CN105612182A - 多特异性结构域交换共有可变轻链抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于具有共同轻链的抗体的多特异性抗体。该多特异性抗体包含通过结构域交换而含有共同轻链可变结构域VL的修饰重链；和通过结构域交换而含有第一抗体(VH1)和第二抗体(VH2)的可变重链结构域的两条修饰轻链，其中一条轻链属于κ同种型，一条轻链属于λ同种型。本发明还涉及该抗体的制备方法及其用途。

Description

多特异性结构域交换共有可变轻链抗体
本发明涉及基于共有可变轻链结构域(VL)和两个不同可变重链结构域(VH1和VH2)的修饰多特异性抗体、其制备和用途。
背景技术
本领域已知诸如能够结合两种或多种抗原的双特异性或多特异性抗体的改造蛋白质。这类多特异性结合蛋白质可以用细胞融合、化学缀合或重组DNA技术产生。
最近发展了多种重组多特异性抗体型式，例如通过例如IgG抗体型式(format)和单链结构域的融合产生的四价双特异性抗体(参见例如Coloma，M.J.等，NatureBiotech.15(1997)159-163；WO2001/077342；和Morrison，S.L.，NatureBiotech.25(2007)1233-1234)。
在一种方法中，用四源杂交瘤(quadroma)技术(参见Milstein，C.和Cuello，A.C.，Nature305(1983)537-540)产生了与天然抗体非常相似的双特异性抗体，该四源杂交瘤技术基于表达具有希望得到的双特异性抗体特异性的鼠单克隆抗体的两种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合。由于两种不同抗体重链和轻链在所得到的杂种杂交瘤(或四源杂交瘤)细胞系内的随机配对，产生至多十种不同的抗体种类，其中只有一种是希望得到的功能性双特异性抗体。由于错配副产物的存在和显著降低的生产产率，需要用于复杂纯化流程的手段(参见例如Morrison，S.L.，NatureBiotech.25(2007)1233-1234)。一般而言，错配副产物的相同问题在使用重组表达技术时仍然存在。
在WO98/50431中，在多特异性抗体中使用共同轻链以阻止轻链和重链的错配，但是，WO98/50431的方法使用通过所谓的“杵入臼”技术(Ridgway，J.B.，ProteinEng.9(1996)617-621；和WO96/027011)异二聚化的不同重链。在WO98/50431中，观察到高产率的具有异二聚化(“杵-臼”)重链的抗体。但是，也观察到了一些同二聚体形成(“臼-臼”或“杵-杵”)。通过用噬菌体展示法重塑两个CH3结构域的相互作用表面，并在两个CH3结构域之间引入二硫键来稳定异二聚体，可以进一步提高异二聚化重链的百分比(MerchantA.M等，NatureBiotech16(1998)677-681；Atwell，S.等，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)。例如EP1870459A1中描述了使用杵入臼技术的原理的新方法。这种策略的一个重要限制是，两种亲本抗体的轻链必须100％一致，以防止错配和形成无活性分子。与从头产生的抗体相配的共同轻链的开发仍具有挑战。因此，此技术不适合用于从抗第一和第二抗原的两种不同抗体起始，容易地开发抗两种抗原的重组、双特异性抗体，因为必须优化这些抗体的重链和/或相同的轻链。
WO2012/023053涉及使用共同重链的双特异性抗体。鉴于普遍存在的产生共同链的困难，以及尤其因为双特异性抗体的结合特性必须仅通过抗第一和第二抗原的两种不同轻链来赋予而没有重链的任何贡献，此方法甚至更受限而不是广泛适用。鉴于认为在大部分抗体中重链高变区尤其是例如重链的互补决定区3(CDR3-H)对抗体与其靶抗原的结合特性很重要这一事实，这是明显的限制。
WO2009/080252涉及二价、双特异性抗体，其中在两个抗体臂的仅一个中，交换了重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，以通过产生由不同结构域建立的轻链来防止轻链错配。
发明概述
本发明涉及基于共同可变轻链结构域(VL)和两个不同可变重链结构域(本文中分别称为第一结合特异性的可变重链结构域的VH1和第二结合特异性的可变重链结构域的VH2)的修饰多特异性抗体、其制备及其用途。
本发明提供多特异性抗体，其中该抗体包含：
a)两条修饰重链，其中各重链按C端至N端方向包含重链恒定结构域3至1(CH3、CH2和CH1，按此顺序)和轻链可变结构域(VL)，其中该轻链可变结构域(VL)是共同轻链的可变结构域；
b)一条、在一个实施方案中确切地为一条修饰轻链，其中该修饰轻链按C端至N端方向包含κ同种型的恒定轻链结构域(CL)(本文称为“CLκ”)和源自特异性结合第一抗原的抗体的可变重链结构域(VH1)；和
c)一条、在一个实施方案中确切地为一条修饰轻链，其中该修饰轻链按C端至N端方向包含λ同种型的恒定轻链结构域(本文称为“CLλ”)和源自特异性结合第二抗原的抗体的可变重链结构域(VH2)。
在本发明的抗体内，该可变结构域VH1和VL形成特异性结合第一抗原的第一抗原结合部位，该可变结构域VH2和VL形成结合第二抗原的第二抗原结合部位。
在本发明的一个实施方案中，该多特异性抗体是二价、双特异性抗体。
在本发明的一个实施方案中，该多特异性抗体属于IgG同种型。在本发明的一个实施方案中，该多特异性抗体属于IgG1或IgG4亚类。在本发明的一个实施方案中，该多特异性抗体属于IgG1亚类。
本发明的一个方面是编码本发明的多特异性抗体的核酸。本发明的另一方面是包含该核酸的表达载体，其中该表达载体能够在原核或真核宿主细胞中表达该核酸。本发明的另一方面是包含该表达载体的原核或真核宿主细胞。
本发明的一个方面是用于制备本发明的多特异性抗体的方法，其包括步骤：
a)用包含编码本发明的多特异性抗体的核酸分子的表达载体转化宿主细胞；
b)在允许合成该多特异性抗体分子的条件下培养该宿主细胞；和
c)从该培养物回收该多特异性抗体分子。
本发明的一个方面是包含本发明的多特异性抗体和至少一种可药用赋形剂的药物组合物。
本发明的一个方面是用作药物的多特异性抗体。
本发明的一个方面是用于治疗癌症的本发明的多特异性抗体。
本发明的一个方面是本发明的多特异性抗体在制备药物中的用途。
本发明的一个实施方案是本发明的多特异性抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
本发明的一个方面是用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于对该患者施用治疗有效量的本发明的多特异性抗体。
本发明的一个方面是用于产生基于特异性结合第一抗原的第一抗体和特异性结合第二抗原的第二抗体的多特异性抗体的方法，其中该第一抗体和该第二抗体包含共同轻链，该方法包括步骤：
a)通过用源自该第一抗体的重链的重链可变结构域(VH1)取代轻链可变结构域(VL)和可选地用κ同种型的恒定轻链结构域取代原来的恒定轻链结构域，来修饰源自该第一抗体的轻链，以获得按C端至N端方向包含κ同种型的恒定轻链结构域(CLκ)和重链可变结构域(VH1)的轻链；和
b)通过用源自该第二抗体的重链的重链可变结构域(VH2)取代轻链可变结构域(VL)和可选地用λ同种型的恒定轻链结构域取代原来的恒定轻链结构域，来修饰源自该第二抗体的轻链，以获得按C端至N端方向包含λ同种型的恒定轻链结构域(CLλ)和重链可变结构域(VH2)的轻链；
及步骤c)和d)中的一个或两个：
c)通过用源自该第一抗体的轻链的轻链可变结构域(VL)取代重链可变结构域(VH1)，来修饰源自该第一抗体的重链，以获得按C端至N端方向包含重链恒定结构域3至1(CH3、CH2和CH1，按此顺序)和轻链可变结构域(VL)的重链；
d)通过用源自该第二抗体的轻链的轻链可变结构域(VL)取代重链可变结构域(VH2)，来修饰源自该第二抗体的重链，以获得按C端至N端方向包含重链恒定结构域3至1(CH3、CH2和CH1，按此顺序)和轻链可变结构域(VL)的重链。
在一个实施方案中，该方法进一步包括步骤：
-用包含编码本发明的多特异性抗体的核酸分子的表达载体转化宿主细胞；
-在允许合成该多特异性抗体分子的条件下培养该宿主细胞；和
-从该培养物回收该多特异性抗体分子。
本发明的一个方面是通过该方法获得的多特异性抗体。
本发明的多特异性抗体可以容易地从具有分别与共同轻链配对的不同重链可变结构域(分别特异性结合第一和第二抗原)的两种抗体衍生。对于本发明的多特异性抗体，没有必要例如通过杵入臼技术或类似的异二聚化方法改造重链来确保异二聚体的结合。本发明的抗体具有IgG样结构，并显示非常好的抗原结合特性。此外，就抗原结合而言，该抗体显示高变异性，因为在本发明的抗体内，抗原结合主要由它的可变重链结构域赋予。这提供了由抗原结合部位结合的广谱的可能表位，因为抗体内所有抗原结合区(CDR)的最高变异性涉及重链可变结构域的CDR3。因此，重链的CDR3通常主要负责特异性抗原或表位结合。总的来说，这意味着在大多数抗体中，就抗体的抗原结合特性而言，重链可变结构域的CDR3内的氨基酸修饰比所有其他CDR中的氨基酸修饰更不可耐受得多。
此外，本发明的抗体可以良好的产率产生，且由于不同的恒定轻链结构域(κ和λ)而可以通过κ和λ特异性纯化步骤容易地从其副产物如不想要的同二聚体分开。
附图简述
图1对一种抗原特异的全长IgG样抗体的示意图，该抗体具有分别按典型顺序包含可变和恒定结构域的两对重链(HC)和轻链(LC)。
图2A本发明的双特异性抗体的示意图，该双特异性抗体基于包含共同轻链的两种抗体，特异性结合两种不同抗原(抗原1和抗原2)。通过重链和轻链可变结构域之间的结构域交换，该双特异性抗体的重链包含该共同轻链的VL结构域。该抗体包含两条不同轻链，其中一条轻链包含该特异性结合抗原2的可变重链结构域和λ同种型的恒定轻链结构域；且其中另一条轻链包含该特异性结合抗原1的可变重链结构域和κ同种型的恒定轻链结构域。显示重链和两条不同轻链的可变和恒定结构域。
图2B本发明的特异性结合FAP和DR5的双特异性抗体的示意图。在该抗体内，使来自抗-FAP(3C6)抗体的可变重链结构域(VH2)与λ同种型的恒定轻链结构域偶联，以形成第一修饰轻链；使来自抗DR5(2A11)抗体的可变重链结构域(VH1)与κ同种型的恒定轻链结构域偶联，以形成第二修饰轻链。显示靶向部分和各轻链结构域。类似地产生了双特异性抗体，但未分开显示，其中使来自抗-FAP(3C6)抗体的VH与CLλ结构域偶联，并使来自抗-DR5(8E11)抗体的VH或来自抗-DR5(21C11)抗体的VH与CLκ结构域偶联。
图3通过还原和非还原条件下的CE-SDS分析来分析本发明的特异性结合FAP和DR5的双特异性抗体的纯度和分子量。电泳图谱显示为以下双特异性抗体的SDS-Page：A)〈FAP(3C6)[CLλ]-DR5(8E11)[CLκ]〉(还原)，B)〈FAP(3C6)[CLλ]-DR5(8E11)[CLκ]〉(非还原)，C)〈FAP(3C6)[CLλ]-DR5(21C11)[CLκ]〉(还原)，D)〈FAP(3C6)[CLλ]-DR5(21C11)[CLκ]〉(非还原)。
图4用抗-FAP和抗-DR5双特异性抗体〈FAP(3C6)[CLλ]-DR5(8E11)[CLκ]作为实例，通过LC-MS确认均质制备物。144697.1Da处的主峰对应于具有两个氧化位点的希望得到的抗体分子的正确分子量。在LC-MS中未检测到包含两条κ或两条λ轻链的抗体分子。
图5显示用于通过表面等离振子共振，检测特异性结合DR5和FAP的双特异性抗体与两种不同抗原的同时结合的测定设置的示意图。将人或食蟹猴DR5偶联至链霉抗生物素蛋白芯片并用于固定双特异性抗体，而用非结合FAP来评估与FAP的抗原结合。
图6表征本发明特异性结合DR5和FAP的双特异性抗体的同时结合的检测的示例性传感图。表面等离振子共振测量结果确认，本发明的双特异性抗体能够同时结合两种抗原(通过分析〈FAP(3C6)[CLλ]-DR5(2A11)[CLκ]〉双特异性抗体(样本识别号GA803_G25_H14D_001)获得的传感图的示例性图像)。
图7来自细胞表面结合研究的结果。通过随后的FACS分析，在使用表达DR5的MDA-MB231肿瘤细胞系的细胞结合研究中，评估了本发明特异性结合DR5和FAP的双特异性抗体与其抗原DR5的结合。所显示的是使用〈FAP(3C6)[CLλ]-DR5(2A11)[CLκ]〉双特异性抗体(样本识别号GA803_G25_H14D_001)的结合研究的结果。构建体以依赖浓度的方式结合MDA-MB231细胞。
图8来自细胞表面结合研究的结果。通过随后的FACS分析，在使用表达FAP的成纤维细胞系GM05389的细胞结合研究中，评估了本发明特异性结合DR5和FAP的双特异性抗体与其抗原FAP的结合。所显示的是使用〈FAP(3C6)[CLλ]-DR5(2A11)[CLκ]〉双特异性抗体(样本识别号GA803_G25_H14D_001)的结合研究的结果。构建体以依赖浓度的方式结合GM05389细胞。
图9在缺乏或存在表达FAP的成纤维细胞(细胞系GM05389)的情况下，用MDA-MB231细胞评估了本发明三种双特异性抗体在表达DR5的MDA-MB231肿瘤细胞中介导的凋亡，该双特异性抗体特异性结合DR5和FAP，且包含源自抗-DR5抗体克隆2A11、8E11和21C11(分别为样本识别号GA803_G25_H14D_001、GA803_G27_H14D_001、GA803_G28_H14D_00)中任一个的不同DR5结合部位的。所有构建体都能够在FAP的存在下，在MDA-MB231细胞中介导凋亡。
发明详述
1.定义
除非文中清楚地另有说明，术语“一”、“一个”和“该”一般包括复数指代物。
用于本文目的的“受体人构架”是包含源自下文定义的人免疫球蛋白构架或人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“源自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的受体人构架可以包含其相同氨基酸序列，或者它可以包含氨基酸序列交换。在一些实施方案中，氨基酸交换的数目为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。在一些实施方案中，VL受体人构架在其氨基酸序列上与VL人免疫球蛋白构架氨基酸序列或人共有构架氨基酸序列100％同一。
本文所用的术语“抗体”指由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体(参见图1)。
全长抗体的重链是按N端至C端方向包含抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链结构域1(CH1)、抗体重链恒定结构域2(CH2)和抗体重链恒定结构域3(CH3)(本文也称为“VH-CH1-CH2-CH3”)及在IgE亚类抗体的情况下可选地包含抗体重链恒定结构域4(CH4)的多肽。在一个实施方案中，这种抗体包含铰链区(位于CH1和CH2结构域之间)。
全长抗体的轻链是按N端至C端方向包含抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)(本文也缩写为“VL-CL”)的多肽。抗体轻链恒定结构域(CL)可以属于κ或λ同种型。
抗体的轻链和重链通过轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间及全长抗体的两条重链的铰链区之间形成的多肽间二硫键连接在一起。
典型全长抗体的实例是天然抗体，如IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类)、IgM、IgA、IgD和IgE。
本发明的抗体可以来自单个物种，例如人，或者它们可以是嵌合或人源化抗体。
野生型全长抗体包含两个抗原结合部位，其中每一个由一对VH和VL结构域形成，其中两个抗原结合部位都特异性结合相同的(例如第一)抗原(参加图1)。本发明的全长抗体包含两个抗原结合部位，其中每一个由一对VH和VL结构域形成，其中结合部位之一(即由共同轻链的VL结构域和源自第一抗体的重链的VH结构域[VH1]这一对形成结合部位)特异性结合至少一种(例如第一)抗原；其中结合部位中的另一个(即由共同轻链的VL结构域和源自第二抗体的重链的VH结构域[VH2]这一对形成结合部位)特异性结合至少一种其他(例如第二)抗原(参见图2)。
抗体的“种类”指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在5个主要的抗体种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些种类中的几种可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文所用的术语“结合部位”或“抗原结合部位”指本文所述多特异性抗体的一个或多个区域，配体(例如它的抗原或抗原片段)实际上与该区域结合，且该区域源自抗体分子或其片段。本发明的抗体的抗原结合部位包含抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)。
特异性结合希望的抗原的抗原结合部位(即VH/VL结构域对)可以源自：a)特异性结合该抗原的已知抗体；或b)通过尤其是使用该抗原蛋白质或核酸或其片段的从头免疫法或通过噬菌体展示获得的新抗体或抗体片段。对于本文所述的结合第一和第二抗原的多特异性抗体，结合该第一和第二抗原的抗原结合部位包含对两个抗原结合部位而言相同的第一共同轻链可变结构域(VL)和第二共同轻链可变结构域(VL)二者。
本发明的多特异性抗体的抗原结合部位包含以不同程度促成结合部位对抗原的亲和力的六个互补决定区(CDR)。存在三个重链可变结构域CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变结构域CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。通过与已根据序列间变异性定义这些区域的氨基酸序列编译数据库比较，来确定CDR和构架区(FR)的程度。
抗体特异性指抗体或多特异性抗体的结合部位对抗原的特定表位的选择性识别。例如天然抗体是单特异性的。双特异性抗体是具有两种不同抗原结合特异性的抗体。在抗体具有一种以上特异性时，所识别的表位可以与单种抗原或与一种以上抗原相关。
本文所用的术语“共同轻链”指这样的轻链，其能够与结合第一抗原的抗体的第一重链配对，形成特异性结合该第一抗原的结合部位，也能够与结合第二抗原的抗体的第二重链配对，形成特异性结合该第二抗原的结合部位。共同轻链是按N端至C端方向包含抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)(本文也缩写为“VL-CL”)的多肽。在本发明的多特异性抗体内，共同轻链可变结构域VL与源自特异性结合第一抗原的抗体的重链可变结构域(VH1)配对，形成特异性结合第一抗原的抗原结合部位。此外，共同轻链可变结构域VL与源自特异性结合第二抗原的抗体的重链可变结构域(VH2)配对，形成特异性结合第二抗原的抗原结合部位。因此，本文所述的包含这种共同轻链可变结构域的多特异性抗体含有两个相同的共同轻链可变结构域(VL)，其与VH1和VH2配对，形成结合第一抗原的抗原结合部位[VH1/VL]和结合第二抗原的抗原结合部位[VH2/VL]。包含在多特异性抗体内的两个共同轻链可变结构域(VL)显示至少95％、在一个实施方案中至少99％、在另一个实施方案中100％氨基酸序列同一性。
共同轻链和产生这类包含其共同轻链可变结构域(VL)的共同轻链的方法描述于例如WO98/50431中或WO2010/084197中、或US2013/045492、WO2011097603和WO2012148873中(其中使用了共同轻链小鼠)。本文所列的实施例1中也详细描述了共同轻链及其可变结构域的产生。在多特异性抗体内使用一种共同轻链可变结构域避免了形成异二聚体，其中源自第一抗体的轻链和源自第二抗体的重链的配对产生无功能或换言之不能结合一种或多种靶抗原的抗原结合结构域。
本文所用的“修饰轻链”指轻链，其中通过重组手段用对应的重链结构域交换了至少一个它的结构域(可变或恒定结构域)。具体而言，在本发明的多特异性抗体内，在修饰轻链内，用源自对应的重链的重链可变结构域VH替换轻链可变结构域VL。因此，本发明的抗体的修饰轻链从N端至C端方向包含结构域VH-CL。
本文所用的“修饰重链”指重链，其中通过重组手段用对应的轻链结构域交换了至少一个它的结构域(可变结构域VH或恒定结构域CH1)。具体而言，在本发明的多特异性抗体内，在修饰重链内，用源自对应的轻链的轻链可变结构域VL替换重链可变结构域VH。因此，本发明的抗体的修饰重链按N端至C端方向包含至少结构域VL-CH1。
本发明的多特异性抗体包含两条修饰重链，它们都含有至少一个共同轻链的轻链可变结构域VL和恒定重链结构域1(VL-CH1)。在一个实施方案中，修饰重链按N端至C端方向包含结构域VL-CH1-CH2-CH3，通常包含位于CH1和CH2结构域之间的铰链区。在一个实施方案中，多特异性抗体的修饰重链显示至少95％、在一个实施方案中至少99％、在另一个实施方案中100％氨基酸序列同一性。
但是，由宿主细胞产生的抗体可以从重链的C端翻译后切割一个或多个、尤其是一个或两个氨基酸。因此，宿主细胞通过表达编码全长重链的具体核酸分子而产生的抗体可以包含全长重链，或者它可以包含全长重链的切割变体(本文也称为切割的变体重链)。在重链的最后两个C端氨基酸是甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，按照KabatEU指数的编号)时，情况可以是这样。抗体群体可以包含具有全长重链的抗体和具有切割的变体重链的抗体。抗体群体可以由具有全长重链的抗体和具有切割的变体重链的抗体的混合物组成；其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体具有切割的变体重链。
本文所用的术语“单特异性”抗体指具有一个或多个结合部位的抗体，其中每个结合部位结合同一抗原的同一表位。
本文所用的术语“价”指抗体分子中存在指定数目的结合部位。例如天然抗体或本发明的全长抗体具有两个结合部位，且是二价的。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别指抗体分子中存在两个结合部位、四个结合部位和六个结合部位。本发明的多特异性抗体优选二价、双特异性抗体。
在优选实施方案中，本发明的多特异性抗体是全长抗体，即包含免疫球蛋白恒定区。本发明的全长抗体包含一个或多个免疫球蛋白种类的免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白种类包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE同种型及其亚型(在IgG和IgA的情况下)。在优选实施方案中，本发明的全长抗体具有IgG同种型抗体的恒定结构域结构。
本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指具有单种氨基酸组成的抗体或抗体分子的制备物。
术语“嵌合抗体”指这样的抗体，其包含来自一个来源或物种的可变区(即结合区)和源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，通常通过重组DNA技术制备。优选包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明所涵盖的其他优选的“嵌合抗体”形式是其中已从原抗体的恒定区修饰或改变恒定区，来产生本发明的特性(尤其是就C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合而言)的那些。这类嵌合抗体也称为“种类转换抗体”。嵌合抗体是所表达的包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段的免疫球蛋白基因的产物。用于产生嵌合抗体的方法涉及常规重组DNA，基因转移技术为本领域公知。参见例如Morrison，S.，L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855；US5,202,238和US5,204,244。
术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中与亲本免疫球蛋白的构架或互补决定区(CDR)相比，已将构架或“互补决定区”(CDR)修饰为包含具有不同特异性的免疫球蛋白的CDR。在优选实施方案中，将鼠CDR移植入人抗体的构架区来制备“人源化抗体”。参见例如Riechmann，L.等，Nature332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.等，Nature314(1985)268-270。尤其优选的CDR对应于代表识别上文针对嵌合抗体指出的抗原的序列的那些。本发明所涵盖的“人源化抗体”的其他形式是其中已从原抗体的恒定区附加地修饰或改变恒定区来产生本发明的特性(尤其是就C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合而言)的那些形式。
本文所用的术语“人抗体”旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体为现有技术中公知(vanDijk，M.A.和vandeWinkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。人抗体也可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，该转基因动物能够在免疫时，在缺乏内源免疫球蛋白产生的情况下，产生全库或一系列的人抗体。这类种系突变体小鼠中，人种系免疫球蛋白基因阵列的转移将导致在抗原攻击时产生人抗体(参见例如Jakobovits，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)2551-2555；Jakobovits，A.等，Nature362(1993)255-258；Brueggemann，M.等，YearImmunol.7(1993)33-40)。人抗体也可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom，H.R.和Winter，G.，J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks，J.D.等，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole等和Boerner等的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole，S.，P.，C.，等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，AlanR.Liss(1985)77-96；和Boerner，P.等，J.Immunol.147(1991)86-95)。如已就本发明的嵌合和人源化抗体提到，本文所用的术语“人抗体”还包括这类抗体，其已例如通过“种类转换”(即改变或突变Fc部分)(例如从IgG1至IgG4和/或IgG1/IgG4的突变)在恒定区中修饰，以产生本发明的特性，尤其是就C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合而言。
本文所用的术语“重组人抗体”旨在包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如从诸如NS0或CHO细胞的宿主细胞或从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)分离的抗体，或用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体。这类重组人抗体具有重排形式的可变区和恒定区。本发明的重组人抗体已经历了体内体细胞高变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其虽然源自人种系VH和VL序列并与人种系VH和VL序列相关，但可以并非在体内天然存在于人抗体种系库内。
本文所用的“可变结构域”(重链的可变结构域(VH)或轻链的可变结构域(VL))指轻链和重链对的每一个，其直接涉及抗体与抗原的结合。在本发明的多特异性抗体内，共同轻链的两个相同的可变结构域(VL)与第一重链可变结构域(VH1)和第二重链可变结构域(VH2)形成两个不同的抗原结合部位。
人轻链和人重链的可变结构域具有相同的一般结构。每个可变结构域包含4个序列高度保守的构架(FR)区，构架区通过三个“高变区”(或互补决定区，CDR)连接。构架区采用β-折叠构象，CDR可以形成连接β-折叠结构的环。每条链中的CDR通过构架区保持其三维结构，并与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合部位。抗体重链和轻链CDR3区在抗体的结合特异性/亲和力中发挥极其重要的作用。
本文提到的个体(individual)”或“对象(subject)”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于饲养的动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如人类和非人灵长类，如猴)、兔和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，该个体或对象是人。
“分离的”抗体是已从其天然环境的成分分开的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)手段测定的纯度大于95％或99％。用于评估抗体纯度的方法的综述参见例如Flatman，S.等，J.Chromatogr.B848(2007)79-87。
“分离的”核酸指已从其天然环境的成分分开的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常含有该核酸分子的细胞中的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或不同于其天然染色体位置的染色体位置上。
在本文中使用时，术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是除本文定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链从N端至C端包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每条链上的CDR由这类构架氨基酸分开。尤其是，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大的区域。按照Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)的标准定义确定CDR和FR区。
本文所用的术语“结合”或“特异性结合”指抗体在使用纯化的野生型抗原的体外测定中、优选等离振子共振测定(GE-HealthcareUppsala，瑞典)中与抗原表位的结合。通过术语ka(抗体从抗体/抗原复合物结合的速率常数)、kD(解离常数)和KD(kD/ka)来定义结合的亲和力。“结合”或“特异性结合”意指10-8mol/l或更小、在一个实施方案中为10-8M至10-13mol/l、在一个实施方案中为10-9M至10-13mol/l的结合亲和力(KD)。因此，在本发明的一个实施方案中，本文所述的多特异性抗体以10-8mol/l或更小、在另一个实施方案中为10-8M至10-13mol/l、在另一个实施方案中为10-9M至10-13mol/l的结合亲和力(KD)特异性结合它对其特异的各抗原。
术语“表位”包括能够与抗体特异性结合的任意多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的分子的具有化学活性的表面分组(surfacegrouping)，且在某些实施方案中可以具有特异的三维结构特征，或特异的电荷特征。表位是抗体结合的抗原区域。
本申请内所用的术语“恒定区”指除可变区外，抗体的结构域的总和。恒定区不直接涉及与抗原的结合，但它显示多种效应子功能。取决于其重链的恒定区的氨基酸序列，将抗体划分为以下种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些种类中的几个可以进一步划分为亚类，如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同种类的抗体，重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。可见于五个抗体种类中的轻链恒定区(CL)称为κ和λ。
本申请中所用的术语“源自人来源的恒定区”指gG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链κ或λ区。这类恒定区为现有技术中公知，并例如由Kabat，E.A.，(参见例如Johnson，G.和Wu，T.T.，NucleicAcidsRes.28(2000)214-218；Kabat，E.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA72(1975)2785-2788)描述。
“效应子功能”指可归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和依赖补体的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；依赖抗体的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；及B细胞活化。
物质(agnet)，例如药物组合物的“有效量”指对在剂量下和必要的时间内达到希望得到的治疗或预防结果有效的量。
本文用术语“Fc区”来定义免疫球蛋白重链的包含至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。但是，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非文中另有说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号按照Kabat，E.A.等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)，NIHPublication91-3242中所述的EU编号系统，也称为EU指数。
2.本发明的实施方案详述
本发明涉及多特异性抗体，其包含：
a)两条修饰重链，其中各重链按C端至N端方向包含重链恒定结构域3至1(CH3、CH2和CH1，按此顺序)和轻链可变结构域(VL)，其中该轻链可变结构域(VL)是共同轻链的可变结构域；
b)一条、在一个实施方案中确切地为一条修饰轻链，其中该修饰轻链按C端至N端方向包含κ同种型的恒定轻链结构域(CL)(本文称为“CLκ”)和源自特异性结合第一抗原的抗体的可变重链结构域(VH1)；和
c)一条、在一个实施方案中确切地为一条修饰轻链，其中该修饰轻链按C端至N端方向包含λ同种型的恒定轻链结构域(本文称为“CLλ”)和源自特异性结合第二抗原的抗体的可变重链结构域(VH2)。
本发明还涉及多特异性抗体，其中该抗体包含：
a)两条修饰重链，其中各重链按C端至N端方向包含重链恒定结构域3至1(CH3、CH2和CH1，按此顺序)和轻链可变结构域(VL)，其中该轻链可变结构域(VL)是共同轻链的可变结构域；
b)一条、在一个实施方案中确切地为一条修饰的第一轻链，其中该修饰的第一轻链按C端至N端方向包含κ同种型的恒定轻链结构域(CL)(本文称为“CLκ”)和源自特异性结合第一抗原的抗体的可变重链结构域(VH1)；和
c)一条、在一个实施方案中确切地为一条修饰的第二轻链，其中该修饰的第二轻链包含按C端至N端方向含有λ同种型的恒定轻链结构域(本文称为“CLλ”)和源自特异性结合第二抗原的抗体的可变重链结构域(VH2)的多肽。
本发明还涉及多特异性抗体，其包含：
a)两条修饰重链，其包含由结构域CH3-CH2-CH1-VL组成的多肽，其中VL是共同轻链的可变结构域；
b)一条修饰轻链，其包含由结构域CLκ-VH1组成的多肽，其中VH1是来自结合第一抗原的抗体的可变重链结构域；和
c)一条修饰轻链，其包含由结构域CLλ-VH2组成的多肽，其中VH2是来自结合第二抗原的抗体的可变重链结构域。
在本发明的一个实施方案中，该多特异性抗体包含：
a)两条修饰重链，其包含由CH3-CH2-CH1-VL组成的多肽，其中VL是共同轻链的可变结构域；
b)一条修饰轻链，其包含由CLκ-VH1组成的多肽，其中VH1是来自结合第一抗原的抗体的可变重链结构域；
c)一条修饰轻链，其包含由CLλ-VH2组成的多肽，其中VH2是来自结合第二抗原的抗体的可变重链结构域；
其中该可变结构域VH1和VL形成特异性结合第一抗原的第一抗原结合部位，其中该可变结构域VH2和VL形成特异性结合第二抗原的第二抗原结合部位。
在本发明的多特异性抗体内，抗体识别第一抗原的一半与抗体识别第二抗原的一半具有共同的轻链可变结构域，且该共同的轻链可变结构域与各VH结构域掉换，产生CH3-CH2-CH1-VL型结构。这确保了正确的抗体链结合。确保了正确的重链配对，因为只有一类重链存在于多特异性抗体内。此外，由于存在一个共同的轻链可变结构域而达到正确的轻链结合。此外，与VH1结构域连接的CLκ和与VH2结构域连接的CLλ的存在允许通过应用以κ和λ特异的柱去除不想要的同二聚体的后续纯化步骤，来纯化希望得到的双特异性抗体。在本发明的多特异性抗体内，该第一结合部位的可变结构域VL和该第二结合部位的可变结构域VL显示至少95％、在一个实施方案中为至少99％、在另一实施方案中为100％氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，该第一结合部位的可变结构域VL和该第二结合部位的可变结构域VL在其氨基酸序列上100％同一。
在另一方面，本发明涉及多特异性抗体，其包含：
a)特异性结合第一抗原的抗体的第一修饰重链和第一修饰共同轻链；和
b)特异性结合第二抗原的抗体的第二修饰重链和第二修饰共同轻链；
其中来自a)的重链和第一共同轻链的可变结构域VH和VL相互替换，其中来自b)的重链和第二共同轻链的可变结构域VH和VL相互替换；其中a)的第一共同轻链包含κ恒定轻链结构域CLκ；其中b)的第二共同轻链包含λ恒定轻链结构域CLλ；其中来自a)的第一共同轻链的VL结构域和b)的第二共同轻链的VL结构域二者相同；其中a)的第一重链和b)的第二重链的恒定区二者相同。
在本发明的一个实施方案中，该多特异性抗体是二价的。在本发明的一个实施方案中，该多特异性抗体是双特异性抗体。在本发明的一个实施方案中，该多特异性抗体是二价、双特异性抗体。
在本发明的多特异性抗体的一个实施方案中，全长抗体的重链按N端至C端方向包含VH结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在一个实施方案中，全长抗体的重链按N端至C端方向由VH结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域组成。在一个实施方案中，全长抗体的重链是按N端至C端方向由VH、CH1、CH2和CH3组成的多肽。
在本发明的一个实施方案中，该修饰重链包含在其氨基酸序列上100％同一的VL-CH1结构域。
在本发明的一个实施方案中，未改变(即通过氨基酸取代)多特异性抗体的重链恒定结构域CH3，以支持异二聚化。具体而言，未例如通过杵入臼技术不对称地改变重链恒定结构域CH3，其中改变一个CH3结构域来产生“杵”，改变另一个CH3结构域来产生“臼”，使得通过将“杵”氨基酸放置在“臼”内，来支持不同重链的异二聚化。相反，本发明的多特异性抗体的具体优势是无需支持异二聚化，由于修饰重链中的结构域交换，修饰重链可以结合多特异性抗体的两条轻链，且当然可以与另一相同的重链配对。
本文提到多肽之间“同一的”和“同一性”(例如重链之间的“同一性”或共同轻链可变结构域VL之间的“同一性”)时意指多肽的氨基酸序列的100％同一性。但是，多肽可以在附着于多肽链的聚糖结构上不同。
本发明的一个方面是用于产生多特异性抗体的方法，其包括步骤：
a)通过相互交换来自重链和共同轻链的可变结构域VH1和VL，来修饰特异性结合第一抗原的抗体的第一重链和第一共同轻链；和
b)修饰第一共同轻链以包含κ恒定轻链结构域CLκ；
c)通过相互交换来自重链和共同轻链的可变结构域VH2和VL，来修饰特异性结合第二抗原的抗体的第二重链和第二共同轻链；和
d)修饰第二共同轻链以包含λ恒定轻链结构域CLλ；
其中来自第一共同轻链和b)的第二共同轻链的可变轻链结构域VL二者相同；其中第一和第二重链的恒定区二者相同。
抗体变体
在某些实施方案中，考虑本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这类修饰包括例如从抗体的氨基酸序列缺失残基和/或在抗体的氨基酸序列内插入残基和/或取代抗体的氨基酸序列内的残基。可以进行缺失、插入和取代的任意组合来达到最终的构建体，只要最终的构建体具有希望得到的特征，例如抗原结合。
a)取代、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。进行取代诱变的目的位点包括CDR和FR。在一个实施方案中，在重链的CDR和/或FR中进行取代诱变。表1中“示例性取代”的表头下提供示例性改变，如下文参考氨基酸侧链种类进一步描述。表1中“优选的取代”的表头下显示保守取代。可以在目的抗体中引入氨基酸取代，并针对希望得到的活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)筛选产物。
表1：
原残基 示例性取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp，Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr12 -->
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可以按照共同的侧链性质分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
保守取代将需要将这些种类之一的成员换为另一种类的成员。
一类取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，所得到的选择用于进一步研究的一种或多种变体将相对于亲本抗体具有某些生物学特性(例如提高的亲和力、降低的免疫原性)的修饰(例如改善)和/或将具有基本上保留的亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文所述的那些)方便地产生。简言之，突变一个或多个CDR残基，将变体抗体展示在噬菌体上，并针对具体的生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可以在CDR中进行改变(例如取代)，例如以改善抗体亲和力。可以在CDR“热点”(即由在体细胞成熟过程中以高频率发生突变的密码子编码的残基)(参见例如Chowdhury，P.S.，MethodsMol.Biol.207(2008)179-196)和/或SDR(a-CDR)中进行这类改变，针对结合亲和力测试所得到的变体VH或VL。通过构建二级文库并从二级文库重新选择的亲和力成熟已描述于例如Hoogenboom，H.R.等inMethodsinMolecularBiology178(2002)1-37中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸定点诱变)中的任一种来在选择用于成熟的可变基因中引入多样性。然后产生二级文库。然后筛选该文库来鉴定具有希望的亲和力的任意抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及CDR定点途径，其中随机化几个CDR残基(例如每次4-6个残基)。可以例如用丙氨酸扫描诱变或模拟来明确地鉴定出涉及抗原结合的CDR残基。尤其是通常靶向CDR-H3和CDR-L3。
如Cunningham，B.C.和Wells，J.A.，Science244(1989)1081-1085所述，用于鉴定可以靶向进行诱变的抗体的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在此方法中，鉴定残基或靶残基组(例如带电荷的残基，如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在证明对最初的取代的功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。备选地或此外，用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。这类接触残基和邻近残基可以作为取代的候选残基靶向或消除。可以筛选变体来确定它们是否包含希望得到的特性。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百或更多个残基的多肽的范围内的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如，对于ADEPT)的融合，或与增加抗体的血清半衰期的多肽的融合。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体来提高或降低该抗体糖基化的程度。通过改变氨基酸序列，使得产生或去除一个或多个糖基化位点，可以方便地实现对抗体进行糖基化位点的加入或缺失。
在抗体包含Fc区时，可以改变附着于Fc区的糖类。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分枝的双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2结构域的Asn297(参见例如Wright，A.和Morrison，S.L.，TIBTECH15(1997)26-32)。寡糖可以包括多种糖类，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“茎”中附着于GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以进行本发明的抗体中的寡糖的修饰来产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有(直接或间接)附着于Fc区的缺乏岩藻糖的糖类结构的抗体变体。例如，这种抗体中的岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。相对于通过例如WO2008/077546中所述的MALDITOF质谱法测量的附着于Asn297的所有糖结构(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，通过计算Asn297处的糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖的量。Asn297指定位在Fc区中的约297位(Fc区残基的Eu指数编号)的天冬酰胺残基；但是，由于抗体中小的序列变异，Asn297也可以定位在297位上游或下游约±3氨基酸，即在294位和300位之间。这类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见例如US2003/0157108；US2004/0093621。涉及“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”的抗体变体的出版物的实例包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki，A.等，J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki，N.等，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka，J.等，Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US2003/0157108；及WO2004/056312，尤其是在实施例11中)和敲除细胞系，如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见例如YamaneOhnuki，N.等，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda，Y.等，Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO2003/085107)。
还提供具有二等分寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的实例描述于例如WO2003/011878、美国专利号6,602,684和US2005/0123546中。还提供在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的CDC功能。这类抗体变体描述于例如WO1997/30087、WO1998/58964和WO1999/22764中。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以向本文提供的抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，从而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置处含有氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。在一个实施方案中，该一个或多个氨基酸位置处的氨基酸修饰在本发明的抗体的两条重链中都相同。
在某些实施方案中，本发明考虑具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，这使得它成为其中抗体的体内半衰期重要但某些效应子功能(如补体和ADCC)不必要或有害的应用所希望的候选者。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定来确认CDC和/或ADCC活性的降低/减损。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定来确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch，J.V.和Kinet，J.P.，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页上的表3中。评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom，I.等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83(1986)7059-7063和Hellstrom，I.等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82(1985)1499-1502)；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann，M.等，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中。备选地，可以利用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.MountainView，CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或此外，可以在体内，例如在诸如公开于Clynes，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(1998)652-656中的动物模型的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定来确认抗体不能结合C1q，并因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro，H.等，J.Immunol.Methods202(1996)163-171；Cragg，M.S.等，Blood101(2003)1045-1052；及Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood103(2004)2738-2743)。还可以用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova，S.B.等，Int.Immunol.18(2006)1759-1769)。
具有减少的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个取代的那些(美国专利号6,737,056，按照Kabat的EU指数的编号)。这类Fc变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或多个处具有取代的Fc突变体，包括具有残基265和297至丙氨酸的取代的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581，按照Kabat的EU指数的编号)。
如本文所使用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置按照Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)中所述的Kabat编号系统编号。具体而言，对于可变结构域及对于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，使用Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)的Kabat编号系统(参见647-660页)，且本文称为“按照Kabat的编号”，对于恒定重链结构域(CH1、铰合部、CH2和CH3)，使用KabatEU指数编号系统(参见661-723页)，且本文称为“按照Kabat的EU指数的编号”。
在一个实施方案中，该多特异性抗体属于IgG同种型。在一个实施方案中，该多特异性抗体属于IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方案中，该多特异性抗体包含IgG1亚类的含有突变L234A和L235A(按照Kabat的EU指数的编号；Kabat，E.A.等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)，NIHPublication91-3242.)的恒定重链区。
在一个实施方案中，该多特异性抗体包含IgG1亚类的含有突变L234A、L235A和P329G(按照Kabat的EU指数的编号)的恒定重链区。
在一个实施方案中，该多特异性抗体包含IgG4亚类的恒定重链区。
在一个实施方案中，该多特异性抗体包含IgG4亚类的含有突变S228P和L235E(按照Kabat的EU指数的编号)的恒定重链区。
在一个实施方案中，该多特异性抗体包含IgG4亚类的含有突变S228P、L235E和P329G(按照Kabat的EU指数的编号)的恒定重链区。
描述了某些具有改善或减少的与FcR的结合的抗体变体(参见例如美国专利号6,737,056；WO2004/056312；及Shields，R.L.等，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代(例如Fc区的298、333和/或334位(按照Kabat的EU指数的编号)的取代)的Fc区。
在一些实施方案中，例如，如美国专利号6,194,551、WO99/51642和Idusogie，E.E.等，J.Immunol.164(2000)4178-4184中所述，在Fc区中进行改变，该改变导致改变(即改善或减少)的C1q结合和/或依赖补体的细胞毒性(ADCC)。
具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)(其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer，R.L.等，J.Immunol.117(1976)587-593和Kim，J.K.等，J.Immunol.24(1994)2429-2434))的结合的抗体描述于US2005/0014934中。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，该取代改善Fc区与FcRn的结合。这类Fc变体包括在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一个或多个处具有取代的那些，例如，Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
关于Fc区变体的其他实例，还参见Duncan，A.R.和Winter，G.，Nature322(1988)738-740；US5,648,260；US5,624,821；和WO94/29351。
d)半胱氨酸改造的抗体变体
在某些实施方案中，可以希望产生半胱氨酸改造的抗体，例如“thioMAb”，其中用半胱氨酸残基取代抗体的一个或多个残基。在具体实施方案中，取代的残基存在于抗体的可接近部位。通过用半胱氨酸取代那些残基，从而将反应性巯基放置在抗体的可接近部位，并可以用于将抗体缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分，以产生本文进一步描述的免疫缀合物。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸取代以下残基中的任意一个或多个：轻链的V205(按照Kabat的编号)；重链的A118(按照Kabat的EU指数的编号)；重链Fc区的S400(按照Kabat的EU指数的编号)。半胱氨酸改造的抗体可以按例如美国专利号7,521,541中所述产生。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体来包含本领域已知且易于得到的附加的非蛋白质部分。适合用于衍生化抗体的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯比咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(同聚物或随机共聚物)、葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、propropyleneglycol同聚物、prolypropyleneoxide/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛可以在制备中具有优势。聚合物可以具有任意分子量，且可以分枝或不分枝。附着于抗体的聚合物的数目可以不同，且如果附着超过一个聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可以根据包括但不限于抗体要改善的具体特性或功能、抗体衍生物是否将在确定的条件下用于治疗等的考虑，来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型。
在另一实施方案中，提供抗体和可通过暴露于照射来选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，该非蛋白质部分是碳纳米管(Kam，N.W.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102(2005)11600-11605)。照射可以具有任意波长，且包括但不限于不损害普通细胞，但加热非蛋白质部分至杀死靠近抗体-非蛋白质部分的细胞的温度的波长。
重组方法和组合物
可以用例如美国专利号4,816,567中所述的重组方法和组合物产生抗体。
本发明的一个方面是用于制备本发明的多特异性抗体的方法，其包括步骤：
a)用包含编码本发明的多特异性抗体的核酸分子的表达载体转化宿主细胞；
b)在允许合成该多特异性抗体分子的条件下培养该宿主细胞；和
c)从该培养物回收该多特异性抗体分子。
在本发明的一个实施方案中，用以下转化宿主细胞：(i)包含编码修饰重链的核酸分子的表达载体；(ii)包含编码修饰轻链的核酸分子的表达载体，该修饰轻链按C端至N端方向包含κ同种型的恒定轻链结构域(CL)(CLκ)和源自特异性结合第一抗原的抗体的可变重链结构域(VH1)；和(iii)包含编码修饰轻链的核酸分子的表达载体，该修饰轻链按C端至N端方向包含λ同种型的恒定轻链结构域(CLλ)和源自特异性结合第二抗原的抗体的可变重链结构域(VH2)。在本发明的一个实施方案中，用这样的摩尔量的包含编码修饰重链的核酸分子的表达载体转化宿主细胞，该摩尔量约为(在一个实施方案中等于)用前面(ii)和(iii)下定义的各轻链的表达载体转化宿主细胞所用摩尔量的总和的摩尔量。
在一个实施方案中，对于本发明的多特异性抗体的产生，使用了确切地一种类型的包含编码修饰重链的核酸的表达载体。在一个实施方案中，对于本发明的多特异性抗体的产生，使用编码修饰重链的核酸。
在一个实施方案中，提供分离的编码本文所述多特异性抗体的核酸。这种核酸可以编码含有抗体的VL的氨基酸序列和/或含有抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。
本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”指任意长度的核苷酸聚合物，且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任意底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸及其类似物。核苷酸的序列可以由非核苷酸成分中断。多核苷酸可以包含合成后进行的一个或多个修饰，如与标记缀合。其他类型的修饰包括例如“帽”，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰，例如具有不带电荷的连接(例如磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)和具有带电荷的连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，包含悬垂部分(例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等))的那些，具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些，包含螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些，包含烷化剂的那些，具有修饰的连接的那些(例如α异头核酸等)，以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖中的任意羟基可以例如通过膦酸基团、磷酸基团取代，通过标准保护基团保护，或活化以制备与附加核苷酸的附加连接，或可以缀合至固体或半固体支持物。5’和3’端OH可以磷酸化或用1至20个碳原子的胺或有机帽化基团部分取代。其他羟基也可以衍生至标准保护基团。多核苷酸还可以包含本领域公知的核糖或脱氧核糖的类似物形式，包括例如2′-O-甲基-、2′-O-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮基-核糖，碳环糖类似物，α-异头糖，差向异构糖如阿拉伯糖、木糖或来苏糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，无环类似物和碱性核苷类似物如甲基核苷。可以用备选的连接基团取代一个或多个磷酸二酯键。这些备选的连接基团包括但不限于其中用P(O)S(“硫代”)、P(S)S(“二硫代”)、(O)NR2(“酰胺”)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“formacetal”)取代磷酸的实施方案，其中每个R或R′独立地是H或可选地包含醚(-O-)键的取代或未取代的烷基(1-20C)、芳基、链烯基、环烷基、环烯基或araldyl。多核苷酸中的所有键无需相同。前面的描述适用于本文提到的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
在另一实施方案中，提供一个或多个包含这种核酸的载体。在另一实施方案中，提供一个或多个包含这种核酸的表达载体。在一个实施方案中，提供能够在原核或真核宿主细胞中表达该核酸的包含这种核酸的表达载体。
在另一实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在另一实施方案中，提供包含上文定义的这种表达载体的原核或真核宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞包含以下(例如已用以下转化)：(1)包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列和含有抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体；或(2)包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体，和包含编码含有抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，该宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。
在一个实施方案中，提供制备多特异性抗体的方法，其中该方法包括在适于表达抗体的条件下培养上文提供的含有编码抗体的核酸的宿主细胞，并可选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
对于多特异性抗体的重组产生，分离例如上文所述的编码抗体的核酸，并插入一个或多个载体用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。这种核酸可以用常规方法(例如通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。
适合用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，尤其是在不需要糖基化和Fc效应子功能时，可以在细菌中产生抗体。抗体片段和多肽在细菌中的表达参见例如US5,648,237、US5,789,199和US5,840,523。(还参见Charlton，K.A.，In：MethodsinMolecularBiology，248卷，Lo，B.K.C.(编辑)，HumanaPress，Totowa，NJ(2003)，245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，可以从可溶性级分中的细菌细胞糊分离抗体，并可以进一步纯化。
除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是编码抗体的载体的适宜的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross，T.U.，Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li，H.等，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
适合用于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了许多可以与昆虫细胞结合使用，尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的杆状病毒毒株。
植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，可以使用适应悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人胚肾细胞系(描述于例如Graham，F.L.等，J.GenVirol.36(1977)59-74中的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(描述于例如Mather，J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-252中的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；buffalo大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；描述于例如Mather，J.P.等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中的TRI细胞；MRC5细胞；及FS4细胞。其他有用的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77(1980)4216-4220)；及骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。适合用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki，P.和Wu，A.M.，MethodsinMolecularBiology，248卷，Lo，B.K.C.(编辑)，HumanaPress，Totowa，NJ(2004)，255-268页。
本发明的多特异性抗体通过重组手段产生。因此，本发明的一个方面是编码本发明的多特异性抗体的核酸，另一方面是包含该编码本发明的多特异性抗体的核酸的细胞。用于重组产生的方法为现有技术中公知，且包括在原核和真核细胞中表达蛋白质，随后分离多特异性抗体，并通常纯化至可药用纯度。
为了在宿主细胞中表达前述抗体，通过标准方法将编码各修饰轻链和重链的核酸插入表达载体。在适当的原核或真核宿主细胞(如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌(E.coli)细胞)中进行表达，并从细胞(上清或裂解后的细胞)回收抗原结合蛋白。用于重组产生抗体的一般方法为现有技术公知，并描述于例如Makrides，S.C.，ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.等，ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-160；Werner，R.G.，DrugRes.48(1998)870-880的综述文章中。
本发明的多特异性抗体具有一个恒定κ轻链结构域(CLκ)和一个恒定λ轻链结构域(CLλ)，且适宜地通过常规免疫球蛋白纯化流程例如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶过滤、透析或亲和层析从培养基分离，具体而言，通过使用κ轻链和λ轻链亲和层析的两个连续的亲和层析步骤及随后的大小排阻层析步骤(如例如实施例3中所述)来纯化本发明的多特异性抗体。
本申请中所用的术语“宿主细胞”指可以改造来产生本发明的抗体的任意一种细胞系统。在一个实施方案中，用HEK293细胞和CHO细胞作为宿主细胞。
本文所用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，且所有这类命名都包括后代。因此，词语“转化体”和“转化细胞”包括最初的主题细胞及从其衍生的培养物，而不考虑转移的数目。还应理解，由于有意或无意的突变，所有后代的DNA含量可以并非精确相同。包括具有与在最初转化的细胞中筛选的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变体后代。
NS0细胞中的表达由例如Barnes，L.M.等，Cytotechnology32(2000)109-123；Barnes，L.M.等，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述。瞬时表达由例如Durocher，Y.等，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述。可变结构域的克隆由Orlandi，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)3833-3837；Carter，P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289；Norderhaug，L.等，J.Immunol.Methods204(1997)77-87描述。优选的瞬时表达系统(HEK293)由Schlaeger，E.-J.和Christensen，K.在Cytotechnology30(1999)71-83中及Schlaeger，E.-J.在J.Immunol.Methods194(1996)191-199中描述。
适合用于原核生物的控制序列例如包括启动子、可选地操纵基因序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和多腺苷酸化信号。
在将它置于与另一多核苷酸序列的功能关系中时，多核苷酸“有效连接”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则它与多肽的DNA有效连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列有效连接；或者，如果放置核糖体结合位点以便于翻译，则它与编码序列有效连接。通常，“有效连接”意指所连接的核酸序列是连续的，且在分泌前导序列的情况下是连续且符合读框的。但是，增强子不必是连续的。通过在方便的限制位点处连接来达到连接。如果这类位点不存在，则按照常规实施使用合成的寡核苷酸衔接物或接头。
本文所用的术语“转化”指将载体/核酸转入宿主细胞的过程。如果用没有难以对付的细胞壁屏障的细胞作为宿主细胞，则例如通过Graham，F.，L.和VanderEb，A.，J.，Virology52(1973)456-467所述的磷酸钙沉淀法进行转染。但是，也可以使用用于将DNA引入细胞的其他方法，如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用包含实质性细胞壁结构的原核细胞，则例如转染的一种方法是Cohen，S.，N.等，PNAS.69(1972)2110-2114所述的使用氯化钙的钙处理。
本文所用的“表达”指核酸转录为mRNA的过程和/或所转录的mRNA(也称为转录物)随后翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和所编码的多肽统称为基因产物。如果多核苷酸源自基因组DNA，则在真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。
“载体”尤其是自我复制的核酸分子，其将所插入的核酸分子转移入宿主细胞和/或宿主细胞之间。该术语包括主要功能是将DNA或RNA插入细胞(例如染色体整合)的载体、主要功能是复制DNA或RNA的复制载体及主要功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供一种以上所述功能的载体。
“表达载体”是多核苷酸，在引入适当的宿主细胞时，其可以转录和翻译为多肽。“表达系统”通常指包含可以发挥功能来产生希望得到的表达产物的表达载体的适宜宿主细胞。
通过包括碱/SDS处理、CsCl分带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他方法的标准技术进行抗体的纯化，以消除细胞成分或其他污染物，例如其他细胞核酸或蛋白质。参见Ausubel，F.等，编辑CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingandWileyInterscience，NewYork(1987)。由于本发明的多特异性抗体在抗体的每个臂上包含两种不同的恒定轻链结构域(κ和λ)，可以通过使用κ轻链和λ轻链亲和层析的两个连续的亲和层析步骤及随后的大小排阻层析步骤(例如实施例3中所述)来从不完整或错配的副产物纯化它们。
一般而言，良好地建立了不同的方法并广泛用于蛋白质纯化，如使用微生物蛋白质的亲和层析(例如proteinA、ptoreinG亲和层析)、离子交换层析(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨乙基树脂)和混合模式交换)、亲硫吸附(例如具有β-巯基乙醇和其他SH配体)、疏水相互作用或芳族吸附层析(例如具有苯基-琼脂糖、aza-arenophilic树脂或间-氨基苯基硼酸)、金属螯合亲和层析(例如具有Ni(II)-和Cu(II)亲和物质)、大小排阻层析和电泳方法(如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
术语“药物组合物”指这样的制备物，其以这样的形式存在，使得允许包含在其中的活性成分的生物活性有效，且不包含对将要施用该组合物的个体具有不可接受的毒性的附加成分。药物组合物包含与可药用载体组合的治疗有效量的活性成分。
“可药用载体”或“可药用赋形剂”指药物组合物中除活性成分之外的成分，其对个体无毒性。可药用载体或赋形剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
药物组合物
通过将具有希望得到的纯度的这种抗体与一种或多种可选的可药用载体(Remington′sPharmaceuticalSciences第16版，Osol，A.(编辑)(1980))混合，以冻干组合物或水溶液的形式制备本文所述的多特异性抗体的药物组合物。可药用载体一般在所利用的剂量和浓度下对受体无毒性，且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；氯苄烷铵；苄索氯铵；苯酚；丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性可药用载体进一步包括间质药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(BaxterInternational，Inc.)。包括rhuPH20的某些示例性sHASEGP和使用方法描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一方面，将sHASEGP与诸如软骨素酶的一种或多种附加的糖胺聚糖酶组合。
示例性冻干抗体制剂/组合物描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂/组合物包括描述于美国专利号6,171,586和WO2006/044908中的那些，后一种制剂/组合物包含组氨酸-乙酸缓冲液。
本文公开的组合物还可以根据所治疗的具体适应症的需要包含一种以上活性成分，优选相互无不利影响的具有互补活性的那些。这类活性成分以对预期目的有效的量适宜地组合存在。
活性成分可以包载在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊(例如，分别为羟甲基纤维素微囊或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米囊(nanocapsule))中或粗滴乳状液中。这类技术公开于Remington′sPharmaceuticalSciences第16版，Osol，A.(编辑)(1980)中。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的适宜的实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成形物品的形式，例如膜或微囊。
待用于体内施用的组合物通常是无菌的。无菌可以容易地例如通过滤过无菌滤膜来达到。
本文所用的“处理”(及其语法变形)指改变所处理的个体的自然过程的尝试中的临床干预，且可以为了预防而进行或在临床病理的过程中进行。希望得到的处理作用包括但不限于防止疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任意直接或间接的病理结果、防止转移、降低疾病进展的速率、改善或缓和疾病状态及消退或改善的预后。在一些实施方案中，用本发明的抗体来延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。
本发明的一个方面是包含本发明的多特异性抗体的药物组合物。
本发明的另一个方面是本发明的多特异性抗体在制备药物组合物中的用途。
本发明的另一个方面是用于制备包含本发明的多特异性抗体的药物组合物的方法。
在另一方面，本发明提供组合物，例如药物组合物，其包含与可药用载体配制在一起的本发明的多特异性抗体。
本发明的另一方面是该药物组合物用作药物。本发明的另一方面是该药物组合物用于治疗癌症。
本发明的另一方面是本发明的多特异性抗体用作药物。本发明的另一方面是本发明的多特异性抗体用于治疗癌症。
本发明的另一方面是本发明的多特异性抗体在制备药物中的用途。本发明的另一方面是本发明的多特异性抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
本发明的另一方面是通过对需要这种治疗的患者施用本发明的多特异性抗体来治疗患有疾病的患者的方法。本发明的另一方面是通过对需要这种治疗的患者施用本发明的多特异性抗体来治疗患有癌症的患者的方法。
本发明的药物组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。如熟练的技术人员将理解，施用的途径和/或方式将取决于希望得到的结果而不同。为了通过某些给药途径施用本发明的化合物，可以有必要用防止其失活的材料包被化合物，或者与防止其失活的材料共同施用化合物。例如，化合物可以在适当的载体(例如脂质体)或稀释剂中对个体施用。可药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药物载体包括无菌水溶液或分散体及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这类介质和物质在药物活性物质中的用途为本领域已知。
本文所用的短语“肠胃外施用”指肠内和局部施用之外的施用方式，通常通过注射，且非限制性地包括静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
本文所用的术语癌症指增生性疾病，如淋巴癌、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、腹部癌(stomachcancer)、胃癌(gastriccancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经系统(CNS)赘生物、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星细胞瘤、施万细胞瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤因肉瘤，包括任意以上癌症的难治形式、或一种或多种以上癌症的组合。
这些组合物还可以包含佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过上文的灭菌流程及通过包含多种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等)二者来确保防止微生物的存在。还可以希望在组合物中包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶来产生可注射药物形式的延长吸收。
无论选择何种给药途径，都通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明的化合物(其可以适宜的水合形式使用)和/或本发明的药物组合物配制为可药用剂型。
为了获得对就具体患者、组合物和施用方式达到希望得到的治疗反应有效而对患者没有毒性的活性成分量，本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以不同。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，其包括所利用的本发明的具体组合物的活性；给药途径；施用时间；所利用的具体化合物的排泄速率；处理持续时间；与所利用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料；所处理的患者的年龄、性别、体重、状态、一般健康和过往病史；和医学领域公知的类似因素。
组合物必须无菌，且为流体，至可通过注射器递送组合物的程度。除水外，载体优选等渗缓冲盐溶液。
可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣、在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小及通过使用表面活性剂，来维持恰当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇或山梨醇)和氯化钠。
提供以下实施例和附图来辅助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中给出。应理解，可以在所示流程中进行修改而不背离本发明的精神。
3.本发明的具体实施方案
下文中列出本发明的具体实施方案：
1.多特异性抗体，其包含：
a)两条修饰重链，其中各重链按C端至N端方向包含重链恒定结构域3、2和1(CH3、CH2和CH1)及轻链可变结构域(VL)，其中该轻链可变结构域(VL)是共同轻链的可变结构域；
b)一条修饰轻链，其中该修饰轻链按C端至N端方向包含κ同种型的恒定轻链结构域(CL)，和源自特异性结合第一抗原的抗体的可变重链结构域(VH1)；和
c)一条修饰轻链，其中该修饰轻链按C端至N端方向包含λ同种型的恒定轻链结构域和源自特异性结合第二抗原的抗体的可变重链结构域(VH2)；
其中该可变结构域VH1和VL形成特异性结合第一抗原的第一抗原结合部位，且其中该可变结构域VH2和VL形成特异性结合第二抗原的第二抗原结合部位。
2.实施方案1的抗体，其中该抗体是双特异的。
3.实施方案1或2的抗体，其中该抗体是二价的。
4.前述实施方案中任一个的抗体，其中该抗体是双特异的和二价的。
5.前述实施方案中任一个的抗体，其中该抗体属于IgG1或IgG4亚类。
6.前述实施方案中任一个的抗体，其中该抗体属于IgG1亚类。
7.前述实施方案中任一个的抗体，其中该抗体属于IgG4亚类。
8.前述实施方案中任一个的抗体，其中该修饰重链包含在其氨基酸序列上100％同一的VL-CH1结构域。
9.前述实施方案中任一个的抗体，其中未通过氨基酸取代改变该多特异性抗体的重链恒定结构域CH3来支持异二聚化。
10.前述实施方案中任一个的抗体，其中未按照杵入臼技术通过氨基酸取代改变该多特异性抗体的重链恒定结构域CH3来支持异二聚化。
11.前述实施方案中任一个的抗体，其中该多特异性抗体的重链恒定结构域CH3在其氨基酸序列上100％同一。
12.前述实施方案中任一个的抗体，其中：
a)该修饰重链按C端至N端方向由CH3-CH2-铰合部-CH1-VL组成，其中该VL是共同轻链的可变结构域；
b)第一修饰轻链按C端至N端方向由κ同种型的恒定轻链结构域(CL)，和源自特异性结合第一抗原的抗体的可变重链结构域(VH1)组成；和
c)第二修饰轻链按C端至N端方向由λ同种型的恒定轻链结构域(CL)和源自特异性结合第二抗原的抗体的可变重链结构域(VH2)组成。
13.用于制备前述实施方案中任一个的多特异性抗体的方法，其包括步骤：
a)用包含编码前述实施方案中任一个的多特异性抗体的核酸分子的表达载体转化宿主细胞；
b)在允许合成该多特异性抗体分子的条件下培养该宿主细胞；和
c)从该培养物回收该多特异性抗体分子。
14.实施方案13的方法，其中用三种不同表达载体转化该宿主细胞，其中第一表达载体包含编码含有κ同种型的恒定轻链结构域的修饰轻链的核酸分子，其中第二表达载体包含编码含有λ同种型的恒定轻链结构域的修饰轻链的核酸分子，其中第三表达载体包含编码修饰的重链的核酸分子。
15.核酸，其编码实施方案1至12中任一个的抗体的轻链。
16.核酸，其编码实施方案1至12中任一个的抗体的重链。
17.核酸，其编码实施方案1至12中任一个的多特异性抗体。
18.表达载体，其包含实施方案15至17中任一个的核酸。
19.实施方案18的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达该核酸。
20.宿主细胞，其包含实施方案18或19的表达载体。
21.实施方案20的宿主细胞，其中该宿主细胞包含三种不同表达载体，其中第一表达载体包含编码含有κ同种型的恒定轻链结构域的修饰轻链的核酸分子，其中第二表达载体包含编码含有λ同种型的恒定轻链结构域的修饰轻链的核酸分子，其中第三表达载体包含编码修饰的重链的核酸分子。
22.实施方案20或21的宿主细胞，其中该宿主细胞是真核的或原核的。
23.实施方案20或21的宿主细胞，其中该宿主细胞是真核的。
24.实施方案20或21的宿主细胞，其中该宿主细胞是原核的。
25.用于产生基于特异性结合第一抗原的第一抗体和特异性结合第二抗原的第二抗体的多特异性抗体的方法，其中该第一抗体和该第二抗体包含共同轻链，该方法包括步骤：
a)通过用源自该第一抗体的重链的重链可变结构域(VH1)取代轻链可变结构域(VL)和可选地用κ同种型的恒定轻链结构域取代原来的恒定轻链结构域，来修饰源自该第一抗体的轻链，以获得按C端至N端方向包含κ同种型的恒定轻链结构域和重链可变结构域(VH1)的轻链；
b)通过用源自该第二抗体的重链的重链可变结构域(VH2)取代轻链可变结构域(VL)和可选地用λ同种型的恒定轻链结构域取代原来的恒定轻链结构域，来修饰源自该第二抗体的轻链，以获得按C端至N端方向包含λ同种型的恒定轻链结构域和重链可变结构域(VH2)的轻链；
c)通过用源自该第一抗体的轻链的轻链可变结构域(VL)取代重链可变结构域(VH1)，来修饰源自该第一抗体的重链，以获得按C端至N端方向包含重链恒定结构域3、2和1(CH3、CH2和CH1)及轻链可变结构域(VL)的重链；和/或
通过用源自该第二抗体的轻链的轻链可变结构域(VL)取代重链可变结构域(VH2)，来修饰源自该第二抗体的重链，以获得按C端至N端方向包含重链恒定结构域3、2和1(CH3、CH2和CH1)及轻链可变结构域(VL)的重链。
26.实施方案25的方法，其用于产生实施方案1至12中任一个的多特异性抗体。
27.多特异性抗体，其通过实施方案25或26的方法获得。
28.药物组合物，其包含与至少一种可药用赋形剂组合的实施方案1至12和26中任一个的多特异性抗体。
29.实施方案28的药物组合物，其中该药物组合物包含治疗有效量的多特异性抗体。
30.实施方案1至12和26中任一个的多特异性抗体，其用作药物。
31.实施方案1至12和26中任一个的多特异性抗体，其用于治疗癌症。
32.实施方案28或29的药物组合物，其用作药物。
33.实施方案28或29的药物组合物，其用于治疗癌症。
34.实施方案1至12和26中任一个的多特异性抗体的用途，用于制备药物。
35.实施方案1至12和26中任一个的多特异性抗体的用途，用于制备用于治疗癌症的药物。
36.用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于对该患者施用治疗有效量的实施方案1至12和26中任一个的多特异性抗体。
37.用于治疗需要治疗的癌症患者的方法，其特征在于对该患者施用治疗有效量的实施方案1至12和26中任一个的多特异性抗体。
序列描述
SEQIDNO：1修饰重链CH3-CH2-CH1-VL(CLC-Fccross-Mab)的核苷酸序列，其中VL是共同轻链的可变结构域
SEQIDNO：2修饰轻链的核苷酸序列，该修饰轻链包含由CLκ-VH1-CLκ组成的多肽，其中VH1是来自结合第一抗原的抗体的可变重链结构域([抗-DR52A11VH1]-CLκ)
SEQIDNO：3修饰轻链的核苷酸序列，该修饰轻链包含由CLκ-VH1-CLκ组成的多肽，其中VH1是来自结合第一抗原的抗体的可变重链结构域([抗-DR58E11VH1]-CLκ)
SEQIDNO：4修饰轻链的核苷酸序列，该修饰轻链包含由CLκ-VH1-CLκ组成的多肽，其中VH1是来自结合第一抗原的抗体的可变重链结构域([抗-DR521C11VH1]-CLκ)
SEQIDNO：5修饰轻链VH2-CLλ的核苷酸序列，其中VH2是来自结合第二抗原的抗体的可变重链结构域([抗-FAP3C6VH2]-CLλ)
SEQIDNO：6修饰重链CH3-CH2-CH1-VL的氨基酸序列，其中VL是共同轻链的可变结构域(CLC-Fccross-Mab)
SEQIDNO：7修饰轻链的氨基酸序列，该修饰轻链包含由CLκ-VH1-CLκ组成的多肽，其中VH1是来自结合第一抗原的抗体的可变重链结构域([抗-DR52A11VH1]-CLκ)
SEQIDNO：8修饰轻链的氨基酸序列，该修饰轻链包含由CLκ-VH1-CLκ组成的多肽，其中VH1是来自结合第一抗原的抗体的可变重链结构域([抗-DR58E11VH1]-CLκ)
SEQIDNO：9修饰轻链的氨基酸序列，该修饰轻链包含由CLκ-VH1-CLκ组成的多肽，其中VH1是来自结合第一抗原的抗体的可变重链结构域([抗-DR521C11VH1]-CLκ)
SEQIDNO：10修饰轻链VH2-CLλ的氨基酸序列，其中VH2是来自结合第二抗原的抗体的可变重链结构域([抗-FAP3C6VH2]-CLλ)
实施例1
共同轻链文库(CLCL)的产生和结合剂产生
产生了用于噬菌体展示的文库，使其全部多样性位于重链中。从来自之前的人源化项目的已有抗体选择轻链(WO2013/026832中所述的抗-MCSP抗体LC007(LC007人源化抗体ML1VL)的人源化轻链)。
选择两种不同重链包含在此文库中。第一种是DP47，另一种是DP88(IMGT检索号分别为IGHV3-23＊01和IGHV1-69＊06)。J元件分别为JH4(FDYWGQGTLVTVSS)和JH6(MDAWGQGTTVTVSS)。用所述基于三核苷酸构件的随机化引物(等；NucleicAcidsRes.1994Dec25；22(25)：5600-7.)多样化两种重链的CDR3。对于对应于D元件(氨基酸95-98、95-100或95-100b)的序列，两个文库中CDR3环的长度为4、6或8个氨基酸长。抗体文库以Fab型式克隆在常规M13噬菌体展示系统中(deHaard等；JournalofBiologicalChemistry274卷，26期，1999年6月25日，18218-18230页)。
生物素化并固定在链霉抗生物素蛋白小球上之后，对重组FAB和DR5蛋白质进行噬菌体淘选。选择后通过ELISA确认结合，通过经典双脱氧测序对阳性克隆进行测序，然后转化为IgG或CrossMab型式。
实施例2
双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体的产生
为了在不使用任何异二聚化方法(例如杵入臼技术)的情况下产生可同时结合两种不同抗原的双特异性抗体，应用了共同轻链与所谓的CrossMab技术的组合：使共同轻链(CLC)的可变区与标准人IgG1抗体的CH1结构域融合形成两种特异性所共有的VL/VH交叉分子(与Fc融合)。为了产生交叉对应物(VH-CL)，使对抗原A特异的可变重链结构域(分离自共同轻链文库)与恒定人κ轻链融合，而对抗原B特异的可变重链结构域(也分离自共同轻链文库)与恒定人l轻链融合。这使得能够通过应用以KappaSelect和LambdaFabSelect柱(GEHealthcare)去除不希望得到的同二聚体抗体的后续纯化步骤，来纯化希望得到的双特异性抗体。
对于概念验证，为了观察这些分子是否可以活性形式产生，将抗人死亡受体(TRAIL-R2)和人成纤维细胞活化蛋白(FAP)的抗体以1+1价组合为双特异性抗体。
在第一个构建体中，将DR5结合剂2A11与FAP结合剂3C6组合。在显示此分子可以结合两种抗原且在凋亡诱导测定中具有活性之后，按上文所述产生了另外两种DR5-FAP双特异性构建体：此处使FAP结合剂3C6与分离自共同轻链文库的不同DR5结合剂(即8E11和21C11)融合。本发明的这些特异性结合DR5和FAP的双特异性抗体也进一步称为“双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体”。
用Sambrook，J.等，Molecularcloning：Alaboratorymanual；ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork，1989中所述的标准重组DNA技术产生了所有抗体表达载体。按照厂家的建议使用分子生物学试剂。基因或基因片段通过聚合酶链反应(PCR)扩增或在GeneartAG(Regensburg，德国)通过自动化基因合成从合成的寡核苷酸产生。通过DNA测序(SynergeneGmbH，瑞士)确认PCR扩增或亚克隆的DNA片段。将质粒DNA转化入适宜的大肠杆菌宿主菌株并在其中扩增，用于用标准Maxiprep试剂盒(Qiagen)制备转染级质粒DNA。为了产生双特异性分子，使用标准的基于聚乙烯亚胺(PEI)的方法，用编码各基因的质粒转染HEK293EBNA细胞。所使用的三种质粒的质粒比为1∶1∶1。转染细胞培养7天，然后收集上清进行纯化。
因此，产生了以下三种本发明的特异性结合DR5和FAP的双特异性抗体：
表4：双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体
图2A中显示双特异性修饰共同轻链-κ-λ抗体的结构示意图。显示两条相同的修饰重链和两条不同的修饰轻链的可变和恒定结构域。图2B中以抗体GA803_G25_H14D_001(基于抗-DR52A11和抗-FAP3C6)为例，显示双特异性κ-λ抗体的示意图。显示靶向部分和各轻链结构域。以类似的结构域结构产生了3C6与8E11和21C11的组合。
实施例3
双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体的表达和纯化
通过用聚乙烯亚胺，用哺乳动物表达载体共转染悬浮生长的HEK293-EBNA细胞来产生该分子。用1∶1∶2比例的相应表达载体(“载体修饰VH1-κ轻链(DR5-CLκ)”：“载体修饰VH2-λ轻链(FAP-CLλ)”：“载体具有共同轻链VL的修饰重链(CLC-Fccross-Mab)”)转染细胞。
在CDCHO培养基中悬浮无血清培养HEK293-EBNA细胞。对于500ml摇瓶中的产生，转染前24小时接种4亿个HEK293-EBNA细胞。对于转染，210xg离心细胞5分钟，用预热的20mlCDCHO培养基替换上清。在20mlCDCHO培养基中混合表达载体至200μgDNA的最终量。加入540μlPEI后，涡旋溶液15秒，随后室温孵育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶，在5％CO2空气的培养箱中37℃孵育3小时。孵育时间之后，加入160mlF17培养基，并培养细胞24个小时。转染一天后，加入1mM丙戊酸(valporicacid)和7％Feed1。培养7天后，通过210xg离心15分钟来收集上清进行纯化，溶液进行无菌过滤(0.22μm滤器)，加入0.01％w/v终浓度的叠氮化钠，并保存在4℃。
通过使用κ轻链和λ轻链亲和层析的两个连续的亲和层析步骤、随后的大小排阻层析步骤来从细胞培养物上清纯化分泌性蛋白质。
对于第一个亲和层析步骤，将上清上样在装填在Tricorn5/50柱(CV＝1mL，GEHealthcare)中并用5ml50mMTRIS、100mM甘氨酸、150mMNaCl、pH8.0平衡的CaptureSelectKappa亲和基质(BAC)上。通过用至少15个柱体积的50mMTRIS、100mM甘氨酸、150mMNaCl、pH8.0洗涤来去除未结合的蛋白质。以25个柱体积内达到50mMTRIS、100mM甘氨酸、150mMNaCl、pH2.0的分级pH梯度洗脱靶蛋白。
通过1∶1稀释入50mMTRIS、100mM甘氨酸、150mMNaCl、pH8.0来中和来自第一纯化步骤的洗脱物。
在装填在Tricorn5/50柱(CV＝1mL，GEHealthcare)中并用5ml50mMTRIS、100mM甘氨酸、150mMNaCl、pH8.0平衡的CaptureSelectLambda亲和基质(BAC)上进行第二亲和层析步骤。上样后，用至少15个柱体积的50mMTRIS、100mM甘氨酸、150mMNaCl、pH8.0洗涤柱。通过在分级pH梯度中降低pH至pH2.0来从柱洗脱靶蛋白。混合来自CaptureSelectLambda亲和柱的级分，并用离心浓缩管(AmiconMWCO：30.000Da)浓缩。由此更换缓冲液为pH6.0的20mM组氨酸、140mM氯化钠溶液。
随后将浓缩的蛋白质溶液上样在用pH6.0的20mM组氨酸、140mM氯化钠溶液平衡的Superdex20010/300GL柱(GEHealthcare)上。
实施例4
双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体的表征
使用根据氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm光密度(OD)来测定纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。
通过存在和缺乏还原剂情况下的CE-SDS分析来分析分子的纯度和分子量。按照厂家的说明书使用CaliperLabChipGXII系统(Caliperlifescience)。用2ug样品进行分析。电泳图谱显示为双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体的SDS-Page：A)3C6/8E11还原)，B)3C6/8E11(非还原)C)3C6/21C11(还原)，D)3C6/21C11(非还原)(结果显示在图3中)。
用TSKgelG3000SWXL分析型大小排阻柱(Tosoh)在25℃下在25mMK2HPO4、125mMNaCl、200mML-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN3、pH6.7运行缓冲液中分析抗体样品的聚集体含量。
通过两个连续的亲和层析步骤可以均质地纯化由共同重链与κ以及λ轻链组成的分子。表5中列出了制备物的最终单体含量。
表5：双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体的产率和最终单体含量
双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体的LC-MS分析
双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体的去糖基化
为了确认通过两个连续的亲和层析步骤获得的双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体的均质制备物，通过LC-MS分析分析了最终的蛋白质溶液。为了去除由糖类引入的异质性，用PNGaseF处理双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体。因此，通过向浓度0.5mg/ml的20μg蛋白质加入2μl2MTris来将蛋白质溶液的pH调节至pH7.0。加入0.8μgIdeS，并在25℃孵育68小时。
去糖基化的双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体的LC-MS分析(在线检测)
在偶联TOF6441质谱仪(Agilent)的AgilentHPLC1200上进行LC-MS法。在MachereyNagel聚苯乙烯柱RP1000-8(8μm颗粒大小，4.6x250mm；目录号719510)上进行层析分离。洗脱液A是含5％乙腈和0.05％(v/v)甲酸的水，洗脱液B是95％乙腈、5％水和0.05％甲酸。流速为1ml/分钟，在40℃进行分离，用前述处理获得了7μg(15μl)抗体样品。
表6：LC-MS洗脱条件
时间(分钟) ％B
0.5 15
10 60
12.5 100
14.5 100
14.6 15
16 15
16.1 100
在前4分钟期间，洗脱物导入废液，以防止质谱仪受盐污染。以12升/分钟的干燥气流、350℃的温度和60psi的喷雾器压力运行ESI源。以阳离子模式用350V碎裂电压(fragmentorvoltage)和700至3200m/z质量范围获取MS谱。通过仪器软件获取MS数据4至17分钟。
结果
图4中以双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体3C6/8E11为例，通过LC-MS显示均质制备物。144697.1Da处的主峰对应于具有2个氧化位点的蛋白质的正确分子量。LC-MS中未检测到携带两条κ或两条λ轻链的分子(图4)。
实施例5
表面等离振子共振分析双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体与两种不同抗原的同时结合
所有表面等离振子共振(SPR)实验都以HBS-EP作为运行缓冲液(0.01MHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/德国)，在25℃下在T100上进行。
通过在链霉抗生物素蛋白芯片(Biacore，Freiburg/德国)上直接偶联约120个响应单位(RU)的生物素化人和食蟹猴DR5，来进行双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体(GA803_G25_H14D_001)与肿瘤抗原FAP和人死亡受体5(DR5)的同时结合。图5中显示示意图。按150nM捕获双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体(GA803_G25_H14D_001)90秒。随后使浓度500nM的人FAP以30μl/分钟的流速通过90秒。测量解离60秒。通过注射10mM甘氨酸、pH1.530秒来再生表面。
通过减去在参考流动池上获得的响应来校正体积折射率差异(bulkrefractiveindexdifference)，在参考流动池中，重组人FAP流过未捕获双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体的表面。
结果
表面等离振子共振测量结果确认，双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体(GA803_G25_H14D_001)能够同时结合两种抗原(显示在图6中)。
实施例6
双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体的细胞表面结合
通过FACS测量了人双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体与表达DR5的MDA-MB231肿瘤细胞系的细胞及与表达FAP的成纤维细胞系GM05389的细胞的结合。作为对照，使用了包含相同结合剂的另一四价双特异性DR5/FAP抗体构建体。简言之，用40μl所示浓度的构建体在4℃孵育96孔圆底板中的0.2Mio细胞/孔30分钟。通过用含0.1％BSA的PBS洗涤细胞来去除未结合的构建体。用Dylight649缀合的AffiniPureF(ab’)2片段山羊抗-人IgGFcg片段特异性二抗(JacksonImmunoResearch#109-496-098；工作液1∶50在PBS、0.1％BSA中)检测结合的构建体。4℃孵育30分钟后，通过洗涤去除未结合的抗体，并用1％PFA固定细胞。用BDFACSCantoII(SoftwareBDDIVA)分析细胞。结果显示在图7和8中。在DR5阳性MDA-MB231细胞上测试了双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体GA803_G25_H14D_001的结合。构建体以浓度依赖方式结合MDA-MB231细胞(图7)。
在FAP阳性GM05389成纤维细胞上测试了双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体GA803_G25_H14D_001的结合。构建体以浓度依赖方式结合GM05389细胞(图8)。
实施例7
凋亡测定
用CellDeathDetectionELISAplus(RocheAppliedScience#11774425001)在共培养测定中测量了人双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体的凋亡诱导。简言之，在96孔平底细胞培养板中接种10000个表达FAP的GM05389细胞，并在培养箱中孵育过夜。第二天，按所示浓度加入稀释的构建体并孵育10分钟，以允许抗体结合。然后向平板加入10000个凋亡敏感的MDA-MB231肿瘤细胞。作为阴性对照，在缺乏GM05389的情况下测试凋亡诱导。孵育24小时后，按厂家的说明书中所述进行CellDeathDetectionELISA。结果显示在图9中。在缺乏或存在表达FAP的成纤维细胞(GM05389)的情况下在MDA-MB231上测试了三种双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-κ-λ抗体的凋亡诱导。所有构建体都能够在FAP的存在下诱导特异性凋亡。

Claims (15)

1.多特异性抗体，其包含：
a)两条修饰重链，其中各重链按C端至N端方向包含重链恒定结构域3、2和1(CH3、CH2和CH1)，及轻链可变结构域(VL)，其中轻链可变结构域(VL)是共同轻链的可变结构域；
b)一条修饰轻链，其中修饰轻链按C端至N端方向包含κ同种型的恒定轻链结构域(CL)，和源自特异性结合第一抗原的抗体的可变重链结构域(VH1)；和
c)一条修饰轻链，其中修饰轻链按C端至N端方向包含λ同种型的恒定轻链结构域，和源自特异性结合第二抗原的抗体的可变重链结构域(VH2)；
其中可变结构域VH1和VL形成特异性结合第一抗原的第一抗原结合部位，且其中可变结构域VH2和VL形成结合第二抗原的第二抗原结合部位。
2.权利要求1的多特异性抗体，其中抗体是二价、双特异性抗体。
3.权利要求1至2中任一项的多特异性抗体，其中抗体属于IgG种类。
4.前述权利要求中任一项的多特异性抗体，其中抗体属于IgG1或IgG4亚类。
5.核酸，其编码前述权利要求中任一项的多特异性抗体。
6.包含权利要求5的核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸。
7.原核或真核宿主细胞，其包含权利要求6的表达载体。
8.用于制备权利要求1至4中任一项的多特异性抗体的方法，其包括步骤：
a)用包含编码权利要求1至4中任一项的多特异性抗体的核酸分子的表达载体转化宿主细胞；
b)在允许合成所述多特异性抗体分子的条件下培养所述宿主细胞；和
c)从所述培养物回收所述多特异性抗体分子。
9.药物组合物，其包含权利要求1至4中任一项的多特异性抗体和至少一种可药用赋形剂。
10.权利要求1至4中任一项的多特异性抗体，其用作药物。
11.权利要求1至4中任一项的多特异性抗体的用途，用于制备药物。
12.用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于对所述患者施用治疗有效量的权利要求1至4中任一项的多特异性抗体。
13.用于产生基于特异性结合第一抗原的第一抗体和特异性结合第二抗原的第二抗体的多特异性抗体的方法，其中第一抗体和第二抗体包含共同轻链，该方法包括步骤：
a)通过用源自所述第一抗体的重链的重链可变结构域(VH1)取代轻链可变结构域(VL)和可选地用κ同种型的恒定轻链结构域取代原来的恒定轻链结构域，来修饰源自所述第一抗体的轻链，以获得按C端至N端方向包含κ同种型的恒定轻链结构域和重链可变结构域(VH1)的轻链；
b)通过用源自所述第二抗体的重链的重链可变结构域(VH2)取代轻链可变结构域(VL)和可选地用λ同种型的恒定轻链结构域取代原来的恒定轻链结构域，来修饰源自所述第二抗体的轻链，以获得按C端至N端方向包含λ同种型的恒定轻链结构域和重链可变结构域(VH2)的轻链；
c)通过用源自所述第一抗体的轻链的轻链可变结构域(VL)取代重链可变结构域(VH1)，来修饰源自所述第一抗体的重链，以获得按C端至N端方向包含重链恒定结构域3、2和1(CH3、CH2和CH1)及轻链可变结构域(VL)的重链；和/或
通过用源自所述第二抗体的轻链的轻链可变结构域(VL)取代重链可变结构域(VH2)，来修饰源自所述第二抗体的重链，以获得按C端至N端方向包含重链恒定结构域3、2和1(CH3、CH2和CH1)及轻链可变结构域(VL)的重链。
14.权利要求13的方法，其进一步包括步骤：
a)用包含编码所获得的多特异性抗体的核酸分子的表达载体转化宿主细胞；
b)在允许合成所述多特异性抗体分子的条件下培养所述宿主细胞；和
c)从所述培养物回收所述多特异性抗体分子。
15.多特异性抗体，其通过权利要求13或14的方法获得。
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