CN108841886A - 一种高效生产l-脯氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效生产L‑脯氨酸的方法，属于发酵工程技术领域。本发明采用DO‑stat法将葡萄糖浓度维持在一个较低的恒定水平，有效消除了L‑脯氨酸发酵生产过程中葡萄糖的阻遏作用；与间歇流加发酵工艺相比，其可将L‑脯氨酸的平均产量从77.4g/L提高到84.3g/L，平均生产强度从1.84g/L·h提高到2.11g/L·h，具有很好的工业应用前景。

Description

一种高效生产L-脯氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种高效生产L-脯氨酸的方法，属于发酵工程技术领域。
背景技术
L-脯氨酸是含有亚氨基的中性氨基酸，也是构成蛋白质的20种基本氨基酸之一，为人体非必需氨基酸。L-脯氨酸具有一定的生理活性，在医药、农业、化工及食品等方面有着广泛的用途，尤其在医药上是许多新药合成的中间体。
目前，L-脯氨酸的工业生产主要是采用发酵法。在L-脯氨酸的发酵生产过程中，通常采用间歇流加工艺以消除高浓度葡萄糖对L-脯氨酸合成的抑制；但是，间歇流加工艺容易使得葡萄糖浓度发生剧烈变化，引起发酵液理化性质的改变，如发酵液瞬时大量稀释、渗透压不稳定等，这些都会扰乱细胞的生理代谢，从而对细胞生长代谢及最终发酵生产带来负面影响。
因此，急需找到一种新的流加工艺以替代现有的间歇流加工艺，解决现有间歇流加工艺的缺陷。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种高效生产L-脯氨酸的方法。其采用DO-stat法将葡萄糖浓度维持在一个较低的恒定水平，有效消除了L-脯氨酸发酵生产过程中葡萄糖的阻遏作用；与间歇流加发酵工艺相比，其可将L-脯氨酸的平均产量从77.4g/L提高到84.3g/L，平均生产强度从1.84g/L·h提高到2.11g/L·h，具有很好的工业应用前景。
本发明提供了一种高效生产L-脯氨酸的方法，所述方法为将L-脯氨酸生产菌株接种于发酵罐中进行分批流加发酵生产L-脯氨酸；所述分批流加发酵是指在分批发酵过程中，采用DO-stat流加控制策略进行流加发酵；所述DO-stat流加控制策略是指在发酵过程的溶氧回升至10％-30％时开始流加葡萄糖，将发酵过程的溶氧控制在10％-30％；所述溶氧以发酵罐中未接种L-脯氨酸生产菌株前的发酵培养基的溶氧为100％。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将L-脯氨酸生产菌株接种于发酵罐中进行分批流加发酵生产L-脯氨酸；所述分批流加发酵是指在分批发酵过程中，采用DO-stat流加控制策略进行流加发酵；所述DO-stat流加控制策略是指在发酵过程的溶氧回升至25％时开始流加葡萄糖，将发酵过程的溶氧控制在25％；所述溶氧以发酵罐中未接种L-脯氨酸生产菌株前的发酵培养基的溶氧为100％。
在本发明的一种实施方式中，所述L-脯氨酸生产菌株在发酵罐中的接种量为2％-5％。
在本发明的一种实施方式中，所述L-脯氨酸生产菌株在发酵罐中的接种量为5％。
在本发明的一种实施方式中，所述分批流加发酵的温度为25-35℃。
在本发明的一种实施方式中，所述分批流加发酵的温度为30℃。
在本发明的一种实施方式中，所述分批流加发酵的转速为400-600rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述分批流加发酵的转速为500rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述分批流加发酵的通气量为1-2vvm。
在本发明的一种实施方式中，所述分批流加发酵的通气量为1.2vvm。
在本发明的一种实施方式中，所述分批流加发酵的时间为55-65h。
在本发明的一种实施方式中，所述分批流加发酵的时间为57h。
在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖为500g/L的葡萄糖。
在本发明的一种实施方式中，所述L-脯氨酸生产菌株为谷氨酸棒杆菌。
本发明提供了上述一种高效生产L-脯氨酸的方法在制备L-脯氨酸方面的应用。
有益效果：
(1)本发明基于DO-stat流加控制策略发酵生产L-脯氨酸的方法，有效消除了L-脯氨酸发酵过程中的阻遏作用，提高了L-脯氨酸的产量；
(2)与间歇流加发酵工艺相比，本发明将L-脯氨酸的平均产量从77.4g/L提高到了84.3g/L，提高了8.9％；
(3)与间歇流加发酵工艺相比，本发明将L-脯氨酸的平均生产强度从1.84g/L·h提高到2.11g/L·h，提高了14.7％。
具体实施方式
下面以谷氨酸棒杆菌为例，结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
L-脯氨酸平均产量及生产强度的检测方法如下：
1.配置试剂
A溶液(含茚三酮)：称取0.5g茚三酮，加入20ml6mol/升的磷酸溶液，加入30ml冰乙酸，搅拌至完全溶解，置于棕色瓶中(使用时间一星期)；
B溶液(不含茚三酮)：吸取20ml6mol/升的磷酸溶液，加入30ml冰乙酸，摇匀即可；
6mol/升的磷酸溶液：量取81ml磷酸，加水稀释至200ml，摇匀；
标准样的配制：称取脯氨酸标准样4.0g(称准至0.0001g)，加水溶解并定容至100ml，续而稀释至5000倍。
2.操作
(1)吸取稀释好的样品液1ml，加1ml冰乙酸、1mlA溶液，摇匀制成样品管；
(2)吸取1ml纯水，加入1ml冰乙酸，1mlB溶液，摇匀制成空白管；
(3)吸取稀释好的标准液1ml，加1ml冰乙酸，1mlA溶液摇匀，制成标准管；
(4)将空白管、样品管、标准管沸水浴1h后，加入1ml冰乙酸、冷却后再加入1ml冰乙酸，然后在515nm波长处测定样品液、标准液的吸光度。
3.计算
L-pro＝(样品吸光度×标准液的含量％×样品的稀释倍数)/(标准液的吸光度×标准液的稀释倍数)
下述实施例中涉及的培养基如下：
发酵培养基：葡萄糖10％，硫酸铵1％，玉米浆3％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％
对比例1：间歇流加分批发酵
具体步骤如下：
(1)将谷氨酸棒杆菌接种于种子培养基上12-16h后，以5％的接种量转接到含有2L发酵培养基的5L发酵罐中(初始发酵条件为：初糖浓度100g/L，转速500rpm，温度30℃，通气量1.2vvm)；
(2)当发酵过程中，还原糖浓度为25g/L以下时，流加一定量500g/L葡萄糖补料液使还原糖浓度维持在25g/L；
(3)每隔4h检测，不断流加一定量的补料液维持此糖浓度(25g/L)；
(4)发酵60h，检测L-脯氨酸的平均产量及生产强度。
检测结果为：L-脯氨酸的平均产量为52.8g/L、生产强度为0.88g/L·h。
实施例1：基于DO-stat流加控制策略的分批发酵(DO控制在10％)
发酵罐开始条件和间歇流加分批发酵相同，当DO回升至10％时开始流加葡萄糖，控制DO关联补料，每当DO高于10％时就进行片刻的流加使溶氧维持在10％左右(流加液成分为500g/L的葡萄糖)，发酵58h，检测L-脯氨酸的平均产量及生产强度。
检测结果为：L-脯氨酸的平均产量为56.2g/L、生产强度为0.97g/L·h。
实施例2：基于DO-stat流加控制策略的分批发酵(DO控制在20％)
发酵罐开始条件和间歇流加分批发酵相同，当DO回升至20％时开始流加葡萄糖，控制DO关联补料，每当DO高于20％时就进行片刻的流加，使溶氧维持在20％左右(流加液成分为500g/L的葡萄糖)，发酵58h，检测L-脯氨酸的平均产量及生产强度。
检测结果为：L-脯氨酸的平均产量为58.6g/L、生产强度为1.00g/L·h。
实施例3：基于DO-stat流加控制策略的分批发酵(DO控制在25％)
发酵罐开始条件和间歇流加分批发酵相同，当DO回升至25％时开始流加葡萄糖，控制DO关联补料，每当DO高于30％时就进行片刻的流加，使溶氧维持在30％左右(流加液成分为500g/L的葡萄糖)，发酵57h，检测L-脯氨酸的平均产量及生产强度。
检测结果为：L-脯氨酸的平均产量为61.5g/L、生产强度为1.08g/L·h。
实施例:4：基于DO-stat流加控制策略的分批发酵(DO控制在30％)
发酵罐开始条件和间歇流加分批发酵相同，当DO回升至30％时开始流加葡萄糖，控制DO关联补料，每当DO高于30％时就进行片刻的流加，使溶氧维持在30％左右(流加液成分为500g/L的葡萄糖)，发酵56h，检测L-脯氨酸的平均产量及生产强度。
检测结果为：L-脯氨酸的平均产量为54.1g/L、生产强度为0.98g/L·h。
表1不同流加发酵模式下L-脯氨酸的产量
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种高效生产L-脯氨酸的方法，其特征在于，所述方法为将L-脯氨酸生产菌株接种于发酵罐中进行分批流加发酵生产L-脯氨酸；所述分批流加发酵是指在分批发酵过程中，采用DO-stat流加控制策略进行流加发酵；所述DO-stat流加控制策略是指在发酵过程的溶氧回升至10％-30％时开始流加葡萄糖，将发酵过程的溶氧控制在10％-30％；所述溶氧以发酵罐中未接种L-脯氨酸生产菌株前的发酵培养基的溶氧为100％。
2.如权利要求1所述的一种高效生产L-脯氨酸的方法，其特征在于，所述方法为将L-脯氨酸生产菌株接种于发酵罐中进行分批流加发酵生产L-脯氨酸；所述分批流加发酵是指在分批发酵过程中，采用DO-stat流加控制策略进行流加发酵；所述DO-stat流加控制策略是指在发酵过程的溶氧回升至25％时开始流加葡萄糖，将发酵过程的溶氧控制在25％；所述溶氧以发酵罐中未接种L-脯氨酸生产菌株前的发酵培养基的溶氧为100％。
3.如权利要求1或2所述的一种高效生产L-脯氨酸的方法，其特征在于，所述L-脯氨酸生产菌株在发酵罐中的接种量为2％-5％。
4.如权利要求1-3任一所述的一种高效生产L-脯氨酸的方法，其特征在于，所述分批流加发酵的温度为25-35℃。
5.如权利要求1-4任一所述的一种高效生产L-脯氨酸的方法，其特征在于，所述分批流加发酵的转速为400-600rpm。
6.如权利要求1-5任一所述的一种高效生产L-脯氨酸的方法，其特征在于，所述分批流加发酵的通气量为1-2vvm。
7.如权利要求1-6任一所述的一种高效生产L-脯氨酸的方法，其特征在于，所述分批流加发酵的时间为55-65h。
8.如权利要求1-7任一所述的一种高效生产L-脯氨酸的方法，其特征在于，所述葡萄糖为500g/L的葡萄糖。
9.如权利要求1-8任一所述的一种高效生产L-脯氨酸的方法，其特征在于，所述L-脯氨酸生产菌株为谷氨酸棒杆菌。
10.权利要求1-9任一所述的一种高效生产L-脯氨酸的方法在制备L-脯氨酸方面的应用。
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