CN109321477A - 一种酵母高密度培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酵母高密度培养的方法，属于酵母发酵领域。本发明通过指数补料结合溶氧反馈脉冲流加补料的两阶段补料方式，有效地将副产物乙醇产量控制在较低水平，提高糖蜜原料利用率，同时可以确保酵母能够迅速繁殖到高浓度，经过108h的培养，酵母细胞干重可达到123.6g·L^‑1，提高了酵母菌体得率，每克糖最高可得到0.51克干菌体，有助于中小型企业在原有规模上实现产能提高。

Description

一种酵母高密度培养的方法

技术领域

本发明涉及一种酵母高密度培养的方法，属于酵母发酵领域。

背景技术

酵母及其副产品可广泛地应用于食品、医药、饲料等行业，有着广阔的应用市场和良好的经济效益。2013年，全球酵母产品市场规模已达到58亿美元，预计2019年将达到92亿美元。糖蜜是制糖加工的副产物，含有17-25％的水、大约50％的糖类，以及一些含氮物质、维生素和微量元素，是用于培养酵母的主要原料。

在酵母培养过程中出现的葡萄糖效应是制约酵母生长的一个因素，所谓的葡萄糖效应是指当可发酵性碳源浓度过高时，即使供氧充足，也会导致碳源流向乙醇合成途径，导致副产物乙醇积累，使得糖利用率下降。而且，产生高浓度的乙醇副产物也会对细胞结构及功能造成损伤，对菌体生长和产物合成造成抑制。因此，酵母培养难点主要在于如何有效控制糖浓度，在保证酵母正常生长条件下同时减小溢流代谢，提高糖蜜原料利用率，实现酵母的高得率、高浓度生长。

高密度培养是酵母工业的发展趋势，实现高密度、高产率和高浓度培养是酵母工业的目标和方向。在补料分批过程中可以通过补料策略的优化，控制培养基营养的流入实现生物量和得率最大化。近年来，随着研究的不断深入，补料策略逐渐变得复杂化。一些更为复杂的数学模型及人工智能技术被引入。如张许等(基于差分进化算法的酿酒酵母分批补料培养在线自适应控制[J].中国生物工程杂志)将差分进化算法与传统PID控制策略相结合，构建了用于酿酒酵母分批补料培养过程的在线自适应控制策略，成功将乙醇稳定地控制在设定值1g/L附近，同时使得酵母增殖浓度达到34.45g/L。Chopda等(Chopda V R,Rathore A S,Gomes J.On-line implementation of decoupled input-outputlinearizing controller in Baker's yeast fermentation[J].Ifac ProceedingsVolumes)采用基于TCP/IP协议的解耦输入-输出线性化控制器(DIOLC)，实时在线控制溶氧和残余葡萄糖，实现酵母生长最大化，与PID或PID-l控制器相比，可提高23％的菌体量。Hocalar等(Hocalar A,Türker M.Model based control of minimal overflowmetabolite in technical scale fed-batch yeast fermentation[J].BiochemicalEngineering Journal)基于状态估计算法构建了状态反馈线性控制策略，通过在控制算法中设定菌体浓度和在乙醇浓度，调节最小乙醇浓度来控制比生长速率，调整流加策略，成功实时控制乙醇浓度，以使生物质生产率最大化。但是，对于大多数中小型酵母生产企业来讲，这些方法并不十分适用，因为更为先进的方法往往涉及复杂的控制设备和实施复杂控制算法，需要必要的辅助设备，这些额外且昂贵的投入是大多数中小型企业现代化道路上的一个严重障碍。

发明内容

本发明的目的在于开发一种投资低、操作简单且生产成本较低的酵母高密度培养方法。

本发明的第一个目的是提供一种高密度培养酵母的方法，所述方法以糖蜜为培养基碳源，结合指数流加和溶氧反馈脉冲流加策略对培养过程进行控制；所述溶氧反馈脉冲流加策略是控制溶氧设定值为30-50％，当溶氧低于设定值时停止补料，当溶氧高于设定值时开始补料；发酵过程中停止补料后溶氧缓慢上升，开始补料后溶氧会缓慢下降。

在本发明的一种实施方式中，发酵过程pH为4.5-6.5。

在本发明的一种实施方式中，发酵温度为26-34℃。

在本发明的一种实施方式中，所述指数流加至发酵液中检测到乙醇，切换为溶氧反馈脉冲流加。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(1)分批培养：向培养基中接入8-15％(v/v)种子培养液，启动发酵，发酵过程控制pH为4.5-6.5，控制发酵温度26-34℃；

(2)指数流加：分批培养至可发酵性糖消耗完毕，溶氧上升至60％以上，开始补料，按照设定补料方式控制补料速率，补料期间控制DO不低于30％；

(3)溶氧反馈脉冲流加：指数流加补料至发酵液中检测到乙醇浓度≥1g/L时，将补料方式改为溶氧反馈脉冲流加，溶氧控制为30％-50％。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(1)分批培养：在机械搅拌式通风发酵罐中装入适量培养基，接入种子培养液，启动发酵，发酵过程中用稀H₂SO₄或稀NaOH溶液维持pH在4.5-6.5之间，夹套或盘管通冷却水控制发酵温度26-34℃。

(2)指数流加：分批培养至可发酵性糖消耗完毕，溶氧上升至60％以上，开启补料泵，按照设定补料方式控制补料速率，补料过程pH值、温度控制与分批培养相同，补料期间控制DO不低于30％。

(3)溶氧反馈脉冲流加：在指数流加补料至发酵液中检测到乙醇，将补料方式改为溶氧反馈脉冲流加，溶氧控制为30％-50％，补料过程pH值、温度控制与分批培养相同。

在本发明的一种实施方式中，所述的分批培养的培养基配方(g/L)：糖蜜稀释液总糖60-90、(NH₄)₂SO₄ 6-10、KH₂PO₄ 0.5-3.0、MnCl₂·4H₂O 0.001-0.004、ZnSO₄·7H₂O 0.005-0.008。

在本发明的一种实施方式中，所述的指数流加的补料培养基配方(g/L)：糖蜜稀释液总糖300-380、(NH₄)₂SO₄ 20-50、KH₂PO₄ 6-12。溶氧反馈脉冲流加的培养基同指数流加培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述糖蜜包括但不限于甜菜糖蜜或甘蔗糖蜜。

在本发明的一种实施方式中，所述指数流加过程中，补料速率按以下公式计算：

其中：F，补料速率，L/h；μ，所设定的酵母比生长速率，h^-1；V₀，补料开始罐内培养基体积，L；C_C0，开始补料时罐内菌体浓度，g/L；Y_X/S，菌体得率，％；C_SF，补料培养基的总糖浓度，g/L；C_S，开始补料时段的罐内总糖浓度，g/L；t，指数补料时间，h。

在本发明的一种实施方式中，所述溶氧反馈脉冲流加是指溶氧和补料泵关联，当溶氧低于30％时停止流加，当溶氧高于60％时开始流加。

本发明与已有技术相比具有以下优点：

(1)指数补料结合溶氧反馈脉冲流加补料的两阶段补料方式，该方法可以有效地将副产物乙醇产量控制在较低水平，提高糖蜜原料利用率；

(2)实现酵母高密度培养，同时可以确保酵母能够迅速繁殖到高浓度，酵母细胞干重可达到136.5g/L。

(3)提高酵母菌体得率，每克糖最高可得到0.51克干菌体。

(4)投资低、操作简单，利用酵母生产企业原有设备即可实施。

附图说明

图1为本发明一种酵母高密度培养方法的工艺流程图。

具体实施方式

乙醇含量的测定方法：用高压液相色谱测定，发酵液在4℃、12000r/min条件下离心10min，取上清液进行0.22μm膜过滤处理，滤液进行高压液相色谱测定。液相色谱条件：AminexHPX-87H色谱柱，RI检测器和UV检测器，流动相为5mmol/L H₂SO₄，柱温60℃，流速0.6mL/min。

菌体干重测定方法：发酵液于恒重的离心管中，8000r/min离心10min，弃去上清液。用去离子水反复洗涤离心菌体3-4次。放入真空干燥箱中干燥至恒重。称量计算菌体干重。

实施例1

1)分批培养：在5L机械搅拌式通风发酵罐中装入1L培养基，接入100mL酵母种子培养液启动发酵，酵母种子液菌体浓度为1×10⁸个/ml，发酵过程中用稀H₂SO₄或稀NaOH溶液维持pH在4.5-5.0之间，夹套通冷却水控制发酵温度26-28℃。

2)指数流加：分批培养约18h可发酵性糖消耗完毕，溶氧上升至60％时开启补料泵，补料方式按补料公式执行(其中酵母比生长速率μ设定为0.02h^-1)。

3)溶氧反馈脉冲流加：指数流加补料约45h，发酵液中检测到2.0g/L的乙醇，将补料方式改为溶氧反馈脉冲流加，即溶氧和补料泵关联且自动控制，设定溶氧控制值为50％，溶氧低于50％时停止补料，溶氧高于50％时开始补料，补料过程pH值、温度控制与分批培养相同。发酵结束后发酵液中酵母菌体干重为130.5g/L，未检出乙醇含量，菌体得率为0.49g/g总糖，总发酵时长112h。

实施例2

1)分批培养：在5L机械搅拌式通风发酵罐中装入1L培养基，接入100mL种子培养液启动发酵，酵母种子液菌体浓度为1×10⁸个/ml，发酵过程中用稀H₂SO₄或稀NaOH溶液维持pH在5.0-5.5之间，夹套通冷却水控制发酵温度28-30℃。

2)指数流加：分批培养约18h可发酵性糖消耗完毕，溶氧上升至60％时开启补料泵，补料方式按补料公式执行(其中酵母比生长速率μ设定为0.03h^-1)。

3)溶氧反馈脉冲流加：指数流加补料约45h，发酵液中检测到2.0g/L的乙醇，将补料方式改为溶氧反馈脉冲流加，即溶氧和补料泵关联且自动控制，设定溶氧控制值为40％，补料过程pH值、温度控制与分批培养相同。发酵结束后发酵液中酵母菌体干重为136.5g/L，未检出乙醇含量，菌体得率为0.51g/g总糖，总发酵时长102h。

实施例3

1)分批培养：在5L机械搅拌式通风发酵罐中装入1L培养基，接入100mL种子培养液启动发酵，酵母种子液菌体浓度为1×10⁸个/ml，发酵过程中用稀H₂SO₄或稀NaOH溶液维持pH在5.5-6.5之间，夹套通冷却水控制发酵温度30-34℃。

2)指数流加：分批培养约18h可发酵性糖消耗完毕，溶氧上升至60％时开启补料泵，补料方式按补料公式执行(其中酵母比生长速率μ设定为0.04h^-1)。

3)溶氧反馈脉冲流加：指数流加补料约45h，发酵液中检测到2.0g/L的乙醇，将补料方式改为溶氧反馈脉冲流加，即溶氧和补料泵关联且自动控制，设定溶氧控制值为30％，补料过程pH值、温度控制与分批培养相同。发酵结束后发酵液中酵母菌体干重为132.6g/L，未检出乙醇含量，菌体得率为0.51g/g总糖，总发酵时长106h。

对比例1：

具体实施方式同实施例1，区别在于，设定溶氧控制值为55％，发酵结束后发酵液中酵母菌体干重为118.6g/L，菌体得率为0.47g/g总糖，尽管发酵结束后未检测到乙醇，但发酵总时长延长至140h。溶氧的设定对酵母的生长有较大的影响，随着设定溶氧值的升高，为了维持较高溶氧培养基的流加速率逐渐降低，使得体系中糖无法累积甚至溶氧过高时菌体出现饥饿状态，导致酵母生长减缓，发酵周期延长。

对比例2：

具体实施方式同实施例1，区别在于，设定溶氧控制值为25％，发酵结束后发酵液中酵母菌体干重为103.7g/L，乙醇含量为2.6g/L，菌体得率为0.44g/g总糖。当设定溶氧较低时，为了匹配较低溶氧，糖的流加速率加快，使得酵母快速生长繁殖，但是由于溶氧的降低以及糖的积累使得更多的糖流向乙醇代谢，对酵母生长造成不利，影响原料利用。

对比例3：

具体实施方式同实施例1，区别在于，不采用溶氧反馈脉冲流加策略，全程按照指数流加策略控制发酵过程。发酵结束后发酵液中酵母菌体干重为100.5g/L，乙醇含量为6.6g/L，菌体得率为0.46g/g总糖，单一的指数流加导致糖的积累，同时又由于酵母快速生长导致溶氧不足，从而使得副产物乙醇含量增加，说明单一的指数流并不适合于酿酒酵母的高密度培养。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种高密度培养酵母的方法，其特征在于，以糖蜜为培养基碳源，结合指数流加和溶氧反馈脉冲流加策略对培养过程进行控制；所述溶氧反馈脉冲流加策略是当溶氧低于设定值时停止补料，当溶氧高于设定值时开始补料，溶氧设定值为30-50％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述指数流加至发酵液中检测到乙醇，

切换为溶氧反馈脉冲流加。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，发酵过程pH为4.5-6.5。

4.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，发酵温度为26-34℃。

5.根据权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)分批培养：向培养基中接入8-15％(v/v)种子培养液，启动发酵，发酵过程控制pH为4.5-6.5，控制发酵温度26-34℃；

(2)指数流加：分批培养至可发酵性糖消耗完毕，溶氧上升至60％以上，开始补料，按照设定补料方式控制补料速率，补料期间控制DO不低于30％；

(3)溶氧反馈脉冲流加：指数流加补料至发酵液中检测到乙醇浓度≥1g/L时，将补料方式改为溶氧反馈脉冲流加，溶氧控制为30％-50％。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的分批培养的培养基含有(按g/L计)：糖蜜稀释液总糖60-90、(NH₄)₂SO₄ 6-10、KH₂PO₄ 0.5-3.0、MnCl₂·4H₂O 0.001-0.004、ZnSO₄·7H₂O 0.005-0.008。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，补料培养基含有(按g/L计)：糖蜜稀释液总糖300-380、(NH₄)₂SO₄ 20-50、KH₂PO₄ 6-12。

8.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述指数流加过程中，补料速率按以下公式计算：

其中：F，补料速率，L/h；μ，所设定的酵母比生长速率，h^-1；V₀，补料开始时培养基体积，L；C_C0，开始补料时菌体浓度，g/L；Y_X/S，菌体得率，％；C_SF，补料培养基的总糖浓度，g/L；C_S，开始补料时段的总糖浓度，g/L；t，指数补料时间，h。

9.根据权利要求1～8任一所述的方法，其特征在于，糖蜜包括但不限于甜菜糖蜜或甘蔗糖蜜。

10.权利要求1～9任一所述的方法在酵母高密度培养方面的应用。