TWI748078B

TWI748078B - 抗體藥物偶聯物的製備方法

Info

Publication number: TWI748078B
Application number: TW107111217A
Authority: TW
Inventors: 劉宇鵬; 張小飛; 梁志; 石瑞君; 鍾金; 劉洵; 陶維康; 張連山; 孫飄揚
Original assignee: 大陸商江蘇恒瑞醫藥股份有限公司; 大陸商上海恒瑞醫藥有限公司
Priority date: 2017-03-30
Filing date: 2018-03-30
Publication date: 2021-12-01
Also published as: EP3603663A1; JP2020518655A; CN110177569A; EP3603663A4; KR20190133233A; BR112019020174A2; US20200030453A1; RU2019134030A; CA3058024A1; WO2018177369A1; MX2019011635A; TW201837049A; AU2018241654A1

Abstract

本發明涉及一種抗體藥物偶聯物（antibody-drug conjugate, ADC）的製備方法，具體而言，該方法主要借助於抗體類生物分子與離子交換載體通過靜電相互作用的結合，實現ADC藥物的固相製備。通過洗脫條件的優化控制藥物與抗體的偶聯比（drug per antibody ratios, DAR）和分離聚體偶聯藥物，降低偶聯反應中藥物的使用量和增強ADC藥物的靶向療效性。該製備方法步驟少，操作簡單，可程序化控制，利於工業放大生產，同時實現製備過程中還原劑和有機溶劑的零留存，明顯提高用藥安全性，也降低了生產成本。

Description

抗體藥物偶聯物的製備方法

本發明涉及一種抗體藥物偶聯物的製備方法。具體地說，本發明涉及採用離子交換柱為載體製備抗體藥物偶聯物（antibody-drug conjugate, ADC）。

製備ADC藥物常用的偶聯方式包括：離胺酸偶聯、輕重鏈間還原性二硫鍵偶聯和定向偶聯（Beck A, Reichert JM. Antibody-drug conjugates: Present and future; MAbs, 2014, 6: 15-17; McCombs J R, Owen S C. Antibody drug conjugates: design and selection of linker, payload and conjugation chemistry. The AAPS journal, 2015, 17: 339-351）。離胺酸偶聯平臺技術利用雙功能基團交聯試劑，對抗體的離胺酸殘基進行隨機修飾，再與毒性小分子如：美登素衍生物DM1、DM4或其它類似物的巰基反應實現偶聯，已經上市的T-DM1（Kadcyla）即採用這一技術。輕重鏈間還原性二硫鍵偶聯則是通過還原抗體輕重鏈間的二硫鍵而產生半胱胺酸殘基，再與含多肽交聯劑的毒素如海兔毒素衍生物甲基澳瑞他汀E（Monomethyl auristatin E, MMAE）或其它類似物反應實現偶聯，上市的ADC藥物Adcetris則採用了此技術。定點偶聯模式主要通過引入新的胺基酸如半胱胺酸等改變胺基酸序列，使毒性小分子定向的與抗體結合，該技術當前還處於早期研發階段（Panowski S, et al. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. MAbs. Taylor & Francis, 2014, 6: 34-45）。目前市場上的ADC藥物主要是以離胺酸偶聯和輕重鏈間還原性二硫鍵隨機偶聯方式為主，這兩種方式獲得的ADC藥物中，單抗上偶聯的藥物個數有著較大差別，導致藥物的異質性，對ADC批量間生產一致性提出了巨大的挑戰（Wang L, et al. Structural characterization of the maytansinoid–monoclonal antibody immunoconjugate, huN901–DM1, by mass spectrometry. Protein science, 2005, 14: 2436-2446）。藥物抗體偶聯比（drug per antibody ratios, DAR）值代表每個抗體上平均偶聯的毒性藥物小分子個數，研究表明，偶聯到抗體上的毒性分子數目會影響到ADC的聚合、抗原的結合活性、血液循環中的清除率、活性及耐受性。DAR值過低則降低了ADC的活性，而DAR值過高則會降低ADC藥物在血液循環中的半衰期和耐受性，影響到ADC藥物與抗原的有效結合，藥效也有可能隨著DAR值的增加而降低（Hamblett KJ, et al. Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibody drug conjugate. Clin Cancer Res, 2004, 10: 7063-7070）。對於目前已經上市的ADC藥物而言，理想的DAR值應該控制在2~4之間。

儘管ADC新藥的開發已經獲得了前所未有的成功，但技術上仍有待於進一步改進，其中傳統製程的偶聯步驟繁多，操作麻煩且污染環境；同時還涉及到有機溶劑的加入和攪拌操作，不可避免地導致抗體蛋白之間的碰撞產生交聯物和多聚體，而且各種有機溶劑的難以徹底清除而存留，可能引起免疫原性及其他副作用，從而約束著ADC藥物的快速發展。另外，DAR值也是製備ADC藥物中的關鍵質控參數，這也需要從偶聯和純化製程著手進行研究。將DAR值控制在目標範圍內，確保批量間生產的一致性和穩定性，並盡可能控制和去除產品中副產物聚集體的含量。

專利（CN104208719A）通過陽離子交換層析純化手段實現DAR值和聚體的控制，但這僅僅是一種純化分離手段，並未改變ADC生產製程的繁瑣性，也無法徹底清除各種有機試劑。

在製程方面的改造，英國埃文斯發明瞭固相製備ADC（CN105579066A），利用親和填料Protein A樹脂作為固定劑，將單株抗體與Protein A通過親和作用而結合於樹脂上，再分別與交聯劑或毒素進行反應，這項研究的確能夠減少生產步驟，但由於ProteinA親和填料的價格昂貴且差的耐鹼性等因素，嚴重束縛了該技術在生產上的推廣應用。

專利（CN101087611A）其全部公開內容特別地在此併入作為參考，公開了通過交聯劑將抗體與DM1、DM3、DM4偶聯的方法，所述的交聯劑包括具有馬來醯亞胺基團、巰基基團、鹵代乙醯基基團；所述馬來醯亞胺基團選自SMCC、LC-SMCC、KMUA、GMBS、EMCS、MBS、AMAS、SMPH、SMPB、PMPI。所述鹵代乙醯基的基團選自SIAB、SIA、SBA、SBAP。

專利（CN106029083A）其全部公開內容特別地在此併入作為參考，公開了通過硫醚鍵直接將MMAE、MMAF偶聯至抗體的水解的琥珀醯亞胺環（或琥珀酸）。

專利（CN106467575A）其全部公開內容特別地在此併入作為參考，公開了通過定點偶聯方式將抗體與MMAE、MMAF、PBD、SN-38及Dox等毒素偶聯。

申請人的先前申請技術WO2016127790A1、WO2015/113476涉及新的毒素分子及偶聯物，其全部公開內容特別地在此併入作為參考；申請人的先前申請技術CN106188293A公開了c-Met抗體偶聯物及製備方法。申請人的先前申請技術（申請號為CN201610526367.6）提供了EGFR抗體藥物偶聯物及其製備方法。

因此，一種新的製程既能減少生產步驟又能降低成本，同時方便清除有機試劑和提高DAR值的可控性，將對ADC藥物合成具有著重要的實質意義。

本發明提供一種製備抗原結合蛋白-藥物偶聯物的方法，借助於抗體類生物分子與離子交換載體通過靜電相互作用的結合，實現ADC藥物的固相製備。通過洗脫條件的優化控制藥物與抗體的偶聯比和分離聚體偶聯藥物，降低偶聯反應中藥物的使用量和增強ADC藥物的靶向療效性。該製備方法步驟少，操作簡單，可程序化控制，利於工業放大生產，同時實現製備過程中還原劑和有機溶劑的零留存，明顯提高用藥安全性，也降低了生產成本。製備方法包括：採用離子型交換載體固定抗原結合蛋白，藥物與固定的抗原結合蛋白通過偶聯的方式相互連接，將偶聯產物從離子交換載體上洗脫下來，收集洗脫液；所述的抗原結合蛋白-藥物偶聯物可以具體為抗體-藥物偶聯物。

為實現上述發明目的，本發明的技術方案為：一種製備抗原結合蛋白-藥物偶聯物的方法，所述方法包含如下步驟： 1）將抗原結合蛋白固定於離子交換載體上，以形成固定的抗原結合蛋白； 2）所述固定的抗原結合蛋白與藥物接觸，以形成抗原結合蛋白-藥物偶聯物； 3）將抗原結合蛋白-藥物偶聯物從所述離子交換載體上洗脫下來。

優選的，所述方法包含如下步驟： 1）將抗原結合蛋白固定於離子交換載體上，以形成固定的抗原結合蛋白； 2）所述固定的抗原結合蛋白與藥物接觸，進行偶聯反應，以形成抗原結合蛋白-藥物偶聯物；所述的進行偶聯反應為所述固定的抗原結合蛋白與藥物發生偶聯反應； 3）將抗原結合蛋白-藥物偶聯物從所述離子交換載體上洗脫下來。

在本發明方法一個優選的實施方案中，其中所述抗原結合蛋白選自人源化抗體、鼠源抗體、人抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體。所述抗原結合蛋白還可以是抗原結合片段，所述抗原結合片段選自但不限於Fab、F（ab'）2和scFv片段。

在本發明方法一個優選的實施方案中，其中所述抗原結合蛋白優選自抗體，更優選單株抗體。

在本發明方法一個優選的實施方案中，所述離子交換載體選自但不限於離子型交換樹脂、離子型交換膜、離子型交換纖維，優選離子交換樹脂。所述離子型交換載體選自陽離子交換載體或陰離子交換載體，優選為陽離子型交換載體，更優選為強陽離子交換載體，所述離子型交換載體交換劑或反應配基選自強酸性的反應配基，優選磺酸基（-SO₃ H）。離子交換載體中所用到的基質（Matrix）包括疏水性基質，可選自但不限於聚苯乙烯、聚甲基丙烯等疏水的類高分子聚合物，優選聚甲基丙烯酸酯；和親水性基質，可選自但不限於瓊脂糖、葡聚糖等親水類的高分子聚合物，優選瓊脂糖；所述離子交換載體中所用到的基質也可包括中性基質的高分子聚合物。在一些實施方式中「離子交換載體」和「載體」可以替換使用，含義相同。

在本發明方法一個優選的實施方案中，其中步驟2）中所述偶聯反應為所述抗原結合蛋白與藥物通過親核基團和親電子基團之間的相互作用而連接；其中所述親核基團任選地來自所述抗原結合蛋白或所述藥物，優選來自所述抗原結合蛋白；其中所述親電子基團任選地來自所述抗原結合蛋白或所述藥物，優選來自所述藥物。

在本發明方法一個優選的實施方案中，其中所述親核基團選自巰基、羥基、氨基、醯肼、肟、肼、縮氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基醯肼基團，條件是：當親核基團來自所述藥物時，所述親核基團優選巰基；當親核基團來自所述抗原結合蛋白時，所述親核基團優選氨基（如本發明實施例2）、巰基（如本發明實施例9）、羥基；所述的氨基更優選N末端氨基、側鏈氨基、糖基化抗原結合蛋白中糖的氨基，所述的羥基更優選糖基化抗原結合蛋白中糖的羥基，所述的巰基更優選側鏈巰基，最優選半胱胺酸的巰基。

在本發明方法一個優選的實施方案中，其中所述巰基來自於抗體裂解還原產生的連接基團，所述的氨基來自於抗體未發生裂解還原的自帶連接基團。

在本發明方法一個優選的實施方案中，其中所述親電子基團選自活性酯類、烴基鹵化物、苄基鹵化物、醛、酮、羧基和馬來醯亞胺基團，條件是：當親電子基團來自所述抗原結合蛋白時，所述親電子基團優選自醛、酮、羧基和馬來醯亞胺基團，更優選馬來醯亞胺基團；當親電子基團來自所述藥物時，所述親電子基團優選活性酯類、烴基鹵化物、馬來醯亞胺基團，更優選馬來醯亞胺基團；所述活性酯類優選NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯、酸性鹵化物，所述烴基鹵化物優選鹵代乙醯胺。

在本發明方法一個優選的實施方案中，其中所述親電子基團來自藥物自身，或來自於對藥物的修飾。

在本發明方法一個優選的實施方案中，其中所述偶聯反應選自離胺酸偶聯、輕重鏈間還原性二硫鍵偶聯、定點偶聯，優選離胺酸偶聯、輕重鏈間還原性二硫鍵偶聯。本發明中所述的輕重鏈間還原性二硫鍵偶聯，包括輕鏈和重鏈間的還原性二硫鍵偶聯，也包括重鏈和重鏈間的還原性二硫鍵偶聯。

在本發明方法一個優選的實施方案中，其中步驟1）中所述的抗原結合蛋白，在與離子交換載體接觸之前調節電導率至小於5 mS/cm。

在本發明方法一個優選的實施方案中，其中步驟1）中所述的抗原結合蛋白固定於離子交換載體上，在緩衝液中進行，所述緩衝液的pH為5.5-7.0，優選pH為6.3。其中所述緩衝液選自磷酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、琥珀酸鹽緩衝液，優選磷酸鹽緩衝液。

在本發明方法一個優選的實施方案中，其中步驟2）所述的偶聯反應中，通過藥物慢速流經離子交換載體，來控制藥物與抗原結合蛋白用量的莫耳比小於6:1，流速為0.2-2 ml/min。所述的反應溫度為室溫，10-37℃；整數或小數，非限制性實施例優選20-25℃；用於工業生產的常規溫度為25℃。在溫度偏高時，會增加多聚體的形成。

在本發明方法一個優選的實施方案中，其中步驟3）所述的洗脫包含使用不同鹽濃度的緩衝液依次進行分步洗脫，所述緩衝液的pH為5.0-6.5，優選為5.5。所述緩衝液選自磷酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、琥珀酸鹽緩衝液，優選檸檬酸鹽緩衝液。

在本發明方法一個優選的實施方案中，所述分步洗脫包含第一步洗脫和第二步洗脫，所述第一步洗脫的鹽濃度為100-140 mM，優選110 mM，所述第二步洗脫的鹽濃度為150-200 mM，優選180 mM。

在本發明還涉及一種優化的製備抗原結合蛋白-藥物偶聯物（ADC）的方法，該方法涉及將抗原結合蛋白與交聯劑結合產生親核基團，本發明中示例性實施例為實施例2、3、4、5、6；包括1）將抗原結合蛋白固定於離子交換載體上，以形成固定的抗原結合蛋白； 2）所述固定的抗原結合蛋白與藥物接觸，進行偶聯反應，以形成抗原結合蛋白-藥物偶聯物； 3）將抗原結合蛋白-藥物偶聯物從所述離子交換載體上洗脫下來；其中所述的步驟1）包括： a、使抗原結合蛋白與交聯劑結合，得到經過修飾的抗原結合蛋白； b、將經過修飾的抗原結合蛋白固定於離子交換載體上，以形成固定的抗原結合蛋白。在本發明方法一個優選的實施方案中，其中抗原結合蛋白與交聯劑結合的溫度為20-40℃。

在本發明方法一個優選的實施方案中，其中抗原結合蛋白與交聯劑的結合在pH為4.0-5.5的緩衝液中進行，優選的pH為4.3；所述緩衝液優選醋酸緩衝液，更優選含有乙腈的醋酸緩衝液。

在本發明方法一個優選的實施方案中，其中所述的步驟1）進一步包括步驟c： c、加入脫保護劑，所述脫保護劑優選NH₂ OH·HCL。

在本發明還涉及另一種優化的製備抗原結合蛋白-藥物偶聯物的方法，該方法涉及將抗原結合蛋白還原產生親核基團，本發明中示例性實施例為實施例9；包括1）將抗原結合蛋白固定於離子交換載體上，以形成固定的抗原結合蛋白； 2）所述固定的抗原結合蛋白與藥物接觸，進行偶聯反應，以形成抗原結合蛋白-藥物偶聯物； 3）將抗原結合蛋白-藥物偶聯物從所述離子交換載體上洗脫下來；其中所述的步驟1）包括： A、將抗原結合蛋白固定於離子交換載體上，以形成固定的抗原結合蛋白； B、加入還原劑，以還原所述固定的抗原結合蛋白的二硫鍵，產生巰基（親核基團巰基，用於與藥物偶聯）；其中所述還原劑優選自TCEP、DTT、巰基乙胺、Ac-Cys，更優選TCEP。所述的還原劑用量為4-8倍抗體莫耳濃度，優選6倍抗體莫耳濃度。

在本發明方法一個優選的實施方案中，其中步驟B的還原反應溫度為25-45℃，優選40℃。

本發明的方法中，藥物包括毒素（例如細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素或其片段）、化療劑、生長抑制劑、微管蛋白抑制劑、抗生素、放射性同位素和核溶酶的細胞毒劑；所述的藥物能夠以抑制腫瘤細胞的微管或斷裂DNA為機制除去腫瘤；所述的毒素選自但不限於小分子藥物，諸如喜樹鹼衍生物、加利車黴素（calicheamicin）、美登木素生物鹼（maytansinoids）、多拉司他汀（dolastatin）、澳瑞他汀、單端孢黴素（trichothecene）及這些藥物具有細胞毒活性的片段；所述藥物選自美登木素衍生物，優選自DM1、DM3、DM4；還可以選自奧瑞他汀衍生物，優選自MMAE、MMAF；也可以選自喜樹鹼類生物鹼，優選自CPT、10-羥基-CPT、CPT-11（伊立替康）、SN-38和托泊替康，更優選SN-38。

本發明的方法，所述抗原結合蛋白結合選自以下的一種或多種多肽：HER2、HER3、CD33、VEGF、VEGFR、VEGFR-2、CD152、CD40、TNF、IL-1、IL-5、IL-17、IL-6R、IL-1、IL-2R、BLYS、OX40L、CTLA4、PCSK9、EGFR、c-Met、CD2、CD3、CD11a、CD19、CD30、CD38、CD20、CD52、CD60、CD80、CD86、TNF-α、IL-12、IL-17、IL-23、IL-6、IL-1β、RSVF、IgE、RANK、BLyS、α4β7、PD-1、CCR4、SLAMF7、GD2、CD21、CD79b、IL20Rα、短縮素、CD22、CD79a、CD72、IGF-1R和RANKL。

本發明的方法中，所述抗原結合蛋白進一步可選自：Humira（阿達木單抗）、Avastin（貝伐單抗）、Erbitux（西妥昔單抗）、Herceptin（曲妥珠單抗）、Perjeta（帕妥珠單抗）、Vectibix（帕尼單抗）、泰欣生（尼妥珠單抗）、Yervoy（伊匹單抗）、Opdivo（納武單抗）、Lucentis（雷珠單抗）、Enbrel（依那西普）、Myoscint（噴替酸英西單抗）、ProstaScint（卡羅單抗噴地肽）、Remicade（英夫利昔單抗）、ReoPro（阿昔單抗）、Rituxan（利妥昔單抗）、Simulect（巴利昔單抗）、Synagis（帕利珠單抗）、Verluma（若莫單抗）、Xolair（奧馬珠單抗）、Zenapax（達利珠單抗）、Cimzia（賽妥珠單抗）、Zevalin（替伊莫單抗）、Orthoclone（莫羅單抗）、Panorex（依決洛單抗）、Mylotarg（吉姆單抗）、Soliris（依庫珠單抗）、CNTO1275（ustekinumab）、Amevive（阿法賽特）、Raptiva（伊伐珠單抗）、Tysabri（那他珠單抗）、Acternra（脫利珠單抗）、Orencia（阿巴西普）、Arcalyst（利洛納賽）、Stelara（優特克單抗）、Removab（卡妥索單抗）、Simponi（戈利木單抗）、Ilaris（康納單抗）、Arzerra（奧法木單抗）、Prolia（狄諾塞麥）、Benlysta（貝利單抗）、Nulojix（貝拉西普）、Eylea（阿柏西普）、Campath（阿侖單抗）、CEA-Scan阿西莫單抗（fab片段）、Poteligeo（mogamalizumab）、Abthrax（raxibacumab）、Gazyva（Obinutuzumab）、郎沐（康柏西普）、Cyramza（雷莫蘆單抗）、Sylvant（西妥昔單抗）、Entyvio（維多珠單抗）、Keytruda（帕母單抗）、Blincyto（Blinatumornab）、Cosentyx（蘇金單抗）、Unituxin（Dinutuximab）、Darzalex（Daratumumab）、Praluent（Alirocumab）、Repatha（Evolocumab）、Portrazza（Necitumumab）、Empliciti（Elotuzumab）、Nucala（美泊利單抗）、Praxbind（Idarucizumab）、Bexxar（托西莫單抗和I131托西莫單抗）。

在一些實施方案中，所述的抗原結合蛋白選自抗EGFR抗體或其抗原結合片段，所述抗EGFR抗體或其抗原結合片段優選包含序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7及其變體所示的LCDR1，LCDR2，LCDR3區，和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及其變體所示的HCDR1，HCDR2，HCDR3區，更優選的，包含序列SEQ ID NO:1所示的輕鏈，和SEQ ID NO:2所示的重鏈。 LCDR1：RSSQNIVHSNGNTYLD SEQ ID NO:5 LCDR2：KVSNRFS SEQ ID NO:6 LCDR3：FQYSHVPWT SEQ ID NO:7 HCDR1：NYYIY SEQ ID NO:8 HCDR2：GINPTSGGSNFNEKFKT SEQ ID NO:9 HCDR3：QGLWFDSDGRGFDF SEQ ID NO:10

SEQ ID NO:1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPWTFGQGTKLQITRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:2 QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

在另一些實施方案中，所述抗原結合蛋白還可以選自抗c-Met抗體或其抗原結合片段，所述c-Met抗體或其抗原結合片段優選的包含序列SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13及其變體所示的LCDR1，LCDR2，LCDR3區，優選LCDR1為SEQ ID NO:17，和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及其變體所示的HCDR1，HCDR2，HCDR3區，更優選的包含序列SEQ ID NO:3所示的輕鏈，和SEQ ID NO:4所示的重鏈。 LCDR1：RANKSVSTSTYNYLH SEQ ID NO: 11 LCDR2：LASNLAS SEQ ID NO: 12 LCDR3：QHSRDLPPT SEQ ID NO: 13 HCDR1：NYGVH SEQ ID NO: 14 HCDR2：VIWSGGSTNYAAAFVS SEQ ID NO: 15 HCDR3：NHDNPYNYAMDY SEQ ID NO: 16 優化的LCDR1：RADKSVSTSTYNYLH SEQ ID NO: 17

SEQ ID NO: 3 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRADKSVSTSTYNYLHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRDLPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 4 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLSNYGVHWVRQAPGKGLEWLAVIWSGGSTNYAAAFVSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARNHDNPYNYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

本發明的方法中，所述藥物是經過修飾或者沒有經過修飾的藥物，優選經過修飾；所述抗原結合蛋白是經過修飾或沒有經過修飾的抗原結合蛋白，優選所述抗原結合蛋白經過修飾；所述藥物和抗原結合蛋白之間的結合是通過親電子基團與親核基團的相互作用形成的，也可是親核基團與親電子基團的相互作用，修飾藥物和抗原結合蛋白所用的化學試劑可以是任何能夠使其形成上述兩種基團的物質，包括交聯劑，通過這些修飾能夠使抗原結合蛋白與藥物之間形成有效的連接物（linker），進而形成ADC藥物。

本發明的方法中，所述linker能夠有效連接抗原結合蛋白和藥物，且合成的ADC藥物能夠在人體中自我斷裂、無毒副作用、發揮藥物對腫瘤細胞的高效殺傷作用。

在ADC藥物的治療過程中，linker起著重要的作用，它既要保證藥物在血液流動中的穩定性，又要保證藥物能夠在腫瘤細胞內快速高效的釋放。目前ADC藥物中使用的linker主要有兩類：可裂解的和不可裂解的。可裂解的linker是指在細胞內包涵體或溶酶體中通過酸性水解或特定蛋白酶切割而釋放毒素藥物；不可裂解的linker需要溶酶體對內吞進細胞的ADC進行消化降解後釋放小分子藥物。可裂解linker有：酸性條件下裂解的腙鍵linker、在穀胱甘肽等還原性物質作用下水解的二硫鍵linker、蛋白酶水解的多肽linker（Val-Cit、Phe-Lys）和β葡萄糖苷linker等；不可裂解linker主要包括可以形成硫醚鍵的linker等。上述可裂解linker和不可裂解linker均適用於本發明的方法，優選不可裂解linker。

本發明的方法中，形成linker使用的交聯劑可以是同型雙功能交聯劑，優選氨基-氨基交聯劑，該交聯劑分子兩端具有兩個相同的活化反應基團，主要為N-羥基琥珀醯亞胺酯和亞氨酸酯，可以與蛋白表面鹼性胺基酸游離的伯胺反應，例如：琥珀醯亞胺類的雙琥珀醯亞胺戊二酸酯（DSG）、3,3'-二硫代二丙酸二（N-羥基丁二醯亞胺酯）（DSP）等，亞氨酸酯類的3,3'-二硫代雙丙亞氨酸二甲酯（DTBP）。

（DSG）

（DSP）

（DTBP）

還可以是異型雙功能交聯劑，該交聯劑分子兩端具有兩個不同的活化反應基團，可與不同類型的其他基團反應，主要包括N-羥基琥珀醯亞胺-馬來醯亞胺類和N-羥基琥珀醯亞胺-二巰基吡啶類，例如N-羥基琥珀醯亞胺-馬來醯亞胺類的SMCC、LC-SMCC、KMUA、GMBS、EMCS、MBS、AMAS、SMPH、SMPB、和PMPI，N-羥基琥珀醯亞胺-二巰基吡啶類的N-琥珀醯亞胺3-（2-吡啶二硫代）丙酸酯（SPDP）、琥珀醯亞胺 4-（1-（吡啶-2-基二硫醚基）乙基）苯甲酸酯（SMPT）。

（SPDP）

（SMPT）

還可以是另一種異型雙功能交聯劑，即羧基-氨基交聯劑，該交聯劑主要為碳二亞胺類，用於C末端和酸性胺基酸羧基及N末端和鹼性胺基酸伯氨的偶聯；該交聯劑能將羧基與碳二亞胺生成加成產物中間體，再與氨基反應形成醯胺鍵。主要包括二環己基碳二亞胺（DCC）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）。

（DCC）

（EDC）

還可以是另一種異型雙功能交聯劑，具有鹵代乙醯基的部分的交聯劑，主要包括SIAB、SIA、SBA和SBAP。

本發明中通過離子交換載體製備抗體-藥物偶聯物的某些方法，對於抗體與藥物的結合，可以採用本領域技術人員知道的有機化學反應、條件和試劑通過數種路徑來完成，包括：（1）抗體經共價鍵與交聯劑反應形成帶有親核基團或親電子基團的抗體-交聯劑結合產物，接著與藥物的親電子基團或親核基團反應；和（2）藥物的經共價鍵與交聯劑反應形成帶有親核基團或親電子基團的藥物-交聯劑結合產物，接著與抗體的親電子基團或親核基團反應；和（3）抗體經過修飾之後形成帶有親核基團，之後與帶有親電子基團的藥物結合。上述抗體和藥物的親核基團或親電子基團任選地可以經過化學試劑或交聯劑的修飾產生，所述的化學試劑無任何限制。

本發明所述抗原結合蛋白的親核基團包括但不限於巰基、羥基、醯肼、肟、肼、縮氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基醯肼基團，優選巰基；所述抗原結合蛋白的親核基團能夠與交聯劑或藥物的親電子基團反應而形成共價鍵，所述交聯劑或藥物的親電子基團選自活性酯類、烴基鹵化物、苄基鹵化物、醛、酮、羧基和馬來醯亞胺基團，優選烴基鹵化物、馬來醯亞胺基團，更優選馬來醯亞胺基團；所述活性酯類優選NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯、酸性鹵化物，所述烴基鹵化物優選鹵代乙醯胺。或者所述抗原結合蛋白具有親電子基團，所述親電子基團選自醛、酮、羧基和馬來醯亞胺基團，優選馬來醯亞胺基團；其中所述藥物具有親核基團，所述親核基團選自巰基、羥基、醯肼、肟、肼、縮氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基醯肼基團，優選巰基；上述抗原結合蛋白與上述藥物結合形成ADC。

本發明所述抗原結合蛋白的親核基團還可以選自N末端氨基、側鏈氨基、側鏈巰基、糖基化抗原結合蛋白中糖的羥基或氨基，優選側鏈巰基，更優選半胱胺酸的巰基；其中所述藥物具有親電子基團，所述親電子基團選自活性酯類、烴基鹵化物、苄基鹵化物、醛、酮、羧基和馬來醯亞胺基團，優選烴基鹵化物、馬來醯亞胺基團，更優選馬來醯亞胺基團；所述活性酯類優選NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯、酸性鹵化物，所述烴基鹵化物優選鹵代乙醯胺。

本發明的方法中所述的抗體與藥物偶聯方式，可以採用離胺酸偶聯或輕重鏈間還原性二硫鍵隨機偶聯方式，也可以採用定點偶聯方式；不同的偶聯方式對抗體本身並沒有選擇性。

在一些實施方案中，所述藥物選自通式（Dr）所示的化合物：

或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其中： R，R¹ -R⁷ 選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、烷基、烷氧基和環烷基； R⁸ -R¹¹ 中至少一個選自鹵素、烯基、烷基和環烷基，其餘為氫原子；或者R⁸ -R¹¹ 之中的任意兩個形成環烷基，餘下的兩個基團任選自氫原子、烷基和環烷基； R¹⁴ 選自芳基或雜芳基，所述的芳基或雜芳基任選進一步被選自氫原子、鹵素、羥基、烷基、烷氧基和環烷基的取代基所取代； R¹² -R¹³ 選自氫原子、烷基或鹵素。

在一些實施方案中，所述（Dr）化合物在與抗原結合蛋白結合之前需經過修飾，優選其修飾後具有親電子基團，之後與帶有親核基團的抗原結合蛋白反應形成ADC；所述的親電子基團優選馬來醯亞胺基團或鹵代乙醯基的部分，更優選馬來醯亞胺基團，所述親核基團優選自巰基。

在一些實施方案中，所述（Dr）化合物在與抗原結合蛋白結合之前需經過修飾，優選其修飾後具有親核基團，之後與帶有親電子基團的抗原結合蛋白反應形成ADC；所述的親核基團優選巰基，所述抗原結合蛋白的親電子基團優選馬來醯亞胺基團或鹵代乙醯基。

在一些優選的實施方案中，所述藥物選自式（I）所示的化合物：

（I）

在一些優選實施方案中，所述（I）化合物在與抗原結合蛋白結合之前需經過修飾，優選其修飾後具有親電子基團，之後與帶有親核基團的抗原結合蛋白反應形成ADC；所述的親電子基團優選馬來醯亞胺基團或鹵代乙醯基的部分，更優選馬來醯亞胺基團，所述親核基團優選自巰基。

在一些優選實施方案中，所述（I）化合物在與抗原結合蛋白結合之前需經過修飾，優選其修飾後具有親核基團，之後與帶有親電子基團的抗原結合蛋白反應形成ADC；所述的親核基團優選巰基，所述抗原結合蛋白的親電子基團優選馬來醯亞胺基團或鹵代乙醯基。

在另一些實施方案中，所述修飾的藥物選自通式（L₁ -Dr）所示的化合物：

（L₁ -Dr）其中 L₁ 結構如下所示：

；優選為MC：

；具體地為：

（L₁ -Dr）其中 n為2-6，優選2-5； R，R² -R⁷ 選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、烷基、烷氧基和環烷基； R⁸ -R¹¹ 中至少一個選自鹵素、烯基、烷基和環烷基，其餘為氫原子；或者R⁸ -R¹¹ 之中的任意兩個形成環烷基，餘下的兩個基團任選自氫原子、烷基和環烷基； R¹² -R¹³ 選自氫原子、烷基或鹵素； R¹⁴ 選自芳基或雜芳基，所述的芳基或雜芳基任選進一步被選自氫原子、鹵素、羥基、烷基、烷氧基和環烷基的取代基所取代。

在另一些優選的實施方案中，所述藥物選自選式（II）所示的化合物：

（II）

本發明的方法中，優選採用離胺酸偶聯的方式，通過離子交換載體固定抗原結合蛋白實現固相製備ADC藥物，其中使用交聯劑對抗體進行修飾之後再與藥物結合形成ADC。所述的修飾包含任選地在所述抗原結合蛋白固定於所述離子交換載體之前或之後，優選在所述抗原結合蛋白固定於所述離子交換載體之前。

在本發明方法一個優選的實施方案中，其中步驟1）中所述抗原結合蛋白，任選經過修飾的抗原結合蛋白或不經過修飾的抗原結合蛋白，優選經過修飾的抗原結合蛋白；所述經過修飾的抗原結合蛋白任選使所述抗原結合蛋白與化學試劑或交聯劑結合，優選與交聯劑結合的經過修飾的抗原結合蛋白；其中步驟2）中所述藥物任選地經過修飾或不經過修飾，優選經過修飾。

在一些實施方案中，在抗原結合蛋白與離子交換載體結合之前使用交聯劑對所述抗原結合蛋白進行修飾，接著將修飾過的抗原結合蛋白固定於離子交換載體，再與藥物結合形成ADC。

在一個實施方案中，所述交聯劑具有通式（L2）所示的化合物：

（L₂ ） T選自H、叔丁基、乙醯基、正丙醯基、異丙醯基、三苯基甲基、甲氧基甲基、2-（三甲矽烷基）乙氧甲基，優選為H或乙醯基； R¹⁵ 選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、烷基、烷氧基和環烷基； R¹⁶ 選自烷基、環烷基和雜環基； m為0-5，優選1-3；其中所述藥物具有親電子基團，所述親電子基團選自活性酯類、烴基鹵化物、芐基鹵化物、醛、酮、羧基和馬來醯亞胺基團，優選烴基鹵化物、馬來醯亞胺基團，更優選馬來醯亞胺基團；所述活性酯類優選NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯、酸性鹵化物，所述烴基鹵化物優選鹵代乙醯胺。

在一個優選的實施方案中，所述修飾的藥物選自通式（L₁ -Dr）所示的化合物。

在一個優選的實施方案中，所述藥物選自式（II）所示的化合物。

在另一個實施方案中，所述交聯劑具有馬來醯亞胺基團或鹵代乙醯基的部分；其中所述具有馬來醯亞胺基團的交聯劑優選自SMCC、LC-SMCC、KMUA、GMBS、EMCS、MBS、AMAS、SMPH、SMPB、和PMPI，更優選SMCC；其中所述具有鹵代乙醯基的部分的交聯劑優選自SIAB、SIA、SBA和SBAP，更優選SIAB；其中所述藥物具有親核基團，所述親核基團優選自巰基、羥基、醯肼、肟、肼、縮氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基醯肼基團，更優選巰基。

本發明的方法中，還可通過還原抗體的鏈間二硫鍵，即半胱胺酸橋，形成巰基，之後與帶有親電子基團的藥物反應形成ADC；所述的藥物可以是自身帶有親電子基團或者經過化學試劑的修飾具有親電子基團，或者經過交聯劑的修飾具有親電子基團。

在一些實施方案中，加入還原劑以還原固定於離子交換載體上的抗原結合蛋白；其中所述還原劑優選自但不限於三（2-羧乙基）膦（TCEP）、二硫蘇糖醇（DTT）、巰基乙胺、乙醯半胱胺酸（Ac-Cys），更優選三（2-羧乙基）膦（TCEP）；其中所述藥物具有親電子基團，所述親電子基團優選自活性酯類、烴基鹵化物、苄基鹵化物、醛、酮、羧基和馬來醯亞胺基團，優選烴基鹵化物、馬來醯亞胺基團，更優選馬來醯亞胺基團；所述活性酯類優選NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯、酸性鹵化物，所述烴基鹵化物優選鹵代乙醯胺；所述藥物本身帶有親電子基團或經過修飾後帶有親電子基團，所述修飾包括使用化學試劑或交聯劑進行修飾。

在一個實施方案中，所述還原劑選自三羰基乙基膦（TCEP），所述的藥物經過交聯劑修飾後具有親電子基團，所述交聯劑具有馬來醯亞胺基團，其中所述具有馬來醯亞胺基團的交聯劑優選自SMCC、LC-SMCC、KMUA、GMBS、EMCS、MBS、AMAS、SMPH、SMPB、和PMPI，更優選SMCC。

在一個優選的實施方案中，所述還原劑選自三（2-羧乙基）膦（TCEP），所述交聯劑具有鹵代乙醯基的部分；其中所述鹵代乙醯基的部分的交聯劑優選自SIAB、SIA、SBA和SBAP，更優選SIAB。

在另一個實施方案中，所述還原劑選自三（2-羧乙基）膦（TCEP），所述的藥物經過化學試劑修飾後具有親電子基團，所述藥物選自通式（Dr）所示的化合物。

在另一個優選的實施方案中，所述藥物選自式（I）所示的化合物。

在另一個實施方案中，所述還原劑選自三（2-羧乙基）膦（TCEP），所述的藥物自身具有親電子基團，所述藥物選自通式（L₁ -Dr）所示的化合物。

在另一個優選的實施方案中，所述藥物選自式（II）所示的化合物。

本發明中抗原結合蛋白與藥物相互作用的基團主要是巰基和馬來醯亞胺（或鹵代乙醯基），二者形成了硫醚鍵的結構，屬於不可裂解linker。為了形成目標linker，可採用交聯劑修飾抗原結合蛋白或藥物，之後與具有反應活性的基團作用形成抗體藥物偶聯物。只要能夠使抗原結合蛋白與藥物穩定連接的交聯劑均適用於本發明。抗原結合蛋白與藥物連接的基團位置是可以互換的，並且硫醚鍵的形成還可以採用鹵代乙醯基與自由巰基反應獲得。

本發明的方法中，採用離子交換載體製備ADC的方法包括如下的步驟：通過交聯劑修飾所述抗原結合蛋白（例如抗體），將抗原結合蛋白固定於離子交換載體上，以形成固定的抗原結合蛋白；固定的抗原結合蛋白與藥物接觸，以形成抗原結合蛋白-藥物偶聯物；將抗原結合蛋白-藥物偶聯物從所述離子交換載體上洗脫下來。

在一個實施方案中，所述交聯劑選自式（L₃ ）所示的化合物，所述抗原結合蛋白包含序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7及其變體所示的LCDR1，LCDR2，LCDR3區，和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及其變體所示的HCDR1，HCDR2，HCDR3區，所述藥物選自式（II）所示的化合物。

（L₃ ）

在一個優選的實施方案中，所述交聯劑選自式（L₃ ）所示的化合物，所述抗原結合蛋白包含序列SEQ ID NO:1所示的輕鏈，和SEQ ID NO:2所示的重鏈，所述藥物選自式（II）所示的化合物。

在另一個實施方案中，所述交聯劑選自式（L₃ ）所示的化合物，所述抗原結合蛋白，包含序列SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13及其變體所示的LCDR1，LCDR2，LCDR3區，優選LCDR1為SEQ ID NO:17，和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及其變體所示的HCDR1，HCDR2，HCDR3區，所述藥物選自式（II）所示的化合物。

在另一個優選的實施方案中，所述交聯劑選自式（L₃ ）所示的化合物，所述抗原結合蛋白包含序列如SEQ ID NO:3所示的輕鏈，和如SEQ ID NO:4所示的重鏈，所述藥物選自式（II）所示的化合物。

優選的實施方案包含如下步驟：（i）利用離胺酸偶聯的機制，在還原劑的作用下使交聯劑對離胺酸進行修飾，使得抗體上離胺酸側鏈的氨基（-NH₂ ）與交聯劑末端的醛基發生還原胺化反應生成抗體-交聯劑結合物，除去遊離的交聯劑；（ii）平衡陽離子交換柱，採用交聯劑潤洗柱子，平衡，將抗體-交聯劑結合物上樣至離子交換柱，三次沖洗；（iii）交聯劑末端的脫保護反應；（iv）平衡，毒素上樣離子交換柱，二次沖洗，二次洗脫，再生。

本發明製備ADC的另外的方法，採用還原鏈間二硫鍵的方法將抗原結合蛋白與藥物偶聯。在抗原結合蛋白固定於離子交換載體之後包含加入還原劑的步驟，使抗原結合蛋白的二硫鍵被還原成自由巰基，再與帶有馬來醯亞胺基團或鹵代乙醯基的藥物反應形成硫醚鍵連接的ADC藥物。

在一個實施方案中，所述還原劑選自三（2-羧乙基）膦（TCEP），所述抗原結合蛋白包含序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7及其變體所示的LCDR1，LCDR2，LCDR3區，和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及其變體所示的HCDR1，HCDR2，HCDR3區，所述藥物選自式（II）所示的化合物。

在一個優選的實施方案中，所述還原劑選自三（2-羧乙基）膦（TCEP），所述抗原結合蛋白包含序列SEQ ID NO:1所示的輕鏈，和SEQ ID NO:2所示的重鏈，所述藥物選自式（II）所示的化合物。

在另一個實施方案中，所述還原劑選自三（2-羧乙基）膦（TCEP），所述抗原結合蛋白，包含序列SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13及其變體所示的LCDR1，LCDR2，LCDR3區，優選LCDR1為SEQ ID NO:17，和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及其變體所示的HCDR1，HCDR2，HCDR3區，所述藥物選自式（II）所示的化合物。

在另一個優選的實施方案中，所述還原劑選自三（2-羧乙基）膦（TCEP），所述抗原結合蛋白包含序列SEQ ID NO:3所示的輕鏈，和SEQ ID NO:4所示的重鏈，所述藥物選自式（II）所示的化合物。

優選的實施方案包含如下步驟：（i）採用鏈間二硫鍵的偶聯策略，以陽離子交換樹脂作為固定載體，平衡柱子，上抗體樣品，沖洗，加入還原劑以還原抗體鏈間的二硫鍵；（ii）毒素上樣離子交換柱，二次沖洗，二次洗脫，再生。

在一些實施方案中，所述的還原劑還原抗體鏈間二硫鍵的反應溫度為25-45℃，優選40℃。

本發明所有的實施方案中，抗原結合蛋白與載體的結合均經過孵育過程，孵育溫度為10℃-37℃，優選25℃，整數或小數，非限制性實施例可以是10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃。

進一步抗原結合蛋白與載體的結合在一定的緩衝液中進行，緩衝液的pH為5.5-7.0，優選pH為6.3，所述緩衝液選自但不限於磷酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、琥珀酸鹽緩衝液，優選磷酸鹽緩衝溶液。

進一步，抗原結合蛋白與載體結合時採用優化後的上樣流速，所述流速控制在0.1-0.5 ml/min，具體的實驗中根據所用的離子交換載體的填料量調節。

進一步，在抗原結合蛋白與離子交換載體結合之前需要調節抗原結合蛋白溶液的電導率，使其控制在5 mS/cm的範圍內。

進一步，固定於離子交換載體上的抗原結合蛋白與藥物的結合是在離子交換柱上進行的。為了減少反應中藥物的使用量，使藥物慢速流經離子交換載體；藥物與抗原結合蛋白的莫耳比為6、5、4、3、2、1，優選6，優選的流速為0.2 ml/min。

進一步，抗原結合蛋白與藥物結合後，需要從離子交換載體上洗脫下來，洗脫過程採用緩衝液的pH為5.0-6.5，優選pH為5.5；緩衝液選自但不限於磷酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、琥珀酸鹽緩衝液，優選檸檬酸緩衝液；緩衝液的濃度為10-50 mM，優選為20 mM。

進一步，為了分離合成的ADC藥物中含有高聚體抗體，採用了分步洗脫的方式。洗脫過程採用的檸檬酸鹽緩衝液中含有NaCl，第一步洗脫緩衝液中NaCl的濃度為100-140 mM，優選110 mM。

進一步，在第二步的洗脫過程中，緩衝液中含有150-200 mM的NaCl，優選180 mM。

在一些實施方案中，抗原結合蛋白與交聯劑的結合在溫度為20℃-40℃的條件下進行，整數或小數，非限制性實施例優選20℃、22℃、24℃、28℃、32℃、36℃，更優選28℃，具體的試驗中可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃。

進一步，抗原結合蛋白與交聯劑的結合在pH為4.0-5.5的緩衝液中進行，優選的pH為4.3；所述緩衝液優選醋酸緩衝液，更優選含有乙腈的醋酸緩衝液。

進一步，對於具有保護基團的交聯劑，在其與抗原蛋白結合後，需要將該交聯劑的保護基團去除，從而使其能夠與藥物結合；所述的脫保護劑可選自但不限於NH₂ OH·HCL，脫保護劑的濃度範圍是10-50 mM，優選20 mM。

本發明的方法中，抗原結合蛋白與載體的結合、抗原結合蛋白與藥物的結合以及抗原結合蛋白與藥物偶聯產物的洗脫都是在離子交換柱上實現的。

本發明的方法中，可以選擇性的包含一個潤洗步驟，採用含有交聯劑的緩衝液潤洗離子交換柱，封閉離子交換填料基質的疏水性，以防止具有疏水性的藥物與基質結合，從而導致ADC藥物難以洗脫；如果採用親水性的離子交換填料基質，如瓊脂糖類，會導致基質與抗體表面的離胺酸殘基反應，從而阻斷了藥物與抗體的偶聯。因此，在離胺酸偶聯策略下，優先選擇疏水性基質的離子交換填料。

[發明詳述]

為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見外，在本文件中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。

本文使用的術語「人源化抗體」，也稱為CDR移植抗體（CDR-grafted antibody）人源化，是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。

術語「鼠源抗體」為根據本領域知識和技能用小鼠製備的抗人的單株抗體。製備時用抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的雜交瘤。所述的鼠源抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。

術語「人抗體」是指具有以下胺基酸序列的抗體，所述胺基酸序列對應於通過人或人細胞產生的或來源於利用人抗體庫或其它人抗體編碼序列的非人來源的抗體的胺基酸序列。人抗體的該定義特別排除了包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。

術語「嵌合抗體」是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的雜交瘤，然後從小鼠雜交瘤細胞中複製可變區基因，再複製到人抗體的恆定區基因，進行重組表達。

術語「單鏈抗體」是指由抗體重鏈可變區和輕鏈可變區通過15～20個胺基酸的短肽連接而成。單鏈抗體是利用基因工程技術在大腸桿菌中表達的人工合成抗體，只有完整抗體的一條鏈。

本發明所述的「抗體」是指表現出所需生物學活性的任何形式的抗體。因此，它以最廣義使用，具體地說，包括但不限於全長抗體，抗體結合片段或衍生物。抗體的來源包括但不限於單株抗體、多複製抗體、基因工程抗體（例如雙特異性抗體）。

術語「Fab片段」是指由一條完整的輕鏈和重鏈的VH和CH1功能區組成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。

術語「Fab’片段」包含一條輕鏈和重鏈的VH和CH1功能區，還包含在CH1與CH2結構域之間的區域，以致於可在兩個Fab’片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵，以形成F（ab’）2分子。

術語「F（ab’）2片段」包含二條輕鏈和含有CH1與CH2結構域之間的部分恆定區的兩條重鏈，以致於在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。因此，F（ab’）2片段由通過兩條重鏈之間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab’片段組成。

術語「scFv片段」是指通過基因工程方法產生單鏈可變區（ScFv），它是Fv類型片段，其包括了通過易彎曲多肽鏈接在一起的VH和VL區域。

術語「抗原結合蛋白」是能識別和結合目標細胞相關的抗原或受體的大分子化合物。抗原結合蛋白的作用是將藥物呈遞給與該抗原結合蛋白結合的目標細胞群，這些抗原結合蛋白包括但不限於蛋白類激素、凝集素、生長因子、抗體或其他能與細胞結合的分子，優選為抗體。

本發明的抗體指單株抗體或mAb，指由單一的複製細胞株得到的抗體；所述的細胞株不限於真核的，原核的或噬菌體的複製細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如雜交瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術，合成技術（如CDR-grafting），或其它現有技術進行重組得到。

本發明所述的抗體指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，其相應的重鏈分別為µ鏈，δ鏈，γ鏈，α鏈，ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。輕鏈通過恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中，每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。

抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區（V區）；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區（C區）。可變區包括3個高變區（HVR）和4個序列相對保守的骨架區（FR）。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區（CDR）。每條輕鏈可變區（LCVR）和重鏈可變區（HCVR）由3個CDR區4個FR區組成，從氨基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1，LCDR2，和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1，HCDR2和HCDR3。發明所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則（LCDR1-3，HCDE2-3），或者符合kabat和chothia的編號規則（HCDR1）。

「任選」或「任選地」意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，「任選包含1-3個抗體重鏈可變區」意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不是必須存在。

術語「交聯劑」是指一類小分子化合物，分子；兩端或分子結構中具有2個或更多的針對特殊基團（氨基、羧基、巰基等）的反應性末端，可以與2個或者多個其他分子進行偶聯，參與反應的各種分子以共價鍵的方式與交聯劑連接，整體結合形成一個新的分子。

術語「連接物（linker）」是指包含使抗原結合蛋白共價附著於藥物的共價鍵或原子鏈的化學模塊。所述的化學模塊由修飾抗原結合蛋白和藥物的修飾部分基團連接而成。

術語「電導率」是指水溶液在兩個電極之間傳導電流的能力。一般而言，導電性或比導電率是物質的傳導電流的度量。在溶液中，電流通過離子運輸來流動。因此，隨著水溶液中存在的離子數量的增加，溶液會具有更高的電導率。電導率的度量單位是mmhos（mS/cm），通過改變其中的離子濃度，可以改變溶液的電導率。例如，可以改變溶液中離子型賦形劑的濃度，以便實現希望的電導率。

術語「藥物」，指如毒素（例如細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素或其片段）、化療劑、生長抑制劑、微管蛋白抑制劑、抗生素、放射性同位素和核溶酶的細胞毒劑。

術語「毒素」指能夠對細胞的生長或增殖產生有害效果的任何物質。

術語「微管蛋白抑制劑」是指通過抑制微管蛋白的聚合或促進微管蛋白的聚合而干擾細胞的有絲分裂過程，從而發揮抗腫瘤作用的一類化合物。其非限制性實施例包括：美登素類、卡利奇黴素、紫杉烷類、長春新鹼、秋水仙鹼、尾海兔素/澳瑞他汀，優選自美登素類或尾海兔素/澳瑞他汀。

美登素類化合物是本領域習知的，而且可以依照已知方法從天然來源分離，或是使用遺傳工程技術生產（Yu et al. The biosynthetic gene cluster of the maytansinoid antitumor agent ansamitocin from Actinosynnema pretiosum. PNAS, 2002, 99: 7968–7973）。美登醇和美登醇類似物也可以依照已知方法合成製備。美登木素生物鹼藥物模塊的非限制性實施例包括：DM1；DM3；和DM4，正如專利WO2016127790A1中所公開的。

澳瑞他汀是全合成藥物，化學結構式相對容易改造，以便優化其物理性質和成藥特性。用於和抗體偶聯的澳瑞他汀衍生物主要包括單甲基澳瑞他汀E（MMAE）和單甲基澳瑞他汀F（MMAF），前者是又天然微管蛋白聚合酶抑制劑尾海兔素-10（dolastatin-10）衍生出的合成五肽，在C-端加上一個2-氨基-1-苯基丙基-1-醇而合成。MMAE對多種人類腫瘤細胞株的抑制活性小於1奈莫耳。為了降低MMAE自身細胞毒活性，MMAF在尾海兔素-10的C-端加上一個苯丙氨酸，因為在結構上引入一個羧基，MMAF的細胞膜通過性較差，因此對細胞的生物活性顯著降低，但是和抗體偶聯後對細胞的抑制活性大幅度提高（US7750116）。

CPT是喜樹鹼的縮寫，並且在本申請中CPT用於表示喜樹鹼本身或喜樹鹼的類似物或衍生物。具有所示的編號和用字母A-E標記的環的喜樹鹼和一些其類似物的結構以下式提供。 CPT：R₁ =R₂ =R₃ =H 10-羥基-CPT：R₁ =OH; R₂ =R₃ =H 伊立替康（CPT-11）：R₁ =

; R₂ =乙基；R₃ =H SN-38：R₁ =OH; R₂ =乙基；R₃ =H 托泊替康：R₁ =OH; R₂ =H；R₃ =CH-N（CH₃ ）₂

本文的「抗體-藥物偶聯物」可互換的稱為或「ADC」。

術語「自由巰基」在本發明中指含硫原子的結構基團，主要指藥物或毒素中的巰基、抗原結合蛋白的二硫鍵還原後暴露的巰基、抗原結合蛋白離胺酸或半胱胺酸上的巰基。

術語「硫醚鍵」是指一類具有通式-S-的結構鍵。

術語「還原劑」是在氧化還原反應裡，失去電子或有電子偏離的物質。還原劑本身在廣義上說也是抗氧化劑，具有還原性，被氧化，其產物叫氧化產物。在本發明的實施方式中，還原劑表示為RA，還原劑的非限制性實例包括：H₂ 、碳（C）、一氧化碳（CO）、還原鐵粉（Fe）、鋅粉（Zn）、鹼金屬（常用的有Li、Na、K）、其他活潑金屬（如Mg、Al、Ca、La等）、氯化亞錫（SnCl2）、草酸、硼氫化鉀（KBH₄ ）、硼氫化鈉（NaBH₄ ）、氰基硼氫化鈉（NaCNBH₃ ）、三乙醯氧基硼氫化鈉（（CH₃ COO）₃ BHNa）、氫化鋁鋰（LiAlH₄ ）、次磷酸、次磷酸鈉、硫代硫酸鈉（Na₂ S₂ O₃ ）、三（2-羧乙基）膦（TCEP）、二硫蘇糖醇（DTT）、巰基乙胺、乙醯半胱胺酸（Ac-Cys）。

本發明中的「陽離子交換載體」是指含有酸性交換基團的載體，包括強酸型陽離子交換載體和弱酸型陽離子交換載體。按載體的形式分，陽離子交換載體包括陽離子交換樹脂、陽離子交換膜、陽離子交換纖維，優選陽離子交換樹脂。強酸型陽離子交換載體，主要含有強酸性的反應基如磺酸基（－SO₃ H），此離子交換載體可以交換所有的陽離子。弱酸型陽離子交換載體，具有較弱的反應基如羧基（－COOH基）、磷酸基等，此離子交換載體僅可交換弱鹼中的陽離子如Ca²⁺ 、Mg²⁺ ，對於強鹼中的離子如Na⁺ 、K+等無法進行交換。強酸型陽離子交換樹脂的非限制性的實施例如: Millpore Fractogel SO₃ ；Millpore Eshmuno S；Millpore Eshmuno CPX；GE CaptoS Impact ；GE SP Sepharose Fast Flow；HiTrap TM Capto S ImpAct。弱酸型陽離子交換樹脂非限制性的實施例如: Millpore EMD COO- ；GE CM Sepharose Fast Flow。

術語「烷基」指飽和脂肪族烴基團，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團，優選含有1至12個碳原子的烷基，更優選含有1至10個碳原子的烷基，最優選含有1至6個碳原子的烷基。非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各種支鏈異構體等。更優選的是含有1至6個碳原子的低級烷基，非限制性實施例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，所述取代基優選為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、氧代基。

術語「環烷基」指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，環烷基環包含3至20個碳原子，優選包含3至12個碳原子，更優選包含3至10個碳原子，最優選包含3至8個碳原子。單環環烷基的非限制性實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環己二烯基、環庚基、環庚三烯基、環辛基等；多環環烷基包括螺環、稠環和橋環的環烷基。

術語「雜環基」指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，其包含3至20個環原子，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S（O）_m （其中m是整數0至2）的雜原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的環部分，其餘環原子為碳。優選包含3至12個環原子，其中1～4個是雜原子；更優選環烷基環包含3至10個環原子。單環雜環基的非限制性實例包括吡咯烷基、呱啶基、呱嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、高呱嗪基等。多環雜環基包括螺環、稠環和橋環的雜環基。

所述雜環基環可以稠合於芳基、雜芳基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜環基，其非限制性實例包括：

和

等。

雜環基可以是任選取代的或非取代的，當被取代時，取代基優選為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、氧代基。

術語「芳基」指具有共軛的π電子體系的6至14元全碳單環或稠合多環（也就是共享毗鄰碳原子對的環）基團，優選為6至10元，例如苯基和萘基，優選苯基。所述芳基環可以稠合於雜芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為芳基環，其非限制性實例包括：

和

。

芳基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基優選為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基。

術語「雜芳基」指包含1至4個雜原子、5至14個環原子的雜芳族體系，其中雜原子選自氧、硫和氮。雜芳基優選為5至10元，更優選為5元或6元，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。所述雜芳基環可以稠合於芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜芳基環，其非限制性實例包括：

和

。

雜芳基可以是任選取代的或非取代的，當被取代時，取代基優選為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基。

術語「烷氧基」指-O-（烷基）和-O-（非取代的環烷基），其中烷基或環烷基的定義如上所述。烷氧基的非限制性實例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基。烷氧基可以是任選取代的或非取代的，當被取代時，取代基優選為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基。

術語「烷氨基」指-N-（烷基）和-N-（非取代的環烷基），其中烷基或環烷基的定義如上所述。烷氨基的非限制性實例包括：甲氨基、乙氨基、丙氨基、丁氨基、環丙氨基、環丁氨基、環戊氨基、環己氨基。烷氨基可以是任選取代的或非取代的，當被取代時，取代基優選為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基。

術語「鍵」指用「—」表示的共價鍵。

術語「羥基」指-OH基團。

術語「鹵素」指氟、氯、溴或碘。

術語「羧酸酯基」指-C（O）O（烷基）或（環烷基），其中烷基、環烷基如上所定義。「任選」或「任選地」意味著隨後所描述的事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，「任選被烷基取代的雜環基團」意味著烷基可以但不必須存在，該說明包括雜環基團被烷基取代的情形和雜環基團不被烷基取代的情形。

「取代的」指基團中的一個或多個氫原子，優選為最多5個，更優選為1～3個氫原子彼此獨立地被相應數目的取代基取代。不言而喻，取代基僅處在它們的可能的化學位置，本領域技術人員能夠在不付出過多努力的情況下確定（通過實驗或理論）可能或不可能的取代。例如，具有游離氫的氨基或羥基與具有不飽和（如烯屬）鍵的碳原子結合時可能是不穩定的。

縮寫 MMAE=單甲基澳瑞他汀E（MW718） MMAF=澳瑞他汀E（MMAE）的變體，其在藥物的C-末端處有苯丙氨酸（MW731.5） DM1=N（2′）-脫乙醯基-N（2′）-（3-巰基-1-氧丙基）-美登素 DM3=N（2′）-脫乙醯基-N2-（4-巰基-1-氧戊基）-美登素 DM4=N（2′）-脫乙醯基-N2-（4-巰基-4-甲基-1-氧戊基）-美登素 SMCC=N-琥珀醯亞胺基4-（馬來醯亞胺甲基）環己烷羧酸酯 LC-SMCC=N-琥珀醯亞胺基-4-（N-馬來醯亞胺甲基）-環己烷-1-羧基-（6-醯氨基己酸酯 KMUA=κ-馬來醯亞胺十一烷酸N-琥珀醯亞胺基酯 GMBS=γ-馬來醯亞胺丁酸N-琥珀醯亞胺基酯 EMCS=ε-馬來醯亞胺己酸N-羥琥珀醯亞胺酯 MBS=m-馬來醯亞胺苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯 AMAS=N-（α-馬來醯亞胺乙酸基）-琥珀醯亞胺酯 SMPH=琥珀醯亞胺基-6-（β-馬來醯亞胺丙醯胺基）己酸酯 SMPB=N-琥珀醯亞胺基4-（p-馬來醯亞胺苯基）-丁酸酯 PMPI=N-（p-馬來醯亞胺苯基）異氰酸酯 SIAB=N-琥珀醯亞胺基-4-（碘乙醯基）-氨基苯甲酸酯 SIA=N-琥珀醯亞胺基碘乙酸酯 SBA=N-琥珀醯亞胺基溴乙酸酯 SBAP=N-琥珀醯亞胺基3-（溴乙醯氨基）丙酸醋

[本發明化合物的合成方法]

為了完成本發明的目的，本發明採用如下技術方案：

方案一

本發明還提供一種通式ADC-1的製備方法，所述的步驟包括上述的步驟1）中的a步驟（如實施例2），b步驟（如實施例4），c步驟（如實施例5），步驟2）和步驟3）（如實施例6）；具體如下：

其中所述的mAb為本發明所述的抗原結合蛋白，L₁ -Dr和L2的定義如通式（L₂ ），和通式（L₁ -Dr）中所述。

本發明製備的通式ADC-1所示的非限制性實施例如下：

其中所述的mAb為實施例2中所述的EGFR抗體和實施例11中所述的c-Met抗體。

方案二

本發明還提供一種通式ADC-2的製備方法（示例性實施例如實施例9），所述的步驟包括上述的步驟1）中的A步驟，B步驟，步驟2）和步驟3）；具體如下：

其中所述的mAb為本發明所述的抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白是通過步驟1）中的A步驟固定於離子載體上，進行還原反應，進一步與藥物發生偶聯反應；L₁ -Dr的定義如通式（L₁ -Dr）中所述。

本發明製備的通式ADC-2所示的非限制性實施例如下：

其中所述的mAb為實施例9中所述的EGFR抗體和實施例11中所述的c-Met抗體。

本發明的有益效果為： 1、本發明通過離子交換樹脂與抗體類生物分子形成靜電相互作用，實現生物分子的固定，從而避免了生物分子在偶聯過程中因相互碰撞而引起聚集的現象。 2、本發明的製程步驟簡單，操作方便，可實現程序化控制，避免人為的誤差，提高了生產效率。 3、通過對抗體等生物分子的固定，實現了有機溶劑的零存留，減少了藥物的副作用。 4、借助優化洗脫條件，可以有效的控制（藥物抗體結合比例）DAR值在需要的範圍內，同時分離除去含高聚體的抗體蛋白偶聯藥物。 5、該生產製程條件溫和，避免對抗體等生物分子造成的機械損傷，保證了抗體的完整性。 6、該製程可以降低毒性小分子的濃度和使用量，減小了操作中對人體的毒性和環境的污染。 7、該製程可以省去抗體純化過程中的陽離子純化步驟，提高了純化的效率。 8、借助離子交換載體合成ADC藥物，降低了生產成本，處理樣品量大，預計每升填料可以處理抗體等生物分子不低於50 g，有助於生產上批量化放大。

以下將結合實施例更詳細地解釋本發明，本發明的實施例僅用於說明本發明的技術方案，本發明的實質和範圍並不局限於此。本發明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照有利於生產的常規條件；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

實施例1、EGFR抗體的構建和表達

EGFR抗體mAb001為尼妥珠單抗通過點突變獲得的尼妥珠單抗修飾IgG1-YTE變體。

設計引物PCR搭建抗體VH/VK基因片段，再與表達載體pHr（帶信號肽及恆定區基因（CH1-FC/CL）片段）進行同源重組，構建抗體全長表達載體VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr。質粒原始形式為IgG1，通過點突變獲得IgG1-YTE抗體形式即M258Y/S260T/T262E（YTE）三個位點突變。最終EGFR抗體mAb001序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。質粒經過測序驗證後通過領域內熟知的方法提取並進行293細胞瞬轉表達獲得含有目的抗體蛋白的培養上清供分離純化。

mAb001的抗體序列： mAb001輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPWTFGQGTKLQITRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC mAb001重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:2 QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL Y I T R E PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 註：雙下劃線即代表YTE突變位點。

mAb001抗體純化分析：將上述細胞培養上清高速離心去除雜質後上Protein A柱親和層析。用PBS沖洗柱子，至A280讀數降至基線。用100 mM乙酸鈉pH 3.0洗脫目的蛋白，用1 M Tris-HCl中和。洗脫樣品適當濃縮後進一步利用PBS平衡好的凝膠層析柱Superdex200（GE）進行分子篩提純，合併收集抗體單體所在吸收峰樣品。通過領域內熟知的超濾方法可以對樣品進行濃縮或者緩衝液置換，獲得最終合適濃度的樣品。

實施例2、單株抗體EGFR抗體與交聯劑的還原胺化反應

利用離胺酸偶聯的機理，將20 mg/ml的單株抗體mAb001原液置換至修飾反應緩衝液（100 mM醋酸+10%乙腈，pH4.3）中，加入0.65-1.7 mM雙功能交聯試劑3-乙醯巰基（ATPPA）和25 mM還原劑氰基硼氫化鈉（NaBH₃ CN），在溫度24-36℃範圍內，100 rpm的攪拌作用下，對離胺酸進行修飾，反應持續2小時。使得單株抗體上的氨基（-NH₂ ）與交聯劑末端的醛基發生還原胺化反應生成中間體I，反應方程式見圖1。在不同的溫度反應條件下，LAR值和生成的mAb-交聯劑的含量有所差別，見表1，其中使用交聯劑和抗體的莫耳比為6。通過超濾（UF）系統除去游離的交聯劑，並將中間體I置換於新的緩衝液（20 mM磷酸鹽緩衝液，pH 6.3）中，待用。通過對交聯劑與單株抗體的莫耳濃度比進行優化，得到曲線圖（見圖2），即交聯劑與單株抗體用量比控制在8:1，溫度28℃，反應2小時，可以控制產物中交聯劑與單株抗體的偶聯比（LAR）在3.5附近。

3-乙醯巰基（ATPPA）表1 不同溫度作用下對mAb001和交聯劑結合的影響

實施例3、交聯劑潤洗離子交換柱

以離胺酸偶聯策略合成ADC製程中，採用了MercK Millipore的陽離子交換樹脂Fractogel®SO3（M）1 ml作為載體合成ADC，按以下步驟用交聯劑封閉強疏水性的基質。 1) 平衡：用100 mM醋酸緩衝液（含5%乙腈，pH4.3），以0.2 ml/min的流速5倍柱體積（CV）流經1 ml的陽離子交換柱子MilliporeSO₃ （M）。 2) 潤洗：用上述醋酸平衡液配製650 mM的3-乙醯巰基（ATPPA）溶液，以0.2 ml/min的流速20 CV潤洗平衡柱子。

實施例4、連接有交聯劑的抗體與離子交換柱的結合 1) 平衡：利用強陽離子（-SO₃ ）交換性樹脂作為介質，平衡緩衝液在0.2 ml/min的流速下，沖洗5 CV。 2) 上樣：控制中間體Ⅰ溶液的電導率在5 mS/cm以內，用1 M檸檬酸和1 M Tris調pH至6.3，在0.2 ml/min的流速下，流經離子交換柱，載量控制在10-50 mg/ml。 3) 沖洗：用3 CV平衡緩衝液沖洗柱子。 4) 再次沖洗：用3 CV的反應緩衝液（100 mM醋酸緩衝液+5%乙腈，pH 4.3），在0.2 ml/min的流速下徹底洗去離子交換柱上累積的離子。 5) 三次沖洗：用5 CV平衡緩衝液在0.2 ml/min流速下除去乙腈。

實施例5、交聯劑末端的脫保護反應

結合在離子交換柱上的中間體Ⅰ含有帶著末端保護基團的交聯劑，需要用脫保護劑鹽酸羥胺（NH2OH·HCL）將帶著保護基團的末端轉變為自由巰基，以便與後續的毒素結合。用平衡緩衝液配製20 mM的鹽酸羥胺溶液，以0.2 ml/min的流速12 CV沖洗柱子，徹底還原交聯劑末端的巰基生成中間體II，反應方程式見圖3。反應終止後，直接用5 CV平衡緩衝液，0.2 ml/min沖洗柱子。

實施例6、抗體與毒素的偶聯結合

本實驗中用到的毒素結構如下：

毒素可按照專利申請WO2016127790A1中的方法製備。在結合毒素的過程中，需要用到新的反應緩衝液（20 mM磷酸鹽緩衝液+5%乙腈，pH 6.3），用該緩衝液配製10 mM的毒素溶液，大約40 CV的用量，整個過程見圖4。 1) 平衡：新的緩衝液（20 mM磷酸鹽緩衝液+5%乙腈，pH 6.3）以0.2 ml/min的流速5 CV的量來平衡結合了中間體Ⅱ的離子交換柱。 2) 上樣：以流速0.2 ml/min，將30-50 CV的10 mM的毒素流經離子交換柱，室溫反應。 3) 沖洗：用緩衝液（20 mM磷酸鹽緩衝液+5%乙腈，pH 6.3）在0.2 ml/min的流速下，5 CV沖洗反應過程中沒有結合上的毒素。 4) 二次沖洗：用平衡緩衝液（100 mM磷酸鹽緩衝液，pH 6.3）在0.2 ml/min的流速下，5 CV沖洗殘留的乙腈。 5) 洗脫：用15 CV的洗脫緩衝液（20 mM檸檬酸+110 mM NaCl，pH 5.5），控制流速在0.2 ml/min下進行洗脫。 6) 二次洗脫：用15 CV的洗脫緩衝液（20 mM檸檬酸+180 mM NaCl，pH 5.5），控制流速在0.2 ml/min洗脫可能產生的多聚體。整個洗脫層析見圖5，相關數據分析見表2。 7) 再生：用1 M NaOH，5 CV的用量，在0.2 ml/min的流速下再生離子交換柱。結果，本發明示例性地得到的ADC結構如下：

表2 不同階段洗脫峰的性質分析

標注：①對於離胺酸偶聯策略，數據來源於MS的分析結果；對於鏈間二硫鍵的偶聯策略，數據來源於HIC的分析結果；②數據來源於SEC的分析結果

實施例7、尺寸排阻色譜（SEC）分析方法

在製備ADC藥物的過程中，只有得到單株抗體和毒素的偶聯物才具有真正的療效性，為了分析ADC藥物中有效成分的含量，使用Waters X Bridge® BEH SEC柱（PN: 186007640; SN: 01143613316121; Size: 7.8×300 mm, 200 Å， 3.5 μm），預裝柱（PN: 186007638; SN: 01093616216101; Size: 7.8×30 mm, 200 Å, 3.5 μm），流動性為100 mM，pH 6.7磷酸鹽緩衝液，包含20 mM硫酸鈉，3%（V/V）異丙醇。對層析結果中不同的洗脫峰分別進行了SEC分析。在0.5 ml/min流速下，檢測280 nm處的吸收峰，進樣量為100 μg蛋白，結果見圖7。

實施例8、質譜分析小分子藥物毒素與抗體的偶聯比（DAR）

對上述陽離子交換柱洗脫的ADC藥物（峰A）進行處理，在500-5000 m/z範圍內的正離子ESI模式下，通過Waters Xevo G2-XS Q-TOF（沃特世公司，米爾福德，馬薩諸塞州）獲得脫糖ADC分子的質譜數據。去溶劑氣體的溫度是450℃，氣體流速是800 L/hr，離子源溫度為120℃，毛細管電壓分別是3000 V。使用UNIFI軟件版本1.8中的最高熵去卷積算法將原始數據轉化為零電荷質譜。mAb001抗體的分子量為147458 Da，交聯劑的分子量為132 Da，毒素的分子量為955 Da。脫糖ADC分子的進樣量為1 μg，毒素藥物與抗體偶聯比（DAR）計算公式為:

註：DAR：毒素與抗體的偶聯比；Vn：抗體偶聯n個藥物分子的峰面積；n=0, 1, 2, 3 ... （n≥0）

毒素藥物與抗體的偶聯比（DAR）對ADC藥物的療效至關重要，而交聯劑結合上單株抗體的偶聯比（LAR）直接影響到後續的DAR。如圖8為EGFR抗體的與交聯劑結合，LAR值3.58的質譜分析圖，圖9為EGFR抗體的ADC偶聯藥物，DAR值2.59的ADC藥物質譜分析圖。

實施例9、單株抗體EGFR抗體鏈間二硫鍵的還原反應

對於鏈間二硫鍵的偶聯策略，不同於離胺酸偶聯機制。EGFR抗體在與載體結合前，二硫鍵是未打開的，選用親水性的載體基質是不會和二硫鍵相互作用的，因此採用了GE公司的陽離子交換樹脂HiTrap TM Capto S ImpAct 1 ml作為固定載體，該載體的基質為親水性的瓊脂糖。

用含有2 mM EDTA的20 mM pH 6.3磷酸緩衝液作為平衡液，在0.2 ml/min流速下平衡柱子；之後以同樣的流速上EGFR單抗樣品60 CV，控制載量在20 mg；平衡緩衝液繼續沖洗，除去未結合上的單抗或雜質；接著將離子交換柱轉入40℃的保溫夾層中（保證還原劑TCEP和EGFR抗體的作用是在40℃進行）；將6倍抗體莫耳濃度的還原劑TCEP溶解在平衡緩衝液中，在0.2 ml/min流速下，緩慢流過柱子24 CV；還原反應結束後，立即將離子交換柱取出保溫夾層，置於室溫（20-25℃，工業常規生產用25℃），加入藥物，使固定的抗原結合蛋白與藥物接觸，保證藥物與還原的巰基的反應在室溫下進行；存留的還原劑不需要沖洗，直接等待下一步與藥物偶聯之後，一併沖洗除去。

用該方法得到的ADC結構圖如下，與毒素的結合及產物洗脫與實施例6相似，洗脫層析見圖6，相關數據分析見表2。

實施例10、疏水作用色譜法( HIC )

由於二硫鍵的偶聯方式是斷開了EGFR抗體重鏈與重鏈、重鏈與輕鏈之間的二硫鍵，在質譜分析藥物的偶聯值時，會得到一系列重鏈、輕鏈質譜峰，不利於分析DAR值，根據抗體結合藥物的強烈疏水性，採用HIC分析法測定DAR值。

使用TOSOH TSK-丁基NPR柱進行疏水作用色譜法，線性梯度為12 min內0-100％緩衝液A與B，流速為0.5 ml/min。其中緩衝液A（含1.5 M乙酸銨，25 mM磷酸鈉，pH 6.95），緩衝液B（25 mM磷酸鈉，25％的IPA，pH 6.95）。通過在280 nm的洗脫峰面積吸光度的積分測定偶聯物的藥物-抗體偶聯比例。如圖10顯示出EGFR抗體的二硫鍵隨機偶聯結果（DAR=3.34），該方法具有一定通用性，不受抗體的限制。

實施例11、c-Met抗體藥物偶聯物的製備

為了驗證本發明在單株抗體應用領域的通用性，再一次選擇另一種抗體：c-Met抗體進行ADC藥物的製備。同樣採用了兩種偶聯方式：離胺酸偶聯和鏈間二硫鍵偶聯策略，具體的實驗方法和採用的毒素和上述實施例中製備EGFR抗體藥物偶聯物相似。

c-Met抗體mAb002為人源化的單株抗體，按照CN106188293A中的方法製備獲得。

mAb002的抗體序列： mAb002輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:3 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRADKSVSTSTYNYLHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRDLPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC mAb002重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:4 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLSNYGVHWVRQAPGKGLEWLAVIWSGGSTNYAAAFVSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARNHDNPYNYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

c-Met抗體藥物偶聯物的離胺酸偶聯結果，利用MS進行分析，見圖11A。離胺酸偶聯方法獲得的c-Met抗體ADC藥物結構式如下：

鏈間二硫鍵的偶聯下，還原劑由原來的TCEP調整為DTT，DTT的濃度為c-Met抗體莫耳濃度的8倍，偶聯步驟和其餘參數與EGFR抗體相似。偶聯產物的HIC分析圖見圖11B，c-Met抗體鏈間的二硫鍵幾乎全部打開，ADC藥物的DAR為4.85。鏈間二硫鍵還原偶聯c-Met抗體的ADC藥物結構如下：

無

圖1.抗體與交聯劑的反應方程式；圖2.交聯劑與抗體的莫耳比對LAR值的影響；圖3.交聯劑末端保護基團的去除反應方程式；圖4.毒素的連接及抗體藥物偶聯物洗脫流程圖；圖5.EGFR抗體藥物偶聯物的階段洗脫層析圖；圖6.EGFR抗體鏈間二硫鍵偶聯方式獲得的ADC階段洗脫層析圖；圖7.離胺酸偶聯方式下，洗脫抗體藥物偶聯物的SEC分析結果；（A）抗體-交聯劑的分析圖；（B）洗脫峰A的分析圖；（C）洗脫峰B的分析圖；（D）洗脫峰C的分析圖；圖8.抗體與交聯劑結合的質譜分析圖；圖9.EGFR抗體藥物偶聯物的質譜分析圖；圖10.EGFR抗體的鏈間二硫鍵偶聯方式的HIC分析圖；圖11.c-Met抗體的ADC藥物偶聯結果分析；（A）離胺酸偶聯結果的質譜圖；（B）鏈間二硫鍵還原偶聯的HIC圖。

Claims

一種製備抗原結合蛋白-藥物偶聯物的方法，所述方法包含如下步驟：1)將抗原結合蛋白固定於離子交換載體上，以形成固定的抗原結合蛋白；2)所述固定的抗原結合蛋白與藥物接觸，以形成抗原結合蛋白-藥物偶聯物；3)將抗原結合蛋白-藥物偶聯物從所述離子交換載體上洗脫下來，其中，所述離子交換載體選自離子交換樹脂、離子交換膜、離子交換纖維，並且其中所述離子交換載體為陽離子交換載體。
如請求項1所述的方法，所述陽離子交換載體為含有強酸性的反應配基。
如請求項2所述的方法，所述強酸性的反應配基為磺酸基。
如請求項1所述的方法，其中步驟2)中所述固定的抗原結合蛋白與藥物發生偶聯反應，所述偶聯反應為所述抗原結合蛋白與藥物通過親核基團和親電子基團之間的相互作用而連接。
如請求項4所述的方法，其中所述親核基團來自所述抗原結合蛋白，所述親電子基團來自所述藥物；或所述親核基團來自所述藥物，所述親電子基團來自所述抗原結合蛋白。
如請求項5所述的方法，其中所述親核基團選自巰基、羥基、氨基、醯肼、肟、肼、縮氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基醯肼基團。
如請求項6所述的方法，當親核基團來自所述藥物時，所述親核基團為巰基；當親核基團來自所述抗原結合蛋白時，所述親核基團為氨基、巰基、羥基。
如請求項7所述的方法，當親核基團來自所述抗原結合蛋白時，所述親核基團為氨基，所述的氨基為N末端氨基、側鏈氨基、糖基化抗原結合蛋白中糖的氨基；當親核基團來自所述抗原結合蛋白時，所述親核基團為羥基，所述的羥基為糖基化抗原結合蛋白中糖的羥基。
如請求項4-8任一項所述的方法，當親電子基團來自所述藥物時，所述親電子基團為活性酯類，所述活性酯類為NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯、酸性鹵化物；當親電子基團來自所述藥物時，所述親電子基團為烴基鹵化物，所述烴基鹵化物為鹵代乙醯胺。
如請求項9所述的方法，其中所述親電子基團來自藥物自身，或來自於對藥物的修飾。
如請求項1所述的方法，其中所述固定的抗原結合蛋白與藥物發生偶聯反應，所述偶聯反應選自離胺酸偶聯、輕重鏈間還原性二硫鍵偶聯、定點偶聯。
如請求項1所述的方法，其中步驟1)中所述抗原結合蛋白為經過修飾的抗原結合蛋白或不經過修飾的抗原結合蛋白；所述經過修飾的抗原結合蛋白為使所述抗原結合蛋白與化學試劑或交聯劑結合。
如請求項12所述的方法，其中所述經過修飾的抗原結合蛋白為與交聯劑結合的經過修飾的抗原結合蛋白。
如請求項1或12所述的方法，其中步驟2)中所述藥物經過修飾。
如請求項12所述的方法，其中所述交聯劑為具有通式(L₂)所示的化合物：
T選自H、叔丁基、乙醯基、正丙醯基、異丙醯基、三苯基甲基、甲氧基甲基、2-(三甲矽烷基)乙氧甲基；R¹⁵選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、烷基、烷氧基和環烷基；R¹⁶選自烷基、環烷基和雜環基；m為0-5。
如請求項15所述的方法，其中T為H或乙醯基。
如請求項15或16所述的方法，其中m為1-3。
如請求項15所述的方法，其中所述通式(L₂)所示的交聯劑選自式(L₃)的化合物
如請求項12所述的方法，所述交聯劑具有馬來醯亞胺基團或鹵代乙醯基的部分。
如請求項19所述的方法，其中所述具有馬來醯亞胺基團的交聯劑選自SMCC、LC-SMCC、KMUA、GMBS、EMCS、MBS、AMAS、SMPH、SMPB、和PMPI。
如請求項19所述的方法，其中所述具有鹵代乙醯基的部分的交聯劑選自SIAB、SIA、SBA和SBAP。
如請求項1所述的方法，其中所述藥物選自毒素、化療劑、生長抑制劑、微管蛋白抑制劑、抗生素、放射性同位素和核溶酶的細胞毒劑。
如請求項22所述的方法，所述藥物選自美登木素衍生物、奧瑞他汀衍生物、喜樹鹼類生物鹼。
如請求項23所述的方法，所述美登木素衍生物選自DM1、DM3、DM4；所述奧瑞他汀衍生物選自MMAE、MMAF；所述喜樹鹼類生物鹼選自CPT、10-羥基-CPT、CPT-11、SN-38和托泊替康。
如請求項1所述的方法，其中所述抗原結合蛋白選自人源化抗體、鼠源抗體、人抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體。
如請求項1所述的方法，其中所述抗原結合蛋白是單株抗體或抗原結合片段，所述抗原結合片段選自Fab、F(ab')2、scFv片段。
如請求項1所述的方法，所述抗原結合蛋白結合選自以下的一種或多種多肽：HER2、HER3、CD33、VEGF、VEGFR、VEGFR-2、CD152、CD40、TNF、IL-1、IL-5、IL-17、IL-6R、IL-1、IL-2R、BLYS、OX40L、CTLA4、PCSK9、EGFR、c-Met、CD2、CD3、CD11a、CD19、CD30、CD38、CD20、CD52、CD60、CD80、CD86、TNF-α、IL-12、IL-17、IL-23、IL-6、IL-1 β、RSVF、IgE、RANK、BLyS、α 4 β 7、PD-1、CCR4、SLAMF7、GD2、CD21、CD79b、IL20R α、短縮素、CD22、CD79a、CD72、IGF-1R和RANKL，或其抗原結合片段。
如請求項1所述的方法，其中所述抗原結合蛋白選自：Humira(阿達木單抗)、Avastin(貝伐單抗)、Erbitux(西妥昔單抗)、Herceptin(曲妥珠單抗)、Perjeta(帕妥珠單抗)、Vectibix(帕尼單抗)、泰欣生(尼妥珠單抗)、Yervoy(伊匹單抗)、Opdivo(納武單抗)、Lucentis(雷珠單抗)、Enbrel(依那西普)、Myoscint(噴替酸英西單抗)、ProstaScint(卡羅單抗噴地肽)、Remicade(英夫利昔單抗)、ReoPro(阿昔單抗)、Rituxan(利妥昔單抗)、Simulect(巴利昔單抗)、Synagis(帕利珠單抗)、Verluma(若莫單抗)、Xolair(奧馬珠單抗)、Zenapax(達利珠單抗)、Cimzia(賽妥珠單抗)、Zevalin(替伊莫單抗)、Orthoclone(莫羅單抗)、Panorex(依決洛單抗)、Mylotarg(吉姆單抗)、Soliris(依庫珠單抗)、CNTO1275(ustekinumab)、Amevive(阿法賽特)、Raptiva(伊伐珠單抗)、Tysabri(那他珠單抗)、Acternra(脫利珠單抗)、Orencia(阿巴西普)、Arcalyst(利洛納賽)、Stelara(優特克單抗)、Removab(卡妥索單抗)、Simponi(戈利木單抗)、Ilaris(康納單抗)、Arzerra(奧法木單抗)、Prolia(狄諾塞麥)、Benlysta(貝利單抗)、Nulojix(貝拉西普)、Eylea(阿柏西普)、Campath(阿侖單抗)、CEA-Scan阿西莫單抗(fab片段)、Poteligeo(mogamalizumab)、Abthrax(raxibacumab)、Gazyva(Obinutuzumab)、郎沐(康柏西普)、Cyramza(雷莫蘆單抗)、Sylvant(西妥昔單抗)、Entyvio(維多珠單抗)、Keytruda(帕母單抗)、Blincyto(Blinatumornab)、Cosentyx(蘇金單抗)、Unituxin(Dinutuximab)、Darzalex(Daratumumab)、Praluent(Alirocumab)、Repatha(Evolocumab)、Portrazza(Necitumumab)、Empliciti(Elotuzumab)、Nucala(美泊利單抗)、Praxbind (Idarucizumab)、Bexxar(托西莫單抗和I131托西莫單抗)，或其抗原結合片段。
如請求項1所述的方法，其中步驟1)中所述的抗原結合蛋白，在與離子交換載體接觸之前調節電導率至小於5mS/cm。
如請求項1所述的方法，其中步驟1)中所述的抗原結合蛋白固定於離子交換載體上，在緩衝液中進行，所述緩衝液的pH為5.5-7.0。
如請求項1所述的方法，其中步驟2)所述固定的抗原結合蛋白與藥物發生偶聯反應，所述的偶聯反應中，通過藥物慢速流經離子交換載體，來控制藥物與抗原結合蛋白用量的莫耳比小於6：1，流速為0.2-2ml/min。
如請求項1所述的方法，其中步驟3)所述的洗脫包含使用不同鹽濃度的緩衝液依次進行分步洗脫，所述緩衝液的pH為5.0-6.5。
如請求項32所述的方法，所述分步洗脫包含第一步洗脫和第二步洗脫，所述第一步洗脫的鹽濃度為100-140mM，所述第二步洗脫的鹽濃度為150-200mM。
如請求項30、32或33任一項所述的方法，所述緩衝液選自磷酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、琥珀酸鹽緩衝液。
如請求項1所述的方法，其中所述的步驟1)包括：a、使抗原結合蛋白與交聯劑結合，得到經過修飾的抗原結合蛋白；b、將經過修飾的抗原結合蛋白固定於離子交換載體上，以形成固定的抗原結合蛋白；c、加入脫保護劑。
如請求項35所述的方法，其中所述的步驟c的脫保護劑為NH₂OH．HCL。
如請求項35所述的方法，其中抗原結合蛋白與交聯劑結合的溫度為20-40℃。
如請求項35所述的方法，其中抗原結合蛋白與交聯劑的結合在pH為4.0-5.5的緩衝液中進行。
如請求項35所述的方法，其中脫保護劑為NH₂OH．HCL，抗原結合蛋白與交聯劑結合的溫度為20-40℃，抗原結合蛋白與交聯劑的結合在pH為4.0-5.5的緩衝液中進行。
如請求項39所述的方法，其中所述緩衝液為醋酸緩衝液。
如請求項40所述的方法，其中所述緩衝液為含有乙腈的醋酸緩衝液。
如請求項1所述的方法，其中所述的步驟1)包括：A、將抗原結合蛋白固定於離子交換載體上，以形成固定的抗原結合蛋白；B、加入還原劑，以還原所述固定的抗原結合蛋白的二硫鍵。
如請求項42所述的方法，其中所述還原劑選自三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)、巰基乙胺、乙醯半胱胺酸(Ac-Cys)。
如請求項42或43所述的方法，其中步驟B的還原反應溫度為25-45℃。