KR20230122685A - 신규 고리형 디뉴클레오티드 유도체 및 그 항체 약물콘쥬게이트 - Google Patents

신규 고리형 디뉴클레오티드 유도체 및 그 항체 약물콘쥬게이트 Download PDF

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KR20230122685A
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도시키 다부치
히데아키 와타나베
히로유키 고바야시
마사유키 이시자키
교코 하라
데이지 와다
마사미 아라이
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다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
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Abstract

(과제) STING 아고니스트 활성을 갖는 신규 CDN 유도체 및 그 신규 CDN 유도체를 사용한 STING 아고니스트 활성이 관련하는 질환의 치료제 및/또는 치료법의 개발이 요망되고 있다. 또, 그 신규 CDN 유도체를 목적으로 하는 세포나 장기에 특이적으로 송달할 수 있는, STING 아고니스트 활성이 관련하는 질환의 치료제 및/또는 치료법의 개발이 요망되고 있다.
(해결 수단) 본 발명에 의해, 강한 STING 아고니스트 활성을 갖는 신규 CDN 유도체, 신규 CDN 유도체를 포함하는 항체 CDN 유도체 콘쥬게이트가 제공된다.

Description

신규 고리형 디뉴클레오티드 유도체 및 그 항체 약물 콘쥬게이트{NOVEL CYCLIC DINUCLEOTIDE DERIVATIVE AND ANTIBODY-DRUG CONJUGATE THEREOF}
본 발명은, STING 아고니스트 활성을 갖는 신규 구조를 갖는 고리형 디뉴클레오티드 유도체, 그 신규 고리형 디뉴클레오티드 유도체와 표적 세포에 대한 항체를 링커를 개재하여 결합시킨 항체 약물 콘쥬게이트, 그 항체 약물 콘쥬게이트를 함유하는 의약 조성물 등에 관한 것이다.
STING (Stimulator of Interferon Genes) 은, 소포체에 국재하는 막 관통형의 어댑터 단백질이다 (비특허문헌 1). STING 은, 포유 동물에 있어서의 자연 면역 활성화의 중추 분자로서 기능하고 있고, 세균이나 바이러스와 같은 병원체의 진입에 대한 방어의 최전선을 담당하고 있다. STING 의 활성화는, 복수의 세포질 DNA 센서가, 외인성 및 내인성의 DNA 를 감지했을 때의 시그널에 의해 야기되는 것이 알려져 있다. 세포질 DNA 센서 중에서는, cGAS (Cyclic GMP-AMP Synthase) 가 중요한 DNA 센서라고 생각되고 있다. cGAS 가 DNA 를 감지하면 고리형 디뉴클레오티드 (2',3'-cGAMP) 가 산생되고, 이 2',3'-cGAMP 가 STING 에 직접 결합하여, STING 을 활성화시킨다 (비특허문헌 2). 활성화한 STING 은 골지체로 이동하고, 거기서 TBK1 (Tank-binding kinase 1) 의 자기 인산화를 재촉한다. 자기 인산화하여 활성화한 TBK-1 은, IRF3 (Interferon regulatory factor 3) 전사 경로 (비특허문헌 3) 및 NFκＢ 전사 경로 (비특허문헌 4) 의 양방을 활성화하고, 인터페론이나 사이토카인 (I 형 IFN (Interferon), IL-6 (Interleukin-6), TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α)) 이라고 불리는 염증성 단백질의 산생을 증가시킨다. 이들 단백질은, 복잡한 캐스케이드를 통해서 병원체나 암 세포를 파괴하는 T 세포를 포함하는 획득 면역계를 시동시킨다.
최근 연구에 의해, STING 은 미생물에 대한 숙주 방어 뿐만 아니라, 항종양 면역을 촉진하는 것이 나타났다. 예를 들어, STING 결손 마우스에 면역원성 종양을 이식한 경우, 종양은, 야생형 마우스나 TRIF (Toll/Interleukin-1 (IL-1) receptor domain containing adaptor-inducing interferon-β) 결손 마우스보다 급속히 증식한다. 또, STING 결손 마우스에서는, TLR (Toll-like receptor), MyD88 (Myeloid differentiation primary response 88), MAVS (Mitochondrial antiviral-signaling protein) 결손 마우스와는 달리, 종양에 대한 자발적인 CD8＋ T 세포의 프라임도 소실하였다. 이것은 세포질 DNA 감지에 의해 시동하는 STING 경로가 종양 증식의 제어에 관여하고 있는 것을 시사하고 있다 (비특허문헌 5). 다른 연구에서는, STING 이 방사선 치료 (비특허문헌 6) 또는 항CD47 항체 요법 (비특허문헌 7) 의 항종양 효과에 필요한 것도 나타나 있다. 방사선 또는 항CD47 항체로 처치한 후의, 죽은 종양 세포 유래의 DNA 는, 수상 세포의 세포질로 이동하여 cGAS-STING 경로를 활성화한 후, IFN 산생을 유도하여 자연 면역과 획득 면역의 중개 역할을 한다. 이 연구는, STING 경로에 의해 활성화된 수상 세포를 개재하는 크로스 프라이밍이 종양에 대한 획득 면역을 일으키기 위해서 중요한 것을 시사하고 있다.
혈관 파괴제로서 알려져 있는 플라보노이드계 저분자 화합물 DMXAA 는, 매크로파지의 I 형 IFN 을 유도하기 때문에, 마우스 종양 모델에 있어서, 강력한 항종양 활성을 갖는 것이 나타났다 (비특허문헌 8). DMXAA 는 전(前) 임상에서의 우수한 항종양 효과 때문에, 비소세포 폐암의 면역요법약으로서 기대되고 있었지만, 인간 임상 시험에는 실패하였다 (비특허문헌 9). 최근 연구에 의해, DMXAA 는 마우스의 STING 에 대한 특이적인 아고니스트이고, 인간의 STING 에는 종 교차성이 없기 때문에, 결합할 수 없는 것이 밝혀졌다 (비특허문헌 10). DMXAA 는, 결과적으로 인간에서는 무효하였지만, 마우스 모델에 있어서의 연구에 의해, 저분자약이 STING 을 개재하여, 효과적으로 CD8＋ T 세포를 프라이밍하고, 항종양 면역을 증강할 수 있는 것이 시사되었다.
다른 저분자 화합물로서, 고리형 디뉴클레오티드 (Cyclic dinucleotide, CDN) 는, 담암 (tumour-bearing) 마우스에 투여하면 STING 개재에 의한 항종양 면역 응답이 증강하여 종양 증식이 현저하게 저해되고, 마우스의 생존률을 개선하는 것이 나타났다 (비특허문헌 11). CDN 은, 세균 유래의 표준적인 2 개의 3'-5'인산 결합을 갖는 CDN (cyclic-di-GMP, cyclic-di-AMP, 3',3'-cGAMP) 과, 포유 동물의 cGAS 가 산생하는 비표준적인 2'-5'인산 결합을 갖는 혼합 결합형의 CDN (2',3'-cGAMP) 으로 분류된다. 최근 연구에 의해, 표준적인 CDN 보다 혼합 결합형의 CDN 쪽이 다양한 STING 을 보편적으로 활성화 가능한 것이 나타나 있다 (비특허문헌 12).
천연형의 CDN 은, 많은 핵산 분자와 같이 혈액 중의 핵산 분해 효소에 의해 신속하게 분해되기 때문에, 그대로의 형태로 투여할 수는 없다. 그 때문에, 생체내에서 STING 아고니스트 활성을 갖는 합성 저분자 화합물이 개발되고 있다 (예를 들어, 특허문헌 1 ∼ 26).
현재, 항종양제로서 임상 시험이 진행되고 있는 STING 아고니스트의 MIW-815 (ADU-S100, ML RR-S2 CDA 또는 ML-RR-CDA·2Na＋ 라고 불리는 경우도 있다) 는, 종양 내에 직접 투여된다. STING 아고니스트를 종양에 직접 투여하는 방법으로는, 종양 내의 한정된 범위 밖에 약제를 투여할 수 없고, 또, 복수의 원격 전이 종양 전부에 직접 투여하는 것은 곤란하기 때문에, 치료 가능한 종양이 한정되어 버린다는 문제가 있다. 비특허문헌 13 에는, ML RR-S2 CDA 투여에 의해 항종양 효과가 나타난 것이 기재되지만, 종양내 투여 뿐이며, 전신 투여 (예를 들어, 정맥내 투여) 에 의한 항종양 효과는 개시되어 있지 않다. 비특허문헌 14 에는, STING 아고니스트의 SB11285 를 마우스 종양 모델에 정맥내 투여하면 항종양 효과가 나타난 것이 기재되지만, SB11285 가 구체적으로 어떠한 구조를 갖는 화합물인지는 밝혀져 있지 않다. 특허문헌 14 에는, 면역 자극 화합물과 항체 구축물과 링커를 함유하는 콘쥬게이트가 기재되어 있지만, 면역 자극 화합물로서 STING 아고니스트를 사용한 콘쥬게이트의 구체예는 기재되어 있지 않다. 특허문헌 26 에는, 특정한 구조를 갖는 CDN 과 항체를 링커를 개재하여 결합시킨 콘쥬게이트가 기재되어 있지만, 콘쥬게이트를 in vivo 에서 투여한 실시예의 기재가 없고, 콘쥬게이트의 항종양 효과는 확인되어 있지 않다.
WO2014/099824 WO2014/179335 WO2014/189805 WO2014/189806 WO2015/074145 WO2015/185565 WO2016/096714 WO2016/012305 WO2016/145102 WO2017/027646 WO2017/027645 WO2017/075477 WO2017/093933 WO2017/100305 WO2017/123669 WO2017/161349 WO2017/175147 WO2017/175156 WO2018/009466 WO2018/045204 WO2018/060323 WO2018/067423 WO2018/065360 WO2014/093936 WO2018/009648 WO2018/100558
Nature 2008, 455, 674-678 Mol. Cell, 2013, 51, 226-235 Science 2015a, 347, aaa2630 J. Virol. 2014, 88, 5328-5341 I㎜unity 2014, 41, 830-842 I㎜unity 2014, 41, 843-852 Nat. Med. 2015, 21, 1209-1215 J. I㎜unol. 1994, 153, 4684-4693 J. Clin. Oncol. 2011, 29, 2965-2971 J. I㎜unol. 2013, 190, 5216-5225 Sci. Rep. 2016, 6, 19049 Mol. Cell, 2015, 59, 891-903 Cell Rep. 2015, 11, 1018-1030 AACR Tumor I㎜unology and I㎜unotherapy, 2017, Poster＃A25
STING 아고니스트 활성을 갖고, 인터페론이나 사이토카인 등의 염증성 단백질의 산생을 증가시켜 면역 세포를 부활화하는, 신규 골격을 갖는 CDN 유도체 및 그 신규 CDN 유도체를 사용한 STING 아고니스트 활성이 관련하는 질환, 예를 들어, 면역 부활화에 의한 치료가 가능한 질환 (예를 들어, 암) 의 치료제 및/또는 치료법의 개발이 요망되고 있다. 또, 전신 투여가 가능하고, 또한, 목적으로 하는 세포나 장기 (예를 들어, 종양 부위) 에 특이적으로 STING 아고니스트를 송달할 수 있는 그 신규 CDN 유도체와 표적 세포에 대한 항체를 링커를 개재하여 결합시킨 항체 약물 콘쥬게이트 및 그 항체 약물 콘쥬게이트를 사용한 STING 아고니스트 활성이 관련하는 질환, 예를 들어, 면역 부활화에 의한 치료가 가능한 질환 (예를 들어, 암) 의 치료제 및/또는 치료법의 개발이 요망되고 있다.
본 발명자들은, 상기의 과제를 해결하기 위해서, 축합 3 고리성 치환기를 갖는 것을 특징으로 하는 신규 CDN 유도체를 알아내어, 그 신규 CDN 유도체가, 강한 STING 아고니스트 활성을 갖고, 강한 항종양 활성을 나타내는 것을 알아냈다. 본 발명자들은 또한, 본원 발명의 신규 CDN 유도체와 항체를 링커를 개재하여 결합시킨 항체 약물 콘쥬게이트를 알아내어, 그 항체 약물 콘쥬게이트를 전신 투여하면, 항원이 발현하고 있는 종양에서 항종양 효과가 나타나는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.
즉 본원 발명은 이하에 관한 것이다.
[1] 다음 식 (II) :
[화학식 1]
Figure pat00001
(식 중, m1 은 1 내지 10 의 범위이고,
Ab 는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편을 나타내고, 그 항체의 당사슬은 리모델링 되어 있어도 되고,
L 은, Ab 와 D 를 연결하는 링커를 나타내고,
Ab 는 그 아미노산 잔기로부터 직접 L 에 결합하거나, Ab 의 당사슬 또는 리모델링 된 당사슬로부터 L 에 결합하고 있어도 되고,
D 는, 다음 식 (I) :
[화학식 2]
Figure pat00002
(여기서,
L 은, L1 또는 L2 에 포함되는 임의의 -NH2 또는 하이드록시기와 결합하고,
L1 은, 하이드록시기, -NH2, 2-하이드록시아세틸아미노메틸기 및 2-[(2-하이드록시아세틸)아미노]에틸기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 내지 3 개의 기에 의해 임의의 위치에서 치환되어 있어도 되는, 다음 식
[화학식 3]
Figure pat00003
(여기서,
R6 및 R6' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, -NH2, C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기 또는 C2-C6 알키닐기를 나타내고,
R7 및 R7' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1-C6 알킬기를 나타내고, 그 C1-C6 알킬기는, 할로겐 원자 및 옥소기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 개의 치환기에 의해 치환되어 있어도 되고,
R8 및 R8' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 할로겐 원자를 나타내고,
Z4 는, -CH2-, -NH- 또는 산소 원자를 나타내고,
Z5 는, 질소 원자 또는 -CH= 를 나타낸다)
으로 이루어지는 군에서 선택되는 기를 나타내고,
L2 는, 하기 (i) 또는 (ii) :
(i) L 과 결합할 때, L2 는, -NHR', 하이드록시 C1-C6 알킬기 또는 아미노 C1-C6 알킬기를 나타내고, 여기서, R' 는, 수소 원자, C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기, C2-C6 알키닐기 또는 C3-C6 시클로알킬기를 나타내고, 그 C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기 또는 C2-C6 알키닐기는, 1 내지 6 개의 할로겐 원자로 치환되어도 된다 ; 또는
(ii) L 과 결합하지 않을 때, L2 는, 수소 원자 또는 할로겐 원자를 나타낸다,
에서 선택되는 기를 나타내고,
Q1 및 Q1' 는, 각각 독립적으로, 하이드록시기, 티올기 또는 보라노기 (BH3 -) 를 나타내고,
Q2 및 Q2' 는, 각각 독립적으로, 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고,
X1 및 X2 는, 각각 독립적으로, 산소 원자, 황 원자 또는 -CH2- 를 나타내고,
Y1 및 Y2 는, 산소 원자 또는 -CH2- 를 나타내고,
X3 및 X4 는, 하기 (iii) 또는 (iv) :
(iii) Y1 이 산소 원자일 때, X3-X4 는, -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-CH2- 또는 -CH2-CF2- 를 나타낸다 ; 또는
(iv) Y1 이 -CH2- 일 때, X3-X4 는, -O-CH2- 를 나타낸다,
에서 선택되는 기를 나타내고,
X5 및 X6 은, 하기 (v) 또는 (vi) :
(v) Y2 가 산소 원자일 때, X5-X6 은, -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-CH2- 또는 -CH2-CF2- 를 나타낸다 ; 또는
(vi) Y2 가 -CH2- 일 때, X5-X6 은, -O-CH2- 를 나타낸다,
에서 선택되는 기를 나타내고,
R1, R2 및 R3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, -OR', -OC(=O)R', -N3, -NHR', -NR'R'' 또는 -NHC(=O)R' (여기서, R' 는, 앞에 정의한 바와 같고, R'' 는, C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기, C2-C6 알키닐기 또는 C3-C6 시클로알킬기를 나타낸다) 를 나타내고,
W1 은, 질소 원자, 산소 원자, 황 원자 또는 -CH- 를 나타내고,
W2 는, 질소 원자 또는 -CH= 를 나타내고,
R4 는, 수소 원자, 할로겐 원자 또는 -NH2 를 나타내고,
R5 는, 하기 (vii) 내지 (x) :
(vii) W1 이 질소 원자일 때, R5 는 수소 원자, C1-C6 알킬기, 하이드록시 C1-C6 알킬기 또는 아미노 C1-C6 알킬기를 나타낸다 ;
(viii) W1 이 산소 원자일 때, R5 는 존재하지 않고 ;
(ix) W1 이 황 원자일 때, R5 는 존재하지 않고 ; 또는
(x) W1 이 -CH- 일 때, R5 는 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, -NH2 또는 C1-C6 알킬기를 나타낸다,
에서 선택되는 기를 나타내고,
Z1-Z2-Z3 은, 하나가 되어, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-R'''-, -CH=CH-CH2-, -CH=CX-CH2-, -CX=CH-CH2-, -CX=CX-CH2-, -C(=O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(=O)-, -CH2-CH(CH3)-CH2- 또는 -CH2-CH2-CH(CH3)- (여기서, R''' 는, -O- 또는 -CH2-CH2- 를 나타내고, X 는, 할로겐 원자를 나타낸다) 또는 하기 식 중 어느 것으로 나타내는 기
[화학식 4]
Figure pat00004
(여기서, 아스테리스크는, W1 에 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은, =C- 의 탄소 원자에 결합하고 있는 것을 나타낸다) 에서 선택되는 기를 나타낸다)
로 나타내는 화합물을 나타낸다)
로 나타내는 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[2] W1 이 질소 원자인, [1] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[3] W1 이 질소 원자이고, R5 가 수소 원자인, [2] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[4] W1 이 산소 원자인, [1] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[5] W1 이 황 원자인, [1] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[6] W1 이 -CH- 인, [1] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[7] W1 이 -CH- 이고, R5 가 수소 원자인, [6] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[8] Z1, Z2 및 Z3 이, 하나가 되어, -CH2-CH2-CH2- 또는 -CH=CH-CH2- 인, [1] ∼ [7] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[9] Z1, Z2 및 Z3 이, 하나가 되어, -CH2-CH(CH3)-CH2- 또는 -CH2-CH2-CH(CH3)- 인, [1] ∼ [7] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[10] Z1, Z2 및 Z3 이, 하나가 되어, -CH2-CH2-R'''- (여기서, R''' 는, -O- 또는 -CH2-CH2- 를 나타낸다) 인, [1] ∼ [7] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[11] W2 가 -CH= 인, [1] ∼ [10] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[12] W2 가 질소 원자인, [1] ∼ [10] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[13] R4 가, 수소 원자를 나타내는, [1] ∼ [12] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[14] R4 가, 불소 원자를 나타내는, [1] ∼ [12] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[15] L1 중의 R8 및 R8' 가, 각각 독립적으로, 수소 원자인, [1] ∼ [14] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[16] L1 이, 다음 식으로 이루어지는 군에서 선택되는 기
[화학식 5]
Figure pat00005
(여기서, R9 및 R9' 는, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기 또는 -NH2 를 나타내고,
R10 은, 하이드록시기, -NH2, -NHC(=O)CH2OH, -CH2NHC(=O)CH2OH, -CH2CH2NHC(=O)CH2OH, 하이드록시 C1-C3 알킬기 또는 아미노 C1-C3 알킬기를 나타내고,
R11 및 R11' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 불소 원자 혹은 메틸기를 나타내거나, 또는, R11 및 R11' 가 결합하여 시클로프로판을 나타내고,
Z4 는, -CH2-, -NH- 또는 산소 원자를 나타낸다)
인, [1] ∼ [15] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[17] L1 이, 다음 식으로 이루어지는 군에서 선택되는 기
[화학식 6]
Figure pat00006
(여기서, R13 및 R13' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 하이드록시기 또는 -NH2 를 나타내고,
R12 는, 하이드록시기, -NH2, -CH2OH, -NHC(=O)CH2OH, -CH2NHC(=O)CH2OH 또는 -CH2CH2NHC(=O)CH2OH 를 나타내고,
Z4 는, 앞에 정의한 바와 같다)
인, [1] ∼ [15] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[18] L1 이, 다음 식으로 이루어지는 군에서 선택되는 기
[화학식 7]
Figure pat00007
(여기서, R14 는, 수소 원자 또는 -NH2 를 나타내고,
R15 는, 수소 원자 또는 -C(=O)CH2OH 를 나타내고,
R16 은, 하이드록시기, -NH2, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2NH2 또는 -CH2CH2NH2 를 나타낸다)
인, [1] ∼ [15] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[19] L2 가, L 과 결합하고, -NH2, -CH2NH2 또는 -CH2OH 를 나타내는, [1] ∼ [18] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[20] L2 가, L 과 결합하지 않고, 수소 원자 또는 불소 원자를 나타내는, [1] ∼ [18] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[21] Q1 및 Q1' 가, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 티올기를 나타내는, [1] ∼ [20] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[22] X1 및 X2 가, 산소 원자를 나타내는, [1] ∼ [21] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[23] Y1 및 Y2 가, 산소 원자를 나타내는, [1] ∼ [22] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[24] X3 및 X4 가, -CH2-O- 를 나타내는, [1] ∼ [23] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[25] X5 및 X6 이, -CH2-O- 를 나타내는, [1] ∼ [24] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[26] R1, R2 및 R3 이, 각각 독립적으로, 수소 원자, 하이드록시기 또는 불소 원자인, [1] ∼ [25] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트
[27] D 가, 이하의 2 식 :
[화학식 8]
Figure pat00008
(여기서, L1, Q1, Q1', Q2 및 Q2' 는, 앞에 정의한 바와 같고,
R17, R17', R18 및 R18' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기 또는 -NH2 를 나타내고,
W3 은, -NH-, 산소 원자, 황 원자 또는 -CH2- 를 나타내고,
W4 는, -CH= 또는 질소 원자를 나타낸다)
중 어느 것으로 나타내는, [1] ∼ [26] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[28] D 가, 이하의 2 식 :
[화학식 9]
Figure pat00009
(여기서, L1, Q1, Q1', Q2, Q2', R17, R17', R18 및 R18' 는, 앞에 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, [27] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[29] D 가, 이하의 8 식 :
[화학식 10]
Figure pat00010
(여기서, L1, Q1, Q1', Q2 및 Q2' 는, 앞에 정의한 바와 같고,
R19, R19', R20 및 R20' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 불소 원자를 나타낸다)
중 어느 것으로 나타내는, [27] 또는 [28] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[30] D 가, 이하의 4 식 :
[화학식 11]
Figure pat00011
(여기서, L1 은, 앞에 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, [27] ∼ [29] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[31] D 가, 이하의 4 식 :
[화학식 12]
Figure pat00012
(여기서, L1 은, 앞에 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, [27] ∼ [30] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[32] D 가, 이하의 4 식 :
[화학식 13]
Figure pat00013
(여기서, L1 은, 앞에 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, [27] ∼ [30] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[33] D 가, 다음 식 :
[화학식 14]
Figure pat00014
(여기서, L1 은, 앞에 정의한 바와 같고,
Q3 및 Q3' 는, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 티올기를 나타내고,
R21 및 R22 는, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 불소 원자를 나타내고,
W5 는, -NH- 또는 황 원자를 나타낸다)
으로 나타내는, [1] ∼ [26] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[34] D 가, 이하의 2 식 :
[화학식 15]
Figure pat00015
(여기서, L1, Q3 및 Q3', W5 는, 앞에 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, [33] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[35] L1 이, 이하의 4 식 :
[화학식 16]
Figure pat00016
중 어느 것으로 나타내는, [1] ∼ [34] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[36] L1 이, 이하의 4 식 :
[화학식 17]
Figure pat00017
(식 중, 아스테리스크는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다)
중 어느 것으로 나타내는, [1] ∼ [34] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[37] D 가, 이하의 4 식 :
[화학식 18]
Figure pat00018
(여기서, 아스테리스크는 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고, Q3, Q3' 및 W5 는, 앞에 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, [33], [34] 또는 [36] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[38] D 가, 이하의 4 식 :
[화학식 19]
Figure pat00019
(여기서, 아스테리스크는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다)
중 어느 것으로 나타내는, [33], [34], [36] 또는 [37] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[39] D 가, 이하의 3 식 :
[화학식 20]
Figure pat00020
(여기서, 아스테리스크는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다)
중 어느 것으로 나타내는, [33], [34], [36] 또는 [37] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[40] D 가, 이하의 4 식 :
[화학식 21]
Figure pat00021
(여기서, 아스테리스크는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다)
중 어느 것으로 나타내는, [33], [34], [36] 또는 [37] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[41] 링커 L 이, -Lb-La-Lp-Lc-* 로 나타내고,
식 중, 아스테리스크는, 약물 D 와 결합하고 있는 것을 나타내고,
Lp 는, 표적 세포에 있어서 절단 가능한 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 나타내거나 또는 존재하지 않고,
La 는, 이하의 군에서 선택되는 어느 1 개를 나타내고,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-,
-(CH2)n4-O-C(=O)-, 및,
-(CH2)n9-C(=O)-
(여기서, n2 는 1 ∼ 3 의 정수를 나타내고, n3 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타내고, n4 는 0 ∼ 2 의 정수를 나타내고, n9 는 2 ∼ 7 의 정수를 나타낸다),
Lb 는, La 와 Ab 의 당사슬 또는 리모델링 된 당사슬을 결합하는 스페이서 또는 La 와 Ab 의 시스테인 잔기를 결합하는 스페이서를 나타내고, 그리고,
Lc 는, -NH-CH2-, -페닐기-CH2-O(C=O)- 또는 -NH-헤테로아릴기-CH2-O(C=O)- 를 나타내거나 또는 존재하지 않는
[1] ∼ [40] 중 어느 하나에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[42] Lc 가 존재하지 않는, [41] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[43] Lc 가 -NH-CH2- 인, [41] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[44] Lp 가, 이하 :
-GGVA-, -VA-, -GGFG-, -FG-, -GGPI-, -PI-, -GGVCit-, -VCit-, -GGVK-, -VK-, -GGFCit-, -FCit-, -GGFM-, -FM-, -GGLM-, -LM-, -GGICit- 및 -ICit-
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내는, [41] ∼ [43] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[45] Lp 가, -GGVA-, -VA-, -GGFG-, -FG-, -GGVCit-, -VCit-, -GGFCit- 또는 -FCit- 중 어느 1 개인, [44] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[46] Lp 가, -GGFG-, -GGPI-, -GGVA-, -GGFM-, -GGVCit-, -GGFCit-, -GGICit-, -GGPL-, -GGAQ- 또는 -GGPP- 중 어느 1 개인, [41] ∼ [43] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[47] Lp 가, -GGFG- 또는 -GGPI- 인, [46] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[48] La 가, 이하 :
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)4-CH2-C(=O)-, 및
-(CH2)5-C(=O)-
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 1 개를 나타내는, [41] ∼ [47] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[49] Lb 가, 다음 식
[화학식 22]
Figure pat00022
[화학식 23]
Figure pat00023
또는,
[화학식 24]
Figure pat00024
(상기에서 나타내는 Lb 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 La 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링 된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타낸다) 중 어느 것으로 나타내는, [41] ∼ [48] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[50] Lb 가, -(숙신이미드-3-일-N)- 이고,
여기서, -(숙신이미드-3-일-N)- 는, 이하의 구조식 :
[화학식 25]
Figure pat00025
을 나타내고,
여기서, 아스테리스크는 La 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 항체의 시스테인 잔기의 측사슬과 티오에테르를 형성하여 결합하고 있는 것을 나타내는, [41] ∼ [48] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[51] 링커 L 이, -Lb-La-Lp-Lc-* 로 나타내고,
식 중, 아스테리스크는, 약물 D 와 결합하고 있는 것을 나타내고,
Lp 가, -GGFG-, 또는 -GGPI- 이고,
La 가, -C(=O)-CH2CH2-C(=O)- 를 나타내고,
Lb 가, 다음 식
[화학식 26]
Figure pat00026
(상기에서 나타내는 Lb 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 La 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링 된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타낸다) 을 나타내고,
Lc 가, -NH-CH2- 를 나타내는, [41], [46] ∼ [49] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[52] 항체 약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수가, 1 내지 10 개의 범위인, [1] ∼ [51] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[53] 항체 약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수가, 1 내지 5 개의 범위인, [52] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[54] 항체가, 항체의 Asn297 에 결합하는 당사슬 (N297 당사슬) 로부터 L 에 결합하고 있는, [1] ∼ [53] 중 어느 하나에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[55] N297 당사슬이, 리모델링 된 당사슬인, [54] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[56] N297 당사슬이, N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)SG 인, [54] 또는 [55] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[57] 항체가, 항HER2 항체, 항HER3 항체, 항DLL3 항체, 항FAP 항체, 항CDH11 항체, 항CDH6 항체, 항A33 항체, 항CanAg 항체, 항CD19 항체, 항CD20 항체, 항CD22 항체, 항CD30 항체, 항CD33 항체, 항CD56 항체, 항CD70 항체, 항CD98 항체, 항TROP2 항체, 항CEA 항체, 항Cripto 항체, 항EphA2 항체, 항G250 항체, 항MUC1 항체, 항GPNMB 항체, 항Integrin 항체, 항PSMA 항체, 항Tenascin-C 항체, 항SLC44A4 항체, 항Mesothelin 항체, 항ENPP3 항체, 항CD47 항체, 항EGFR 항체, 항GPR20 항체 또는 항DR5 항체인, [1] ∼ [56] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[58] 항체가, 항HER2 항체인, [57] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[59] 항체가, 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체, 또는, 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체인, [58] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[60] 항체가, 서열 번호 28 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 29 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체, 또는, 서열 번호 28 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 30 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체인, [58] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[61] 항체가, 서열 번호 31 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 32 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체, 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 34 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체, 또는, 서열 번호 35 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 36 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체인, [57] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 ;
[62]다음 식 (Ia) :
[화학식 27]
Figure pat00027
(여기서,
L1 은, 하이드록시기, -NH2, 2-하이드록시아세틸아미노메틸기 및 2-[(2-하이드록시아세틸)아미노]에틸기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 내지 3 개의 기에 의해 임의의 위치에서 치환되어 있어도 되는, 다음 식
[화학식 28]
Figure pat00028
(여기서,
R6 및 R6' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, -NH2, C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기 또는 C2-C6 알키닐기를 나타내고,
R7 및 R7' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1-C6 알킬기를 나타내고, 그 C1-C6 알킬기는, 할로겐 원자 및 옥소기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 개의 치환기에 의해 치환되어 있어도 되고,
R8 및 R8' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 할로겐 원자를 나타내고,
Z4 는, -CH2-, -NH- 또는 산소 원자를 나타내고,
Z5 는, 질소 원자 또는 -CH= 를 나타낸다)
으로 이루어지는 군에서 선택되는 기를 나타내고,
L3 은, 수소 원자, 할로겐 원자, -NH2, 하이드록시 C1-C3 알킬기 또는 아미노 C1-C3 알킬기를 나타내고,
Q1 및 Q1' 는, 각각 독립적으로, 하이드록시기, 티올기 또는 보라노기 (BH3 -) 를 나타내고,
Q2 및 Q2' 는, 각각 독립적으로, 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고,
X1 및 X2 는, 각각 독립적으로, 산소 원자, 황 원자 또는 -CH2- 를 나타내고,
Y1 및 Y2 는, 산소 원자 또는 -CH2- 를 나타내고,
X3 및 X4 는, 하기 (iii) 또는 (iv) :
(iii) Y1 이 산소 원자일 때, X3-X4 는, -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-CH2- 또는 -CH2-CF2- 를 나타낸다 ; 또는
(iv) Y1 이 -CH2- 일 때, X3-X4 는, -O-CH2- 를 나타낸다,
에서 선택되는 기를 나타내고,
X5 및 X6 은, 하기 (v) 또는 (vi) :
(v) Y2 가 산소 원자일 때, X5-X6 은, -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-CH2- 또는 -CH2-CF2- 를 나타낸다 ; 또는
(vi) Y2 가 -CH2- 일 때, X5-X6 은, -O-CH2- 를 나타낸다,
에서 선택되는 기를 나타내고,
R1, R2 및 R3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, -OR', -OC(=O)R', -N3, -NHR', -NR'R'' 또는 -NHC(=O)R' (여기서, R' 는, 수소 원자, C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기, C2-C6 알키닐기 또는 C3-C6 시클로알킬기를 나타내고, 그 C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기 또는 C2-C6 알키닐기는, 1 내지 6 개의 할로겐 원자로 치환되어도 된다, R'' 는, C1-6 알킬기, C2-6 알케닐기, C2-6 알키닐기 또는 C3-C6 시클로알킬기를 나타낸다) 를 나타내고,
W1 은, 질소 원자, 산소 원자, 황 원자 또는 -CH- 를 나타내고,
W2 는, 질소 원자 또는 -CH= 를 나타내고,
R4 는, 수소 원자, 할로겐 원자 또는 -NH2 를 나타내고,
R5 는, 하기 (vii) 내지 (x) :
(vii) W1 이 질소 원자일 때, R5 는 수소 원자, C1-C6 알킬기, 하이드록시 C1-C6 알킬기 또는 아미노 C1-C6 알킬기를 나타낸다 ;
(viii) W1 이 산소 원자일 때, R5 는 존재하지 않고 ;
(ix) W1 이 황 원자일 때, R5 는 존재하지 않고 ; 또는
(x) W1 이 -CH- 일 때, R5 는 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, -NH2 또는 C1-C6 알킬기를 나타낸다,
에서 선택되는 기를 나타내고,
Z1-Z2-Z3 은 하나가 되어, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-R'''-, -CH=CH-CH2-, -CH=CX-CH2-, -CX=CH-CH2-, -CX=CX-CH2-, -C(=O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(=O)-, -CH2-CH(CH3)-CH2- 또는 -CH2-CH2-CH(CH3)- (여기서, R''' 는, -O- 또는 -CH2-CH2- 를 나타내고, X 는, 할로겐 원자를 나타낸다) 또는 하기 식 중 어느 것으로 나타내는 기
[화학식 29]
Figure pat00029
(여기서, 아스테리스크는, W1 에 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은, =C- 의 탄소 원자에 결합하고 있는 것을 나타낸다) 에서 선택되는 기를 나타낸다)
로 나타내는 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[63] W1 이 질소 원자인, [62] 에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[64] W1 이 질소 원자이고, R5 가 수소 원자인, [63] 에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[65] W1 이 산소 원자인, [62] 에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[66] W1 이 황 원자인, [62] 에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[67] W1 이 -CH- 인, [62] 에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[68] W1 이 -CH- 이고, R5 가 수소 원자인, [67] 에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[69] Z1, Z2 및 Z3 이, 하나가 되어, -CH2-CH2-CH2- 또는 -CH=CH-CH2- 인, [62] ∼ [68] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[70] Z1, Z2 및 Z3 이, 하나가 되어, -CH2-CH(CH3)-CH2- 또는 -CH2-CH2-CH(CH3)- 인, [62] ∼ [68] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[71] Z1, Z2 및 Z3 이, 하나가 되어, -CH2-CH2-R'''- (여기서, R''' 는, -O- 또는 -CH2-CH2- 를 나타낸다) 인, [62] ∼ [68] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[72] W2 가 -CH= 인, [62] ∼ [71] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[73] W2 가 질소 원자인, [62] ∼ [71] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[74] R4 가, 수소 원자를 나타내는, [62] ∼ [73] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[75] R4 가, 불소 원자를 나타내는, [62] ∼ [73] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[76] L1 중의 R8 및 R8' 가, 각각 독립적으로, 수소 원자인, [62] ∼ [75] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[77] L1 이, 다음 식으로 이루어지는 군에서 선택되는 기
[화학식 30]
Figure pat00030
(여기서, R9 및 R9' 는, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기 또는 -NH2 를 나타내고,
R10 은, 하이드록시기, -NH2, -NHC(=O)CH2OH, -CH2NHC(=O)CH2OH, -CH2CH2NHC(=O)CH2OH, 하이드록시 C1-C3 알킬기 또는 아미노 C1-C3 알킬기를 나타내고,
R11 및 R11' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 불소 원자 혹은 메틸기를 나타내거나, 또는, R11 및 R11' 가 결합하여 시클로프로판을 나타내고,
Z4 는, -CH2-, -NH- 또는 산소 원자를 나타낸다)
인, [62] ∼ [76] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[78] L1 이, 다음 식으로 이루어지는 군에서 선택되는 기
[화학식 31]
Figure pat00031
(여기서, R13 및 R13' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 하이드록시기 또는 -NH2 를 나타내고,
R12 는, 하이드록시기, -NH2, -CH2OH, -NHC(=O)CH2OH, -CH2NHC(=O)CH2OH 또는 -CH2CH2NHC(=O)CH2OH 를 나타내고,
Z4 는, 앞에 정의한 바와 같다)
인, [62] ∼ [76] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[79] L1 이, 다음 식으로 이루어지는 군에서 선택되는 기
[화학식 32]
Figure pat00032
(여기서, R14 는, 수소 원자 또는 -NH2 를 나타내고,
R15 는, 수소 원자 또는 -C(=O)CH2OH 를 나타내고,
R16 은, 하이드록시기, -NH2, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2NH2 또는 -CH2CH2NH2 를 나타낸다)
인, [62] ∼ [76] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[80] L3 이, 수소 원자, 불소 원자, -NH2, -CH2OH 또는 -CH2NH2 를 나타내는, [62] ∼ [79] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[81] Q1 및 Q1' 가, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 티올기를 나타내는, [62] ∼ [80] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[82] X1 및 X2 가, 산소 원자를 나타내는, [62] ∼ [81] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[83] Y1 및 Y2 가, 산소 원자를 나타내는, [62] ∼ [82] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[84] X3 및 X4 가, -CH2-O- 를 나타내는, [62] ∼ [83] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[85] X5 및 X6 이, -CH2-O- 를 나타내는, [62] ∼ [84] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[86] R1, R2 및 R3 이, 각각 독립적으로, 수소 원자, 하이드록시기 또는 불소 원자인, [62] ∼ [85] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[87] 이하의 2 식 :
[화학식 33]
Figure pat00033
(여기서, L1, Q1, Q1', Q2 및 Q2' 는, 앞에 정의한 바와 같고,
R17, R17', R18 및 R18' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기 또는 -NH2 를 나타내고,
W3 은, -NH-, 산소 원자, 황 원자 또는 -CH2- 를 나타내고,
W4 는, -CH= 또는 질소 원자를 나타낸다)
중 어느 것으로 나타내는, [62] ∼ [86] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[88] 이하의 2 식 :
[화학식 34]
Figure pat00034
(여기서, L1, Q1, Q1', Q2, Q2', R17, R17', R18 및 R18' 는, 앞에 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, [87] 에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[89] 이하의 8 식 :
[화학식 35]
Figure pat00035
(여기서, L1, Q1, Q1', Q2 및 Q2' 는, 앞에 정의한 바와 같고,
R19, R19', R20 및 R20' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 불소 원자를 나타낸다)
중 어느 것으로 나타내는, [87] 또는 [88] 에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[90] 이하의 4 식 :
[화학식 36]
Figure pat00036
(여기서, L1 은, 앞에 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, [87] ∼ [89] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[91] 이하의 4 식 :
[화학식 37]
Figure pat00037
(여기서, L1 은, 앞에 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, [87] ∼ [90] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[92] 이하의 4 식 :
[화학식 38]
Figure pat00038
(여기서, L1 은, 앞에 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, [87] ∼ [90] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[93] 다음 식 :
[화학식 39]
Figure pat00039
(여기서, L1 은, 앞에 정의한 바와 같고,
Q3 및 Q3' 는, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 티올기를 나타내고,
R21 및 R22 는, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 불소 원자를 나타내고,
W5 는, -NH- 또는 황 원자를 나타낸다)
으로 나타내는, [62] ∼ [86] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[94] 이하의 2 식 :
[화학식 40]
Figure pat00040
(여기서, L1, Q3 및 Q3', W5 는, 앞에 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, [93] 에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[95] L1 이, 이하의 :
[화학식 41]
Figure pat00041
중 어느 것으로 나타내는, [62] ∼ [94] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[96] L1 이, 이하의 4 식 :
[화학식 42]
Figure pat00042
중 어느 것으로 나타내는, [62] ∼ [94] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[97] D 가, 이하의 4 식 :
[화학식 43]
Figure pat00043
(여기서, Q3, Q3' 및 W5 는, 앞에 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, [93], [94] 또는 [96] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[98] D 가, 이하의 4 식 :
[화학식 44]
Figure pat00044
중 어느 것으로 나타내는, [93], [94], [96] 또는 [97] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[99] D 가, 이하의 3 식 :
[화학식 45]
Figure pat00045
중 어느 것으로 나타내는, [93], [94], [96] 또는 [97] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[100] D 가, 이하의 4 식 :
[화학식 46]
Figure pat00046
중 어느 것으로 나타내는, [93], [94], [96] 또는 [97] 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염 ;
[101] [1] ∼ [61] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 및 [62] ∼ [100] 에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것을 함유하는, STING 아고니스트 ;
[102] [1] ∼ [61] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 및 [62] ∼ [100] 에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것을 함유하는, 의약 조성물 ;
[103] [1] ∼ [61] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트 및 [62] ∼ [100] 에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것을 함유하는, 항종양제 ;
[104] 종양이, 폐암, 신장암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 다형 신경교아종, 난소암, 췌암, 유방암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 자궁체암, 정소암, 자궁경암, 태반 융모암, 다형 신경교아종, 뇌종양, 두경부암, 갑상선암, 중피종, 소화관 간질 종양 (GIST), 담낭암, 담관암, 부신암, 유극세포암, 백혈병, 악성 림프종, 형질 세포종, 골수종 또는 육종인, [103] 에 기재된 항종양제 ;
[105] [1] ∼ [61] 에 기재된 항체 약물 콘쥬게이트, [62] ∼ [100] 에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염, [101] 에 기재된 STING 아고니스트, [102] 에 기재된 의약 조성물, 및 [103] 또는 [104] 에 기재된 항종양제로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법 ;
[106] 암이, 폐암, 신장암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 다형 신경교아종, 난소암, 췌암, 유방암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 자궁체암, 정소암, 자궁경암, 태반 융모암, 다형 신경교아종, 뇌종양, 두경부암, 갑상선암, 중피종, 소화관 간질 종양 (GIST), 담낭암, 담관암, 부신암, 유극세포암, 백혈병, 악성 림프종, 형질 세포종, 골수종 또는 육종인, [105] 에 기재된 방법,
에 관한 것이다.
본 발명에 의해, 신규 CDN 유도체가 제공된다. 본 발명의 신규 CDN 유도체는 강한 STING 아고니스트 활성을 갖고, 높은 항종양 활성을 나타낸다. 또, 본 발명에 의해, 전신 투여할 수 있고, 또한, 항원이 발현하고 있는 종양에서 항종양 효과를 나타내는, 신규 항체 CDN 유도체 콘쥬게이트가 제공된다.
도 1 은, 본 발명의 약물 콘쥬게이트체 ((II) 의 분자) 인, SG 형 당사슬 리모델링 항체로부터 얻어진 약물 콘쥬게이트체 (도 1 의 A 의 (II) 의 분자) 및, MSG 형 당사슬 리모델링 항체로부터 얻어진 약물 콘쥬게이트체 (도 1 의 B 의 (II) 의 분자) 를 모식적으로 나타낸 것이다. (a) 는 약물 D, (b) 는 링커 L, (c) 는 PEG 링커 (L(PEG)), (d) 는 N297 당사슬 (여기서, 백색 원은 NeuAc(Sia), 백색 육각형은 Man, 흑색 육각형은 GlcNAc, 백색 마름모꼴은 Gal, 및, 백색 역삼각형은 Fuc) 을 각각 나타낸다. 백색 오각형은, 링커 L 유래의 알킨과 PEG 링커 유래의 아지드기가 반응하여 생성된 트리아졸 고리를 나타낸다. Y 자형은, 항체 Ab 를 나타낸다. PEG 링커는, 비환원 말단에 위치하는 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합을 개재하여 연결되어 있다. 이와 같은 표시 방법은, 특별히 언급이 없는 한, 본 명세서의 전체를 통해 적용된다.
도 2 는, 본 발명의 약물 콘쥬게이트체의 제조 중간체인, (Fucα1,6)GlcNAc-항체 (도 2 의 A 의 (III) 의 분자), SG 형 당사슬 리모델링 항체 (도 2 의 B 의 (IV) 의 분자), 및 MSG 형 당사슬 리모델링 항체 (도 2 의 C 의 (IV) 의 분자) 의 구조를 나타내는 모식도이다. 모든 도면에 있어서, Y 자형은 도 1 과 마찬가지로 항체 Ab 를 나타낸다. 도 2 의 A 에 있어서, (e) 는 Fuc 의 1 위치와, GlcNAc 의 6 위치에 있어서 α글리코시드 결합한 이당으로 이루어지는 N297 당사슬을 나타낸다. 도 2 의 B 및 C 에 있어서, (d) 는 도 1 과 동일한 N297 당사슬을 나타내고, (f) 는 아지드기를 갖는 PEG 링커이며, 말단에 링커 L 과의 결합에 제공되는 아지드기를 나타낸다. 아지드기를 갖는 PEG 링커의 결합 양식은, 도 1 의 PEG 링커와 동일하다.
도 3 은, 동물 세포에서 산생된 항체로부터 SG 형 당사슬 리모델링 항체 및 MSG 형 당사슬 리모델링 항체를 제조하는 공정의 모식도이다. 도면 중의 분자 (III) 및 (IV) 는, 도 2 와 마찬가지로, (Fucα1,6)GlcNAc-항체 및 SG 형 당사슬 리모델링 항체 또는 MSG 형 당사슬 리모델링 항체를 각각 나타낸다. (V) 의 분자는 동물 세포에서 산생된 항체이며, N297 당사슬이 불균일한 분자의 혼합물이다. 도 3A 는, (V) 의 불균일한 N297 당사슬을, EndoS 와 같은 가수분해 효소로 처리함으로써, 균일한 (Fucα1,6)GlcNAc-항체 (III) 이 제조되는 공정을 나타낸다. 도 3B 는, 항체 (III) 의 N297 당사슬의 GlcNAc 에 대하여, EndoS D233Q/Q303L 변이체와 같은 당전이 효소를 사용하여, SG 형 당사슬 도너 분자를 당사슬 전이시킴으로써, (IV) 의 SG 형 당사슬 리모델링 항체가 제조되는 공정을 나타낸다. 도 3C 는, 도 3B 와 마찬가지로, 항체 (III) 에 대하여, MSG 형 당사슬 도너 분자를 당사슬 전이시킴으로써 (IV) 의 MSG 형 당사슬 리모델링 항체가 제조되는 공정을 나타낸다. 여기서 사용되는 SG 형 당사슬 도너 분자 및 MSG 형 당사슬 도너 분자는, 각각의 비환원 말단의 시알산이 아지드기를 갖는 PEG 링커로 수식된 것이고, 제조되는 SG 형 N297 당사슬 리모델링 항체 및 MSG 형 N297 당사슬 리모델링 항체에 있어서도, 도 2 의 B 및 C 에서 도시한 바와 같이, 비환원 말단의 시알산이 동일한 수식을 받은 것이 된다.
도 4 는, 트라스투주맙의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 1) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 2) 을 나타낸다.
도 5 는, 개변 항HER2 항체의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 1) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 3) 을 나타낸다.
도 6 은, (a) 인간 STING 야생형의 아미노산 서열, (b) 인간 STING REF 변이형 (R232H) 의 아미노산 서열, 및, (c) 인간 STING HAQ 변이체 (R71H, G230A, R293Q) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 7 은, CDN 유도체의 종양내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 사각선은 화합물 번호 6a 투여군, 백색 역삼각선은 화합물 번호 8b 투여군, 백색 동그라미선은 화합물 번호 9b 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 8 은, 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 및 항LPS 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 삼각선은, 참고예 1 에서 제조한 개변 항HER2 항체에 실시예 8b 의 화합물을 콘쥬게이트시킨 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 투여군, 흑색 삼각선은, 참고예 2 에서 제조한 개변 항LPS 항체에 동일하게 실시예 8b 의 화합물을 콘쥬게이트시킨 항LPS 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 9 는, 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (2) 및 (3) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 사각선은 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (2) 투여군, 백색 삼각선은 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (3) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 10 은, 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (19) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 삼각선은 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (19) 투여군을 나타낸다. 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (19) 는 약물 링커가 시스테인 콘쥬게이션으로 항체에 결합되어 있다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 11 은, 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 및 (9) ∼ (12) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 삼각선은 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (9) 투여군, 백색 역삼각선은 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (10) 투여군, 백색 마름모꼴선은 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (11) 투여군, 백색 동그라미선은 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (12) 투여군, 백색 사각선은 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 투여군을 나타낸다. 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (9), (10), (11), (12), (1) 은 각각 상이한 링커로 실시예 8b 의 화합물이 콘쥬게이션되어 있다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 12 는, 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (1), 항HER2 항체 2 및 화합물 번호 8b 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 삼각선은 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (1) 의 60 ㎍ 투여군, 흑색 역삼각선은 항HER2 항체 2 의 59 ㎍ 투여군, 흑색 동그라미선은 화합물 번호 8b 의 1.2 ㎍ 투여군을 나타낸다. 항HER2 항체 2 및 화합물 번호 8b 의 투여량은, 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (1) 을 구성하는 각 성분의 당량이다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 13 은, (a) 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (2) 및 (3) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. (b) 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (4), (5), (7) 및 (8) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. (c) 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (6) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 각 백색 심볼선은 평가한 각 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (2) ∼ (8) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 14 는, 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (9) 및 (10) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 삼각선은 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (9) 투여군, 백색 동그라미선은 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (10) 투여군을 나타낸다. 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (9), (10) 은 약물 평균 결합수가 약 2 인 MSG 형 당사슬 리모델링 항체를 사용한 항체 - CDN 콘쥬게이트이다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 15 는, 항EphA2 항체 및 항EphA2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 동그라미선은 항EphA2 항체 투여군, 백색 삼각선은 항EphA2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 16 은, 항CD33 항체 및 항CD33 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 동그라미선은 항CD33 항체 투여군, 백색 삼각선은 항CD33 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 17 은, 페르투주맙의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 28) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 29) 을 나타낸다.
도 18 은, 개변 항HER2 항체 2 의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 28) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 30) 을 나타낸다.
도 19 는, 항CD33 항체의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 31) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 32) 을 나타낸다.
도 20 은, 항EphA2 항체의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 33) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 34) 을 나타낸다.
도 21 은, 항CDH6 항체의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 35) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 36) 을 나타낸다.
도 22 는, 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (11) 및 (12) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 삼각선은 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (11) 투여군, 백색 동그라미선은 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (12) 투여군을 나타낸다.
본 발명은, STING 아고니스트 활성을 갖는 신규 CDN 유도체 및 그 항체 약물 콘쥬게이트, 그리고 이들의 사용에 관한 것이다. 본 발명의 신규 CDN 유도체는, STING 아고니스트 활성을 갖고, 면역 세포를 부활화하여 인터페론이나 사이토카인의 산생을 유도한다. 또, 본 발명의 신규 CDN 유도체는, 당해 면역 세포의 부활화에 의해 항종양 효과를 발휘한다. 신규 CDN 유도체는, 면역 기능을 부활화하고자 하는 목적의 조직에 직접 투여되어도 되고, 또는, 표적 세포 (예를 들어, 종양 세포 또는 면역 세포) 를 인식하여 결합할 수 있는 항체에 임의의 링커를 개재하여 연결되어 전신 투여되어도 된다.
STING (Stimulator of Interferon Genes) 란, 소포체에 국재하는 막 관통형의 어댑터 단백질이다. STING 에는, 선천적인 다형 (多型) 이 높은 빈도로 존재하는 것이 알려져 있다 (PLoS One, 2013 Oct, 21, 8 (10), e77846). STING 변이형으로는, 예를 들어, 232 번째의 아미노산이 아르기닌 (R) 으로부터 히스티딘 (H) 으로 변이한 R232H 변이나, 71 번째의 아르기닌 (R) 이 히스티딘 (H) 으로, 230 번째의 글리신 (G) 이 알라닌 (A) 으로, 293 번째의 아르기닌 (R) 이 글루타민 (Q) 으로 변이한 HAQ 변이가 알려져 있다. 이와 같은 STING 의 다형에서는, STING 아고니스트 자극에 의해 유도되는 사이토카인 산생량 등의 응답의 강도에 차이가 있는 것이 알려져 있다 (Genes and I㎜unity, 2011, 12, 263-269). 그 때문에, 인간에게 있어서 안정적으로 STING 아고니스트가 작용하기 위해서는, 각 STING 의 형 (型) 에 대하여 활성을 갖는 것이 바람직하다.
본 명세서에 있어서, 「암」, 「암」 및 「종양」 은 동일한 의미로 사용하고 있다.
본 발명에 있어서, 「면역 부활화 활성」 이란, 어떠한 형태로, 단구, 매크로파지, 수상 세포, T 세포, B 세포, NK 세포, 호중구 등의 항종양 면역에 관여하는 면역 세포의 활성화를 일으키는 것을 말하며, 예를 들어 사이토카인 및 케모카인의 산생, 면역 활성화 마커의 발현 상승, 면역 억제성 마커의 발현 저하, 세포내 시그널 전달계의 인산화 등의 변화, 유전자 발현의 변화 등, 모든 면역 세포의 구조나 기능 상의 변화를 일으키는 것을 말한다. 또, 종양 세포가 항종양 면역을 유도하는 변화를 일으키는 것도 포함하며, 예를 들어 면역 세포를 부활화 또는 유주를 유도하는 사이토카인 및 케모카인의 산생, 면역 세포에 대한 감수성 항진 등을 유도하는 것을 말한다.
본 발명에 있어서, 「항종양 효과」 란, 약물에 의해 종양 세포에 대하여 직접적 또는 간접적으로 영향을 미침으로써, 종양의 감소 또는 축퇴를 유도하는 것을 말한다. 예를 들어, 종양 세포에 대하여 약물이 직접적인 상해를 주거나, 종양 세포가 약물의 자극에 의해 항종양 면역을 부활화하거나, 종양 세포에 송달된 약물이 세포외로 방출되는 등 하여 종양 세포 주변의 항종양 면역이 부활화하는 것 등에 의해, 종양 세포수의 감소 및 상해, 또는 종양의 축퇴를 일으키는 것을 항종양 효과라고 한다.
본 발명에 있어서, 「세포 상해 활성」 이란, 어떠한 형태로, 세포에 병리적인 변화를 일으키는 것을 말하며, 직접적인 외상에 그치지 않고, DNA 의 절단이나 염기의 2량체의 형성, 염색체의 절단, 세포 분열 장치의 손상, 각종 효소 활성의 저하 등 모든 세포의 구조나 기능 상의 손상을 일으키는 것을 말한다.
본 발명에 있어서, 「세포」 에는, 동물 개체 내의 세포, 배양 세포도 포함하고 있다.
본 명세서에 있어서, 「할로겐 원자」 란, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자를 의미한다.
본 명세서에 있어서, 「C1-C6 알킬기」 란, 탄소수 1 ∼ 6 의 직사슬 또는 분기 사슬의 알킬기를 의미한다. 「C1-C6 알킬기」 는, 총탄소수가 6 을 넘지 않으면, 알킬기 상에 시클로프로판을 갖고 있어도 된다. 「C1-C6 알킬기」 로는, 예를 들어, 이하의 구조 :
[화학식 47]
Figure pat00047
(파선은 치환 위치를 나타낸다.) 를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 명세서에 있어서, 「C2-C6 알케닐기」 란, 탄소수 2 ∼ 6 의 직사슬 또는 분기 사슬의 알케닐기를 의미한다.
본 명세서에 있어서, 「C2-C6 알키닐기」 란, 탄소수 2 ∼ 6 의 직사슬, 분기 사슬의 알키닐기를 의미한다.
본 명세서에 있어서, 「C3-C6 시클로알킬기」 란, 탄소수 3 ∼ 6 의 포화 고리형 탄화수소기를 의미한다. 「C3-C6 시클로알킬기」 는, 총탄소수가 6 을 넘지 않으면, 복수의 알킬기로 치환되어 있어도 된다. 「C3-C6 시클로알킬기」 로는, 예를 들어, 이하의 구조 :
[화학식 48]
Figure pat00048
(파선은 치환 위치를 나타낸다.) 를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 명세서에 있어서, 「하이드록시 C1-C6 알킬기」 란, 탄소수 1 ∼ 6 의 직사슬, 분기 사슬의 알킬기의 임의의 위치에 1 또는 2 개의 하이드록시기가 치환하고 있는 알킬기를 의미한다. 「하이드록시 C1-C6 알킬기」 는, 총탄소수가 6 을 넘지 않으면, 알킬기 상에 시클로프로판을 갖고 있어도 된다. 「하이드록시 C1-C6 알킬기」 로는, 예를 들어, 이하의 구조 :
[화학식 49]
Figure pat00049
(파선은 치환 위치를 나타낸다.) 를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 「아미노 C1-C6 알킬기」 란, 탄소수 1 ∼ 6 의 직사슬 또는 분기 사슬의 알킬기의 임의의 위치에 1 또는 2 개의 아미노기가 치환하고 있는 알킬기를 의미한다. 「아미노 C1-C6 알킬기」 란, 총탄소수가 6 을 넘지 않으면, 알킬기 상에 시클로프로판을 갖고 있어도 된다. 「아미노 C1-C6 알킬기」 로는, 예를 들어, 이하의 구조 :
[화학식 50]
Figure pat00050
(파선은 치환 위치를 나타낸다.) 를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
＜1. 신규 CDN 유도체＞
본 발명의 신규 CDN 유도체는, 다음 식 (Ia) :
[화학식 51]
Figure pat00051
로 나타내는 구조를 갖는다.
L1 은, 하이드록시기, -NH2, 2-하이드록시아세틸아미노메틸기 및 2-[(2-하이드록시아세틸)아미노]에틸기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ∼ 3 개의 기에 의해 임의의 위치에서 치환되어 있어도 되는, 다음 식
[화학식 52]
Figure pat00052
(여기서,
R6 및 R6' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, -NH2, C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기 또는 C2-C6 알키닐기를 나타내고,
R7 및 R7' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1-C6 알킬기를 나타내고, 그 C1-C6 알킬기는, 할로겐 원자 및 옥소기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 개의 치환기에 의해 치환되어 있어도 되고,
R8 및 R8' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 할로겐 원자를 나타내고,
Z4 는, -CH2-, -NH- 또는 산소 원자를 나타내고,
Z5 는, 질소 원자 또는 -CH= 를 나타낸다)
으로 이루어지는 군에서 선택되는 기를 나타낸다.
또, L1 은, 하이드록시기, -NH2, 2-하이드록시아세틸아미노메틸기 및 2-[(2-하이드록시아세틸)아미노]에틸기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ∼ 3 개의 기에 의해 임의의 위치에서 치환되어 있어도 되는, 다음 식
[화학식 53]
Figure pat00053
(여기서,
R6 및 R6' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, -NH2, C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기 또는 C2-C6 알키닐기를 나타내고,
R7 및 R7' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1-C6 알킬기를 나타내고, 그 C1-C6 알킬기는, 할로겐 원자 및 옥소기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 개의 치환기에 의해 치환되어 있어도 되고,
R8 및 R8' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 할로겐 원자를 나타내고,
Z4 는, -CH2-, -NH- 또는 산소 원자를 나타내고,
Z5 는, 질소 원자 또는 -CH= 를 나타낸다)
으로 이루어지는 군에서 선택되는 기를 나타낸다.
L1 은, 바람직하게는, 다음 식으로 이루어지는 군에서 선택되는 기
[화학식 54]
Figure pat00054
(여기서, R9 및 R9' 는, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기 또는 -NH2 를 나타내고,
R10 은, 하이드록시기, -NH2, -NHC(=O)CH2OH, -CH2NHC(=O)CH2OH, -CH2CH2NHC(=O)CH2OH, 하이드록시 C1-C3 알킬기 또는 아미노 C1-C3 알킬기를 나타내고,
R11 및 R11' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 불소 원자 혹은 메틸기를 나타내거나, 또는, R11 및 R11' 가 결합하여 시클로프로판을 나타내고,
Z4 는, -CH2-, -NH- 또는 산소 원자를 나타낸다)
이다.
또, L1 은, 바람직하게는, 다음 식으로 이루어지는 군에서 선택되는 기
[화학식 55]
Figure pat00055
(여기서, R13 및 R13' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 하이드록시기 또는 -NH2 를 나타내고,
R12 는, 하이드록시기, -NH2, -CH2OH, -NHC(=O)CH2OH, -CH2NHC(=O)CH2OH 또는 -CH2CH2NHC(=O)CH2OH 를 나타내고,
Z4 는, 앞에 정의한 바와 같다)
이다.
나아가 또한, L1 은, 바람직하게는, 다음 식으로 이루어지는 군에서 선택되는 기
[화학식 56]
Figure pat00056
(여기서, R14 는, 수소 원자 또는 -NH2 를 나타내고,
R15 는, 수소 원자 또는 -C(=O)CH2OH 를 나타내고,
R16 은, 하이드록시기, -NH2, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2NH2 또는 -CH2CH2NH2 를 나타낸다)
이다.
L1 은, 보다 바람직하게는, 다음 식으로 이루어지는 군에서 선택되는 기
[화학식 57]
Figure pat00057
이다.
L3 은, 수소 원자, 할로겐 원자, -NH2, 하이드록시 C1-C3 알킬기 또는 아미노 C1-C3 알킬기에서 선택된다.
Q1 및 Q1' 는, 각각 독립적으로, 하이드록시기, 티올기 또는 보라노기 (BH3 -) 를 나타낸다. Q1 은, 바람직하게는, 하이드록시기 또는 티올기이다. Q1' 는, 바람직하게는, 하이드록시기 또는 티올기이다. 보다 바람직하게는, Q1 및 Q1' 의 조합은, Q1 및 Q1' 가 티올기이거나, 또는, Q1 및 Q1' 가 하이드록시기이다.
Q2 및 Q2' 는, 각각 독립적으로, 산소 원자 또는 황 원자를 나타낸다. 바람직하게는, Q2 및 Q2' 는, 함께 산소 원자이거나 또는 함께 황 원자이다.
Q1 및 Q2 의 조합은, 바람직하게는, Q1 이 티올기이고 또한 Q2 가 산소 원자이거나, 혹은, Q1 이 티올기이고 또한 Q2 가 황 원자이다.
Q1' 및 Q2' 의 조합은, 바람직하게는, Q1' 가 티올기이고 또한 Q2' 가 산소 원자이거나, Q1' 가 하이드록시기이고 또한 Q2' 가 산소 원자이거나, 혹은 Q1' 가 티올기이고 또한 Q2' 가 황 원자이다.
X1 및 X2 는, 각각 독립적으로, 산소 원자, 황 원자 또는 -CH2- 를 나타낸다. X1 은, 바람직하게는, 산소 원자이다. X2 는, 바람직하게는, 산소 원자이다. 보다 바람직하게는, X1 및 X2 가 산소 원자이다.
Y1 및 Y2 는, 산소 원자 또는 -CH2- 를 나타낸다. Y1 은, 바람직하게는, 산소 원자이다. Y2 는, 바람직하게는, 산소 원자이다. 보다 바람직하게는, Y1 및 Y2 가 산소 원자이다.
X3 및 X4 는, 하기 (iii) 또는 (iv) :
(iii) Y1 이 산소 원자일 때, X3-X4 는, -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-CH2- 또는 -CH2-CF2- 를 나타낸다 ; 또는
(iv) Y1 이 -CH2- 일 때, X3-X4 는, -O-CH2- 를 나타낸다,
에서 선택되는 기를 나타낸다. X3 및 X4 는, 바람직하게는, 상기 (iii) 의 -CH2-O- 이다.
X5 및 X6 은, 하기 (v) 또는 (vi) :
(v) Y2 가 산소 원자일 때, X5-X6 은, -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-CH2- 또는 -CH2-CF2- 를 나타낸다 ; 또는
(vi) Y2 가 -CH2- 일 때, X5-X6 은, -O-CH2- 를 나타낸다,
에서 선택되는 기를 나타낸다. X5 및 X6 은, 바람직하게는, 상기 (v) 의 -CH2-O- 이다.
R1, R2 및 R3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, -OR', -OC(=O)R', -N3, -NHR', -NR'R'' 또는 -NHC(=O)R' (여기서, R' 는, 수소 원자, C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기, C2-C6 알키닐기 또는 C3-C6 시클로알킬기를 나타내고, 그 C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기 또는 C2-C6 알키닐기는, 1 내지 6 개의 할로겐 원자로 치환되어도 된다, R'' 는, C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기, C2-C6 알키닐기 또는 C3-C6 시클로알킬기를 나타낸다) 를 나타낸다.
R1 은, 바람직하게는, 수소 원자, 하이드록시기 또는 불소 원자이다.
R2 는, 바람직하게는, 수소 원자, 하이드록시기 또는 불소 원자이다.
R3 은, 바람직하게는, 수소 원자, 하이드록시기 또는 불소 원자이다.
W1 은, 질소 원자, 산소 원자, 황 원자 또는 -CH- 를 나타낸다.
R5 는, 하기 (vii) 내지 (x) :
(vii) W1 이 질소 원자일 때, R5 는 수소 원자, C1-C6 알킬기, 하이드록시 C1-C6 알킬기 또는 아미노 C1-C6 알킬기를 나타낸다 ;
(viii) W1 이 산소 원자일 때, R5 는 존재하지 않고 ;
(ix) W1 이 황 원자일 때, R5 는 존재하지 않고 ; 또는
(x) W1 이 -CH- 일 때, R5 는 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, -NH2 또는 C1-C6 알킬기를 나타낸다,
에서 선택되는 기를 나타낸다. W1 이 질소 원자일 때, R5 는, 바람직하게는, 수소 원자이다. W1 이 -CH- 일 때, R5 는, 바람직하게는, 수소 원자이다.
W2 는, 질소 원자 또는 -CH= 를 나타낸다. W2 는, 바람직하게는 -CH= 이다.
R4 는, 수소 원자, 할로겐 원자 또는 -NH2 를 나타낸다. R4 는, 바람직하게는, 수소 원자이다.
Z1-Z2-Z3 은 하나가 되어, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-R'''-, -CH=CH-CH2-, -CH=CX-CH2-, -CX=CH-CH2-, -CX=CX-CH2-, -C(=O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(=O)-, -CH2-CH(CH3)-CH2- 또는 -CH2-CH2-CH(CH3)- (여기서, R''' 는, -O- 또는 -CH2-CH2- 를 나타내고, X 는, 할로겐 원자를 나타낸다) 또는 하기 식 중 어느 것으로 나타내는 기
[화학식 58]
Figure pat00058
(여기서, 아스테리스크는, W1 에 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은, =C- 의 탄소 원자에 결합하고 있는 것을 나타낸다) 에서 선택되는 기를 나타낸다. Z1, Z2 및 Z3 은, 바람직하게는, 하나가 되어, -CH2-CH2-CH2-, -CH=CH-CH2-, -CH2-CH(CH3)-CH2-, -CH2-CH2-CH(CH3)-, 또는, -CH2-CH2-R'''- (여기서, R''' 는, -O- 또는 -CH2-CH2- 를 나타낸다) 이다.
또, 본 발명의 신규 CDN 유도체는, 바람직하게는, 다음 식 :
[화학식 59]
Figure pat00059
으로 나타내는 구조를 갖는다.
L1 은, 앞에 정의한 바와 같다.
Q3 및 Q3' 는, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 티올기를 나타낸다. 바람직하게는, Q3 및 Q3' 는, 함께 티올기이다.
R21 및 R22 는, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 불소 원자를 나타낸다. R21 은, 바람직하게는, 하이드록시기이다. R22 는, 바람직하게는, 불소 원자이다.
W5 는, -NH- 또는 황 원자를 나타낸다.
본 발명의 신규 CDN 유도체의 제조 방법은, 후술하는 ＜3. 제조 방법＞ 에 기재한다.
＜2. 항체 약물 콘쥬게이트＞
본 발명의 신규 CDN 유도체는, 목적으로 하는 조직에 직접 투여 (예를 들어, 종양내 투여) 되어도 되고, 혹은, 표적 세포 (예를 들어, 종양 세포 또는 면역 세포) 를 인식하여 결합할 수 있는 항체에 임의의 링커를 개재하여 연결된 항체 약물 콘쥬게이트로서 투여되어도 된다.
본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트는, 다음 식 (II) :
[화학식 60]
Figure pat00060
로 나타낸다. m1 은 항체 약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 약물 결합수를 나타내고, Ab 는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편을 나타내고, L 은, Ab 와 D 를 연결하는 링커를 나타내고, D 는 상기 서술한 신규 CDN 유도체 (본 명세서 중, 신규 CDN 유도체가 항체 약물 콘쥬게이트의 일부로서 사용되는 경우, 간단히 「약물」 이라고도 칭한다) 를 나타낸다.
약물 D 는, 면역 세포를 부활화하는 활성, 구체적으로는, STING 아고니스트 활성을 갖는 화합물이다. 약물 D 는, 링커의 일부 또는 전부가 표적 세포 (예를 들어, 종양 세포 또는 면역 세포) 내에서 절단되면, 본래의 구조로 유리되고, 면역 부활화 효과가 발휘된다. 면역 세포에 대한 표적 세포의 감수성 항진 또는 표적 세포를 개재한 면역 세포의 부활화에 의해, 목적으로 하는 기능이 발휘된다. 목적으로 하는 기능으로는, STING 아고니스트 활성에 관련하는 기능이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 항종양 활성이다. 즉, 종양을 표적으로 하는 항체 (예를 들어, 항HER2 항체) 에 임의의 링커를 개재하여 연결된 약물 D 는, 표적의 세포 또는 조직에 송달되고, 링커의 일부 또는 전부가 절단되어, 면역 세포에 대한 표적 세포의 감수성 항진 또는 표적 세포를 개재한 면역 세포의 부활화 (예를 들어, 인터페론이나 사이토카인의 산생) 를 통해서 항종양 효과를 발휘한다.
본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 결합되는 약물 D 는, 다음 식 (I) :
[화학식 61]
Figure pat00061
(여기서,
L 은, L1 또는 L2 에 포함되는 임의의 -NH2 또는 하이드록시기와 결합하고,
L1 은, 상기 ＜1. 신규 CDN 유도체＞ 에서 규정한 바와 같고,
L2 는, 하기 (i) 또는 (ii) :
(i) L 과 결합할 때, L2 는, -NHR', 하이드록시 C1-C6 알킬기 또는 아미노 C1-C6 알킬기를 나타내고, 여기서, R' 는, 수소 원자, C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기, C2-C6 알키닐기 또는 C3-C6 시클로알킬기를 나타내고, 그 C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기 또는 C2-C6 알키닐기는, 1 내지 6 개의 할로겐 원자로 치환되어도 된다 ; 또는
(ii) L 과 결합하지 않을 때, L2 는, 수소 원자 또는 할로겐 원자를 나타낸다,
에서 선택되는 기를 나타내고,
Q1, Q1', Q2, Q2', X1, X2, X3, X4, X5, X6, Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, R5, W1, W2, Z1, Z2 및 Z3 은, 상기 ＜1. 신규 CDN 유도체＞ 에서 규정한 바와 같다.
L2 는, L 과 결합하는 경우, 바람직하게는, -NH2, -CH2NH2 또는 -CH2OH 이다. L2 는, L 과 결합하지 않는 경우, 바람직하게는, 수소 원자 또는 불소 원자이다.
본 발명의 신규 CDN 유도체 또는 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 사용되는 약물 D 는, 바람직하게는, 이하의 2 식 :
[화학식 62]
Figure pat00062
(여기서, L1, Q1, Q1', Q2 및 Q2' 는, 앞에 정의한 바와 같고,
R17, R17', R18 및 R18' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기 또는 -NH2 를 나타내고,
W3 은, -NH-, 산소 원자, 황 원자 또는 -CH2- 를 나타내고,
W4 는, -CH= 또는 질소 원자를 나타낸다) 중 어느 것으로 나타낸다.
또, 본 발명의 신규 CDN 유도체 또는 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 사용되는 약물 D 는, 바람직하게는, 이하의 2 식 :
[화학식 63]
Figure pat00063
(여기서, L1, Q1, Q1', Q2, Q2', R17, R17', R18 및 R18' 는, 앞에 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타낸다.
또, 본 발명의 신규 CDN 유도체 또는 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 사용되는 약물 D 는, 바람직하게는, 이하의 8 식 :
[화학식 64]
Figure pat00064
(여기서, L1, Q1, Q1', Q2 및 Q2' 는, 앞에 정의한 바와 같고,
R19, R19', R20 및 R20' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 불소 원자를 나타낸다)
중 어느 것으로 나타낸다.
또, 본 발명의 신규 CDN 유도체 또는 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 사용되는 약물 D 는, 바람직하게는, 이하의 4 식 :
[화학식 65]
Figure pat00065
(여기서, L1 은, 앞에 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타낸다.
나아가 또한, 본 발명의 신규 CDN 유도체 또는 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 사용되는 약물 D 는, 바람직하게는, 이하의 4 식 :
[화학식 66]
Figure pat00066
(여기서, L1 은, 앞에 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타낸다.
또, 본 발명의 신규 CDN 유도체 또는 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 사용되는 약물 D 는, 바람직하게는, 이하의 4 식 :
[화학식 67]
Figure pat00067
(여기서, L1 은, 앞에 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타낸다.
또, 본 발명의 신규 CDN 유도체 또는 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 사용되는 약물 D 는, 바람직하게는, 다음 식 :
[화학식 68]
Figure pat00068
(여기서, L1, Q3, Q3', R21, R22 및 W5 는, 상기 ＜1. 신규 CDN 유도체＞ 에서 규정한 바와 같다) 으로 나타낸다.
또, 본 발명의 신규 CDN 유도체 또는 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 사용되는 약물 D 에 있어서, L1 은, 바람직하게는, 이하 :
[화학식 69]
Figure pat00069
중 어느 것으로 나타낸다.
또, 본 발명의 신규 CDN 유도체 또는 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 사용되는 약물 D 에 있어서, L1 은, 바람직하게는, 이하의 4 식 :
[화학식 70]
Figure pat00070
(식 중, 아스테리스크는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다) 중 어느 것으로 나타낸다.
또, 본 발명의 신규 CDN 유도체 또는 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 사용되는 약물 D 는, 바람직하게는, 이하의 4 식 :
[화학식 71]
Figure pat00071
(여기서, 아스테리스크는 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고, Q3, Q3' 및 W5 는, 상기 ＜1. 신규 CDN 유도체＞ 에서 규정한 바와 같다) 중 어느 것으로 나타낸다.
＜2.1. 링커 구조＞
본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 있어서 약물을 항체에 결합시키는 링커 구조에 대해서 설명한다. 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 사용되는 링커는, 항체와 약물을 연결시키는 링커로서 당업자가 이해하는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 사용되는 링커로는, 예를 들어, Protein Cell, 2018, 9 (1) : 33-46, Pharm Res, 2015, 32 : 3526-3540, 또는, Int. J. Mol. Sci., 2016, 17, 561 에 기재되는 링커를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 링커는, 생체내에서 절단되는 링커여도 되고, 생체내에서 절단되지 않는 링커여도 되지만, 바람직하게는, 생체내에서 절단되는 링커이다.
본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 사용되는 링커로는, 예를 들어, 약물을 항체의 Fc 부분의 당사슬 또는 리모델링 된 당사슬에 결합시키는 (본 명세서 중, 「당사슬 콘쥬게이션」 이라고 하는 경우가 있다) 링커 (예를 들어, WO2018/003983 에 기재된다), 또는, 약물을 항체의 임의의 아미노산 잔기 (예를 들어, 시스테인 잔기 또는 리신 잔기) 에 결합시키는 링커 (예를 들어, WO2014/057687 에 기재된다) 를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 약물을 항체의 임의의 아미노산 잔기에 결합시키는 링커로는, 바람직하게는, Ab 의 시스테인의 술프하이드릴기 (SH 기) 와 티오에테르 결합하는 경우 (본 명세서 중, 「시스테인 콘쥬게이션」 이라고 하는 경우가 있다) 또는 Ab 의 리신의 아미노기 (NH2 기) 와 아미드 결합하는 경우 (본 명세서 중, 「리신 콘쥬게이션」 이라고 하는 경우가 있다) 를 들 수 있으며, 바람직하게는, 시스테인 콘쥬게이션이다.
본 발명의 바람직한 링커 L 은, 다음의 식으로 나타낸다.
-Lb-La-Lp-Lc-*
(여기서, 아스테리스크는, 약물 D 의 L1 또는 L2 에 포함되는 임의의 아미노기 또는 하이드록시기와 결합하고 있는 것을 나타낸다.) 로 나타낸다.
먼저, Lp 에 대해서 설명한다.
Lp 는, 생체내 또는 표적 세포에 있어서 절단 가능한 아미노산 서열로 이루어지는 링커 (이하, 본 명세서 중, 펩티드 링커라고도 한다) 를 나타내거나, 또는 존재하지 않는다.
Lp 는, 예를 들어, 펩티다아제나 에스테라아제 등의 효소의 작용에 의해, 절단된다. Lp 는, 2 내지 7 개 (바람직하게는, 2 내지 4 개) 의 아미노산으로 구성되는 펩티드이다. Lp 는, 그 N 말단에 있어서 후술하는 La 의 우단의 카르보닐기와 아미드 결합을 형성하고, C 말단에 있어서 Lc 의 아미노기 (-NH-) 와 아미드 결합을 형성한다. 상기 펩티다아제 등의 효소에 의해, Lp 의 C 말단측의 아미드 결합이 절단된다.
Lp 를 구성하는 아미노산은 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들어, L- 또는 D-아미노산이며, 바람직하게는 L-아미노산이다. 또, α-아미노산 외에, β-알라닌, ε-아미노카프로산, γ-아미노부티르산 등의 구조의 아미노산이어도 되고, 나아가서는, 예를 들어, N-메틸화 된 아미노산 등의 비천연형의 아미노산이어도 된다. Lp 의 아미노산 서열은, 특별히 한정되지 않지만, 구성하는 아미노산으로서, 글리신 (Gly ; G), 발린 (Val ; V), 알라닌 (Ala ; A), 페닐알라닌 (Phe ; F), 글루타민산 (Glu ; E), 이소류신 (Ile ; I), 프롤린 (Pro ; P), 시트룰린 (Cit), 류신 (Leu ; L), 메티오닌 (Met ; M), 세린 (Ser ; S), 리신 (Lys ; K) 및 아스파르트산 (Asp ; D) 등을 들 수 있다. 이들 중에서 바람직하게는, 글리신 (Gly ; G), 발린 (Val ; V), 알라닌 (Ala ; A), 페닐알라닌 (Phe : F), 시트룰린 (Cit) 이다. 이들 아미노산은 중복해도 되며, 임의로 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 또, 아미노산의 종류에 따라, 약물 유리의 패턴을 컨트롤할 수 있다.
Lp 의 구체예로는, 예를 들어, -GGVA-, -VA-, -GGFG-, -FG-, -GGPI-, -PI-, -GGVCit-, -VCit-, -GGVK-, -VK-, -GGFCit-, -FCit-, -GGFM-, -FM-, -GGLM-, -LM-, -GGICit-, -ICit- 를 들 수 있다. 링커 Lp 는, 바람직하게는, -GGVA-, -VA-, -GGFG-, -FG-, -GGVCit-, -VCit-, -GGFCit-, -FCit- 이다. 링커 Lp 는, 보다 바람직하게는, -GGVA-, -GGFG, -GGVCit- 이다. 또, 링커 Lp 는, 바람직하게는, -GGFG- 또는 -GGPI- 이다.
다음으로, La 에 대해서 설명한다.
La 는, 이하 :
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-,
-(CH2)n4-O-C(=O)-, 및,
-(CH2)n9-C(=O)-
(여기서, 식 중, n2 는 1 ∼ 3 의 정수 (바람직하게는, 1 또는 2) 를 나타내고, n3 은 1 ∼ 5 의 정수 (바람직하게는, 2 ∼ 5 의 정수, 보다 바람직하게는, 3 또는 4) 를 나타내고, n4 는 0 ∼ 2 의 정수 (바람직하게는, 0 또는 1) 를 나타내고, n9 는 2 ∼ 7 의 정수 (바람직하게는, 2 ∼ 5 의 정수, 보다 바람직하게는, 2, 3 또는 5) 를 나타낸다) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 1 개를 나타낸다.
La 는, 바람직하게는, 이하 :
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)4-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-CH2-C(=O)-,
-CH2-OC(=O)-,
-OC(=O)-,
-(CH2)5-C(=O)-, 및,
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 1 개를 나타낸다.
La 는, 보다 바람직하게는,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-,
또는
-(CH2)5-C(=O)-
이다.
La 는, 보다 더 바람직하게는, -C(=O)-CH2CH2-C(=O)- 이다.
다음으로, Lb 에 대해서 설명한다.
Lb 는, 당사슬 콘쥬게이션의 링커에 사용되는 스페이서 (본 명세서 중, 「당사슬 콘쥬게이션의 링커의 스페이서」 라고도 한다), 또는, 시스테인 콘쥬게이션에 사용되는 스페이서 (본 명세서 중, 「시스테인 콘쥬게이션의 링커의 스페이서」 라고도 한다) 를 나타낸다.
＜Lb 가 「당사슬 콘쥬게이션의 링커의 스페이서」 인 경우＞
Lb 가 「당사슬 콘쥬게이션의 링커의 스페이서」 인 경우, Lb 는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 다음 식으로 나타내는 스페이서를 들 수 있다.
[화학식 72]
Figure pat00072
[화학식 73]
Figure pat00073
또는,
[화학식 74]
Figure pat00074
상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, 아스테리스크 (*) 는 La 의 좌단의 -(C=O)- 또는 -CH2- 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링 된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타낸다.
Lb 에 Lb-1, Lb-2 또는 Lb-3 중 어느 것을 선택하는 경우, 트리아졸 고리 부위는, 기하 이성 구조를 갖고, 1 개의 Lb 중에, 2 종류의 구조 중 어느 일방을 포함하거나, 또는, 그들의 혼합물을 포함한다. 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트는, 항체 1 분자에 복수의 약물을 결합시킬 수 있다. 항체 1 분자에 복수의 약물을 결합시키는 경우, Lb 도 복수 존재하게 된다 (예를 들어, 후술하는 ＜3. 제조 방법＞ 의 E 법에 나타낸 항체 약물 콘쥬게이트의 모식도 (1e) 를 참조할 것). Lb 가 Lb-1, Lb-2 또는 Lb-3 중 어느 것에서 선택되고, 그 Lb 가 항체 1 분자에 대하여 복수 존재하는 경우 (예를 들어, 후술하는 m2 가 1 또는 2 인 경우), 각각의 Lb 에 있어서, 트리아졸 고리 부위는 기하 이성 구조를 갖고, 1 개의 Lb 중에, 2 종류의 구조 중 어느 일방을 포함하거나, 또는, 그들의 혼합물을 포함한다.
＜Lb 가 「시스테인 콘쥬게이션의 링커의 스페이서」 인 경우＞
Lb 가, 「시스테인 콘쥬게이션의 링커의 스페이서」 인 경우, Lb 는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, -(숙신이미드-3-일-N)- 를 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 「-(숙신이미드-3-일-N)-」 는, 다음 식 :
[화학식 75]
Figure pat00075
으로 나타내는 구조를 갖는다. 상기에서 나타내는 구조식에 있어서, 아스테리스크는 La 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 항체의 시스테인 잔기의 측사슬과 티오에테르를 형성하여 결합하고 있다.
다음으로, Lc 에 대해서 설명한다.
Lc 는, -NH-CH2-, -페닐기-CH2-O(C=O)- 또는 -NH-헤테로아릴기-CH2-O(C=O)- 를 나타내거나, 혹은, 존재하지 않는다. 여기서, 페닐기로는, 바람직하게는, 1,4-페닐기이고, 헤테로아릴기로서 바람직하게는, 2,5-피리딜기, 3,6-피리딜기, 2,5-피리미딜기 또는 2,5-티에닐기이다. Lc 는, 바람직하게는, -NH-CH2- 이거나, 또는 존재하지 않는다.
본 발명의 보다 바람직한 링커 L 은,
약물과 항체의 결합 양식이 「당사슬 콘쥬게이션」 인 경우,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFCit-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGICit-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFM-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGLM-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-FG-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-CH2
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-CH2-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFCit-NH-CH2-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-, 또는
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)4-CH2-C(=O)-,
(여기서, ZL1 은, 상기 Lb 의 이하로 나타내는 구조식 :
[화학식 76]
Figure pat00076
을 나타낸다) 이고, 혹은,
약물과 항체의 결합 양식이 「시스테인 콘쥬게이션」 인 경우,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGFG-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGVA-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGVCit-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGFCit-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGICit-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGFM-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGPI-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGLM-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-FG-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-VA-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGFG-NH-CH2-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-CH2-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGVCit-NH-CH2-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGFCit-NH-CH2-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-, 또는
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-NH-(CH2CH2O)4-CH2-C(=O)-,
(여기서, ZL2 는, 상기 Lb 의 이하로 나타내는 구조식 :
[화학식 77]
Figure pat00077
으로 나타내는 -(숙신이미드-3-일-N)- 를 나타낸다.)
이다.
본 발명의 보다 바람직한 링커 L 은, 약물과 항체의 결합 양식이 「당사슬 콘쥬게이션」 이며,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-,
또는
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-CH2-,
(여기서, ZL1 은, 상기 Lb 의 이하로 나타내는 구조식 :
[화학식 78]
Figure pat00078
을 나타낸다) 이다.
상기의 「바람직한 링커 L」 및 「보다 바람직한 링커 L」 에 있어서의 우단은, 식 (I) 의 L1 또는 L2 에 포함되는 임의의 -NH2 또는 하이드록시기와 결합하고 있다.
＜2.2. 항체 및 그 당사슬 수식＞
＜2.2.1 항체＞
본 명세서에 있어서, 「유전자」 란, 단백질의 아미노산을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함되는 뉴클레오티드 혹은 뉴클레오티드 서열, 또는 그 상보 사슬을 의미하며, 예를 들어, 단백질의 아미노산을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함되는 뉴클레오티드 서열 또는 그 상보 사슬인 폴리 뉴클레오티드, 올리고 뉴클레오티드, DNA, mRNA, cDNA, RNA 등은 「유전자」 의 의미에 포함된다.
본 명세서에 있어서, 「뉴클레오티드」, 「폴리 뉴클레오티드」 또는 「뉴클레오티드 서열」 과「핵산」 은 동일한 의미이며, 예를 들어, DNA, RNA, 프로브, 올리고 뉴클레오티드, 폴리 뉴클레오티드, 프라이머 등도 「뉴클레오티드」 또는 「뉴클레오티드 서열」 의 의미에 포함된다.
본 명세서에 있어서는, 「폴리펩티드」, 「펩티드」, 「단백질」 은 구별하지 않고 사용하고 있다.
본 명세서에 있어서, 「항체의 기능성 단편」 이란, 「항체의 항원 결합 단편」 이라고도 불리고, 항원과의 결합 활성을 갖는 항체의 부분 단편을 의미하고 있으며, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, diabody, 선상 항체 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이성 항체 등을 포함한다. 또, F(ab')2 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 항원 결합 단편에 포함된다. 단, 항원과의 결합능을 갖고 있는 한 이들 분자에 한정되지 않는다. 또, 이들 항원 결합 단편에는, 항체 단백질의 전체 길이 분자를 적당한 효소로 처리한 것 뿐만 아니라, 유전자 공학에 의해 개변된 항체 유전자를 사용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 산생된 단백질도 포함된다.
본 발명의 기능성 단편은, IgG 중사슬의 Fc 영역에 있어서 잘 보존된 N 결합형 당사슬에 의한 수식을 받는 아스파라긴 (Asn297) 및 그 주변의 아미노산을 유지하고, 또한 항원과의 결합능을 갖고 있는 기능성 단편을 포함한다.
본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 사용되는 항체는, 면역 글로블린을 의미하며, 항원과 면역 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자이다. 본 발명의 항체로서, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY 중 어느 클래스여도 되지만, IgG 가 바람직하다. 또, 서브 클래스로서, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2 중 어느 것이어도 되지만, IgG1, IgG2 또는 IgG4 가 바람직하다 (IgG 중사슬의 Fc 영역에 ADCC 및 ADCP 활성에 영향을 미치는 변이를 갖는 항체를 포함한다).
본 발명의 항체의 아이소타입으로서 IgG1 을 사용하는 경우에는, 정상 영역의 아미노산 잔기의 일부를 치환함으로써, 이펙터 기능을 조정하는 것이 가능하다 (WO88/07089, WO94/28027, WO94/29351 참조). IgG1 의 변이체로는, 예를 들어, IgG1 LALA 변이 (IgG1-L234A, L235A) 를 들 수 있다. 상기 L234A, L235A 는 EU index (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 63, No.1 (May 15, 1969), pp. 78-85) 에 의해 특정되는 234 위치 및 235 위치의 류신의 알라닌으로의 치환을 나타낸다.
항체는, 어느 종에서 유래해도 되지만, 바람직하게는, 인간, 래트, 마우스 및 토끼를 예시할 수 있다. 인간 이외의 종에서 유래하는 경우에는, 주지의 기술을 이용하여, 키메라화 또는 인간화하는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체는, 폴리클로날 항체여도 되고, 모노클로날 항체여도 되지만, 모노클로날 항체가 바람직하다. 모노클로날 항체에는, 래트 항체, 마우스 항체, 토끼 항체 등의 비인간 동물 유래의 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 그들의 기능성 단편, 또는 그들의 수식체가 포함된다.
항체는, 바람직하게는, 종양 세포 또는 면역 세포를 표적으로 하는 항체이지만, 이들에 한정되지 않는다. 항체는, 보다 바람직하게는, 종양 세포를 표적으로 하는 항체이다.
종양 세포를 표적으로 하는 항체가 사용되는 경우, 항체로는, 종양 세포를 인식할 수 있는 특성, 종양 세포에 결합할 수 있는 특성, 종양 세포내에 도입되어 내재화하는 특성, 나아가서는 종양 세포를 상해하는 특성 중 1 또는 그 이상의 특성을 구비하고 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체에 링커를 개재하여 결합되는 약물은, STING 아고니스트 활성을 갖는다. 본 발명의 약물은 인터페론 제어 인자 3 (interferon regulatory factor-3 (IRF3)) 의 시그널을 활성화하여 인터페론을 유도한다. 따라서, 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 종양 세포를 표적으로 하는 항체가 사용되는 경우, 항체 약물 콘쥬게이트는 체내에 투여된 후, 종양 부위에 송달되어, 종양 세포내에 도입된 후 펩티다아제 등에 의해 링커 부분이 절단되어 약물 부분이 유리된다. 유리된 약물 부분은 STING 아고니스트 활성을 통해서 항종양 면역을 부활화하여, 항종양 효과를 발휘시키는 것으로 생각된다.
항체의 종양 세포에 대한 결합성은, 플로 사이토메트리를 사용하여 확인할 수 있다. 종양 세포내로의 항체의 도입은, (1) 치료 항체에 결합하는 2 차 항체 (형광 표지) 를 사용하여 세포내에 도입된 항체를 형광 현미경으로 가시화하는 어세이 (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) 치료 항체에 결합하는 2 차 항체 (형광 표지) 를 사용하여 세포내에 도입된 형광량을 측정하는 어세이 (Molecular Biology of the Cell Vol. 15, 5268-5282, December 2004) 또는 (3) 치료 항체에 결합하는 이뮤노톡신을 사용하여, 세포내에 도입되면 독소가 방출되어 세포 증식이 억제된다는 Mab-ZAP 어세이 (Bio Techniques 28 : 162-165, January 2000) 를 사용하여 확인할 수 있다. 이뮤노톡신으로는, 디프테리아 독소의 촉매 영역과 프로테인 G 의 리콤비넌트 복합 단백질도 사용 가능하다.
본 발명에 있어서, 「높은 내재화능」 이란, 당해 항체와 사포린 표지 항마우스 또는 래트 IgG 항체를 첨가한 표적 항원 발현 세포 (예를 들어, 항HER2 항체를 사용하는 경우에는, HER2 발현 세포) 의 생존률 (항체 미첨가 시의 세포 생존률을 100 ％ 로 한 상대율로 나타낸 것) 이, 바람직하게는 70 ％ 이하, 보다 바람직하게는 60 ％ 이하인 것을 의미한다.
본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 종양 세포를 표적으로 한 항체를 사용하는 경우, 항체 자체가 항종양 효과를 갖는 것은, 바람직하지만, 필수는 아니다. 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 사용되는 항체는, 종양 세포내로 이행하는 내재화의 성질을 갖는 것이 바람직하다.
약물 그리고 항체 약물 콘쥬게이트의 항종양 활성은, 종양 세포에 대한 세포 상해 활성, 항세포 효과, 종양 체적의 축퇴를 말한다. 공지된 in vitro 또는 in vivo 의 평가계를 사용하여, 항종양 활성을 확인할 수 있다.
약물 그리고 항체 약물 콘쥬게이트의 면역 부활화 활성은, 면역 세포에 대한 종양 세포의 감수성 항진 또는 종양 세포를 개재한 면역 세포의 부활화를 말한다. 공지된 in vitro 또는 in vivo 의 평가계를 사용하여, 면역 부활화 활성을 확인할 수 있다.
본 발명에 사용되는 항체로는, 예를 들어, 항HER2 항체, 항HER3 항체, 항DLL3 항체, 항FAP 항체, 항CDH11 항체, 항CDH6 항체, 항A33 항체, 항CanAg 항체, 항CD19 항체, 항CD20 항체, 항CD22 항체, 항CD30 항체, 항CD33 항체, 항CD56 항체, 항CD70 항체, 항CD98 항체, 항TROP2 항체, 항CEA 항체, 항Cripto 항체, 항EphA2 항체, 항G250 항체, 항MUC1 항체, 항GPNMB 항체, 항Integrin 항체, 항PSMA 항체, 항Tenascin-C 항체, 항SLC44A4 항체, 항Mesothelin 항체, 항ENPP3 항체, 항CD47 항체, 항EGFR 항체, 항GPR20 항체 또는 항DR5 항체를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 항체로서, 바람직하게는, 항HER2 항체 (예를 들어, 트라스투주맙 또는 페르투주맙), 항CDH6 항체, 항CD33 항체 또는 항EphA2 항체이며, 보다 바람직하게는, 항HER2 항체이다.
본 발명의 항체는, 이 분야에서 통상적으로 실시되는 방법을 사용하여, 항원이 되는 폴리펩티드를 동물에게 면역하고, 생체내에 산생되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있다. 항원의 유래는 인간에 한정되지 않고, 마우스, 래트 등의 인간 이외의 동물에서 유래하는 항원을 동물에게 면역할 수도 있다. 이 경우에는, 취득된 이종 항원에 결합하는 항체와 인간 항원의 교차성을 시험함으로써, 인간의 질환에 적용 가능한 항체를 선별할 수 있다.
또, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497, Kennett, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N. Y. (1980)) 에 따라서, 항원에 대한 항체를 산생하는 항체 산생 세포와 골수종 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하고, 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다.
또한, 항원은 항원 단백질을 코드하는 유전자를 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 인간화 항체는 공지된 방법 (예를 들어, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984), Nature (1986) 321, p. 522-525, WO90/07861) 에 따라서 취득할 수 있다.
예를 들어, 항HER2 항체 (US5821337, WO2004/008099 등), 항CD33 항체 (WO2014/057687 등), 항CD70 항체 (WO2004/073656 등), 항EphA2 항체 (WO2009/028639 등), 항CDH6 항체 (WO2018/212136 등) 는, 공지된 수단에 의해 취득할 수 있다.
본 발명의 항HER2 항체는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 이하의 특성을 갖는 것이 바람직하다.
(1) 이하의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 항HER2 항체 ;
(a) HER2 에 특이적으로 결합한다.
(b) HER2 와 결합함으로써 HER2 발현 세포에 내재화하는 활성을 갖는다.
(2) HER2 의 세포외 도메인에 결합하는 상기 (1) 에 기재된 항체.
(3) 상기 항체가 모노클로날 항체인 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 항체.
(4) 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성 및/또는 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성을 갖는 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(5) 마우스 모노클로날 항체, 키메라 모노크로날 항체 또는 인간화 모노클로날 항체인, 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(6) 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이며, ADCC 및 ADCP 활성의 저감을 가져오는 변이를 포함하는, 상기 (1) ∼ (3) 에 기재된 항체.
(7) 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(8) 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이며, EU 인덱스에 의해 나타내는 234 위치 및 235 위치의 류신이 알라닌으로 치환되어 있는, 상기 (5) 에 기재된 항체.
(9) 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (8) 에 기재된 항체.
(10) 서열 번호 29 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 28 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (1) ∼ (4) 에 기재된 항체.
(11) 서열 번호 30 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 28 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (1) ∼ (4) 에 기재된 항체.
(12) 중사슬 카르복실 말단에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는 상기 (1) ∼ (11) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(13) 상기 (1) ∼ (12) 중 어느 하나에 기재된 항체를 코드하는 폴리 뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체를 채취하는 공정을 포함하는 당해 항체의 제조 방법에 의해 얻어지는 항체.
＜2.2.2 항체의 당사슬 리모델링＞
최근, 불균일한 항체의 당사슬을, 효소 반응에 의해 리모델링 하고, 관능기를 갖는 당사슬을 균일하게 도입하는 방법이 보고되어 있다 (ACS Chem. Biol. 2012, 7, 110-122, ACS Med. Chem. Lett. 2016, 7, 1005-1008). 이 당사슬 리모델링 기술을 이용하여, 부위 특이적으로 약물을 도입하고, 균일한 ADC 를 합성하는 시도도 이루어지고 있다 (Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2233-2242, Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2361-2367, US2016361436).
당사슬의 리모델링은 먼저 가수분해 효소를 이용하여, 단백질 (항체 등) 에 부가되어 있는 불균일한 당사슬을 말단의 GlcNAc 만 남기고 절제하고, GlcNAc 가 부가한 균일한 단백질 부분을 조제한다 (이하, 「억셉터」 라고 한다). 다음으로, 별도 조제한 임의의 당사슬을 준비하고 (이하, 「도너」 라고 한다), 이 억셉터와 도너를, 당전이 효소를 사용하여 연결한다. 이에 따라, 임의의 당사슬 구조를 가진 균일한 당단백질을 합성할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「당사슬」 이란, 2 개 이상의 단당이 글리코시드 결합에 의해 결합된 구조 단위를 의미한다. 구체적인 단당이나 당사슬을, 예를 들어 "GlcNAc-", "SG-" 와 같이, 약호로서 표기하는 경우가 있다. 구조식 중에서 이들 약호로 기재한 경우, 환원 말단에서 별도의 구조 단위와의 글리코시드 결합에 귀속하는 산소 원자 또는 질소 원자는, 특별한 정의가 있는 경우를 제외하고, 당해 당사슬을 나타내는 약호에는 포함되지 않는 것으로서 표시된다.
본 발명에 있어서, 당사슬의 기본 단위가 되는 단당의 기재는, 별도로 정하는 경우를 제외하고, 편의상, 그 고리 구조에 있어서, 고리를 구성하는 산소 원자에 결합하고, 또한, 하이드록시기 (또는 글리코시드 결합에 귀속하는 산소 원자) 와 직접 결합한 탄소 원자를 1 위치 (시알산에 있어서만 2 위치) 로서 표기한다. 실시예 화합물의 명칭은, 화학 구조 전체적으로 붙여진 것이며, 이 룰은 반드시 적용되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 당사슬을 기호 (예를 들어, SG, MSG, GlcNAc 등) 로서 기재하는 경우, 별도로 정의되는 경우를 제외하고, 환원 말단의 탄소까지를, 당해 기호에 포함시키는 것으로 하고, N- 또는 O-글리코시드 결합에 귀속하는 N 또는 O 는, 당해 기호에는 포함되지 않는 것으로 한다.
본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트는, 다음 식
[화학식 79]
Figure pat00079
으로 나타내고, 항체 Ab 또는 그 기능성 단편은, 그 아미노산 잔기 (예를 들어, 시스테인, 리신 등) 의 측사슬로부터 직접 L 에 결합하거나, Ab 의 당사슬 또는 리모델링 된 당사슬로부터 L 에 결합하고 있다.
본 발명에 있어서의 Ab 의 당사슬은, N 결합형 당사슬이나 O 결합형 당사슬이고, 바람직하게는, N 결합형 당사슬이다.
N 결합형 당사슬은 N 글리코시드 결합, O 결합형 당사슬은 O 글리코시드 결합에 의해, 항체의 아미노산 측사슬과 결합하고 있다.
본 발명의 Ab 는, IgG 이며, 바람직하게는, IgG1, IgG2 또는 IgG4 이다.
IgG 는 그 중사슬의 Fc 영역에 있어서의 297 번째의 아스파라긴 잔기 (이하, 「Asn297 또는 N297」 이라고 한다.) 에 잘 보존된 N 결합형 당사슬을 갖고 있고, 항체 분자의 활성이나 동태 등에 기여하는 것이 알려져 있다 (Eon-Duval, A. et al, Biotechnol. Prog. 2012, 28, 608-622, Sanglier-Cianferani, S., Anal. Chem. 2013, 85, 715-736).
IgG 의 정상 영역에 있어서의 아미노산 서열은 잘 보존되어 있고, Edelman 등의 보고 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 63, 78-85, (1969)) 에 있어서, 각각의 아미노산이 EU 번호 (EU INDEX) 로 특정되어 있다. 예를 들어, Fc 영역에 있어서 N 결합형 당사슬이 부가하는 Asn297 은, EU 번호에 있어서 297 위치에 상당하는 것이며, 분자의 단편화나 영역 결손에 의해 실제의 아미노산 위치가 변동한 경우이더라도 EU 번호로 표시함으로써 아미노산이 일의적으로 특정된다.
아래 그림은 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트가 항체 또는 그 기능성 단편의 상기 N297 당사슬로부터 L 에 결합하고 있는 경우를 나타낸다.
[화학식 80]
Figure pat00080
또한, 당해 리모델링 된 당사슬을 갖는 항체를 당사슬 리모델링 항체라고 한다.
SGP(α2,6-SGP) 는, Sialylglycopeptide 의 약칭이며, N 결합형 당펩티드의 대표적인 것이다. SGP 는, 예를 들어, WO2011/027868 에 기재된 방법에 따라서, 계란의 난황으로부터 단리, 정제할 수 있다. 또, SGP 의 정제품이 도쿄 화성 공업 및 후시미 제약소에서 판매되고 있다. 본 명세서에 있어서, SGP 의 당사슬 부분을 SG 라고 표기하고, SG 의 환원 말단의 GlcNAc 가 1 개 결손된 당사슬을 SG(10) 으로 표기한다. SG(10) 은, 예를 들어, 우메가와 등의 보고 (Biochim. Biophys. Acta 2010, 1800, 1203-1209) 를 참조하여, SGP 의 효소적인 가수분해에 의해 조제할 수 있다. 또, SG(10) 도 도쿄 화성 공업 및 후시미 제약소에서 구입할 수 있다.
본 명세서에 있어서, SG(10) 의 β-Man 의 분기 사슬의 어느 일방에서만 비환원 말단의 시알산이 결실된 당사슬 구조를 MSG(9) 로 표기하고, 분기 사슬의 1-3 당사슬에만 시알산을 갖는 것을 MSG1, 분기 사슬의 1-6 당사슬에만 시알산을 갖는 것을 MSG2 라고 각각 표기한다.
본 발명의 리모델링 된 당사슬은, N297-(Fuc)SG, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, 또는 N297-(Fuc)MSG1 과 N297-(Fuc)MSG2 의 혼합물이고, 바람직하게는, N297-(Fuc)SG, N297-(Fuc)MSG1 또는, N297-(Fuc)MSG2 이며, 보다 바람직하게는 N297-(Fuc)SG 또는 N297-(Fuc)MSG1 이다.
N297-(Fuc)SG 는 이하의 구조식 또는 서열식으로 나타낸다.
[화학식 81]
Figure pat00081
[화학식 82]
Figure pat00082
상기 식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, 아스테리스크는, 상기 링커 L, 특히 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
여기서, n5 는 2 ∼ 10 의 정수이며, 바람직하게는, 2 ∼ 5 의 정수이다.
N297-(Fuc)MSG1 은 이하의 구조식 또는 서열식으로 나타낸다.
[화학식 83]
Figure pat00083
[화학식 84]
Figure pat00084
상기 식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
아스테리스크는, 상기 링커 L, 특히 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
여기서, n5 는 2 ∼ 10 의 정수이며, 바람직하게는, 2 ∼ 5 의 정수이다.
N297-(Fuc)MSG2 는 이하의 구조식 또는 서열식으로 나타낸다.
[화학식 85]
Figure pat00085
[화학식 86]
Figure pat00086
상기 식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, 아스테리스크는, 상기 링커 L, 특히 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
여기서, n5 는 2 ∼ 10 의 정수이며, 바람직하게는, 2 ∼ 5 의 정수이다.
본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체의 N297 당사슬이, N297-(Fuc)SG 인 경우, 항체는 2량체이기 때문에, 항체 약물 콘쥬게이트는 4 개의 링커 L 및 4 개의 약물 D 가 결합된 분자 (상기 m2 = 2) 가 된다.
본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체의 N297 당사슬이, N297-(Fuc)MSG1 혹은 N297-(Fuc)MSG2 또는 그들의 혼합물인 경우, 항체는 2량체이기 때문에, 항체 약물 콘쥬게이트는 2 개의 링커 L 및 2 개의 약물 D 가 결합된 분자 (상기 m2 = 1) 가 된다 (도 1 참조).
N297 당사슬은, 바람직하게는, N297-(Fuc)SG 혹은 N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)MSG2 이며, 보다 바람직하게는, N297-(Fuc)SG 이다.
본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체의 N297 당사슬이 N297-(Fuc)SG 혹은 N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)MSG2 인 경우, 균일성이 높은 ADC 를 취득할 수 있다.
＜3. 제조 방법＞
본 발명의 신규 CDN 유도체 및 그 항체 약물 콘쥬게이트 또는 그들의 제조 중간체의 대표적인 제조 방법을 설명한다. 또한, 이하에 있어서, 화합물을 나타내기 위해서, 각 반응식 중에 나타내는 화합물의 번호를 사용한다. 즉, 「식 (1) 의 화합물」, 「화합물 (1)」 등으로 칭한다. 또, 이외의 번호의 화합물에 대해서도 동일하게 기재한다.
하기의 A 법 ∼ E 법에 있어서, 치환기 R1 ∼ R5, L1, L2, W1, W2, Z1 ∼ Z3 은, 상기와 동일한 의미이다. 치환기 Ra, Rc, Re 및 Rg 는, 천연형 α-아미노산의 측사슬을 나타낸다. 예를 들어, 메틸기, 이소프로필기, sec-부틸기, 이소부틸기, 벤질기 등이다. PRO1 은, 제 1 급 알코올의 보호기를 나타낸다. 적합하게는, 4,4'-디메톡시트리틸기, 4-메톡시트리틸기 등이다. PRO2, PRO3, PRO7, PRO8 은, 제 2 급 알코올의 보호기를 나타낸다. 적합하게는 tert-부틸디메틸실릴기, 트리이소프로필실릴옥시메틸기, 벤조일기, 2-니트로벤질기, 4-메톡시테트라하이드로피란-4-일기 등이다. PRO6 은 카르복실산의 보호기를 나타낸다. 적합하게는, tert-부틸기, 벤질기 등이다. PRO5, PRO9 는, 아민의 보호기를 나타낸다. PRO5 는, 적합하게는, tert-부틸옥시카르보닐기, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기, 알릴옥시카르보닐기, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐기, 벤질옥시카르보닐기 등이며, PRO9 는, 적합하게는, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기 또는 2-(트리메틸실릴)에톡시카르보닐기이다. PRO4 는, 알코올 또는 아민의 보호기를 나타낸다. 알코올의 경우, 적합하게는 tert-부틸디메틸실릴기, 벤조일기 등이며, 아민의 경우, 적합하게는 2-(트리메틸실릴)에톡시카르보닐기, 알릴옥시카르보닐기, tert-부틸옥시카르보닐기 등이다. Qa 는 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고, Qb 는 하이드록시기 또는 티올기를 나타낸다. Qa' 및 Qb' 는, 각각 독립적으로, 부 (負) 로 하전한 산소 원자 (O-) 또는 황 원자 (S-) 를 나타낸다. Rx 및 Ry 는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자 또는 -O-PRO2 를 나타낸다. n 은 1 내지 3 의 정수를 나타낸다.
A 법
본 발명의 (1) 로 나타내는 CDN 유도체는, 이하에 기재하는 A 법에 따라서 제조할 수 있다.
[화학식 87]
Figure pat00087
본 제조법은 일반식 (1) 로 나타내는 화합물을 제조하기 위한 방법이다. 본 제조법의 A-1 공정부터 A-5 공정까지는 원 포트 합성이 가능하지만, 이것은, Gaffney 등의 보고 (Org. Lett. 2010, 12, 3269-3271) 를 참조하여 실시할 수 있다.
[화학식 88]
Figure pat00088
(A-1 공정)
본 공정은, 식 (1a) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 가수분해 반응과 시아노에틸기의 제거를 연속해서 실시함으로써, 식 (2a) 의 화합물을 제조하는 공정이다.
화합물 (1a) 를 용매 (아세토니트릴, 테트라하이드로푸란, N,N-디메틸포름아미드 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -10 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 15 ℃ 부터 35 ℃ 까지에 있어서, 물 및 산 (피리딘트리플루오로아세트산염, 4,5-디시아노이미다졸, 1H-테트라졸 등) 으로 처리함으로써 가수분해 반응을 실시하였다. 화합물 (1a) 1 몰에 대하여, 물은 2 몰 내지 과잉 몰, 바람직하게는 2 몰 내지 10 몰 사용하고, 산은 1 몰 내지 과잉 몰, 바람직하게는 1 몰 내지 5 몰 사용하였다. 반응 시간은 1 분간 내지 3 시간, 바람직하게는 5 분간 내지 30 분간이다. 이어서, 이 반응액에 염기 (tert-부틸아민 등) 를 첨가하여 시아노에틸기를 제거하였다. 염기는, 화합물 (1a) 1 몰에 대하여 과잉 몰, 바람직하게는 30 몰 내지 50 몰 사용하였다. 반응 시간은, 5 분간 내지 6 시간, 바람직하게는 15 분간 내지 1 시간이다. 반응액을 감압하에서 농축하여, 화합물 (2a) 의 미정제체를 얻었다. 화합물 (2a) 의 미정제체는, 정제하지 않고 다음의 공정으로 진행할 수 있다.
(A-2 공정)
본 공정은, 식 (2a) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 하이드록시기의 보호기를 제거하고, 식 (3a) 의 화합물을 제조하는 공정이다. 본 공정의 반응을 개시하기 전에, 필요에 따라, 아세토니트릴을 사용하여 1 회 내지 3 회 공비하고, 식 (2a) 의 미정제체를 건조시켰다.
PRO1 이 4,4'-디메톡시트리틸기인 경우, 화합물 (2a) 를 용매 (디클로로메탄, 클로로포름, 디클로로에탄 등) 중에서, -10 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 15 ℃ 부터 35 ℃ 까지에 있어서, 물과 산 (디클로로아세트산, 트리플루오로아세트산 등) 으로 처리함으로써 4,4'-디메톡시트리틸기를 제거하였다. 화합물 (2a) 1 몰에 대하여, 물은 과잉 몰, 바람직하게는 10 몰 내지 20 몰 사용하고, 산은, 반응에 사용하는 용매로 1 ％ 내지 50 ％ (v/v), 바람직하게는 5 ％ 에서 10 ％ (v/v) 까지 희석하고, 그 희석 용액을 과잉 몰, 바람직하게는 5 몰 내지 15 몰 사용하였다. 반응 시간은 1 분간 내지 3 시간, 바람직하게는 5 분간 내지 30 분간이다. 반응액에 피리딘을 첨가하여 반응 정지 처리를 하였다. 피리딘은 사용한 산을 충분히 중화할 수 있는 양, 바람직하게는 산 1 몰에 대하여 2 몰 내지 10 몰 사용하였다. 반응액을 감압하에서 농축하여, 화합물 (3a) 의 미정제체를 얻었다. 화합물 (3a) 의 미정제체를, 탈수 아세토니트릴을 사용하여 3 회 내지 5 회 공비하였다. 마지막 공비 시에 아세토니트릴을 남기고, 화합물 (3a) 의 0.01 M 내지 1 M 의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 얻어진 아세토니트릴 용액을, 그대로 다음의 공정으로 진행하였다.
(A-3 공정)
본 공정은, 식 (3a) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 식 (4a) 의 화합물과의 커플링 반응 및 얻어진 커플링체의 황화 반응을 연속해서 실시함으로써, 식 (5a) 의 화합물을 제조하는 공정이다.
본 공정의 반응을 개시하기 전에, 화합물 (4a) 를, 탈수 아세토니트릴을 사용하여 3 회 내지 5 회 공비하였다. 마지막 공비 시에 아세토니트릴을 남기고, 화합물 (4a) 의 0.01 M 내지 1 M 의 아세토니트릴 용액을 조제하였다. 이 용액에 건조제 (분말상 또는 펠릿상의 몰레큘러 시브스 3A 혹은 몰레큘러 시브스 4A) 를 첨가하고, 용액을 사용할 때까지 질소 또는 아르곤 분위기하에서 보존하였다.
화합물 (3a) 의 아세토니트릴 용액에, 5 ℃ 부터 35 ℃ 까지에 있어서, 공비에 의해 건조시킨 화합물 (4a) 의 아세토니트릴 용액을 첨가함으로써 커플링 반응을 실시하였다. 반응 시간은, 1 분간 내지 24 시간, 바람직하게는 5 분간 내지 6 시간이다. 이어서, 이 반응액에 황화제 (N,N-디메틸-N'-(3-술파닐리덴-3H-1,2,4-디티아졸-5-일)메탄이미드아미드, 3H-1,2-벤조디티올-3-온 등) 첨가하여 황화 반응을 실시하였다. 황화제는 화합물 (3a) 1 몰에 대하여 1 몰 내지 5 몰, 바람직하게는 1 몰 내지 2 몰 사용하였다. 반응 시간은 5 분간 내지 24 시간, 바람직하게는 30 분간 내지 6 시간이다. 반응액을 감압하에서 농축하여, 화합물 (5a) 의 미정제체를 얻었다. 얻어진 화합물 (5a) 의 미정제체는, 그대로 다음의 공정으로 진행하였다.
(A-4 공정)
본 공정은, 식 (5a) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 하이드록시기의 보호기를 제거하고, 식 (6a) 의 화합물을 제조하는 공정이다.
PRO1 이 4,4'-디메톡시트리틸기인 경우, 화합물 (5a) 의 화합물을 용매 (디클로로메탄, 클로로포름, 디클로로에탄 등) 중에서, -10 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 15 ℃ 부터 35 ℃ 까지에 있어서, 물과 산 (디클로로아세트산, 트리플루오로아세트산 등) 으로 처리함으로써 4,4'-디메톡시트리틸기를 제거하였다. 화합물 (5a) 1 몰에 대하여, 물은 과잉 몰, 바람직하게는 10 내지 20 몰을 사용하고, 산은, 반응에 사용하는 용매로 1 ％ 내지 50 ％ (v/v), 바람직하게는 5 ％ 에서 10 ％ (v/v) 까지 희석하고, 그 희석 용액을 과잉 몰, 바람직하게는 5 몰 내지 15 몰 사용하였다. 반응 시간은 1 분간 내지 3 시간, 바람직하게는 5 분간 내지 30 분간이다. 반응액에 피리딘을 첨가하여 반응 정지 처리를 하였다. 피리딘은 사용한 산을 충분히 중화할 수 있는 양, 바람직하게는 산 1 몰에 대하여 10 몰 내지 200 몰 사용하였다. 반응액을 감압하에서 농축하여, 화합물 (6a) 의 미정제체를 얻었다. 얻어진 화합물 (6a) 의 미정제체를, 그대로 다음의 공정으로 진행하였다.
(A-5 공정)
본 공정은, 식 (6a) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 고리화 반응과 황화 반응을 연속해서 실시하고, 식 (7a) 의 화합물을 제조하는 공정이다.
화합물 (6a) 를 피리딘에 용해 후, 감압하에서 농축하여 0.01 M 내지 0.5 M의 피리딘 용액을 조제하였다. 이 피리딘 용액에, 5 ℃ 부터 35 ℃ 까지에 있어서, 탈수 축합제 (2-클로로-5,5-디메틸-1,3,2λ5-디옥사포스피난-2-온 등) 를 첨가함으로써 고리화 반응을 실시하였다. 탈수 축합제는, 화합물 (6a) 1 몰에 대하여, 1 몰 내지 과잉 몰, 바람직하게는 3 몰 내지 5 몰 사용하였다. 반응 시간은 1 분간 내지 6 시간, 바람직하게는 5 분간 내지 1 시간이다. 이어서, 이 반응액에 물과 황화제 (3H-1,2-벤조디티올-3-온, N,N-디메틸-N'-(3-술파닐리덴-3H-1,2,4-디티아졸-5-일)메탄이미드아미드 등) 를 첨가하여 황화 반응을 실시하였다. 화합물 (6a) 1 몰에 대하여, 물은 과잉 몰, 바람직하게는 30 몰 내지 50 몰 사용하고, 황화제는 1 몰 내지 5 몰, 바람직하게는 1 몰 내지 2 몰 사용하였다. 반응 시간은 5 분간 내지 12 시간, 바람직하게는 30 분간 내지 3 시간이다. 반응액을 탄산수소나트륨 수용액 (0.1 M 부터 1 M 까지) 에 첨가한 후, 15 분간 내지 24 시간 교반하여 반응 정지 처리를 하였다. 반응액을 유기 용매 (아세트산에틸, 디에틸에테르, 톨루엔 또는 그들의 혼합 용매) 로 1 회 내지 5 회 추출한 후, 추출액을 아울러 무수 염 (무수 황산나트륨 또는 무수 황산마그네슘) 으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고 여과액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올, 아세트산에틸/메탄올, 헥산/아세트산에틸 등], C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [완충액/아세토니트릴] 또는 그것들을 조합함으로써 정제하고, 화합물 (7a) 를 2 종류 이상의 디아스테레오머 혼합물 또는 2 종류 이상의 순수한 디아스테레오머로서 얻었다. 본 공정에서는 많은 경우, 2 종류의 디아스테레오머가 얻어지지만, 원료 (1a) 및 (4a) 에 의존하여, 추가로 1 종류 또는 2 종류의 디아스테레오머가 얻어지는 경우도 있다. 얻어진 화합물 (7a) 가 복수의 디아스테레오머 혼합물이더라도, 그 이상의 정제를 하지 않고 다음의 공정으로 진행할 수 있다.
(A-6 공정)
본 공정은, 식 (7a) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 시아노에틸기 및 모든 아실계 보호기를 동시에 제거하고, 식 (8a) 의 화합물을 제조하는 공정이다. 본 공정은, 필요에 따라 오토클레이브 안, 또는 실드 튜브 안에서 실시하였다.
PRO4 가 벤조일기인 경우, 화합물 (7a) 의 화합물을 용매 (메탄올, 에탄올, 테트라하이드로푸란 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, 5 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지에 있어서, 28 ％ (v/v) 암모니아수로 처리함으로써 시아노에틸기와 벤조일기를 제거하였다. 암모니아는, 화합물 (7a) 1 몰에 대하여 과잉 몰, 바람직하게는 300 몰 내지 3000 몰 사용하였다. 반응 시간은 30 분간 내지 96 시간, 바람직하게는 2 시간 내지 48 시간이다. 필요에 따라 반응액을 농축하고, 잔류물을 분취 HPLC [완충액/아세토니트릴, 완충액/메탄올 등], C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [완충액/아세토니트릴, 완충액/메탄올 등] 또는 그것들을 조합함으로써 정제하고, 화합물 (8a) 를 얻었다. 얻어진 화합물 (8a) 가 디아스테레오머 혼합물이더라도, 그 이상의 정제를 하지 않고 다음의 공정으로 진행할 수 있다. 또, 본 공정에서는 정제를 하지 않고 그대로 다음의 공정으로 진행할 수도 있다.
(A-7 공정)
본 공정은, 식 (8a) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 모든 실릴계 보호기를 동시에 제거하고, 식 (9a) 의 화합물을 제조하는 공정이다.
PRO2 및 PRO3 이 tert-부틸디메틸실릴기인 경우, 화합물 (8a) 를, 5 ℃ 부터 100 ℃ 까지, 바람직하게는 35 ℃ 부터 60 ℃ 까지에 있어서, 직접 트리에틸아민3불화수소산염으로 처리함으로써 tert-부틸디메틸실릴기를 제거하였다. 트리에틸아민3불화수소산염은, 화합물 (8a) 1 몰에 대하여 과잉 몰, 바람직하게는 100 내지 200 몰 사용하였다. 반응 시간은 30 분간 내지 24 시간, 바람직하게는 2 시간 내지 12 시간이다. 반응액을 실온까지 냉각 후, 반응액에 빙랭한 1 M 탄산수소트리에틸암모늄 수용액과 트리에틸아민의 3 : 1 내지 10 : 1 (v/v) 의 혼합 용액을 조금씩 따라 반응 정지 처리를 하였다. 필요에 따라, 반응액을 빙랭한 1 M 탄산수소트리에틸암모늄 수용액과 트리에틸아민의 혼합 용액에 따라도 된다. 이 경우에는, 반응 용기를 아세토니트릴과 물로 세정하였다. 트리에틸아민은 반응액의 액성을 약염기성으로 변화시킬 수 있는 충분량, 바람직하게는 트리에틸아민3불화수소산염 1 몰에 대하여, 트리에틸아민을 약 2 몰 사용한다. 반응액의 유기 용매 성분을 감압하에서 증류 제거한 후, 잔류한 수용액을 분취 HPLC [완충액/아세토니트릴, 완충액/메탄올 등], C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [완충액/아세토니트릴, 완충액/메탄올 등] 또는 그것들을 조합함으로써 정제하고, 화합물 (9a) 를 단일의 디아스테레오머로서 얻었다.
(A-8 공정)
본 공정은, 식 (9a) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 이온 교환하고, 식 (1) 의 화합물을 제조하는 공정이다.
양이온 교환 수지 (BT AG (등록상표) 50W-X2 레진, 100-200 메시, 수소형) 를 순수에 현탁시키고, 빈 칼럼 카트리지에 충전하였다. 양이온 교환 수지는, 중량비로 화합물 (9a) 의 10 배 내지 50 배량 사용하였다. 과잉의 순수를 자연 유하시킨 후, 1 M 수산화나트륨 수용액을 3 칼럼 체적 자연 유하시키고, 이어서, 6 칼럼 체적의 순수를 자연 유하시켰다. 화합물 (9a) 를 약 3 칼럼 체적의 순수에 용해하여, 칼럼에 차지하였다. 화합물이 순수에 잘 용해되지 않는 경우에는, 소량의 유기 용매 (아세토니트릴, 메탄올 등) 와의 혼합액을 사용해도 된다. 자연 유하한 용액을 분취 후, 추가로 6 칼럼 체적의 순수 등으로 용출하고, 획분을 분취하였다. 목적물을 포함하는 획분을 아울러 동결 건조시켜, 화합물 (1) 을 단일의 디아스테레오머로서 얻었다.
A' 법
본 발명의 (1') 로 나타내는 CDN 유도체는, 이하에 기재하는 A' 법에 따라서 제조할 수 있다.
[화학식 89]
Figure pat00089
본 제조법은, A 법의 일부를 변경하여 일반식 (1') 로 나타내는 화합물을 제조하기 위한 방법이다. 구체적으로는, 일반식 (1') 의 화합물은 A 법 A-5 공정을 이하에 나타내는 A'-5 공정으로 변경하여 제조할 수 있다. 또, 치환기 Rx 와 Ry 가 양방 할로겐 원자인 경우에는, A-7 공정을 생략할 수 있다.
[화학식 90]
Figure pat00090
(A'-5 공정)
본 공정은, 식 (6a') 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 고리화 반응과 산화 반응을 연속해서 실시하고, 식 (7a') 의 화합물을 제조하는 공정이다.
화합물 (6a') 를 피리딘에 용해 후, 감압하에서 농축하여 0.01 M 내지 0.5 M의 피리딘 용액을 조제하였다. 이 피리딘 용액에, 5 ℃ 부터 35 ℃ 까지에 있어서, 탈수 축합제 (2-클로로-5,5-디메틸-1,3,2λ5-디옥사포스피난-2-온 등) 를 첨가하여 고리화 반응을 실시하였다. 탈수 축합제는, 화합물 (6a') 1 몰에 대하여, 1 몰 내지 과잉 몰, 바람직하게는 3 몰 내지 5 몰 사용하였다. 반응 시간은 1 분간 내지 6 시간, 바람직하게는 5 분간 내지 1 시간이다. 이어서, 이 반응액에 물과 산화제 (요오드 등) 를 첨가하여 산화 반응을 실시하였다. 화합물 (6a') 1 몰에 대하여, 물은 0 몰 내지 과잉 몰, 바람직하게는 30 몰 내지 50 몰 사용하고, 산화제는 2 몰 내지 10 몰, 바람직하게는 3 몰 내지 5 몰 사용하였다. 반응 시간은 5 분간 내지 12 시간, 바람직하게는 30 분간 내지 3 시간이다. 반응액을 탄산수소나트륨 수용액 (0.1 M 부터 1 M 까지) 에 첨가하고, 15 분간 내지 24 시간 교반하여 반응 정지 처리를 하였다. 반응액을 유기 용매 (아세트산에틸, 디에틸에테르, 톨루엔 또는 그들의 혼합 용매) 로 1 회 내지 5 회 추출한 후, 추출액을 아울러 무수 염 (무수 황산나트륨 또는 무수 황산마그네슘) 으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고 여과액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올, 아세트산에틸/메탄올, 헥산/아세트산에틸 등], C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [완충액/아세토니트릴] 또는 그것들을 조합함으로써 정제하고, 화합물 (7a') 를 얻었다.
A'' 법
본 발명의 (1'') 로 나타내는 CDN 유도체는, 이하에 기재하는 A'' 법에 따라서 제조할 수 있다.
[화학식 91]
Figure pat00091
본 제조법은, A 법의 일부를 변경하여 일반식 (1'') 로 나타내는 화합물을 제조하기 위한 방법이다. 구체적으로는, 일반식 (1'') 의 화합물은, A 법의 A-3 공정을 이하에 나타내는 A''-3 공정으로 변경하여 제조할 수 있다. 또, 치환기 Rx 와 Ry 가 양방 할로겐 원자인 경우에는, A-7 공정을 생략할 수 있다.
[화학식 92]
Figure pat00092
(A''-3 공정)
본 공정은, 식 (3a'') 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 식 (4a'') 의 화합물과의 커플링 반응 및 얻어진 커플링체의 산화 반응을 연속해서 실시함으로써, 식 (5a'') 의 화합물을 제조하는 공정이다.
본 공정의 반응을 개시하기 전에, 화합물 (4a'') 를, 탈수 아세토니트릴을 사용하여 3 회 내지 5 회 공비하였다. 마지막 공비 시에 아세토니트릴을 남기고, 화합물 (4a'') 의 0.01 M 내지 1 M 의 아세토니트릴 용액을 조제하였다. 이 용액에 건조제 (분말상 또는 펠릿상의 몰레큘러 시브스 3A 혹은 몰레큘러 시브스 4A) 를 첨가하고, 용액을 사용할 때까지 질소 또는 아르곤 분위기하에서 보존하였다.
화합물 (3a'') 의 아세토니트릴 용액에, 5 ℃ 부터 35 ℃ 까지에 있어서, 공비에 의해 건조시킨 화합물 (4a'') 의 아세토니트릴 용액을 첨가함으로써 커플링 반응을 실시하였다. 반응 시간은, 1 분간 내지 24 시간, 바람직하게는 5 분간 내지 6 시간이다. 이어서, 이 반응액에 산화제 (tert-부틸하이드로퍼옥사이드 등) 를 첨가하여 산화 반응을 실시하였다. 산화제는 화합물 (3a'') 1 몰에 대하여 1 몰 내지 5 몰, 바람직하게는 2 몰 내지 3 몰 사용하였다. 반응 시간은 5 분간 내지 24 시간, 바람직하게는 30 분간 내지 6 시간이다. 반응액에 포화 티오황산나트륨 수용액을 첨가하고, 10 분간 내지 12 시간 교반하여 반응 정지 처리를 하였다. 반응액을 유기 용매 (디클로로메탄과 메탄올의 혼합 용매 등) 로 1 회 내지 5 회 추출한 후, 추출액을 아울러 무수 염 (무수 황산나트륨 또는 무수 황산마그네슘) 으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고 여과액을 감압하에서 농축하여, 화합물 (5a'') 의 미정제체를 얻었다. 얻어진 화합물 (5a'') 의 미정제체를 그대로 다음의 공정으로 진행하였다.
A''' 법
본 발명의 (1''') 로 나타내는 CDN 유도체는, 이하에 기재하는 A''' 법에 따라서 제조할 수 있다.
[화학식 93]
Figure pat00093
본 제조법은, A 법의 일부를 변경하여 일반식 (1''') 로 나타내는 화합물을 제조하기 위한 방법이다. 구체적으로는, 일반식 (1''') 의 화합물은, A 법의 A-3 공정을 A''-3 공정으로, A-5 공정을 A'-5 공정으로 변경하여 제조할 수 있다. 또, 치환기 Rx 와 Ry 가 양방 할로겐 원자인 경우에는, A-7 공정을 생략할 수 있다.
[화학식 94]
Figure pat00094
B 법 : 콘쥬게이션 전구체 (당사슬 콘쥬게이션)
본 발명의 (2) 로 나타내는 콘쥬게이션 전구체는, 이하에 기재하는 B 법에 따라서 제조할 수 있다.
[화학식 95]
Figure pat00095
본 제조법은, L1 의 임의의 위치에 -NH2 가 치환되어 있는 경우의 콘쥬게이션 전구체 (2) 를 제조하기 위한 방법이다.
[화학식 96]
Figure pat00096
(B-1 공정)
본 공정은, 식 (1b) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 보호기를 제거함으로써, 식 (2b) 의 화합물을 제조하는 공정이다.
PRO5 가 tert-부틸옥시카르보닐기인 경우, 화합물 (1b) 를 용매 (디클로로메탄, 디옥산, 아세토니트릴, 아세트산에틸, 테트라하이드로푸란, 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -10 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 15 ℃ 부터 35 ℃ 까지에 있어서, 트리플루오로아세트산으로 처리함으로써 보호기를 제거하였다. 트리플루오로아세트산은, 화합물 (1b) 1 몰에 대하여 과잉 몰, 바람직하게는 20 몰 내지 50 몰 사용하였다. 반응 시간은 5 분간 내지 24 시간, 바람직하게는 30 분간 내지 6 시간이다. 반응액을 감압하에서 농축한 후, 톨루엔에 현탁시켜 재차 감압하에서 농축하였다. 이 조작을 2 회 내지 5 회 반복하였다. 용매 (디에틸에테르, 디이소프로필에테르, 헥산, 디클로로메탄, 아세트산에틸 또는 그들의 혼합 용매) 를 첨가하여 슬러리상으로 한 후, 고체를 여과 채취하고, 화합물 (2b) 의 미정제체를 얻었다. 화합물 (2b) 의 미정제체는, 이 이상의 정제를 하지 않고 다음의 공정으로 진행하였다.
(B-2 공정)
본 공정은, 식 (2b) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 식 (3b) 의 화합물과의 아미드화를 실시함으로써, 식 (4b) 의 화합물을 제조하는 공정이다.
화합물 (2b) 를 용매 (N,N-디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, N,N-디메틸아세트아미드, 아세토니트릴 등) 중에서, 5 ℃ 부터 35 ℃ 까지에 있어서, 염기 (트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민 등) 및 화합물 (3b) 와 반응시킴으로써 아미드화를 실시하였다. 화합물 (2b) 1 몰에 대하여, 염기는 1 몰 내지 5 몰 사용하고, 화합물 (3b) 는 0.5 몰 내지 1.5 몰 사용하였다. 반응 시간은 10 분간 내지 72 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 24 시간이다. 반응액을 유기 용매 (디클로로메탄, 클로로포름, 아세트산에틸, 메탄올 또는 그 혼합 용매) 와 물 또는 산성 수용액 (0.1 에서 1 M 의 염산, 시트르산 수용액 등) 의 2 층에 따르고, 유기 용매로 1 회 내지 5 회 추출하였다. 추출액을 아울러 포화 식염수로 세정 후, 무수 염 (무수 황산나트륨 또는 무수 황산마그네슘) 으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고 여과액을 감압하에서 농축하였다. 또한, 상기 분액 조작을 생략하고, 반응액을 그대로 감압하에서 농축하여 다음의 실리카 겔 칼럼 정제로 진행할 수도 있다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올, 아세트산에틸/메탄올 등] 으로 정제하고, 화합물 (4b) 를 얻었다. 필요에 따라, 얻어진 화합물 (4b) 를 양용매 (아세트산에틸, 아세토니트릴, 디클로로메탄, 메탄올 또는 그들의 혼합 용매) 에 용해한 후, 빈용매 (디에틸에테르, 디이소프로필에테르, 헥산 등) 를 첨가하여 재침전하고, 고체를 여과 채취함으로써 순도를 올릴 수 있다.
(B-3 공정)
본 공정은, 식 (4b) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 에스테르화를 실시함으로써, 식 (5b) 의 화합물을 제조하는 공정이다.
화합물 (4b) 를, 용매 (N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 아세토니트릴 등) 중에서, 5 ℃ 부터 35 ℃ 까지에 있어서, N-하이드록시숙신이미드 및 축합제 (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 등) 과 반응시킴으로써 에스테르화를 실시하였다. N-하이드록시숙신이미드 및 축합제는, 화합물 (4b) 1 몰에 대하여, 각각 1 몰 내지 3 몰 사용하였다. 반응 시간은 30 분간 내지 72 시간, 바람직하게는 2 시간 내지 24 시간이다. 반응액을 유기 용매 (디클로로메탄, 클로로포름, 아세트산에틸 또는 그 혼합 용매) 로 엷게 한 후, 빙수 (氷水) 로 3 회 내지 5 회 세정하였다. 유기층을 무수 염 (무수 황산나트륨 또는 무수 황산마그네슘) 을 사용하여 건조시켰다. 건조제를 여과 제거한 후, 여과액을 감압하에서 농축하여 화합물 (5b) 의 미정제체를 얻었다. 필요에 따라, 얻어진 화합물 (5b) 를 C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [아세토니트릴만] 으로 정제해도 된다. 또, 얻어진 화합물 (5b) 를 양용매 (아세트산에틸, 아세토니트릴, 디클로로메탄 또는 그들의 혼합 용매) 에 용해한 후, 빈용매 (디에틸에테르, 디이소프로필에테르, 헥산 등) 를 첨가하여 재침전하고, 고체를 여과 채취함으로써 순도를 올릴 수 있다.
(B-4 공정)
본 공정은, 식 (5b) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여, 식 (6b) 의 화합물과의 축합 반응을 실시함으로써, 식 (2) 의 화합물을 제조하는 공정이다.
화합물 (6b) 를 용매 중 (N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 아세토니트릴 등) 에서, -10 ℃ 부터 100 ℃ 까지, 바람직하게는 15 ℃ 부터 35 ℃ 까지에 있어서, 염기 (트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민 등) 및 화합물 (5b) 와 반응시킴으로써 축합 반응을 실시하였다. 화합물 (6b) 1 몰에 대하여, 염기는 2 몰 내지 5 몰 사용하고, 화합물 (5b) 는 1 몰 내지 2 몰 사용하였다. 반응 시간은 5 분간 내지 24 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 6 시간이다. 반응액에 벤질아민을 첨가하여 반응 정지 처리를 하였다. 벤질아민은 화합물 (6b) 1 몰에 대하여 4 몰 내지 10 몰 사용하였다. 필요에 따라 반응액을 감압하에서 부분적으로 농축하고, 잔류한 용액을 분취 HPLC [완충액/아세토니트릴, 완충액/메탄올 등], C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [완충액/아세토니트릴, 완충액/메탄올 등] 또는 그것들을 조합함으로써 정제하고, 화합물 (2) 를 얻었다.
B' 법 : 콘쥬게이션 전구체 (시스테인 콘쥬게이션)
B' 법
본 발명의 (2') 로 나타내는 콘쥬게이션 전구체는, 이하에 기재하는 B' 법에 따라서 제조할 수 있다.
[화학식 97]
Figure pat00097
본 제조법은, L1 의 임의의 위치에 -NH2 가 치환되어 있는 경우의 콘쥬게이션 전구체 (2') 를 제조하기 위한 방법이다.
[화학식 98]
Figure pat00098
(B-5 공정)
본 공정은, 식 (2b') 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 식 (7b) 의 화합물과의 아미드화를 실시함으로써, 식 (8b) 의 화합물을 제조하는 공정이다. 염기를 사용하지 않는 것 이외는, B 법 B-2 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (8b) 를 얻었다.
(B-6 공정)
본 공정은, 식 (8b) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 보호기를 제거함으로써 식 (9b) 의 화합물을 제조하는 공정이다. PRO6 이 tert-부틸기인 경우, 정제 조작에 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 을 사용하는 것 이외는, B 법 B-1 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (9b) 를 얻었다
(B-7 공정)
본 공정은, 식 (9b) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 에스테르화를 실시함으로써, 식 (10b) 의 화합물을 제조하는 공정이다. B 법 B-3 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (10b) 를 얻었다.
(B-8 공정)
본 공정은, 식 (6b) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여, 식 (10b) 의 화합물과의 축합 반응을 실시함으로써, 식 (2') 의 화합물을 제조하는 공정이다. B 법 B-4 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (2') 를 얻었다.
C 법
본 발명의 (3) 으로 나타내는 콘쥬게이션 전구체는, 이하에 기재하는 C 법에 따라서 제조할 수 있다.
[화학식 99]
Figure pat00099
본 제조법은, L1 의 임의의 위치에 하이드록시기가 치환되어 있는 경우의 콘쥬게이션 전구체 (3) 을 제조하기 위한 방법이다.
[화학식 100]
Figure pat00100
(C-1 공정)
본 공정은, 식 (1c) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 식 (2c) 의 화합물과의 아미드화를 실시함으로써, 식 (3c) 의 화합물을 제조하는 공정이다. B 법 B-2 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (3c) 를 얻었다.
(C-2 공정)
본 공정은, 식 (3c) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 에스테르화를 실시함으로써, 식 (4c) 의 화합물을 제조하는 공정이다. B 법 B-3 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (4c) 를 얻었다.
(C-3 공정)
본 공정은, 식 (5c) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 식 (6c) 의 화합물과의 커플링 반응 (아미노메틸렌화) 과 얻어진 커플링체의 탈보호를 연속해서 실시함으로써, 식 (7c) 의 화합물을 제조하는 공정이다.
PRO9 가 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기인 경우, 화합물 (5c) 를, 테트라하이드로푸란 중에서, 5 ℃ 부터 35 ℃ 까지에 있어서, 화합물 (6c) 및 산 (p-톨루엔술폰산 등) 과 반응시킴으로써 아미노메틸렌화를 실시하였다. 화합물 (5c) 1 몰에 대하여, 화합물 (6c) 는 1 몰 내지 20 몰, 바람직하게는 2 몰 내지 10 몰 사용하고, 산은 0.05 몰 내지 과잉 몰, 바람직하게는 0.1 몰 내지 3 몰 사용하였다. 반응 시간은 30 분간 내지 72 시간, 바람직하게는 2 시간 내지 24 시간이다. 이어서, 반응액에 염기 (1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 등) 를 첨가하고, 탈보호를 실시하였다. 반응액이 현탁해 있는 경우에는, 필요에 따라 용매 (N,N-디메틸포름아미드 등) 를 추가하여 용해시킨 후에 반응시킬 수 있다. 염기는 화합물 (5c) 1 몰에 대하여 과잉 몰, 바람직하게는 5 몰 내지 20 몰 사용하였다. 반응 시간은 10 분간 내지 24 시간, 바람직하게는 2 시간 내지 12 시간이다. 반응액에 물을 첨가하여 그대로 C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [완충액/아세토니트릴 등] 으로 정제하고, 화합물 (7c) 를 얻었다.
(C-4 공정)
본 공정은, 식 (7c) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 보호기를 제거하고, 식 (8c) 의 화합물을 제조하는 공정이다. PRO7 및 PRO8 이 tert-부틸디메틸실릴기인 경우, A 법 A-7 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (8c) 를 얻었다.
(C-5 공정)
본 공정은, 식 (8c) 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여, 식 (4c) 의 화합물과의 축합 반응을 실시함으로써, 식 (3) 의 화합물을 제조하는 공정이다. B 법 B-4 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (3) 을 얻었다.
C' 법
본 발명의 (3') 로 나타내는 콘쥬게이션 전구체는, 이하에 기재하는 C' 법에 따라서 제조할 수 있다.
[화학식 101]
Figure pat00101
본 제조법은, L1 의 임의의 위치에 하이드록시기가 치환되어 있는 경우의 콘쥬게이션 전구체 (3') 를 제조하기 위한 방법이다.
[화학식 102]
Figure pat00102
(C'-1 공정)
본 공정은, 식 (1c') 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 가수분해 반응과 시아노에틸기의 제거를 연속해서 실시함으로써, 식 (2c') 의 화합물을 제조하는 공정이다. A 법 A-1 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (2c') 를 얻었다.
(C'-2 공정)
본 공정은, 식 (2c') 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 하이드록시기의 보호기를 제거하고, 식 (3c') 의 화합물을 제조하는 공정이다. A 법 A-2 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (3c') 를 얻었다.
(C'-3 공정)
본 공정은, 식 (3c') 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 식 (4c') 의 화합물과의 커플링 반응 및 얻어진 커플링체의 황화 반응 또는 산화 반응을 연속해서 실시함으로써, 식 (5c') 의 화합물을 제조하는 공정이다. A 법 A-3 공정 또는 A'' 법 A''-3 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (5c') 를 얻었다.
(C'-4 공정)
본 공정은, 식 (5c') 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 하이드록시기의 보호기를 제거하고, 식 (6c') 의 화합물을 제조하는 공정이다. A 법 A-4 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (6c') 를 얻었다.
(C'-5 공정)
본 공정은, 식 (6c') 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 고리화 반응과 황화 반응 또는 산화 반응을 연속해서 실시하고, 식 (7c') 의 화합물을 제조하는 공정이다. A 법 A-5 공정 또는 A' 법 A'-5 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (7c') 를 얻었다.
(C'-6 공정)
본 공정은, 식 (7c') 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 시아노에틸기 및 모든 아실계 보호기를 동시에 제거하고, 식 (8c') 의 화합물을 제조하는 공정이다. A 법 A-6 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (8c') 를 얻었다.
(C'-7 공정)
본 공정은, 식 (8c') 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여 모든 실릴계 보호기를 동시에 제거하고, 식 (9c') 의 화합물을 제조하는 공정이다. PRO9 가 2-(트리메틸실릴)에톡시카르보닐기인 경우, 화합물 (8c') 를, 5 ℃ 부터 100 ℃ 까지, 바람직하게는 35 ℃ 부터 60 ℃ 까지에 있어서, 불화테트라부틸암모늄의 테트라하이드로푸란 용액으로 처리함으로써, 2-(트리메틸실릴)에톡시카르보닐기를 제거하였다. 불화테트라부틸암모늄은, 화합물 (8c') 1 몰에 대하여 과잉 몰, 바람직하게는 10 내지 30 몰 사용하였다. 반응 시간은 1 시간 내지 48 시간, 바람직하게는 4 시간 내지 24 시간이다. 반응액에 완충액을 첨가하여 희석 후, 필요에 따라 유기 용매 성분을 감압하에서 증류 제거하였다. 잔류물을 분취 HPLC [완충액/아세토니트릴, 완충액/메탄올 등], C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [완충액/아세토니트릴, 완충액/메탄올 등] 또는 그것들을 조합함으로써 정제하고, 화합물 (9c') 를 얻었다.
(C'-8 공정)
본 공정은, 식 (9c') 의 화합물에 대하여 공지된 유기 화학적 수법을 이용하여, 식 (4c) 의 화합물과의 축합 반응을 실시함으로써, 식 (3') 의 화합물을 제조하는 공정이다. B 법 B-4 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (3') 를 얻었다.
D 법 : 당사슬 리모델링 항체의 제조
당사슬 리모델링 항체는, 예를 들어 WO2018/003983 등에 기재된 방법에 준하여, 다음 식에 나타내는 방법으로 제조할 수 있다.
[화학식 103]
(D-1 공정)
본 공정은, 목적으로 하는 항체에 대하여, 공지된 효소 반응을 이용하여 항체의 아미노산 서열 297 번째의 아스파라긴에 결합하는 N 결합형 당사슬 (N297 결합 당사슬) 의 환원 말단 키토비오스 구조의 GlcNAcβ1 - 4GlcNAc 사이의 글리코시드 결합을 가수분해에 의해 절단하고, 당사슬 절단 항체를 제조하는 공정이다. 목적으로 하는 항체 (1d) (10 ㎎/㎖) 를 완충액 (인산 완충액 등) 중, 0 ℃ 부터 40 ℃ 까지에 있어서, 야생형 EndoS 효소 등의 가수분해 효소를 사용하여 환원 말단의 키토비오스 구조의 GlcNAcβ1 과 4GlcNAc 사이의 글리코시드 결합의 가수분해 반응을 실시하였다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 6 시간이다. 야생형 EndoS 효소는 항체 (1d) 100 ㎎ 에 대하여, 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎, 바람직하게는 0.1 ㎎ 내지 3 ㎎ 을 사용하였다. 반응 종료 후, 어피니티 크로마토그래피 (HiTrap rProtein A FF (5 ㎖) (GE 헬스 케어 제조)) 및/또는 하이드록시 아파타이트 칼럼 (Bio-Scale Mini CHT Type I 카트리지 (5 ㎖) (BIO-RAD 제조)) 으로 정제하고, (Fucα1,6)GlcNAc 항체 (2d) 를 얻었다.
(D-2 공정)
본 공정은, D-1 공정에서 얻어진 (Fucα1,6)GlcNAc 항체 (2d) 에 대하여, 공지된 효소 반응을 이용하여 아지드기를 포함하는 PEG 링커를 갖는 SG 형 또는 MSG (MSG1, MSG2) 형 당사슬 옥사졸린체 (이하, 「아지드 당사슬 옥사졸린체」) 를 결합시켜, 당사슬 리모델링 항체 (3d) 를 제조하는 공정이다.
항체 (2d) 를 완충액 (인산 완충액 등) 중, 0 ℃ 부터 40 ℃ 까지에 있어서, EndoS (D233Q/Q303L) 등의 당전이 효소 존재하, 아지드 당사슬 옥사졸린체와 반응시킴으로써, 당사슬 전이 반응을 실시하였다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 6 시간이다. EndoS 효소 (D233Q/Q303L) 는 항체 100 ㎎ 에 대하여, 1 ㎎ 내지 10 ㎎, 바람직하게는 1 ㎎ 내지 3 ㎎ 을 사용하고, 아지드 당사슬 옥사졸린체는 2 당량 내지 과잉 당량, 바람직하게는 4 당량 내지 20 당량 사용하였다. 반응 종료 후, 어피니티 크로마토그래피 (HiTrap rProtein A FF (5 ㎖) (GE 헬스 케어 제조)) 및 하이드록시 아파타이트 칼럼 (Bio-Scale Mini CHT Type I 카트리지 (5 ㎖) (BIO-RAD 제조)) 으로 정제하고, 당사슬 리모델링 항체 (3d) 를 얻었다.
상기의 당사슬 리모델링 항체의 조제에 있어서, 항체 수용액의 농축, 농도 측정, 그리고 버퍼 교환은, 후술하는 공통 조작 A 내지 C 에 따라서 실시할 수 있다.
또한, SG 형의 아지드 당사슬 옥사졸린체는 WO2018/003983 에 기재된 방법에 준하여 합성하였다. 일례로서 [N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox (WO2018/003983 에 기재된 화합물 1-10) 의 합성 방법을 다음 식에 나타낸다.
[화학식 104]
Figure pat00104
MSG 형의 아지드 당사슬 옥사졸린체도 WO2018/003983 에 기재된 방법에 준하여 합성하였다. 일례로서 [N3-PEG(3)]-MSG1(9)-Ox (WO2018/003983 에 기재된 화합물 1-11) 의 합성 방법을 다음 식에 나타낸다.
[화학식 105]
Figure pat00105
E 법 : 항체와 약물의 콘쥬게이션 (당사슬 콘쥬게이션 1)
[화학식 106]
Figure pat00106
(여기서, 항체 약물 콘쥬게이트 (1e) 의 좌측의 2 개의 아스테리스크 (*) 는 우측의 아스테리스크로 나타내는 약물 링커 부분을 나타낸다.)
본 제조법은, D 법 D-2 공정에서 얻어진 당사슬 리모델링 항체 (3d) 와 B 법 B-4 공정에서 얻어진 콘쥬게이션 전구체 (2) 를 SPAAC (strain-promoted azide-alkyne cycloaddition : J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15046-15047) 반응에 의해 결합시켜, 항체 약물 콘쥬게이트 (1e) 를 제조하는 방법이다.
(E-1 공정)
당사슬 리모델링 항체 (3d) 의 완충 용액 (인산 완충액, 아세트산 완충액, 붕산 완충액 등) 과, 콘쥬게이션 전구체 (2) 를 적당한 용매 (디메틸술폭시드, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 프로필렌글리콜 또는 그들의 혼합 용매) 에 용해시킨 용액을 혼합함으로써, SPAAC 반응을 실시하였다. 콘쥬게이션 전구체 (2) 는, 당사슬 리모델링 항체 (3d) 1 몰에 대하여, 2 몰 내지 과잉 몰, 바람직하게는 4 몰 내지 30 몰이며, 유기 용매의 비율은, 항체의 완충 용액에 대하여 1 ％ 내지 200 ％ (v/v) 가 바람직하다. 반응 온도는 0 ℃ 내지 37 ℃, 바람직하게는 15 ℃ 내지 25 ℃ 이며, 반응 시간은 1 시간 내지 150 시간, 바람직하게는 6 시간 내지 72 시간이다. 반응 용액의 pH 는 5 내지 9 가 바람직하다. 반응 용액을 후술하는 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 항체 약물 콘쥬게이트 (1e) 를 얻었다.
E' 법 : 항체와 약물의 콘쥬게이션 (시스테인 콘쥬게이션)
시스테인 콘쥬게이션을 갖는 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트는, 참고예 1 등에 따라서 조제한 목적으로 하는 항체와 B' 법 B-8 공정에서 얻어진 말레이미드기를 갖는 콘쥬게이션 전구체 (2') 를 사용하여, WO2014/057687 등에 기재된 방법에 준하여 제조할 수 있다.
E'' 법 : 항체와 약물의 콘쥬게이션 (당사슬 콘쥬게이션 2)
E 법에 있어서, 콘쥬게이션 전구체 (2) 를 C' 법 C'-8 공정에서 얻어진 콘쥬게이션 전구체 (3') 로 바꿈으로써, 다음 식에 나타내는 항체 약물 콘쥬게이트 (1e'') 를 얻었다.
[화학식 107]
Figure pat00107
(여기서, 항체 약물 콘쥬게이트 (1e'') 의 좌측의 2 개의 아스테리스크 (*1) 는 우측의 아스테리스크로 나타내는 약물 링커 부분을 나타낸다.)
항체 약물 콘쥬게이트는, 후술하는 공통 조작 D 내지 G 에 의해 버퍼 교환, 정제, 항체 농도의 측정 및 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수의 측정을 실시하고, 항체 약물 콘쥬게이트의 동정 (同定) 을 실시할 수 있다.
공통 조작 A : 항체 수용액의 농축
Amicon (등록상표) Ultra 원심식 필터 디바이스 (50,000 NMWL, Merck Millipore Ltd.) 에 항체 또는 항체 약물 콘쥬게이트 용액을 넣고, 원심기 (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.) 를 사용한 원심 조작 (2000 G 내지 4000 G 로 5 분간 내지 20 분간 원심) 에 의해, 항체 및 항체 약물 콘쥬게이트 용액을 농축하였다.
공통 조작 B : 항체의 농도 측정
UV 측정기 (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific, Inc.) 를 사용하여, 메이커 규정의 방법에 따라서, 항체 농도의 측정을 실시하였다. 그 때에, 항체마다 상이한 280 ㎚ 흡광 계수 (1.3 ㎖㎎-1㎝-1 내지 1.8 ㎖㎎-1㎝-1) 를 사용하였다.
공통 조작 C : 항체의 버퍼 교환
항체 수용액에 완충액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0), 인산 완충액 (pH 6.0) 등) 을 첨가하고, 공통 조작 A 에 기재된 방법에 따라서 농축하였다. 이 조작을 수 회 실시한 후, 공통 조작 B 에 기재된 방법에 따라서 항체 농도를 측정하였다. 이 항체 완충 용액에, 적절히 완충액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0), 인산 완충액 (pH 6.0) 등) 을 첨가하여, 목적으로 하는 농도 (예를 들어, 약 10 ㎎/㎖) 의 항체 완충 용액을 조제하였다.
공통 조작 D : 항체 약물 콘쥬게이트의 정제 (겔 여과 크로마토그래피)
아세트산 완충액 (10 mM Acetate Buffer, 5 ％ Sorbitol, pH 5.5 ; 본 명세서에서는 ABS 라고 칭한다) 또는 그 이외의 적당한 완충액으로 NAP 칼럼 (NAP-5, NAP-10, NAP-25 (GE 헬스 케어 제조)) 을 평형화시켰다. 이 NAP 칼럼에, 항체 약물 콘쥬게이트 반응 용액을 차지하고, 메이커 규정량의 완충액을 자연 유하시켜, 항체 획분을 분취하였다. 이 획분을 재차 NAP 칼럼에 차지하고, 메이커 규정량의 완충액을 자연 유하시켜, 항체 획분을 분취하였다. 이 조작을 합계 2 회 내지 3 회 반복함으로써, 미결합의 약물 링커나 디메틸술폭시드, 프로필렌글리콜을 제외한 항체 약물 콘쥬게이트를 얻었다. 필요에 따라, 공통 조작 A 및 C 에 의해 항체 약물 콘쥬게이트 용액의 농도를 조절하였다.
공통 조작 E : 항체 약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 농도 및 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수의 측정 (UV 법)
항체 약물 콘쥬게이트에 있어서의 결합 약물 농도는, 흡광 광도계 (UV/VIS Spectrometer Lambda 25, PerkinElmer, Inc.) 를 사용하여, 항체 약물 콘쥬게이트 수용액의 280 ㎚ 및 260 ㎚ (260 ㎚ 이외의 파장을 사용하는 경우도 있다) 의 2 파장에 있어서의 흡광도를 측정한 후에, 하기의 계산을 실시함으로써 산출할 수 있다. 어느 파장에 있어서의 전체 흡광도는 계내에 존재하는 모든 흡수 화학종의 흡광도의 합에 동일 (흡광도의 가성성) 하기 때문에, 항체와 약물의 콘쥬게이션 전후에 있어서, 항체 및 약물의 몰 흡광 계수에 변화가 없다고 가정하면, 항체 약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 농도 및 약물 농도는, 하기의 관계식으로 나타낸다.
A280 = AD,280 ＋ AA,280 = εD,280CD ＋εA,280CA 식 (I)
A260 = AD,260 ＋ AA,260 = εD,260CD ＋εA,260CA 식 (II)
여기서, A280 은 280 ㎚ 에 있어서의 항체 약물 콘쥬게이트 수용액의 흡광도를 나타내고, A260 은 260 ㎚ 에 있어서의 항체 약물 콘쥬게이트 수용액의 흡광도를 나타내고, AA,280 은 280 ㎚ 에 있어서의 항체의 흡광도를 나타내고, AA,260 은 260 ㎚ 에 있어서의 항체의 흡광도를 나타내고, AD,280 은 280 ㎚ 에 있어서의 콘쥬게이트 전구체의 흡광도를 나타내고, AD,260 은 260 ㎚ 에 있어서의 콘쥬게이트 전구체의 흡광도를 나타내고, εA,280 은 280 ㎚ 에 있어서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εA,260 은 260 ㎚ 에 있어서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD,280 은 280 ㎚ 에 있어서의 콘쥬게이트 전구체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD,260 은 260 ㎚ 에 있어서의 콘쥬게이트 전구체의 몰 흡광 계수를 나타내고, CA 는 항체 약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 농도를 나타내고, CD 는 항체 약물 콘쥬게이트에 있어서의 약물 농도를 나타낸다. 여기서, εA,280, εA,260, εD,280, εD,260 은, 사전에 준비한 값 (계산 추정값 또는 실측값) 이 사용된다. 예를 들어, εA,280 은, 항체의 아미노산 서열로부터, 이미 알려진 계산 방법 (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423) 에 의해 추정할 수 있다. εA,260 은, 항체의 UV 측정으로부터 얻어진 실측값과 εA,280 의 추정값으로부터 계산한 값을 사용하였다. 실시예에 있어서, 개변 항HER2 항체의 몰 흡광 계수는, εA,280 = 215380 및 εA,260 = 110117 을 사용하였다. 개변 항LPS 항체의 몰 흡광 계수는, εA,280 = 227300 및 εA,260 = 110710 을 사용하였다. εD,280 및 εD,260 은, 사용하는 콘쥬게이트 전구체를 어느 몰 농도로 용해시킨 용액의 흡광도를 측정함으로써, 랩버트·비어의 법칙 (흡광도 = 몰 농도 × 몰 흡광 계수 × 셀 광로 길이) 에 의해, 얻을 수 있다. 실시예에 있어서의 콘쥬게이트 전구체의 몰 흡광 계수는, 그때마다 UV 측정으로 얻었다. 항체 약물 콘쥬게이트 수용액의 A280 및 A260 을 측정하고, 이들 값을 식 (I) 및 (II) 에 대입하여 연립 방정식을 풀음으로써, CA 및 CD 를 구할 수 있다. 또한 CD 를 CA 로 나눔으로써, 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수를 구할 수 있다.
공통 조작 F : 항체 약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 농도 및 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수의 측정 (역상 고속 액체 크로마토그래피법 : RP-HPLC)
항체 약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 농도 및 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수는, 전술한 공통 조작 E 에 더하여, 이하의 방법을 사용하는 고속 액체 크로마토그래피 분석에 의해 구할 수 있다.
[F-1. HPLC 분석용 샘플의 조제 (항체 약물 콘쥬게이트의 환원)]
항체 약물 콘쥬게이트 용액 (약 1 ㎎/㎖, 60 ㎕) 을 디티오트레이톨 (DTT) 수용액 (100 mM, 15 ㎕) 과 혼합하였다. 혼합물을 37 ℃ 에서 30 분간 인큐베이트하여, 항체 약물 콘쥬게이트의 L 사슬 및 H 사슬 사이의 디술파이드 결합을 절단하였다. 이 반응 용액을 그대로 HPLC 분석에 사용하였다.
[F-2. HPLC 분석]
대표적인 분석 조건은 하기하는 바와 같음.
HPLC 시스템 : Agilent 1290 HPLC 시스템 (Agilent Technologies)
검출기 : 자외 흡광도계 (측정 파장 : 280 ㎚)
칼럼 : Acquity BEH Phenyl (2.1 × 50 ㎜, 1.7 ㎛, Waters 제조)
칼럼 온도 : 75 ℃
유속 : 0.8 ㎖/분
샘플 주입량 : 10 ㎕
이동상 A : 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 (TFA), 15 ％ 이소프로필알코올 수용액
이동상 B : 0.075 ％ TFA, 15 ％ 이소프로필알코올아세토니트릴 용액
그래디언트 프로그램 (이동상 B) : 14 ％ - 36 ％ (0 분 - 15 분), 36 ％ - 80 ％ (15 - 17 분), 80 ％ - 14 ％ (17 분 - 17.1 분), 14 ％ - 14 ％ (17.1 분 - 23 분)
[F-3. 데이터 해석]
〔F-3-1〕 약물이 결합하고 있지 않은 항체의 L 사슬 (L0) 및 H 사슬 (H0) 에 대하여, 약물이 결합한 H 사슬 (약물이 1 개 결합한 H 사슬 : H1, 약물이 2 개 결합한 H 사슬 : H2) 은, 결합한 약물의 수에 비례하여 소수성이 증가하여 유지 시간이 커지기 때문에, 원칙적으로 L0, H0, H1, H2 의 순서로 용출된다. L0 및 H0 의 유지 시간을 비교함으로써 검출 피크를 L0, H0, H1, H2 중 어느 것에 할당할 수 있다.
〔F-3-2〕 약물 링커에 UV 흡수가 있기 때문에, 약물 링커의 결합수에 따라, H 사슬 및 약물 링커의 몰 흡광 계수를 사용하여 하기 식에 따라서 피크 면적의 보정을 실시하였다.
Figure pat00108
여기서, 각 항체에 있어서의 L 사슬 및 H 사슬의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 는, 공통 조작 E 에 기재한 이미 알려진 계산 방법으로 산출한 추정값을 사용하였다. 개변 항HER2 항체의 경우, L 사슬의 몰 흡광 계수로서 26213 을, H 사슬의 몰 흡광 계수로서 81478 을 사용하였다. 마찬가지로 개변 항LPS 항체의 경우, L 사슬의 몰 흡광 계수로서 27703 을, H 사슬의 몰 흡광 계수로서 85948 을 사용하였다. 약물 링커의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 는, SPAAC 반응에서의 콘쥬게이션인 경우에는, 콘쥬게이션 전구체의 실측값을 사용하고, 시스테인 콘쥬게이션인 경우에는, 각 콘쥬게이션 전구체를 메르캅토에탄올 또는 N-아세틸시스테인으로 반응시키고, 말레이미드기를 숙신이미드티오에테르로 변환한 화합물의 실측값을 사용하였다.
〔F-3-3〕 피크 면적 보정값 합계에 대한 각 사슬 피크 면적비 (％) 를 하기 식에 따라서 계산하였다.
Figure pat00109
〔F-3-4〕 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (DAR) 를, 하기 식에 따라서 계산하였다.
Figure pat00110
〔F-3-5〕 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 농도를, 하기 식에 따라서 계산하였다.
Figure pat00111
여기서 항체 약물 복합체의 흡광도 (280 ㎚) 는, 항체 약물 콘쥬게이트 수용액의 실측값을 사용하였다. 희석 배수는, 흡광도를 측정할 때에 항체 약물 콘쥬게이트 수용액을 몇 배로 희석했는지를 나타내며, 통상적으로 4 배 희석이다. 항체의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 는, 공통 조작 E 에 기재한 이미 알려진 계산 방법으로 산출한 추정값을 사용하였다. 약물 평균 결합수는〔F-3-4〕 에서 얻어진 값을 사용하였다. 약물 링커의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 는, SPAAC 반응에 의한 콘쥬게이션인 경우에는, 콘쥬게이션 전구체의 실측값을 사용하고, 시스테인 콘쥬게이션인 경우에는, 각 약물 링커를 메르캅토에탄올 또는 N-아세틸시스테인으로 반응시키고, 말레이미드기를 숙신이미드티오에테르로 변환한 화합물의 실측값을 사용하였다.
공통 조작 G : 항체 약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 농도 및 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수의 측정 (소수성 상호 작용 - 고속 액체 크로마토그래피법 : HI - HPLC)
항체 약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 농도 및 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수는, 전술한 공통 조작 E 및 F 에 더하여, 이하의 방법을 사용하는 고속 액체 크로마토그래피 분석에 의해 구할 수 있다.
[G-1. HPLC 분석용 샘플의 조제]
항체 약물 콘쥬게이트 용액 (약 1 ㎎/㎖, 60 ㎕) 을 그대로 HPLC 분석에 사용하였다.
[G-2. HPLC 분석]
대표적인 분석 조건은 하기의 두가지.
HPLC 시스템 : SHIMADZU CBM-20A (시마즈 제작소)
검출기 : 자외 흡광도계 (측정 파장 : 280 ㎚)
칼럼 : TSK-gel Butyl-NPR (4.6 × 100 ㎜, 2.5 ㎛, TOSOH 제조)
칼럼 온도 : 25 ℃ 부근의 일정 온도
이동상 A : 1.5 M 황산암모늄 함유 25 mM 인산 완충액 (pH = 7.0)
이동상 B : 25 mM 인산 완충액 (pH = 7.0)/이소프로필알코올 혼합액 (3 : 1)
유속 : 0.8 ㎖/분
샘플 주입량 : 15 ㎕
그래디언트 프로그램 (이동상 B) : 10 ％ - 15 ％ (0 분 - 5 분), 15 ％ - 65 ％ (5 분 - 20 분)
또는
HPLC 시스템 : SHIMADZU CBM-20A (시마즈 제작소)
검출기 : 자외 흡광도계 (측정 파장 : 280 ㎚)
칼럼 : PolyPROPYL A (4.6 × 100 ㎜, 3 ㎛, 1500 Å, PolyLC 제조)
칼럼 온도 : 40 ℃ 부근의 일정 온도
이동상 A : 1.5 M 황산암모늄 함유 20 mM 인산 완충액 (pH = 7.4)
이동상 B : 20 mM 인산 완충액 (pH = 7.4)
유속 : 0.8 ㎖/분
샘플 주입량 : 15 ㎕
그래디언트 프로그램 (이동상 B) : 40 ％ - 80 ％ (0 분 - 20 분)
[G-3. 데이터 해석]
〔G-3-1〕 항체에 결합한 약물의 수에 비례하여 소수성이 증가하여 유지 시간이 커지기 때문에, SPAAC 반응에 의한 콘쥬게이션인 경우에는, 원칙적으로 DAR = 0, DAR = 2, DAR = 4 의 순서로 용출된다. DAR = 0 과의 유지 시간을 비교함으로써, 검출 피크를 DAR = 2 및 DAR = 4 중 어느 하나에 할당할 수 있다. 항체나 약물 링커의 종류에 의존하여 DAR = 1 및 DAR = 3 의 피크가 검출되는 경우도 있다. 검출 피크의 DAR 은, HI-HPLC 로 당해 피크를 분획 후, 매스 스펙트럼을 측정하여 추정하는 경우도 있다.
〔G-3-2〕 약물 링커에 UV 흡수가 있기 때문에, 약물 링커의 결합수에 따라, 항체 및 약물 링커의 몰 흡광 계수를 사용하여 하기 식에 따라서 피크 면적값의 보정을 실시하였다.
Figure pat00112
여기서, 항체의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 는, 공통 조작 E 에 기재한 이미 알려진 계산 방법으로 산출한 추정값을 사용하였다. 약물 링커의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 는, 콘쥬게이션 전구체의 실측값을 사용하였다.
〔G-3-3〕 피크 면적 보정값 합계에 대한 항체 피크 면적비 (％) 를 하기 식에 따라서 계산하였다.
Figure pat00113
〔G-3-4〕 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수를, 하기 식에 따라서 계산하였다.
Figure pat00114
〔G-3-5〕 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 농도는,〔F-3-5〕 에 기재된 식에 따라서 계산하였다. 그 때, 약물 평균 결합수는〔G-3-4〕 에서 얻어진 값을 사용하였다.
본 발명의 신규 CDN 유도체, 항체 약물 콘쥬게이트 또는 그들 제조 중간체에는, 입체 이성체 혹은 부제 탄소 원자에서 유래하는 광학 이성체, 기하 이성체, 호변 이성체 또는 d 체, l 체, 아트로프 이성체 등의 광학 이성체가 존재하는 경우도 있지만, 이들 이성체, 광학 이성체 및 이들 혼합물 모두 본 발명에 포함된다.
본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 있어서, 항체 1 분자에 대한 약물의 결합수는, 그 유효성, 안전성에 영향을 미치는 중요 인자이다. 항체 약물 콘쥬게이트의 제조는, 약물의 결합수가 일정한 수가 되도록, 반응시키는 원료·시약의 사용량 등의 반응 조건을 규정하여 실시되지만, 저분자 화합물의 화학 반응과는 달리, 상이한 수의 약물이 결합한 혼합물로서 얻어지는 것이 통상적이다. 항체 1 분자에 대한 약물의 결합수는 평균값, 즉, 평균 약물 결합수 (DAR) 로서 특정할 수 있다. 항체 분자에 대한 고리형 디뉴클레오티드 유도체의 결합수는 컨트롤 가능하고, 1 항체당의 약물 평균 결합수로서, 1 내지 10 의 범위의 고리형 디뉴클레오티드 유도체를 결합시킬 수 있지만, 바람직하게는 1 내지 8 개이며, 보다 바람직하게는 1 내지 5 개이다.
본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트에 있어서, 항체 Ab 가, 항체 Ab 의 리모델링 된 당사슬로부터 L 에 결합하고 있는 경우, 항체 약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 약물 결합수 m2 는 1 또는 2 의 정수이다. 당해 당사슬이 N297 당사슬이고, 당사슬이 N297-(Fuc)SG 인 경우, m2 는 2 이고, DAR 은 3 ∼ 5 의 범위 (바람직하게는, 3.2 ∼ 4.8 의 범위이며, 보다 바람직하게는, 3.5 ∼ 4.2 의 범위) 이다. N297 당사슬이 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 또는 N297-(Fuc)MSG1 과 N297-(Fuc)MSG2 의 혼합물인 경우, m2 는 1 이고, DAR 은 1 ∼ 3 의 범위 (바람직하게는, 1.0 ∼ 2.5 의 범위, 보다 바람직하게는, 1.2 ∼ 2.2 의 범위) 이다.
또한, 당업자이면 본원의 실시예의 기재로부터 항체에 필요한 수의 약물을 결합시키는 반응을 설계할 수 있고, 고리형 디뉴클레오티드 유도체의 결합수를 컨트롤 한 항체를 취득할 수 있다.
또한, 본 발명의 CDN 유도체, 항체 약물 콘쥬게이트, 그들의 제조 중간체는, 대기 중에 방치하거나, 또는 재결정함으로써, 수분을 흡수하여, 흡착수가 묻거나, 수화물이 되는 경우가 있으며, 그와 같은 물을 포함하는 화합물 및 염도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 CDN 유도체, 항체 약물 콘쥬게이트, 그들의 제조 중간체가, 아미노기 등의 염기성 기를 갖는 경우, 원하는 바에 따라 의약적으로 허용되는 염으로 할 수 있다. 그러한 염으로는, 예를 들어 염산염, 요오드화수소산염 등의 할로겐 화수소산염 ; 질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염 ; 메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염 등의 저급 알칸술폰산염 ; 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염 등의 아릴술폰산염 ; 포름산, 아세트산, 말산, 푸마르산염, 숙신산염, 시트르산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염 ; 및 오르니틴산염, 글루타민산염, 아스파르트산염 등의 아미노산염을 들 수 있다.
본 발명의 CDN 유도체 또는 항체 약물 콘쥬게이트는, 인산기 및/또는 티오 인산기를 그 구조에 포함하기 때문에, 일반적으로 염기 부가 염을 형성하는 것이 가능하다. 또, 그들의 제조 중간체가, 카르복시기 등의 산성기를 갖는 경우에도, 일반적으로 염기 부가 염을 형성하는 것이 가능하다. 의약적으로 허용되는 염으로는, 예를 들어, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염 등의 알칼리 금속염 ; 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토금속염 ; 암모늄염 등의 무기염 ; 디벤질아민염, 모르폴린염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 시클로헥실아민염, 디시클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 디에탄올아민염, N-벤질-N-(2-페닐에톡시)아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄염 등의 유기 아민염, 등을 들 수 있다.
본 발명의 CDN 유도체, 항체 약물 콘쥬게이트, 그들의 제조 중간체는, 공기중의 수분을 흡수하는 것 등에 의해 수화물로서 존재하는 경우도 있다. 본 발명의 용매화물로는, 의약적으로 허용할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로는, 수화물, 에탄올화물, 2-프로판올화물 등이 바람직하다. 또, 본 발명의 CDN 유도체, 항체 약물 콘쥬게이트, 그들의 제조 중간체 중에 질소 원자가 존재하는 경우에는 N-옥사이드체로 되어 있어도 되고, 이들 용매화물 및 N-옥사이드체도 본 발명의 범위에 포함된다. 또, 본 발명의 CDN 유도체, 항체 약물 콘쥬게이트, 그들의 제조 중간체 중에 황 원자가 존재하는 경우에는 술폭시드체로 되어 있어도 되며, 이들 용매화물 및 술폭시드체도 본 발명의 범위에 포함된다.
또, 본 발명에는, 각종 방사성 또는 비방사성 동위체로 라벨된 화합물도 포함된다. 본 발명의 CDN 유도체, 항체 약물 콘쥬게이트, 그들의 제조 중간체를 구성하는 원자의 1 이상에, 원자 동위체의 비천연 비율도 함유할 수 있다. 원자 동위체로는, 예를 들어, 중수소 (2H), 트리튬 (3H), 요오드-125 (125I) 또는 탄소-14 (14C) 등을 들 수 있다. 또, 본 발명 화합물은, 예를 들어, 트리튬 (3H), 요오드-125 (125I) 또는 탄소-14 (14C) 와 같은 방사성 동위체로 방사성 표지될 수 있다. 방사성 표지된 화합물은, 치료 또는 예방제, 연구 시약, 예를 들어, 어세이 시약, 및 진단제, 예를 들어, 인비보 화상 진단제로서 유용하다. 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트의 모든 동위체 변이종은, 방사성 유무를 묻지 않고, 본 발명의 범위에 포함된다.
＜4. 의약＞
본 발명의 CDN 유도체 또는 항체 약물 콘쥬게이트는, 암세포에 대하여 항종양 면역 활성 또는 세포 상해 활성을 나타내기 때문에, 의약으로서, 특히 암에 대한 치료제 및/또는 예방제, 또는 항종양제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 CDN 유도체 또는 항체 약물 콘쥬게이트가 적용되는 암의 종류로는, 폐암 (비소세포 폐암, 소세포 폐암 등), 신장암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 다형 신경교아종, 난소암 (표층 상피성 종양, 간질성 종양, 배세포 종양 등), 췌암, 유방암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 자궁체암, 정소암 (세미노마, 비세미노마), 자궁경암, 태반 융모암, 다형 신경교아종, 뇌종양, 두경부암, 갑상선암, 중피종, 소화관 간질 종양 (Gastrointestinal Stromal Tumor, GIST), 담낭암, 담관암, 부신암, 유극세포암, 백혈병, 악성 림프종, 형질 세포종, 골수종, 육종 등을 들 수 있지만, 항체 약물 콘쥬게이트에 대해서는, 치료 대상이 되는 암세포에 있어서 항체 약물 콘쥬게이트 중의 항체를 인식할 수 있는 단백질을 발현하고 있는 암세포이면 이들에는 한정되지 않는다.
본 발명의 CDN 유도체 또는 항체 약물 콘쥬게이트는, 포유 동물에 대하여 적합하게 투여할 수 있지만, 보다 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 CDN 유도체 또는 항체 약물 콘쥬게이트가 포함되는 의약 조성물에 있어서 사용되는 물질로는, 투여량이나 투여 농도에 있어서, 이 분야에 있어서 통상적으로 사용되는 제제 첨가물 그 외로부터 적절히 선택하여 적용할 수 있다.
본 발명의 CDN 유도체 또는 항체 약물 콘쥬게이트는, 1 종 이상의 약학적으로 적합성의 성분을 포함하는 의약 조성물로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 의약 조성물은, 대표적으로는, 1 종 이상의 약학적 캐리어 (예를 들어, 멸균한 액체 (예를 들어, 물 및 기름 (석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 기름 (예를 들어, 낙화생유, 대두유, 광유, 참기름 등)) 을 포함한다)) 를 포함한다. 물은, 상기 의약 조성물이 정맥내 투여되는 경우에, 보다 대표적인 캐리어이다. 식염수 용액, 그리고 덱스트로스 수용액 및 글리세롤 수용액도 또한, 액체 캐리어로서, 특히, 주사용 용액을 위해서 사용될 수 있다. 적절한 약학적 부형제는, 당해 분야에서 공지이다. 상기 조성물은 또한, 원한다면, 미량의 습윤제 혹은 유화제, 또는 pH 완충화제를 포함할 수 있다. 적절한 약학적 캐리어의 예는, E. W. Martin 에 의한 「Remington's Pharmaceutical Sciences」 에 기재된다. 그 처방은, 투여의 양태에 대응한다.
여러 가지 송달 시스템이 공지이며, 본 발명의 CDN 유도체 또는 항체 약물 콘쥬게이트를 투여하기 위해서 사용될 수 있다. 도입 방법으로는, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 및 피하의 경로를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 투여는, 예를 들어, 주입 또는 볼러스 주사에 의한 것일 수 있다. 특정한 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 CDN 유도체 또는 항체 약물 콘쥬게이트의 투여는, 주입에 의한 것이다. 비경구적 투여는, 바람직한 투여 경로이다.
대표적 실시형태에 있어서, 상기 항체 약물 콘쥬게이트를 포함하는 의약 조성물은, 인간에 대한 정맥내 투여에 적합한 의약 조성물로서, 상습적 순서에 따라서 처방된다. 대표적으로는, 정맥내 투여를 위한 조성물은, 멸균 등장성의 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 상기 의약은 또한, 가용화제 및 주사 부위에서의 동통을 완화시키기 위한 국소 마취제 (예를 들어, 리그노카인) 를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분은, 예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰 등의 밀봉하여 시일된 용기 중의 건조 동결 건조 분말 또는 무수의 농축물로서, 별개로, 또는 단위 제형 중에서 함께 혼합하여, 중 어느 것으로 공급된다. 상기 의약 조성물이 주입에 의해 투여될 예정인 경우, 그것은, 예를 들어, 멸균의 제약 그레이드의 물 또는 식염수를 포함하는 주입 보틀로 투약될 수 있다. 상기 의약이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플은, 예를 들어, 상기 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록, 제공될 수 있다. 상기 의약 조성물은, 용액으로서 제공되는 경우도 있다.
본 발명의 의약 조성물에는 본원의 CDN 유도체 또는 항체 약물 콘쥬게이트만을 포함하는 의약 조성물이어도 되고, CDN 유도체 또는 항체 약물 콘쥬게이트 및 적어도 하나의 이것 이외의 암 치료제를 포함하는 의약 조성물이어도 된다. 본 발명의 CDN 유도체 또는 항체 약물 콘쥬게이트는, 다른 암 치료제와 함께 투여할 수도 있으며, 이에 따라 항암 효과를 증강시킬 수 있다. 이와 같은 목적으로 사용되는 다른 항암제는, CDN 유도체 또는 항체 약물 콘쥬게이트와 동시에, 따로 따로, 혹은 연속해서 개체에 투여되어도 되고, 각각의 투여 간격을 바꾸어 투여해도 된다. 이와 같은 암 치료제로서, abraxane, carboplatin, cisplatin, gemcitabine, irinotecan (CPT-11), paclitaxel, pemetrexed, sorafenib, vinblastin 또는 국제 공개 제WO2003/038043호 팜플렛에 기재된 약제, 또한 LH-RH 아날로그 (류프로렐린, 고세렐린 등), 에스트라무스틴·포스페이트, 에스트로겐 길항약 (타목시펜, 라록시펜 등), 아로마타제 저해제 (아나스트로졸, 레트로졸, 엑세메스탄 등), 면역 체크 포인트 저해약 (니보르맙, 이필리뮤맙 등) 등을 들 수 있지만, 항종양 활성을 갖는 약제이면 한정되지는 않는다.
이와 같은 의약 조성물은, 선택된 조성과 필요한 순도를 갖는 제제로서, 동결 건조 제제 혹은 액상 제제로서 제제화하면 된다. 동결 건조 제제로서 제제화할 때, 이 분야에 있어서 사용되는 적당한 제제 첨가물이 포함되는 제제여도 된다. 또 액제에 있어서도 동일하게 하여, 이 분야에 있어서 사용되는 각종 제제 첨가물을 포함하는 액상 제제로서 제제화할 수 있다.
의약 조성물의 조성 및 농도는 투여 방법에 따라서도 변화하지만, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항체 약물 콘쥬게이트는, 항체 약물 콘쥬게이트의 항원에 대한 친화성, 즉, 항원에 대한 해리 정수 (定數) (Kd 값) 의 점에 있어서, 친화성이 높을 (Kd 값이 낮을) 수록, 소량의 투여량이더라도 약효를 발휘시킬 수 있다. 따라서, 항체 약물 콘쥬게이트의 투여량의 결정에 있어서는, 항체 약물 콘쥬게이트와 항원의 친화성의 상황에 기초하여 투여량을 설정할 수도 있다. 본 발명의 CDN 유도체 또는 항체 약물 콘쥬게이트를 인간에 대하여 투여할 때에는, 예를 들어, 약 0.001 ∼ 100 ㎎/㎏ 을 1 회 혹은 1 ∼ 180 일간에 1 회의 간격으로 복수 회 투여하면 된다.
이하 본 발명을 실시예에서 설명하지만 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예
이하의 실시예에 있어서, 실온은 15 ℃ 내지 35 ℃ 를 나타낸다. 탈수 아세토니트릴은, 칸토 화학에서 판매되고 있는 아세토니트릴 (탈수) -Super- 또는 와코 쥰야쿠 공업에서 판매되고 있는 아세토니트릴 (초탈수) 을 사용하였다. 피리딘은, 칸토 화학에서 판매되고 있는 피리딘 (탈수) -Super- 를 사용하였다. 실리카 겔 크로마토그래피는, Biotage SNAP Ultra (Biotage 제조), Chromatorex Q-Pack SI (후지 실리시아 제조) 또는 Purif-Pack-Ex SI (쇼코 사이언스 제조) 를 사용하여 실시하였다. DIOL 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피는, Chromatorex Q-pack DIOL (후지 실리시아 제조) 을 사용하여 실시하였다. C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피는, Biotage SNAP Ultra C18 (Biotage 제조) 을 사용하여 실시하였다. 아미노 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피는, Biotage SNAP Isolute NH2 (Biotage 제조) 를 사용하여 실시하였다. 분취 HPLC 는, SHIMADZU SPD-M10A HPLC 시스템 (시마즈 제작소) 등을 사용하여 실시하였다. 분취 칼럼은, Kinetex (5 ㎛, C18, 100 Å, 250 × 30.0 ㎜, Phenomenex 제조) 또는 Kinetex (5 ㎛, C18, 100 Å, 250 × 21.2 ㎜, Phenomenex 제조) 를 사용하였다.
각종 스펙트럼 데이터의 측정에는 이하의 기기를 사용하였다. 1H-NMR 스펙트럼은, JEOL ECS-400 (400 ㎒), Varian 400-MR (400 ㎒) 또는 Varian Unity Inova 500 (500 ㎒) 을 사용하여 측정하였다. 31P-NMR 스펙트럼은, JEOL ECS-400 (160 ㎒) 을 사용하여 측정하였다. 매스 스펙트럼은, Agilent 6130 Quadrupole LC/MS 시스템 (Agilent Technologies) 을 사용하여 측정하였다. LC/MS 의 측정은, 이하의 조건으로 실시한 [칼럼 : Develosil Combi-RP, 5 ㎛, 50 × 2.0 ㎜ (노무라 화학 제조), 이동상 : 0.1 ％ 포름산아세토니트릴 용액/0.1 ％ 포름산 수용액, 0.1 ％ 포름산아세토니트릴 용액 : 2 ％ - 100 ％ (0 분 - 5 분 또는 0 분 -10 분)].
실시예 1 : CDN1 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 108]
Figure pat00115
[합성 스킴]
[화학식 109]
Figure pat00116
(공정 1)
7-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-5-요오드-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
이미 알려진 문헌 (Tetrahedron 2007, 63, 9850-9861) 의 5-요오드투베르시딘 (1.0 g) 의 N,N-디메틸포름아미드 (10 ㎖) 용액에, 0 ℃ 에서 디-tert-부틸실릴비스(트리플루오로메탄술포네이트) (1.24 ㎖) 를 천천히 적하한 후, 동 (同) 온도에서 30 분간 교반하였다. 이미다졸 (868 ㎎) 을 0 ℃ 에서 첨가한 후, 실온까지 승온하여 30 분간 교반하였다. 실온에서 tert-부틸디메틸클로로실란을 첨가하고, 동 온도에서 밤새 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (910 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00117
(공정 2)
7-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-5-(3,3-디에톡시프로파-1-인-1-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (910 ㎎) 의 N,N-디메틸포름아미드 (3.0 ㎖) - 테트라하이드로푸란 (9.0 ㎖) 혼합 용액에 프로파르길알데히드디메틸아세탈 (1.01 ㎖), 트리에틸아민 (0.392 ㎖), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (163 ㎎), 및 요오드화구리(I) (53.6 ㎎) 을 차례로 첨가하고, 40 ℃ 에서 18 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액과 아세트산에틸을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (878 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00118
(공정 3)
2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (878 ㎎) 의 에탄올 (8.8 ㎖) 용액에 10 ％ 팔라듐탄소 (M) wet (500 ㎎) 를 첨가하고, 수소 분위기하, 실온에서 9 시간 교반하였다. 촉매를 여과 제거한 후, 디클로로메탄으로 세정하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물의 아세트산 (8.8 ㎖) 용액에 10 ％ 팔라듐탄소 (M) wet (500 ㎎) 를 첨가하고, 수소 분위기하, 40 ℃ 에서 2 일간 교반하였다. 촉매를 여과 제거한 후, 디클로로메탄으로 세정하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (603 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00119
(공정 4)
6-벤조일-2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (2.17 g) 의 디클로로메탄 (21.7 ㎖) 용액에 실온에서, 피리딘 (1.56 ㎖), N,N-디메틸아미노피리딘 (94.5 ㎎), 및 염화벤조일 (0.898 ㎖) 을 차례로 첨가하고, 50 ℃ 에서 15 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 디클로로메탄으로 추출 후, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (1.91 g) 을 얻었다.
Figure pat00120
(공정 5)
6-벤조일-2-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.91 g) 의 디클로로메탄 (15 ㎖) 용액에, 0 ℃ 에서 조제한 불화수소-피리딘 (0.30 ㎖) 과 피리딘 (1.88 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 0 ℃ 에서 2 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응액을 디클로로메탄으로 추출한 후, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 피리딘 (15 ㎖) 에 용해하고, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (1.17 g) 를 첨가하고, 0 ℃ 에서 12 시간 교반하였다. 메탄올을 첨가하고 30 분간 교반한 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응액을 디클로로메탄으로 추출한 후, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (1.98 g) 을 얻었다.
Figure pat00121
(공정 6)
6-벤조일-2-(5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-β-D-리보퓨라노실)-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (1.98 g) 의 디클로로메탄 (23.9 ㎖) 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (1.02 ㎖) 과 2-시아노에틸N,N-디이소프로필클로로포스포로아미다이트 (1.07 ㎖) 를 첨가하고, 실온에서 15 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응액을 디클로로메탄으로 추출 후, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (2.06 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 7 : 3) 로서 얻었다.
Figure pat00122
(공정 7)
6-벤조일-2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (1.37 g) 의 아세토니트릴 (6.67 ㎖) 용액에 물 (48 ㎕) 과 트리플루오로아세트산피리딘염 (335 ㎎) 을 첨가하고, 실온에서 15 분간 교반하였다. 반응액에 tert-부틸아민 (6.67 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 15 분간 교반하였다. 반응액을 감압 농축한 후, 잔류물을 아세토니트릴 (5 ㎖) 로 2 회 공비하였다. 잔류물의 디클로로메탄 (16.7 ㎖) 용액에 물 (0.240 ㎖) 을 첨가한 후, 디클로로아세트산 (0.953 ㎖) 의 디클로로메탄 (16.7 ㎖) 용액을 첨가하고, 실온에서 15 분간 교반하였다. 피리딘 (1.82 ㎖) 을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 반응액을 감압 농축하였다. 잔류물을 탈수 아세토니트릴 (10 ㎖) 로 3 회 공비하고, 마지막 1 회는 5 ㎖ 정도의 아세토니트릴을 남겼다. 얻어진 표제 화합물의 아세토니트릴 용액을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 8)
시판 (ChemGenes) 되는 N-벤조일-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}아데노신 (1.31 g) 을 탈수 아세토니트릴 (10 ㎖) 로 3 회 공비하고, 마지막 1 회는 5 ㎖ 정도의 아세토니트릴을 남기고, 몰레큘러 시브스 3A, 1/16 (펠릿상의 것 5 립 (粒)) 을 첨가하였다. 상기 공정 7 에서 합성한 용액에, 상기 서술한 아세토니트릴 용액을 첨가하고, 질소 분위기하, 실온에서 20 분간 교반하였다. 반응액에 N,N-디메틸-N'-(3-술파닐리덴-3H-1,2,4-디티아졸-5-일)메탄이미드아미드 (300 ㎎) 를 첨가하고, 실온에서 30 분간 교반한 후, 반응액을 감압 농축하였다. 잔류물의 디클로로메탄 (19.0 ㎖) 용액에 물 (0.240 ㎖) 을 첨가한 후, 디클로로아세트산 (1.20 ㎖) 의 디클로로메탄 (19.0 ㎖) 용액을 첨가하고, 실온에서 15 분간 교반하였다. 반응액에 피리딘 (13.2 ㎖) 을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 감압 농축하였다. 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 9)
N-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-6-일}벤즈아미드
상기 공정 8 에서 얻어진 미정제 생성물의 피리딘 (39.6 ㎖) 용액을 25 ㎖ 정도까지 농축한 후, 2-클로로-5,5-디메틸-1,3,2λ5-디옥사포스피난-2-온 (908 ㎎) 을 첨가하고, 실온에서 30 분간 교반하였다. 반응액에 물 (0.84 ㎖) 과 3H-1,2-벤조디티올-3-온 (336 ㎎) 을 첨가하고, 실온에서 15 분간 교반하였다. 반응액을 탄산수소나트륨 (5.25 g) 의 수용액 (180 ㎖) 에 따르고, 실온에서 30 분간 교반한 후, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후, 건조제를 여과 제거하고 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (507 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1219(M＋H)＋.
(공정 10)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (507 ㎎) 의 메탄올 (5 ㎖) 용액에 28 ％ 암모니아수 (5 ㎖) 를 첨가하고, 실온에서 14 시간 교반하였다. 반응액을 농축 후, 잔류물을 C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물 (301 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 958(M＋H)＋.
(공정 11)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (301 ㎎) 에 트리에틸아민3불화수소산염 (3.84 ㎖) 을 첨가하고, 45 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 실온하, 반응액에 빙랭한 1 M 탄산수소트리에틸암모늄 수용액 (20 ㎖) 과 트리에틸아민 (4 ㎖) 의 혼합액을 첨가하였다. 반응액을 감압 농축 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 과 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 0 ％ - 25 ％ (0 분 - 40 분)] 로 정제하고, 인 원자 상의 디아스테레오머를 분리하였다. 얻어진 화합물 (트리에틸아민염) 을 이하의 수법으로 나트륨염으로 변환하였다.
[나트륨염으로의 변환]
BT AG (등록상표) 50W-X2 Resin (biotechnology grade, 100-200 mesh, hydrogen form) (500 ㎎) 을 순수에 현탁하고, 빈 칼럼에 충전하였다. 과잉의 순수를 자연 유하시킨 후, 1 M 수산화나트륨 수용액 (5 ㎖) 과 순수 (10 ㎖) 를 차례로 자연 유하시켰다. 상기에서 얻어진 화합물을 순수 (5 ㎖) 에 용해하여 칼럼에 차지하였다. 자연 유하한 용액을 분취 후, 추가로 순수 (10 ㎖) 로 용출하였다. 목적물을 포함하는 획분을 아울러 동결 건조시켜, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (83.4 ㎎), 디아스테레오머 2 (44.8 ㎎), 및 디아스테레오머 3 (13.1 ㎎) 을 얻었다 (HPLC 의 유지 시간 : 디아스테레오머 1 ＞ 2, 3).
디아스테레오머 1
Figure pat00123
디아스테레오머 2
Figure pat00124
디아스테레오머 3
Figure pat00125
실시예 2 : CDN2 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
(실시예 1 에 기재한 화합물 1 의 디아스테레오머 4)
[화학식 110]
Figure pat00126
[합성 스킴]
[화학식 111]
Figure pat00127
(공정 1)
N-벤조일-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]아데노신
시판 (ChemGenes) 되는 N-벤조일-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}아데노신 (962 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 이 아세토니트릴 용액을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 2)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물과 실시예 1 공정 6 에서 얻어진 화합물 (1.00 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하였다. 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 3)
N-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2-(2-시아노에톡시)-10-옥소-10-술파닐-2-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-6-일}벤즈아미드
상기 공정 2 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (367 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1219(M＋H)＋.
(공정 4)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (367 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (115 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 4 (101 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 958(M＋H)＋.
디아스테레오머 4 (고극성)
MS(ESI)m/z : 958(M＋H)＋.
(공정 5)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(화합물 1 의 디아스테레오머 4)
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 4) (101 ㎎ : 불순물 함유) 를 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 25 ％ (0 분 - 40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 5 ％ - 100 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (28.5 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00128
실시예 3 : CDN3 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-2,10,15,16-테트라하이드록시-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 112]
Figure pat00129
[합성 스킴]
[화학식 113]
Figure pat00130
(공정 1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(올레이트)
실시예 1 공정 11 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (30.0 ㎎) 의 아세톤 (0.5 ㎖) - 물 (0.2 ㎖) 용액에 트리에틸아민 (0.27 ㎖) 과 요오드메탄 (60 ㎕) 을 첨가하여 1 일간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 0 ％ - 20 ％ (0 분 - 40 분)] 로 정제하였다. 얻어진 화합물을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (21.2 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00131
실시예 4 : CDN4 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(2-아미노-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 114]
Figure pat00132
[합성 스킴]
[화학식 115]
Figure pat00133
(공정 1)
실시예 1 공정 7 의 반응을 이하의 스케일로 실시하였다 (원료 : 1.01 g). 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액과 시판 (Wuhu Nuowei Chemistry) 되는 5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-N-(2-메틸프로파노일)구아노신 (954 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하였다. 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 2)
N-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-2-일}-2-메틸프로판아미드
상기 공정 1 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (357 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1201(M＋H)＋.
(공정 3)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(2-아미노-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (357 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (241 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 974(M＋H)＋.
(공정 4)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(2-아미노-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (241 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 인 원자 상의 디아스테레오머를 분리하고, 표제 화합물의 2 종류의 디아스테레오머를 각각 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 20 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (56.7 ㎎) 과 디아스테레오머 2 (25.9 ㎎) 를 얻었다 (HPLC 의 유지 시간 : 디아스테레오머 1 ＞ 2).
디아스테레오머 1 (저극성)
Figure pat00134
디아스테레오머 2 (고극성)
Figure pat00135
실시예 5 : CDN5 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[1-(2-아미노에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 116]
Figure pat00136
[합성 스킴]
[화학식 117]
Figure pat00137
(공정 1)
2',3',5'-트리-O-아세틸-1-[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]이노신
2',3',5'-트리-O-아세틸이노신 (5.00 g) 의 테트라하이드로푸란 (90 ㎖) 현탁액에, 2-(트리메틸실릴)에틸(2-하이드록시에틸)카르바메이트 (3.12 g) 와 트리페닐포스핀 (3.99 g) 을 첨가한 후, 디프로판-2-일 (E)-디아젠-1,2-디카르복실레이트 (3.05 ㎖) 의 테트라하이드로푸란 (10 ㎖) 용액을 첨가하고, 실온에서 15 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (3.01 g) 을 얻었다.
Figure pat00138
(공정 2)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-1-[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]이노신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (3.01 g) 의 테트라하이드로푸란 (15 ㎖) - 메탄올 (15 ㎖) 용액에 탄산칼륨 (100 ㎎) 을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응액에 아세트산 (83 ㎕) 을 첨가하고, 감압 농축하고, 잔류물을 피리딘으로 공비하였다. 재차 피리딘 (30 ㎖) 에 용해 후, 0 ℃ 에서 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (2.10 g) 를 첨가하고, 30 분간 교반한 후, 냉장고에서 밤새 보관하였다. 반응액에 메탄올 (1㎖) 을 첨가하고, 30 분간 교반한 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (3.61 g) 을 얻었다.
(관측 가능한 피크만 기재)
(공정 3)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]이노신
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (3.61 g) 의 디클로로메탄 (18 ㎖) 용액에, 이미다졸 (811 ㎎) 과 tert-부틸(클로로)디메틸실란 (861 ㎎) 을 첨가하고, 실온에서 17 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (1.61 g) 과 표제 화합물의 위치 이성체인 5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]이노신 (1.31 g) 을 각각 얻었다.
Figure pat00140
위치 이성체 (2'-O-TBS 체)
Figure pat00141
(공정 4)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-1-[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]이노신
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.61 g) 의 디클로로메탄 (18.5 ㎖) 용액에, 4,5-디시아노이미다졸 (240 ㎎) 과 2-시아노에틸N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트 (0.703 ㎖) 를 첨가하고, 실온에서 15 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응액을 디클로로메탄으로 추출 후, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 DIOL 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (1.95 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 61 : 39) 로서 얻었다.
Figure pat00142
(공정 5)
실시예 1 공정 7 과 동일한 반응을 이하의 스케일로 실시하였다 (원료 : 910 ㎎). 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액과 상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (950 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하였다. 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 6)
2-(트리메틸실릴)에틸 (2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸)카르바메이트
상기 공정 5 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (602 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1303(M＋H)＋.
(공정 7)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-7-{6-옥소-1-[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일}-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (602 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (205 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (244 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1146(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1146(M＋H)＋.
(공정 8-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[1-(2-아미노에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (145 ㎎ : 불순물 함유) 에 트리에틸아민3불화수소산염 (1.31 ㎖) 을 첨가하고, 45 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 실온하, 반응액에 빙랭한 1 M 탄산수소트리에틸암모늄 용액 (10 ㎖) 과 트리에틸아민 (2 ㎖) 의 혼합 용액을 첨가하였다. 반응액을 감압 농축 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하였다. 얻어진 화합물의 테트라하이드로푸란 (4 ㎖) 용액에 불화테트라부틸암모늄의 테트라하이드로푸란 용액 (약 1 M, 2 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 39 시간 교반하였다. 반응액에, 10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액 (4 ㎖) 을 첨가하고, 감압 농축하였다. 잔류물을 C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 50 ％ (0 분 - 40 분)] 로 정제하였다. 얻어진 화합물 (트리에틸아민염) 의 염 교환을 실시할 때에, 화합물을 용해하는 용매 및 용출액의 일부에 아세토니트릴-메탄올-순수 (1 : 1 : 1) 의 혼합액을 사용하는 것 이외에는, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (72.5 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00143
(공정 8-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[1-(2-아미노에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (133 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여 상기 공정 8-1 과 동일한 수법으로 반응 및 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (55.4 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00144
실시예 6 : CDN6 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 118]
Figure pat00145
[합성 스킴]
[화학식 119]
Figure pat00146
(공정 1)
2',3',5'-트리-O-아세틸-1-(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)이노신
시판 (Ark Pharm) 되는 2',3',5'-트리-O-아세틸이노신 (10.0 g) 의 테트라하이드로푸란 (100 ㎖) 현탁액에, 2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에탄-1-올 (5.37 g) 과 트리페닐포스핀 (7.69 g) 을 첨가한 후, 디프로판-2-일 (E)-디아젠-1,2-디카르복실레이트 (6.10 ㎖) 를 첨가하고, 실온에서 6 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/디클로로메탄] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리페닐포스핀옥사이드와의 혼합물 (10.6 g) 로서 얻었다.
Figure pat00147
(공정 2)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-1-(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)이노신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (10.6 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 2 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물을 트리페닐포스핀옥사이드와의 혼합물 (7.21 g) 로서 얻었다.
Figure pat00148
(공정 3)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)이노신
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (7.21 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (2.17 g) 과 표제 화합물의 위치 이성체인 5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)이노신 (2.55 g) 을 얻었다.
Figure pat00149
위치 이성체 (2'-O-TBS 체)
Figure pat00150
(공정 4)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}이노신
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (2.17 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (2.65 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
Figure pat00151
(공정 5)
실시예 1 공정 7 과 동일한 반응을 이하의 스케일로 실시하였다 (원료 : 935 ㎎). 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액과 상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (950 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하였다. 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 6)
3-({(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-[1-(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-일}옥시)프로판니트릴
상기 공정 5 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (494 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1274(M＋H)＋.
(공정 7)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-[1-(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ 5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (494 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (88.5 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (70.7 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1003(M-C6H15Si＋2H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1003(M-C6H15Si＋2H)＋.
(공정 8-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (88.5 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 30 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (25.7 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00152
(공정 8-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (70.7 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 25 ％ (0 분 - 40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 15 ％ - 70 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (17.8 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00153
실시예 7 : CDN7 의 합성
N-(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸)-2-하이드록시아세트아미드
[화학식 120]
Figure pat00154
[합성 스킴]
[화학식 121]
Figure pat00155
(공정 1-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-{1-[2-(2-하이드록시아세트아미드)에틸]-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
실시예 5 공정 8-1 에서 얻어진 화합물 (10.0 ㎎) 의 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 ㎖) 용액에, 트리에틸아민 (8 ㎕) 과 1-[(하이드록시아세틸)옥시]피롤리딘-2,5-디온 (5.3 ㎎) 을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응액을 10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액으로 희석하고, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 0 ％ - 30 ％ (0 분 - 40 분)] 로 정제하였다. 얻어진 화합물 (트리에틸아민염) 을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (10.5 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00156
(공정 1-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-{1-[2-(2-하이드록시아세트아미드)에틸]-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
실시예 5 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (30.0 ㎎) 을 사용하여, 상기 공정 1-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 30 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (23.6 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00157
실시예 8 : CDN8 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 122]
Figure pat00158
[합성 스킴]
[화학식 123]
Figure pat00159
(공정 1)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2',3'-비스-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2-클로로아데노신
이미 알려진 문헌 (J. Med. Chem. 1989, 32, 1135-1140) 의 5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-클로로아데노신 (29.1 g) 의 N,N-디메틸포르미아미드 (145 ㎖) 용액에, 이미다졸 (16.4 g) 과 tert-부틸디메틸클로로실란 (18.2 g) 을 첨가하고, 실온에서 18 시간 교반하였다. 반응액에 물을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (34.9 g) 을 얻었다.
Figure pat00160
(공정 2)
N-아세틸-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2',3'-비스-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2-클로로아데노신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (34.9 g) 의 피리딘 (210 ㎖) 용액에, 무수 아세트산 (140 ㎖) 과 4-디메틸아미노피리딘 (515 ㎎) 을 첨가하고, 질소 분위기하, 실온에서 21 시간 교반하였다. 반응액을 디클로로메탄 (100 ㎖) 으로 희석한 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물에 디클로로메탄 (210 ㎖) 과 모르폴린 (7.30 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응액에 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (45.4 g : 불순물 함유) 을 얻었다. 얻어진 화합물은 그 이상의 정제를 실시하지 않고 다음의 반응에 사용하였다.
Figure pat00161
(공정 3)
N-아세틸-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-클로로아데노신
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (45.4 g : 불순물 함유) 의 테트라하이드로푸란 (200 ㎖) 용액에, 불화테트라부틸암모늄의 테트라하이드로푸란 용액 (약 1.0 M, 100 ㎖) 을 첨가하고, 질소 분위기하, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응액에 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/아세톤/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (23.0 g) 을 얻었다.
Figure pat00162
(공정 4)
N-아세틸-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2-클로로아데노신
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (23.0 g) 의 N,N-디메틸포름아미드 (178 ㎖) 용액에, 이미다졸 (5.94 g) 과 tert-부틸디메틸클로로실란 (6.44 g) 을 첨가하고, 질소 분위기하, 실온에서 18 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (9.01 g) 을 얻었다.
Figure pat00163
(공정 5)
N-아세틸-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2-클로로-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}아데노신
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (9.01 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 6 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (10.6 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 65 : 35) 로서 얻었다.
Figure pat00164
(공정 6)
N,N-디에틸에탄아미늄 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아세트아미드 2-클로로-9H-푸린-9-일)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-2-옥소-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2-티올레이트
실시예 1 공정 7 과 동일한 반응을 이하의 스케일로 실시하였다 (원료 : 2.06 g). 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액과 상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (1.98 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 및 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (180 ㎎) 과 디아스테레오머 2 (167 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
Figure pat00165
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1191(M＋H)＋.
(공정 7-1)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (49.6 ㎎) 의 메탄올 (1.28 ㎖) 용액에, 에틸렌디아민 (256 ㎕) 을 첨가하고, 60 ℃ 에서 2 시간 교반한 후, 마이크로 웨이브 반응 장치를 사용하여 120 ℃ 에서 2 시간 반응시켰다. 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 40 ％ - 70 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물을 (37.2 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00166
(공정 7-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (50.0 ㎎ : 불순물 함유) 의 메탄올 (1.29 ㎖) 용액에, 에틸렌디아민 (25.8 ㎕) 을 첨가하고, 60 ℃ 에서 2 시간 교반한 후, 마이크로 웨이브 반응 장치를 사용하여 120 ℃ 에서 2 시간 반응시켰다. 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 30 ％ - 50 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물을 (23.7 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00167
(공정 8-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 7-1 에서 얻어진 화합물 (37.2 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 2 ％ - 20 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (16.5 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00168
(공정 8-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 7-2 에서 얻어진 화합물 (23.7 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 2 ％ - 20 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (14.9 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00169
실시예 9 : CDN9 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-하이드록시에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 124]
Figure pat00170
[합성 스킴]
[화학식 125]
Figure pat00171
(공정 1-1)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-하이드록시에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
실시예 8 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (50.1 ㎎) 의 메탄올 (1.29 ㎖) 용액에, 2-아미노에탄올 (258 ㎕) 을 첨가하고, 60 ℃ 에서 2 시간 교반한 후, 마이크로 웨이브 반응 장치를 사용하여 120 ℃ 에서 2 시간 반응시켰다. 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 20 ％ - 60 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (39.4 ㎎) 을 에탄올아민 유래의 화합물을 포함하는 혼합물로서 얻었다.
Figure pat00172
(공정 1-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-하이드록시에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
실시예 8 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (49.3 ㎎ : 불순물 함유) 의 메탄올 (1.27 ㎖) 용액에, 2-아미노에탄올 (254 ㎕) 을 첨가하고, 60 ℃ 에서 2 시간 교반한 후, 마이크로 웨이브 반응 장치를 사용하여 120 ℃ 에서 3 시간 반응시켰다. 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 20 ％ - 60 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물을 (26.1 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00173
(공정 2-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-하이드록시에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 1-1 에서 얻어진 혼합물 (39.4 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 2 ％ - 20 ％ (0 분 - 30 분)].
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (16.8 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00174
(공정 2-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-하이드록시에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 1-2 에서 얻어진 화합물 (26.1 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 2 ％ - 20 ％ (0 분 - 30 분)].
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (18.6 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00175
실시예 10 : CDN10 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노-2-메틸프로필)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 126]
Figure pat00176
[합성 스킴]
[화학식 127]
Figure pat00177
(공정 1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노-2-메틸프로필)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
실시예 8 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (41.0 ㎎) 의 메탄올 (1.10 ㎖) 용액에, 1,2-디아미노-2-메틸프로판 (210 ㎕) 을 첨가하고, 60 ℃ 에서 2 시간 교반한 후, 마이크로 웨이브 반응 장치를 사용하여 120 ℃ 에서 6 시간 반응시켰다. 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 20 ％ - 60 ％ (0 분 - 30 분)] 로 간이 정제하고, 표제 화합물을 (16.3 ㎎ : 불순물 함유) 을 얻었다. 얻어진 화합물은 그 이상의 정제를 실시하지 않고 다음의 반응에 사용하였다.
MS(ESI)m/z : 1044(M＋H)＋.
(공정 2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노-2-메틸프로필)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (16.3 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 25 ％ (0 분 - 30 분)].
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (6.4 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00178
실시예 11 : CDN11 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[6-아미노-2-(아미노메틸)-9H-푸린-9-일]-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ 5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 128]
Figure pat00179
[합성 스킴]
[화학식 129]
Figure pat00180
(공정 1)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-시아노아데노신
이미 알려진 문헌 (J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8502-8504) 의 2-시아노아데노신 (440 ㎎) 의 피리딘 (8.00 ㎖) 용액에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (642 ㎎) 를 첨가하고, 질소 분위기하, 실온에서 4 시간 교반하였다. 반응액에 메탄올 (10 ㎖) 을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (528 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00181
(공정 2)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-[({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)메틸]아데노신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (14.3 g) 의 테트라하이드로푸란 (500 ㎖) 용액에 수소화리튬알루미늄의 테트라하이드로푸란 용액 (약 2.5 M, 29.0 ㎖) 을 첨가하고, 질소 분위기하, 40 ℃ 에서 2 시간 교반하였다. 반응액을 빙랭하여 포화 탄산수소나트륨 수용액 (450 ㎖) 을 첨가하고 10 분간 교반한 후, 1-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온 (25.0 g) 을 첨가하고, 실온에서 18 시간 반응시켰다. 포화 로셸염 수용액을 첨가하고, 2.5 시간 교반한 후, 디클로로메탄/메탄올의 혼합액으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (10.8 g) 을 얻었다.
Figure pat00182
(공정 3)
N-벤조일-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-[({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)메틸]아데노신
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (10.8 g) 의 피리딘 (70.0 ㎖) 용액에 클로로트리메틸실란 (15.0 ㎖) 을 첨가하고, 질소 분위기하, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응액에 염화벤조일 (8.44 ㎖) 을 첨가하고, 추가로 2 시간 교반하였다. 반응액을 0 ℃ 까지 냉각시키고, 물 (21.0 ㎖) 를 첨가하여 10 분간 교반한 후, 28 ％ 암모니아수 (31.4 ㎖) 를 첨가하여 동 온도에서 추가로 20 분간 교반하였다. 실온까지 승온하여 추가로 3 시간 교반한 후, 반응액을 감압 농축하였다. 잔류물을 아세트산에틸에 현탁시키고, 고체를 여과 제거하였다. 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (9.47 g) 을 얻었다.
Figure pat00183
(공정 4)
N-벤조일-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2-[({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)메틸]아데노신
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (9.47 g) 을 사용하여, 실시예 8 공정 4 와 동일한 수법에 의해 표제 화합물 (3.13 g) 을 얻었다.
Figure pat00184
(공정 5)
N-벤조일-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-2-[({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)메틸]아데노신
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.49 g) 의 디클로로메탄 (15.5 ㎖) 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (1.58 ㎖) 과 2-시아노에틸N,N-디이소프로필클로로포스포로아미다이트 (1.04 ㎖) 를 첨가하고, 질소 분위기하, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 및 C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [아세토니트릴 : 100 ％] 로 정제하고, 표제 화합물 (1.39 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 6 : 4) 로서 얻었다.
Figure pat00185
(공정 6)
N,N-디에틸에탄아미늄 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{6-벤즈아미드-2-[({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)메틸]-9H-푸린-9-일}-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-2-옥소-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2-티올레이트
실시예 1 공정 7 과 동일한 반응을 이하의 스케일로 실시하였다 (원료 : 1.94 g). 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액과 상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (2.19 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 및 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (138 ㎎) 과 디아스테레오머 2 (82.8 ㎎) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
Figure pat00186
디아스테레오머 2 (고극성)
(관측 가능한 피크만 기재)
(공정 7-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{6-아미노-2-[({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)메틸]-9H-푸린-9-일}-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5, 10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (42.3 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (25.9 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00188
(공정 7-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{6-아미노-2-[({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)메틸]-9H-푸린-9-일}-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5, 10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (82.8 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (45.2 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00189
(공정 8-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{6-아미노-2-[({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)메틸]-9H-푸린-9-일}-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 7-1 에서 얻어진 화합물 (25.9 ㎎) 에 트리에틸아민3불화수소산염 (700 ㎕) 을 첨가하고, 55 ℃ 에서 2 시간 교반하였다. 실온하, 반응액에 빙랭한 1 M 탄산트리에틸암모늄 수용액 (3.5 ㎖) 과 트리에틸아민 (1.10 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％ - 40 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (19.1 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00190
(공정 8-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{6-아미노-2-[({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)메틸]-9H-푸린-9-일}-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 7-2 에서 얻어진 화합물 (45.2 ㎎) 을 사용하여, 상기 공정 8-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (37.1 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00191
(공정 9-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[6-아미노-2-(아미노메틸)-9H-푸린-9-일]-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5, 10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 8-1 에서 얻어진 화합물 (19.1 ㎎) 의 테트라하이드로푸란 (576 ㎕) 용액에, 불화테트라부틸암모늄의 테트라하이드로푸란 용액 (약 1 M, 288 ㎕) 을 첨가하고, 질소 분위기하, 실온에서 밤새 교반한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 0 ％ - 30 ％ (0 분 - 40 분)] 및 Sep-Pak (등록상표) C18 [물/아세토니트릴].
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (8.4 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00192
(공정 9-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[6-아미노-2-(아미노메틸)-9H-푸린-9-일]-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5, 10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (37.1 ㎎) 을 사용하여, 상기 공정 9-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (12.8 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00193
실시예 12 : CDN12 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[6-아미노-2-(하이드록시메틸)-9H-푸린-9-일]-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 130]
Figure pat00194
[합성 스킴]
[화학식 131]
Figure pat00195
(공정 1)
6-클로로-2-요오드-9-{2,3,5-트리스-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보퓨라노실}-9H-푸린
시판 (Amadis Chemical) 되는 6-클로로-2-요오드-9-β-D-리보퓨라노실-9H-푸린 (9.65 g) 의 에틸렌글리콜디메틸에테르 (120 ㎖) 용액에, 0 ℃ 에서 N,N-디이소프로필에틸아민 (40.7 ㎖) 과 tert-부틸디메틸실릴트리플루오로메탄술포네이트 (26.9 ㎖) 를 첨가하고, 질소 분위기하, 실온까지 승온하여 19 시간 교반하였다. 반응액을 0 ℃ 까지 냉각시키고, 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (13.7 g) 을 얻었다.
Figure pat00196
(공정 2)
2-[(벤조일옥시)메틸]-6-클로로-9-{2,3,5-트리스-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보퓨라노실}-9H-푸린
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (13.7 g) 의 테트라하이드로푸란 (121 ㎖) 용액에, 질소 분위기하에서 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (2.10 g) 과 하기의 수법으로 조제한 벤질옥시메틸요오드화아연 (약 0.9 M, 30.2 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 20 시간 교반하였다. 반응액에 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (7.29 g) 을 얻었다.
[벤질옥시메틸요오드화아연의 조제]
질소 분위기하, 아연 분말 (5.99 g) 의 테트라하이드로푸란 (17.1 ㎖) 현탁액을 초음파 처리한 후, 요오드메틸벤조에이트 (12.0 g) 의 테트라하이드로푸란 (21.3 ㎖) 용액을 10 ∼ 15 ℃ 에서 첨가하고, 동 온도에서 1.5 시간 교반하고, 벤질옥시메틸요오드화아연의 테트라하이드로푸란 용액 (약 0.9 M, 38.4 ㎖) 을 얻었다.
Figure pat00197
(공정 3)
2-[(벤조일옥시)메틸]-6-클로로-9-β-D-리보퓨라노실-9H-푸린
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (7.29 g) 의 테트라하이드로푸란 (47.7 ㎖) 용액에, 질소 분위기, 0 ℃ 에서 불화테트라부틸암모늄의 테트라하이드로푸란 용액 (약 1 M, 38 ㎖) 을 첨가하고, 동 온도에서 2.5 시간 교반하였다. 반응액에 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (3.69 g) 을 얻었다.
Figure pat00198
(공정 4)
2-[(벤조일옥시)메틸]-9-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-β-D-리보퓨라노실}-6-클로로-9H-푸린
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (2.36 g) 의 피리딘 (56 ㎖) 용액에, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (2.30 g) 를 첨가하고, 질소 분위기하, 실온에서 17 시간 교반하였다. 반응액에 에탄올 (20 ㎖) 을 첨가하여, 추가로 10 분간 정도 교반한 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (1.41 g) 을 얻었다.
Figure pat00199
(공정 5)
2-[(벤조일옥시)메틸]-9-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보퓨라노실}-6-클로로-9H-푸린
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (2.61 g) 의 에틸렌글리콜디메틸에테르 (72.0 ㎖) 용액에, N,N-디이소프로필에틸아민 (1.89 ㎖) 과 tert-부틸디메틸실릴트리플루오로메탄술포네이트 (1.24 ㎖) 를 첨가하고, 질소 분위기하, 실온에서 1.5 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (1.10 g) 을 얻었다.
Figure pat00200
(공정 6)
2-[(벤조일옥시)메틸]-9-(5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-β-D-리보퓨라노실)-6-클로로-9H-푸린
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (511 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 6 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (569 ㎎) 을 인 원자에 관한 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 6 : 4) 로서 얻었다.
Figure pat00201
(공정 7)
N,N-디에틸에탄아미늄 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{2-[(벤조일옥시)메틸]-6-클로로-9H-푸린-9-일}-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-2-옥소-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2-티올레이트
실시예 1 공정 7 과 동일한 반응을 이하의 스케일로 실시하였다 (원료 : 2.72 g). 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액과 상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (3.03 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 및 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (351 ㎎) 과 디아스테레오머 2 (351 ㎎) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
Figure pat00202
디아스테레오머 2 (고극성)
Figure pat00203
(공정 8-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[6-아미노-2-(하이드록시메틸)-9H-푸린-9-일]-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (37.3 ㎎) 의 메탄올 (0.500 ㎖) 용액에, 28 ％ 암모니아 수용액 (0.500 ㎖) 을 첨가하고, 실드 튜브 중 60 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 반응액을 그대로 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 35 ％ - 55 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (22.0 ㎎ : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 988(M＋H)＋.
(공정 8-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[6-아미노-2-(하이드록시메틸)-9H-푸린-9-일]-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (37.7 ㎎) 의 테트라하이드로푸란 (0.500 ㎖) 용액에, 28 ％ 암모니아 수용액 (0.500 ㎖) 을 첨가하고, 실드 튜브 중 60 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 28 ％ 암모니아 수용액 (0.500 ㎖) 을 추가하고 3 시간 더 교반하였다. 28 ％ 암모니아 수용액 (0.500 ㎖) 을 추가하고 밤새 더 교반하였다. 반응액을 그대로 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 20 ％ - 50 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (19.3 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00204
(공정 9-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[6-아미노-2-(하이드록시메틸)-9H-푸린-9-일]-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 8-1 에서 얻어진 화합물 (22.0 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 2 ％ - 30 ％ (0 분 - 30 분)].
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (8.0 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00205
(공정 9-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[6-아미노-2-(하이드록시메틸)-9H-푸린-9-일]-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (19.3 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 2 ％ - 30 ％ (0 분 - 30 분)].
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (6.5 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00206
실시예 13 : CDN13 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{6-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 132]
Figure pat00207
[합성 스킴]
[화학식 133]
Figure pat00208
(공정 1)
9-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보퓨라노실}-6-클로로-9H-푸린
이미 알려진 문헌 (J. Org. Chem. 2000, 65, 5104-5113) 의 9-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-β-D-리보퓨라노실}-6-클로로-9H-푸린 (15.3 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (8.44 g) 과 표제 화합물의 위치 이성체인 9-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보퓨라노실}-6-클로로-9H-푸린 (5.77 g) 을 얻었다.
Figure pat00209
위치 이성체 (2'-O-TBS 체)
Figure pat00210
(공정 2)
9-(5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-β-D-리보퓨라노실)-6-클로로-9H-푸린
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (5.39 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (5.78 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 1 : 1) 로서 얻었다.
Figure pat00211
(공정 3)
실시예 1 공정 7 과 동일한 반응을 이하의 스케일로 실시하였다 (원료 : 1.84 g). 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액과 상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (1.62 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하였다. 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 4)
3-{[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-(6-클로로-9H-푸린-9-일)-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-10-일]옥시}프로판니트릴
상기 공정 3 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (626 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1134(M＋H)＋.
(공정 5)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{6-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (299 ㎎ : 디아스테레오머 혼합물) 의 에탄올 (10 ㎖) 용액에 에틸렌디아민 (0.352 ㎖) 과 트리에틸아민 (0.735 ㎖) 을 첨가하고, 60 ℃ 에서 15 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (122 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (111 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1001(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1001(M＋H)＋.
(공정 6-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{6-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (122 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 30 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (29.6 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00212
(공정 6-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{6-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5, 10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (119 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 25 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (15.6 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00213
실시예 14 : CDN14 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-{6-[(2-하이드록시에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5, 10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 134]
Figure pat00214
[합성 스킴]
[화학식 135]
Figure pat00215
(공정 1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-{6-[(2-하이드록시에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
실시예 13 공정 4 에서 얻어진 화합물 (313 ㎎) 의 에탄올 (10 ㎖) 용액에, 2-아미노에탄올 (0.330 ㎖) 과 트리에틸아민 (0.769 ㎖) 을 첨가하고, 60 ℃ 에서 15 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (111 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (102 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1002(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1002(M＋H)＋.
(공정 2-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-{6-[(2-하이드록시에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (111 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 30 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (47.1 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00216
(공정 2-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-{6-[(2-하이드록시에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (102 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 25 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (27.1 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00217
실시예 15 : CDN15 의 합성
N-[2-({9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-6-일}아미노)에틸]-2-하이드록시아세트아미드
[화학식 136]
Figure pat00218
[합성 스킴]
[화학식 137]
Figure pat00219
(공정 1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-(6-{[2-(2-하이드록시아세트아미드)에틸]아미노}-9H-푸린-9-일)-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
실시예 13 공정 6-2 에서 얻어진 화합물 (10.0 ㎎) 을 사용하여, 실시예 7 공정 1-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 35 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (6.6 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00220
실시예 16 : CDN16 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{2-아미노-6-[(2-하이드록시에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 138]
Figure pat00221
[합성 스킴]
[화학식 139]
Figure pat00222
(공정 1)
2-아세트아미드-2',3',5'-트리-O-아세틸-N-(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)아데노신
시판 (도쿄 화성 공업) 되는 6-클로로-9-β-D-리보퓨라노실-9H-푸린-2-아민 (5.00 g) 의 에탄올 (30 ㎖) 용액에 2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에탄-1-아민 (3.49 g) 과 N,N-디이소프로필에틸아민 (4.33 ㎖) 을 첨가하고, 80 ℃ 에서 65 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물에 피리딘 (15 ㎖) 과 무수 아세트산 (15 ㎖) 을 첨가하고, 70 ℃ 에서 4 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (8.91 g) 을 얻었다.
Figure pat00223
(공정 2)
2-아세트아미드-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-N-(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)아데노신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (4.00 g) 의 디클로로메탄 (40 ㎖) 용액에 나트륨메톡시드의 메탄올 용액 (1.0 M, 6.64 ㎖) 을 첨가하고, 0 ℃ 에서 1 시간 교반하였다. 반응액에 아세트산 (0.413 ㎖) 과 피리딘 (0.5 ㎖) 을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 반응액을 감압 농축하였다. 잔류물에 피리딘을 첨가한 후, 감압하에서 일부 농축하고, 피리딘 (약 20 ㎖) 용액을 조제하였다. 이 용액에 0 ℃ 에서 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (4.68 g) 를 첨가하고, 동 온도에서 30 분간 교반한 후, 4 ℃ 에서 밤새 보존하였다. 반응액에 메탄올 (2 ㎖) 을 첨가하고, 30 분간 교반한 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (4.41 g) 을 얻었다.
(관측 가능한 피크만 기재)
(공정 3)
2-아세트아미드-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-N-(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)아데노신
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (4.41 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.75 g) 및 표제 화합물의 위치 이성체인 2-아세트아미드-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-N-(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)아데노신 (1.31 g) 을 얻었다.
(관측 가능한 피크만을 기재)
위치 이성체 (2'-O-TBS 체)
Figure pat00226
(공정 4)
2-아세트아미드-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-N-(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}아데노신
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.75 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (2.08 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 6 : 4) 로서 얻었다.
Figure pat00227
(공정 5)
실시예 1 공정 7 과 동일한 반응을 이하의 스케일로 실시하였다 (원료 : 981 ㎎). 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액과 상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.05 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하였다. 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 6)
N-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-[(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)아미노]-9H-푸린-2-일}아세트아미드
상기 공정 5 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (413 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1330(M＋H)＋.
(공정 7)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{2-아미노-6-[(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (413 ㎎) 의 메탄올 (5 ㎖) 과 28 ％ 암모니아수 (5 ㎖) 에 용해시키고, 실온에서 63 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 간이 정제하고, 저극성의 디아스테레오머 1 과 고극성의 디아스테레오머 2 를 분리하였다. 각각의 디아스테레오머를 재차 메탄올 (5 ㎖) 과 28 ％ 암모니아수 (5 ㎖) 에 용해시키고, 100 ℃ 에서 2 일간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (70.4 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (65.1 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1131(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1131(M＋H)＋.
(공정 8-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{2-아미노-6-[(2-하이드록시에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (70.4 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 30 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (20.8 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00228
(공정 8-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{2-아미노-6-[(2-하이드록시에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (65.1 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 30 ％ (0 분 - 40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 0 ％ - 60 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (7.9 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00229
실시예 17 : CDN17 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-[6-(하이드록시메틸)-9H-푸린-9-일]-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 140]
Figure pat00230
[합성 스킴]
[화학식 141]
Figure pat00231
(공정 1)
6-[(벤조일옥시)메틸]-9-{2,3,5-트리스-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보퓨라노실}-9H-푸린
이미 알려진 문헌 (J. Org. Chem. 1997, 62, 6833-6841) 의 6-클로로-9-{2,3,5-트리스-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보퓨라노실}-9H-푸린 (10.7 g) 을 사용하여, 실시예 12 공정 2 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (10.4 g) 을 얻었다.
Figure pat00232
(공정 2)
6-[(벤조일옥시)메틸]-9-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-β-D-리보퓨라노실}-9H-푸린
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (10.3 g) 의 테트라하이드로푸란 (50 ㎖) 용액에, 불화테트라부틸암모늄의 테트라하이드로푸란 용액 (약 1 M, 49.4 ㎖) 을 첨가하고, 0 ℃ 에서 4 시간 교반하였다. 반응액에 아세트산 (2.83 ㎖) 을 첨가한 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 로 조 (粗) 정제하였다. 미정제 생성물의 피리딘 (50 ㎖) 용액에, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (10.1 g) 를 0 ℃ 에서 첨가하고, 4 ℃ 에서 밤새 교반하였다. 반응액에 메탄올 (2 ㎖) 을 첨가하고, 1 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (4.62 g) 을 얻었다.
Figure pat00233
(공정 3)
6-[(벤조일옥시)메틸]-9-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보퓨라노실}-9H-푸린
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (4.53 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (2.09 g) 및 표제 화합물의 위치 이성체인 6-[(벤조일옥시)메틸]-9-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보퓨라노실}-9H-푸린 (1.81 g) 을 얻었다.
Figure pat00234
위치 이성체 (2'-O-TBS 체)
Figure pat00235
(공정 4)
6-[(벤조일옥시)메틸]-9-(5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-β-D-리보퓨라노실)-9H-푸린
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (2.04 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (2.37 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 56 : 44) 로서 얻었다.
Figure pat00236
(공정 5)
실시예 1 공정 7 과 동일한 반응을 이하의 스케일로 실시하였다 (원료 : 783 ㎎). 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액과 상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (765 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하였다. 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 6)
{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-6-일}메틸 벤조에이트
상기 공정 5 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (345 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1234(M＋H)＋.
(공정 7)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-[6-(하이드록시메틸)-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (345 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (101 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (89.9 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 973(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 973(M＋H)＋.
(공정 8-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-[6-(하이드록시메틸)-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (101 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 30 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (59.2 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00237
(공정 8-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-[6-(하이드록시메틸)-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (88.5 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 30 ％ (0 분 - 40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 10 ％ - 70 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (27.7 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00238
실시예 18 : CDN18 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[4-아미노-5-(3-아미노프로필)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일]-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 142]
Figure pat00239
[합성 스킴]
[화학식 143]
Figure pat00240
(공정 1)
4-아지드-5-요오드-7-(2,3,5-트리-O-벤조일-β-D-리보퓨라노실)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘
이미 알려진 문헌 (Synth. Co㎜un. 2012, 42, 358-374) 의 4-클로로-5-요오드-7-(2,3,5-트리-O-벤조일-β-D-리보퓨라노실)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (17.96 g) 의 N,N-디메틸포름아미드 (90 ㎖) 용액에, 아지화 테트라부틸암모늄 (10.1 g) 을 첨가하고, 80 ℃ 에서 30 분간 교반하였다. 반응액을 실온으로 되돌리고, 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액과 아세트산에틸을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (17.66 g) 을 얻었다.
Figure pat00241
(공정 2)
4-아지드-7-(2,3,5-트리-O-벤조일-β-D-리보퓨라노실)-5-[3-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)프로파-1-인-1-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (9.64 g) 의 N,N-디메틸포름아미드 (30 ㎖) - 테트라하이드로푸란 (100 ㎖) 혼합 용액에, 2-(트리메틸실릴)에틸프로파-2-인-1-일카르바메이트 (6.58 g), 트리에틸아민 (4.57 ㎖), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (763 ㎎), 및 요오드화구리(I) (251 ㎎) 을 차례로 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응액에 물을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (7.20 g) 을 얻었다.
Figure pat00242
(공정 3)
7-(2,3,5-트리-O-벤조일-β-D-리보퓨라노실)-5-[3-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)프로필]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (7.20 g) 의 메탄올 (70 ㎖) - 테트라하이드로푸란 (70 ㎖) 혼합 용액에 20 ％ 수산화팔라듐탄소 (2g) 를 첨가하고, 수소 분위기하, 실온에서 2 시간 교반하였다. 촉매를 여과 제거한 후, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (5.45 g) 을 얻었다.
Figure pat00243
(공정 4)
N,N-디벤조일-7-(2,3,5-트리-O-벤조일-β-D-리보퓨라노실)-5-[3-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)프로필]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (5.45 g) 의 디클로로메탄 (60 ㎖) 용액에, 0 ℃ 에서 피리딘 (1.69 ㎖) 과 염화벤조일 (2.01 ㎖) 을 차례로 첨가하고, 0 ℃ 에서 5 분간 교반 후, 추가로 트리에틸아민 (2.91 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액과 디클로로메탄을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 추가로 아세트산에틸과 헥산으로 분말화하였다. 얻어진 고체를 여과 채취하고, 표제 화합물 (6.16 g) 을 얻었다.
Figure pat00244
(공정 5)
N-벤조일-7-β-D-리보퓨라노실-5-[3-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)프로필]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (6.16 g) 의 테트라하이드로푸란 (250 ㎖) 용액에, 0 ℃ 에서 나트륨메톡시드의 메탄올 용액 (1.0 M, 12.0 ㎖) 을 적하하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 0 ℃ 에서 반응액에 아세트산 (1.07 ㎖) 을 첨가한 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [아세트산에틸/메탄올] 로 정제하고, 추가로 아세트산에틸과 헥산으로 분말화하였다. 얻어진 고체를 여과 채취하고, 표제 화합물 (3.35 g) 을 얻었다.
Figure pat00245
(공정 6)
N-벤조일-7-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-β-D-리보퓨라노실}-5-[3-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)프로필]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (3.35 g) 을 피리딘으로 공비하고, 잔류물의 무수 피리딘 (50 ㎖) 용액에, 0 ℃ 에서 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (2.38 g) 를 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응액에 에탄올 (5 ㎖) 을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고 표제 화합물 (4.34 g) 을 얻었다.
Figure pat00246
(공정 7)
N-벤조일-7-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보퓨라노실}-5-[3-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)프로필]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 (3'-O-TBS 체)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (4.34 g) 을 사용하여, 실시예 8 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.51 g) 과, 표제 화합물의 위치 이성체인, N-벤조일-7-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보퓨라노실}-5-[3-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)프로필]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 (2'-O-TBS 체) (2.01 g) 을 각각 얻었다.
(3'-OTBS 체) (고극성)
(2'-OTBS 체) (저극성)
(공정 8)
N-벤조일-7-(5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-β-D-리보퓨라노실)-5-[3-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)프로필]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (3'-OTBS 체) (1.51 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 6 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 인 원자 상의 디아스테레오머인 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (0.77 g) 과 디아스테레오머 2 (0.48 g) 를 각각 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
Figure pat00249
디아스테레오머 2 (고극성)
Figure pat00250
(공정 9)
2-(트리메틸실릴)에틸 (3-{4-벤즈아미드-7-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일}프로필)카르바메이트
실시예 1 공정 7 과 동일한 반응을 이하의 스케일로 실시하였다 (원료 : 1.08 g). 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액과 상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (1.25 g : 디아스테레오머 혼합물) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 및 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다. 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％ - 50 ％ (0 분 - 35 분)] 로 인 원자 상의 디아스테레오머를 분리하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (0.19 g) 과 디아스테레오머 2 (0.043 g) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1419(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1419(M＋H)＋.
(공정 10-1)
2-(트리메틸실릴)에틸 (3-{4-아미노-7-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일}프로필)카르바메이트
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (0.19 g) 을 사용하여, 실시예 12 공정 8-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하였다. 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 40 ％ - 70 ％ (0 분 - 35 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (58 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1158(M＋H)＋.
(공정 10-2)
2-(트리메틸실릴)에틸 (3-{4-아미노-7-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일}프로필)카르바메이트
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (43 ㎎) 을 사용하여, 실시예 12 공정 8-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하였다. 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 30 ％ - 60 ％ (0 분 - 35 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (15 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1158(M＋H)＋.
(공정 11-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[4-아미노-5-(3-아미노프로필)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일]-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 10-1 에서 얻어진 화합물 (58 ㎎) 의 테트라하이드로푸란 (1㎖) 용액에, 불화테트라부틸암모늄의 테트라하이드로푸란 용액 (약 1 M, 5 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 완결되어 있지 않기 때문에, 추가로 40 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％ - 40 ％ (0 분 - 35 분)] 로 정제하였다. 또한 Sep-Pak (등록상표) C18 [0.1 ％ 트리에틸아민 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 0 ％ - 30 ％] 로 정제하고, 표제 화합물 (25 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 786(M＋H)＋.
(공정 11-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[4-아미노-5-(3-아미노프로필)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일]-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 10-2 에서 얻어진 화합물 (15 ㎎) 을 사용하여, 상기 공정 11-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (7.2 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 786(M＋H)＋.
(공정 12-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[4-아미노-5-(3-아미노프로필)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일]-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 11-1 에서 얻어진 화합물 (25 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (17 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00251
(공정 12-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[4-아미노-5-(3-아미노프로필)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일]-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 11-2 에서 얻어진 화합물 (7.2 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (6.0 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00252
실시예 19 : CDN19 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-1,2,3,5,6-펜타아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 144]
Figure pat00253
[합성 스킴]
[화학식 145]
Figure pat00254
(공정 1)
3-브로모-N-(프로파-2-엔-1-일)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민
시판 (Bepharm) 되는 3-브로모-4-클로로-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘 (8.50 g) 을 디옥산 (140 ㎖) 에 현탁시키고, 실온에서 N,N,-디이소프로필에틸아민 (12.5 ㎖) 과 알릴아민 (11 ㎖) 을 첨가하고, 동 온도에서 70 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물을 디클로로메탄과 아세트산에틸로 슬러리상으로 한 후, 고체를 여과 채취하였다 (고체 1). 여과액을 감압 농축 후, 동일한 조작을 2 회 반복해서 각각 고체 2 와 고체 3 을 얻었다. 마지막 여과액을 실리카 겔 칼럼 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하여 고체 4 를 얻었다. 또한, 고체 1 을 실리카 겔 칼럼 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하여 고체 5 를 얻었다. 고체 4 와 고체 5 를 아울러, 표제 화합물 (4.48 g) 을 얻었다. 고체 2 와 고체 3 을 아울러, 불순물을 포함하는 표제 화합물 (3.78 g) 을 얻었다.
Figure pat00255
(공정 2)
3-브로모-N-(프로파-2-엔-1-일)-1-(2,3,5-트리-O-벤조일-β-D-리보퓨라노실)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (1.00 g) 과 시판 (Ark Pharm) 되는 1-O-아세틸-2,3,5-트리-O-벤조일-β-D-리보퓨라노스 (2.58 g) 를 니트로메탄 (50 ㎖) 에 현탁시킨 후, 가열하여 용해시켰다. 가열 환류하에서 3불화붕소디에틸에테르 착물 (0.63 ㎖) 을 첨가하고, 동 온도에서 1 시간 교반하였다. 1-O-아세틸-2,3,5-트리-O-벤조일-β-D-리보퓨라노스 (0.40 g) 와 3불화붕소디에틸에테르 착물 (0.10 ㎖) 을 추가하여, 3 시간 더 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (1.80 g) 을 얻었다.
Figure pat00256
(공정 3)
3-에테닐-N-(프로파-2-엔-1-일)-1-(2,3,5-트리-O-벤조일-β-D-리보퓨라노실)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (11.65 g) 의 톨루엔 (120 ㎖) 에 용액을, 감압하에서 초음파 처리하여 탈기하였다. 질소 분위기하, 반응액에 트리부틸비닐주석 (12.8 ㎖) 과 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (2.73 g) 을 첨가하고, 2 시간 가열 환류하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (10.07 g) 을 얻었다.
Figure pat00257
(공정 4)
2-(2,3,5-트리-O-벤조일-β-D-리보퓨라노실)-6,7-디하이드로-2H-1,2,3,5,6-펜타아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (9.0 g) 을 벤젠으로 2 회 공비하였다. 잔류물의 디클로로메탄 용액 (480 ㎖) 에 (＋)-10-캠퍼술폰산 (4.2 g) 과 벤질리덴[1,3-비스(2,4,6-트리메틸페닐)이미다졸리딘-2-일리덴]디클로라이드(트리시클로헥실-λ5-포스파닐)루테늄 (제 2 세대 Grubbs 촉매) (360 ㎎) 을 첨가하고, 3 시간 가열 환류하였다. 제 2 세대 Grubbs 촉매 (360 ㎎) 를 추가하고, 1 시간 더 가열 환류하였다. 반응액을 실온까지 냉각시키고, 포화 탄산수소나트륨 수용액과 포화 식염수로 차례로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (6.39 g) 을 얻었다.
Figure pat00258
(공정 5)
2-β-D-리보퓨라노실-6,7-디하이드로-2H-1,2,3,5,6-펜타아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (620 ㎎) 의 메탄올 (10 ㎖) - 테트라하이드로푸란 (5.0 ㎖) 혼합 용액에, 실온에서 나트륨메톡시드의 메탄올 용액 (1.0 M, 0.10 ㎖) 을 첨가하고, 동 온도에서 18 시간 교반하였다. 반응액을 1 규정 염산으로 중화 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (279 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00259
(공정 6)
2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-6,7-디하이드로-2H-1,2,3,5,6-펜타아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (2.81 g) 을 사용하여, 실시예 1 의 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (4.72 g) 을 얻었다.
Figure pat00260
(공정 7)
2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-1,2,3,5,6-펜타아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (2.12 g) 의 테트라하이드로푸란 (20 ㎖) 용액에, 아세트산 (파스퇴르 피펫으로 3 방울), 10 ％ 팔라듐탄소 (AD) wet (0.82 g) 를 첨가하고, 수소 분위기하, 실온에서 3 시간 교반하였다. 촉매를 여과 제거한 후, 테트라하이드로푸란으로 세정하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (2.09 g) 을 얻었다.
Figure pat00261
(공정 8)
6-벤조일-2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-1,2,3,5,6-펜타아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (2.09 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (2.23 g) 을 얻었다.
Figure pat00262
(공정 9)
6-벤조일-2-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-1,2,3,5,6-펜타아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (2.23 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (2.69 g) 을 얻었다.
Figure pat00263
(공정 10)
6-벤조일-2-(5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-β-D-리보퓨라노실)-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-1,2,3,5,6-펜타아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (2.69 g) 을 사용하여, 실시예 5 의 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (2.93 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 6 : 4) 로서 얻었다.
Figure pat00264
(공정 11)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-1,2,3,5,6-펜타아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (1.04 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 6-벤조일-2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3-O-(디하이드록시포스파닐)-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-1,2,3,5,6-펜타아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 이 아세토니트릴 용액과 시판 (Cool Pharm) 되는 N-벤조일-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}아데노신 (1.20 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8, 실시예 1 공정 9, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다. 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 25 - 50 ％ (0 분 - 35 분)] 로 인 원자 상의 디아스테레오머를 분리하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (15 ㎎) 과 디아스테레오머 2 (55 ㎎) 를 얻었다 (HPLC 의 유지 시간 : 디아스테레오머 1 ＞ 2).
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 959(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 959(M＋H)＋.
(공정 12-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-1,2,3,5,6-펜타아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5, 10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (20 ㎎) 에, 트리에틸아민3불화수소산염 (1㎖) 을 첨가하고, 45 ℃ 에서 2 시간 교반하였다. 반응액을 빙랭한 1 M 탄산수소트리에틸암모늄 수용액 (3 ㎖) 과 트리에틸아민 (1㎖) 의 혼합 용액에 첨가하여 반응을 정지시켰다. Sep-Pak (등록상표) C18 [0.1 ％ 트리에틸아민수/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 0 ％ - 17 ％] 로 정제하고, 표제 화합물 (15 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 731(M＋H)＋.
(공정 12-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-1,2,3,5,6-펜타아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5, 10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (43 ㎎) 을 사용하여, 상기 공정 12-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (34 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 731(M＋H)＋.
(공정 13-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-1,2,3,5,6-펜타아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 12-1 에서 얻어진 화합물 (15 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 혼합물 (12 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00265
(공정 13-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-1,2,3,5,6-펜타아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 12-2 에서 얻어진 화합물 (34 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 혼합물 (28 ㎎ : 디아스테레오머비 = 4 : 1) 을 얻었다.
Figure pat00266
실시예 20 : CDN20 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-14-(8,9-디하이드로-6-옥사-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 146]
Figure pat00267
[합성 스킴]
[화학식 147]
Figure pat00268
(공정 1)
7-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-4-클로로-5-요오드-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘
이미 알려진 문헌 (J. Med. Chem. 2008, 51, 3934-3945) 의 4-클로로-5-요오드-7-β-D-리보퓨라노실-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (3.15 g) 을 사용하여, 실시예 1 의 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (2.97 g) 을 얻었다.
Figure pat00269
(공정 2)
4-(벤질옥시)-7-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-5-요오드-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (4.97 g) 과 벤질알코올 (1.0 ㎖) 의 테트라하이드로푸란 (50 ㎖) 용액에, 빙랭하에서 수소화나트륨 (미네랄 오일을 37 ％ 함유) (426 ㎎) 을 첨가하고, 실온으로 승온하여 밤새 교반하였다. 빙랭하, 반응액에 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응액을 아세트산에틸로 추출 후, 유기층을 물, 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (3.38 g) 을 얻었다.
Figure pat00270
(공정 3)
4-(벤질옥시)-7-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-5-(3-하이드록시프로파-1-인-1-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (3.38 g) 과 2-프로핀-1-올 (1.35 ㎖) 을 사용하고, 반응 온도를 실온으로 하여, 실시예 1 공정 2 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (2.22 g) 을 얻었다.
Figure pat00271
(공정 4)
7-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-5-(3-하이드록시프로필)-3,7-디하이드로-4H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-온
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (3.38 g) 을 사용하여, 반응 용매를 메탄올 (20 ㎖) - 테트라하이드로푸란 (20 ㎖) 의 혼합액으로 하고, 실시예 19 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (0.92 g) 을 얻었다.
Figure pat00272
(공정 5)
2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-2,7,8,9-테트라하이드로-6-옥사-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.92 g) 의 테트라하이드로푸란 (32 ㎖) 용액에, 빙랭하에서 트리페닐포스핀 (0.62 g) 과 아조디카르복실산디이소프로필 (0.47 ㎖) 을 첨가하고, 실온까지 승온하여 1 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (0.77 g) 을 얻었다.
Figure pat00273
(공정 6)
2-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보퓨라노실}-2,7,8,9-테트라하이드로-6-옥사-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.95 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.13 g) 을 얻었다.
Figure pat00274
(공정 7)
2-(5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-β-D-리보퓨라노실)-2,7,8,9-테트라하이드로-6-옥사-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (1.13 g) 을 사용하여, 정제에 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 을 사용한 것 이외는, 실시예 5 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.00 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 6 : 4) 로서 얻었다.
Figure pat00275
(공정 8)
N-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-14-(8,9-디하이드로-6-옥사-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-6-일}벤즈아미드
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (1.00 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3-O-(디하이드록시포스파닐)-β-D-리보퓨라노실}-2,7,8,9-테트라하이드로-6-옥사-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 이 아세토니트릴 용액과 시판 (Cool Pharm) 되는 N-벤조일-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}아데노신 (1.28 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 을 포함하는 혼합물과 디아스테레오머 2 를 포함하는 혼합물을 각각 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1116(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1116(M＋H)＋.
(공정 9-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-14-(8,9-디하이드로-6-옥사-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1 을 포함하는 혼합물) 을 전량 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물 (73 ㎎) 을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 30 ％ - 60 ％ (0 분 - 35 분)].
MS(ESI)m/z : 959(M＋H)＋.
(공정 9-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-14-(8,9-디하이드로-6-옥사-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2 를 포함하는 혼합물) 을 전량 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물 (58 ㎎) 을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 25 ％ - 50 ％ (0 분 - 35 분)].
MS(ESI)m/z : 959(M＋H)＋.
(공정 10-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-14-(8,9-디하이드로-6-옥사-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 9-1 에서 얻어진 화합물 (68 ㎎) 을 사용하여, 실시예 19 공정 12-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (42 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00276
(공정 10-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-14-(8,9-디하이드로-6-옥사-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 9-2 에서 얻어진 화합물 (58 ㎎) 을 사용하여, 실시예 19 공정 12-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (35 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00277
실시예 21 : 약물 링커 1 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 148]
Figure pat00278
(공정 1)
N-(아자니우밀아세틸)글리실-L-페닐알라닐글리신트리플루오로아세테이트
시판 (BACHEM) 되는 N-(tert-부톡시카르보닐)글리실글리실-L-페닐알라닐글리신 (3.00 g) 의 디클로로메탄 (30 ㎖) 용액에 실온에서 트리플루오로아세트산 (15 ㎖) 을 첨가하고, 동 온도에서 3 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 톨루엔에 현탁시켜 재차 감압 농축하였다. 이 농축 조작을 추가로 2 회 반복하였다. 잔류물을 디에틸에테르 (100 ㎖) 로 슬러리상으로 한 후, 여과 채취하고, 표제 화합물 (3.27 g) 의 미정제체를 얻었다.
Figure pat00279
(공정 2)
N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐글리신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (2.09 g) 의 N,N-디메틸포르미아미드 (46.4 ㎖) 용액에 트리에틸아민 (0.804 ㎖) 과 1-{[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]옥시}피롤리딘-2,5-디온 (1.87 g) 을 첨가하고, 실온에서 21 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 로 정제하였다. 얻어진 화합물의 디클로로메탄 용액에 디에틸에테르를 첨가하여 슬러리상으로 한 후, 여과 채취하고, 표제 화합물 (2.10 g) 을 얻었다.
(관측 가능한 피크만 기재)
(공정 3)
2,5-디옥소피롤리딘-1-일N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐글리시네이트
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (2.10 g) 의 N,N-디메틸포르미아미드 (33.7 ㎖) 용액에 N-하이드록시숙신이미드 (426 ㎎) 와 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드염산염 (710 ㎎) 을 첨가하고, 질소 분위기하, 실온에서 16 시간 교반하였다. 반응액을 디클로로메탄으로 희석 후, 빙수로 3 회 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 유상 (油狀) 의 잔류물에 아세트산에틸을 첨가하여 고체를 석출시켰다. 용매를 감압하에서 증류 제거, 얻어진 고체에 디에틸에테르를 첨가하여 슬러리상으로 한 후, 여과 채취하고, 표제 화합물 (2.18 g) 을 얻었다.
Figure pat00281
(공정 4)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸)글리신아미드
(약물 링커 1)
실시예 5 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (10.0 ㎎) 의 N,N-디메틸포름아미드 (1㎖) 용액에 트리에틸아민 (8 ㎕) 과 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (17.6 ㎎) 을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응액에, 벤질아민 (3 ㎕) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응액에 10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액과 메탄올을 첨가하고, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 과 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 50 ％ (0 분 - 40 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (10.9 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00282
실시예 22 : 약물 링커 2 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 149]
Figure pat00283
(공정 1)
1-[2-(벤조일옥시)에틸]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]이노신
이노신 (10.0 g) 의 피리딘 (50 ㎖) 과 N,N-디메틸아세트아미드 (50 ㎖) 용액에, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (15.2 g) 를 0 ℃ 에서 첨가한 후, 4 ℃ 에서 64 시간 교반하였다. 반응액에 메탄올 (2 ㎖) 을 첨가하고, 10 분 교반 후에 50 ㎖ 정도까지 농축하였다. 잔류물에 2-브로모에틸벤조에이트 (7.02 ㎖) 와 2,3,4,6,7,8,9,10-옥타하이드로피리미드[1,2-a]아제핀 (13.9 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 1 일 교반하였다. 반응액에, 포화 탄산수소나트륨 수용액과 물을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (15.2 g) 을 얻었다.
Figure pat00284
(공정 2)
1-[2-(벤조일옥시)에틸]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]이노신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (3.01 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 3 과 동일한 수법으로 합성을 실시하고, 표제 화합물 (1.20 g) 과 표제 화합물의 위치 이성체인 1-[2-(벤조일옥시)에틸]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]이노신 (1.22 g) 을 얻었다.
Figure pat00285
(2'-O-TBS 체)
(공정 3)
1-[2-(벤조일옥시)에틸]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}이노신
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (1.20 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 4 와 동일한 수법으로 합성을 실시하고, 표제 화합물 (1.41 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 0.55 : 0.45) 로서 얻었다.
Figure pat00287
(공정 4)
실시예 1 공정 7 과 동일한 반응을 이하의 스케일로 실시하였다 (원료 : 1.40 g). 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액과 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.41 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하였다. 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 5)
2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸 벤조에이트
상기 공정 4 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (778 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1264(M＋H)＋.
(공정 6)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (778 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (255 ㎎) 과 디아스테레오머 2 (불순물 함유) 를 얻었다. 디아스테레오머 2 를 분취 HPLC [물/0.2 ％ 트리에틸아민 함유 아세토니트릴, 0.2 ％ 트리에틸아민 함유 아세토니트릴 : 5 ％ - 50 ％ (0 분 - 40 분)] 로 재차 정제하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 2 (94.6 ㎎) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
디아스테레오머 2 (고극성)
Figure pat00289
(공정 7-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-(1-{2-[(글리실아미노)메톡시]에틸}-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-yl)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (30 ㎎) 의 테트라하이드로푸란 (0.5 ㎖) 용액에 [(N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}글리실)아미노]메틸 아세테이트 (91.7 ㎎) 와 p-톨루엔술폰산 1수화물 (11.8 ㎎) 을 첨가하고, 실온에서 6 시간 교반하였다. 반응액에 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 ㎖) 와 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 (56 ㎕) 을 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응액에 10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액을 첨가하고, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 불순물로서 원료를 포함하는 표제 화합물 (25.6 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1089(M＋H)＋.
(공정 7-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-(1-{2-[(글리실아미노)메톡시]에틸}-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (84.6 ㎎) 을 사용하여, 상기 공정 7-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 불순물로서 원료를 포함하는 표제 화합물 (70.9 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1089(M＋H)＋.
(공정 8-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(1-{2-[(글리실아미노)메톡시]에틸}-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트) 디아스테레오머 1
상기 공정 7-1 에서 얻어진 화합물 (25.6 ㎎) 에 트리에틸아민3불화수소산염 (2 ㎖) 을 첨가하고, 45 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 실온하, 반응액에 빙랭한 1 M 탄산수소트리에틸암모늄 용액 (10 ㎖) 과 트리에틸아민 (2 ㎖) 의 혼합액을 첨가하였다. 반응액을 감압 농축 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴) 로 정제하고, 표제 화합물 (16.6 ㎎ : 공정 7-1 의 원료 유래의 불순물을 포함한다) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 861(M＋H)＋.
(공정 8-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(1-{2-[(글리실아미노)메톡시]에틸}-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 7-2 에서 얻어진 화합물 (70.9 ㎎) 을 사용하여, 상기 공정 8-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (51.7 ㎎ : 공정 7-2 의 원료 유래의 불순물을 포함한다) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 861(M＋H)＋.
(공정 9-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에톡시)메틸]글리신아미드
(약물 링커 2a : 디아스테레오머 1)
상기 공정 8-1 에서 얻어진 화합물 (16.6 ㎎) 의 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 ㎖) 용액에 트리에틸아민 (6 ㎕) 과 후술하는 공정 11 에서 얻어진 화합물 (15.5 ㎎) 을 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응액에 벤질아민 (3 ㎕) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액과 메탄올을 첨가하고, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 과 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％ - 45 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (5.1 ㎎) 을 얻었다.
(관측 가능한 피크만 기재)
(공정 9-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-yl)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에톡시)메틸]글리신아미드
(약물 링커 2b : 디아스테레오머 2)
상기 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (51.7 ㎎) 을 사용하여, 상기 공정 9-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물 (33.7 ㎎) 을 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％ - 50 ％ (0 분 - 30 분)].
Figure pat00291
(공정 10)
N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닌
시판 (BACHEM) 되는 (2S)-2-[[2-[(2-아미노아세틸)아미노]아세틸]아미노]-3-페닐프로판산 (2.86 g) 의 N,N-디메틸포름아미드 (51.2 ㎖) 용액에 트리에틸아민 (2.56 ㎖) 과 시판 (Click Chemistry Tools) 되는 1-{[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]옥시}피롤리딘-2,5-디온 (3.69 g) 을 첨가하고, 실온에서 24 시간 교반하였다. 반응액에 시트르산 1수화물 (24.0 g) 의 물 (500 ㎖) 용액을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 아세트산에틸/아세토니트릴 혼합 용액에 용해시킨 후, 디이소프로필에테르로 석출시켜 여과 채취하고, 표제 화합물 (4.30 g) 을 얻었다.
Figure pat00292
(공정 11)
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라니네이트
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (2.10 g) 의 N,N-디메틸포름아미드 (75.9 ㎖) 용액에 N-하이드록시숙신이미드 (961 ㎎) 와 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 (1.60 g) 을 첨가하고, 질소 분위기하, 실온에서 21 시간 교반하였다. 반응액을 디클로로메탄으로 희석하고, 빙수로 3 회 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물에 톨루엔을 첨가하고, 재차 감압 농축하였다. 잔류물을 아세토니트릴에 용해하고, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [아세토니트릴 : 100 ％] 로 정제하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 감압 농축 후, 잔류물에 디이소프로필에테르를 첨가하여 슬러리상으로 하였다. 얻어진 고체를 여과 채취하고, 표제 화합물 (2.59 g) 을 얻었다.
Figure pat00293
실시예 23 : 약물 링커 3 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 150]
Figure pat00294
(공정 1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[2-({6-아미노-9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-2-일}아미노)에틸]글리신아미드
(약물 링커 3)
실시예 8 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (4.8 ㎎) 의 N,N-디메틸포름아미드 (0.29 ㎖) 용액에, 트리에틸아민 (1.9 ㎕) 과 실시예 21 공정 3 에서 얻어진 화합물 (5.2 ㎎) 을 첨가하고, 질소 분위기하, 실온에서 1.5 시간 교반하였다. 벤질아민 (3.2 ㎕) 을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 20 ％ - 40 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (8.0 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00295
실시예 24 : 약물 링커 4 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 151]
Figure pat00296
(공정 1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[6-아미노-2-({2-[(글리실아미노)메톡시]에틸}아미노)-9H-푸린-9-일]-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-yl)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
실시예 9 공정 1-2 에서 얻어진 화합물 (17.6 ㎎) 을 사용하여, 실시예 22 공정 7-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (8.3 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1103(M＋H)＋.
(공정 2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[6-아미노-2-({2-[(글리실아미노)메톡시]에틸}아미노)-9H-푸린-9-일]-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (10.7 ㎎) 을 사용하여, 실시예 22 공정 8-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (7.6 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 875(M＋H)＋.
(공정 3)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-{[2-({6-아미노-9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-2-일}아미노)에톡시]메틸}글리신아미드
(약물 링커 4)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (7.6 ㎎) 을 사용하여, 실시예 22 공정 9-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하였다. 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물 (7.6 ㎎) 을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 20 ％ - 40 ％ (0 분 - 30 분)].
Figure pat00297
실시예 25 : 당사슬 리모델링 항체 1 의 합성
개변 항HER2 항체 - [SG-(N3)2]2 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 152]
Figure pat00298
(공정 1)
(Fucα1,6)GlcNAc - 개변 항HER2 항체의 조제
참고예 1 에 따라서 조제한 개변 항HER2 항체의 인산 완충 생리 식염수 용액 (20 ㎖, 12.6 ㎎/㎖, pH 6.0) 에, 야생형 EndoS 의 인산 완충 생리 식염수 용액 (0.147 ㎖, 7.70 ㎎/㎖, pH 6.0) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 2 시간 15 분간 흔들었다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 으로 확인하였다. 반응 종료 후, 이하의 방법에 따라서, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시아파타이트 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제를 실시하였다.
(1) 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA avant 25 (GE 헬스 케어 제조)
칼럼 : HiTrap rProtein A FF (5 ㎖) (GE 헬스 케어 제조)
유속 : 5 ㎖/분 (차지 시에는 1.25 ㎖/분)
상기에서 얻은 반응액을 2 회로 나누어 정제하였다. 칼럼으로의 결합 시에는, 반응액을 칼럼에 첨가하고, 결합 버퍼 [20 mM 인산 완충액 (pH 6.0)] 을 1.25 ㎖/분으로 2 CV 흘리고, 추가로 5 ㎖/분으로 5 CV 흘렸다. 중간 세정 시에는, 세정 용액 [20 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 0.5 M 염화나트륨 용액] 을 15 CV 흘렸다. 용출 시에는, 용출 버퍼 (I㎜unoPure IgG Elution buffer, PIERCE 제조) 를 6 CV 흘렸다. 용출액을 1 M 트리스 완충액 (pH 9.0) 으로 즉시 중화하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 공통 조작 C 에 기재된 방법에 따라서, 5 mM 인산 완충액, 50 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.8) 으로의 완충액 교환을 실시하였다. 얻어진 완충 용액의 항체 농도를 공통 조작 B 에 기재된 방법에 따라서 측정하고, 조정제된 표제 항체 용액 (26.57 ㎎/㎖, 9.0 ㎖) 을 얻었다.
(2) 하이드록시아파타이트 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA avant 25 (GE 헬스 케어 제조)
칼럼 : Bio-Scale Mini CHT Type I 카트리지 (5 ㎖) (BIO-RAD 제조)
유속 : 5 ㎖/분 (차지 시에는 1.25 ㎖/분)
상기 (1) 에서 얻어진 용액을 칼럼에 첨가하고, A 액 [5 mM 인산 완충액, 50 mM MES 용액 (pH 6.8)] 을 1.25 ㎖/분으로 2 CV 흘리고, 추가로 5 ㎖/분으로 3 CV 흘렸다. 그 후, A 액과 B 액 [5 mM 인산 완충액, 50 mM MES 용액 (pH 6.8), 2 M 염화나트륨 용액] 을 사용하여, 용출하였다. 용출 조건은, A 액 : B 액 = 100 : 0 ∼ 0 : 100 (5 CV) 이다. 또한 세정 용액 [500 mM 인산 완충액 (pH 6.5)] 을 5 CV 흘렸다. 목적물을 포함하는 프랙션을 공통 조작 C 에 기재된 방법에 따라서, 20 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로의 완충액 교환을 실시하였다. 얻어진 완충 용액의 항체 농도를 공통 조작 B 에 기재된 방법에 따라서 측정하고, 표제 항체 용액 (17.29 ㎎/㎖, 약 13 ㎖) 을 얻었다.
(공정 2)
개변 항HER2 항체 - [SG-(N3)2]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 항체의 20 mM 인산 완충 용액 (17.29 ㎎/㎖, 13 ㎖, pH 6.0) 에 [N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox (WO2018/003983 의 화합물 1-10) (52 ㎎) 의 20 mM 인산 완충 용액 (pH 6.0) (3.0 ㎖ ＋ 씻어내기 1.0 ㎖) 및 EndoS (D233Q/Q303L) 의 인산 완충 생리 식염수 용액 (0.698 ㎖, 5.8 ㎎/㎖, pH 6.0) 을 첨가하고, 30 ℃ 에서 4 시간 흔들었다. 반응액을 -80 ℃ 에서 15 시간 보존한 후, 30 ℃ 에서 해동하고, [N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox (7.4 ㎎) 및 EndoS (D233Q/Q303L) 의 인산 완충 생리 식염수 용액 (0.155 ㎖, 5.8 ㎎/㎖, pH 6.0) 을 추가하여 30 ℃ 에서 2 시간 흔들었다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 으로 확인하였다. 반응 종료 후, 상기 공정 1 과 동일하게 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시아파타이트 크로마토그래피에 의한 정제를 실시하였다. 목적물을 포함하는 프랙션 (합계 7 개) 을 전의 4 개와 후의 3 개로 나누고, 각각을 공통 조작 C 에 기재된 방법에 따라서, 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 로의 완충액 교환을 실시하였다. 얻어진 완충 용액의 항체 농도를 공통 조작 B 에 기재된 방법에 따라서 측정하고, 표제 항체 용액 (전의 4 개 : 14.99 ㎎/㎖, 10 ㎖) 과 표제 항체 용액 (후의 3 개 : 10.97 ㎎/㎖, 6.2 ㎖) 을 각각 얻었다.
실시예 26 : 당사슬 리모델링 항체 2 의 합성
개변 항LPS 항체 - [SG-(N3)2]2 의 조제
[합성 스킴]
[화학식 153]
Figure pat00299
(공정 1)
(Fucα1,6)GlcNAc - 개변 항LPS 항체의 조제
참고예 2 에 따라서 조제한 개변 항LPS 항체의 인산 완충 생리 식염수 용액 (8.5 ㎖, 10.96 ㎎/㎖, pH 6.0) 을 사용하여, 실시예 25 공정 1 과 동일한 조작을 실시하고, 표제 항체의 20 mM 인산 완충 용액 (11.70 ㎎/㎖, 7.5 ㎖, pH 6.0) 을 얻었다.
(공정 2)
개변 항LPS 항체 - [SG-(N3)2]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 항체의 20 mM 인산 완충 용액 (11.70 ㎎/㎖, 7.5 ㎖, pH 6.0) 과 [N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox (20.3 ㎎) 를 사용하여, 실시예 25 공정 2 와 동일한 조작을 실시하고, 표제 항체의 인산 완충 생리 식염수 용액 (10.55 ㎎/㎖, 7.5 ㎖, pH 6.0) 을 얻었다.
실시예 27 : 항체 약물 콘쥬게이트 1 의 합성 (항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 1 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 1 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.97 ㎎/㎖, 0.500 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.250 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 3 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.0907 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.159 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS (10 mM Acetate Buffer, 5 ％ Sorbitol, pH 5.5) 용액 (3.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.97 ㎎/㎖
항체 수량 (收量) : 3.41 ㎎ (62 ％)
약물 평균 결합수 : 3.6
실시예 28 : 항체 약물 콘쥬게이트 2 의 합성 (항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 2 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 1 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.97 ㎎/㎖, 0.500 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.250 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 4 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.0907 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.159 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (3.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.08 ㎎/㎖
항체 수량 : 3.78 ㎎ (69 ％)
약물 평균 결합수 : 3.2
실시예 29 : 항체 약물 콘쥬게이트 3 의 합성 (항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 3 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 1 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.97 ㎎/㎖, 0.500 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.250 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 2a 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.0907 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.159 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 47 시간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (3.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.91 ㎎/㎖
항체 수량 : 3.17 ㎎ (58 ％)
약물 평균 결합수 : 3.6
실시예 30 : 항체 약물 콘쥬게이트 4 의 합성 (항LPS 항체 - CDN 콘쥬게이트 1 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 2 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.55 ㎎/㎖, 1.00 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.500 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 3 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.174 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.326 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (6.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.11 ㎎/㎖
항체 수량 : 7.23 ㎎ (69 ％)
약물 평균 결합수 : 3.9
실시예 31 : CDN21 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(7,8,9,10-테트라하이드로-2H-6-옥사-2,3,5-트리아자시클로옥타[1,2,3-cd]인덴-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 154]
Figure pat00300
[합성 스킴]
[화학식 155]
Figure pat00301
(공정 1)
4-(벤질옥시)-7-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-5-(4-하이드록시부타-1-인-1-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘
실시예 20 공정 2 에서 얻어진 화합물 (3.37 g) 과 3-부틴-1-올 (1.72 ㎖) 을 사용하여, 반응 온도를 실온으로 하여, 실시예 1 공정 2 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (2.74 g) 을 얻었다.
Figure pat00302
(공정 2)
7-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-5-(4-하이드록시부틸)-3,7-디하이드로-4H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-온
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (2.74 g) 을 사용하여, 반응 용매를 메탄올 (30 ㎖) - 테트라하이드로푸란 (30 ㎖) 혼합 용매로 하고, 실시예 19 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (2.21 g) 을 얻었다.
Figure pat00303
(공정 3)
2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-7,8,9,10-테트라하이드로-2H-6-옥사-2,3,5-트리아자시클로옥타[1,2,3-cd]인덴
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (1.89 g) 을 사용하여, 실시예 20 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.40 g) 을 얻었다.
Figure pat00304
(공정 4)
2-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보퓨라노실}-7,8,9,10-테트라하이드로-2H-6-옥사-2,3,5-트리아자시클로옥타[1,2,3-cd]인덴
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.61 g) 을 사용하여, 실시예 1 의 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.95 g) 을 얻었다.
Figure pat00305
(공정 5)
2-(5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-β-D-리보퓨라노실)-7,8,9,10-테트라하이드로-2H-6-옥사-2,3,5-트리아자시클로옥타[1,2,3-cd]인덴
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.95 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 4 와 동일하게 조작하고, 표제 화합물 (2.20 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 6 : 4) 로서 얻었다.
Figure pat00306
(공정 6)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-비스(술파닐)-14-(7,8,9,10-테트라하이드로-2H-6-옥사-2,3,5-트리아자시클로옥타[1,2,3-cd]인덴-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (1.18 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보퓨라노실}-7,8,9,10-테트라하이드로-2H-6-옥사-2,3,5-트리아자시클로옥타[1,2,3-cd]인덴의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 이 아세토니트릴 용액과 시판 (Cool Pharm) 되는 N-벤조일-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}아데노신 (1.49 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8, 공정 9, 및 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다. 이 혼합물을 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 25 ％ - 60 ％ (0 분 - 35 분)] 로 정제하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (50 ㎎) 과 디아스테레오머 2 (34 ㎎) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 973(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 973(M＋H)＋.
(공정 7-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(7,8,9,10-테트라하이드로-2H-6-옥사-2,3,5-트리아자시클로옥타[1,2,3-cd]인덴-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (50 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, Sep-Pak (등록상표) C18 [0.1 ％ 트리에틸아민 수용액/아세토니트릴 = 5 : 1] 로 정제하고, 표제 화합물의 트리에틸아민염을 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (33 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00307
(공정 7-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(7,8,9,10-테트라하이드로-2H-6-옥사-2,3,5-트리아자시클로옥타[1,2,3-cd]인덴-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (34 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, Sep-Pak (등록상표) C18 [0.1 ％ 트리에틸아민 수용액/아세토니트릴 = 5 : 1] 로 정제하고, 표제 화합물의 트리에틸아민염을 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (21 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00308
실시예 32 : CDN22 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-14-[(7S)-7-메틸-8,9-디하이드로-6-옥사-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일]-2,10-비스(술파닐)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 156]
Figure pat00309
[합성 스킴]
[화학식 157]
Figure pat00310
(공정 1)
4-(벤질옥시)-7-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-5-[(3R)-3-하이드록시부타-1-인-1-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘
실시예 20 공정 2 에서 얻어진 화합물 (2.54 g) 과 (R)-(＋)-3-부틴-2-올 (1.36 ㎖) 을 사용하여, 반응 온도를 실온으로 하고, 실시예 1 공정 2 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.85 g) 을 얻었다.
Figure pat00311
(공정 2)
7-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-5-[(3R)-3-하이드록시부틸]-3,7-디하이드로-4H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-온
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (1.85 g) 을 사용하여, 반응 용매를 메탄올 (15 ㎖) - 테트라하이드로푸란 (15 ㎖) 혼합 용매로 하고, 실시예 19 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.34 g) 을 얻었다.
Figure pat00312
(공정 3)
(7S)-2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-7-메틸-2,7,8,9-테트라하이드로-6-옥사-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (1.34 g) 을 사용하여, 실시예 20 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (0.70 g) 을 얻었다.
Figure pat00313
(공정 4)
(7S)-2-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보퓨라노실}-7-메틸-2,7,8,9-테트라하이드로-6-옥사-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.70 g) 을 사용하여, 실시예 1 의 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (0.82 g) 을 얻었다.
Figure pat00314
(공정 5)
(7S)-2-(5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-β-D-리보퓨라노실)-7-메틸-2,7,8,9-테트라하이드로-6-옥사-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.82 g) 을 사용하여, 실시예 5 의 공정 4 와 동일하게 조작하고, 표제 화합물 (0.85 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 6 : 4) 로서 얻었다.
Figure pat00315
(공정 6)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-14-[(7S)-7-메틸-8,9-디하이드로-6-옥사-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일]-2,10-비스(술파닐)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.85 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, (7S)-2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보퓨라노실}-7-메틸-2,7,8,9-테트라하이드로-6-옥사-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 이 아세토니트릴 용액과 시판 (Cool Pharm) 되는 N-벤조일-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}아데노신 (1.12 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8, 공정 9, 및 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다. 이 혼합물을 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 25 ％ - 60 ％ (0 분 - 35 분)] 로 정제하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (95 ㎎) 과 디아스테레오머 2 (44 ㎎) 를 얻었다 (HPLC 의 유지 시간 : 디아스테레오머 1 ＞ 2).
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 973(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 973(M＋H)＋.
(공정 7-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-14-[(7S)-7-메틸-8,9-디하이드로-6-옥사-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일]-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (95 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, Sep-Pak (등록상표) C18 [0.1 ％ 트리에틸아민 수용액/아세토니트릴 = 5 : 1] 로 정제하고, 표제 화합물의 트리에틸아민염을 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (57 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00316
(공정 7-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-14-[(7S)-7-메틸-8,9-디하이드로-6-옥사-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일]-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (44 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, Sep-Pak (등록상표) C18 [0.1 ％ 트리에틸아민 수용액/아세토니트릴 = 5 : 1] 로 정제하고, 표제 화합물의 트리에틸아민염을 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (30 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00317
실시예 33 : CDN23 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 158]
Figure pat00318
[합성 스킴]
[화학식 159]
Figure pat00319
(공정1)
4-(벤질옥시)-5-{3-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시]프로파-1-인-1-일}-7-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘
실시예 20 공정 3 에서 얻어진 화합물 (4.17 g) 을 사용하여, 반응 용매를 디클로로메탄 (40 ㎖) - 피리딘 (40 ㎖) 혼합 용매로 하고, 실시예 11 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (5.70 g) 을 얻었다.
Figure pat00320
(공정 2)
5-{3-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시]프로필}-7-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-3,7-디하이드로-4H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-온
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (5.70 g) 의 메탄올 (100 ㎖) - 테트라하이드로푸란 (50 ㎖) 혼합 용액에, 포름산암모늄 (3.71 g) 과 10 ％ 팔라듐탄소 (AD) wet (2g) 를 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 촉매를 여과 제거한 후, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (4.56 g) 을 얻었다.
Figure pat00321
(공정 3)
5-{3-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시]프로필}-7-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-3,7-디하이드로-4H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-티온
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (1.01 g) 의 디클로로메탄 (10 ㎖) 용액에, 피리딘 (0.461 ㎖) 을 첨가하고, 빙랭하에서 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (0.385 ㎖) 을 적하하고 30 분간 교반하였다. 동 온도에서 반응액에 1 황화수소나트륨 n 수화물 (2.54 g) 의 N,N-디메틸포르미아미드 (25 ㎖) 현탁액을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액과 아세트산에틸을 첨가하고, 셀라이트로 여과한 후, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (0.51 g) 을 얻었다.
Figure pat00322
(공정 4)
7-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-5-(3-하이드록시프로필)-3,7-디하이드로-4H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-티온
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (2.79 g) 의 디클로로메탄 (80 ㎖) 용액에, 증류수 (4 ㎖) 를 첨가하고, 빙랭하에서 디클로로아세트산 (1.28 ㎖) 을 적하하고 30 분간 교반하였다. 동 온도에서 반응액에 피리딘 (2.50 ㎖) 을 첨가한 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (0.96 g) 을 얻었다.
Figure pat00323
(공정 5)
2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보퓨라노실}-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.35 g) 을 사용하여, 실시예 20 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (0.25 g) 을 얻었다.
Figure pat00324
(공정 6)
2-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보퓨라노실}-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.41 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (0.46 g) 을 얻었다.
Figure pat00325
(공정 7)
2-(5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-β-D-리보퓨라노실)-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.46 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 4 와 동일하게 조작하고, 표제 화합물 (0.48 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 6 : 4) 로서 얻었다.
Figure pat00326
(공정 8)
N-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-6-일}벤즈아미드
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.48 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보퓨라노실}-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 이 아세토니트릴 용액과 시판 (Cool Pharm) 되는 N-벤조일-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}아데노신 (0.61 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8, 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다. 이 혼합물을 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 40 ％ - 90 ％ (0 분 - 35 분)] 로 정제하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (40 ㎎) 과 디아스테레오머 2 (18 ㎎) 를 각각 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1132(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1132(M＋H)＋.
(공정 9-1)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-2,10-비스(술파닐)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (40 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 30 ％ - 60 ％ (0 분 - 35 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (35 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 975(M＋H)＋.
(공정 9-2)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-2,10-비스(술파닐)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (18 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 25 ％ - 50 ％ (0 분 - 35 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (15 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 975(M＋H)＋.
(공정 10-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 9-1 에서 얻어진 화합물 (35 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, Sep-Pak (등록상표) C18 [0.1 ％ 트리에틸아민 수용액/아세토니트릴 = 5 : 1] 로 정제하고, 표제 화합물의 트리에틸아민염을 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (18 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00327
(공정 10-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 9-2 에서 얻어진 화합물 (15 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, Sep-Pak (등록상표) C18 [0.1 ％ 트리에틸아민 수용액/아세토니트릴 = 5 : 1] 로 정제하고, 표제 화합물의 트리에틸아민염을 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (8.1 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00328
실시예 34 : CDN24 의 합성
1-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]피리미딘-2,4(1H,3H)-디온
[화학식 160]
Figure pat00329
[합성 스킴]
[화학식 161]
Figure pat00330
(공정 1)
1-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]피리미딘-2,4(1H,3H)-디온
실시예 1 공정 7 의 반응을 이하의 스케일로 실시하였다 (원료 : 1.01 g). 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액과 시판 (Angene) 되는 5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}우리딘 (1.03 g) 을 사용하여, 실시예 1 의 공정 8, 공정 9, 및 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다. 이 혼합물을 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 25 ％ - 60 ％ (0 분 - 35 분)] 로 정제하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (50 ㎎) 과 디아스테레오머 2 (23 ㎎) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 935(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 935(M＋H)＋.
(공정 2-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로 피리미딘-1(2H)-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (50 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, Sep-Pak (등록상표) C18 [0.1 ％ 트리에틸아민 수용액/아세토니트릴 = 5 : 1] 로 정제하고, 표제 화합물의 트리에틸아민염을 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (30 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00331
(공정 2-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로 피리미딘-1(2H)-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (23 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, Sep-Pak (등록상표) C18 [0.1 ％ 트리에틸아민 수용액/아세토니트릴 = 5 : 1] 로 정제하고, 표제 화합물의 트리에틸아민염을 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (11 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00332
실시예 35 : CDN25 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-(6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 162]
Figure pat00333
[합성 스킴]
[화학식 163]
Figure pat00334
(공정 1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-7-(6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
실시예 13 공정 4 에서 얻어진 화합물 (313 ㎎) 의 테트라하이드로푸란 (5.0 ㎖) 용액에, N-[(E)-(피리딘-2-일)메틸리덴]하이드록실아민 (337 ㎎) 과 N,N,N',N'-테트라메틸구아니딘 (0.346 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 1 일간 교반하였다. 반응액에 메탄올 (5.0 ㎖) 과 28 ％ 암모니아수 (5.0 ㎖) 를 첨가하고, 50 ℃ 에서 5 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (106 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (105 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 959(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 959(M＋H)＋.
(공정 2-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-7-(6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5, 10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (106 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1), 아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1) : 7 ％ - 50 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (43.4 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00335
(공정 2-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-7-(6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (105 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1), 아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1) : 7 ％ - 45 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (21.5 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00336
실시예 36 : CDN26 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-[1-(3-하이드록시프로필)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 164]
Figure pat00337
[합성 스킴]
[화학식 165]
Figure pat00338
(공정 1)
1-[3-(벤조일옥시)프로필]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]이노신
3-브로모프로판-1-올 (1.14 ㎖) 의 테트라하이드로푸란 (25 ㎖) 용액에, 트리에틸아민 (1.83 ㎖) 과 염화벤조일 (1.43 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 6 시간 교반하였다. 반응 용액을 여과하고, 테트라하이드로푸란으로 세정하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물의 탈수 N,N-디메틸아세트아미드 (25 ㎖) 용액에, 시판 (Aamdis Chemical) 되는 5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]이노신 (5.0 g) 과 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 (2.75 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 3 일간 교반하였다. 반응액에, 물을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (4.41 g) 을 얻었다.
Figure pat00339
(공정 2)
1-[3-(벤조일옥시)프로필]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]이노신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (4.41 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.60 g) 과 표제 화합물의 위치 이성체인 1-[3-(벤조일옥시)프로필]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]이노신 (1.70 g) 을 얻었다.
Figure pat00340
위치 이성체 (2'-O-TBS 체)
Figure pat00341
(공정 3)
1-[3-(벤조일옥시)프로필]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}이노신
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (1.60 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.91 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 67 : 33) 로서 얻었다.
Figure pat00342
(공정 4)
실시예 1 공정 7 과 동일한 반응을 이하의 스케일로 실시하였다 (원료 : 981 ㎎). 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액과 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.03 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 5)
3-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}프로필 벤조에이트
상기 공정 4 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (774 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1278(M＋H)＋.
(공정 6)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-[1-(3-하이드록시프로필)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (774 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법을 이용하여 반응을 실시하고, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [0.2 ％ 트리에틸아민 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (101 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (90.8 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1017(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1017(M＋H)＋.
(공정 7-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-[1-(3-하이드록시프로필)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (101 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (48.8 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00343
(공정 7-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-[1-(3-하이드록시프로필)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (90.8 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 3 ％ - 20 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (22.3 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00344
실시예 37 : CDN27 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[2-아미노-1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 166]
Figure pat00345
[합성 스킴]
[화학식 167]
Figure pat00346
(공정 1)
1-[2-(벤조일옥시)에틸]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-N-[(디메틸아미노)메틸리덴]구아노신
이미 알려진 문헌 (Journal of Organic Chemistry, 1994, 59, 7243-7248) 의 N-[(디메틸아미노)메틸리덴]구아노신 (10.0 g) 의 N,N-디메틸아세트아미드 (50 ㎖) - 피리딘 (50 ㎖) 혼합 용액에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (10.5 g) 를 0 ℃ 에서 첨가하고, 4 ℃ 에서 16 시간 교반하였다. 반응액에 벤조산2-브로모에틸 (6.54 ㎖) 과 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 (11.0 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 2 일간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액과 물을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물을 트리페닐포스핀옥사이드와의 혼합물 (16.7 g) 로서 얻었다.
Figure pat00347
(공정 2)
1-[2-(벤조일옥시)에틸]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-N-[(디메틸아미노)메틸리덴]구아노신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (15.7 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (4.82 g) 과 표제 화합물의 위치 이성체인 1-[2-(벤조일옥시)에틸]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-N-[(디메틸아미노)메틸리덴]구아노신 (6.01 g) 을 얻었다.
Figure pat00348
위치 이성체 (2'-O-TBS 체)
Figure pat00349
(공정 3)
1-[2-(벤조일옥시)에틸]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-N-[(디메틸아미노)메틸리덴]구아노신
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (4.81 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (5.41 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 7 : 3) 로서 얻었다.
Figure pat00350
(공정 4)
실시예 1 공정 7 과 동일한 반응을 이하의 스케일로 실시하였다 (원료 : 1.68 g). 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액과 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.81 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 5)
2-(9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-2-{(E)-[(디메틸아미노)메틸리덴]아미노}-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일)에틸 벤조에이트
상기 공정 4 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.15 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1334(M＋H)＋.
(공정 6)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[2-아미노-1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (1.15 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법을 이용하여 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (134 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (127 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1018(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1018(M＋H)＋.
(공정 7-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[2-아미노-1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (134 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 25 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (36.0 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00351
(공정 7-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[2-아미노-1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (127 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 3 ％ - 20 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (20.1 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00352
실시예 38 : CDN28 의 합성
N-[2-({6-아미노-9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-2-일}아미노)에틸]-2-하이드록시아세트아미드
[화학식 168]
Figure pat00353
[합성 스킴]
[화학식 169]
Figure pat00354
(공정 1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-2-{[2-(2-하이드록시아세트아미드)에틸]아미노}-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
실시예 8 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (6.6 ㎎) 을 사용하여, 실시예 7 공정 1-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 2 ％ - 30 ％ (0 분 - 30 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (2.9 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00355
실시예 39 : CDN29 의 합성
N-({6-아미노-9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-2-일}메틸)-2-하이드록시아세트아미드
[화학식 170]
Figure pat00356
[합성 스킴]
[화학식 171]
Figure pat00357
(공정 1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-하이드록시아세트아미드)메틸]-9H-푸린-9-일}-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
실시예 11 공정 9-2 에서 얻어진 화합물 (4.6 ㎎) 을 사용하여, 실시예 7 공정 1-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 2 ％ - 30 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (4.0 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00358
실시예 40 : CDN30 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-2-{[(1-아미노시클로프로필)메틸]아미노}-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 172]
Figure pat00359
[합성 스킴]
[화학식 173]
Figure pat00360
(공정 1-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-2-클로로-9H-푸린-9-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
실시예 8 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (590 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (420 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00361
(공정 1-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-2-클로로-9H-푸린-9-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
실시예 8 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (710 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (452 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00362
(공정 2-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-2-{[(1-아미노시클로프로필)메틸]아미노}-9H-푸린-9-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
1-(아미노메틸)시클로프로판-1-아민·2HCl (309 ㎎) 의 메탄올 (40 ㎖) 용액에, MP-Carbonate 레진 (5.45 g) 을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 레진을 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물의 메탄올 (0.837 ㎖) 용액을, 상기 공정 1-1 에서 얻어진 화합물 (30.0 ㎎) 에 첨가하고, 마이크로 웨이브 반응 장치를 사용하여, 120 ℃ 에서 4 시간 반응시켰다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 30 ％ - 60 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물을 포함하는 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물은 그대로 다음의 공정에 사용하였다.
MS(ESI)m/z : 1042(M＋H)＋.
(공정 2-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-2-{[(1-아미노시클로프로필)메틸]아미노}-9H-푸린-9-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 1-2 에서 얻어진 화합물 (58.6 ㎎) 을 사용하여, 상기 공정 2-1 과 동일한 수법에 의해 표제 화합물을 포함하는 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물은 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
MS(ESI)m/z : 1042(M＋H)＋.
(공정 3-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-2-{[(1-아미노시클로프로필)메틸]아미노}-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 2-1 에서 얻어진 혼합물을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 2 ％ - 20 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (2.0 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00363
(공정 3-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-2-{[(1-아미노시클로프로필)메틸]아미노}-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 2-2 에서 얻어진 혼합물을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법에 의해 표제 화합물을 포함하는 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물은 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 4)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[6-아미노-2-({[1-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)시클로프로필]메틸}아미노)-9H-푸린-9-일]-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 3-2 에서 얻어진 혼합물의 N,N-디메틸포름아미드 (1.0 ㎖) 용액에 트리에틸아민 (40.8 ㎕) 과 2,5-디옥소피롤리딘-1-일(2-(트리메틸실릴)에틸)카보네이트 (39.5 ㎎) 를 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응액에 물을 첨가하여 퀀치 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％ - 50 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (11.0 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00364
(공정 5)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-2-{[(1-아미노시클로프로필)메틸]아미노}-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (11.0 ㎎) 의 테트라하이드로푸란 (474 ㎕) 용액에, 불화테트라부틸암모늄의 테트라하이드로푸란 용액 (약 1 M, 237 ㎕) 을 첨가하고, 질소 분위기하, 40 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 반응액에 10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액을 첨가하여 퀀치 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 2 ％ - 30 ％ (0 분 - 30 분)] 및 Sep-Pak (등록상표) C18 [물/아세토니트릴/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (4.1 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00365
실시예 41 : CDN31 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-[2-(하이드록시메틸)-6-(메틸아미노)-9H-푸린-9-일]-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 174]
Figure pat00366
[합성 스킴]
[화학식 175]
Figure pat00367
(공정 1)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-[2-(하이드록시메틸)-6-(메틸아미노)-9H-푸린-9-일]-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
실시예 12 공정 7 에서 얻어진 디아스테레오머 2 (고극성) (56.5 ㎎) 의 메탄올 (1.00 ㎖) 용액에, 40 ％ 메틸아민 수용액 (1.00 ㎖) 을 첨가하고, 봉관 (封管) 중 60 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하여 표제 화합물을 포함하는 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
MS(ESI)m/z : 1002(M＋H)＋.
(공정 2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-[2-(하이드록시메틸)-6-(메틸아미노)-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 1 에서 얻어진 혼합물을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 2 ％ - 20 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (16.0 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00368
실시예 42 : CDN32 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15aS,16R)-16-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 176]
Figure pat00369
[합성 스킴]
[화학식 177]
Figure pat00370
(공정 1)
5-(3,3-디에톡시프로파-1-인-1-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
시판 (PharmaBlock) 되는 5-요오드-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 (22 g) 의 N,N-디메틸포르미아미드 (70 ㎖) 용액에, 요오드화구리 (1.61 g), 비스(트리페닐포스핀)팔라듐디클로라이드 (5.94 g), 및 트리에틸아민 (35 ㎖) 을 첨가하였다. 프로파르길알데히드디에틸아세탈 (22 ㎖) 을 2 시간 걸쳐 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응액에 클로로포름 (350 ㎖) 을 첨가하고, 물로 2 회 세정하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물에 아세트산에틸 (350 ㎖) 을 첨가하고, 밤새 교반하였다. 석출한 고체를 여과 채취하고, 표제 화합물 (9.60 g) 을 얻었다.
Figure pat00371
(공정 2)
5-(3,3-디에톡시프로필)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (17.9 g) 의 테트라하이드로푸란 (160 ㎖) - 에탄올 (80 ㎖) 혼합 용액에, 10 ％ 팔라듐탄소 (M) wet (25.0 g) 를 첨가하고, 수소 분위기하, 실온에서 밤새 교반하였다. 촉매를 셀라이트로 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하고, 표제 화합물 (17.0 g) 의 미정제체를 얻었다.
MS(ESI)m/z : 265(M＋H)＋.
(공정 3)
6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (50.21 g) 을 90 ％ 아세트산 수용액 (344 ㎖) 에 용해하고, 50 ℃ 에서 밤새 교반하였다. 원료의 소실을 확인 후, 반응액에 팔라듐탄소 (M) wet (60 g) 를 첨가하고, 수소 분위기하, 40 ℃ 에서 밤새 교반하였다. 촉매를 셀라이트로 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물에 포화 탄산수소나트륨 수용액 (350 ㎖) 을 첨가하고, 클로로포름/메탄올 (9 : 1) 로 7 회 추출하였다. 유기층을 감압 농축 후, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (18.47 g) 을 얻었다.
Figure pat00372
(공정 4)
페닐(2,7,8,9-테트라하이드로-6H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-6-일)메타논
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (8.47 g) 의 디클로로메탄 (120 ㎖) 현탁액에, 탈수 피리딘 (39.2 ㎖), N,N-디메틸아미노피리딘 (2.38 g), 및 염화벤조일 (22.6 ㎖) 을 차례로 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물에 클로로포름 (150 ㎖), 메탄올 (60 ㎖), 및 트리에틸아민 (50 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응액을 클로로포름과 물의 2 층에 따르고, 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 25 w/v％ 황산수소칼륨 수용액으로 2 회 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물에 아세트산에틸 (50 ㎖) 과 헥산 (125 ㎖) 을 차례로 첨가하여 슬러리상으로 한 후, 1 시간 교반하였다. 석출한 고체를 여과 채취하고, 표제 화합물 (9.89 g) 을 얻었다.
Figure pat00373
(공정 5)
6-벤조일-2-[2-데옥시-3,5-비스-O-(4-메틸벤조일)-β-D-에리트로-펜토퓨라노실]-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (7.10 g) 의 아세토니트릴 (80 ㎖) 현탁액에, 질소 분위기하, 분말상의 수산화칼륨 (2.9 g) 과 트리스[2-(2-메톡시에톡시)에틸]아민 (0.41 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 15 분간 교반하였다. 빙랭하, 이미 알려진 문헌 (Synlett 2004 (2) : 335-337) 의 2-데옥시-3,5-비스-O-(4-메틸벤조일)-α-D-에리트로-펜토퓨라노실클로라이드 (10.12 g) 와 아세토니트릴 (60 ㎖) 을 첨가하고, 실온까지 승온하고, 밤새 교반하였다. 반응액에 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 석출한 고체를 여과 채취한 후, 물로 세정하고, 표제 화합물 (9.70 g) 을 얻었다.
Figure pat00374
(공정 6)
6-벤조일-2-(2-데옥시-β-D-에리트로-펜토퓨라노실)-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (8.69 g) 의 메탄올 (45 ㎖) - 테트라하이드로푸란 (135 ㎖) 혼합 용액에, -10 ℃ 에서 2 규정 수산화나트륨 수용액 (27.6 ㎖) 을 20 분간 걸쳐 적하하였다. 동 온도에서 2 시간 교반 후, 1 규정 염산 (58 ㎖) 을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (4.09 g) 을 얻었다.
Figure pat00375
(공정 7)
6-벤조일-2-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-데옥시-β-D-에리트로-펜토퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (4.55 g) 을 사용하여, 실시예 11 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (6.38 g) 을 얻었다.
(관측 가능한 피크만 기재)
(공정 8)
6-벤조일-2-(5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-2-데옥시-β-D-에리트로-펜토퓨라노실)-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (6.37 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 6 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (6.05 g) 을 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 1 : 1) 로서 얻었다.
Figure pat00377
(공정 9)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (868 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 6-벤조일-2-{2-데옥시-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-에리트로-펜토퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 이 아세토니트릴 용액과 실시예 22 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.00 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 10)
2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15aS,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸 벤조에이트
상기 공정 9 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (702 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1134(M＋H)＋.
(공정 11)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15aS,16R)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (702 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법을 이용하여 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (119 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (113 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 873(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 873(M＋H)＋.
(공정 12-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15aS,16R)-16-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (119 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 30 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (51.8 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00378
(공정 12-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15aS,16R)-16-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (113 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 25 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (65.4 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00379
실시예 43 : CDN33 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15S,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 178]
Figure pat00380
[합성 스킴]
[화학식 179]
Figure pat00381
(공정 1)
1-(2,7,8,9-테트라하이드로-6H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-6-일)에탄-1-온
실시예 42 공정 3 에서 얻어진 화합물 (6.88 g) 을 무수 아세트산 (48 ㎖) 에 용해하고, 90 ℃ 에서 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물을 클로로포름 (100 ㎖) - 메탄올 (50 ㎖) - 트리에틸아민 (30 ㎖) 의 혼합액에 용해하였다. 실온에서 4 시간 교반 후, 반응액을 클로로포름과 물의 2 층에 따르고, 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물에 헥산/아세트산에틸 (1 : 2) 을 첨가하여 슬러리상으로 한 후, 고체를 여과 채취하고, 표제 화합물 (7.18 g) 을 얻었다.
Figure pat00382
(공정 2)
6-아세틸-2-(3,5-디-O-벤조일-2-데옥시-2-플루오로-β-D-아라비노퓨라노실)-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (6.00 g) 과 시판 (CARBOSYNTH) 되는 [(2R,3R,4S,5R)-3-벤조일옥시-5-브로모-4-플루오로-테트라하이드로푸란-2-일]메틸벤조에이트 (14.1 g) 를 사용하여, 실시예 42 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (11.45 g) 을 얻었다.
Figure pat00383
(공정 3)
6-아세틸-2-(2-데옥시-2-플루오로-β-D-아라비노퓨라노실)-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (8.70 g) 의 메탄올 (58 ㎖) - 테트라하이드로푸란 (117 ㎖) 혼합 용액에, -20 ℃ 에서 2 규정 수산화나트륨 수용액 (32 ㎖) 을 12 분간 걸쳐 적하하였다. 동 온도에서 3 시간 교반 후, 1 규정 염산 (66 ㎖) 을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (3.27 g) 을 얻었다.
Figure pat00384
(관측 가능한 피크만 기재)
(공정 4)
6-아세틸-2-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-데옥시-2-플루오로-β-D-아라비노퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (3.95 g) 을 사용하여, 실시예 11 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (5.66 g) 을 얻었다.
Figure pat00385
(공정 5)
6-아세틸-2-(5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-2-데옥시-2-플루오로-β-D-아라비노퓨라노실)-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (5.68 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 6 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (5.08 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 1 : 1) 로서 얻었다.
Figure pat00386
(공정 6)
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (1.00 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 6-아세틸-2-{2-데옥시-2-플루오로-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-아라비노퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 이 아세토니트릴 용액과 실시예 22 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.21 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 7)
2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15S,15aR,16R)-14-(6-아세틸-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-15-플루오로-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸 벤조에이트
상기 공정 6 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (757 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1090(M＋H)＋.
(공정 8)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15S,15aR,16R)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-15-플루오로-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (757 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법을 이용하여 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (113 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (108 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 891(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 891(M＋H)＋.
(공정 9-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15S,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (113 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 30 ％ (0 분 - 30 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (28.8 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00387
(공정 9-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15S,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (108 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 20 ％ (0 분 - 30 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (3.2 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00388
실시예 44 : CDN34 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 180]
Figure pat00389
[합성 스킴]
[화학식 181]
Figure pat00390
(공정 1)
6-벤조일-2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
실시예 1 공정 4 에서 얻어진 화합물 (35.80 g) 의 디클로로메탄 (322 ㎖) - 피리딘 (35 ㎖) 혼합 용액에, 빙랭하에서 불화수소-피리딘 (6.33 g) 의 디클로로메탄 (36 ㎖) 용액을 5 분간 걸쳐 첨가하고, 동 온도에서 3 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액 (268 ㎖) 과 포화 식염수 (143 ㎖) 를 차례로 첨가하여 반응을 정지시키고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물에 헥산/아세트산에틸 (1 : 1) (108 ㎖) 을 첨가하여 슬러리상으로 한 후, 50 ℃ 에서 30 분간 교반하고, 헥산 (161 ㎖) 을 추가하여 2 시간 더 교반하였다. 석출한 고체를 여과 채취하고, 헥산/아세트산에틸 (4 : 1) (143 ㎖) 로 세정하고, 표제 화합물 (26.81 g) 을 얻었다.
Figure pat00391
(공정 2)
6-벤조일-2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-비스-O-(옥산-2-일)-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (19.93 g) 과 3,4-디하이드로-2H-피란 (35 ㎖) 의 N,N-디메틸포르미아미드 (200 ㎖) 용액에, 빙랭하에서 p-톨루엔술폰산 1수화물 (7.25 g) 을 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 빙랭하에서 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지시키고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물과 포화 식염수로 차례로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (24.73 g) 을 얻었다.
Figure pat00392
(공정 3)
6-벤조일-2-[3,5-비스-O-(옥산-2-일)-β-D-리보퓨라노실]-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (24.73 g) 과 아세트산 (3.1 ㎖) 의 테트라하이드로푸란 (250 ㎖) 용액에, 빙랭하에서 불화테트라부틸암모늄의 테트라하이드로푸란 용액 (약 1 M, 55 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물에 아세트산에틸을 첨가하고, 물과 포화 식염수로 차례로 세정하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (18.74 g) 을 얻었다.
Figure pat00393
(공정 4)
6-벤조일-2-[3,5-비스-O-(옥산-2-일)-β-D-아라비노퓨라노실]-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (18.74 g) 과 피리딘 (13.1 ㎖) 의 디클로로메탄 (300 ㎖) 용액에, 빙랭하에서 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (11 ㎖) 을 적하하고 10 분간 교반하였다. 반응액에 포화 식염수를 첨가하여 반응을 정지시키고, 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 테트라하이드로푸란 (300 ㎖) 에 용해하고, 빙랭하에서 아질산테트라부틸암모늄 (28.34 g) 의 테트라하이드로푸란 (150 ㎖) 용액을 적하하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물에 아세트산에틸을 첨가하고, 물과 포화 식염수로 차례로 세정하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (10.46 g) 을 얻었다.
Figure pat00394
(공정 5)
6-벤조일-2-[2-데옥시-2-플루오로-3,5-비스-O-(옥산-2-일)-β-D-리보퓨라노실]-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (10.46 g) 과 피리딘 (7.3 ㎖) 의 디클로로메탄 (200 ㎖) 용액에, 빙랭하에서 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (6.1 ㎖) 을 적하하고 10 분간 교반하였다. 반응액에 포화 식염수를 첨가하여 반응을 정지시키고, 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 테트라하이드로푸란 (200 ㎖) 에 용해하고, 빙랭하에서 불화테트라부틸암모늄의 테트라하이드로푸란 용액 (약 1 M, 150 ㎖) 을 첨가하고, 동 온도에서 3 시간 교반하였다. 반응액에 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (7.65 g) 을 얻었다.
Figure pat00395
(공정 6)
6-벤조일-2-(2-데옥시-2-플루오로-β-D-리보퓨라노실)-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (7.65 g) 의 에탄올 (150 ㎖) 용액에, p-톨루엔술폰산피리디늄 (6.62 g) 을 첨가하고, 50 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물에 아세트산에틸을 첨가하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액과 포화 식염수로 차례로 세정하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (3.55 g) 을 얻었다.
Figure pat00396
(공정 7)
6-벤조일-2-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-데옥시-2-플루오로-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (3.55 g) 을 사용하여, 실시예 11 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (5.77 g) 을 얻었다.
Figure pat00397
(공정 8)
6-벤조일-2-(5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-2-데옥시-2-플루오로-β-D-리보퓨라노실)-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (5.77 g) 을 사용하여, 실시예 1 의 공정 6 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (5.95 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 1 : 1) 로서 얻었다.
Figure pat00398
(공정 9)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (1.02 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 6-벤조일-2-{2-데옥시-2-플루오로-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 얻어진 아세토니트릴 용액과 실시예 22 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.15 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 10)
2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-15-플루오로-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸 벤조에이트
상기 공정 9 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (818 ㎎ : 불순물 함유) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1152(M＋H)＋.
(공정 11)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-15-플루오로-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (818 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법을 이용하여 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (107 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (101 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 891(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 891(M＋H)＋.
(공정 12-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (107 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 30 ％ (0 분 - 30 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (29.1 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00399
(공정 12-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (101 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 20 ％ (0 분 - 30 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (11.2 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00400
실시예 45 : CDN35 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[1-(2-아미노에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 182]
Figure pat00401
[합성 스킴]
[화학식 183]
Figure pat00402
(공정 1)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-1-[2-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)에틸]이노신
시판 (Aamdis Chemical) 되는 5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]이노신 (13.0 g) 의 N,N-디메틸아세트아미드 (60 ㎖) 현탁액에, N-(2-브로모에틸)프탈이미드 (7.02 g) 와 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 (4.1 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. N-(2-브로모에틸)프탈이미드 (1.75 g) 와 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 (1.1 ㎖) 을 추가하고, 1 일간 더 교반하였다. 반응액에 물을 첨가하여 반응을 정지시키고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [아세트산에틸/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (12.4 g) 을 얻었다.
Figure pat00403
(공정 2)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-[2-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)에틸]이노신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (12.4 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (4.18 g) 과 표제 화합물의 위치 이성체인 5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-[2-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)에틸]이노신 (6.31 g) 을 얻었다.
Figure pat00404
위치 이성체 (2'-O-TBS 체)
Figure pat00405
(공정 3)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-1-[2-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)에틸]이노신
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (8.89 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 6 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (9.45 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 1 : 1) 로서 얻었다.
Figure pat00406
(공정 4)
실시예 44 공정 8 에서 얻어진 화합물 (1.30 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 6-벤조일-2-{2-데옥시-2-플루오로-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 얻어진 아세토니트릴 용액과 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.50 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 5)
3-{[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-{1-[2-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)에틸]-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일}-15-플루오로-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-10-일]옥시}프로판니트릴
상기 공정 4 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (828 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1177(M＋H)＋.
(공정 6)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[1-(2-아미노에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-15-플루오로-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (828 ㎎) 의 에탄올 (5.0 ㎖) - 테트라하이드로푸란 (5.0 ㎖) 혼합 용액에, 하이드라진 1수화물 (0.342 ㎖) 을 첨가하고, 50 ℃ 에서 6 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (90.9 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (91.1 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 890(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 890(M＋H)＋.
(공정 7-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[1-(2-아미노에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (90.9 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1), 아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1) : 10 ％ - 50 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (20.2 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00407
(공정 7-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[1-(2-아미노에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (91.1 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1), 아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1) : 10 ％ - 45 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (26.3 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00408
실시예 46 : CDN36 의 합성
N-(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸)-2-하이드록시아세트아미드
[화학식 184]
Figure pat00409
[합성 스킴]
[화학식 185]
Figure pat00410
(공정 1-1)
디나트륨 (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aS,16R)-16-플루오로-15-하이드록시-7-{1-[2-(2-하이드록시아세트아미드)에틸]-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
실시예 45 공정 7-1 에서 얻어진 화합물 (15.0 ㎎) 을 사용하여, 실시예 7 공정 1-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1), 아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1) : 10 ％ - 45 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (10.3 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00411
(공정 1-2)
디나트륨 (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aS,16R)-16-플루오로-15-하이드록시-7-{1-[2-(2-하이드록시아세트아미드)에틸]-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
실시예 45 공정 7-2 에서 얻어진 화합물 (15.0 ㎎) 을 사용하여, 실시예 7 공정 1-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1), 아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1) : 10 ％ - 45 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (10.6 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00412
실시예 47 : CDN37 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 186]
Figure pat00413
[합성 스킴]
[화학식 187]
Figure pat00414
(공정 1)
2-[(2-아자니우밀에틸)아미노]아데노신 디클로라이드
이미 알려진 문헌 (WO2012/159072) 의 2-({2-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]에틸}아미노)아데노신 (28.7 g) 의 메탄올 (240 ㎖) 용액에, 염화수소의 디옥산 용액 (약 4 M, 240 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응액을 50 ㎖ 정도까지 감압 농축 후, 석출한 고체를 디에틸에테르로 현탁시켜 여과 채취하고, 표제 화합물 (28.8 g) 을 얻었다.
Figure pat00415
(공정 2)
2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}아데노신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (28.8 g) 의 테트라하이드로푸란 (330 ㎖) - 물 (70 ㎖) 혼합액에 트리에틸아민 (37 ㎖) 과 1-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온 (18.4 g) 을 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 톨루엔으로 공비하였다. 잔류물을 톨루엔에 현탁시키고, 고체를 여과 채취하였다. 얻어진 고체를 디클로로메탄과 메탄올에 용해시키고, 감압 농축하였다. 잔류물에 테트라하이드로푸란을 첨가하고, 석출한 고체를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 디클로로메탄과 메탄올에 용해시키고, 감압 농축하였다. 석출한 고체를 디클로로메탄에 현탁시켜 여과 채취하고, 표제 화합물 (22.5 g) 을 얻었다.
Figure pat00416
(공정 3)
N-벤조일-2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}아데노신
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (24.7 g) 을 사용하여, 실시예 11 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (22.1 g) 을 얻었다.
Figure pat00417
(공정 4)
N-벤조일-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}아데노신
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (22.1 g) 을 사용하여, 실시예 11 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (29.5 g) 을 얻었다.
Figure pat00418
(공정 5)
N-벤조일-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}아데노신
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (29.5 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (6.85 g) 을 얻었다.
Figure pat00419
(공정 6)
N-벤조일-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}아데노신
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (6.22 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 6 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (6.18 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 1 : 1) 로서 얻었다.
Figure pat00420
(공정 7)
실시예 44 공정 8 에서 얻어진 화합물 (1.03 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 6-벤조일-2-{2-데옥시-2-플루오로-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 얻어진 아세토니트릴 용액과 상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (999 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 8)
2-(트리메틸실릴)에틸 [2-({6-벤즈아미드-9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-15-플루오로-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-2-일}아미노)에틸]카르바메이트
상기 공정 7 에서 얻어진 혼합물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (370 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (201 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1307(M-H)-.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1307(M-H)-.
(공정 9-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}-9H-푸린-9-일)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-15-플루오로-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (370 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (134 ㎎ : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1048(M＋H)＋.
(공정 9-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}-9H-푸린-9-일)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-15-플루오로-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (201 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (49.1 ㎎ : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1048(M＋H)＋.
(공정 10-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 9-1 에서 얻어진 화합물 (134 ㎎) 을 사용하여 실시예 40 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (22 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00421
(공정 10-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 9-2 에서 얻어진 화합물 (49.1 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 40 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (21 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00422
실시예 48 : CDN38 의 합성
(5S,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS)-15-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 188]
Figure pat00423
[합성 스킴]
[화학식 189]
Figure pat00424
(공정 1)
1-[2-(벤조일옥시)에틸]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3'-O-(1H-이미다졸-1-카르보티오일)이노신
실시예 22 공정 2 에서 얻어진 화합물 (2'-O-TBS 체) (1.45 g) 의 N,N-디메틸포름아미드 (8.7 ㎖) 용액에, 실온에서 N,N-디메틸-4-아미노피리딘 (213 ㎎) 과 디(1H-이미다졸-1-일)메탄티온 (1.55 g) 을 첨가하고, 20 시간 교반하였다. 반응액을 아세트산에틸로 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액과 포화 식염수로 차례로 세정하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (1.58 g) 을 얻었다.
Figure pat00425
(공정 2)
1-[2-(벤조일옥시)에틸]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3'-데옥시이노신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (1.69 g) 의 벤젠 (10 ㎖) 용액에, 실온에서 수소화트리부틸주석 (1.42 ㎖) 과 2,2'-아조비스(이소부티로니트릴) (29.4 ㎎) 을 첨가하고, 80 ℃ 에서 4 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (1.12 g) 을 얻었다.
Figure pat00426
(공정 3)
1-[2-(벤조일옥시)에틸]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-데옥시이노신
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (1.75 g) 의 테트라하이드로푸란 (11 ㎖) 용액에, 0 ℃ 에서 불화테트라부틸암모늄의 테트라하이드로푸란 용액 (약 1 M, 2.6 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (1.29 g) 을 얻었다.
Figure pat00427
(관측 가능한 피크만 기재)
(공정 4)
1-[2-(벤조일옥시)에틸]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-3'-데옥시이노신
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.28 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.47 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 1 : 1) 로서 얻었다.
Figure pat00428
(공정 5)
실시예 1 공정 7 과 동일한 반응을 이하의 스케일로 실시하였다 (원료 : 836 ㎎). 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액과 상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (735 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 6)
2-{9-[(5S,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸 벤조에이트
상기 공정 5 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (67.6 ㎎) 과 디아스테레오머 2 (91.6 ㎎) 를 얻었다 (HPLC 의 유지 시간 : 디아스테레오머 1 ＞ 2).
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1134(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1134(M＋H)＋.
(공정 7-1)
(5S,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR)-15-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (67.6 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법을 이용하여 반응을 실시하고, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 0 ％ - 50 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (34.9 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 873(M＋H)＋.
(공정 7-2)
(5S,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR)-15-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (91.6 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법을 이용하여 반응을 실시하고, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 0 ％ - 50 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (44.2 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 873(M＋H)＋.
(공정 8-1)
디나트륨 (5S,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS)-15-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 7-1 에서 얻어진 화합물 (34.9 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, Sep-Pak (등록상표) C18 [0.1 ％ 트리에틸아민 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (21.9 ㎎) 을 얻었다.
(공정 8-2)
디나트륨 (5S,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS)-15-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 7-2 에서 얻어진 화합물 (44.2 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, Sep-Pak (등록상표) C18 [0.1 ％ 트리에틸아민 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (26.5 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00430
실시예 49 : CDN39 의 합성
(5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aS,16R)-16-플루오로-15-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 190]
Figure pat00431
[합성 스킴]
[화학식 191]
Figure pat00432
(공정 1)
1-[2-(벤조일옥시)에틸]-2'5'-비스-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]이노신
시판 (Amadis Chemical) 되는 5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]이노신 (20.0 g) 의 피리딘 (50 ㎖) - N,N-디메틸아세트아미드 (70.1 ㎖) 혼합 용액에, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (12.5 g), 2-브로모에틸벤조에이트 (6.60 ㎖), 및 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 (13.1 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 20 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액과 물을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (24.1 g : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1121(M＋H)＋.
(공정 2)
1-[2-(벤조일옥시)에틸]-2'5'-비스-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-(트리플루오로메탄술포닐)이노신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (24.1 g) 의 디클로로메탄 (120 ㎖) 용액에, 피리딘 (19.0 ㎖) 을 첨가한 후, 0 ℃ 에서 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (5.96 ㎖) 을 천천히 적하하고, 동 온도에서 1 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액과 물을 첨가하여 반응을 정지 후, 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (19.7 g : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1153(M＋H)＋.
(공정 3)
9-{2,5-비스-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-β-D-자일로퓨라노실}-1-(2-하이드록시에틸)-1,9-디하이드로-6H-푸린-6-온
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (19.7 g) 의 N,N-디메틸포름아미드 (85.4 ㎖) 용액에, 아세트산세슘 (8.20 g) 을 첨가하고, 실온에서 16 시간 교반하였다. 반응액에, 메탄올 (85.4 ㎖) 과 탄산칼륨 (4.72 g) 을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응액에 물을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (12.2 g : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 917(M＋H)＋.
(공정 4)
1-[2-(벤조일옥시)에틸]-9-{2,5-비스-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-β-D-자일로퓨라노실}-1,9-디하이드로-6H-푸린-6-온
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (12.2 g) 의 디클로로메탄 (48.8 ㎖) 용액에, 피리딘 (1.61 ㎖) 과 무수 벤조산 (3.16 g) 을 첨가하고, 실온에서 64 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액과 물을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (7.36 g : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1021(M＋H)＋.
(공정 5)
1-[2-(벤조일옥시)에틸]-2'5'-비스-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-데옥시-3'-플루오로이노신
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (7.36 g) 의 디클로로메탄 (37.0 ㎖) 용액에, 2,6-루티딘 (3.34 ㎖) 을 첨가한 후, -78 ℃ 에서 3불화N,N-디에틸아미노황 (1.42 g) 을 첨가하고, 질소 분위기하, 서서히 실온까지 승온한 후, 밤새 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 천천히 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 물을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸 0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (6.89 g : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1023(M＋H)＋.
(공정 6)
1-[2-(벤조일옥시)에틸]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-데옥시-3'-플루오로이노신
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (6.89 g) 의 디클로로메탄 (25.0 ㎖) 용액에, 물 (0.303 ㎖) 과 디클로로아세트산 (1.39 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 63 시간 교반하였다. 반응액에 피리딘 (2.0 ㎖) 을 첨가하고, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올] 및 DIOL 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 조정제하였다. 얻어진 화합물의 피리딘 (25.0 ㎖) 용액에, 0 ℃ 에서 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (1.83 g) 를 첨가하고, 4 ℃ 에서 21 시간 교반하였다. 반응액에 메탄올 (1.0 ㎖) 을 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 교반한 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (1.33 g) 을 얻었다.
Figure pat00433
(공정 7)
1-[2-(벤조일옥시)에틸]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-3'-데옥시-3'-플루오로이노신
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (1.33 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.49 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 1 : 1) 로서 얻었다.
Figure pat00434
(공정 8)
실시예 1 공정 7 과 동일한 반응을 이하의 스케일로 실시하였다 (원료 : 948 ㎎). 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액과 상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (850 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 9)
2-{9-[(5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-16-플루오로-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸벤조에이트
상기 공정 8 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (709 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1152(M＋H)＋.
(공정 10)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-16-플루오로-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (709 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법을 이용하여 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (108 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (102 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 891(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 891(M＋H)＋.
(공정 11-1)
디나트륨 (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aS,16R)-16-플루오로-15-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (108 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 3 ％ - 30 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (40.1 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00435
(공정 11-2)
디나트륨 (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aS,16R)-16-플루오로-15-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (102 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 3 ％ - 25 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (26.7 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00436
실시예 50 : CDN40 의 합성
(5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[1-(2-아미노에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-16-플루오로-15-하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 192]
Figure pat00437
[합성 스킴]
[화학식 193]
Figure pat00438
(공정 1)
3'-데옥시-3'-플루오로이노신
시판 (Angene) 되는 3'-데옥시-3'-플루오로아데노신 (2.38 g) 의 아세트산 (120 ㎖) 용액에, 아질산나트륨 (6.10 g) 의 수용액 (48 ㎖) 을 조금씩 첨가하고, 실온에서 43 시간 교반하였다. 반응 용액을 감압 농축하고, 톨루엔으로 2 회 공비하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (3.76 g) 을 얻었다.
Figure pat00439
(공정 2)
3'-데옥시-1-[2-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)에틸]-3'-플루오로이노신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (3.76 g) 의 N,N-디메틸아세트아미드 (37.6 ㎖) 용액에, 2-(2-브로모에틸)-1H-이소인돌-1,3(2H)-디온 (6.60 ㎖) 과 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 (3.12 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 3 일간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (3.51 g : 불순물 함유) 을 얻었다.
Figure pat00440
(공정 3)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-데옥시-1-[2-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)에틸]-3'-플루오로이노신
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (3.51 g) 을 사용하여, 실시예 11 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (4.05 g) 을 얻었다.
Figure pat00441
(공정 4)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-3'-데옥시-1-[2-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)에틸]-3'-플루오로이노신
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (4.05 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (4.35 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 1 : 1) 로서 얻었다.
Figure pat00442
(공정 5)
실시예 1 공정 7 과 동일한 반응을 이하의 스케일로 실시하였다 (원료 : 1.47 g). 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액과 상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.35 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 6)
3-{[(5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-{1-[2-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)에틸]-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일}-16-플루오로-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-10-일]옥시}프로판니트릴
상기 공정 5 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.25 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1177(M＋H)＋.
(공정 7)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[1-(2-아미노에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-15-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-16-플루오로-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (1.25 g) 의 에탄올 (7.5 ㎖) - 테트라하이드로푸란 (7.5 ㎖) 혼합 용액에, 하이드라진 1수화물 (0.599 ㎖) 을 첨가하고, 50 ℃ 에서 6 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (145 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (198 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다 (HPLC 의 유지 시간 : 디아스테레오머 1 ＞ 2).
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 890(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 890(M＋H)＋.
(공정 8-1)
디나트륨 (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[1-(2-아미노에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-16-플루오로-15-하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (145 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1), 아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1) : 5 ％ - 50 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (70.7 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00443
(공정 8-2)
디나트륨 (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-[1-(2-아미노에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-16-플루오로-15-하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (198 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1), 아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1) : 5 ％ - 50 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (69.7 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00444
실시예 51 : CDN41 의 합성
N-(2-{9-[(5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aS,16R)-16-플루오로-15-하이드록시-2,10-디옥소-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸)-2-하이드록시아세트아미드
[화학식 194]
Figure pat00445
[합성 스킴]
[화학식 195]
Figure pat00446
(공정 1-1)
디나트륨 (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aS,16R)-16-플루오로-15-하이드록시-7-{1-[2-(2-하이드록시아세트아미드)에틸]-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
실시예 50 공정 8-1 에서 얻어진 화합물 (25.0 ㎎) 을 사용하여, 실시예 7 공정 1-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 30 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (18.6 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00447
(공정 1-2)
디나트륨 (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aS,16R)-16-플루오로-15-하이드록시-7-{1-[2-(2-하이드록시아세트아미드)에틸]-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
실시예 50 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (15.0 ㎎) 을 사용하여, 실시예 7 공정 1-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 30 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (7.4 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00448
실시예 52 : CDN42 의 합성
(5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-16-플루오로-15-하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 196]
Figure pat00449
[합성 스킴]
[화학식 197]
Figure pat00450
(공정 1)
2'5'-비스-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-요오드아데노신
시판 (Amadis Chemical) 되는 2-요오드아데노신 (1.35 g) 을 피리딘으로 3 회 공비하였다. 잔류물의 탈수 피리딘 (17.0 ㎖) 용액에, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (2.35 g) 를 첨가하고, 질소 분위기, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응액에 메탄올 (5.00 ㎖) 을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (1.96 g : 불순물 함유) 을 얻었다.
Figure pat00451
(공정 2)
2'5'-비스-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-요오드-3'-O-(트리플루오로메탄술포닐)아데노신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (100 ㎎) 을 톨루엔으로 3 회 공비하였다. 잔류물의 탈수 디클로로메탄 (1.0 ㎖) 용액에, 질소 분위기하, 0 ℃ 에서 피리딘 (0.20 ㎖) 과 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (27.0 ㎕) 을 첨가하고, 동 온도에서 80 분간 교반하였다. 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (27.0 ㎕) 을 추가하고, 80 분간 더 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (57.2 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00452
(공정 3)
9-{2,5-비스-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-β-D-자일로퓨라노실}-2-요오드-9H-푸린-6-아민
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (2.76 g) 의 N,N-디메틸포르미아미드 (24.4 ㎖) 용액에 아세트산세슘 (1.20 g) 을 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응액에 메탄올 (24.4 ㎖) 과 탄산칼륨 (675 ㎎) 을 첨가하고, 추가로 2 시간 교반하였다. 반응액에 물을 첨가하여 고체를 석출시킨 후, 감압하에서 메탄올 성분을 증류 제거하였다. 얻어진 고체 여과 채취하여 표제 화합물 (2.38 g) 을 얻었다.
Figure pat00453
(공정 4)
2'5'-비스-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-데옥시-3'-플루오로-2-요오드아데노신
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (2.54 g) 의 디클로로메탄 (17.0 ㎖) 용액에, 피리딘 (1.13 ㎖) 을 첨가한 후, 빙랭하에서 3불화N,N-디에틸아미노황 (0.397 ㎖) 을 첨가하고, 질소 분위기하, 실온에서 40 분간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (2.02 g : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1000(M＋H)＋.
(공정 5)
3'-데옥시-3'-플루오로-2-요오드아데노신
상기 공정 4 에서 얻어진 혼합물 (2.02 g) 의 디클로로메탄 용액 (20.2 ㎖) 에, 빙랭하, 물 (0.364 ㎖) 과 디클로로아세트산 (0.996 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 15 분간 교반하였다. 반응액에 피리딘 (1.95 ㎖) 을 첨가하여 반응을 정지 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (1.34 g : 불순물 함유) 을 얻었다.
(관측 가능한 피크만 기재)
(공정 6)
2-[(2-아미노에틸)아미노]-3'-데옥시-3'-플루오로아데노신
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (1.34 g) 에 에틸렌디아민 (1.35 ㎖) 을 첨가하고, 110 ℃ 에서 1 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물을 C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물 (543 ㎎ : 불순물 함유) 을 얻었다.
Figure pat00455
(공정 7)
3'-데옥시-3'-플루오로-2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}아데노신
상기 공정 6 에서 얻은 화합물 (543 ㎎) 의 테트라하이드로푸란 용액 (10 ㎖) 에, 1-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온 (961 ㎎), N,N-디메틸포름아미드 (5.0 ㎖), 및 메탄올 (5.0 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 1.5 시간 교반하였다. 1-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온 (800 ㎎) 을 추가하고, 40 분간 더 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (483 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00456
(공정 8)
N-벤조일-3'-데옥시-3'-플루오로-2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}아데노신
상기 공정 7 에서 얻은 화합물 (483 ㎎) 을 사용하여, 실시예 11 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (374 ㎎) 을 얻었다.
(관측 가능한 피크만 기재)
(공정 9)
N-벤조일-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-데옥시-3'-플루오로-2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}아데노신
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (374 ㎎) 을 사용하여, 실시예 11 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (398 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00458
(공정 10)
N-벤조일-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-3'-데옥시-3'-플루오로-2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}아데노신
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (398 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 6 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (434 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 1 : 1) 로서 얻었다.
Figure pat00459
(공정 11)
화합물 A :
N,N-디에틸에탄아미늄 (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-벤즈아미드-2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}-9H-푸린-9-일)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-16-플루오로-2-옥소-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2-티올레이트
화합물 B :
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-벤즈아미드-2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}-9H-푸린-9-일)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-16-플루오로-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
실시예 1 공정 7 과 동일한 반응을 이하의 스케일로 실시하였다 (원료 : 502 ㎎). 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액과 상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (434 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 및 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 A 의 디아스테레오머 1 (43.9 ㎎) 및 디아스테레오머 2 (27.0 ㎎), 그리고 표제 화합물 B 의 디아스테레오머 1 (55.0 ㎎) 및 디아스테레오머 2 (121 ㎎) 를 얻었다 (각각 불순물 함유).
화합물 A 의 디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1309(M＋H)＋.
화합물 A 의 디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1309(M＋H)＋.
화합물 B 의 디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1256(M＋H)＋.
화합물 B 의 디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1256(M＋H)＋.
(공정 12-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}-9H-푸린-9-일)-15-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-16-플루오로-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 A (디아스테레오머 1) (43.9 ㎎) 를 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1048(M＋H)＋.
(공정 12'-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}-9H-푸린-9-일)-15-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-16-플루오로-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 B (디아스테레오머 1) (55.0 ㎎) 를 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1048(M＋H)＋.
(공정 12-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}-9H-푸린-9-일)-15-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-16-플루오로-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 A (디아스테레오머 2) (27.0 ㎎ : 불순물 함유) 를 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1048(M＋H)＋.
(공정 13-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}-9H-푸린-9-일)-16-플루오로-15-하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 12-1 및 12'-1 에서 얻어진 화합물을 아울러, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (36.4 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 934(M＋H)＋.
(공정 13-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}-9H-푸린-9-일)-16-플루오로-15-하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 12-2 에서 얻어진 화합물을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (12.4 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 934(M＋H)＋.
(공정 14-1)
디나트륨 (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-16-플루오로-15-하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 13-1 에서 얻어진 화합물 (36.4 ㎎) 을 사용하여, 실시예 40 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 2 ％ - 30 ％ (0 분 - 40 분)] 및 Sep-Pak (등록상표) C18 [물/아세토니트릴/0.1 ％ 트리에틸아민].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (21.0 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00460
(공정 14-2)
비스(N,N,N-트리부틸부탄-1-아미늄) (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-16-플루오로-15-하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 13-2 에서 얻어진 화합물 (29.5 ㎎) 을 사용하여, 실시예 40 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물 (24.2 ㎎ : 불순물 함유) 을 얻었다.
[정제 조건] 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 2 ％ - 30 ％ (0 분 - 30 분)], Sep-Pak (등록상표) C18 [물/아세토니트릴/0.1 ％ 트리에틸아민], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％ - 25 ％ (0 분 - 30 분)].
Figure pat00461
(공정 14-2')
디나트륨 (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-16-플루오로-15-하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 14-2 에서 얻어진 화합물 (19.0 ㎎ : 불순물 함유) 을, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％ - 25 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하였다.
얻어진 화합물을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (8.4 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00462
실시예 53 : CDN43 의 합성
(5S,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-16-아미노-7-(2-아미노-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-15-하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 198]
Figure pat00463
[합성 스킴]
[화학식 199]
Figure pat00464
(공정 1)
2'-O-아세틸-3'-아지드-5'-O-벤조일-3'-데옥시-N-(2-메틸프로파노일)구아노신
이미 알려진 문헌 (Recl. Trav. Chim. Pay-Bas 1986, 105, 85-91) 의 1,2-디-O-아세틸-3-아지드-5-O-벤조일-3-데옥시-D-리보퓨라노스 (4.0 g) 의 아세토니트릴 (60 ㎖) 용액에, N2-이소부티릴구아닌 (3.65 g) 과 N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아미드 (8.08 ㎖) 를 실온에서 첨가하고, 70 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 트리메틸실릴트리플루오로메탄술포네이트 (2.98 ㎖) 를 70 ℃ 에서 첨가하고, 동 온도에서 1 일간 교반하였다. 반응액을 냉각 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지시키고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (4.82 g) 을 얻었다.
Figure pat00465
(공정 2)
3'-아지드-3'-데옥시-N-(2-메틸프로파노일)구아노신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (5.48 g) 의 테트라하이드로푸란 (64 ㎖) - 메탄올 (32 ㎖) 혼합 용액에, 5 M 수산화나트륨 (17 ㎖) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 15 분간 교반하였다. 반응액에 아세트산 (5.08 ㎖) 을 첨가하여 반응을 정지시키고, 반응액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (3.8 g) 을 얻었다.
Figure pat00466
(공정 3)
3'-아지드-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-데옥시-N-(2-메틸프로파노일)구아노신
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (3.8 g) 을 사용하여, 실시예 11 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (5.78 g) 을 얻었다.
Figure pat00467
(공정 4)
3'-아미노-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-데옥시-N-(2-메틸프로파노일)구아노신
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (5.17 g) 의 메탄올 (60 ㎖) 용액에, 트리페닐포스핀 (3.98 g) 을 첨가하고, 실온에서 4 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (2.22 g) 을 얻었다.
Figure pat00468
(공정 5)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-데옥시-N-(2-메틸프로파노일)-3'-(2,2,2-트리플루오로아세트아미드)구아노신
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (2.22 g) 의 N,N-디메틸포름아미드 (20 ㎖) 용액에, 트리플루오로아세트산에틸 (4.0 ㎖) 을 첨가하고, 50 ℃ 에서 2 일간 교반하였다. 반응액을 냉각 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지시키고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (2.06 g) 을 얻었다.
Figure pat00469
(공정 6)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-3'-데옥시-N-(2-메틸프로파노일)-3'-(2,2,2-트리플루오로아세트아미드)구아노신
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (1.0 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (780 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
(공정 7)
2-메틸프로판-2-아미늄 6-벤조일-2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3-O-[옥사이드(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
실시예 1 공정 6 에서 얻어진 화합물 (5.0 g) 의 아세토니트릴 (30 ㎖) 용액에, 물 (0.18 ㎖) 과 트리플루오로아세트산피리딘염 (1.2 g) 을 첨가하고, 실온에서 30 분간 교반하였다. 반응액에 tert-부틸아민 (30 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 30 분간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 아세토니트릴로 2 회 공비하였다. 잔류물의 디클로로메탄 (50 ㎖) 용액에 물 (0.88 ㎖) 과 디클로로아세트산 (3.2 ㎖) 의 디클로로메탄 (50 ㎖) 용액을 차례로 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 메탄올 (5 ㎖) 과 피리딘 (6.3 ㎖) 을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 반응액을 감압 농축하였다. 잔류물을 DIOL 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸 → 디클로로메탄/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (3.0 g) 을 얻었다.
Figure pat00470
(공정 8)
디뉴클레오티드 A
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (543 ㎎) 의 디클로로메탄 (6.0 ㎖) - 아세토니트릴 (6.0 ㎖) 혼합 용액에, 몰레큘러 시브스 3A, 1/16 (500 ㎎) 과 4,5-디시아노이미다졸 (126 ㎎) 을 첨가하고, 실온에서 15 분간 교반하였다. 반응액에 상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (780 ㎎) 을 첨가하고, 5 시간 교반 후, N,N-디메틸-N'-(3-술파닐리덴-3H-1,2,4-디티아졸-5-일)메탄이미드아미드 (219 ㎎) 를 첨가하고, 추가로 2 시간 교반하였다. 반응액으로부터 몰레큘러 시브스 3A 를 여과 제거하고, 여과액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하였다. 얻어진 화합물 (740 ㎎) 의 디클로로메탄 (6.0 ㎖) 용액에, 물 (0.086 ㎖) 과 디클로로아세트산 (0.158 ㎖) 의 디클로로메탄 (6.0 ㎖) 용액을 차례로 첨가하고, 실온에서 1.5 시간 교반하였다. 피리딘 (0.31 ㎖) 을 첨가하여 반응을 정지 후, 반응액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (520 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1168(M＋H)＋.
(공정 9)
N-{9-[(5S,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴-16-(2,2,2-트리플루오로아세트아미드)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-2-일}-2-메틸프로판아미드
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (270 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (110 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1182(M＋H)＋.
(공정 10)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5S,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-16-아미노-7-(2-아미노-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-15-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (110 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법을 이용하여 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (34.2 ㎎) 과 디아스테레오머 2 (19.3 ㎎) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 859(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 859(M＋H)＋.
(공정 11-1)
디나트륨 (5S,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-16-아미노-7-(2-아미노-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-15-하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (34.2 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (8.9 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00471
(공정 11-2)
디나트륨 (5S,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-16-아미노-7-(2-아미노-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-15-하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (19.3 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (5.6 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00472
실시예 54 : CDN44 의 합성
(5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-디플루오로-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 200]
Figure pat00473
[합성 스킴]
[화학식 201]
Figure pat00474
(공정 1)
실시예 44 공정 8 에서 얻어진 화합물 (636 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 6-벤조일-2-{2-데옥시-2-플루오로-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 얻어진 아세토니트릴 용액과 실시예 49 공정 7 에서 얻어진 화합물 (640 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 2)
2-{9-[(5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-10-(2-시아노에톡시)-15,16-디플루오로-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸벤조에이트
상기 공정 1 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (228 ㎎ : 불순물 함유) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1040(M＋H)＋.
(공정 3)
디나트륨 (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-디플루오로-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (228 ㎎) 을 메탄올 (5 ㎖) 과 28 ％ 암모니아 수용액 (5 ㎖) 에 용해하고, 60 ℃ 에서 12 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 30 ％ (0 분 - 40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1), 아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1) : 7 ％ - 50 ％ (0 분 - 40 분)] 로 차례로 정제하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 과 디아스테레오머 2 를 각각 트리에틸아민염으로서 얻었다 (HPLC 의 유지 시간 : 디아스테레오머 1 ＞ 2).
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (12.5 ㎎) 과 디아스테레오머 2 (15.8 ㎎) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
Figure pat00475
디아스테레오머 2 (고극성)
Figure pat00476
실시예 55 : CDN45 의 합성
(5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-디플루오로-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 202]
Figure pat00477
[합성 스킴]
[화학식 203]
Figure pat00478
(공정 1)
실시예 44 공정 8 에서 얻어진 화합물 (696 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 6-벤조일-2-{2-데옥시-2-플루오로-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 얻어진 아세토니트릴 용액과 실시예 52 공정 10 에서 얻어진 화합물 (738 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 2)
2-(트리메틸실릴)에틸 [2-({6-벤즈아미드-9-[(5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-10-(2-시아노에톡시)-15,16-디플루오로-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-2-일}아미노)에틸]카르바메이트
상기 공정 1 에서 얻어진 혼합물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물을 포함하는 혼합물 (1.31 g) 을 얻었다. 얻어진 혼합물은 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
MS(ESI)m/z : 1195(M-H)-.
(공정 3)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}-9H-푸린-9-일)-15,16-디플루오로-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 2 에서 얻어진 혼합물 (1.31 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (249 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (344 ㎎ : 불순물 함유) 를 각각 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 936(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 936(M＋H)＋.
(공정 4-1)
디나트륨 (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-디플루오로-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (249 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 40 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％ - 40 ％ (0 분 - 30 분)] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 0 ％ - 30 ％ (0 분 - 30 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (9.2 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00479
(공정 4-2)
디나트륨 (5R,7R,8S,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-15,16-디플루오로-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (344 ㎎ : 불순물 포함한다) 을 사용하여, 실시예 40 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％ - 40 ％ (0 분 - 30 분)] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％ - 30 ％ (0 분 - 30 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (4.7 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00480
실시예 56 : CDN46 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15S,15aR,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)데카하이드로-2H,10H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-시클로펜타[l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 204]
Figure pat00481
[합성 스킴]
[화학식 205]
Figure pat00482
(공정 1)
(1R,2S,3R,5R)-3-(4-클로로-5-요오드-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)-5-(하이드록시메틸)시클로펜탄-1,2-디올
이미 알려진 문헌 (WO2015/199136) 의 7-[(3aS,4R,6R,6aR)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로-2H,3aH-시클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일]-4-클로로-5-요오드-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (6.0 g) 에, 트리플루오로아세트산 (36 ㎖) 과 물 (12 ㎖) 을 차례로 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 표제 화합물의 미정제체를 얻었다. 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 2)
(1R,2S,3R,5R)-3-(4-아미노-5-요오드-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)-5-(하이드록시메틸)시클로펜탄-1,2-디올
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (4.4 g) 의 1,4-디옥산 (40 ㎖) 용액에, 28 ％ 암모니아수 (40 ㎖) 를 첨가하고, 90 ℃ 에서 72 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [물/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (3.4 g) 을 얻었다.
Figure pat00483
(공정 3)
7-[(4aR,6R,7S,7aR)-2,2-디-tert-부틸-7-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}헥사하이드로-2H-시클로펜타[d][1,3,2]디옥사실린-6-일]-5-요오드-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (3.3 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (4.6 g) 을 얻었다.
Figure pat00484
(공정 4)
7-[(4aR,6R,7S,7aR)-2,2-디-tert-부틸-7-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}헥사하이드로-2H-시클로펜타[d][1,3,2]디옥사실린-6-일]-5-(3,3-디에톡시프로파-1-인-1-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (4.6 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 2 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (3.6 g) 을 얻었다.
Figure pat00485
(공정 5)
2-[(4aR,6R,7S,7aR)-2,2-디-tert-부틸-7-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}헥사하이드로-2H-시클로펜타[d][1,3,2]디옥사실린-6-일]-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (3.60 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (2.44 g) 을 얻었다.
Figure pat00486
(공정 6)
{2-[(4aR,6R,7S,7aR)-2,2-디-tert-부틸-7-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}헥사하이드로-2H-시클로펜타[d][1,3,2]디옥사실린-6-일]-2,7,8,9-테트라하이드로-6H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-6-일}(페닐)메타논
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (2.44 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (2.01 g) 을 얻었다.
Figure pat00487
(공정 7)
{2-[(1R,2S,3R,4R)-4-{[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시]메틸}-2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-3-하이드록시시클로펜틸]-2,7,8,9-테트라하이드로-6H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-6-일}(페닐)메타논
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (2.01 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (2.13 g) 을 얻었다.
Figure pat00488
(공정 8)
(1R,2S,3R,5R)-3-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-5-{[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시]메틸}-2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}시클로펜틸 4-옥소펜타노에이트
레불린산 (2.96 g) 의 테트로하이드로푸란 (20 ㎖) 용액에, N,N-디시클로헥실카르보디이미드 (2.63 g) 를 첨가하고, 실온에서 12 시간 교반하였다. 석출물을 여과 제거한 후, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물의 디클로로메탄 (20 ㎖) 용액에, 상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (2.10 g) 과 4-디메틸아미노피리딘 (155 ㎎) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지 후, 아세트산에틸로 추출하고, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (2.35 g) 을 얻었다.
Figure pat00489
(공정 9)
(1R,2S,3R,5R)-3-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-5-(하이드록시메틸)시클로펜틸-4-옥소펜타노에이트
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (2.35 g) 의 디클로로메탄 (25 ㎖) 용액에, 물 (0.24 ㎖) 과 디클로로아세트산 (1.05 ㎖) 의 디클로로메탄 (25 ㎖) 용액을 차례로 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응액에 메탄올 (1.0 ㎖) 과 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 아세트산에틸로 추출하고, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (1.15 g) 을 얻었다.
Figure pat00490
(공정 10)
N-벤조일-2'-O-[({(1R,2R,3S,4R)-4-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-3-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2-[(4-옥소펜타노일)옥시]시클로펜틸}메톡시)(2-시아노에톡시)포스포로티오일]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]아데노신
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (550 ㎎) 의 아세토니트릴 (12 ㎖) 용액에, 몰레큘러 시브스 3A, 1/16 (500 ㎎) 과 N-벤조일-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}아데노신 (1.23 g) 을 첨가하고, 실온에서 15 분 교반하였다. 반응액에 4,5-디시아노이미다졸을 첨가하여 1 시간 교반 후, 3H-1,2-벤조티올-3-온 1,1-디옥사이드 (355 ㎎) 를 첨가하고, 추가로 1 시간 교반하였다. 반응액으로부터 몰레큘러 시브스 3A 를 여과 제거하고, 여과액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (1.17 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1539(M＋H)＋.
(공정 11)
N-벤조일-2'-O-[{[(1R,2R,3S,4R)-4-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-3-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2-하이드록시시클로펜틸]메톡시}(2-시아노에톡시)포스포로티오일]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]아데노신
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (1.22 g) 의 아세토니트릴 (2.0 ㎖) 용액에, 하이드라진 1수화물 (0.25 ㎖) 의 아세트산 (5.0 ㎖) - 피리딘 (7.5 ㎖) 혼합 용액을 첨가하고, 실온에서 30 분 교반하였다. 반응액에 물을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 아세트산에틸로 추출하고, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (770 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1442(M＋H)＋.
(공정 12)
N-벤조일-2'-O-[{[(1R,2R,3S,4R)-4-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-3-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2-{[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]옥시}시클로펜틸]메톡시}(2-시아노에톡시)포스포로티오일]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]아데노신
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (770 ㎎) 의 피리딘 (8.0 ㎖) 용액에, 아인산디페닐 (0.61 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응액에 물 (20 ㎖), 아세토니트릴 (8.0 ㎖), 및 아세트산트리에틸암모늄 수용액 (2 M, 1.6 ㎖) 을 첨가하고, 1 시간 교반 후, 반응액을 감압 농축하였다. 잔류물의 디클로로메탄 (5.0 ㎖) 용액에, 물 (0.096 ㎖) 과 디클로로아세트산 (0.22 ㎖) 의 디클로로메탄 (5.0 ㎖) 용액을 차례로 첨가하고, 30 분간 교반하였다. 피리딘 (0.43 ㎖) 을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 반응액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (400 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1203(M＋H)＋.
(공정 13)
N-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15S,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴데카하이드로-2H,10H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-시클로펜타[l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-6-일}벤즈아미드
상기 공정 12 에서 얻어진 화합물 (400 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (300 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1217(M＋H)＋.
(공정 14)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15S,15aR,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)데카하이드로-2H,10H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-시클로펜타[l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 13 에서 얻어진 화합물 (300 ㎎) 의 메탄올 (10 ㎖) 용액에, 28 ％ 암모니아수 (10 ㎖) 를 첨가하고, 실온에서 12 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물에 트리에틸아민3불화수소산염 (3.0 ㎖) 을 첨가하고, 45 ℃ 에서 2 시간 교반하였다. 빙랭한 1 M 탄산수소트리에틸암모늄 용액 (18 ㎖) - 트리에틸아민 (6.0 ㎖) 혼합 용액에 반응액을 적하하여 반응을 정지시켰다. 반응액을 감압 농축 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 과 디아스테레오머 2 를 각각 트리에틸아민염으로서 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (45.6 ㎎) 과 디아스테레오머 2 (12.6 ㎎) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
Figure pat00491
디아스테레오머 2 (고극성)
Figure pat00492
실시예 57 : CDN47 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-비스(술파닐)-10-술파닐리덴-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2-온
[화학식 206]
Figure pat00493
[합성 스킴]
[화학식 207]
Figure pat00494
(공정 1)
6-벤조일-2-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3-O-(4-옥소펜타노일)-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
실시예 1 공정 5 에서 얻어진 화합물을 사용하여, 실시예 56 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (2.8 g) 을 얻었다.
Figure pat00495
(공정 2)
6-벤조일-2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3-O-(4-옥소펜타노일)-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (2.8 g) 을 사용하여, 실시예 56 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.74 g) 을 얻었다.
Figure pat00496
(공정 3)
N-벤조일-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-[(2-시아노에톡시){[(2,4-디클로로페닐)메틸]술파닐}포스포로티오일]아데노신
시판 (ChemGenes) 되는 N-벤조일-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}아데노신 (3.73 g) 의 아세토니트릴 (30 ㎖) 용액에, 몰레큘러 시브스 3A, 1/16 (1.0 g) 과 2,4-디클로로벤질메르캅탄 (1.8 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 10 분간 교반하였다. 반응액에 이미다졸과염소산염 (3.18 g) 을 첨가하여 2.5 시간 교반 후, 황 (242 ㎎) 을 첨가하고, 추가로 1 시간 교반하였다. 반응액으로부터 몰레큘러 시브스 3A 를 여과 제거하고, 여과액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (2.73 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
Figure pat00497
(공정 4)
N,N-디에틸에탄아미늄 N-벤조일-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-[{[(2,4-디클로로페닐)메틸]술파닐}(술파이드)포스포릴]아데노신
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (2.66 g) 의 아세토니트릴 (30 ㎖) 용액에, 트리에틸아민 (30 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 4 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물을 DIOL 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (2.5 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1058(M＋H)＋.
(공정 5)
디뉴클레오티드 B
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (2.5 g) 의 디클로로메탄 (10 ㎖) 용액에, 몰레큘러 시브스 4A, 1/16 (1.0 g), 상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (930 ㎎), 및 1-메틸이미다졸 (1.18 ㎖) 을 차례로 첨가하고, 실온에서 20 분간 교반하였다. 반응액에 2,4,6-트리이소프로필벤젠술포닐클로라이드 (905 ㎎) 를 첨가하고, 추가로 4 시간 교반하였다. 반응액으로부터 몰레큘러 시브스 4A 를 여과 제거하고, 여과액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (1.04 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1662(M＋H)＋.
(공정 6)
디뉴클레오티드 C
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (1.04 g) 을 사용하여, 실시예 56 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (820 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1564(M＋H)＋.
(공정 7)
디뉴클레오티드 D
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (820 ㎎) 을 사용하여, 실시예 56 공정 12 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (440 ㎎) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
(공정 8)
N-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-{[(2,4-디클로로페닐)메틸]술파닐}-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-6-일}벤즈아미드
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (440 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (360 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1340(M＋H)＋.
(공정 9)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-벤즈아미드-9H-푸린-9-일)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-2-옥소-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (360 ㎎) 의 디메틸술폭시드 용액에, 1-도데칸티올 (434 ㎎) 과 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 (0.40 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 6 시간 교반하였다. 반응액을 그대로 C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물 (130 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1182(M＋H)＋.
(공정 10)
디나트륨 (2S,5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-아미노-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2-옥소-10-술파닐리덴-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (130 ㎎) 을 사용하여, 실시예 56 공정 14 와 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
얻어진 트리에틸아민염을 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (62.8 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00498
실시예 58 : CDN48 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-비스(술파닐)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 208]
Figure pat00499
[합성 스킴]
[화학식 209]
Figure pat00500
(공정 1)
4-클로로-5-요오드-7-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘
시판 (PharmaBlock) 되는 4-클로로-5-요오드-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (73.8 g) 의 N,N-디메틸포르미아미드 (10 ㎖) 용액에, 빙랭하에서 수소화나트륨 (미네랄 오일을 45 ％ 함유) (13.3 g) 을 첨가하고, 실온까지 승온하면서 40 분간 교반하였다. 재차 빙랭하고, [2-(클로로메톡시)에틸](트리메틸)실란 (51.0 ㎖) 을 10 분간 걸쳐 첨가한 후, 동 온도에서 30 분간 교반하였다. 대부분이 고화한 반응액에 물 (260 ㎖) 을 조금씩 첨가하여 반응을 정지시켰다. 고체를 여과 채취하고, 물 (1500 ㎖) 과 헥산 (600 ㎖) 으로 세정 후, 감압하 40 ℃ 에서 건조시키고, 표제 화합물 (97.63 g) 을 얻었다.
Figure pat00501
(공정 2)
4-(벤질옥시)-5-요오드-7-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘
벤질알코올 (27 ㎖) 의 N,N-디메틸포르미아미드 (170 ㎖) 용액에, 빙랭하에서 수소화나트륨 (미네랄 오일을 45 ％ 함유) (12 g) 을 첨가하고, 실온까지 승온하면서 40 분간 교반하였다. 재차 빙랭하고, 상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (97.63 g) 의 N,N-디메틸포르미아미드 (360 ㎖) 현탁액을 40 분간 걸쳐 첨가하고, 동 온도에서 35 분간 교반하였다. 반응액에 빙편 (氷片) 과 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응액을 포화 염화암모늄 수용액과 아세트산에틸의 2 층에 따르고, 아세트산에틸 : 톨루엔 (9 : 1) 으로 추출하였다. 유기층을 물과 포화 식염수로 2 회씩 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (107.7 g) 을 얻었다.
Figure pat00502
(공정 3)
4-(벤질옥시)-5-(3,3-디에톡시프로파-1-인-1-일)-7-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (113.4 g) 의 아세토니트릴 (1000 ㎖) - 트리에틸아민 (98 ㎖) 혼합 용액에, 질소 분위기하, 실온에서 요오드화구리 (4.49 g), 테트라키스트리페닐포스핀팔라듐(0) (8.17 g), 및 3,3-디에톡시프로파-1-인 (104 ㎖) 을 첨가하고, 동 온도에서 4.5 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물에 아세트산에틸과 헥산을 첨가하고, 석출한 고체를 여과 제거하였다. 고체를 아세트산에틸 : 헥산 (1 : 1) 의 혼합액으로 세정 후, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (145.5 g : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 482(M＋H)＋.
(공정 4)
5-(3,3-디에톡시프로필)-7-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-올
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (145.5 g) 의 에탄올 (900 ㎖) 용액에, 10 ％ 팔라듐탄소 촉매 (M) wet (50.2 g) 를 첨가하고, 수소 분위기하, 실온에서 5 시간 교반하였다. 반응액에 디클로로메탄 (500 ㎖) 을 첨가하고, 셀라이트로 촉매를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 2 회 정제하고, 표제 화합물 (59.6 g) 을 얻었다.
Figure pat00503
(공정 5)
5-(3,3-디에톡시프로필)-7-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-티올
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (59.6 g) 의 탈수 디클로로메탄 (300 ㎖) 용액에, 질소 분위기하, 2,6-루티딘 (42 ㎖) 을 첨가하였다. 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (31 ㎖) 을 -20 ℃ 에서 20 분간 걸쳐 적하하고, 동 온도에서 20 분간 교반하였다. N,N-디메틸포름아미드 (500 ㎖) 와 1황화수소나트륨 n 수화물 (33.5 g) 을 빙랭하에서 첨가하고, 실온까지 승온한 후, 2.5 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 저비점 성분을 증류 제거하였다. 잔류물을 아세트산에틸과 빙랭한 포화 염화암모늄 수용액의 2 층에 따르고, 아세트산에틸 : 톨루엔 (9 : 1) 의 혼합액으로 추출하였다. 유기층을 포화 염화암모늄 수용액으로 1 회, 포화 식염수로 2 회 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물과 2,6-루티딘의 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물을 아세트산에틸과 1 규정 염산의 2 층에 따르고, 아세트산에틸로 2 회 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 3 회 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하고, 표제 화합물 (57.6 g) 을 얻었다.
Figure pat00504
(공정 6)
3-(4-술파닐-7-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)프로판-1-올
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (31.62 g) 을 80 ％ 아세트산 수용액 (300 ㎖) 에 용해하고, 실온에서 30 분간 교반하였다. 원료의 소실을 확인 후, 빙랭하고, 수소화붕소나트륨 (1.45 g) 을 소량씩 주의 깊게 첨가하고, 동 온도에서 30 분간 교반하였다. 이어서, 수소화트리아세톡시붕소나트륨 (24.4 g) 을 15 분간 걸쳐 첨가하고, 동 온도에서 1.5 시간 교반하였다. 반응액을 5 분의 1 정도의 양까지 감압 농축하였다. 잔류물에 탄산수소나트륨 (고체) 을 주의 깊게 첨가하여 어느 정도 중화한 후, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨과 포화 식염수로 차례로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (17.93 g) 을 얻었다.
Figure pat00505
(공정 7)
2-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (31.31 g) 의 탈수 테트라하이드로푸란 (600 ㎖) 용액에, 질소 분위기하, 0 ℃ 에서 트리페닐포스핀 (25.4 g) 과 디이소프로필아조디카르복실레이트 (21.8 g) 를 첨가하고, 동 온도에서 1 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/아세트산에틸] 및 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 차례로 정제하고, 표제 화합물 (35.93 g : 불순물 함유) 을 얻었다.
Figure pat00506
(공정 8)
(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)메탄올
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (35.93 g) 의 디클로로메탄 (150 ㎖) 용액에, 실온에서 트리플루오로아세트산 (150 ㎖) 을 첨가하고, 동 온도에서 1.5 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 톨루엔으로 4 회 공비하였다. 잔류물에 디클로로메탄 : 헥산 (1 : 2) 의 혼합액을 첨가하고, 석출한 고체를 여과 채취하였다 (고체 1). 여과액을 감압 농축 후, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸 → 아세트산에틸/메탄올] 로 정제하고, 고체 2 를 얻었다. 고체 1 과 고체 2 를 아울러, 표제 화합물 (20.13 g) 을 얻었다.
(관측 가능한 피크만 기재)
(공정 9)
2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (20.13 g) 의 메탄올 (250 ㎖) 현탁액에, 28 ％ 암모니아 수용액 (150 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 1.5 시간 교반하였다. 반응액을 감압하에서 절반 정도의 양까지 농축하였다. 석출한 고체를 여과 채취하고, 에탄올로 세정하고, 고체 1 을 얻었다. 여과액을 감압 농축하고, 동일한 조작으로 고체 2 를 얻었다. 여과액을 실리카 겔에 바른 후, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 로 정제하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 감압 농축하고, 에탄올로 슬러리 세정 후, 고체를 여과 채취하였다 (고체 3). 고체 1, 고체 2, 및 고체 3 을 아울러, 표제 화합물 (12.36 g) 을 얻었다.
Figure pat00508
(공정 10)
2-(2,3,5-트리-O-벤질-β-D-아라비노퓨라노실)-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (13.47 g) 의 탈수 아세토니트릴 (350 ㎖) 현탁액에, 질소 분위기하, 분말상의 수산화칼륨 (10.3 g) 과 트리스[2-(2-메톡시에톡시)에틸]아민 (1.13 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 1.5 시간 교반하였다. 빙랭하, 이미 알려진 문헌 (J. Med. Chem. 1976, 19, 6, 814-816) 의 2,3,5-트리-O-벤질-α-D-아라비노퓨라노실클로라이드 (40.2 g) 의 아세토니트릴 (100 ㎖) 용액을 조금씩 첨가한 후, 실온까지 승온하여 4 시간 교반하였다. 불용물을 여과 제거하고, 아세토니트릴로 세정하였다. 여과액을 감압 농축하고, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 2 회 정제하고, 표제 화합물 (26.19 g) 을 얻었다.
Figure pat00509
(공정 11)
2-β-D-아라비노퓨라노실-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (26.19 g) 의 탈수 디클로로메탄 (300 ㎖) 용액에, 질소 분위기하, -78 ℃ 에서 3염화붕소의 디클로로메탄 용액 (1M, 200 ㎖) 을 첨가하고, 동 온도에서 2 시간 교반한 후, 0 ℃ 까지 승온하여 추가로 4 시간 교반하였다. 반응액을 재차 -78 ℃ 까지 냉각시키고, 메탄올 (80 ㎖) 의 디클로로메탄 (160 ㎖) 용액을 첨가하고, 실온까지 승온하면서 30 분간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 에탄올로 2 회 공비하였다. 잔류물에 에탄올 (200 ㎖) 과 디에틸에테르 (100 ㎖) 를 첨가하여 슬러리상으로 하고, 고체를 여과 채취하였다 (고체 1). 여과액을 감압 농축하고, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 로 정제하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 감압 농축 후, 에탄올을 첨가하여 슬러리상으로 하고, 고체를 여과 채취하였다 (고체 2). 고체 1 과 고체 2 를 아울러 표제 화합물 (13.2 g) 을 얻었다.
Figure pat00510
(공정 12)
2-[3,5-비스-O-(옥산-2-일)-β-D-아라비노퓨라노실]-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (15.35 g) 의 탈수 디메틸술폭시드 (160 ㎖) 용액에, 0 ℃ 에서 3,4-디하이드로-2H-피란 (17.2 ㎖) 과 p-톨루엔술폰산 1수화물 (9.02 g) 을 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 3,4-디하이드로-2H-피란 (8.6 ㎖) 을 추가하고, 45 분간 교반한 후, 곧바로 트리에틸아민 (13 ㎖) 을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응액을 아세트산에틸과 포화 탄산수소나트륨 수용액의 2 층에 따르고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물로 1 회, 포화 식염수로 2 회 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (10.81 g) 을 4 종류의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
Figure pat00511
(공정 13)
2-[2-데옥시-2-플루오로-3,5-비스-O-(옥산-2-일)-β-D-리보퓨라노실]-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 12 에서 얻어진 화합물 (10.81 g) 의 탈수 디클로로메탄 (150 ㎖) 용액에, 질소 분위기하, 0 ℃ 에서 피리딘 (5.3 ㎖) 과 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (5.6 ㎖) 을 첨가하고, 동 온도에서 1 시간 교반하였다. 반응액에 빙편을 넣어 반응을 정지시킨 후, 반응액을 아세트산에틸과 포화 탄산수소나트륨 수용액의 2 층에 따르고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 2 회 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하고, 트리플레이트의 미정제체를 아모르퍼스로서 얻었다. 얻어진 트리플레이트의 미정제체를 탈수 테트라하이드로푸란 (150 ㎖) 에 용해하고, 빙랭하에서 불화테트라부틸암모늄의 테트라하이드로푸란 용액 (약 1 M, 154 ㎖) 을 조금씩 첨가하고, 동 온도에서 밤새 교반하였다. 반응액에 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응액을 절반 정도의 양까지 감압 농축하였다. 잔류물을 아세트산에틸과 포화 염화암모늄 수용액의 2 층에 따르고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 염화암모늄 수용액으로 1 회, 포화 식염수로 2 회 세정하였다. 수층을 아세트산에틸로 재차 추출하고, 추출액을 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 아울러 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하고, 표제 화합물 (40.37 g) 의 미정제체를 얻었다.
MS(ESI)m/z : 494[M＋H]＋.
(공정 14)
2-(2-데옥시-2-플루오로-β-D-리보퓨라노실)-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 13 에서 얻어진 화합물 (40.37 g) 의 메탄올 (400 ㎖) 용액에 p-톨루엔술폰산 1수화물 (2.09 g) 을 첨가하고, 60 ℃ 에서 4 시간 교반하였다. 반응액에 트리에틸아민 (16 ㎖) 을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸 → 아세트산에틸/메탄올] 로 정제하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 슬러리상이 될 때까지 감압 농축하고, 고체를 여과 채취하였다. 얻어진 고체를 헥산/아세트산에틸 (1 : 1) 로 세정하고, 고체 1 을 얻었다. 여과액을 감압 농축하고, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 로 정제하고, 고체 2 를 얻었다. 고체 1 과 고체 2 를 아울러 표제 화합물 (5.32 g) 을 얻었다.
Figure pat00512
(공정 15)
2-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-데옥시-2-플루오로-β-D-리보퓨라노실}-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 14 에서 얻어진 화합물 (5.32 g) 을 사용하여, 실시예 11 공정 1 과 동일한 수법을 이용하여 반응을 실시하고, 표제 화합물 (10.1 g) 을 얻었다.
Figure pat00513
(공정 16)
2-(5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-2-데옥시-2-플루오로-β-D-리보퓨라노실)-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 15 에서 얻어진 화합물 (10.1 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 6 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (12.6 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 1 : 1) 로서 얻었다.
Figure pat00514
(공정 17)
상기 공정 16 에서 얻어진 화합물 (740 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 2-{2-데옥시-2-플루오로-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보퓨라노실}-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 얻어진 아세토니트릴 용액과 실시예 22 공정 3 에서 얻어진 화합물 (924 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 18)
2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸 벤조에이트
상기 공정 17 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (502 ㎎ : 불순물 함유) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1065(M＋H)＋.
(공정 19)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 18 에서 얻어진 화합물 (502 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법을 이용하여 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (67.8 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (69.5 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 908(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 908(M＋H)＋.
(공정 20-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 19 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (67.8 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1), 아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1) : 10 ％ - 45 ％ (0 분 - 40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 25 ％ - 75 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (21.2 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00515
(공정 20-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 19 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (69.5 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1), 아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1) : 10 ％ - 45 ％ (0 분 - 40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 25 ％ - 75 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (14.9 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00516
실시예 59 : CDN49 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[1-(2-아미노에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-비스(술파닐)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 210]
Figure pat00517
[합성 스킴]
[화학식 211]
Figure pat00518
(공정 1)
실시예 58 공정 16 에서 얻어진 화합물 (1.80 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 2-{2-데옥시-2-플루오로-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보퓨라노실}-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 얻어진 아세토니트릴 용액과 실시예 45 공정 3 에서 얻어진 화합물 (2.30 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 2)
3-{[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-7-{1-[2-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)에틸]-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일}-15-플루오로-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-10-일]옥시}프로판니트릴
상기 공정 1 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.22 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1090(M＋H)＋.
(공정 3)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[1-(2-아미노에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (1.22 g) 을 사용하여, 실시예 45 공정 6 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (108 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (111 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 907(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 907(M＋H)＋.
(공정 4-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[1-(2-아미노에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (108 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1), 아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1) : 10 ％ - 50 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (44.4 ㎎) 을 얻었다.
(공정 4-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[1-(2-아미노에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (111 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 25 ％ (0 분 - 40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 20 ％ - 60 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (40.6 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00520
실시예 60 : CDN50 의 합성
N-(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-2,10-비스(술파닐)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸)-2-하이드록시아세트아미드
[화학식 212]
Figure pat00521
[합성 스킴]
[화학식 213]
Figure pat00522
(공정 1-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-7-{1-[2-(2-하이드록시아세트아미드)에틸]-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일}-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
실시예 59 공정 4-1 에서 얻어진 화합물 (20.0 ㎎) 을 사용하여, 실시예 7 공정 1-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％ - 30 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (15.6 ㎎) 을 얻었다.
(공정 1-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-7-{1-[2-(2-하이드록시아세트아미드)에틸]-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일}-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
실시예 59 공정 4-2 에서 얻어진 화합물 (10.0 ㎎) 을 사용하여, 실시예 7 공정 1-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 7 ％ - 25 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (6.6 ㎎) 을 얻었다.
실시예 61 : CDN51 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-비스(술파닐)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 214]
Figure pat00525
[합성 스킴]
[화학식 215]
Figure pat00526
(공정 1)
실시예 58 공정 16 에서 얻어진 화합물 (1.80 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 2-{2-데옥시-2-플루오로-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보퓨라노실}-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 얻어진 아세토니트릴 용액과 실시예 47 공정 6 에서 얻어진 화합물 (3.10 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 2)
2-(트리메틸실릴)에틸[2-({6-벤즈아미드-9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-2-일}아미노)에틸]카르바메이트
상기 공정 1 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.83 g : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1222(M＋H)＋.
(공정 3)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-(6-아미노-2-{[2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)에틸]아미노}-9H-푸린-9-일)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 2 에서 얻어진 혼합물 (1.83 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (151 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (103 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1065(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1065(M＋H)＋.
(공정 4-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (151 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 40 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 2 ％ - 30 ％ (0 분 - 30 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (10.6 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00527
(공정 4-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{6-아미노-2-[(2-아미노에틸)아미노]-9H-푸린-9-일}-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (103 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 40 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％ - 30 ％ (0 분 - 30 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (12.1 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00528
실시예 62 : CDN52 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-2,16-디하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-10-술파닐-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 216]
Figure pat00529
[합성 스킴]
[화학식 217]
Figure pat00530
(공정 1)
실시예 44 공정 8 에서 얻어진 화합물 (1.00 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 6-벤조일-2-{2-데옥시-2-플루오로-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 얻어진 아세토니트릴 용액과 실시예 22 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.13 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 2)
2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-15-플루오로-2-하이드록시-2-옥소-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸 벤조에이트
상기 공정 1 에서 얻어진 미정제 생성물의 피리딘 (32.5 ㎖) 용액을 25 ㎖ 정도까지 농축 후, 2-클로로-5,5-디메틸-1,3,2λ5-디옥사포스피난-2-온 (945 ㎎) 을 첨가하고, 실온에서 30 분간 교반하였다. 반응액에 요오드 (1.11 g) 를 첨가하고, 1 시간 교반하였다. 반응액을 탄산수소나트륨 (4.30 g) 의 수용액 (150 ㎖) 에 따르고, 30 분간 교반 후, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (671 ㎎ : 불순물 함유) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1136(M＋H)＋.
(공정 3)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-15-플루오로-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-10-술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2-올레이트
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (671 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (55.6 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (65.7 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 875(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 875(M＋H)＋.
(공정 4-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-10-술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2-올레이트
(디아스테레오머 1)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (55.6 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 과 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％ - 25 ％ (0 분 - 30 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (11.3 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00531
(공정 4-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-10-술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2-올레이트
(디아스테레오머 2)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (65.7 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 과 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 3 ％ - 20 ％ (0 분 - 30 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (23.5 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00532
실시예 63 : CDN53 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-10,16-디하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2-술파닐-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 218]
Figure pat00533
[합성 스킴]
[화학식 219]
Figure pat00534
(공정 1)
실시예 44 공정 8 에서 얻어진 화합물 (1.02 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 6-벤조일-2-{2-데옥시-2-플루오로-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다 (아세토니트릴 용액 A). 실시예 22 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.23 g) 을 탈수 아세토니트릴 (10 ㎖) 로 3 회 공비 탈수하였다. 마지막 1 회는 7 ㎖ 정도의 아세토니트릴을 남기고, 몰레큘러 시브스 3A, 1/16 (펠릿상의 5 립) 을 첨가하였다 (아세토니트릴 용액 B). 아세토니트릴 용액 A 와 아세토니트릴 용액 B 를 혼합하고, 질소 분위기하, 실온에서 15 분간 교반하였다. 반응액에 tert-부틸하이드로퍼옥사이드의 데칸 용액 (5.5 M, 0.50 ㎖) 을 첨가하고, 40 분간 교반 후, 반응액을 빙랭하고, 티오황산나트륨 5 수화물 (826 ㎎) 의 수용액 (1.1 ㎖) 을 첨가하고, 10 분간 교반하였다. 반응액에 물 (20 ㎖) 을 첨가하고, 디클로로메탄-메탄올 혼합액으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물의 디클로로메탄 (15.9 ㎖) 용액에 물 (0.200 ㎖) 과 디클로로아세트산 (1.00 ㎖) 의 디클로로메탄 (15.9 ㎖) 용액을 차례로 첨가하고, 실온에서 15 분간 교반하였다. 반응액에 피리딘 (11.0 ㎖) 을 첨가하여 반응을 정지 후, 반응액을 감압 농축하였다. 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 2)
N,N-디에틸에탄아미늄 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-{1-[2-(벤조일옥시)에틸]-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일}-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-15-플루오로-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2-티올레이트
상기 공정 1 에서 얻어진 미정제 생성물을, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (122 ㎎ : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1136(M＋H)＋.
(공정 3)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-15-플루오로-10-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2-술파닐-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (122 mg, 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
MS(ESI)m/z : 875(M＋H)＋.
(공정 4)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-2-술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-10-올레이트
상기 공정 3 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 2 ％ - 30 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다. 얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (30 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00535
실시예 64 : CDN54 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-2,10,16-트리하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 220]
Figure pat00536
[합성 스킴]
[화학식 221]
Figure pat00537
(공정 1)
실시예 44 공정 8 에서 얻어진 화합물 (1.00 g) 과 실시예 22 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.13 g) 을 사용하여, 실시예 63 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 2)
2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-15-플루오로-2-하이드록시-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸 벤조에이트
상기 공정 1 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 62 공정 2 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (602 ㎎ : 불순물 함유) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1120(M＋H)＋.
(공정 3)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-15-플루오로-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(올레이트)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (602 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (90.8 ㎎ : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 859(M＋H)＋.
(공정 4)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(올레이트)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (90.8 ㎎ : 불순물 함유) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 과 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 1 ％ - 20 ％ (0 분 - 40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 11 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하고, 표제 화합물 (40.4 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00538
실시예 65 : 약물 링커 5 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 222]
Figure pat00539
(공정 1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-(6-{[(글리실아미노)메톡시]메틸}-9H-푸린-9-일)-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
실시예 17 공정 7 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (80.6 ㎎) 을 사용하여, 실시예 22 공정 7-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (66.1 ㎎ : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1059(M＋H)＋.
(공정 2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(6-{[(글리실아미노)메톡시]메틸}-9H-푸린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (66.1 ㎎) 을 사용하여, 실시예 22 공정 8-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (40.4 ㎎ : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 831(M＋H)＋.
(공정 3)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[({9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-6-일}메톡시)메틸]글리신아미드
(약물 링커 5)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (40.4 ㎎) 을 사용하여, 실시예 22 공정 9-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％ - 45 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (5.0 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00540
실시예 66 : 약물 링커 6 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 223]
Figure pat00541
(공정 1)
N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-({2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에톡시}메틸)글리신아미드
이미 알려진 문헌 (WO2014/057687) 의 {[(N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}글리실)아미노]메톡시}아세트산 (955 ㎎) 의 N,N-디메틸포름아미드 (8.0 ㎖) 용액에, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 (0.74 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다 (반응액 A). 실시예 22 공정 10 에서 얻어진 화합물 (938 ㎎) 의 N,N-디메틸포름아미드 (8.0 ㎖) 용액에 N-하이드록시숙신이미드 (229 ㎎) 와 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드염산염 (380 ㎎) 을 첨가하고, 실온에서 50 분간 교반하였다 (반응액 B). 반응액 A 를 반응액 B 에 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응액에 디클로로메탄 (50 ㎖) 과 10 ％ 시트르산 수용액 (10 ㎖) 을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름/(클로로포름/메탄올/물 = 7 : 3 : 1 의 하층)] 으로 정제하였다. 얻어진 화합물의 N,N-디메틸포름아미드 (8.0 ㎖) 용액에, N-하이드록시숙신이미드 (229 ㎎) 와 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드염산염 (380 ㎎) 을 첨가하고, 실온에서 30 분간 교반하였다. 반응액에 디클로로메탄 (100 ㎖) 과 물 (25 ㎖) 을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름/메탄올] 로 정제하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 감압 농축하고, 잔류물에 디에틸에테르를 첨가하여 슬러리상으로 하였다. 얻어진 고체를 여과 채취하고, 표제 화합물 (412 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00542
(공정 2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-({2-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸)아미노]-2-옥소에톡시}메틸)글리신아미드
(약물 링커 6)
실시예 5 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (20.0 ㎎) 과 상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (23.7 ㎎) 을 사용하여, 실시예 21 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 20 ％ - 45 ％ (0 분 - 40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 30 ％ - 80 ％ (0 분 - 40 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (14.1 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00543
실시예 67 : 약물 링커 7 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 224]
Figure pat00544
(공정 1)
[(N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-L-이소류실)아미노]메틸 아세테이트
시판 (IRIS) 되는 N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-L-이소류실글리신 (2.50 g) 의 테트라하이드로푸란 (45 ㎖) - 톨루엔 (15 ㎖) 혼합액에, 실온에서 피리딘 (0.588 ㎖) 과 4아세트산납 (3.24 g) 을 첨가하고, 65 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 반응액을 아세트산에틸로 희석하고, 물과 포화 식염수로 차례로 세정하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (2.06 g) 을 얻었다.
Figure pat00545
(공정 2)
벤질 {[(N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}-L-이소류실)아미노]메톡시}아세테이트
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (2.06 g) 의 테트라하이드로푸란 (48 ㎖) 현탁액에, 0 ℃ 에서 글리콜산벤질 (1.38 ㎖) 과 p-톨루엔술폰산 1수화물 (92.3 ㎎) 을 첨가하고, 실온에서 4 시간 교반하였다. 반응액을 아세트산에틸로 희석하고, 포화 탄산수소나트륨수로 세정 후, 수층을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 아울러, 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (1.72 g) 을 얻었다.
Figure pat00546
(공정 3)
N-[(벤질옥시)카르보닐]글리실글리실-L-프롤릴-N-{[2-(벤질옥시)-2-옥소에톡시]메틸}-L-이소류신아미드
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (1.72 g) 의 아세토니트릴 (40 ㎖) 현탁액에, 실온에서 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 (0.290 ㎖) 을 첨가하고, 1 시간 교반하였다 (반응액 A). 시판되는 N-[(벤질옥시)카르보닐]글리실글리실-L-프롤린 (1.41 g) 의 아세토니트릴 (20 ㎖) 현탁액에, 실온에서 3H-[1,2,3]트리아졸[4,5-b]피리딘-3-올 (529 ㎎), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드염산염 (746 ㎎), 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.678 ㎖) 을 첨가하고, 1 시간 교반하였다. 이 반응액을 실온에서 상기 반응액 A 에 첨가하고, 6 시간 교반 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (1.56 g) 을 얻었다.
Figure pat00547
(공정 4)
글리실글리실-L-프롤릴-N-[(카르복시메톡시)메틸]-L-이소류신아미드
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.56 g) 의 메탄올 (8 ㎖) - 테트라하이드로푸란 (24 ㎖) - 디클로로메탄 (8 ㎖) 혼합액에, 10 ％ 팔라듐탄소 (M) wet (1.4 g) 를 첨가하고, 수소 분위기하, 실온에서 23 시간 교반하였다. 반응액에 메탄올/테트라하이드로푸란 (1 : 1) 혼합액 (50 ㎖) 을 첨가하고, 셀라이트로 여과하였다. 셀라이트를 메탄올/테트라하이드로푸란 (1 : 1) 혼합액으로 세정하였다. 여과액을 감압 농축 후, 잔류물에 메탄올 (20 ㎖), 테트라하이드로푸란 (20 ㎖), 및 10 ％ 팔라듐탄소 (M) wet (1.0 g) 를 첨가하고, 수소 분위기하, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응액을 셀라이트로 여과 후, 셀라이트를 메탄올/테트라하이드로푸란 (1 : 1) 으로 세정하였다. 여과액을 감압 농축하고, 표제 화합물의 미정제체 (1.02 g) 를 얻었다.
MS(ESI)m/z : 430(M＋H)＋.
(공정 5)
N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-프롤릴-N-[(카르복시메톡시)메틸]-L-이소류신아미드
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.02 g) 의 N,N-디메틸포름아미드 (24 ㎖) 용액에, 1-{[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]옥시}피롤리딘-2,5-디온 (956 ㎎) 과 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.496 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름/메탄올] 로 정제하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 감압 농축 후, 잔류물에 아세트산에틸을 첨가하여 고화시켰다. 얻어진 고체를 여과 채취하고, 표제 화합물 (1.06 g) 을 얻었다.
Figure pat00548
(공정 6)
N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-프롤릴-N-({2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에톡시}메틸)-L-이소류신아미드
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (1.06 g) 의 N,N-디메틸포름아미드 (16 ㎖) 현탁액에, N-하이드록시숙신이미드 (187 ㎎) 와 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드염산염 (312 ㎎) 을 첨가하고, 실온에서 16 시간 교반하였다. 반응액을 클로로포름으로 희석하고, 물로 3 회 세정하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물에 아세트산에틸을 첨가하고, 얻어진 고체를 여과 채취하였다. 여과 채취한 고체에 디에틸에테르를 첨가하고, 슬러리상으로 한 후, 고체를 여과 채취하여, 표제 화합물 (767 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00549
(공정 7)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-프롤릴-N-({2-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸)아미노]-2-옥소에톡시}메틸)-L-이소류신아미드
(약물 링커 7)
실시예 5 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (20.0 ㎎) 과 상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (20.9 ㎎) 을 사용하여, 실시예 21 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 20 ％ - 45 ％ (0 분 - 40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 30 ％ - 80 ％ (0 분 - 40 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (11.9 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00550
실시예 68 : 약물 링커 8 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 225]
Figure pat00551
(공정 1)
N-(tert-부톡시카르보닐)글리실글리실-L-발릴-L-알라닌
시판 (ChemFun) 되는 N-(tert-부톡시카르보닐)글리실글리신 (5.00 g) 과 N-하이드록시숙신이미드 (2.97 g) 의 N,N-디메틸포르미아미드 (50 ㎖) 용액에, 질소 분위기하, 0 ℃ 에서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드염산염 (4.95 g) 을 첨가하고, 실온으로 승온하여 1 시간 교반하였다. 반응액에 트리에틸아민 (3.6 ㎖) 과 시판 (고쿠산 화학) 되는 L-발릴-L-알라닌 (4.05 g) 을 첨가하고, 동 온도 6 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 로 정제하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 감압 농축하고, 디에틸에테르를 첨가하여 슬러리상으로 하였다. 얻어진 고체를 여과 채취하고, 표제 화합물 (4.99 g) 을 얻었다.
Figure pat00552
(공정 2)
N-(아자니우밀아세틸)글리실-L-발릴-L-알라닌 트리플루오로아세테이트
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (1.00 g) 을 사용하여, 실시예 21 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.10 g) 의 미정제체를 얻었다.
Figure pat00553
(공정 3)
N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-L-알라닌
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (861 ㎎) 을 사용하여, 실시예 21 공정 2 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (737 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00554
(공정 4)
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-L-알라니네이트
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (260 ㎎) 을 사용하여, 실시예 21 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (84 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00555
(공정 5)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-[2-({6-아미노-9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-2-일}아미노)에틸]-L-알라닌아미드
(약물 링커 8)
실시예 8 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (5.3 ㎎) 과 상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (4.5 ㎎) 을 사용하여, 실시예 23 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 25 ％ - 35 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (5.1 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00556
실시예 69 : 약물 링커 9 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 226]
Figure pat00557
(공정 1)
N-(아자니우밀아세틸)글리실-L-프롤릴-L-이소류신 트리플루오로아세테이트
시판 (Hangzhou Peptide Biochem) 되는 N-(tert-부톡시카르보닐)글리실글리실-L-프롤릴-L-이소류신 (1.00 g) 을 사용하여, 실시예 21 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.02 g) 의 미정제체를 얻었다.
Figure pat00558
(공정 2)
N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-프롤릴-L-이소류신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (1.02 g) 을 사용하여, 실시예 21 공정 2 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (993 ㎎) 을 얻었다.
(공정 3)
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-프롤릴-L-이소류시네이트
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (300 ㎎) 을 사용하여, 실시예 21 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (287 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00560
(공정 4)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-프롤릴-N-[2-({6-아미노-9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-2-일}아미노)에틸]-L-이소류신아미드
(약물 링커 9)
실시예 8 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (51.8 ㎎) 과 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (36.9 ㎎) 을 사용하여, 실시예 23 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 20 ％ - 35 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (62.5 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1397(M-H)-.
실시예 70 : 약물 링커 10 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 227]
Figure pat00561
(공정 1)
N-(아자니우밀아세틸)글리실-L-페닐알라닐-L-메티오닌 트리플루오로아세테이트
시판 (Hangzhou Peptide Biochem) 되는 N-(tert-부톡시카르보닐)글리실글리실-L-페닐알라닐-L-메티오닌 (1.00 g) 을 사용하여, 실시예 21 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.19 g) 의 미정제체를 얻었다.
(관측 가능한 피크만 기재)
(공정 2)
N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-L-메티오닌
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (1.03 g) 을 사용하여, 실시예 21 공정 2 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (652 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00563
(공정 3)
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-L-메티오니네이트
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (201 ㎎) 을 사용하여, 실시예 21 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (95 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00564
(공정 4)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[2-({6-아미노-9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-2-일}아미노)에틸]-L-메티오닌아미드
(약물 링커 10)
실시예 8 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (6.0 ㎎) 과 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (5.5 ㎎) 을 사용하여, 실시예 23 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 20 ％ - 40 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (2.0 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00565
실시예 71 : 약물 링커 11 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 228]
Figure pat00566
(공정 1)
N-(아자니우밀아세틸)글리실-L-발릴-N5-카르바모일-L-오르니틴 트리플루오로아세테이트
시판 (Hangzhou Peptide Biochem) 되는 N-(tert-부톡시카르보닐)글리실글리실-L-발릴-N5-카르바모일-L-오르니틴 (1.00 g) 을 사용하여, 실시예 21 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.02 g) 의 미정제체를 얻었다.
(관측 가능한 피크만 기재)
(공정 2)
N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N5-카르바모일-L-오르니틴
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (1.02 g) 을 사용하여, 실시예 21 공정 2 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (795 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00568
(공정 3)
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N5-카르바모일-L-오르니티네이트
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (300 ㎎) 을 사용하여, 실시예 21 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (177 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00569
(공정 4)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-[2-({6-아미노-9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-2-일}아미노)에틸]-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드
(약물 링커 11)
실시예 8 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (5.0 ㎎) 과 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (3.8 ㎎) 을 사용하여, 실시예 23 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 20 ％ - 35 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (3.0 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1443(M-H)-.
실시예 72 : 약물 링커 12 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 229]
Figure pat00570
(공정 1)
N-(아자니우밀아세틸)글리실-L-페닐알라닐-N5-카르바모일-L-오르니틴 트리플루오로아세테이트
시판 (Hangzhou Peptide Biochem) 되는 N-(tert-부톡시카르보닐)글리실글리실-L-페닐알라닐-N5-카르바모일-L-오르니틴 (1.00 g) 을 사용하여, 실시예 21 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.05 g) 의 미정제체를 얻었다.
Figure pat00571
(공정 2)
N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N5-카르바모일-L-오르니틴
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (1.05 g) 을 사용하여, 실시예 21 공정 2 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (550 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00572
(공정 3)
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N5-카르바모일-L-오르니티네이트
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (225 ㎎) 을 사용하여, 실시예 21 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (226 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00573
(공정 4)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[2-({6-아미노-9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-2-일}아미노)에틸]-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드
(약물 링커 12)
실시예 8 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (5.1 ㎎) 과 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (4.0 ㎎) 을 사용하여, 실시예 23 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 20 ％ - 35 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (4.6 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00574
실시예 73 : 약물 링커 13 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 230]
Figure pat00575
(공정 1)
N-(아자니우밀아세틸)글리실-L-이소류실-N5-카르바모일-L-오르니틴 트리플루오로아세테이트
시판 (Hangzhou Peptide Biochem) 되는 N-(tert-부톡시카르보닐)글리실글리실-L-이소류실-N5-카르바모일-L-오르니틴 (1.00 g) 을 사용하여, 실시예 21 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.09 g) 의 미정제체를 얻었다.
(관측 가능한 피크만 기재)
(공정 2)
N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-이소류실-N5-카르바모일-L-오르니틴
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (1.08 g) 을 사용하여, 실시예 21 공정 2 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (524 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00577
(공정 3)
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-이소류실-N5-카르바모일-L-오르니티네이트
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (250 ㎎) 을 사용하여, 실시예 21 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (224 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00578
(공정 4)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-이소류실-N-[2-({6-아미노-9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-2-일}아미노)에틸]-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드
(약물 링커 13)
실시예 8 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (5.4 ㎎) 과 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (4.0 ㎎) 을 사용하여, 실시예 23 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 20 ％ - 35 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (4.7 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1457(M-H)-.
실시예 74 : 약물 링커 14 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 231]
Figure pat00579
(공정 1)
N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리신
시판 (도쿄 화성 공업) 되는 글리실글리신 (0.61 g) 을 사용하여, 실시예 21 공정 2 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.08 g) 을 얻었다.
Figure pat00580
(공정 2)
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리시네이트
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (1.07 g) 을 사용하여, 실시예 21 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (942 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00581
(공정 3)
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-프롤릴-L-류시네이트
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (250 ㎎) 과 시판 (고쿠산 화학) 되는 L-프롤릴-L-류신 (166 ㎎) 의 N,N-디메틸포름아미드 (5.0 ㎖) 현탁액에, N,N-디이소프로필에틸아민 (0.25 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 2.5 시간 교반하였다. L-프롤릴-L-류신 (833 ㎎) 을 추가하여 밤새 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물에 클로로포름 (50 ㎖) 과 10 ％ 시트르산 수용액 (10 ㎖) 을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 감압 농축하고, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름/(클로로포름 : 메탄올 : 물 = 7 : 3 : 1) 의 하층] 으로 조정제하였다. 미정제 생성물의 N,N-디메틸포름아미드 (5.0 ㎖) 용액에 N-하이드록시숙신이미드 (67 ㎎) 와 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드염산염 (111 ㎎) 을 첨가하고, 실온에서 1.5 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물에 클로로포름 (40 ㎖) 과 물 (15 ㎖) 을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름/메탄올], [아세트산에틸/메탄올] 로 차례로 정제하고, 표제 화합물 (127 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00582
(공정 4)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-프롤릴-N-[2-({6-아미노-9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-2-일}아미노)에틸]-L-류신아미드
(약물 링커 14)
실시예 8 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (6.9 ㎎) 과 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (4.7 ㎎) 을 사용하여, 실시예 23 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 20 ％ - 40 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (7.2 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1397(M-H)-.
실시예 75 : 약물 링커 15 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 232]
Figure pat00583
(공정 1)
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-알라닐-L-글루타미네이트
시판 (와코 쥰야쿠 공업) 되는 L-알라닐-L-글루타민 (263 ㎎) 과 실시예 74 공정 2 에서 얻어진 화합물 (250 ㎎) 을 사용하여, 실시예 74 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (90 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00584
(공정 2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄)N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-알라닐-N1-[2-({6-아미노-9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-2-일}아미노)에틸]-L-글루탐아미드
(약물 링커 15)
실시예 8 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (6.9 ㎎) 과 상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (4.7 ㎎) 을 사용하여, 실시예 23 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 20 ％ - 40 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (3.9 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00585
실시예 76 : 약물 링커 16 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 233]
Figure pat00586
(공정 1)
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-프롤릴-L-프롤리네이트
시판 (Cool Pharm) 되는 1-(tert-부톡시카르보닐)-L-프롤릴-L-프롤린 (777 ㎎) 을 사용하여, 실시예 21 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 1-[(2S)-피롤리딘-1-이움-2-카르보닐]-L-프롤린 트리플루오로아세테이트의 미정제체를 얻었다. 이 미정제 생성물과 실시예 74 공정 2 에서 얻어진 화합물 (428 ㎎) 을 사용하여, 실시예 74 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (238 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00587
(공정 2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-프롤릴-N-[2-({6-아미노-9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-2-일}아미노)에틸]-L-프롤린아미드
(약물 링커 16)
실시예 8 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (6.9 ㎎) 과 상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (4.6 ㎎) 을 사용하여, 실시예 23 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 20 ％ - 40 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (5.8 ㎎) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1383(M＋H)＋.
실시예 77 : 약물 링커 17 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 234]
Figure pat00588
(공정 1)
[(N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리실)아미노]메틸 아세테이트
시판 (SUNDIA) 되는 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리실글리신 (9.32 g) 을 사용하여, 실시예 67 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (8.24 g) 을 얻었다.
Figure pat00589
(공정 2)
2',3',5'-트리스-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-(2-하이드록시에틸)이노신
이미 알려진 문헌 (Chem. Pharm. Bull. 1987, 35 (1), 72-79) 의 2',3',5'-트리스-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]이노신 (31.3 g) 의 테트라하이드로푸란 (75 ㎖) - N,N-디메틸아세트아미드 (75 ㎖) 혼합 용액에, 2-브로모에탄올 (4.82 ㎖) 과 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 (7.65 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 23 시간 교반하였다. 반응액에, 물과 아세트산에틸을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (29.4 g) 을 얻었다.
Figure pat00590
(공정 3)
2',3',5'-트리스-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-(2-{[(N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리실)아미노]메톡시}에틸)이노신
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (15.6 g) 의 톨루엔 (46.8 ㎖) 용액에 상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (10.4 g) 과 피리딘 (9.63 ㎖) 을 첨가하고, 110 ℃ 에서 12 시간 교반하였다. 반응액에 상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (3.46 g) 을 추가하고, 110 ℃ 에서 1 일간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액과 디클로로메탄을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하고, 표제 화합물 (20.6 g : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 885(M＋H)＋.
(공정 4)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-1-(2-{[(N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리실)아미노]메톡시}에틸)이노신
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (20.6 g) 의 테트라하이드로푸란 (50 ㎖) 용액에 트리에틸아민3불화수소산염 (10 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 17 시간 교반하였다. 빙랭하, 반응액에 1 M 탄산수소트리에틸암모늄 용액 (50 ㎖) 과 트리에틸아민 (10 ㎖) 의 혼합액을 천천히 첨가한 후, 반응액을 감압 농축하였다. 잔류물을 C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [물/아세토니트릴] 로 조정제 후, 동결 건조시켰다. 얻어진 미정제체를 피리딘으로 공비하고, 잔류물의 피리딘 (50 ㎖) 용액에, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (4.73 g) 를 0 ℃ 에서 첨가하고, 4 ℃ 에서 17 시간 교반하였다. 반응액에 메탄올 (2 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 15 분간 교반 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (9.18 g : 불순물 함유) 을 얻었다.
Figure pat00591
(공정 5)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-(2-{[(N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리실)아미노]메톡시}에틸)이노신
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (5.96 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (2.33 g) 과 표제 화합물의 위치 이성체인 5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-(2-{[(N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리실)아미노]메톡시}에틸)이노신 (2.45 g) 을 얻었다.
Figure pat00592
위치 이성체 (2'-O-TBS 체)
Figure pat00593
(공정 6)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-1-(2-{[(N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리실)아미노]메톡시}에틸)이노신
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (2.33 g) 을 사용하여, 실시예 5 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (2.72 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 6 : 4) 로서 얻었다.
Figure pat00594
(공정 7)
실시예 44 공정 8 에서 얻어진 화합물 (2.15 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 6-벤조일-2-{2-데옥시-2-플루오로-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 얻어진 아세토니트릴 용액과 상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (2.72 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 8)
2-(트리메틸실릴)에틸 (2-{[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-15-플루오로-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에톡시)메틸]아미노}-2-옥소에틸)카르바메이트
상기 공정 7 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.47 g : 불순물 함유) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1278(M＋H)＋.
(공정 9)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-15-플루오로-2,10-디옥소-7-[6-옥소-1-(2-{[(N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리실)아미노]메톡시}에틸)-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (1.47 g) 의 메탄올 (10 ㎖) - 테트라하이드로푸란 (10 ㎖) 혼합 용액에, 28 ％ 암모니아수 (10 ㎖) 를 첨가하고, 50 ℃ 에서 6 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (204 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (205 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1121(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1121(M＋H)＋.
(공정 10-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-7-(1-{2-[(글리실아미노)메톡시]에틸}-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-16-하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (204 ㎎) 을 사용하여, 실시예 11 공정 9-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 과 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1), 아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1) : 10 ％ - 50 ％ (0 분 - 40 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (40.7 ㎎ : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 863(M＋H)＋.
(공정 10-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-7-(1-{2-[(글리실아미노)메톡시]에틸}-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-16-하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (205 ㎎) 을 사용하여, 실시예 11 공정 9-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 과 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1), 아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1) : 10 ％ - 50 ％ (0 분 - 40 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (50.8 ㎎ : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 863(M＋H)＋.
(공정 11-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에톡시)메틸]글리신아미드
(약물 링커 17a : 디아스테레오머 1)
상기 공정 10-1 에서 얻어진 화합물 (40.7 ㎎) 을 사용하여, 실시예 22 공정 9-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 20 ％ - 45 ％ (0 분 - 40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 40 ％ - 90 ％ (0 분 - 40 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (25.1 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00595
(공정 11-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에톡시)메틸]글리신아미드
(약물 링커 17b : 디아스테레오머 2)
상기 공정 10-2 에서 얻어진 화합물 (50.8 ㎎) 을 사용하여, 실시예 22 공정 9-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 25 ％ - 45 ％ (0 분 - 40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 45 ％ - 90 ％ (0 분 - 40 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (23.4 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00596
실시예 78 : 약물 링커 18 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 235]
Figure pat00597
(공정 1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸)글리신아미드
(약물 링커 18)
실시예 45 공정 7-2 에서 얻어진 화합물 (10.0 ㎎) 과 실시예 21 공정 3 에서 얻어진 화합물 (8.8 ㎎) 을 사용하여, 실시예 21 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 25 ％ - 50 ％ (0 분 - 40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 45 ％ - 90 ％ (0 분 - 40 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (10.9 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00598
실시예 79 : 약물 링커 19 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 236]
Figure pat00599
(공정 1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-({2-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸)아미노]-2-옥소에톡시}메틸)글리신아미드
(약물 링커 19)
실시예 45 공정 7-2 에서 얻어진 화합물 (20.0 ㎎) 과 실시예 66 공정 1 에서 얻어진 화합물 (19.8 ㎎) 을 사용하여, 실시예 21 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 20 ％ - 45 ％ (0 분 - 40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 30 ％ - 80 ％ (0 분 - 40 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (22.1 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00600
실시예 80 : 약물 링커 20 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 237]
Figure pat00601
(공정 1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸)글리신아미드
(약물 링커 20)
실시예 59 공정 4-2 에서 얻어진 화합물 (25.0 ㎎) 과 실시예 21 공정 3 에서 얻어진 화합물 (25.8 ㎎) 을 사용하여, 실시예 21 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 30 ％ - 50 ％ (0 분 - 40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 50 ％ - 90 ％ (0 분 - 40 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (33.1 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00602
실시예 81 : 약물 링커 21 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 238]
Figure pat00603
(공정 1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-({2-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에틸)아미노]-2-옥소에톡시}메틸)글리신아미드
(약물 링커 21)
실시예 59 공정 4-2 에서 얻어진 화합물 (15.0 ㎎) 과 실시예 66 공정 1 에서 얻어진 화합물 (17.4 ㎎) 을 사용하여, 실시예 21 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 25 ％ - 50 ％ (0 분 - 40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 40 ％ - 90 ％ (0 분 - 40 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (21.8 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00604
실시예 82 : 약물 링커 22 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 239]
Figure pat00605
(공정 1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[2-({6-아미노-9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-2-일}아미노)에틸]글리신아미드
(약물 링커 22)
실시예 61 공정 4-2 에서 얻어진 화합물 (4.4 ㎎) 과 실시예 21 공정 3 에서 얻어진 화합물 (3.5 ㎎) 을 사용하여, 실시예 21 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 25 ％ - 45 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (6.4 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00606
실시예 83 : 약물 링커 23 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 240]
Figure pat00607
(공정 1)
tert-부틸 N-[(벤질옥시)카르보닐]글리실글리실-L-페닐알라닐글리시네이트
시판 (BACHEM) 되는 N-[(벤질옥시)카르보닐]글리실글리실-L-페닐알라닌 (5.00 g) 과 글리신 tert-부틸에스테르염산염 (2.03 g) 의 N,N-디메틸포르미아미드 (50 ㎖) 용액에, 빙랭하, N,N-디이소프로필에틸아민 (4.11 ㎖) 과 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드염산염 (3.01 g) 을 첨가하고, 실온까지 승온하면서 밤새 교반하였다. 반응액을 클로로포름과 포화 탄산수소나트륨 수용액의 2 층에 따르고, 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 물과 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축 후, 톨루엔으로 2 회 공비하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (4.51 g) 을 얻었다.
Figure pat00608
(공정 2)
tert-부틸 글리실글리실-L-페닐알라닐글리시네이트
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (4.51 g) 의 메탄올 (20 ㎖) - 디클로로메탄 (80 ㎖) 혼합액에, 10 ％ 팔라듐탄소 (M) wet (750 ㎎) 를 첨가하고, 수소 분위기하, 실온에서 밤새 교반하였다. 10 ％ 팔라듐탄소 (M) wet (1.5 g) 를 추가하고, 수소 분위기하, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응액을 셀라이트로 여과하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 아미노 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (3.18 g) 을 얻었다.
Figure pat00609
(공정 3)
tert-부틸 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐글리시네이트
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (2.65 g) 과 시판 (도쿄 화성 공업) 되는 6-말레이미드헥산산 N-숙신이미딜 (2.20 g) 을 N,N-디메틸포르미아미드 (20 ㎖) 에 용해하고, 실온에서 7 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 디클로로메탄과 물의 2 층에 따르고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 물로 3 회, 포화 식염수로 1 회 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (3.52 g) 을 얻었다.
Figure pat00610
(공정 4)
N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐글리신
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.00 g) 의 디클로로메탄 (9.0 ㎖) 용액에, 0 ℃ 에서 트리플루오로아세트산 (4.5 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 2.5 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 톨루엔으로 2 회 공비하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 로 정제하고, 표제 화합물 (534 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00611
(공정 5)
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐글리시네이트
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (462 ㎎) 을 사용하여, 실시예 21 공정 3 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (258 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00612
(공정 6)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[2-({6-아미노-9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-9H-푸린-2-일}아미노)에틸]글리신아미드
(약물 링커 23)
실시예 8 공정 8-2 에서 얻어진 화합물 (9.5 ㎎) 과 상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (7.5 ㎎) 을 사용하여, 실시예 23 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％ - 30 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (7.8 ㎎) 을 얻었다.
Figure pat00613
실시예 84 : 당사슬 리모델링 항체 3 의 합성
항HER2 항체 2 - [SG-(N3)2]2 의 조제
[합성 스킴]
[화학식 241]
Figure pat00614
(공정 1)
(Fucα1,6)GlcNAc-항HER2 항체 2 의 조제
시판되는 PERJETA (등록상표) 점적정주 (點滴靜注) 420 ㎎/14 ㎖ (츄가이 제약) (3.5 ㎖) 를 공통 조작 C 에 따라서 버퍼 교환하고, 인산 완충 생리 식염수 용액 (6.0 ㎖, 15.39 ㎎/㎖, pH 6.0) 을 얻었다. 실시예 25 공정 1 과 동일한 조작을 실시하고, 표제 항체의 20 mM 인산 완충 용액 (12.96 ㎎/㎖, 7.5 ㎖, pH 6.0) 을 얻었다.
(공정 2)
항HER2 항체 2 - [SG-(N3)2]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 항체의 20 mM 인산 완충 용액 (12.96 ㎎/㎖, 7.5 ㎖, pH 6.0) 과 [N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox (22.5 ㎎) 를 사용하여, 실시예 25 공정 2 과 동일한 조작을 실시하고, 표제 항체의 인산 완충 생리 식염수 용액 (10.21 ㎎/㎖, 9.0 ㎖, pH 6.0) 을 얻었다.
실시예 85 : 당사슬 리모델링 항체 4 의 합성
개변 항HER2 항체 2 - [SG-(N3)2]2 의 조제
[합성 스킴]
[화학식 242]
Figure pat00615
(공정 1)
(Fucα1,6)GlcNAc - 개변 항HER2 항체 2 의 조제
참고예 5 에 따라서 조제한 개변 항HER2 항체 2 의 인산 완충 생리 식염수 용액 (24 ㎖, 12.25 ㎎/㎖, pH 6.0) 을 사용하여, 실시예 25 공정 1 과 동일한 조작을 실시하고, 표제 항체의 20 mM 인산 완충 용액 (20.86 ㎎/㎖, 12.5 ㎖, pH 6.0) 을 얻었다.
(공정 2)
개변 항HER2 항체 2 - [SG-(N3)2]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 항체의 20 mM 인산 완충 용액 (20.86 ㎎/㎖, 12.5 ㎖, pH 6.0) 과 [N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox (52 ㎎) 를 사용하여, 실시예 25 공정 2 와 동일한 조작을 실시하고, 표제 항체의 인산 완충 생리 식염수 용액 (10.87 ㎎/㎖, 22 ㎖, pH 6.0) 을 얻었다.
실시예 86 : 당사슬 리모델링 항체 5 의 합성
항CD33 항체 - [SG-(N3)2]2 의 조제
[합성 스킴]
[화학식 243]
Figure pat00616
(공정 1)
(Fucα1,6)GlcNAc-항CD33 항체의 조제
참고예 6 에 따라서 조제한 항CD33 항체의 인산 완충 생리 식염수 용액 (9.0 ㎖, 11.56 ㎎/㎖, pH 6.0) 을 사용하여, 실시예 25 공정 1 과 동일한 조작을 실시하고, 표제 항체의 20 mM 인산 완충 용액 (11.62 ㎎/㎖, 8 ㎖, pH 6.0) 을 얻었다.
(공정 2)
항CD33 항체 - [SG-(N3)2]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 항체의 20 mM 인산 완충 용액 (11.62 ㎎/㎖, 8 ㎖, pH 6.0) 과 [N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox (21.5 ㎎) 를 사용하여, 실시예 25 공정 2 와 동일한 조작을 실시하고, 표제 항체의 인산 완충 생리 식염수 용액 (10.01 ㎎/㎖, 8 ㎖, pH 6.0) 을 얻었다.
실시예 87 : 당사슬 리모델링 항체 6 의 합성
항EphA2 항체 - [SG-(N3)2]2 의 조제
[합성 스킴]
[화학식 244]
Figure pat00617
(공정 1)
(Fucα1,6)GlcNAc-항EphA2 항체의 조제
참고예 7 에 따라서 조제한 항EphA2 항체의 인산 완충 생리 식염수 용액 (8.0 ㎖, 12.83 ㎎/㎖, pH 6.0) 을 사용하여, 실시예 25 공정 1 과 동일한 조작을 실시하고, 표제 항체의 20 mM 인산 완충 용액 (13.51 ㎎/㎖, 7 ㎖, pH 6.0) 을 얻었다.
(공정 2)
항EphA2 항체 - [SG-(N3)2]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 항체의 20 mM 인산 완충 용액 (13.51 ㎎/㎖, 7 ㎖, pH 6.0) 과 [N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox (21.7 ㎎) 를 사용하여, 실시예 25 공정 2 와 동일한 조작을 실시하고, 표제 항체의 인산 완충 생리 식염수 용액 (8.91 ㎎/㎖, 7.5 ㎖, pH 6.0) 을 얻었다.
실시예 88 : 당사슬 리모델링 항체 7 의 합성
항CDH6 항체 - [SG-(N3)2]2 의 조제
[합성 스킴]
[화학식 245]
Figure pat00618
(공정 1)
(Fucα1,6)GlcNAc-항CDH6 항체의 조제
참고예 8 에 따라서 조제한 항CDH6 항체의 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH = 6.0) 완충액 (5.0 ㎖, 20.0 ㎎/㎖) 을 공통 조작 C 에 따라서, 인산 완충 생리 식염수 용액 (pH = 6.0) 으로 버퍼 교환 후, 실시예 25 공정 1 과 동일한 조작을 실시하고, 표제 항체의 20 mM 인산 완충 용액 (9.58 ㎎/㎖, 9.0 ㎖, pH 6.0) 을 얻었다.
(공정 2)
항CDH6 항체 - [SG-(N3)2]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 항체의 20 mM 인산 완충 용액 (9.58 ㎎/㎖, 9.0 ㎖, pH 6.0) 과 [N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox (24.5 ㎎) 를 사용하여, 실시예 25 공정 2 와 동일한 조작을 실시하고, 표제 항체의 인산 완충 생리 식염수 용액 (10.69 ㎎/㎖, 7.5 ㎖, pH 6.0) 을 얻었다.
실시예 89 : 당사슬 리모델링 항체 8 의 합성
개변 항HER2 항체 2 - [MSG1-(N3)]2 의 조제
[합성 스킴]
[화학식 246]
Figure pat00619
(공정 1)
(Fucα1,6)GlcNAc - 개변 항HER2 항체 2 의 조제
실시예 85 공정 1 과 동일한 반응을 실시하고, 원료 항체의 완충 용액 (10 ㎖, 12.25 ㎎/㎖, pH 6.0) 으로부터, 표제 항체의 20 mM 인산 완충 용액 (14.84 ㎎/㎖, 7.5 ㎖, pH 6.0) 을 얻었다.
(공정 2)
개변 항HER2 항체 2 - [MSG1-(N3)]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 항체의 20 mM 인산 완충 용액 (14.84 ㎎/㎖, 7.5 ㎖, pH 6.0) 과 [N3-PEG(3)]-MSG1(9)-Ox (WO2018/003983 의 화합물 1-11) (19 ㎎) 를 사용하여, 실시예 25 공정 2 와 동일한 조작을 실시하고, 표제 항체의 인산 완충 생리 식염수 용액 (10.48 ㎎/㎖, 9.25 ㎖, pH 6.0) 을 얻었다.
실시예 90 : 항체 약물 콘쥬게이트 5 의 합성 (항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 4 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 1 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.97 ㎎/㎖, 0.500 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.250 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 1 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.091 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.159 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 3 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (3.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.49 ㎎/㎖
항체 수량 : 1.71 ㎎ (31 ％)
약물 평균 결합수 : 3.6
실시예 91 : 항체 약물 콘쥬게이트 6 의 합성 (항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 5 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 1 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.97 ㎎/㎖, 0.500 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.250 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 2a 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.091 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.159 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (3.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.91 ㎎/㎖
항체 수량 : 3.17 ㎎ (58 ％)
약물 평균 결합수 : 3.6
실시예 92 : 항체 약물 콘쥬게이트 7 의 합성 (항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 6 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 1 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.70 ㎎/㎖, 4.00 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (2.00 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 2b 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.707 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (1.293 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 3 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (24.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.96 ㎎/㎖
항체 수량 : 23.57 ㎎ (59 ％)
약물 평균 결합수 : 3.7
실시예 93 : 항체 약물 콘쥬게이트 8 의 합성 (항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 7 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 1 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.70 ㎎/㎖, 4.00 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (2.00 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 5 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.707 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (1.293 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (24.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.10 ㎎/㎖
항체 수량 : 26.86 ㎎ (67 ％)
약물 평균 결합수 : 3.7
실시예 94 : 항체 약물 콘쥬게이트 9 의 합성 (항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 8 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 1 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.70 ㎎/㎖, 4.00 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (2.00 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 6 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.707 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (1.293 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (24.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.34 ㎎/㎖
항체 수량 : 32.92 ㎎ (82 ％)
약물 평균 결합수 : 3.7
실시예 95 : 항체 약물 콘쥬게이트 10 의 합성 (항LPS 항체 - CDN 콘쥬게이트 2 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 2 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.55 ㎎/㎖, 0.500 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.250 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 2a 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.087 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.163 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (3.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.88 ㎎/㎖
항체 수량 : 3.08 ㎎ (62 ％)
약물 평균 결합수 : 3.6
실시예 96 : 항체 약물 콘쥬게이트 11 의 합성 (항EphA2 항체 - CDN 콘쥬게이트 1 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 6 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (8.91 ㎎/㎖, 0.500 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.250 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 2b 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.073 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.177 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (3.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 F 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.60 ㎎/㎖
항체 수량 : 2.10 ㎎ (47 ％)
약물 평균 결합수 : 3.8
실시예 97 : 항체 약물 콘쥬게이트 12 의 합성 (항CD33 항체 - CDN 콘쥬게이트 1 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 5 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.01 ㎎/㎖, 0.500 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.250 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 2b 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.083 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.167 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (3.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.73 ㎎/㎖
항체 수량 : 2.57 ㎎ (51 ％)
약물 평균 결합수 : 3.9
실시예 98 : 항체 약물 콘쥬게이트 13 의 합성 (항CDH6 항체 - CDN 콘쥬게이트 1 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 7 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.69 ㎎/㎖, 0.500 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.250 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 2b 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.088 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.162 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 3 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (3.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.96 ㎎/㎖
항체 수량 : 3.37 ㎎ (63 ％)
약물 평균 결합수 : 3.8
실시예 99 : 항체 약물 콘쥬게이트 14 의 합성 (항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 1 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 3 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.21 ㎎/㎖, 1.50 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.750 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 3 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.253 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.497 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (9.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.02 ㎎/㎖
항체 수량 : 9.73 ㎎ (64 ％)
약물 평균 결합수 : 3.7
실시예 100 : 항체 약물 콘쥬게이트 15 의 합성 (항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 9 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 1 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.70 ㎎/㎖, 0.500 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.250 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 8 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.088 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.162 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (3.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.93 ㎎/㎖
항체 수량 : 3.24 ㎎ (61 ％)
약물 평균 결합수 : 3.6
실시예 101 : 항체 약물 콘쥬게이트 16 의 합성 (항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 10 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 1 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.35 ㎎/㎖, 13.50 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (6.750 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 9 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 2.310 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (4.440 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (74.3 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.36 ㎎/㎖
항체 수량 : 100.8 ㎎ (72 ％)
약물 평균 결합수 : 3.7
실시예 102 : 항체 약물 콘쥬게이트 17 의 합성 (항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 11 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 1 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.70 ㎎/㎖, 0.500 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.250 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 10 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.088 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.162 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 3 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (3.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.63 ㎎/㎖
항체 수량 : 2.22 ㎎ (42 ％)
약물 평균 결합수 : 3.5
실시예 103 : 항체 약물 콘쥬게이트 18 의 합성 (항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 12 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 1 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.70 ㎎/㎖, 0.500 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.250 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 11 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.088 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.162 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 3 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (3.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.94 ㎎/㎖
항체 수량 : 3.29 ㎎ (62 ％)
약물 평균 결합수 : 3.6
실시예 104 : 항체 약물 콘쥬게이트 19 의 합성 (항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 13 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 1 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.70 ㎎/㎖, 0.500 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.250 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 12 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.088 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.162 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 3 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (3.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.92 ㎎/㎖
항체 수량 : 3.20 ㎎ (60 ％)
약물 평균 결합수 : 3.5
실시예 105 : 항체 약물 콘쥬게이트 20 의 합성 (항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 14 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 1 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.70 ㎎/㎖, 0.500 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.250 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 13 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.088 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.162 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 3 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (3.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.01 ㎎/㎖
항체 수량 : 3.52 ㎎ (66 ％)
약물 평균 결합수 : 3.5
실시예 106 : 항체 약물 콘쥬게이트 21 의 합성 (항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 15 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 1 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.70 ㎎/㎖, 0.500 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.250 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 14 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.088 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.162 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (3.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.78 ㎎/㎖
항체 수량 : 2.74 ㎎ (51 ％)
약물 평균 결합수 : 3.6
실시예 107 : 항체 약물 콘쥬게이트 22 의 합성 (항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 16 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 1 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.70 ㎎/㎖, 0.500 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.250 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 15 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.088 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.162 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (3.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.32 ㎎/㎖
항체 수량 : 4.61 ㎎ (86 ％)
약물 평균 결합수 : 3.6
실시예 108 : 항체 약물 콘쥬게이트 23 의 합성 (항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 17 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 1 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.70 ㎎/㎖, 0.500 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.250 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 16 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.088 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.162 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (3.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.93 ㎎/㎖
항체 수량 : 3.25 ㎎ (61 ％)
약물 평균 결합수 : 3.6
실시예 109 : 항체 약물 콘쥬게이트 24 의 합성 (항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 18 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 1 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.70 ㎎/㎖, 4.00 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (2.00 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 7 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.707 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (1.293 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 3 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (24.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.33 ㎎/㎖
항체 수량 : 32.64 ㎎ (82 ％)
약물 평균 결합수 : 3.7
실시예 110 : 항체 약물 콘쥬게이트 25 의 합성 (항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 2 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 4 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.87 ㎎/㎖, 8.00 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (4.00 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 17a 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 1.079 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 18 당량) 과 프로필렌글리콜 (2.921 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 3 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (44.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.16 ㎎/㎖
항체 수량 : 51.5 ㎎ (59 ％)
약물 평균 결합수 : 3.8
실시예 111 : 항체 약물 콘쥬게이트 26 의 합성 (항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 3 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 4 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.87 ㎎/㎖, 8.00 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (4.00 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 17b 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 1.079 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 18 당량) 과 프로필렌글리콜 (2.921 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 3 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (44.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.24 ㎎/㎖
항체 수량 : 54.99 ㎎ (63 ％)
약물 평균 결합수 : 3.9
실시예 112 : 항체 약물 콘쥬게이트 27 의 합성 (항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 4 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 4 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.89 ㎎/㎖, 1.00 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.500 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 19 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.180 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.320 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 3 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (7.0 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.79 ㎎/㎖
항체 수량 : 5.53 ㎎ (51 ％)
약물 평균 결합수 : 3.9
실시예 113 : 항체 약물 콘쥬게이트 28 의 합성 (항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 5 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 4 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.89 ㎎/㎖, 1.00 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.500 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 21 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.180 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.320 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 3 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (7.0 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.84 ㎎/㎖
항체 수량 : 5.91 ㎎ (54 ％)
약물 평균 결합수 : 3.9
실시예 114 : 항체 약물 콘쥬게이트 29 의 합성 (항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 6 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 4 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.89 ㎎/㎖, 1.00 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.500 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 22 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.180 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.320 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (5.0 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.92 ㎎/㎖
항체 수량 : 4.60 ㎎ (42 ％)
약물 평균 결합수 : 3.5
실시예 115 : 항체 약물 콘쥬게이트 30 의 합성 (항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 7 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 4 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.89 ㎎/㎖, 1.00 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.500 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 18 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.180 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.320 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (7.0 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.08 ㎎/㎖
항체 수량 : 7.53 ㎎ (69 ％)
약물 평균 결합수 : 3.9
실시예 116 : 항체 약물 콘쥬게이트 31 의 합성 (항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 8 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 4 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.89 ㎎/㎖, 1.00 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.500 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 20 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.180 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.320 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (7.0 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.09 ㎎/㎖
항체 수량 : 7.62 ㎎ (70 ％)
약물 평균 결합수 : 3.8
실시예 117 : 항체 약물 콘쥬게이트 32 의 합성 (항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 9 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 8 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.48 ㎎/㎖, 1.00 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.500 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 17a 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.087 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 12 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.413 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (7.0 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.77 ㎎/㎖
항체 수량 : 5.36 ㎎ (51 ％)
약물 평균 결합수 : 1.8
실시예 118 : 항체 약물 콘쥬게이트 33 의 합성 (항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 10 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 8 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.48 ㎎/㎖, 1.00 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.500 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 17b 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.087 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 12 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.413 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (7.0 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.91 ㎎/㎖
항체 수량 : 6.34 ㎎ (61 ％)
약물 평균 결합수 : 1.8
실시예 119 : 항체 약물 콘쥬게이트 34 의 합성 (항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 19 의 합성)
참고예 1 에 따라서 조제한 항HER2 항체의 인산 완충 용액을, 공통 조작 C 에 따라서 버퍼 교환하고, 인산 완충 생리 식염수/5 mM - EDTA 의 항체 용액 (7.69 ㎎/㎖) 을 조제하였다. 이 항체 용액 (0.65 ㎖) 에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀염산염의 수용액 (10 mM, 20.7 ㎕) 과 인산수소2칼륨 수용액 (1 M, 9.8 ㎕) 을 첨가하였다. 반응액의 pH 가 7.4 ± 1.0 이내인 것을 확인한 후, 37 ℃ 에서 2 시간 교반하였다. 약물 링커 23 의 DMSO 용액 (10 mM, 0.0689 ㎖) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 1 시간 반응시켰다. 반응액에 N-아세틸-L-시스테인 수용액 (100 mM, 6.9 ㎕) 을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응액을 공통 조작 C 에 기재된 방법에 따라서 버퍼 교환하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (1.6 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.46 ㎎/㎖
항체 수량 : 2.34 ㎎ (47 ％)
약물 평균 결합수 : 6.5
실시예 120 : 약물 링커 24 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 247]
Figure pat00620
(공정 1)
실시예 44 공정 8 에서 얻어진 화합물 (1.55 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 6-벤조일-2-{2-데옥시-2-플루오로-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 얻어진 아세토니트릴 용액과 실시예 77 공정 6 에서 얻어진 화합물 (1.96 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 8 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 2)
2-(트리메틸실릴)에틸 (2-{[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-15-플루오로-2-하이드록시-2-옥소-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에톡시)메틸]아미노}-2-옥소에틸)카르바메이트
상기 공정 1 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 62 공정 2 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.07 g : 불순물 함유) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1262(M＋H)＋.
(공정 3)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,16R)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-15-플루오로-2,10-디옥소-7-[6-옥소-1-(2-{[(N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리실)아미노]메톡시}에틸)-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-10-술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2-올레이트
상기 공정 2 에서 얻어진 (1.07 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 과 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴 - 메탄올 (1 : 1), 아세토니트릴 - 메탄올 (1 : 1) : 25 ％ - 90 ％ (0 분 - 40 분)] 로 정제하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (67.8 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (56.6 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1105(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1105(M＋H)＋.
(공정 4-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,16R)-15-플루오로-7-(1-{2-[(글리실아미노)메톡시]에틸}-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-16-하이드록시-2,10-디옥소-10-술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2-올레이트
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (67.8 ㎎) 을 사용하여, 실시예 11 공정 9-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 과 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴 - 메탄올 (1 : 1), 아세토니트릴 - 메탄올 (1 : 1) : 10 ％ - 60 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (33.7 ㎎ : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 847(M＋H)＋.
(공정 4-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,16R)-15-플루오로-7-(1-{2-[(글리실아미노)메톡시]에틸}-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-16-하이드록시-2,10-디옥소-10-술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2-올레이트
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (56.6 ㎎) 을 사용하여, 실시예 11 공정 9-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 과 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴 - 메탄올 (1 : 1), 아세토니트릴 - 메탄올 (1 : 1) : 10 ％ - 60 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (32.6 ㎎ : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 847(M＋H)＋.
(공정 5-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-2-옥사이드-2,10-디옥소-10-술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에톡시)메틸]글리신아미드
(디아스테레오머 1)
상기 공정 4-1 에서 얻어진 화합물 (33.7 ㎎) 과 실시예 22 공정 11 에서 얻어진 화합물 (21.3 ㎎) 을 사용하여, 실시예 22 공정 9-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물 (11.2 ㎎) 을 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 과 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 40 ％ - 90 ％ (0 분 - 40 분)].
Figure pat00621
(공정 5-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-2-옥사이드-2,10-디옥소-10-술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에톡시)메틸]글리신아미드
(디아스테레오머 2)
상기 공정 4-2 에서 얻어진 화합물 (32.6 ㎎) 과 실시예 22 공정 11 에서 얻어진 화합물 (20.6 ㎎) 을 사용하여, 실시예 22 공정 9-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물 (16.7 ㎎) 을 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 40 ％ - 90 ％ (0 분 - 40 분)], 및 분취 HPLC [100 mM 헥사플루오로-2-프로판올, 8 mM 트리에틸아민 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％ - 45 ％ (0 분 - 40 분)].
Figure pat00622
실시예 121 : 약물 링커 25 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 248]
Figure pat00623
(공정 1)
N,N-디에틸에탄아미늄 6-벤조일-2-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-데옥시-2-플루오로-3-O-[옥사이드(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
실시예 44 공정 7 에서 얻어진 화합물 (1.49 g) 의 피리딘 (10.4 ㎖) 용액에, 빙랭하에서 아인산디페닐 (599 ㎕) 을 첨가하고, 실온까지 승온하여 30 분간 교반하였다. 아인산디페닐 (200 ㎕) 을 추가하여, 2 시간 더 교반하였다. 빙랭하, 반응액에 물 (1.5 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 30 분간 교반한 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [아세트산에틸/메탄올/0.1 ％ 트리에틸아민] 으로 정제하고, 표제 화합물 (1.41 g) 을 얻었다.
Figure pat00624
(공정 2)
6-벤조일-2-{2-데옥시-2-플루오로-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보퓨라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (1.41 g) 의 디클로로메탄 (20.0 ㎖) 용액에, 물 (289 ㎕) 과 디클로로아세트산 (1.14 ㎖) 의 디클로로메탄 (20.0 ㎖) 용액을 첨가하고, 실온에서 10 분간 교반하였다. 반응액에 피리딘 (2.19 ㎖) 을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 감압 농축하였다. 잔류물에 트리플루오로아세트산피리딘염 (402 ㎎) 을 첨가하고, 탈수 아세토니트릴 (15 ㎖) 로 3 회 공비하고, 마지막 1 회는 10 ㎖ 정도의 아세토니트릴을 남겼다. 얻어진 아세토니트릴 용액을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
MS(ESI)m/z : 477(M＋H)＋.
(공정 3)
실시예 77 공정 6 에서 얻어진 화합물 (2.15 g) 과 상기 공정 2 에서 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액을 사용하여, 실시예 63 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 4)
2-(트리메틸실릴)에틸 (2-{[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-15-플루오로-2,10-디옥소-2-술파닐옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에톡시)메틸]아미노}-2-옥소에틸)카르바메이트
상기 공정 3 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 9 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (1.00 g : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1262(M＋H)＋.
(공정 5)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-15-플루오로-2,10-디옥소-7-[6-옥소-1-(2-{[(N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리실)아미노]메톡시}에틸)-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일]-2-술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-10-올레이트
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.00 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (191 ㎎ : 불순물 함유) 과 디아스테레오머 2 (369 ㎎ : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1105(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1105(M＋H)＋.
(공정 6-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-7-(1-{2-[(글리실아미노)메톡시]에틸}-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-16-하이드록시-2,10-디옥소-2-술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-10-올레이트
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (191 ㎎) 을 사용하여, 실시예 40 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (21.9 ㎎ : 불순물 함유) 을 얻었다.
Figure pat00625
(공정 6-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-7-(1-{2-[(글리실아미노)메톡시]에틸}-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-16-하이드록시-2,10-디옥소-2-술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-10-올레이트
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (369 ㎎) 을 사용하여, 실시예 40 공정 5 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (137 ㎎ : 불순물 함유) 을 얻었다.
Figure pat00626
(공정 7-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-10-옥사이드-2,10-디옥소-2-술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에톡시)메틸]글리신아미드
(약물 링커 25a : 디아스테레오머 1)
상기 공정 6-1 에서 얻어진 화합물 (21.9 ㎎) 을 사용하여, 실시예 22 공정 9-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물 (26.3 ㎎) 을 얻었다.
[정제 조건] 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 30 ％ - 50 ％ (0 분 - 30 분)] 및 Sep-Pak (등록상표) C18 [물/아세토니트릴/0.1 ％ 트리에틸아민].
Figure pat00627
(공정 7-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-10-옥사이드-2,10-디옥소-2-술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에톡시)메틸]글리신아미드
(약물 링커 25b : 디아스테레오머 2)
상기 공정 6-2 에서 얻어진 화합물 (47.5 ㎎) 을 사용하여, 실시예 22 공정 9-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하고, 표제 화합물 (15.1 ㎎) 을 얻었다.
[정제 조건] 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 30 ％ - 50 ％ (0 분 - 30 분)] 및 Sep-Pak (등록상표) C18 [물/아세토니트릴/0.1 ％ 트리에틸아민].
Figure pat00628
실시예 122 : 약물 링커 26 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 249]
Figure pat00629
(공정 1)
실시예 77 공정 6 에서 얻어진 화합물 (1.26 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-1-(2-{[(N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리실)아미노]메톡시}에틸)이노신의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 얻어진 아세토니트릴 용액과 실시예 44 공정 8 에서 얻어진 화합물 (1.00 g) 을 사용하여, 실시예 63 공정 1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 얻어진 미정제 생성물을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(공정 2)
2-(트리메틸실릴)에틸 (2-{[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-15-플루오로-2-하이드록시-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에톡시)메틸]아미노}-2-옥소에틸)카르바메이트
상기 공정 1 에서 얻어진 미정제 생성물을 사용하여, 실시예 62 공정 2 와 동일한 수법으로 반응을 실시하고, 표제 화합물 (678 ㎎ : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1246(M＋H)＋.
(공정 3)
2-(트리메틸실릴)에틸 (2-{[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-15-플루오로-2-하이드록시-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에톡시)메틸]아미노}-2-옥소에틸)카르바메이트
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (678 ㎎) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 과 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1), 아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1) : 25 ％ - 90 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (99.6 ㎎ : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1089(M＋H)＋.
(공정 4)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,16R)-15-플루오로-7-(1-{2-[(글리실아미노)메톡시]에틸}-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-푸린-9-일)-16-하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(올레이트)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (99.6 ㎎) 을 사용하여, 실시예 11 공정 9-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 과 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1), 아세토니트릴 - 메탄올 용액 (1 : 1) : 10 ％ - 60 ％ (0 분 - 30 분)] 로 정제하고, 표제 화합물 (60.8 ㎎ : 불순물 함유) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 831(M＋H)＋.
(공정 5)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데히드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥사이드-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에톡시)메틸]글리신아미드
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (60.8 ㎎) 과 실시예 22 공정 11 에서 얻어진 화합물 (21.3 ㎎) 을 사용하여, 실시예 22 공정 9-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하고, 표제 화합물 (30.5 ㎎) 을 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 과 분취 HPLC [100 mM 헥사플루오로-2-프로판올, 8 mM 트리에틸아민 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％ - 45 ％ (0 분 - 40 분)].
Figure pat00630
실시예 123 : 항체 약물 콘쥬게이트 35 의 합성 (항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 11 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 4 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.87 ㎎/㎖, 1.00 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.500 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 24a 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.135 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 18 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.365 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (7.0 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 F 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.08 ㎎/㎖
항체 수량 : 7.54 ㎎ (69 ％)
약물 평균 결합수 : 3.8
실시예 124 : 항체 약물 콘쥬게이트 36 의 합성 (항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 12 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 4 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.87 ㎎/㎖, 1.00 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.500 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 24b 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.135 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 18 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.365 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (7.0 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 F 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.12 ㎎/㎖
항체 수량 : 7.85 ㎎ (72 ％)
약물 평균 결합수 : 3.8
실시예 125 : 항체 약물 콘쥬게이트 37 의 합성 (항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 13 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 4 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.87 ㎎/㎖, 2.00 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (1.00 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 26 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.270 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 18 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.730 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (14.0 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 F 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.05 ㎎/㎖
항체 수량 : 14.71 ㎎ (68 ％)
약물 평균 결합수 : 3.8
실시예 126 : 항체 약물 콘쥬게이트 38 의 합성 (항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 14 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 4 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.89 ㎎/㎖, 3.00 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (1.50 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 25a 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.540 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.960 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 3 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (19 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.38 ㎎/㎖
항체 수량 : 26.28 ㎎ (80 ％)
약물 평균 결합수 : 3.7
실시예 127 : 항체 약물 콘쥬게이트 39 의 합성 (항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 15 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 4 의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.89 ㎎/㎖, 0.500 ㎖) 을 프로필렌글리콜 (0.250 ㎖) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 25b 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.090 ㎖, 항체 1 분자에 대하여 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.160 ㎖) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하고, 목적으로 하는 항체 약물 콘쥬게이트의 ABS 용액 (3.5 ㎖) 을 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.93 ㎎/㎖
항체 수량 : 3.25 ㎎ (60 ％)
약물 평균 결합수 : 3.5
(참고예 1 : 항HER2 항체의 제조)
본 명세서에 있어서, 「트라스투주맙」 은 HERCEPTIN (등록상표), huMAb4D5-8, rhuMAb4D5-8 이라고 불리는 경우도 있으며, 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 인간화 IgG1 항체이다. 아미노산 서열은 US5821337 을 참조하였다. 트라스투주맙의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 1) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 2) 을 도 4 에 나타낸다.
본 명세서에서 사용한 항HER2 항체는, 트라스투주맙의 중사슬 아미노산 서열의 EU 인덱스 234 번째 및 235 번째의 류신 (L) 을 알라닌 (A) 으로 변이 (본 명세서 중, LALA 변이라고도 한다) 시킨, 트라스투주맙의 정상 영역 개변 IgG1 항체 (본 명세서 중, 개변 항HER2 항체라고도 한다) 를 설계하고, 제조하였다. 개변 항HER2 항체의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 1) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 3) 을 도 5 에 나타낸다.
(참고예 2 : 항LPS 항체의 제조)
항LPS 항체는 WO2015/046505 를 참조하여 제조하였다. 본 실시예에서 사용한 항LPS 항체는, 아이소타입이 IgG1 이며, LALA 변이를 갖는다 (본 명세서 중, 개변 항LPS 항체라고도 한다). 본 실시예에서 사용한 개변 항LPS 항체의 경사슬 및 중사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 26 및 서열 번호 27 에 나타낸다.
(참고예 3 : ML-RR-CDA·2Na＋ 의 합성)
본 명세서에서, 레퍼런스 화합물로서 사용한 ML-RR-CDA·2Na＋ 는, 특허문헌 3 (WO2014/189805) 에 기재된 방법에 따라서 합성하였다.
(참고예 4 : 2',3'-cGAMP 의 합성)
본 명세서에서, 레퍼런스 화합물로서 사용한 2',3'-cGAMP 는, cGAS 를 사용하여 ATP 와 GTP 로부터 효소적으로 합성하였다. cGAS 의 조제 및 효소 반응은, 문헌 기재의 방법 (I㎜unity, 2013, 39, 1019-1031, Cell Rep. 2014, 6, 421-430) 을 적절히 개변하여 실시하였다. 정제는, 약염기성 음이온 교환 수지 (DIAION WA10) 및 합성 흡착제 (SEPABEADS SP207SS) 를 사용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 실시하였다.
(참고예 5 : 항HER2 항체 2 의 제조)
「페르투주맙」 은 PERJETA (등록상표) 라고 불리는 경우도 있으며, 서열 번호 28 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 29 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 인간화 IgG1 항체이다. 아미노산 서열은 WO2004/008099 를 참조하였다. 본 명세서에서는 항HER2 항체 2 라고도 한다. 페르투주맙의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 28) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 29) 을 도 17 에 나타낸다.
본 명세서에서는, LALA 변이에 더하여, 중사슬 아미노산 서열의 EU 인덱스 214 번째의 리신 (K) 을 아르기닌 (R) 으로 변이시킨 G1m3 알로타입의 정상 영역을 갖는 항HER2 항체 2 를 설계하고, 제조하였다 (본 명세서 중, 개변 항HER2 항체 2라고도 한다). 본 실시예에서 사용한 개변 항HER2 항체 2 의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 28) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 30) 을 도 18 에 나타낸다.
(참고예 6 : 항CD33 항체의 제조)
항CD33 항체는 WO2014/057687 을 참조하여 제조하였다. 본 실시예에서 사용한 항CD33 항체는, 아이소타입이 IgG1 이며, LALA 변이를 갖는다. 본 실시예에서 사용한 항CD33 항체의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 31) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 32) 을 도 19 에 나타낸다.
(참고예 7 : 항EphA2 항체의 제조)
항EphA2 항체는 WO2009/028639 를 참조하여 제조하였다. 본 실시예에서 사용한 항EphA2 항체는, 아이소타입이 IgG1 이다. 본 실시예에서 사용한 항EphA2 항체의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 33) 및 중사슬 아미노산 서열을 (서열 번호 34) 을 도 20 에 나타낸다.
(참고예 8 : 항CDH6 항체의 제조)
항CDH6 항체는 WO2018/212136 을 참조하여 제조하였다. 본 실시예에서 사용한 항CDH6 항체는, 아이소타입이 IgG1 이며, LALA 변이에 더하여, 중사슬 아미노산 서열의 EU 인덱스 329 번째의 프롤린 (P) 을 글리신 (G) 으로 한 변이를 갖는다. 본 실시예에서 사용한 항CDH6 항체의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 35) 및 중사슬 아미노산 서열을 (서열 번호 36) 을 도 21 에 나타낸다.
(시험예 1) 리포터 세포를 사용한 STING 아고니스트 활성 평가
＜리포터 유전자 어세이＞
인간 STING 아고니스트 활성은, STING 경로의 하류에 있는 인터페론 제어 인자 3 (interferon regulatory factor-3 (IRF3)) 의 경로의 활성화를 확인할 수 있는 THP1-DualTM 세포 (HAQ 변이형) (InvivoGen, CA, US) 를 사용하여 평가하였다. 마우스 STING 아고니스트 활성은 RAW-DualTM 세포 (InvivoGen) 를 사용하여 평가하였다.
어세이는 이하와 같이 실시하였다. 처음에, 투명 96 웰 플레이트 (Corning, NY, US) 에, PBS 로 희석한 피험 화합물을 20 ㎕/웰로 분주 (分注) 하였다. 이어서, 어세이 버퍼 (10 ％ 소 혈청 알부민을 포함하는 RPMI1640 배지 또는 DMEM 배지) 에 현탁한 리포터 세포를 180 ㎕/웰 (1 × 105 세포/웰) 로 첨가하고 자극을 개시하였다. 37 ℃, 5 ％ CO2 환경하에서 24 시간 배양한 후의 원심 상청을 회수하였다. 6 ㎕ 의 회수한 상청을 백색 384 웰 플레이트에 첨가하고, 거기에 QUANTI-Luc (InvivoGen) 용액을 15 ㎕ 첨가하였다. 잘 혼화한 후, 플레이트 리더 (PerkinElmer, MA, US) 를 사용하여 발광을 측정하였다. 1.37 내지 100 μM 의 ML-RR-CDA·2Na＋ (Compound 21 in WO2014/189805) 를 처리한 세포에 있어서의 최대 카운트값을 100 ％, PBS 로 처리한 세포에서의 카운트를 0 ％ 로 하고, 피험 화합물이 50 ％ 의 카운트를 얻는 데에 필요한 농도를 EC50 (μM) 값으로 하여 GraphPad Prism (GraphPad Software, CA, US) 을 사용하여 산출하였다. 표 1 에 인간 STING 아고니스트 활성 시험의 결과를 나타낸다.
[표 1]
이 결과, 본원 화합물이 인간 STING 에 대한 아고니스트 활성을 갖는 것이 분명해졌다. 또, 마우스 STING 에 대해서도, 기존의 CDN 과 동등 이상의 아고니스트 활성을 확인하였다.
(시험예 2) 리콤비넌트 STING C말 결합 도메인 단백질을 사용한 Protein thermal shift 어세이
(i) 각종 발현 플라스미드의 구축
＜인간 TMEM173 발현 플라스미드 (Plasmid) 의 구축＞
인간 STING (본 명세서 중, 인간 TMEM173 이라고 칭하는 경우도 있다) 의 포유 동물 세포 발현용 플라스미드는, 232 번째의 아르기닌 (R) 이 히스티딘 (H) 으로 변이한 (본 명세서 중, H232 변이 또는 REF 변이라고 한다) 인간 TMEM173 cDNA Clone (Accession NM＿198282.3, H232 (REF) 변이형 STING 발현 플라스미드) (GeneCopoeia, MD, US) 을 구입하였다. 인간 H232 (REF) 변이형 STING 의 아미노산 서열을 서열 번호 4 에, 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 5 에 나타낸다. 또, H232 변이형 STING 발현 플라스미드를 주형 (鑄型) 으로 하고, Inverse PCR 법에 기초하는 부위 특이적 변이 도입을 실시하여 야생형 STING 및 변이형 STING 의 발현 플라스미드를 제조하였다. 상세하게는, 먼저 2 종류의 프라이머 (5'-CGTGCTGGCATCAAGGATCGGGTTTAC-3' (H232R(WT)fwd) (서열 번호 12) 및 5'-GTCACCGGTCTGCTGGGGCAGTTTATC-3' (H232R(WT)rev)) (서열 번호 13) 와 KOD-Plus-Mutagenesis 키트 (SMK-101) (토요보) 를 사용하여 PCR 을 실시하고, DNA 시퀀싱에 의해 목적으로 하는 야생형 (R232) STING 발현 플라스미드의 구축을 확인하였다. 인간 야생형 STING 의 아미노산 서열을 서열 번호 6 에, 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 7 에 나타낸다.
다음으로, HAQ (R71H, G230A 및 R293Q) 변이형을, 야생형 STING 발현 플라스미드와 동일한 수법으로 제조하였다. 상세하게는, H232 변이형 STING 발현 플라스미드를 주형으로 하고, 2 종류의 프라이머 (5'-GCTGACCGTGCTGGCATCAAGGATCGGGTTTAC-3' (H232R/G230A fwd) (서열 번호 14) 및 5'-GGTCTGCTGGGGCAGTTTATCCAGG-3' (H232R/G230A rev) (서열 번호 15)) 와 Mutagenesis 키트를 사용하여 PCR 을 실시. 2 개 지점에 동시에 변이를 도입함으로써, G230A 변이형 STING 플라스미드를 취득하였다. 또한, G230A 변이형 STING 발현 플라스미드를 주형으로 하고, 2 종류의 프라이머 (5'-CACCACATCCACTCCAGGTACCGG-3' (R71H fwd) (서열 번호 16) 및 5'-CAGCTCCTCAGCCAGGCTGCAGAC-3' (R71H rev) (서열 번호 17)) 와 Mutagenesis 키트를 사용하여 PCR 을 실시하여, R71H/G230A 변이형 STING 발현 플라스미드를 취득하였다.
계속해서, R71H/G230A 변이형의 STING 발현 플라스미드를 주형으로 하고, 2 종류의 프라이머 (5'-CAGACACTTGAGGACATCCTGGCAG-3' (R293Q fwd) (서열 번호 18) 및 5'-GCAGAAGAGTTTGGCCTGCTCAA-3' (R293Q rev) (서열 번호 19)) 와 Mutagenesis 키트를 사용하여 PCR 을 실시하고, HAQ (R71H/G230A/R293Q) 변이형의 발현 플라스미드를 취득하였다. 인간 HAQ 변이형 STING 의 아미노산 서열을 서열 번호 8 에, 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 9 에 나타낸다.
인간의 야생형 STING, REF 형 STING, HAQ 형 STING 의 아미노산 서열을 도 6 에 나타낸다.
＜리콤비넌트 STING C말 결합 도메인 단백질 발현 플라스미드 등의 구축＞
인간 STING C말 결합 도메인 (aa139-342) 단백질 (UniProt entry Q86WV6) cDNA 는, 전체 길이의 인간 TMEM173 cDNA clone 발현 플라스미드 (야생형, H232 변이형 및 HAQ 변이형) 로부터 2 종류의 프라이머 (5'-ACCTGTATTTTCAGGGCCTGGCCCCAGCTGAGATCTCTG-3' (hST Fw＿v2) (서열 번호 20) 및 5'-CAGAATTCGCAAGCTTTTAAGTAACCTCTTCCTTTTCCTCCTGC-3' (hST Rv＿V3) (서열 번호 21)) 를 사용한 PCR 로 제조하였다. PCR 산물은, N말에 히스티딘 6 염기로 이루어지는 6xHis 태그, Avidin 태그 및 TEV 프로테아제 절단 사이트를 갖도록, In-Fusion HD Cloning 키트 (다카라 바이오) 를 사용하여 대장균 발현용 벡터인 pET15b 에 삽입하고, pET15b-HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 야생형, pET15b-HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 REF 변이형 및 pET15b-HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 AQ 변이형의 발현 플라스미드를 구축하였다.
마우스 STING C말 결합 도메인 (aa138-341) 단백질 (UniProt entry Q3TBT3) 발현용 cDNA 에는, 마우스 TMEM173 cDNA 서열로부터 138 번째 내지 341 번째의 아미노산에 해당하는 cDNA 를 eurofins Genomics 로 인공 합성한 것을 사용하였다. 마우스 STING 의 아미노산 서열을 서열 번호 10 에, 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 11 에 나타낸다. 합성한 cDNA 는, N말에 히스티딘 6 염기로 이루어지는 6xHis 태그, Avidin 태그 및 TEV 프로테아제 절단 사이트를 갖도록 In-Fusion HD Cloning 키트를 사용하여 대장균 발현용 벡터인 pET15b 에 삽입하고, pET15b-HisAviTEV-mSTING (138-341) 마우스 야생형의 발현 플라스미드를 구축하였다.
pCDF＿Duet-1 벡터에 인공 합성한 대장균 BirA (UniProt entry P06709) cDNA 를 삽입하고, pCDF＿Duet-1 BirA (1-321) 발현 플라스미드를 구축하였다.
(ii) STING C말 결합 도메인 단백질의 조제법
제조한 각 pET15b-HisAviTEV-hSTING (139-342) (인간 야생형, 인간 REF 변이형 및 인간 AQ 변이형의 STING C말 결합 도메인 단백질) 발현 플라스미드 및 pET15b-HisAviTEV-mSTING (138-341) (마우스 야생형의 STING C말 결합 도메인 단백질) 발현 플라스미드는 각각 pCDF＿Duet-1 BirA (1-321) 발현 플라스미드와 동시에 Competent E. coli Rosetta 2 (DE3) (Merck Millipore, MA, US) 로 형질 전환하고, 각 HisAviTEV-STING 발현주를 제조하였다. 이들 발현주를 100 ㎍/㎖ 암피실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 및 30 ㎍/㎖ 카나마이신을 포함하는 TB 배지에 첨가하고, 37 ℃ 에서 배양 후, 100 μM IPTG 로 유도 발현하고 추가로 16 ℃ 에서 배양하였다.
배양액을 원심하고, 얻어진 균체를 50 mM HEPES pH 8.0, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole, 1 mM DTT, 5 ％ (w/v) glycerol, Complete EDTA free 에 현탁 후, 동결 융해하였다. Lysozyme, DNase I 을 첨가한 후, 초음파 파쇄에 의해 단백질을 추출하고, 원심을 거쳐 상청을 회수하였다. 얻어진 상청을 AKTAexpress 크로마토그래피 시스템 (GE Healthcare, IL, US) 을 사용하여 HisTrap FF 칼럼 (GE Healthcare) 으로 정제하고, Superdex200 16/60 칼럼 (GE Healthcare) 에 통과시켜 Buffer (20 mM HEPES pH 7.5, 120 mM NaCl, 20 ％ Glycerol, 0.8 mM DTT) 로 용출하였다. SEC 로 목적 분자량의 단백질을 포함하는 획분 회수하고, His-Avi-TEV-hSTING (139-342) 인간 야생형 단백질, HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 REF 변이형 단백질, HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 AQ 변이형 단백질 및 His-Avi-TEV-mSTING (138-341) 마우스 야생형 단백질로서 회수하였다. 단백질 농도는 Nanodrop2000 (Thermo Fisher Scientific, MA, US) 을 사용하여 측정하고, 사용까지 -80 ℃ 에서 동결 보존하였다.
HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 야생형 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호 22, HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 REF 변이형 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호 23, HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 AQ 변이형 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호 24, His-Avi-TEV-mSTING (138-341) 마우스 야생형 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호 25 에 나타낸다.
(iii) STING 결합 시험
STING C말 결합 도메인 단백질에 대한 화합물의 결합성은, 단백질의 열 변성 온도의 상승을 지표로 하는 Protein thermal shift assay 에 의해 실시하였다.
상세하게는, 384 웰의 리얼타임 PCR 플레이트에, 어세이 버퍼 (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 120 mM NaCl) 를 사용하여, 3 ㎕ 의 피험 화합물 (종농도 0.5 mM), 3 ㎕ 의 SYPRO Orange Protein Gel Stain (Thermo Fisher Scientific) (종농도 20 × 농도) 와 6 ㎕ 의 STING 단백질을 혼합하고, 플레이트 쉐이커를 사용하여 혼화하였다. 리얼타임 PCR 시스템 (Thermo Fisher Scientific) 에 의해, 온도를 매초 0.03 ℃ 의 속도로 25 ℃ 에서 95 ℃ 까지 상승시켜, 단백질의 열 변성 온도를 SYPRO Orange 가 발하는 형광을 지표로 측정하였다. 얻어진 측정값은, 해석 소프트웨어인 Protein Thermal Shift software (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여, 형광 강도의 증가 속도가 최대값을 나타내는 온도로서 Tm (the midpoint of the unfolding transition) (℃) 을 구하였다. 각 화합물의 Tm 값으로부터, 화합물 무첨가 웰의 Tm 값을 뺌으로써, 피험 화합물에 의한 Tm 의 시프트를 ΔTm (℃) 으로서 산출하였다. STING 단백질에 대한 결합 시험의 결과를 표 2 에 나타낸다.
[표 2]
이 결과, 본원 화합물이 인간의 야생형 STING 및 변이형 STING, 마우스의 야생형 STING 에 대하여 결합 활성을 갖는 것이 분명해졌다.
(시험예 3) 항종양 시험 (1)
마우스 : 5 주령의 자성 (雌性) BALB/c 마우스 (BALB/cAnNCrlCrlj) (일본 찰스·리버) 를 실험 사용 전에 SPF 조건하에서 4 일간 이상 순화하였다.
측정, 계산식 : 모든 연구에 있어서, 종양의 장경 및 단경을 전자식 디지털 캘리퍼 (CD15-CX, 미츠토요) 로 1 주간에 2 ∼ 3 회 측정하고, 종양 체적 (㎣) 을 계산하였다. 계산식은 이하에 나타내는 바와 같음.
종양 체적 (㎣) = 0.5 × 장경 (㎜) × [단경 (㎜)]2
시험 화합물은 생리 식염수 (오츠카 제약 공장) 에 의해 희석하여 사용하였다. 투여 시에는 50 ㎕ 를 종양내 투여하였다.
American Type Culture Collection 사로부터 구입한 마우스 대장암 세포주 CT26.WT (CRL2638) 세포를 사용하였다. CT26.WT 세포를 생리 식염수에 현탁하고, 1.0 × 106 세포를 BALB/c 마우스의 우측 액와부에 피하 이식하고 (Day 0), 7 일 후에 무작위로 군 분류를 실시하였다. 각 시험 화합물은 10 ㎍ 의 용량으로, Day 7, 9 및 11 에 합계 3 회 종양내 투여하였다. 또 비히클군으로서 생리 식염수를 투여하는 군을 설정하였다. 각 군의 마우스 마릿수는 5 마리 또는 6 마리로 하였다.
결과를 도 7a 및 도 7b 에 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 사각선은 화합물 번호 6a 투여군, 백색 역삼각선은 화합물 번호 8b 투여군, 백색 동그라미선은 화합물 번호 9b 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다. 비히클군은 종양의 증식이 진행되었다. 이에 반해, 화합물 투여군에서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
이상으로부터, 고리형 디뉴클레오티드 유도체의 종양내 투여에 의한 항종양 효과가 확인되었다.
(시험예 4) 항종양 시험 (2)
American Type Culture Collection 사로부터 구입한 마우스 대장암 세포주 CT26.WT (CRL2638) 에 인간 HER2 유전자를 도입한 CT26.WT-hHER2 세포를 만들었다. 상세하게는, 인간 HER2 의 cDNA 를 포함하는 플라스미드 (Clone ID IOH82145 ; Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여 cDNA 를 증폭하고, 이것을 In-Fusion HD Cloning 키트 (Clontech) 를 사용하여 pQCXIN 레트로바이러스 벡터 (다카라 바이오) 에 삽입하였다. 인간 HER2 삽입 pQCXIN 레트로바이러스 벡터를 EcoPack2-293 세포주 (다카라 바이오) 에 Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) 을 사용하여 도입하고, 상청을 회수하여 CT26.WT 에 감염시켰다. 세포는 250 ㎍/㎖ Geneticin (Thermo Fisher Scientific) 첨가 배지에서 유지하였다.
항체 - CDN 콘쥬게이트는 아세트산염 완충액 (10 mM Acetate Buffer, 5 ％ Sorbitol, pH 5.5) (나칼라이 테스크) 에 의해 희석하여 사용하였다. 투여 시에는 200 ㎕ 를 꼬리 정맥내 투여하였다.
CT26.WT-hHER2 세포를 생리 식염수에 현탁하고, 5.0 × 106 세포를 BALB/c 마우스의 우측 액와부에 피하 이식하고 (Day 0), 7 일 후에 무작위로 군 분류를 실시하였다. 각 항체 - CDN 콘쥬게이트는 30 ㎍ 의 용량으로, Day 7 에 합계 1 회 꼬리 정맥내 투여하였다. 또 비히클군으로서 아세트산염 완충액을 투여하는 군을 설정하였다. 각 군의 마우스 마릿수는 8 마리로 하였다.
결과를 도 8 에 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 삼각선은, 참고예 1 에서 제조한 개변 항HER2 항체에 실시예 8b 의 화합물을 콘쥬게이트시킨 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 투여군, 흑색 삼각선은, 참고예 2 에서 제조한 개변 항LPS 항체에 동일하게 실시예 8b 의 화합물을 콘쥬게이트시킨 항LPS 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다. 비히클군 및 HER2 에 결합하지 않는 항LPS 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 투여군에서는 종양의 증식이 진행되었다. 이에 반해, 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 투여군에서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
이상으로부터, 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 의 정맥내 투여에 의한 항체 표적 의존적인 항종양 효과가 확인되었다.
(시험예 5) 항종양 시험 (3)
CT26.WT-hHER2 세포를 생리 식염수에 현탁하고, 5.0 × 106 세포를 BALB/c 마우스의 우측 액와부에 피하 이식하고 (Day 0), 6 일 후에 무작위로 군 분류를 실시하였다. 각 항체 - CDN 콘쥬게이트는 30 ㎍ 의 용량으로, Day 6 에 합계 1 회 꼬리 정맥내 투여하였다. 또 비히클군으로서 아세트산염 완충액을 투여하는 군을 설정하였다. 각 군의 마우스 마릿수는 6 마리 또는 8 마리로 하였다.
결과를 도 9 에 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 사각선은 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (2) 투여군, 백색 삼각선은 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (3) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다. 비히클군은 종양의 증식이 진행되었다. 이에 반해, 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (2) 및 (3) 투여군에서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
이상으로부터, 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트의 강한 항종양 효과가 확인되었다.
(시험예 6) 항종양 시험 (4)
CT26.WT-hHER2 세포를 생리 식염수에 현탁하고, 5.0 × 106 세포를 BALB/c 마우스의 우측 액와부에 피하 이식하고 (Day 0), 7 일 후에 무작위로 군 분류를 실시하였다. 항체 - CDN 콘쥬게이트 (19) 는 30 ㎍ 의 용량으로, Day 7 에 합계 1 회 꼬리 정맥내 투여하였다. 또 비히클군으로서 아세트산염 완충액을 투여하는 군을 설정하였다. 각 군의 마우스 마릿수는 6 마리로 하였다.
결과를 도 10 에 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 삼각선은 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (19) 투여군을 나타낸다. 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (19) 는 약물 링커가 시스테인 콘쥬게이션으로 항체에 결합되어 있다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다. 비히클군은 종양의 증식이 진행되었다. 이에 반해, 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (19) 투여군에서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
이상으로부터, 항체와 약물 링커를 시스테인 콘쥬게이션 한 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트의 강한 항종양 효과가 확인되었다.
(시험예 7) 항종양 시험 (5)
CT26.WT-hHER2 세포를 생리 식염수에 현탁하고, 5.0 × 106 세포를 BALB/c 마우스의 우측 액와부에 피하 이식하고 (Day 0), 6 일 후에 무작위로 군 분류를 실시하였다. 각 항체 - CDN 콘쥬게이트는 30 ㎍ 의 용량으로, Day 6 에 합계 1 회 꼬리 정맥내 투여하였다. 또 비히클군으로서 아세트산염 완충액을 투여하는 군을 설정하였다. 각 군의 마우스 마릿수는 5 마리로 하였다.
결과를 도 11 에 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 삼각선은 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (9) 투여군, 백색 역삼각선은 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (10) 투여군, 백색 마름모꼴선은 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (11) 투여군, 백색 동그라미선은 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (12) 투여군, 백색 사각선은 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 투여군을 나타낸다. 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (9), (10), (11), (12) 및 (1) 은 각각 상이한 링커로 실시예 8b 의 화합물이 콘쥬게이션 되어 있다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다. 비히클군은 종양의 증식이 진행되었다. 이에 반해, 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (9), (10), (11) 및 (12) 투여군에서는 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 투여군과 마찬가지로 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
이상으로부터, 항HER2 항체 - CDN 콘쥬게이트는 링커를 바꾼 경우에 있어서도 항종양 효과를 나타내는 것이 확인되었다.
(시험예 8) 항종양 시험 (6)
CT26.WT-hHER2 세포를 생리 식염수에 현탁하고, 5.0 × 106 세포를 BALB/c 마우스의 우측 액와부에 피하 이식하고 (Day 0), 7 일 후에 무작위로 군 분류를 실시하였다. 각 투여 검체는, Day 7 에 합계 1 회 꼬리 정맥내 투여하였다. 또 비히클군으로서 아세트산염 완충액을 투여하는 군을 설정하였다. 각 군의 마우스 마릿수는 5 마리로 하였다.
결과를 도 12 에 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 삼각선은 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (1) 의 60 ㎍ 투여군, 흑색 역삼각선은 항HER2 항체 2 의 59 ㎍ 투여군, 흑색 동그라미선은 화합물 번호 8b 의 1.2 ㎍ 투여군을 나타낸다. 항HER2 항체 2 및 화합물 번호 8b 의 투여량은, 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (1) 을 구성하는 각 성분의 당량이다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다. 비히클군은 종양의 증식이 진행되었다. 이에 반해, 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (1) 투여군에서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다. 그러나, 항HER2 항체 2 및 화합물 번호 8b 의 당량을 투여했을 때는 종양의 증식을 억제하지 않았다.
이상으로부터, 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (1) 은 항종양 효과를 나타내고, 당량의 항HER2 항체 2 및 화합물 번호 8b 는, 꼬리 정맥내 투여에서는 항종양 효과를 나타내지 않는 것이 확인되었다.
(시험예 9) 항종양 시험 (7)
CT26.WT-hHER2 세포를 생리 식염수에 현탁하고, 5.0 × 106 세포를 BALB/c 마우스의 우측 액와부에 피하 이식하고 (Day 0), 7 일 후에 무작위로 군 분류를 실시하였다. 각 항체 - CDN 콘쥬게이트는 30 ㎍ 의 용량으로, Day 7 에 합계 1 회 꼬리 정맥내 투여하였다. 또 비히클군으로서 아세트산염 완충액을 투여하는 군을 설정하였다. 각 군의 마우스 마릿수는 5 마리 또는 6 마리로 하였다.
결과를 도 13(a) 내지 (c) 에 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 각 백색 심볼선은 평가한 각 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (2), (3), (4), (5), (6), (7) 및 (8) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다. 비히클군은 종양의 증식이 진행되었다. 이에 반해, 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (2), (3), (4), (5), (6), (7) 및 (8) 투여군에서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
이상으로부터, 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트의 강한 항종양 효과가 확인되었다.
(시험예 10) 항종양 시험 (8)
CT26.WT-hHER2 세포를 생리 식염수에 현탁하고, 5.0 × 106 세포를 BALB/c 마우스의 우측 액와부에 피하 이식하고 (Day 0), 7 일 후에 무작위로 군 분류를 실시하였다. 각 항체 - CDN 콘쥬게이트는 60 ㎍ 의 용량으로, Day 7 에 합계 1 회 꼬리 정맥내 투여하였다. 또 비히클군으로서 아세트산염 완충액을 투여하는 군을 설정하였다. 각 군의 마우스 마릿수는 5 마리로 하였다.
결과를 도 14 에 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 삼각선은 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (9) 투여군, 백색 동그라미선은 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (10) 투여군을 나타낸다. 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (9) 및 (10) 은 약물 평균 결합수가 약 2 인 MSG 형 당사슬 리모델링 항체를 사용한 항체 - CDN 콘쥬게이트이다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다. 비히클군은 종양의 증식이 진행되었다. 이에 반해, 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (9) 및 (10) 투여군에서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
이상으로부터, 약물 평균 결합수가 약 2 인 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트의 강한 항종양 효과가 확인되었다.
(시험예 11) 항종양 시험 (9)
American Type Culture Collection 사로부터 구입한 마우스 대장암 세포주 CT26.WT (CRL2638) 에 인간 EphA2 유전자를 도입한 CT26.WT-hEphA2 세포를 만들었다. 상세하게는, 인간 EphA2 의 cDNA 를 포함하는 pDONR221 (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여 cDNA 를 증폭하고, 이것을 Gateway vector conversion system (Thermo Fisher Scientific) 을 사용하여 pLNCX 레트로바이러스 벡터 (다카라 바이오) 에 삽입하였다. 인간 EphA2 삽입 pLNCX 레트로바이러스 벡터를 EcoPack2-293 세포주 (다카라 바이오) 에 Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) 을 사용하여 도입하고, 상청을 회수하여 CT26.WT 에 감염시켰다. 세포는 500 ㎍/㎖ Geneticin (Thermo Fisher Scientific) 첨가 배지에서 유지하였다.
CT26.WT-hEphA2 세포를 인산 완충액에 현탁하고, 1.9 × 106 세포를 BALB/c 마우스의 우측 액와부에 피하 이식하고 (Day 0), 7 일 후에 무작위로 군 분류를 실시하였다. 항EphA2 항체 및 항EphA2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 은 60 ㎍ 의 용량으로, Day 7 에 합계 1 회 꼬리 정맥내 투여하였다. 또 비히클군으로서 아세트산염 완충액을 투여하는 군을 설정하였다. 각 군의 마우스 마릿수는 8 마리로 하였다.
결과를 도 15 에 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 동그라미선은 항EphA2 항체 투여군, 백색 삼각선은 항EphA2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다. 비히클군은 종양의 증식이 진행되었다. 항EphA2 항체 투여군은 종양의 증식을 억제하지 않았다. 이에 반해, 항EphA2 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 투여군에서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
이상으로부터, 항EphA2 항체가 항종양 효과를 나타내지 않는 모델을 사용하여, 항EphA2 항체 - CDN 콘쥬게이트의 강한 항종양 효과가 확인되었다.
(시험예 12) 항종양 시험 (10)
American Type Culture Collection 사로부터 구입한 마우스 림프구형 세포주 P388D1 (CCL-46) 에 인간 CD33 유전자를 도입한 P388D1-hCD33 세포를 만들었다. 상세하게는, 인간 CD33 의 cDNA 를 삽입한 pLVSIN 렌티바이러스 벡터 (다카라 바이오) 를 만들고, Lenti-X293T 세포주 (다카라 바이오) 에 Lentiviral High Titer Packaging Mix (다카라 바이오) 를 사용하여 도입하고, 상청을 회수하여 P388D1 에 감염시켰다. 세포는 2 ㎍/㎖ Puromycin (Thermo Fisher Scientific) 첨가 배지에서 유지하였다.
마우스는 4 주령의 자성 DBA/2 마우스 (DBA/2NCrl) (일본 찰스·리버) 를 구입하고, 실험 사용 전에 SPF 조건하에서 5 일간 순화하였다.
P388D1-hCD33 세포를 인산 완충액에 현탁하고, 1.0 × 106 세포를 DBA/2 마우스의 우측 액와부에 피하 이식하고 (Day 0), 4 일 후에 무작위로 군 분류를 실시하였다. 항CD33 항체 및 항CD33 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 은 60 ㎍ 의 용량으로, Day 4 에 합계 1 회 꼬리 정맥내 투여하였다. 또 비히클군으로서 아세트산염 완충액을 투여하는 군을 설정하였다. 각 군의 마우스 마릿수는 10 마리로 하였다.
결과를 도 16 에 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 동그라미선은 항CD33 항체 투여군, 백색 삼각선은 항CD33 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다. 비히클군은 종양의 증식이 진행되었다. 항CD33 항체 투여군은 종양의 증식을 억제하지 않았다. 이에 반해, 항CD33 항체 - CDN 콘쥬게이트 (1) 투여군에서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
이상으로부터, 항CD33 항체가 항종양 효과를 나타내지 않는 모델을 사용하여, 항CD33 항체 - CDN 콘쥬게이트의 강한 항종양 효과가 확인되었다.
(시험예 13) 항종양 시험 (11)
CT26.WT-hHER2 세포를 생리 식염수에 현탁하고, 5.0 × 106 세포를 BALB/c 마우스의 우측 액와부에 피하 이식하고 (Day 0), 7 일 후에 무작위로 군 분류를 실시하였다. 각 항체 - CDN 콘쥬게이트는 60 ㎍ 의 용량으로, Day 7 에 합계 1 회 꼬리 정맥내 투여하였다. 또 비히클군으로서 아세트산염 완충액을 투여하는 군을 설정하였다. 각 군의 마우스 마릿수는 6 마리로 하였다.
결과를 도 22 에 나타낸다. 도면 중의 흑색 사각선은 비히클군, 백색 삼각선은 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (11) 투여군, 백색 동그라미선은 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (12) 투여군을 나타낸다. 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (11) 및 (12) 에 콘쥬게이션 되어 있는 화합물 번호 52a 및 52b 는 인산기를 갖는 CDN 이다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다. 비히클군은 종양의 증식이 진행되었다. 이에 반해, 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (11) 및 (12) 투여군에서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
이상으로부터, 인산기를 갖는 CDN 을 콘쥬게이트 한 항HER2 항체 2 - CDN 콘쥬게이트 (11) 및 (12) 의 강한 항종양 효과가 확인되었다.
본 발명에 의해 강한 STING 아고니스트 활성을 갖고, 강한 항종양 효과를 나타내는 신규 CDN 유도체가 제공된다. 또, 본 발명에 의해 당해 신규 CDN 유도체를 포함하는 항체 약물 콘쥬게이트가 제공된다. 이들은, STING 아고니스트 활성이 관련하는 질환 (예를 들어, 암) 의 치료제로서 유용하다.
서열표 프리텍스트
서열 번호 1 : 트라스투주맙의 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 2 : 트라스투주맙의 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 3 : 개변 항HER2 항체의 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 4 : 인간 H232 (REF) 변이형 STING 의 아미노산 서열
서열 번호 5 : 인간 H232 (REF) 변이형 STING 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 6 : 인간 야생형 STING 의 아미노산 서열
서열 번호 7 : 인간 야생형 STING 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 8 : 인간 HAQ 변이형 STING 의 아미노산 서열
서열 번호 9 : 인간 HAQ 변이형 STING 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 10 : 마우스 STING 의 아미노산 서열
서열 번호 11 : 마우스 STING 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 12 ∼ 21 : 프라이머의 서열
서열 번호 22 : HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 야생형 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 23 : HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 REF 변이형 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 24 : HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 AQ 변이형 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 25 : His-Avi-TEV-mSTING (138-341) 마우스 야생형 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 26 : 개변 항LPS 항체의 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 27 : 개변 항LPS 항체의 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 28 : 페르투주맙 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 29 : 페르투주맙 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 30 : 개변 항HER2 항체 2 의 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 31 : 항CD33 항체 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 32 : 항CD33 항체 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 33 : 항EphA2 항체 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 34 : 항EphA2 항체 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 35 : 항CDH6 항체 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 36 : 항CDH6 항체 중사슬의 아미노산 서열
SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Novel Cyclic Dinucleotide Derivatives and Antibody-Drug Conjugate thereof <130> SAP-855-PCT <141> 2019-09-06 <150> JP 2018167369 <151> 2018-09-06 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trastuzumab Light Chain <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 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actccaggta ccggggcagc 240 tactggagga ctgtgcgggc ctgcctgggc tgccccctcc gccgtggggc cctgttgctg 300 ctgtccatct atttctacta ctccctccca aatgcggtcg gcccgccctt cacttggatg 360 cttgccctcc tgggcctctc gcaggcactg aacatcctcc tgggcctcaa gggcctggcc 420 ccagctgaga tctctgcagt gtgtgaaaaa gggaatttca acgtggccca tgggctggca 480 tggtcatatt acatcggata tctgcggctg atcctgccag agctccaggc ccggattcga 540 acttacaatc agcattacaa caacctgcta cggggtgcag tgagccagcg gctgtatatt 600 ctcctcccat tggactgtgg ggtgcctgat aacctgagta tggctgaccc caacattcgc 660 ttcctggata aactgcccca gcagaccggt gaccatgctg gcatcaagga tcgggtttac 720 agcaacagca tctatgagct tctggagaac gggcagcggg cgggcacctg tgtcctggag 780 tacgccaccc ccttgcagac tttgtttgcc atgtcacaat acagtcaagc tggctttagc 840 cgggaggata ggcttgagca ggccaaactc ttctgccgga cacttgagga catcctggca 900 gatgcccctg agtctcagaa caactgccgc ctcattgcct accaggaacc tgcagatgac 960 agcagcttct cgctgtccca ggaggttctc cggcacctgc ggcaggagga aaaggaagag 1020 gttactgtgg gcagcttgaa gacctcagcg gtgcccagta cctccacgat 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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 31 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD33 Antibody Light Chain <400> 31 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Leu Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Arg Phe Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Met Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys 85 90 95 Glu Val Pro Trp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 32 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD33 Antibody Heavy Chain <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Ser 20 25 30 Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Pro Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 33 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-EphA2 Antibody Light Chain <400> 33 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 34 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-EphA2 Antibody Heavy Chain <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 35 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CDH6 Antibody Light Chain <400> 35 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Lys Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Asn Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Gly Trp Ala 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 36 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CDH6 Antibody Heavy Chain <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn 20 25 30 Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450

Claims (43)

  1. 다음 식 (Ia) :

    (여기서,
    L1 은, 하이드록시기, -NH2, 2-하이드록시아세틸아미노메틸기 및 2-[(2-하이드록시아세틸)아미노]에틸기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 내지 3 개의 기에 의해 임의의 위치에서 치환되어 있어도 되는, 다음 식

    (여기서,
    R6 및 R6' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, -NH2, C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기 또는 C2-C6 알키닐기를 나타내고,
    R7 및 R7' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1-C6 알킬기를 나타내고, 그 C1-C6 알킬기는, 할로겐 원자 및 옥소기로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 개의 치환기에 의해 치환되어 있어도 되고,
    R8 및 R8' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 할로겐 원자를 나타내고,
    Z4 는, -CH2-, -NH- 또는 산소 원자를 나타내고,
    Z5 는, 질소 원자 또는 -CH= 를 나타낸다)
    으로 이루어지는 군에서 선택되는 기를 나타내고,
    L3 은, 수소 원자, 할로겐 원자, -NH2, 하이드록시 C1-C3 알킬기 또는 아미노 C1-C3 알킬기를 나타내고,
    Q1 및 Q1' 는, 각각 독립적으로, 하이드록시기, 티올기 또는 보라노기 (BH3 -) 를 나타내고,
    Q2 및 Q2' 는, 각각 독립적으로, 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고,
    X1 및 X2 는, 각각 독립적으로, 산소 원자, 황 원자 또는 -CH2- 를 나타내고,
    Y1 및 Y2 는, 산소 원자 또는 -CH2- 를 나타내고,
    X3 및 X4 는, 하기 (iii) 또는 (iv) :
    (iii) Y1 이 산소 원자일 때, X3-X4 는, -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-CH2- 또는 -CH2-CF2- 를 나타낸다 ; 또는
    (iv) Y1 이 -CH2- 일 때, X3-X4 는, -O-CH2- 를 나타낸다,
    에서 선택되는 기를 나타내고,
    X5 및 X6 은, 하기 (v) 또는 (vi) :
    (v) Y2 가 산소 원자일 때, X5-X6 은, -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-CH2- 또는 -CH2-CF2- 를 나타낸다 ; 또는
    (vi) Y2 가 -CH2- 일 때, X5-X6 은, -O-CH2- 를 나타낸다,
    에서 선택되는 기를 나타내고,
    R1, R2 및 R3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, -OR', -OC(=O)R', -N3, -NHR', -NR'R'' 또는 -NHC(=O)R' (여기서, R' 는, 수소 원자, C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기, C2-C6 알키닐기 또는 C3-C6 시클로알킬기를 나타내고, 그 C1-6 알킬기, C2-C6 알케닐기 또는 C2-C6 알키닐기는, 1 내지 6 개의 할로겐 원자로 치환되어도 된다, R'' 는, C1-6 알킬기, C2-6 알케닐기, C2-6 알키닐기 또는 C3-C6 시클로알킬기를 나타낸다) 를 나타내고,
    W1 은, 질소 원자, 산소 원자, 황 원자 또는 -CH- 를 나타내고,
    W2 는, 질소 원자 또는 -CH= 를 나타내고,
    R4 는, 수소 원자, 할로겐 원자 또는 -NH2 를 나타내고,
    R5 는, 하기 (vii) 내지 (x) :
    (vii) W1 이 질소 원자일 때, R5 는 수소 원자, C1-C6 알킬기, 하이드록시 C1-C6 알킬기 또는 아미노 C1-C6 알킬기를 나타낸다 ;
    (viii) W1 이 산소 원자일 때, R5 는 존재하지 않고 ;
    (ix) W1 이 황 원자일 때, R5 는 존재하지 않고 ; 또는
    (x) W1 이 -CH- 일 때, R5 는 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, -NH2 또는 C1-C6 알킬기를 나타낸다,
    에서 선택되는 기를 나타내고,
    Z1-Z2-Z3 은 하나가 되어, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-R'''-, -CH=CH-CH2-, -CH=CX-CH2-, -CX=CH-CH2-, -CX=CX-CH2-, -C(=O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(=O)-, -CH2-CH(CH3)-CH2- 또는 -CH2-CH2-CH(CH3)- (여기서, R''' 는, -O- 또는 -CH2-CH2- 를 나타내고, X 는, 할로겐 원자를 나타낸다) 또는 하기 식 중 어느 것으로 나타내는 기

    (여기서, 아스테리스크는, W1 에 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은, =C- 의 탄소 원자에 결합하고 있는 것을 나타낸다) 에서 선택되는 기를 나타낸다)
    으로 나타내는 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  2. 제 1 항에 있어서,
    W1 이 질소 원자인, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  3. 제 2 항에 있어서,
    W1 이 질소 원자이고, R5 가 수소 원자인, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  4. 제 1 항에 있어서,
    W1 이 산소 원자인, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  5. 제 1 항에 있어서,
    W1 이 황 원자인, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  6. 제 1 항에 있어서,
    W1 이 -CH- 인, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  7. 제 6 항에 있어서,
    W1 이 -CH- 이고, R5 가 수소 원자인, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  8. 제 1 항에 있어서,
    Z1, Z2 및 Z3 이, 하나가 되어, -CH2-CH2-CH2- 또는 -CH=CH-CH2- 인, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  9. 제 1 항에 있어서,
    Z1, Z2 및 Z3 이, 하나가 되어, -CH2-CH(CH3)-CH2- 또는 -CH2-CH2-CH(CH3)- 인, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  10. 제 1 항에 있어서,
    Z1, Z2 및 Z3 이, 하나가 되어, -CH2-CH2-R'''- (여기서, R''' 는, -O- 또는 -CH2-CH2- 를 나타낸다) 인, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  11. 제 1 항에 있어서,
    W2 가 -CH= 인, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  12. 제 1 항에 있어서,
    W2 가 질소 원자인, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  13. 제 1 항에 있어서,
    R4 가, 수소 원자를 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  14. 제 1 항에 있어서,
    R4 가, 불소 원자를 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  15. 제 1 항에 있어서,
    L1 중의 R8 및 R8' 가, 각각 독립적으로, 수소 원자인, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  16. 제 1 항에 있어서,
    L1 이, 다음 식으로 이루어지는 군에서 선택되는 기

    (여기서, R9 및 R9' 는, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기 또는 -NH2 를 나타내고,
    R10 은, 하이드록시기, -NH2, -NHC(=O)CH2OH, -CH2NHC(=O)CH2OH, -CH2CH2NHC(=O)CH2OH, 하이드록시 C1-C3 알킬기 또는 아미노 C1-C3 알킬기를 나타내고,
    R11 및 R11' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 불소 원자 혹은 메틸기를 나타내거나, 또는, R11 및 R11' 가 결합하여 시클로프로판을 나타내고,
    Z4 는, -CH2-, -NH- 또는 산소 원자를 나타낸다)
    인, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  17. 제 1 항에 있어서,
    L1 이, 다음 식으로 이루어지는 군에서 선택되는 기

    (여기서, R13 및 R13' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 하이드록시기 또는 -NH2 를 나타내고,
    R12 는, 하이드록시기, -NH2, -CH2OH, -NHC(=O)CH2OH, -CH2NHC(=O)CH2OH 또는 -CH2CH2NHC(=O)CH2OH 를 나타내고,
    Z4 는, 제 1 항에서 정의한 바와 같다)
    인, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  18. 제 1 항에 있어서,
    L1 이, 다음 식으로 이루어지는 군에서 선택되는 기

    (여기서, R14 는, 수소 원자 또는 -NH2 를 나타내고,
    R15 는, 수소 원자 또는 -C(=O)CH2OH 를 나타내고,
    R16 은, 하이드록시기, -NH2, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2NH2 또는 -CH2CH2NH2 를 나타낸다)
    인, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  19. 제 1 항에 있어서,
    L3 이, 수소 원자, 불소 원자, -NH2, -CH2OH 또는 -CH2NH2 를 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  20. 제 1 항에 있어서,
    Q1 및 Q1' 가, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 티올기를 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  21. 제 1 항에 있어서,
    X1 및 X2 가, 산소 원자를 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  22. 제 1 항에 있어서,
    Y1 및 Y2 가, 산소 원자를 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  23. 제 1 항에 있어서,
    X3 및 X4 가, -CH2-O- 를 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  24. 제 1 항에 있어서,
    X5 및 X6 이, -CH2-O- 를 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  25. 제 1 항에 있어서,
    R1, R2 및 R3 이, 각각 독립적으로, 수소 원자, 하이드록시기 또는 불소 원자인, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  26. 제 1 항에 있어서,
    이하의 2 식 :

    (여기서, L1, Q1, Q1', Q2 및 Q2' 는, 제 1 항에서 정의한 바와 같고,
    R17, R17', R18 및 R18' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기 또는 -NH2 를 나타내고,
    W3 은, -NH-, 산소 원자, 황 원자 또는 -CH2- 를 나타내고,
    W4 는, -CH= 또는 질소 원자를 나타낸다)
    중 어느 것으로 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  27. 제 26 항에 있어서,
    이하의 2 식 :

    (여기서, L1, Q1, Q1', Q2 및 Q2' 는, 제 1 항에서 정의한 바와 같고, R17, R17', R18 및 R18' 는, 제 26 항에서 정의한 바와 같다)
    중 어느 것으로 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  28. 제 26 항에 있어서,
    이하의 8 식 :

    (여기서, L1, Q1, Q1', Q2 및 Q2' 는, 제 1 항에서 정의한 바와 같고,
    R19, R19', R20 및 R20' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 불소 원자를 나타낸다)
    중 어느 것으로 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  29. 제 26 항에 있어서,
    이하의 4 식 :

    (여기서, L1 은, 제 1 항에서 정의한 바와 같다)
    중 어느 것으로 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  30. 제 26 항에 있어서,
    이하의 4 식 :

    (여기서, L1 은, 제 1 항에서 정의한 바와 같다)
    중 어느 것으로 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  31. 제 26 항에 있어서,
    이하의 4 식 :

    (여기서, L1 은, 제 1 항에서 정의한 바와 같다)
    중 어느 것으로 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  32. 제 1 항에 있어서,
    다음 식 :

    (여기서, L1 은, 제 1 항에서 정의한 바와 같고,
    Q3 및 Q3' 는, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 티올기를 나타내고,
    R21 및 R22 는, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 불소 원자를 나타내고,
    W5 는, -NH- 또는 황 원자를 나타낸다)
    으로 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  33. 제 32 항에 있어서,
    이하의 2 식 :

    (여기서, L1 은, 제 1 항에서 정의한 바와 같고, Q3, Q3'및 W5 는, 제 32 항에서 정의한 바와 같다)
    중 어느 것으로 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  34. 제 1 항에 있어서,
    L1 이, 이하의 4 식:

    중 어느 것으로 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  35. 제 1 항에 있어서,
    L1 이, 이하의 4 식 :

    중 어느 것으로 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  36. 제 32 항에 있어서,
    D 가, 이하의 4 식 :

    (여기서, Q3, Q3' 및 W5 는, 제 32 항에서 정의한 바와 같다)
    중 어느 것으로 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  37. 제 32 항에 있어서,
    D 가, 이하의 4 식 :

    중 어느 것으로 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  38. 제 32 항에 있어서,
    D 가, 이하의 3 식 :

    중 어느 것으로 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  39. 제 32 항에 있어서,
    D 가, 이하의 4 식 :

    중 어느 것으로 나타내는, 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염.
  40. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염을 함유하는, 암 치료용 STING 아고니스트.
  41. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염을 함유하는, 암 치료용 의약 조성물.
  42. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약리상 허용되는 염을 함유하는, 항종양제.
  43. 제 42 항에 있어서,
    종양이, 폐암, 신장암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 다형 신경교아종, 난소암, 췌암, 유방암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 자궁체암, 정소암, 자궁경암, 태반 융모암, 다형 신경교아종, 뇌종양, 두경부암, 갑상선암, 중피종, 소화관 간질 종양 (GIST), 담낭암, 담관암, 부신암, 유극세포암, 백혈병, 악성 림프종, 형질 세포종, 골수종 또는 육종인, 항종양제.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4115909A1 (en) * 2020-03-06 2023-01-11 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate including novel cyclic dinucleotide derivative
EP4134098A4 (en) 2020-04-10 2024-05-15 ONO Pharmaceutical Co., Ltd. CANCER THERAPY METHODS
EP4209506A1 (en) 2020-09-02 2023-07-12 Daiichi Sankyo Company, Limited Novel endo-?-n-acetylglucosaminidase
TW202241454A (zh) * 2021-02-01 2022-11-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－免疫賦活化劑共軛物之新穎製造方法
JPWO2022191313A1 (ko) 2021-03-12 2022-09-15
US11806405B1 (en) 2021-07-19 2023-11-07 Zeno Management, Inc. Immunoconjugates and methods
TW202334175A (zh) 2021-10-29 2023-09-01 日商第一三共股份有限公司 新穎寡糖、該寡糖之製造中間體及其等之製造方法
TW202334238A (zh) 2021-11-30 2023-09-01 日商第一三共股份有限公司 蛋白酶分解性遮蔽抗體
WO2024024935A1 (ja) * 2022-07-29 2024-02-01 第一三共株式会社 抗腫瘍効果を有する抗体薬物複合体の新規製造方法
WO2024048490A1 (ja) * 2022-08-29 2024-03-07 第一三共株式会社 変異Ｆｃ領域を含む抗体薬物コンジュゲート
WO2024107827A1 (en) * 2022-11-16 2024-05-23 The Broad Institute, Inc. Therapeutic exploitation of sting channel activity
WO2024118785A2 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tlr7 agonists and antibody-drug-conjugates thereof

Citations (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014093936A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Aduro Biotech, Inc. Compositions comprising cyclic purine dinucleotides having defined stereochemistries and methods for their preparation and use
WO2014099824A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Pharmaceutical targeting of a mammalian cyclic di-nucleotide signaling pathway
WO2014179335A1 (en) 2013-04-29 2014-11-06 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods for altering second messenger signaling
WO2014189806A1 (en) 2013-05-18 2014-11-27 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for inhibiting "stimulator of interferon gene" dependent signalling
WO2014189805A1 (en) 2013-05-18 2014-11-27 Auro Biotech, Inc. Compositions and methods for activating "stimulator of interferon gene"-dependent signalling
WO2015074145A1 (en) 2013-11-22 2015-05-28 Brock University Use of fluorinated cyclic dinucleotides as oral vaccine adjuvants
WO2015185565A1 (en) 2014-06-04 2015-12-10 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Cyclic di-nucleotides as modulators of sting
WO2016012305A1 (de) 2014-07-23 2016-01-28 Wacker Chemie Ag Härtbare organopolysiloxanzusammensetzungen
WO2016096714A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 Henkel Ag & Co. Kgaa Detergent composition comprising subtilase variants
WO2016145102A1 (en) 2015-03-10 2016-09-15 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for activating "stimulator of interferon gene" -dependent signalling
WO2017027645A1 (en) 2015-08-13 2017-02-16 Merck Sharp & Dohme Corp. Cyclic di-nucleotide compounds as sting agonists
WO2017075477A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for activating "stimulator of interferon gene"-dependent signalling
WO2017093933A1 (en) 2015-12-03 2017-06-08 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Cyclic purine dinucleotides as modulators of sting
WO2017100305A2 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Opi Vi - Ip Holdco Llc Composition of antibody construct-agonist conjugates and methods of use thereof
WO2017123669A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Gary Glick Cyclic dinucleotides for treating conditions associated with sting activity such as cancer
WO2017161349A1 (en) 2016-03-18 2017-09-21 Immune Sensor, Llc Cyclic di-nucleotide compounds and methods of use
WO2017175147A1 (en) 2016-04-07 2017-10-12 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Heterocyclic amides useful as protein modulators
WO2017175156A1 (en) 2016-04-07 2017-10-12 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Heterocyclic amides useful as protein modulators
WO2018009466A1 (en) 2016-07-05 2018-01-11 Aduro Biotech, Inc. Locked nucleic acid cyclic dinucleotide compounds and uses thereof
WO2018009648A1 (en) 2016-07-06 2018-01-11 Sperovie Biosciences, Inc. Compounds, compositions, and methods for the treatment of disease
WO2018045204A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Ifm Therapeutics, Inc Cyclic dinucleotide analogs for treating conditions associated with sting (stimulator of interferon genes) activity
WO2018060323A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cyclic dinucleotide compounds
WO2018067423A1 (en) 2016-10-04 2018-04-12 Merck Sharp & Dohme Corp. BENZO[b]THIOPHENE COMPOUNDS AS STING AGONISTS
WO2018065360A1 (de) 2016-10-07 2018-04-12 Biolog Life Science Institute Forschungslabor Und Biochemica-Vertrieb Gmbh Benzimidazolhaltige cyclische dinukleotide, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung zur aktivierung von stimulator von interferongenen (sting)-abhängigen signalwegen
WO2018100558A2 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Takeda Pharmaceutical Company Limited Cyclic dinucleotide

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
JPH08511420A (ja) 1993-06-16 1996-12-03 セルテック・セラピューテイクス・リミテッド 抗 体
HU230378B1 (hu) 2001-11-01 2016-03-29 Uab Research Foundation Anti-DR5 ellenanyagok és anti-DR4 ellenanyagok és más terápiás ágensek kombinációi
HUP0600340A3 (en) 2002-07-15 2011-06-28 Genentech Inc Methods for identifying tumors that are responsive to treatment with anti-erbb2 antibodies
US7662387B2 (en) 2003-02-20 2010-02-16 Seattle Genetics Anti-cd70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders
HUE032301T2 (en) 2007-08-30 2017-09-28 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-EPHA2 antibody
JP5566226B2 (ja) 2009-09-03 2014-08-06 旭化成株式会社 １１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの製造方法
KR102584005B1 (ko) 2012-10-11 2023-09-27 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 글리신아미드 화합물의 제조 방법
US11559581B2 (en) 2015-01-09 2023-01-24 Oxford University Innovation Limited Antibody conjugates and methods of making the antibody conjugates
ES2938186T3 (es) * 2015-06-29 2023-04-05 Daiichi Sankyo Co Ltd Procedimiento de fabricación selectiva de un conjugado anticuerpo-fármaco
MA44334A (fr) * 2015-10-29 2018-09-05 Novartis Ag Conjugués d'anticorps comprenant un agoniste du récepteur de type toll
KR102493562B1 (ko) 2016-07-01 2023-01-30 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 hANP-Fc 함유 분자 콘주게이트
US20190330368A1 (en) * 2016-10-07 2019-10-31 Daiichi Sankyo Company, Limited Therapy for drug-resistant cancer by administration of anti-her2 antibody/drug conjugate
JP2018090562A (ja) * 2016-12-01 2018-06-14 武田薬品工業株式会社 環状ジヌクレオチド
WO2018140831A2 (en) * 2017-01-27 2018-08-02 Silverback Therapeutics, Inc. Tumor targeting conjugates and methods of use thereof
TW202330036A (zh) 2017-05-15 2023-08-01 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物之製造方法

Patent Citations (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014093936A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Aduro Biotech, Inc. Compositions comprising cyclic purine dinucleotides having defined stereochemistries and methods for their preparation and use
WO2014099824A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Pharmaceutical targeting of a mammalian cyclic di-nucleotide signaling pathway
WO2014179335A1 (en) 2013-04-29 2014-11-06 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods for altering second messenger signaling
WO2014189806A1 (en) 2013-05-18 2014-11-27 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for inhibiting "stimulator of interferon gene" dependent signalling
WO2014189805A1 (en) 2013-05-18 2014-11-27 Auro Biotech, Inc. Compositions and methods for activating "stimulator of interferon gene"-dependent signalling
WO2015074145A1 (en) 2013-11-22 2015-05-28 Brock University Use of fluorinated cyclic dinucleotides as oral vaccine adjuvants
WO2015185565A1 (en) 2014-06-04 2015-12-10 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Cyclic di-nucleotides as modulators of sting
WO2016012305A1 (de) 2014-07-23 2016-01-28 Wacker Chemie Ag Härtbare organopolysiloxanzusammensetzungen
WO2016096714A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 Henkel Ag & Co. Kgaa Detergent composition comprising subtilase variants
WO2016145102A1 (en) 2015-03-10 2016-09-15 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for activating "stimulator of interferon gene" -dependent signalling
WO2017027645A1 (en) 2015-08-13 2017-02-16 Merck Sharp & Dohme Corp. Cyclic di-nucleotide compounds as sting agonists
WO2017027646A1 (en) 2015-08-13 2017-02-16 Merck Sharp & Dohme Corp. Cyclic di-nucleotide compounds as sting agonists
WO2017075477A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for activating "stimulator of interferon gene"-dependent signalling
WO2017093933A1 (en) 2015-12-03 2017-06-08 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Cyclic purine dinucleotides as modulators of sting
WO2017100305A2 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Opi Vi - Ip Holdco Llc Composition of antibody construct-agonist conjugates and methods of use thereof
WO2017123669A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Gary Glick Cyclic dinucleotides for treating conditions associated with sting activity such as cancer
WO2017161349A1 (en) 2016-03-18 2017-09-21 Immune Sensor, Llc Cyclic di-nucleotide compounds and methods of use
WO2017175147A1 (en) 2016-04-07 2017-10-12 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Heterocyclic amides useful as protein modulators
WO2017175156A1 (en) 2016-04-07 2017-10-12 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Heterocyclic amides useful as protein modulators
WO2018009466A1 (en) 2016-07-05 2018-01-11 Aduro Biotech, Inc. Locked nucleic acid cyclic dinucleotide compounds and uses thereof
WO2018009648A1 (en) 2016-07-06 2018-01-11 Sperovie Biosciences, Inc. Compounds, compositions, and methods for the treatment of disease
WO2018045204A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Ifm Therapeutics, Inc Cyclic dinucleotide analogs for treating conditions associated with sting (stimulator of interferon genes) activity
WO2018060323A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cyclic dinucleotide compounds
WO2018067423A1 (en) 2016-10-04 2018-04-12 Merck Sharp & Dohme Corp. BENZO[b]THIOPHENE COMPOUNDS AS STING AGONISTS
WO2018065360A1 (de) 2016-10-07 2018-04-12 Biolog Life Science Institute Forschungslabor Und Biochemica-Vertrieb Gmbh Benzimidazolhaltige cyclische dinukleotide, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung zur aktivierung von stimulator von interferongenen (sting)-abhängigen signalwegen
WO2018100558A2 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Takeda Pharmaceutical Company Limited Cyclic dinucleotide

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AACR Tumor I㎜unology and I㎜unotherapy, 2017, Poster＃A25
Cell Rep. 2015, 11, 1018-1030
I㎜unity 2014, 41, 830-842
I㎜unity 2014, 41, 843-852
J. Clin. Oncol. 2011, 29, 2965-2971
J. I㎜unol. 1994, 153, 4684-4693
J. I㎜unol. 2013, 190, 5216-5225
J. Virol. 2014, 88, 5328-5341
Mol. Cell, 2013, 51, 226-235
Mol. Cell, 2015, 59, 891-903
Nat. Med. 2015, 21, 1209-1215
Nature 2008, 455, 674-678
Sci. Rep. 2016, 6, 19049
Science 2015a, 347, aaa2630

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