CN116121170A - 一种降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法及其应用 - Google Patents

一种降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116121170A
CN116121170A CN202310088577.1A CN202310088577A CN116121170A CN 116121170 A CN116121170 A CN 116121170A CN 202310088577 A CN202310088577 A CN 202310088577A CN 116121170 A CN116121170 A CN 116121170A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mammalian cell
medium
high mannose
expression system
mannosamine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310088577.1A
Other languages
English (en)
Inventor
樊寅卯
张曼
舒海
龙子仙
曹云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Original Assignee
Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd filed Critical Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Priority to CN202310088577.1A priority Critical patent/CN116121170A/zh
Publication of CN116121170A publication Critical patent/CN116121170A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法及其应用，所述方法包括如下方式的任意一种或两种的组合：(a)向接种前一代哺乳动物细胞表达系统的传代培养基中添加N‑乙酰基‑D‑甘露糖胺，培养后再接种至生产培养基，继续培养；(b)将哺乳动物细胞表达系统由传代培养基接种至生产培养基后，在培养过程中向培养基添加N‑乙酰基‑D‑甘露糖胺。该方法不仅能有效降低所产糖蛋白中高甘露糖型糖基化水平，且蛋白产量不受影响，同时细胞生长代谢也不受影响，其他质量结果如蛋白纯度、酸碱峰等也不会发生明显改变，因此对新抗体药物的研发和制备具备意义。

Description

一种降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法及其应用
技术领域
本发明属于蛋白类生物制品制备技术领域，涉及一种降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法及其应用，具体涉及一种降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法及其在生产制备蛋白类生物制品中的应用。
背景技术
目前生产的生物制剂很多是蛋白质治疗剂，主要是抗体形式的糖蛋白、基于抗体的融合蛋白和抗体药物偶联物。这些药物具有许多重要特性，这些特性会改变它们对人体的影响，微小的偏差可能会导致严重后果，因此这些生物制剂的质量控制对制药公司至关重要，这就使得有必要正确分析关键质量属性(CQA)，如糖基化。蛋白质糖基化是对重组糖蛋白治疗剂的功能、免疫原性和功效至关重要的翻译后修饰。糖基化已被证明会影响糖蛋白治疗剂的各种物理化学性质，包括蛋白质折叠、溶解度、结合亲和力、稳定性和半衰期等。
CHO细胞(Chinese hamster ovary cells，中国仓鼠卵巢细胞)作为哺乳动物细胞表达系统中应用最为广泛的细胞系之一，参与了70％以上的重组生物制药蛋白的生产。CHO细胞有很多优势，例如：属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利；适用于大规模生物反应器悬浮培养；适应在化学成分确定的培养基中生长以确保不同培养批次间的可重复性；更重要的是它们能够产生具有复杂糖基化、翻译后修饰的蛋白质，这与人类产生的蛋白质相似。
Yu M et.al(2012)表征了具有不同水平Man 5和Man 8/9的抗体的体外生物活性，结果表明高甘露糖糖型似乎都增加了ADCC活性，降低了CDC活性，增加了对FcγRIIIA的结合亲和力，降低了对FcγRIIA和IIB的结合亲和力。此外，Yu M et.al还在小鼠中研究了具有homogeneous Man 5或Man 8/9聚糖的抗体PK，发现具有Man 5和Man 8/9糖型的抗体的清除率比复杂的岩藻糖基化糖型的抗体快3倍。Turner MR et.al(2012)报导了在缺乏血清α-甘露糖苷酶的皮下(SC)环境中，具有高甘露糖型的抗体与皮肤树突状细胞上的DC-SIGN和dectin-2结合可能会触发SC给药蛋白的免疫原性。Gorovits B et.al(2013)报导了LgG/ADC Fc区CH2内结构域内Asn297氨基酸上的N-glycan含有高甘露糖残基，与MR结合亲和力较高，可能引起MR摄取驱动的潜在脱靶毒性。
由此可见，高含量的高甘露糖型将会提高抗体药效(主要增强ADCC效应)，但会降低药物半衰期(加快体内清除速率)并且具有较强的免疫原性。在新抗体药物研发的早期，一般将甘露糖型Man 5的含量控制在10％以下认为是可接受的范围(通常为5％)。通常人IgG含有少量的Man 5糖型，由于其对清除率、免疫原性和疗效的影响尚不确定，治疗性抗体中高水平的高甘露糖可能是一个问题。
目前有大量文献关注增加高甘露糖型含量的方法，例如添加剂α-甘露糖苷酶I抑制剂kifunensine、细胞培养基补充剂棉子糖、补料培养基中调节甘露糖与葡萄糖比例、添加高尔基体pH中和剂莫能霉素等。但是关于降低高甘露糖型水平的机制的可用信息较少，其中主要有如下四个方面的策略：第一，克隆筛选阶段选择蛋白表达量高且高尔基体N-乙酰葡萄糖胺转移酶-I(GnTI)的活性较高(即Man 5水平低)的细胞株；第二，改变细胞培养模式，例如选用IPC(Intensified Perfusion Culture)，IFB(Intensified Fed Batch)工艺，但是工艺相对繁琐复杂；第三，调整细胞培养条件，例如低的渗透压和NH4 +水平，但是降低高甘露糖型水平的效果比较有限；第四，培养阶段添加一定量Mn2+，可以加速GnTI的周转率，从而降低高甘露糖型，但是其效果可能受到细胞株类型，补充水平，其他培养条件和细胞培养基组分的影响；第五，还有研究表明，缩短培养周期可降低高甘露糖型水平，但这种方式同时伴随着抗体表达量的下降；此外，在生物仿制药的开发中，开发人员正做出很多努力来调节高甘露糖型，以实现与原研药的生物相似性。因此，开发出更多能够降低高甘露糖型水平的策略是很有意义的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法及其应用，具体提供一种降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法及其在生产制备蛋白类生物制品中的应用。该方法不仅能有效降低所产糖蛋白中高甘露糖型糖基化水平，且蛋白产量不受影响，同时细胞生长代谢也不受影响，其他质量结果如蛋白纯度、酸碱峰等也不会发生明显改变，因此对新抗体药物的研发和制备具备意义。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法，所述方法包括如下方式的任意一种或两种的组合：
(a)向接种前一代哺乳动物细胞表达系统的传代培养基中添加N-乙酰基-D-甘露糖胺，培养后再接种至生产培养基，继续培养；
(b)将哺乳动物细胞表达系统由传代培养基接种至生产培养基后，在培养过程中向培养基中添加N-乙酰基-D-甘露糖胺。
本发明创造性地发现通过上述两种方式在哺乳动物细胞表达系统的培养体系中添加N-乙酰基-D-甘露糖胺，能使哺乳动物细胞所表达蛋白不受影响的同时，有效降低高甘露糖型糖蛋白水平，且对其它质量(例如蛋白纯度、酸碱峰等)也不会发生不利影响。该方法相较于现有技术中已公开的降低高甘露糖型糖蛋白水平的策略，更加简单易操作，降低高甘露糖型糖蛋白水平的效果更加显著，且基本不会受到细胞株类型，补充水平，其他培养条件和细胞培养基组分的影响。
优选地，方式(a)中，所述添加N-乙酰基-D-甘露糖胺后培养2-4天再接种至生产培养基。
所述2-4天例如可以是2天、2.5天、3天、3.5天、4天等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
在本发明方法中，方式(a)是在所涉及哺乳动物细胞表达系统的前一代培养时就在培养体系中加入N-乙酰基-D-甘露糖胺，培养2-4天后再接种至生产培养基中，继续以常规方式培养。
优选地，方式(b)中，所述添加N-乙酰基-D-甘露糖胺的时间点为接种至生产培养基后的第0-11天，优选第0-7天，更优选第0-5天。
所述第0-11天例如可以是第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
在本发明方法中，方式(b)是以常规方式传代培养，在接种至生产培养基0-11天后再在培养体系中加入N-乙酰基-D-甘露糖胺，培养生产目标蛋白。本发明还发现不同的添加时间对活细胞密度、细胞活率、乳酸代谢均没有明显影响，对抗体表达量没有明显影响，对抗体纯度没有明显影响，对酸性峰、主峰、碱性峰均没有明显影响，但在第0-5天添加降低高甘露糖型糖蛋白水平的效果更加显著。
优选地，方式(a)或方式(b)中，所述N-乙酰基-D-甘露糖胺在培养体系中的浓度为10-100mM，优选10-80mM，更优选10-40mM。
所述10-100mM例如可以是10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明还创造性地发现当添加的N-乙酰基-D-甘露糖胺浓度为10-100mM时，都能降低高甘露糖型糖蛋白的水平；当高于100mM时，会在一定程度抑制细胞生长和抗体表达量；当浓度低于10mM时，将无法显著降低哺乳动物细胞生产高甘露糖型糖蛋白的水平。当浓度处于10-40mM时，能更好地平衡蛋白表达量、高甘露糖型糖蛋白水平和细胞生长代谢状态之间的关系。
优选地，方式(a)或方式(b)中，所述接种至生产培养基后的培养方式为在35.0-37.0℃(例如35.0℃、35.5℃、36.0℃、36.5℃、37.0℃等)摇床中培养，当细胞密度达到(10-16)×106cells/mL(例如10×106cells/mL、12×106cells/mL、15×106cells/mL等)后降温至32.5-34.5℃(例如32.5℃、33.0℃、33.5℃、34.0℃、34.5℃等)继续培养。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明所涉及的方法在细胞密度达到(10-16)×106cells/mL后降温至32.5-34.5℃能够更好地平衡蛋白表达量、高甘露糖型糖蛋白水平和细胞生长代谢状态之间的关系。
更优选地，方式(a)或方式(b)中，所述接种至生产培养基后的培养方式为在35.5-36.5℃摇床中培养，当细胞密度达到(10-16)×106cells/mL后降温至33.0-34.0℃继续培养。
优选地，所述哺乳动物细胞表达系统包括CHO细胞、NS0细胞或SP2/0细胞，更优选CHO细胞。
本发明所涉及的方法中哺乳动物细胞表达系统更优选CHO细胞是因为CHO细胞相较于其他哺乳动物细胞更有优势，其一，本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利；其二，适用于大规模生物反应器悬浮培养；其三，适应在化学成分确定的培养基中生长以确保不同培养批次间的可重复性；其四，能够产生具有复杂糖基化、翻译后修饰的蛋白质，与人类产生的蛋白质更相似。
优选地，所述糖蛋白包括天然糖蛋白或通过基因工程将外源DNA插入宿主细胞所表达的糖蛋白。
优选地，所述通过基因工程将外源DNA插入宿主细胞所表达的糖蛋白包括单克隆抗体、双特异性抗体、抗体偶联药物或Fc融合蛋白。
优选地，所述传代培养基包括CD CHO培养基。
优选地，所述生产培养基包括ActiProTM培养基。
本发明所涉及的方法中使用的传代培养基和生产培养基选用本领域常规传代培养基和生产培养基均可实现。
在本发明中，方式(a)或方式(b)中，所述接种至生产培养基后，在培养过程中补加补料培养基。
优选地，所述补料培养基包括CB7a/CB7b培养基。
第二方面，本发明提供根据第一方面所述的降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法在生产制备蛋白类生物制剂中的应用。
由于高含量的高甘露糖型将会提高抗体药效(主要增强ADCC效应)，但会降低药物半衰期(加快体内清除速率)并且具有较强的免疫原性，因此本发明所涉及的降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法能够应用于新抗体药物的研发中，帮助将高甘露糖型糖蛋白的含量控制在10％以下。
第三方面，本发明提供一种N-乙酰基-D-甘露糖胺的新应用，即N-乙酰基-D-甘露糖胺在制备降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的试剂中的应用。
现有技术中并未有N-乙酰基-D-甘露糖胺用于降低高甘露糖型糖蛋白水平的相关报道，因此本发明也开发了一种N-乙酰基-D-甘露糖胺的新用途。
优选地，所述哺乳动物细胞表达系统包括CHO细胞、NS0细胞或SP2/0细胞，更优选CHO细胞。
优选地，所述糖蛋白包括天然糖蛋白或通过基因工程将外源DNA插入宿主细胞所表达的糖蛋白。
优选地，所述通过基因工程将外源DNA插入宿主细胞所表达的糖蛋白包括单克隆抗体、双特异性抗体、抗体偶联药物或Fc融合蛋白。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性地发现通过上述两种方式在哺乳动物细胞表达系统的培养体系中添加N-乙酰基-D-甘露糖胺，能使哺乳动物细胞所表达蛋白不受影响的同时，有效降低高甘露糖型糖蛋白水平，且对其它质量(例如蛋白纯度、酸碱峰等)也不会发生不利影响。该方法相较于现有技术中已公开的降低高甘露糖型糖蛋白水平的策略，更加简单易操作，降低高甘露糖型糖蛋白水平的效果更加显著，且基本不会受到细胞株类型，补充水平，其他培养条件和细胞培养基组分的影响。
附图说明
图1是不同N-乙酰基-D-甘露糖胺浓度对抗体表达量的影响图；
图2是不同N-乙酰基-D-甘露糖胺浓度对高甘露糖型糖蛋白Man 5表达水平的影响图；
图3是不同N-乙酰基-D-甘露糖胺浓度对Man 5/Titer的影响图；
图4是不同N-乙酰基-D-甘露糖胺浓度对活细胞密度的影响图；
图5是不同N-乙酰基-D-甘露糖胺浓度对细胞活率的影响图；
图6是不同N-乙酰基-D-甘露糖胺浓度对乳酸代谢的影响图；
图7是不同N-乙酰基-D-甘露糖胺添加时间对抗体表达量的影响图；
图8是不同N-乙酰基-D-甘露糖胺添加时间对高甘露糖型糖蛋白Man 5表达水平的影响图；
图9是不同N-乙酰基-D-甘露糖胺添加时间对Man 5/Titer的影响图；
图10是不同N-乙酰基-D-甘露糖胺添加时间对活细胞密度的影响图；
图11是不同N-乙酰基-D-甘露糖胺添加时间对细胞活率的影响图；
图12是不同N-乙酰基-D-甘露糖胺添加时间对乳酸代谢的影响图；
图13是不同培养温度对抗体表达量的影响图；
图14是不同培养温度对高甘露糖型糖蛋白Man 5表达水平的影响图；
图15是不同培养温度对Man 5/Titer的影响图；
图16是不同培养温度对活细胞密度的影响图；
图17是不同培养温度对细胞活率的影响图；
图18是不同培养温度对乳酸代谢的影响图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述内容中所涉及的哺乳动物细胞表达系统是能稳定表达IgG1单克隆抗体的细胞株，其由包含IgG1编码基因的双表达载体转染CHO-K1细胞而来，具体操作为：双表达载体分别包含编码单克隆抗体轻链、重链的基因序列和不同的筛选标记基因，然后按一定比例通过电转方式转染至CHO-K1细胞，之后在含有筛选压力的培养基中进行传代。再进一步通过Single Cell Printer(SCP)分选结合单细胞成像技术获得单克隆。所用CHO-K1细胞株为申请人实验室所保存。
下述内容中所涉及的生产培养基为ActiProTM，购自HyClone公司；传代培养基为CDCHO培养基，购自Gibco公司；补料培养基为CB7a/CB7b培养基，购自HyClone公司；N-乙酰基-D-甘露糖胺购自New Zealand Pharmaceuticals(NZP)公司。
制备例
本制备例配制1M的N-乙酰基-D-甘露糖胺贮存液：
(1)准备配液容器，并记录重量，在容器中加入纯化水；
(2)加入N-乙酰基-D-甘露糖胺粉末，混合15min直至完全溶解；
(3)用纯化水定容，然后过滤除菌；
(4)将配制好的1M的N-乙酰基-D-甘露糖胺贮存液分装保存至无菌离心管内，贴好标签，冻存于-80℃冰箱内，备用。
实施例1
本实施例探究N-乙酰基-D-甘露糖胺的添加浓度对哺乳动物细胞表达系统细胞生长代谢、抗体表达量、抗体纯度、高甘露糖型糖蛋白Man 5水平、以及酸性峰、主峰、碱性峰的影响：
具体操作：将哺乳动物细胞表达系统(能稳定表达IgG1单克隆抗体的细胞株)从液氮罐中取出，在37.0℃恒温浴中迅速解冻，并悬浮于装有CD CHO培养基的摇瓶中，然后将摇瓶放置在36.5℃，125rpm摇床中进行培养。之后每间隔2-3天按0.15×106cells/mL的密度传代一次。大约14天后，将细胞按照0.40×106cells/mL的密度接种到装有ActiProTM培养基的250mL摇瓶中，培养体积50mL，置于36.5℃，125rpm摇床中进行培养。并在细胞密度达到约10×106cells/mL后，转移至33.0℃，125rpm的摇床中。
试验共设置10组，如下表所示，共10个摇瓶，其中编号SF No.01作为对照组，SFNo.02-07添加对应浓度的N-乙酰基-D-甘露糖胺，其中SF No.02-03是在培养的第5天添加，SF No.04-07是分别在培养的第5天、第7天、第9天分三次添加。SF No.08-10添加锰离子(Mn2+)或尿苷(Uridine)(其中SF No.08是在培养第0天添加，SF No.09-10是在培养第3天添加)，作为阳性对照组。在第14天检测抗体表达量并将收获液离心后，经过Protein A一步纯化，再送分析部门进行质量检测。所有检测数据都以对照组SF No.01为1。
SF No. N-乙酰基-D-甘露糖胺(mM) 锰离子(μM) 尿苷(mM)
01 0 - -
02 10 - -
03 20 - -
04 40 - -
05 60 - -
06 80 - -
07 100 - -
08 - 5 -
09 - - 5
10 - - 10
试验结果如下：
(1)抗体表达量结果如表1和图1所示，添加10-40mM N-乙酰基-D-甘露糖胺(ManNAc)对抗体表达量(Titer)没有影响，添加60-100mM N-乙酰基-D-甘露糖胺导致抗体表达量降低14％-20％。5μM锰离子或5mM尿苷均对抗体表达量没有影响，但10mM尿苷会影响抗体表达量，使抗体表达量降低21％。
表1
Figure BDA0004069552740000111
(2)高甘露糖型糖蛋白Man 5表达水平结果如表2、图2、图3所示，添加10-100mM的N-乙酰基-D-甘露糖胺都能降低Man 5水平，其中浓度在20mM-100mM时能使Man 5降低44％-65％。另外，添加N-乙酰基-D-甘露糖胺后，G0F有显著提高，推测N-乙酰基-D-甘露糖胺作为N-乙酰神经氨酸/唾液酸(Neu5Ac)的前体，添加后，促进糖型往成熟方向合成，从而降低了Man 5水平。5μM锰离子或5mM尿苷不能有效降低Man 5，而添加10mM尿苷，Man 5可降低36％。
表2
Figure BDA0004069552740000112
Figure BDA0004069552740000121
注释#1：SF No.01的Man 5绝对值为7.7％。
(3)抗体纯度结果如表3所示，从SDS-Caliper-NR和SEC-UPLC结果来看，添加不同浓度的N-乙酰基-D-甘露糖胺对抗体纯度没有影响。
表3
Figure BDA0004069552740000122
Figure BDA0004069552740000131
(4)各组的iCIEF结果如表4所示，从iCIEF结果来看，添加不同浓度的N-乙酰基-D-甘露糖胺对酸性峰，主峰，碱性峰都没有影响。
表4
Figure BDA0004069552740000132
(5)对活细胞密度、细胞活率、乳酸代谢的影响结果分别如图4、图5、图6所示，从细胞生长、代谢方面来看，与对照组相比，添加10-100mM的N-乙酰基-D-甘露糖胺对活细胞密度、细胞活率、乳酸代谢均没有影响。添加10mM尿苷会抑制细胞生长。
综上所述，添加10-100mM的N-乙酰基-D-甘露糖胺都能降低Man 5水平；当浓度控制在10-40mM时，对抗体表达量没有影响；当浓度在20-40mM时，既能明显降低Man 5，抗体表达量又能维持在与对照组可比的水平。添加100mM尿苷后，Man 5虽然降低62％，但同时抗体表达量降低了20％。
实施例2
本实施例探究N-乙酰基-D-甘露糖胺的添加时间点对哺乳动物细胞表达系统细胞生长代谢、抗体表达量、抗体纯度、高甘露糖型糖蛋白Man 5水平、以及酸性峰、主峰、碱性峰的影响：
具体操作：将哺乳动物细胞表达系统(能稳定表达IgG1单克隆抗体的细胞株)从液氮罐中取出，在37.0℃恒温浴中迅速解冻，并悬浮于装有CD CHO培养基的摇瓶中，然后将摇瓶放置在36.5℃，125rpm摇床中进行培养。之后每间隔2-3天按0.15×106cells/mL的密度传代一次。大约14天后，将细胞按照0.40×106cells/mL的密度接种到装有ActiProTM培养基的250mL摇瓶中，培养体积50mL，置于36.5℃，125rpm摇床中进行培养。并在细胞密度达到约10×106cells/mL后，转移至33.0℃，125rpm的摇床中。
试验共设置5组，如下表所示，共5个摇瓶，其中编号SF No.01作为对照组，SFNo.02是在N-1阶段添加，三天后接种至ActiProTM培养基，SF No.03-05为将细胞接种至ActiProTM后分别在培养的第0天，第5天，第11天添加20mM的N-乙酰基-D-甘露糖胺。在第14天检测抗体表达量并将收获液离心后，经过Protein A一步纯化，再送分析部门进行质量检测。所有检测数据都以对照组SF No.01为1。
Figure BDA0004069552740000141
试验结果如下：
(1)抗体表达量结果如表5和图7所示，不同的添加时间对抗体表达量均没有明显影响。
表5
Figure BDA0004069552740000151
(2)高甘露糖型糖蛋白Man 5表达水平结果如表6和图8、图9所示，种子培养N-1阶段，接种后的第0天或第5天添加20mM N-乙酰基-D-甘露糖胺均能有效降低Man 5水平，达41％-65％。而在接种后培养第11天添加，则不能明显降低Man 5水平。
表6
Figure BDA0004069552740000152
注释#1：SF No.01的Man 5绝对值为6.6％。
从表2可看出，总的高甘露糖型与Man 5水平趋势一致，实施例1、实施例2中使用的细胞为相同克隆，以此预测表6中，总的高甘露糖型与Man
5水平趋势一致。
(3)抗体纯度结果如表7所示，不同的添加时间对抗体纯度没有影响。
表7
Figure BDA0004069552740000161
(4)各组的iCIEF结果如表8所示，从iCIEF结果来看，不同的时间点添加N-乙酰基-D-甘露糖胺对酸性峰，主峰，碱性峰都没有影响。
表8
Figure BDA0004069552740000162
(5)对活细胞密度、细胞活率、乳酸代谢的影响结果分别如图10、图11、图12所示，从细胞生长、代谢方面来看，与对照组相比，不同的N-乙酰基-D-甘露糖胺添加时间对活细胞密度、细胞活率、乳酸代谢均没有明显影响。
综上所述，与对照组相比，在不同阶段添加20mM N-乙酰基-D-甘露糖胺对抗体表达量都没有明显影响(变化在10％以内)。当N-乙酰基-D-甘露糖胺的添加时间为接种前一代传代培养基中，接种后第0天，接种后第5天，都能明显降低Man 5水平，而在培养第11天添加，则不能显著降低Man 5。
实施例3
本实施例探究N-乙酰基-D-甘露糖胺添加后细胞培养温度对哺乳动物细胞表达系统细胞生长代谢、抗体表达量、抗体纯度、高甘露糖型糖蛋白Man 5水平、以及酸性峰、主峰、碱性峰的影响：
具体操作：将哺乳动物细胞表达系统(能稳定表达IgG1单克隆抗体的细胞株)从液氮罐中取出，在37.0℃恒温浴中迅速解冻，并悬浮于装有CD CHO培养基的摇瓶中，然后将摇瓶放置在36.5℃，125rpm摇床中进行培养。之后每间隔2-3天按0.15×106cells/mL的密度传代一次。大约14天后，将细胞按照0.40×106cells/mL的密度接种到装有ActiProTM培养基的250mL摇瓶中，培养体积50mL，置于36.5或35.5℃，125rpm摇床中进行培养。并在细胞密度达到约10×106cells/mL后，转移至33.0℃、31.0℃、29.0℃、34.0℃或35.0℃，125rpm的摇床中。
试验共设置5组，如下表所示，共5个摇瓶，其中编号SF No.01作为对照组，不添加N-乙酰基-D-甘露糖胺，SF No.02-05都是在接种到ActiProTM培养基的第5天添加20mM N-乙酰基-D-甘露糖胺。在第14天检测抗体表达量并将收获液离心后，经过Protein A一步纯化，再送分析部门进行质量检测。所有检测数据都以对照组SF No.01为1。
Figure BDA0004069552740000171
Figure BDA0004069552740000181
注释：根据平台历史经验，初始培养温度36.5℃降温至34.0℃及以上，很大概率会使后期细胞密度降低，细胞活率降低，从而降低抗体表达量，所以本实施例中不再考察此条件。
试验结果如下：
(1)抗体表达量结果如表9和图13所示，添加20mM N-乙酰基-D-甘露糖胺的条件中，初始培养温度为36.5℃时，与降温至33.0℃相比，降温至31.0℃或29.0℃时，抗体表达量有明显下降。初始培养温度35.5℃，降温至34.0℃时，抗体表达量稍有提高。
表9
Figure BDA0004069552740000182
(2)高甘露糖型糖蛋白Man 5表达水平结果如表10和图14、图15所示，与不添加N-乙酰基-D-甘露糖胺的摇瓶对比，添加20mM N-乙酰基-D-甘露糖胺，降温至33.0℃、31.0℃、34.0℃，Man 5水平都明显降低。因SF No.04抗体表达量过低，未送样进行质量分析。
表10
Figure BDA0004069552740000191
注释#1：SF01的Man 5绝对值为6.6％。
从表2可看出，总的高甘露糖型与Man 5水平趋势一致，实施例1、实施例2、实施例3中使用的细胞为相同克隆，以此预测表10中，总的高甘露糖型与Man 5水平趋势一致。
(3)抗体纯度结果如表11所示，从SDS-Caliper-NR和SEC-UPLC结果来看，不同的培养温度对抗体纯度没有影响。因SF No.04抗体表达量过低，未送样进行质量分析。
表11
Figure BDA0004069552740000192
(4)各组的iCIEF结果如表12所示，从iCIEF结果来看，不同的培养温度对酸性峰，主峰，碱性峰都没有影响。因SF No.04抗体表达量过低，未送样进行质量分析。
表12
Figure BDA0004069552740000201
(5)对活细胞密度、细胞活率、乳酸代谢的影响结果分别如图16、图17、图18所示，从细胞生长、代谢方面来看，与对照组相比，不同的N-乙酰基-D-甘露糖胺添加时间对活细胞密度、细胞活率、乳酸代谢均没有明显影响。
综上所述，与不添加N-乙酰基-D-甘露糖胺相比，添加20mM N-乙酰基-D-甘露糖胺的条件中，初始温度为35.5-36.5℃，降温至33.0-34.0℃，抗体表达量都与对照比较一致，且明显降低Man 5。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下方式的任意一种或两种的组合：
(a)向接种前一代哺乳动物细胞表达系统的传代培养基中添加N-乙酰基-D-甘露糖胺，培养后再接种至生产培养基，继续培养；
(b)将哺乳动物细胞表达系统由传代培养基接种至生产培养基后，在培养过程中向培养基添加N-乙酰基-D-甘露糖胺。
2.根据权利要求1所述的降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法，其特征在于，方式(a)中，所述添加N-乙酰基-D-甘露糖胺后培养2-4天再接种至生产培养基。
3.根据权利要求1所述的降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法，其特征在于，方式(b)中，所述添加N-乙酰基-D-甘露糖胺的时间点为接种至生产培养基后的第0-11天，优选第0-7天，更优选0-5天。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法，其特征在于，方式(a)或方式(b)中，所述N-乙酰基-D-甘露糖胺在培养体系中的浓度为10-100mM，优选10-80mM，更优选10-40mM。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法，其特征在于，方式(a)或方式(b)中，所述接种至生产培养基后的培养方式为在35.0-37.0℃摇床中培养，当细胞密度达到(10-16)×106cells/mL后降温至32.5-34.5℃继续培养；
优选地，方式(a)或方式(b)中，所述接种至生产培养基后的培养方式为在35.5-36.5℃摇床中培养，当细胞密度达到(10-16)×106cells/mL后降温至33.0-34.0℃继续培养。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞表达系统包括CHO细胞、NS0细胞或SP2/0细胞，优选CHO细胞。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法，其特征在于，所述糖蛋白包括天然糖蛋白或通过基因工程将外源DNA插入宿主细胞所表达的糖蛋白；
优选地，所述通过基因工程将外源DNA插入宿主细胞所表达的糖蛋白包括单克隆抗体、双特异性抗体、抗体偶联药物或Fc融合蛋白。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法，其特征在于，所述传代培养基包括CD CHO培养基；
优选地，所述生产培养基包括ActiProTM培养基；
优选地，方式(a)或方式(b)中，所述接种至生产培养基后，在培养过程中补加补料培养基；
优选地，所述补料培养基包括CB7a/CB7b培养基。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法在生产制备蛋白类生物制品中的应用。
10.N-乙酰基-D-甘露糖胺在制备降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的制剂中的应用。
CN202310088577.1A 2023-02-09 2023-02-09 一种降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法及其应用 Pending CN116121170A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310088577.1A CN116121170A (zh) 2023-02-09 2023-02-09 一种降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310088577.1A CN116121170A (zh) 2023-02-09 2023-02-09 一种降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116121170A true CN116121170A (zh) 2023-05-16

Family

ID=86307905

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310088577.1A Pending CN116121170A (zh) 2023-02-09 2023-02-09 一种降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116121170A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116590371A (zh) * 2023-07-13 2023-08-15 智享生物(苏州)有限公司 一种降低中华仓鼠卵巢细胞中抗体高甘露糖型的细胞培养方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116590371A (zh) * 2023-07-13 2023-08-15 智享生物(苏州)有限公司 一种降低中华仓鼠卵巢细胞中抗体高甘露糖型的细胞培养方法
CN116590371B (zh) * 2023-07-13 2023-10-17 智享生物(苏州)有限公司 一种降低中华仓鼠卵巢细胞中抗体高甘露糖型的细胞培养方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10745672B2 (en) Method of producing a polypeptide or virus of interest in a continuous cell culture
EP2702143B1 (en) Methods for reducing accumulation of lactate during culturing and method for producing polypeptide
Butler Animal cell cultures: recent achievements and perspectives in the production of biopharmaceuticals
Chartrain et al. Development and production of commercial therapeutic monoclonal antibodies in Mammalian cell expression systems: an overview of the current upstream technologies
KR101848945B1 (ko) 개선된 세포 배양 배지
CN110462054B (zh) 灌注培养基
CN116121170A (zh) 一种降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法及其应用
CN111454877A (zh) 一种cho细胞培养方法
EP2655600B1 (en) Methods for culturing human myeloid leukaemia cells and cells derived therefrom
Tang et al. Bax and Bak knockout apoptosis‐resistant Chinese hamster ovary cell lines significantly improve culture viability and titer in intensified fed‐batch culture process
Rezaei et al. The effect of different media composition and temperatures on the production of recombinant human growth hormone by CHO cells
CN110551693A (zh) 抗生素筛选hek细胞的方法
US10435464B1 (en) Methods for making recombinant proteins
US20230081499A1 (en) Method for increasing the specific production rate of eukaryotic cells
CN102392047A (zh) 一种适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体及其应用
CN115427562A (zh) 制备重组玻尿酸酶的方法
CN108823267A (zh) 调节cho-k1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法
dos Santos et al. Mammalian cell culture technology
Wisnuwardhani et al. Sequential Adaptation in Mammalian CHO-K1 Cells Producing Human Erythropoietin
Bhavsar et al. An Improved Cell Culture Process for Production of Omalizumab
WO2023161885A1 (en) A process for improving polypeptide expression in mammalian cell culture
CN117025538A (zh) 重组神经生长因子的高效表达方法
CN114431221A (zh) 一种抗体生产细胞的冻存制剂、其应用及冻存方法
CN115537445A (zh) 用含尿苷和n-乙酰葡糖胺的培养基调节甘露聚糖糖型
Loke et al. The Performance of Serum-Free and Animal Component-Free Media for Multiple Hybridoma Cell Lines and Culture Systems

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination