖型Man5占比。在浓缩补料培养工艺的基础上可对糖型调节剂的浓度进行调整，来达到所需的糖型结构分布。大量相关文献表明抗体的高甘露糖型会提高抗体在人体内的清除率，导致抗体的半衰期降低，显著影响到抗体的药代动力学，并可能引发显著的免疫原性。因此降低抗体的高甘露糖型含量通常作为抗体生产工艺开发的目标之一。
本发明采用浓缩补料培养工艺优化细胞的生存环境来提高蛋白产量，同时搭配糖型调节剂来优化抗体糖型。较低的pH有利于高尔基体进行翻译后修饰，降低高甘露糖型的比例。在常规的流加培养工艺中，较低的pH可能导致细胞生长缓慢、代谢副产物如乳酸的增加、蛋白产量的降低。流加培养工艺的细胞代谢副产物NH4 +是被逐步积累的，对细胞生长、蛋白产量和蛋白质量可能存在负面影响。特别的，提高NH4 +浓度可能不利于高尔基体对抗体的翻译后修饰，导致高甘露糖水平的提高。
本发明采用的浓缩补料培养工艺通过含50 KD的中空纤维柱的交替切向流截留系统来截留罐内的产品蛋白，而代谢副产物如乳酸和NH4 +不断被排出罐体。通过浓缩补料培养工艺优化细胞的生存环境，细胞能够在较低的pH的环境中仍保持较高的蛋白产量和较优的蛋白质量。因此该技术通过降低pH和排出细胞代谢副产物乳酸和NH4 +，有利于高尔基体对抗体的翻译后修饰，从而降低抗体的高甘露糖基化。进一步添加糖型调节剂剂N-乙酰葡萄糖胺、Mn2+、尿嘧啶、半乳糖，能够有效促进高甘露糖型抗体的进一步修饰，合成更加完善的双天线糖型结构，如G0F/G1F/G2F等。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.一种降低抗体甘露糖型水平并提高蛋白产量的方法，其特征在于，采用浓缩补料灌流培养工艺培养表达抗体的细胞，并在基础培养基和用于灌流的培养基中加入糖型调节剂；所述糖型调节剂为N-乙酰葡萄糖胺、Mn2+、尿嘧啶和半乳糖的组合；所述N-乙酰葡萄糖胺的浓度为5~15 mM，所述Mn2+的浓度为1~4 μM，所述尿嘧啶的浓度为1~4 mM，所述半乳糖的浓度为5~20 mM；
所述浓缩补料灌流培养工艺具体是：控制初始接种密度为8 × 105~1.2 × 106cells/ml，控制初始pH为6.6~7.2，第1~3天培养温度36.0℃~37.0℃，第四天降温至30.5℃~31.5℃,并控制pH为6.75~6.85；控制第1~3天灌流速率为0.405VVD，第4~6天灌流速率为0.805VVD，第8~14天灌流速率为1.005 VVD；灌流速率的操作范围为设定值± 5%；所述基础培养基是含谷氨酰胺的EdenB600S培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灌流通过连续灌流装置进行；所述连续灌流装置采用交替切向流细胞截留系统。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述截留系统中，中空纤维柱截留孔径为50KD。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用于灌流培养的培养基包括PM01培养基和PM02培养基；所述PM01培养基含有按体积百分比计90%含4 mM谷氨酰胺的EdenB600S培养基和10% EdenB600aS培养基；所述PM02培养基为EdenB600bS培养基。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在基础培养基和补料培养基中加入糖型调节剂，使基础培养基和灌流培养基PM01中均含有糖型调节剂5 mM N-乙酰葡萄糖胺、1 uMMn2+、1 mM 尿嘧啶、5 mM半乳糖，或基础培养基和灌流培养基PM01中均含有糖型调节剂10mM N-乙酰葡萄糖胺、2 uM Mn2+、2 mM 尿嘧啶、10 mM半乳糖，或基础培养基和灌流培养基PM01中均含有糖型调节剂15 mM N-乙酰葡萄糖胺、4 uM Mn2+、4 mM 尿嘧啶、20 mM半乳糖。
6.权利要求1~5任一所述方法在调控抗体糖基化水平中的应用。
7.一种生产抗体蛋白的方法，其特征在于，以含糖型调节剂的培养基进行细胞培养；所述细胞培养采用浓缩补料灌流培养工艺；所述糖型调节剂包括N-乙酰葡萄糖胺、Mn2+、尿嘧啶或半乳糖；所述浓缩补料灌流培养工艺具体是：初始接种密度为8 × 105~1.2 × 106cells/ml，控制初始pH为6.6~7.2，第1~3天培养温度36.0℃~37.0℃，第四天降温至30.5℃~31.5℃,并控制pH为6.75~6.85。
8.权利要求1~7任一所述方法在生产低甘露糖型抗体中的应用。
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