TW202344264A - Tsp1抑制劑 - Google Patents

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山口孝弘
古川詔大
齊藤博直
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Abstract

根據本發明，則可提供式(I)： 所表示之環狀肽或其藥學上可容許之鹽等 [式中，A選自環形成基A 1～A 5；X aa1為芳香族胺基酸的殘基；X aa2為芳香族胺基酸、鹼性胺基酸或脂肪族胺基酸的殘基；X aa3及X aa8為各自獨立地選擇之式(III)或(III’)所表示之胺基酸的殘基中X aa3及X aa8的硫醇基形成鍵結之結構；X aa4為中性胺基酸的殘基；X aa5為鹼性胺基酸的殘基；X aa6為中性胺基酸或酸性胺基酸的殘基；X aa7為芳香族胺基酸的殘基；X aa9為芳香族胺基酸、脂肪族胺基酸或鹼性胺基酸的殘基；X aa10為芳香族胺基酸的殘基；X aa11為脂肪族胺基酸的殘基]。

Description

TSP1抑制劑
本發明關於一種環狀肽或其藥學上可容許之鹽、PK-PD(藥物動力學-藥物動態學(pharmacokinetics-pharmacodynamics))特徵(profile)經改善之該環狀肽的複合體(conjugate)、含有彼等作為有效成分之醫藥、該複合體之製造方法等，該環狀肽係藉由阻礙TSP1(血小板反應蛋白-1(thrombospondin 1))的機能而可改善血流，且有用於嚴重肢體缺血等疾病之治療或預防的環狀肽。
周邊動脈疾病(PAD)係因在腳的血管發生動脈硬化且血流降低而發病之疾病，可引起疼痛等各種症狀。將重症化的PAD稱為嚴重肢體缺血(CLI)，佔PAD患者的1～3%。CLI為因往下肢的血流障礙而產生休息疼痛(rest pain)疼痛，且於下肢周邊產生潰瘍、壞死的狀態。在Fontaine分類中被分類為III及IV，在Rutherford分類中被分類為4-6(非專利文獻1)。
CLI係預後不良，有死亡率高的問題，而對於CLI患者，正探討以下之治療：藉由在缺血組織的血管重建等而再建構血管系統，將氧及養分送抵缺血組織以抑制下肢之潰瘍/壞死的發展(非專利文獻2)。迄今為止，亦嘗試了使用促進血管新生之增殖因子的基因治療，但與動物實驗不同，在臨床試驗並未達顯示出有效性。由於這樣的臨床試驗成績，血管新生抑制因子亦成為焦點，而建立了血管新生促進因子與血管新生抑制因子的平衡為重要的之類的假設(非專利文獻3及4)。
又，近年來所提出的慢性肢體威脅性缺血(CLTI，chronic limbthreatening ischemia)，係具有下肢缺血、組織缺損、神經病變、感染等截肢風險，需要治療干預介入之疾病的總稱。於缺血之外亦包含缺血以外的要素之更綜合性的概念。例如，CLTI中亦包含糖尿病性腳病變。CLTI的重症度使用WIfI分類，將「潰瘍(Wound; W)」、「缺血(Ischemia; I)」、及「感染(foot Infection; fI)」之重症度各自以0-3級來評價([非專利文獻22])。
被報告對於血管新生抑制性地作用之醣蛋白thrombospondin 1(TSP1)，有報告其由活化血小板被釋放，在包含內皮細胞、平滑肌細胞、腎小球膜細胞(mesangial cell)、腎小管細胞、及足細胞的許多細胞被合成、分泌(非專利文獻5～7)。由於TSP1在周邊血管疾病患者的血液及CLI患者的下肢骨骼肌中其表現亢進，而暗示其對CLI患者下肢之潰瘍/壞死的發展之參與(非專利文獻8及9)。由於TSP1抑制大鼠下肢缺血-再灌流後的血流恢復、於TSP1缺陷小鼠中下肢缺血後的血管新生亢進，故TSP1被認為是對於下肢缺血後的血流恢復抑制性地起作用(非專利文獻10及11)。又，在TSP1缺陷小鼠，由於在創傷部位的血流增加，創傷尺寸的縮小亦亢進，而對於在CLI患者可觀察到的傷，藉由阻礙TSP1的機能，可期待創傷治癒效果(非專利文獻12)。
TSP1被認為在血管新生抑制作用以外亦顯示各種藥理作用，參與許多疾病。TSP1由血小板被分泌，而使纖維蛋白溶解系統(fibrinolytic system)PAI-1等級(level)增加，使血栓形成亢進(非專利文獻13)。在因肥胖而產生胰島素抗性之患者，TSP1等級增加，且TSP1於巨噬細胞作用，而促進因肥胖而誘發的發炎反應，使胰島素抗性惡化加劇(非專利文獻14及15)。TSP1係促進腎足細胞的細胞凋亡，而誘發細胞機能降低(非專利文獻16)。TSP1係與非吞噬细胞(non-phagocytic cell)上的訊息調節蛋白α(signal-regulatory protein-α)結合而活化NADPH氧化酶，抑制血管鬆弛作用，藉此而誘發在腎臟的缺血再灌流傷害(非專利文獻17)。由此等之結果來看，藉由TSP1抑制，而有改善心肌梗塞、肥胖患者之發炎反應或胰島素抗性、還有包含缺血再灌流傷害之腎損傷的可能性。又，因TSP1而產生之源自血小板的微粒會在鐮刀型紅血球患者誘發血管阻塞危機(vaso-occlusive crisis)(非專利文獻18及19)。進而，有報告TSP1使單核白血球的移動/黏著亢進，增強主動脈瘤中的發炎反應(非專利文獻20)。有報告TSP1透過對癌細胞之細胞增殖、黏著、浸潤的作用，而參與癌之抑制或促進的可能性(非專利文獻21)。 另一方面，作為阻礙TSP1與CD47受體的結合之物質，已知有抗體(專利文獻1)和多肽(專利文獻2)。又，本申請人開發可與TSP1結合，且阻礙TSP1與血管內皮細胞等細胞之黏著的大環狀多肽(macro cyclic polypeptide)(專利文獻3)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]WO 2008/060785 [專利文獻2]US 2014/296477 [專利文獻3]WO 2018/052002 [非專利文獻]
[非專利文獻1]Kinlay S. Circ Cardiovasc Interv. 2016; 9: e001946. [非專利文獻2]Davies MG. Methodist Debakey Cardiovasc J. 2012; 8: 20–27. [非專利文獻3]Hellsten Y, Hoier B. Biochem. Soc. Trans. 2014; 42: 1616–1622. [非專利文獻4]Olfert IM. Microcirculation 2016; 23: 146–156. [非專利文獻5]Jimenez B, Volpert OV, Crawford SE, et al. Nat Med. 2000; 6: 41-48. [非專利文獻6]Henkin J, Volpert OV. Expert Opin Ther Targets. 2011; 15(12): 1369-1386. [非專利文獻7]Murphy-Ullrich JE, Iozzo RV. Matrix Biol. 2012; 31(3): 152-154. [非專利文獻8]Smadja DM, d’Audigier C, Bieche I, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011; 31: 551-559. [非專利文獻9]Favier J, Germain S, Emmerich J, et al. J Pathol 2005; 207: 358–366. [非專利文獻10]Isenberg JS, Romeo MJ, Abu-Asab M, et al. Circ Res. 2007; 100(5): 712-720. [非專利文獻11]Csanyi G, Yao M, Rodriguez AI, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012; 32: 2966-2973. [非專利文獻12]Soto-Pantoja DR, Shih HB, Maxhimer JB, et al. Matrix Biol. 2014; 37: 25-34. [非專利文獻13]Prakash P, Kulkarni PP, Chauhan AK. Blood 2015; 125(2): 399-406. [非專利文獻14]Varma V, Yao-Borengasser A, Bodles AM, et al. Diabetes. 2008; 57(2): 432-439. [非專利文獻15]Li Y, Tong X, Rumala C, et al. PLoS One. 2011; 6(10): e26656. [非專利文獻16]Cui W, Maimaitiyiming H, Zhou Q, et al. Biochim Biophys Acta. 2015; 1852(7): 1323-1333. [非專利文獻17]Yao M, Rogers NM, Csanyi G, et al. J Am Soc Nephrol. 2014; 25(6): 1171-1186. [非專利文獻18]Hagag AA, Elmashad G, Abd El-Lateef AE. Mediterr J Hematol Infect Dis. 2014; 6(1): e2014044. [非專利文獻19]Camus SM, Gausseres B, Bonnin P, et al. Blood. 2012; 120(25): 5050-5058. [非專利文獻20]Liu Z, Morgan S, Ren J, et al. Circ Res. 2015; 117(2): 129-141. [非專利文獻21]Esemuede N, Lee T, Pierre-Paul D. et al., The role of thrombospondin-1 in human disease. J Surg Res. 2004;122(1):135-42. [非專利文獻22]Conte MS, Bradbury AW, et al.: Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Eur J Vasc Endovasc Surg. 2019; 58: S1-S109 e133.
[發明欲解決之課題]
本發明以提供一種藉由阻礙TSP1的機能而可改善血流，且有用於嚴重肢體缺血等疾病之治療或預防的新穎化合物為目的。進一步，本發明以提供一種化合物為目的，其係藉由阻礙TSP1的機能而可改善血流之化合物，且為PK-PD(藥物動力學-藥物動態學)特徵經改善之化合物，例如以較少的投予頻率顯示優異的藥效之化合物。 [用以解決課題之手段]
本發明人等為了解決上述課題而專心致力研究之結果，發現了：一種為具有特定胺基酸序列的環狀肽，且藉由構成環的胺基酸殘基之中2個胺基酸殘基的側鏈鍵結而成為二環性者(二環性環狀肽)，其可與TSP1結合，阻礙TSP1與細胞的黏著，藉此阻礙TSP1的機能而改善血流。進一步發現了：可藉由將可阻礙TSP1的機能而改善血流的化合物作成與含Fc分子之複合體(conjugate)，而以較少的投予頻率來改善血流。本發明人等基於此等見解，且藉由進一步反覆進行研究，而完成了本發明。
亦即，本發明提供下述[1]～[90]。 [1]　一種式(I) 所表示之環狀肽或其藥學上可容許之鹽 [式中，A選自環形成基 A 1、 A 2、 A 3、 A 4、及 A 5， 其中 表示對X aa1的N末端胺基之鍵結點， 表示對X aa11的C末端羰基之鍵結點， R 1及R 2各自獨立地為氫原子或C 1-3烷基， R 10為胺基或羥基， n為0～3的整數(例如0、1、2、或3)， k及l各自獨立地為0～3的整數(例如0、1、2、或3)， m為1～7的整數(例如1、2、3、4、5、6、或7)； X aa1為芳香族胺基酸的殘基； X aa2為芳香族胺基酸、鹼性胺基酸或脂肪族胺基酸的殘基； X aa3及X aa8為各自獨立地選擇之以下之式(III) [式中，R a為式-(CH 2) tSH(式中，t為1～3的整數(例如1、2、或3))所表示之基]、或 式(III’) [式中，R b為式-CH v(CH 3) 2-vCH w(CH 3) 2-w SH(式中，v為0～2的整數，v為0或1時，w為2，v為2時，w為0或1)、或-CH x(CH 3) 2-xSH(式中，x為0或1)所表示之基] 所表示之胺基酸的殘基中X aa3及X aa8的硫醇基形成-S-S-、-S-CH 2-S-、或-S-X-S- (式中，X選自 、 、或 (式中， 表示對S之鍵結點))所表示之鍵結的結構，且X aa3及X aa8之至少任意一者為式(III)所表示之胺基酸的殘基； X aa4為中性胺基酸的殘基； X aa5為鹼性胺基酸的殘基； X aa6為中性胺基酸或酸性胺基酸的殘基； X aa7為芳香族胺基酸的殘基； X aa9為芳香族胺基酸、脂肪族胺基酸或鹼性胺基酸的殘基； X aa10為芳香族胺基酸的殘基； X aa11為脂肪族胺基酸的殘基； 其中 脂肪族胺基酸為式(IIa)所表示之胺基酸 (IIa) (式中，R 3為C 1-6烷基、C 2-6烯基或C 3-6環烷基)； 芳香族胺基酸為式(IIb)所表示之胺基酸 (IIb) (式中，R 4為選自苯基、噻吩基、吡啶基、萘基、吲哚基、苯并呋喃基、及苯并噻吩基的芳香族基，該芳香族基可由獨立地選自由C 1-3烷基、鹵素原子、羥基、C 1-3烷氧基所組成之群組的1以上之取代基所取代，p為0～3的整數(例如0、1、2、或3))； 鹼性胺基酸為式(IIc)所表示之胺基酸 (IIc) [式中，R 5為 式-(CH 2) qaNH 2(式中，qa為1～6的整數(例如1、2、3、4、5、或6))、 式 (式中，R 6為氫原子或C 1-3烷基，qb為1～6的整數(例如1、2、3、4、5、或6))、 式-(CH 2) qcNHC(=NH)NH 2(式中，qc為1～6的整數(例如1、2、3、4、5、或6))、或 式 (式中，qd及qe各自獨立地為1～3的整數(例如1、2、或3))所表示之基]； 中性胺基酸為式(IId)所表示之胺基酸、Gly、Met、Pro、3HyP、Asn、Gln、Ser、 mS、MS、或Thr (IId) [式中，R 7為式-(CH 2) raNHCONH 2(式中，ra為1～6的整數(例如1、2、3、4、5、或6))或式-(CH 2) rbSH(式中，rb為1～3的整數(例如1、2、或3))所表示之基]； 酸性胺基酸為式(IIe)所表示之胺基酸 (IIe) [式中，R 8為式-(CH 2) sCOOH(式中，s為1～6的整數(例如1、2、3、4、5、或6))所表示之基]]。 [2]　如[1]所記載的環狀肽或其藥學上可容許之鹽，其中X aa1為2Nal殘基， X aa2為Arg、AGB、PHG或Tle的殘基， X aa3及X aa8之結構中，式(III)或(III’)所表示之胺基酸的殘基為HCY或Cys的殘基， X aa4為Gly殘基， X aa5為Arg或AGB的殘基， X aa6為Asn或Asp的殘基， X aa7為Trp殘基， X aa9為Val、Arg、PHG、4PAL或AGB的殘基， X aa10為Trp殘基，且 X aa11為Val、CPTG、或CHXG的殘基。 [3]　如[1]或[2]所記載的環狀肽或其藥學上可容許之鹽，其中A為環形成基： A 1a、 A 1b、或 A 1c。 [4]　如[3]所記載的環狀肽或其藥學上可容許之鹽，其中A為環形成基： A 1a。 [5]　如[1]～[4]中之任一項所記載的環狀肽或其藥學上可容許之鹽，其中X aa3及X aa8之結構中，硫醇基形成-S-S-或-S-CH 2-S-所表示之鍵結。 [6]　如[1]～[5]中之任一項所記載的環狀肽或其藥學上可容許之鹽，其選自由下列所表示之化合物所組成之群組： 。 [7]　一種醫藥組成物，其包含如[1]～[6]中之任一項所記載的環狀肽或其藥學上可容許之鹽作為有效成分。 [8]　如[7]所記載的醫藥組成物，其用以治療或預防能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病。 [9]　如[8]所記載的醫藥組成物，其用以治療或預防嚴重肢體缺血、周邊動脈疾病或慢性肢體威脅性缺血。 [10]　一種血流改善劑，其包含如[1]～[6]中之任一項所記載的環狀肽或其藥學上可容許之鹽作為有效成分。 [11]　一種複合體或其藥學上可容許之鹽，其係如[1]～[6]中之任一項所記載的環狀肽或下式(X)所表示之環狀肽、與載體(carrier)分子結合 [式中， B選自環形成基： B 1、 B 2、 B 3、 B 4、 B 5、及 B 6，其中 表示對Z aa1的N末端胺基之鍵結點、或於Z aa1不存在的情形表示對Z aa2的N末端胺基之鍵結點， 表示對Z aa12的C末端羰基之鍵結點， 表示對Z aa1的α碳之鍵結點、或於Z aa1不存在的情形表示對Z aa2的α碳之鍵結點， R 101及R 102各自獨立地為氫原子或C 1-3烷基， R 110為胺基或羥基， bn為0～3的整數(例如0、1、2、或3)， bi及bj各自獨立地為1～3的整數(例如1、2、或3)， bk及bl各自獨立地為0～3的整數(例如0、1、2、或3)， bm為1～7的整數(例如1、2、3、4、5、6、或7)； Z aa1為脂肪族胺基酸、芳香族胺基酸、鹼性胺基酸、中性胺基酸、或酸性胺基酸的殘基，或者是不存在； Z aa2為芳香族胺基酸或中性胺基酸的殘基； Z aa3為脂肪族胺基酸、芳香族胺基酸、或鹼性胺基酸的殘基； Z aa4為Ser、Thr、Ala、或 mS； Z aa5為Gly或Ser； Z aa6為鹼性胺基酸或中性胺基酸的殘基； Z aa7為中性胺基酸或酸性胺基酸的殘基； Z aa8為芳香族胺基酸的殘基； Z aa9為脂肪族胺基酸、中性胺基酸、或芳香族胺基酸的殘基； Z aa10為鹼性胺基酸、脂肪族胺基酸、芳香族胺基酸、或中性胺基酸的殘基； Z aa11為芳香族胺基酸的殘基； Z aa12為脂肪族胺基酸、芳香族胺基酸、或鹼性胺基酸的殘基； 其中 脂肪族胺基酸、芳香族胺基酸、鹼性胺基酸、中性胺基酸、及酸性胺基酸係如[1]中所定義]。 [12]　如[11]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中Z aa1為Arg、Lys、His、Gly、Ala、Asn、Thr、Ser、Met、Leu、Ile、Val、Gln、Phe、Tyr、Trp、或Cys的殘基，或者是不存在； Z aa2為Phe、Tyr、Trp、2Nal、4CF、或DCF的殘基； Z aa3為Ile、Leu、Nle、Tle、Trp、2Nal、4CF、或Arg的殘基； Z aa4為Ser殘基； Z aa5為Gly殘基； Z aa6為Arg、Lys、His、Ser、Cit、或AGB的殘基； Z aa7為Asn或Asp的殘基； Z aa8為Trp或2Nal的殘基； Z aa9為Val、Nle、Ahp、或Met的殘基； Z aa10為Arg、AGB、Lys、His、AMF、Phg、或Val的殘基； Z aa11為Trp或2Nal的殘基； Z aa12為Val、Tle、CPTG、CHXG、或Phe的殘基； B為環形成基 B 1a、 B 1b、或 B 1c。 [13]　如[12]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中Z aa1不存在； Z aa2為2Nal殘基； Z aa3為Arg或Tle的殘基； Z aa4為Ser殘基； Z aa5為Gly殘基； Z aa6為Arg或AGB的殘基； Z aa7為Asn或Asp的殘基； Z aa8為Trp殘基； Z aa9為Val或Nle的殘基； Z aa10為Arg、AGB、或Val的殘基； Z aa11為Trp殘基； Z aa12為Val、CPTG、或CHXG的殘基； B為 B 1a。 [14]　如[13]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中式(X)所表示之環狀肽選自由下列所表示之化合物所組成之群組： 、及 。 [15]　如[11]～[14]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述載體分子為人類血清白蛋白或其片段或是變異體。 [16]　如[11]～[14]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述載體分子為含Fc分子。 [17]　如[16]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述含Fc分子為全長IgG、全長IgG重鏈、或包含Fc區的全部或是一部分之IgG的片段，或者是其變異體。 [18]　如[16]或[17]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述含Fc分子包含IgG重鏈之恆定區的CH2結構域及CH3結構域。 [19]　如[16]～[18]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述含Fc分子包含人類IgG重鏈中相當於按照Eu索引(Eu index)之第226位的半胱胺酸殘基、相當於第229位的半胱胺酸殘基、或相當於第297位的天門冬醯胺酸殘基之至少任意一個胺基酸殘基。 [20]　如[16]～[19]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述含Fc分子包含人類IgG重鏈中相當於按照Eu索引之第221～230位、第222～230位、第223～230位、第224～230位、第225～230位、或第226～230位的胺基酸序列。 [21]　如[16]～[20]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述含Fc分子包含人類IgG重鏈中相當於按照Eu索引之第234位的白胺酸殘基及相當於第235位的白胺酸殘基之被丙胺酸殘基的取代，或包含相當於第234位的白胺酸殘基、相當於第235位的白胺酸殘基、及相當於第329位的脯胺酸殘基之被丙胺酸殘基的取代。 [22]　如[16]～[21]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述含Fc分子為由人類IgG重鏈之恆定區所組成的CH、由人類IgG之恆定區所組成的CLCH、或由人類IgG之Fc區所組成的分子或是其片段，或者是其變異體。 [23]　如[22]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述含Fc分子為： 由重鏈及輕鏈之組合所組成的抗體(mAb-A)，該重鏈由序列識別號125之胺基酸編號20～474之胺基酸序列所組成，該輕鏈由序列識別號127之胺基酸編號21～234之胺基酸序列所組成； 由序列識別號129之胺基酸編號20～349之胺基酸序列所組成的CH(CH-A)； 由序列識別號133之胺基酸編號20～349之胺基酸序列所組成的CH(CH-B)； 由重鏈及輕鏈之組合所組成的CLCH(CLCH-A)，該重鏈由序列識別號129之胺基酸編號20～349之胺基酸序列所組成，該輕鏈由序列識別號131之胺基酸編號21～125之胺基酸序列所組成； 由重鏈及輕鏈之組合所組成的CLCH(CLCH-B)，該重鏈由序列識別號133之胺基酸編號20～349之胺基酸序列所組成，該輕鏈由序列識別號131之胺基酸編號21～125之胺基酸序列所組成； 由序列識別號135之胺基酸編號21～243之胺基酸序列所組成的Fc片段(Fc-B)； 由序列識別號137之胺基酸編號21～247之胺基酸序列所組成的Fc片段(Fc-A)；或 由序列識別號139之胺基酸編號21～247之胺基酸序列所組成的Fc片段(Fc-C)；或者是 其變異體。 [24]　如[16]～[23]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中含Fc分子包含選自由以下所組成之群組的1或2以上之修飾：對N-鍵結之糖鏈附加、對O-鍵結之糖鏈附加、N端的加工、C端的加工、脫醯胺化、天門冬胺酸的異構化、甲硫胺酸的氧化、於N端之甲硫胺酸殘基的附加、脯胺酸殘基的醯胺化及重鏈的羧基末端中之1或2個胺基酸殘基的缺失。 [25]　如[24]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中於含Fc分子之重鏈的羧基末端有1或2個胺基酸殘基缺失。 [26]　如[25]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中在含Fc分子之2條重鏈雙方於羧基末端有1個胺基酸殘基缺失。 [27]　如[24]～[26]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中含Fc分子之重鏈的羧基末端的脯胺酸殘基進一步經醯胺化。 [28]　如[11]～[27]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述環狀肽與前述載體分子透過連接子(linker)結構而結合。 [29]　如[28]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述連接子結構包含選自由聚氧伸烷基鏈、胺基酸殘基、及由2以上之胺基酸殘基所組成的寡肽鏈所組成之群組的至少1個結構。 [30]　如[29]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述連接子結構中包含的聚氧伸烷基鏈為聚乙二醇(PEG)鏈。 [31]　如[30]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述連接子結構之主鏈中包含的PEG鏈之總聚合度為6～100。 [32]　如[29]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述連接子結構中包含的胺基酸殘基係Gly、N-甲基甘胺酸、Asp、D-Asp、Glu、D-Glu、Lys、D-Lys、β-丙胺酸、Ser、D-Ser、側鏈中包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸、或側鏈中包含SG鏈之非天然胺基酸的殘基。 [33]　如[29]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述連接子結構中包含的寡肽鏈由2～20個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)胺基酸殘基所組成。 [34]　如[29]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述連接子結構中包含的寡肽鏈包含選自由Gly、N-甲基甘胺酸、Asp、D-Asp、Glu、D-Glu、Lys、D-Lys、β-丙胺酸、Ser、D-Ser、側鏈中包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸、及側鏈中包含SG鏈之非天然胺基酸所組成之群組的1以上之胺基酸殘基。 [35]　如[29]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述連接子結構中包含的胺基酸殘基或寡肽鏈之N末端胺基、與環形成基A的R 10或環形成基B的R 110所鍵結之羰基形成醯胺鍵結，R 10或R 110被該N末端胺基的NH取代。 [36]　如[28]至[35]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述連接子結構包含與載體分子結合之連結基C。 [37]　如[36]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述連結基C包含藉由馬來醯亞胺基與硫醇基之反應所形成之硫醚鍵結中的源自馬來醯亞胺基之部分或1,2,3-三唑環。 [38]　如[37]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中馬來醯亞胺基與載體分子的半胱胺酸殘基之硫醇基結合而形成硫醚鍵結。 [39]　如[37]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述載體分子為含Fc分子，且前述連結基C中包含的1,2,3-三唑環、與鍵結於含Fc分子的相當於按照Eu索引之第297位的天門冬醯胺酸殘基之糖鏈(N297結合糖鏈)結合。 [40]　如[36]～[39]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述連結基C係以下式的任一者表示： C 1、 C 2、及 C 3(式中， N297GLY表示與含Fc分子之N297結合糖鏈的非還原末端鍵結， Cys表示與載體分子的半胱胺酸殘基之硫醇基鍵結， Y表示與連接子結構中之鄰接的胺基酸殘基之鍵結點)。 [41]　如[39]或[40]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中含Fc分子之N297結合糖鏈為選自具有下式所表示之結構的糖鏈N297-(Fuc)SG、N297-(Fuc)MSG1及N297-(Fuc)MSG2的至少1個， 、及 [式中，(C)表示與連結基C之鍵結點，(Asn297)表示與含Fc分子的相當於按照Eu索引之第297位的天門冬醯胺酸殘基之鍵結點]。 [42]　如[41]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中含Fc分子之N297結合糖鏈為N297-(Fuc)SG。 [43]　如[36]～[42]中之任一項記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述連接子結構為下式(XX)： -L1-L2-L3-C- [式中， L1為包含直鏈狀地鍵結之3～6個(例如3、4、5、或6個)中性胺基酸殘基的寡肽； L2為L2a或L2b， L2a為在主鏈包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸殘基，或為包含在主鏈包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸殘基的寡肽，且L2a之主鏈中包含的聚氧伸烷基鏈之總聚合度為6～100(例如5～100，較佳為6～50，更佳為10～50，進一步更佳為10～40或20～40)的寡肽， L2b為包含直鏈狀地鍵結之10～20個(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個)天然或非天然之α胺基酸殘基的寡肽； L3為下式所表示之胺基酸殘基 (式中，R 201為羥基或胺基， 表示與L2中之鄰接的胺基酸殘基之鍵結點， 表示與連結基C之鍵結點)； C為連結基C； L1之N末端胺基係與環形成基A的R 10或環形成基B的R 110所鍵結之羰基形成醯胺鍵結，R 10或R 110被該N末端胺基的NH取代； L1與L2以醯胺鍵結連結；且 L2與L3以醯胺鍵結連結。]。 [44]　如[43]記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L1中包含的中性胺基酸殘基為選自由Gly、Ser、D-Ser、N-甲基甘胺酸(NMeG)、及β-丙胺酸(bAla)所組成之群組的1個以上之胺基酸的殘基。 [45]　如[43]或[44]記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L2a中包含的主鏈之聚氧伸烷基鏈為PEG鏈。 [46]　如[45]記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L2a中包含的在主鏈包含PEG鏈之非天然胺基酸殘基，為下式所表示之胺基酸的殘基： [式中，n表示5～40的整數(例如5、11、23、35等)。]。 [47]　如[46]記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述PEG鏈之總聚合度為10～40(例如12、18、24、30、36等)。 [48]　如[43]或[44]記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L2b之α胺基酸為甘胺酸或N-甲基甘胺酸。 [49]　如[48]記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L2b之寡肽為N-甲基甘胺酸13個連續的寡聚N-甲基甘胺酸。 [50]　如[43]～[49]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L2包含側鏈中包含PEG鏈之非天然胺基酸殘基、或側鏈中包含SG鏈之非天然胺基酸殘基。 [51]　如[50]記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述側鏈中包含PEG鏈非天然胺基酸為KPEG。 [52]　如[50]記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述側鏈中包含SG鏈之非天然胺基酸為KSG。 [53]　如[43]～[52]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其係於L1及L2之寡肽的主鏈上，於不鄰接前述環形成基A或環形成基B的1個以上之位置合計包含1～3個(例如1、2、或3個)酸性胺基酸殘基。 [54]　如[53]記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述酸性胺基酸殘基為選自由Asp、D-Asp、Glu、D-Glu所組成之群組的胺基酸。 [55]　如[43]～[54]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L1係包含以下之序列或由該序列所組成的寡肽： Gly-Gly-Gly-Gly、 Gly-Ser-Gly-Ser、 NMeG-NMeG-NMeG-NMeG、 bAla-bAla-bAla-bAla、或 Gly-Gly-Glu-Gly-Gly。 [56]　如[55]記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L1為 由在Gly-Gly-Gly-Gly、 Gly-Ser-Gly-Ser、 NMeG-NMeG-NMeG-NMeG、或 bAla-bAla-bAla-bAla 的C末端有2個酸性胺基酸殘基連結之序列所組成的寡肽。 [57]　如[56]記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述酸性胺基酸殘基為Asp殘基。 [58]　如[43]～[55]中之任一項記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L2為為由以下之序列所組成的寡肽： Asp-Asp-KPEG-P12P-P12P、 KSG-P12P-P12P、 Asp-Asp-P12P、 Asp-Asp-P12P-P12P、或 Asp-Asp-P12P-KPEG-P12P。 [59]　如[43]～[58]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L3為Lys殘基。 [60]　如[43]記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中前述連接子結構為以下之結構： L1為由Gly-Gly-Gly-Gly或是Gly-Ser-Gly-Ser之序列所組成的寡肽，L2a為由Asp-Asp-KPEG-P12P-P12P之序列所組成的寡肽，L3為Lys殘基之結構； L1為由Gly-Gly-Gly-Gly之序列所組成的寡肽，L2a為由KSG-P12P-P12P之序列所組成的寡肽，L3為Lys殘基之結構； L1為由Gly-Gly-Gly-Gly之序列所組成的寡肽，L2a為由Asp-Asp-P12P之序列所組成的寡肽，L3為Lys殘基之結構； L1為由Gly-Ser-Gly-Ser之序列所組成的寡肽，L2a為由Asp-Asp-P12P-P12P之序列所組成的寡肽，L3為Lys殘基之結構；或 L1為由Gly-Gly-Gly-Gly之序列所組成的寡肽，L2a為由Asp-Asp-P12P-KPEG-P12P之序列所組成的寡肽，L3為Lys殘基之結構。 [61]　如[11]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中環狀肽及連接子結構係以下述的任一者表示： 、及 (式中， N297GLY表示連結基C中包含的1,2,3-三唑環與含Fc分子之N297結合糖鏈的非還原末端鍵結， Fc表示連結基C中包含的馬來醯亞胺基與含Fc分子的半胱胺酸殘基之硫醇基鍵結)。 [62]　一種醫藥組成物，其含有如[11]～[61]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽作為有效成分。 [63]　如[62]所記載的醫藥組成物，其用以治療或預防能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病。 [64]　如[63]所記載的醫藥組成物，其用以治療或預防嚴重肢體缺血、周邊動脈疾病或慢性肢體威脅性缺血。 [65]　一種血流改善劑，其包含如[11]～[61]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽作為有效成分。 [66]　一種製造如[11]～[61]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽的方法，該方法包含以下之步驟： (1)藉由固相合成法，而從C末端側合成下式所表示之寡肽X-A-L或Z-B-L之步驟 X aa1-X aa2-X aa3-X aa4-X aa5-X aa6-X aa7-X aa8-X aa9-X aa10-X aa11-A 0-L1-L2-L3、或 Z aa1-Z aa2-Z aa3-Z aa4-Z aa5-Z aa6-Z aa7-Z aa8-Z aa9-Z aa10-Z aa11-Z aa12-B 0-L1-L2-L3 [式中， X aa1～X aa11係如[1]中所定義(但是，X aa3及X aa8之結構中，硫醇基並未形成鍵結，各自仍為硫醇基)， L1～L3係如[43]中所定義(但是，L2包含側鏈中包含糖鏈之非天然胺基酸的殘基之情形，該殘基被Lys殘基取代)， Z aa1～Z aa12係如[11]中所定義， A 0為下式所表示之殘基 A 0a、或 A 0b(式中，(X aa11)表示與X aa11之鍵結點，(L1)表示與L1之N末端的胺基酸殘基之鍵結點，l及n係如[1]中所定義)， B 0為下式所表示之殘基 B 0a、或 B 0b(式中，(Z aa12)表示與Z aa12之鍵結點，(L1)表示與L1之N末端的胺基酸殘基之鍵結點，bl及bn係如[11]中所定義)]； (2)藉由 (a)於寡肽X-A-L中連結X aa1之N末端胺基與A 0a而使環形成基A 1～A 3(但是，於R 10的位置與L1連結)之任一者形成、或 (b)於寡肽X-A-L中連結X aa1之N末端胺基與A 0b而使環形成基A 4或A 5(但是，於R 10的位置與L1連結)形成、或 (c)於寡肽Z-B-L中連結Z aa1或Z aa2之N末端胺基與B 0a而使環形成基B 1～B 4(但是，於R 110的位置與L1連結)之任一者形成、或 (d)於寡肽Z-B-L中連結Z aa1或Z aa2之N末端胺基與B 0b而使環形成基B 5或B 6(但是，於R 110的位置與L1連結)形成， 使步驟(1)中所合成之寡肽環化，而得到環狀肽之步驟； (3)於步驟(1)中合成寡肽X-A-L之情形，於步驟(2)中所環化的寡肽X-A-L之X aa3及X aa8的硫醇基中，使-S-S-、-S-CH 2-S-、或-S-X-S-(式中，X係如[1]中所定義)所表示之鍵結形成，而得到二環性環狀肽之步驟； (4)L2包含側鏈中包含糖鏈之非天然胺基酸的殘基，且於寡肽X-A-L或Z-B-L中被Lys殘基取代之情形，藉由對該Lys殘基導入糖鏈，而使側鏈中包含糖鏈之非天然胺基酸的殘基形成之步驟； (5)使馬來醯亞胺基或可形成1,2,3-三唑環的反應基與L3鍵結之步驟；及 (6)透過步驟(5)的反應基而使環狀肽與載體分子結合之步驟。 [67]　一種用以治療或預防疾病或症狀的方法，其包含將如[1]～[6]中之任一項所記載的環狀肽或其藥學上可容許之鹽的治療或預防有效量投予至對象。 [68]　如[67]所記載的方法，其中疾病或症狀為能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病。 [69]　如[68]所記載的方法，其中疾病或症狀為嚴重肢體缺血、周邊動脈疾病或慢性肢體威脅性缺血。 [70]　一種血流改善方法，其包含將如[1]～[6]中之任一項所記載的環狀肽或其藥學上可容許之鹽的治療或預防有效量投予至對象。 [71]　如[1]～[6]中之任一項所記載的環狀肽或其藥學上可容許之鹽，其用於疾病或症狀之治療或預防的用途。 [72]　如[71]所記載的環狀肽或其藥學上可容許之鹽，其中疾病或症狀為能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病。 [73]　如[72]所記載的環狀肽或其藥學上可容許之鹽，其中疾病或症狀為嚴重肢體缺血、周邊動脈疾病或慢性肢體威脅性缺血。 [74]　如[1]～[6]中之任一項所記載的環狀肽或其藥學上可容許之鹽，其用於血流改善的用途。 [75]　一種如[1]～[6]中之任一項所記載的環狀肽或其藥學上可容許之鹽的用途，其用於製造用以治療或預防疾病或症狀之醫藥品。 [76]　如[75]所記載的用途，其中疾病或症狀為能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病。 [77]　如[76]所記載的用途，其中疾病或症狀為嚴重肢體缺血、周邊動脈疾病或慢性肢體威脅性缺血。 [78]　一種如[1]～[6]中之任一項所記載的環狀肽或其藥學上可容許之鹽的用途，其用於製造血流改善劑。 [79]　一種用以治療或預防疾病或症狀的方法，其包含將如[11]～[61]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽的治療或預防有效量投予至對象。 [80]　如[79]所記載的方法，其中疾病或症狀為能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病。 [81]　如[80]所記載的方法，其中疾病或症狀為嚴重肢體缺血、周邊動脈疾病或慢性肢體威脅性缺血 [82]　一種血流改善方法，其包含將如[11]～[61]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽的治療或預防有效量投予至對象。 [83]　如[11]～[61]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其用於疾病或症狀之治療或預防的用途。 [84]　如[83]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中疾病或症狀為能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病。 [85] 如[84]所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其中疾病或症狀為嚴重肢體缺血、周邊動脈疾病或慢性肢體威脅性缺血。 [86]　如[11]～[61]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽，其用於血流改善的用途。 [87]　一種如[11]～[61]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽的用途，其用於製造用以治療或預防疾病或症狀之醫藥品。 [88]　如[87]所記載的用途，其中疾病或症狀為能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病。 [89]　如[88]所記載的用途，其中疾病或症狀為嚴重肢體缺血、周邊動脈疾病或慢性肢體威脅性缺血。 [90]　一種如[11]～[61]中之任一項所記載的複合體或其藥學上可容許之鹽的用途，其用於製造血流改善劑。 [發明之效果]
本發明之環狀肽或其藥學上可容許之鹽有用於嚴重肢體缺血等能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病之治療或預防。又，本發明之複合體或其藥學上可容許之鹽可提供以較少的投予頻率來治療或預防能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病或症狀之手段。
[用以實施發明的形態]
(定義) 本說明書中，天然胺基酸係意指於天然中存在之蛋白質中通常會發現的未修飾之胺基酸，具體而言係意指丙胺酸、精胺酸、天門冬醯胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、及纈胺酸。再者，於本說明書中，於天然胺基酸之標記，有使用三字母標記或一字母標記之情形(亦即，丙胺酸：Ala或A；精胺酸：Arg或R；天門冬醯胺酸：Asn或N；天門冬胺酸：Asp或D；半胱胺酸：Cys或C；麩胺酸：Glu或E；麩醯胺酸：Gln或Q；甘胺酸：Gly或G；組胺酸：His或H；異白胺酸：Ile或I；白胺酸：Leu或L；離胺酸：Lys或K；甲硫胺酸：Met或M；苯丙胺酸：Phe或F；脯胺酸：Pro或P；絲胺酸：Ser或S；蘇胺酸：Thr或T；色胺酸：Trp或W；酪胺酸：Tyr或Y；纈胺酸：Val或V)。
本說明書中，非天然胺基酸係意指天然胺基酸以外之胺基酸，亦包含天然胺基酸之修飾體。於以下呈示本說明書中記載之非天然胺基酸的縮寫。再者，本說明書中，於以下的縮寫中，字母的小寫係可以大寫取代。例如，2Nal、Nle、Phg、Tle、及Hcy各自與2NAL、NLE、PHG、TLE、及HCY同意義。
mS：N-甲基-L-絲胺酸 2Nal：3-(2-萘基)-L-丙胺酸 4CF：4-氯-L-苯丙胺酸 Nle：L-正白胺酸 DCF：L-3,4-二氯苯丙胺酸 HF：L-同苯丙胺酸 3MH：3-甲基-L-組胺酸 AMF：L-4-胺甲基苯丙胺酸 Phg：L-苯基甘胺酸 Tle：L-三級白胺酸 Hcy：L-同半胱胺酸 Ahp：(2S)-2-胺基庚酸 Aoc：(2S)-2-胺基辛酸 MS：L-O-甲基絲胺酸 3Hyp：L-羥脯胺酸 Alb：L-2-胺基-3-脲基丙酸 Cit：L-瓜胺酸 HCt：L-同瓜胺酸 C(O)：(2R)-2-胺基-3-氫亞磺醯基-丙酸 C(O2)：(2R)-2-胺基-3-氫磺醯基-丙酸 Pen：L-青黴胺 Alg：L-烯丙基甘胺酸 Btg：(2S)-2-胺基己-5-烯酸 AGB：(2S)-2-胺基-4-胍基-丁酸 CPTG：L-環戊基甘胺酸 CHXG：L-α-環己基甘胺酸 NMeG：肌胺酸 bAla：β-丙胺酸 P6P：3-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸 P12P：3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸 P24P：3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸 KSG：(2R,4S,5R,6R)-5-乙醯胺基-2-[[(2R,3R,4S,5R,6S)-6-[(2R,3S,4R,5R,6S)-5-乙醯胺基-6-[(2S,3S,4S,5S,6R)-2-[[(2R,3R,4S,5S,6S)-6-[(2R,3S,4R,5R,6S)-5-乙醯胺基-6-[(2R,3S,4R,5R,6R)-5-乙醯胺基-6-[2-[[(5S)-5-胺基-5-羧基-戊基]胺基]-2-氧基-乙氧基]-4-羥基-2-(羥基甲基)四氫哌喃-3-基]氧基-4-羥基-2-(羥基甲基)四氫哌喃-3-基]氧基-4-[(2R,3S,4S,5S,6R)-3-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺基-5-[(2S,3R,4S,5R,6R)-6-[[(2R,4S,5R,6R)-5-乙醯胺基-2-羧基-4-羥基-6-[(1R,2R)-1,2,3-三羥基丙基]四氫哌喃-2-基]氧甲基]-3,4,5-三羥基-四氫哌喃-2-基]氧基-4-羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基-3,5-二羥基-四氫哌喃-2-基]甲氧基]-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-3-基]氧基-4-羥基-2-(羥基甲基)四氫哌喃-3-基]氧基-3,4,5-三羥基-四氫哌喃-2-基]甲氧基]-4-羥基-6-[(1R,2R)-1,2,3-三羥基丙基]四氫哌喃-2-甲酸 KPEG：(2S)-6-胺基-2-[[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]己酸 4PAL：L-4-吡啶基丙胺酸 P36P：3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸
本說明書中，非天然胺基酸中亦包含以下的結構式所表示之PEN類似化合物。
再者，於本說明書中稱為胺基酸之情形，針對寡肽及多肽的構成胺基酸，係意指胺基酸殘基。又，若無特別述明，則胺基酸係意指L-胺基酸。關於特定胺基酸，表示其為右式之情形，有於胺基酸之簡寫附加「D-」之情形(例如D-Asp、D-Glu、D-Lys、D-Ser等)。再者，本說明書中，有將D-Asp標記為「d」之情形。
本說明書中，脂肪族胺基酸為式(IIa)所表示之胺基酸。
(IIa)
(式中，R 3為C 1-6烷基、C 2-6烯基或C 3-6環烷基)。
就天然之脂肪族胺基酸而言，可舉出Ala、Val、Leu、及Ile。又，就非天然之脂肪族胺基酸而言，可舉出Nle、Tle、Ahp、Aoc、Alg、Btg、CPTG、CHXG等，但不限定於此等
本說明書中，芳香族胺基酸為式(IIb)所表示之胺基酸。
(IIb)
(式中，R 4為選自苯基、噻吩基、吡啶基、萘基、吲哚基、苯并呋喃基、及苯并噻吩基的芳香族基，該芳香族基可由獨立地選自由C 1-3烷基、鹵素原子、羥基、C 1-3烷氧基所組成之群組的1以上之取代基所取代，p為0～3的整數(例如0、1、2、或3))。
就天然之芳香族胺基酸而言，可舉出Phe、Tyr、及Trp。又，就非天然之芳香族胺基酸而言，可舉出2Nal、4CF、DCF、HF、Phg、4PAL等，但不限定於此等。
本說明書中，鹼性胺基酸為式(IIc)所表示之胺基酸。
(IIc)
[式中，R 5為 式-(CH 2) qaNH 2(式中，qa為1～6的整數(例如1、2、3、4、5、或6))、 式
(式中，R 6為氫原子或C 1-3烷基，qb為1～6的整數(例如1、2、3、4、5、或6))、 式-(CH 2) qcNHC(=NH)NH 2(式中，qc為1～6的整數(例如1、2、3、4、5、或6))、或 式
(式中，qd及qe各自獨立地為1～3的整數(例如1、2、或3))所表示之基]。
就天然之鹼性胺基酸而言，可舉出Lys、His、及Arg。又，就非天然之鹼性胺基酸而言，可舉出3MH、AMF、AGB等，但不限定於此等。
本說明書中，中性胺基酸為式(IId)所表示之胺基酸、Gly、Met、Pro、3HyP、Asn、Gln、Ser、 mS、MS、Thr、C(O)、C(O2)、Pen、或Pen類似化合物
(IId)
[式中，R 7為式-(CH 2) raNHCONH 2(式中，ra為1～6的整數(例如1、2、3、4、5、或6))、或式-(CH 2) rbSH(式中，rb為1～3的整數(例如1、2、或3))所表示之基]。
就天然之中性胺基酸而言，可舉出Gly、Ser、Thr、Cys、Met、Pro、Asn、及Gln。又，就非天然之中性胺基酸而言，可舉出3HyP、 mS、MS、Alb、Cit、Hct、HCY、C(O)、C(O2)、Pen、Pen類似化合物等，但不限定於此等。
本說明書中，酸性胺基酸為式(IIe)所表示之胺基酸。
(IIe)
[式中，R 8為式-(CH 2) sCOOH(式中，s為1～6的整數(例如1、2、3、4、5、或6))所表示之基]。
就天然之酸性胺基酸而言，可舉出Asp及Glu。
本說明書中，C 1-3烷基為具有1～3個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、1-丙基、或2-丙基。
本說明書中，C 1-6烷基為具有1～6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-丁基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、2-乙基-1-丁基、2,2-二甲基-1-丁基、或2,3-二甲基-1-丁基。
本說明書中，C 2-6烯基為具有2～6個碳原子且包含1以上之雙鍵的直鏈或支鏈烯基，可舉出例如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-甲基-2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、3-甲基-2-戊烯基等，較佳為乙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、3-丁烯基、4-戊烯基、5-己烯基。
本說明書中，C 3-6環烷基為具有3～6個碳原子的環狀烷基，例如環丙基、環丁基、環戊基、或環己基。
本說明書中，鹵素原子為F、Cl、Br、或I。
本說明書中，C 1-3烷氧基為經1個上述C 1-3烷基所取代的羥基，例如甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、或2-丙氧基。
本說明書中，所謂「糖鏈」，係意指2個以上的單醣藉由醣苷鍵所鍵結之結構單元。有時會將具體的單醣、糖鏈如例如“GlcNAc-”、“SG-”地標示作為簡寫。在結構式中以此等之簡寫記載之情形，在還原末端歸於與其他結構單元之醣苷鍵的氧原子或氮原子，除了有特別的定義之情形以外，係表示為不包含在表示該糖鏈之簡寫中。
本說明書中，為糖鏈之基本單元的單醣之記載，除了另行規定之情形以外，方便起見，其環結構中，將鍵結於構成環的氧原子，且與氫氧基(或歸於醣苷鍵的氧原子)直接鍵結之碳原子標記第1位(僅於唾液酸為第2位)。 就糖鏈中包含的單醣而言，只要為具有糖的基本結構者，則不特別限定，可使用六元糖、五元糖等各式各樣之物。又，可為天然中存在之糖，亦可為人工合成之糖，但較佳為天然中存在之糖。就單醣而言，可舉出例如葡萄糖(Glu)、果糖(Flu)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、葡萄糖胺(Glc)、N乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)、葡萄糖醛酸(GlucA)、神經胺酸(Neu)、唾液酸/N-乙醯神經胺酸(Sia/NeuNAc/Neu5Ac)、半乳胺糖、N乙醯半乳胺糖(GalNAc)、木糖(Xyl)、艾杜糖醛酸(IdoA)、岩藻醣(Fuc)、醛丙醣、甘油醛、醛丁醣、赤藻糖、蘇糖、戊醛醣、核糖、來蘇糖、阿拉伯糖、己醛醣、阿洛糖、塔羅糖(talose)、古洛糖、醛醣、艾杜糖、酮丙醣、二羥丙酮、酮丁醣、赤藻酮糖、酮戊醣、木酮糖、核酮糖、酮己醣、阿洛酮糖(psicose)、山梨糖、塔格糖等。
本說明書中，將糖鏈以記號(例如GLY、SG、GlcNAc等)來記載之情形，除了另行定義之情形以外，係將還原末端的碳為止設為包含在該記號中，將歸於N-或O-醣苷鍵的N或O設為不包含在該記號中。
本說明書中，所謂唾液酸聚醣(以下為「SG」)，係指以下的結構式及序列式所示之糖鏈，其係已知在人類的體內不顯示抗原性之N鍵結型複合型糖鏈。 (式中，「-(N)」表示與Asn之側鏈進行N醣苷鍵結。)
本說明書中，所謂TSP1抑制活性，係指阻礙包含血管新生抑制作用等之TSP1的作用之至少1個的活性。TSP1抑制活性係藉由本案實施例所示之使用了人類TSP1及血管內皮細胞的細胞黏著抑制試驗來測定。該試驗中，將受試物質之50%抑制濃度(IC 50)為500nM以下之情形，決定為具有TSP1抑制活性。
I.環狀肽 本發明提供具有TSP1抑制活性的新穎環狀肽或其藥學上可容許之鹽。
於一態樣中，本發明之化合物為式(I)所表示之環狀肽(以下稱為本發明之環狀肽I)。 於本發明之環狀肽I中，X aa1～X aa11之胺基酸藉由醯胺鍵結連結而形成寡肽鏈，N末端胺基酸(X aa1)與C末端胺基酸(X aa11)透過環形成基A連結而形成環狀結構。
於式(I)中，A選自包含胺基酸結構之下述環形成基A 1～A 5： A 1、 A 2、 A 3、 A 4、及 A 5。
於A中，末端所記載之 表示對X aa1的N末端胺基之鍵結點， 表示對X aa11的C末端羰基之鍵結點。上述環形成基中包含的胺基酸結構之非對稱點可為R型亦可為S型。
於一態樣中，A為 (以下稱為A 1)。
於環形成基A 1中，n為0～3的整數(例如0、1、2、或3)，R 1及R 2各自獨立地為氫原子或C 1-3烷基，R 10為胺基或羥基。C 1-3烷基較佳為甲基。
就A 1之較佳態樣而言，可舉出R 1及R 2各自為氫原子，R 10為胺基，且n為0之環形成基(以下稱為A 1a)。
A 1a係例如可藉由使醯胺鍵結於X aa11之C末端側的Cys(但是羧基轉變成醯胺基)之-SH，與鍵結於X aa1之N末端胺基的-COCH 2X(X為Cl等脫離基)反應而得到。此情形，Cys可為L-胺基酸或D-胺基酸。尤其，將A 1a中醯胺鍵結於X aa11之C末端側的Cys(但是羧基轉變成醯胺基)為L-胺基酸之情形的環形成基，稱為A 1a1。
就A 1之較佳的其他態樣而言，可舉出R 1及R 2各自為氫原子，R 10為胺基，且n為1之環形成基(以下稱為A 1b)。 A 1b係例如可藉由使醯胺鍵結於X aa11之C末端側的HCY(但是羧基轉變成醯胺基)之-SH、與鍵結於X aa1之N末端胺基的-COCH 2X(X為Cl等脫離基)反應而得到。此情形，HCY可為L-胺基酸或D-胺基酸。尤其，將A 1b中醯胺鍵結於X aa11之C末端側的HCY(但是羧基轉變成醯胺基)為L-胺基酸之情形的環形成基，稱為A 1b1。
就A 1之較佳的其他態樣而言，可舉出R 1及R 2各自為甲基，R 10為胺基，且n為0之環形成基(以下稱為A 1c)。 A 1c係例如可藉由使醯胺鍵結於X aa11之C末端側的Pen(但是羧基轉變成醯胺基)之-SH、與鍵結於X aa1之N末端胺基的-COCH 2X(X為Cl等脫離基)反應而得到。此情形，Pen可為L-胺基酸或D-胺基酸。尤其，將A 1c中醯胺鍵結於X aa11之C末端側的Pen(但是羧基轉變成醯胺基)為L-胺基酸之情形的環形成基，稱為A 1c1。
於其他態樣中，環形成基A為 (以下稱為A 2)。於A 2中，n為0～3的整數(例如0、1、2、或3)，R 1及R 2各自獨立地為氫原子或C 1-3烷基，R 10為胺基或羥基。A 2係例如可藉由使上述A 1之硫醚基(sulfide group)氧化成亞碸而得到。
就A 2之較佳態樣而言，可舉出R 1及R 2各自為氫原子，R 10為胺基，且n為0之環形成基(以下稱為A 2a)。A 2a係例如可藉由使上述A 1a之硫醚基氧化成亞碸而得到。尤其，將使A 1a1之硫醚基氧化成為亞碸之情形的環形成基，稱為A 2a1。
於其他態樣中，A為 (以下稱為A 3)。於A 3中，n為0～3的整數(例如0、1、2、或3)，R 1及R 2各自獨立地為氫原子或C 1-3烷基，R 10為胺基或羥基。A 3係例如可藉由使上述A 1之硫醚基氧化成碸而得到。
就A 3之較佳態樣而言，可舉出R 1及R 2各自為氫原子，R 10為胺基，且n為0之環形成基(以下稱為A 3a)。A 3a係例如可藉由使上述A 1a之硫醚基氧化成碸而得到。尤其，將使A 1a1之硫醚基氧化成為碸之情形的環形成基，稱為A 3a1。
於其他態樣中，A為 (以下稱為A 4)。於A 4中，k及l各自獨立地為0～3的整數(例如0、1、2、或3)，R 10為胺基或羥基。環形成基A 4係例如可藉由醯胺鍵結於X aa11之C末端側的於側鏈具有-(CH 2) lCH=CH 2的胺基酸(羧基亦可轉變成醯胺基)、與鍵結於X aa1之N末端胺基的-CO(CH 2) kCH=CH 2之烯烴複分解(olefin-metathesis)而得到。此情形，醯胺鍵結於X aa11之C末端側的胺基酸可為L-胺基酸及D-胺基酸之任一者。
於其他態樣中，A為 (以下稱為A 5)。於A 5中，m為1～7的整數(例如1、2、3、4、5、6、或7)，R 10為胺基或羥基。A 5係例如可藉由使A 4中的C-C雙鍵還原而得到。
於較佳態樣中，環形成基A為A 1a、A 1b、或A 1c，更佳為A 1a。
於式(I)中，X aa1為芳香族胺基酸的殘基。於較佳態樣中，X aa1為2Nal殘基。
於式(I)中，X aa2為芳香族胺基酸、鹼性胺基酸或脂肪族胺基酸的殘基。於較佳態樣中，X aa2為Arg、AGB、PHG、或Tle的殘基。
於式(I)中，X aa3及X aa8為各自獨立地選擇之以下之式(III) [式中，R a為式-(CH 2) tSH所表示之基(式中，t為1～3的整數(例如1、2、或3))]、或 式(III’) [式中，R b為式-CH v(CH 3) 2-vCH w(CH 3) 2-wSH所表示之基(式中，v為0～2的整數，v為0或1時，w為2，v為2時，w為0或1)、或-CH x(CH 3) 2-xSH(式中，x為0或1)] 所表示之胺基酸的殘基中X aa3及X aa8的硫醇基形成-S-S-、-S-CH 2-S-、或-S-X-S-所表示之鍵結的結構，且X aa3及X aa8之至少任意一者為式(III)所表示之胺基酸的殘基(式中，X選自 、 、或 (式中， 表示對S之鍵結點))。該結構係存在於本發明之環狀肽I的X aa3及X aa8之位置的2個胺基酸殘基之側鏈的硫醇基如上述地交聯之結構。於一實施形態中，X aa3及X aa8之結構可為：X aa3殘基為HCY殘基，且X aa8殘基為HCY殘基、Cys殘基、或Pen殘基、較佳為HCY殘基或Cys殘基、更佳為HCY殘基，而且X aa3及X aa8之硫醇基為如上述地交聯之結構、較佳為以-S-S-或-S-CH 2-S-所表示之鍵結交聯之結構，更佳為以-S-S-所表示之鍵結(即雙硫鍵結(disulfide bond))交聯之結構。於其他實施形態中，X aa3及X aa8之結構可為：X aa3殘基為Cys殘基，且X aa8殘基為HCY殘基、Cys殘基、或Pen殘基，而且X aa3及X aa8之硫醇基如上述地交聯之結構，較佳為以-S-S-或-S-CH 2-S-所表示之鍵結交聯之結構，更佳為以-S-S-所表示之鍵結(即雙硫鍵結)交聯之結構。於其他實施形態中，X aa3及X aa8結構可為：X aa3殘基為Pen殘基，且X aa8殘基為HCY殘基，而且X aa3及X aa8之硫醇基如上述地交聯之結構。於較佳態樣中，X aa3及X aa8之結構中，式(III)或(III’)所表示之胺基酸的殘基為HCY殘基或Cys殘基。於更佳態樣中，X aa3及X aa8係存在於本發明之環狀肽I的X aa3及X aa8之位置的2個HCY殘基之側鏈的硫醇基如上述地交聯之結構。再者，HCY殘基為t=2之式(III)所表示之胺基酸的殘基。
於較佳態樣中，X aa3及X aa8之結構中，硫醇基形成-S-S-或-S-CH 2-S-，更佳為形成-S-S-所表示之鍵結。於更佳態樣中，X aa3及X aa8之結構中，式(III)或(III’)所表示之胺基酸的殘基為HCY殘基，且硫醇基形成-S-S-所表示之鍵結。
於式(I)中，X aa4為中性胺基酸的殘基。於較佳態樣中，X aa4為Gly殘基。
於式(I)中，X aa5為鹼性胺基酸的殘基。於較佳態樣中，X aa5為Arg或AGB的殘基。
於式(I)中，X aa6為中性胺基酸或酸性胺基酸的殘基。於較佳態樣中，X aa6為Asn或Asp的殘基。
於式(I)中，X aa7為芳香族胺基酸的殘基。於較佳態樣中，X aa7為Trp殘基。
於式(I)中，X aa9為芳香族胺基酸、脂肪族胺基酸或鹼性胺基酸的殘基。於較佳態樣中，X aa9為Val、Arg、PHG、4PAL、或AGB的殘基，更佳為Val、Arg、PHG、或4PAL的殘基。
於式(I)中，X aa10為芳香族胺基酸的殘基。於較佳態樣中，X aa10為Trp殘基。
於式(I)中，X aa11為脂肪族胺基酸的殘基。於較佳態樣中，X aa11為Val、CPTG、或CHXG的殘基，更佳為Val或CPTG的殘基。
就本發明之環狀肽I之較佳態樣而言，可舉出以下之環狀肽，其係於式(I)中， X aa1為2Nal殘基， X aa2為Arg、AGB、PHG、或Tle的殘基， X aa3及X aa8之結構中，式(III)或(III’)所表示之胺基酸的殘基為HCY殘基或Cys， X aa4為Gly殘基， X aa5為Arg或AGB的殘基， X aa6為Asn或Asp的殘基， X aa7為Trp殘基， X aa9為Val、Arg、PHG、4PAL、或AGB的殘基， X aa10為Trp殘基，且 X aa11為Val、CPTG、或CHXG的殘基。
就本發明之環狀肽I的更較佳態樣而言，可舉出選自由以下所表示之化合物所組成之群組的環狀肽 。 此處所示之環狀肽，係後述之實施例中的胜肽-1～胜肽-12及胜肽-125～胜肽-139，環形成基A皆為A 1a1。
本發明之環狀肽I具有鹼性基之情形，可與酸組合而形成鹽，此等之鹽包含在本發明中。就該種之鹽而言，可舉出例如無機酸鹽、有機酸鹽、胺基酸鹽、及磺酸鹽。就無機酸鹽而言，可舉出例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等。就有機酸鹽而言，可舉出例如乙酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、酞酸鹽、三氟乙酸鹽等。就胺基酸鹽而言，可舉出例如麩胺酸鹽、天門冬胺酸鹽等。就磺酸鹽而言，可舉出例如甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、2,4-二甲基苯磺酸鹽、2,4,6-三甲基苯磺酸鹽、4-乙基苯磺酸鹽、萘磺酸鹽等。就本發明之環狀肽I的藥學上可容許之鹽的較佳態樣而言，為乙酸鹽、鹽酸鹽、或三氟乙酸鹽，更佳為乙酸鹽。
本發明之環狀肽I具有酸性基之情形，可與鹼組合而形成鹽，此等之鹽包含在本發明。就此等之鹽而言，可舉出例如金屬鹽、無機胺鹽、有機胺鹽、及胺基酸鹽。就金屬鹽而言，可舉出例如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽等鹼金屬鹽、鈣鹽、鎂鹽等鹼土族金屬鹽、鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等。就無機胺鹽而言，可舉出例如銨鹽。就有機胺鹽而言，可舉出例如啉鹽、葡萄糖胺鹽、乙二胺鹽、胍鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽、二環己胺鹽、二乙醇胺鹽、哌鹽、四甲基銨鹽等。就胺基酸鹽而言，可舉出例如離胺酸鹽、精胺酸鹽等。
本發明之環狀肽I或其藥學上可容許之鹽，可以結晶之形態使用，該結晶可僅由本發明之環狀肽I或其藥學上可容許之鹽形成，亦可形成共結晶或溶劑合物(例如水合物)。本發明之環狀肽I及其藥學上可容許之鹽，可單獨使用任一者或適當地組合2種以上而使用。
本發明之環狀肽I或其藥學上可容許之鹽，可形成構成其之1個以上的原子以非天然之比率被同位素原子取代而成的同位素化合物。同位素原子可為放射性或非放射性，例如氘( 2H；D)、氚( 3H；T)、碳-14( 14C)、碘-125( 125I)等。以放射性的同位素原子所標識的化合物，可使用作為疾病之治療或預防藥、研究用試藥(例如試驗用試藥)、診斷藥(例如影像診斷藥)等。本發明包含放射性或非放射性的同位素化合物。
本發明之環狀肽I或其藥學上可容許之鹽，可利用化學合成、無細胞轉譯系統(cell-free translation system)等該技術領域中已知的方法來製造。例如，本發明之環狀肽的化學合成，可依照使用9-茀基甲氧羰基(Fmoc基)作為胺基的保護基之一般的固相合成法來進行。於固相合成，可使用市售之自動合成機(例如Syro II(Biotage Japan公司)、Liberty Blue(CEM公司)等)。
例如，具有A 1作為環形成基的本發明之環狀肽I，係可依照以下的方法而得到。
使用肽自動合成機，而在固相擔体(solid support)(例如Rink Amide Resin AM(Novaviochem公司)、2-氯三苯甲基氯樹脂(2-Chlorotrityl chloride resin)(Novaviochem公司)等)，由C末端側依序連結、以胺基的保護基(例如Fmoc基等)所保護之胺基酸(C末端胺基酸為具有硫醇基的胺基酸)。胺基的脫保護係藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的方法(例如，Fmoc基之情形為20%哌啶/1-甲基-2-吡咯啶酮等)來進行。連結N末端的胺基酸，且將胺基脫保護之後，導入用以使環形成基形成之基(例如氯甲基羰基等)(例如，使氯乙酸與N末端胺基反應)，形成環狀肽。然後，藉由慣用方法(例如，於使用Rink Amide Resin AM之情形，為使用三氟乙酸-乙二硫醇-三異丙基矽烷-水之條件)，而從肽樹脂將所得之肽切斷。藉由醚沉澱而回收粗肽後，藉由慣用方法(例如逆相高效能液相層析法)而純化目的物。 關於所得之環狀肽，可藉由慣用方法(例如碘氧化法)而使X aa3與X aa8之間的雙硫鍵結等鍵結形成，得到二環性環狀肽。 所得之目的物可藉由慣用方法而轉變為所期望之鹽。
具有A 2或A 3作為環形成基的本發明之環狀肽I或其藥學上可容許之鹽，係例如可使具有A 1的本發明之環狀肽I或其藥學上可容許之鹽藉由氧化劑(例如間氯過苯甲酸、過氧化氫水或二甲基二氧環丙烷)氧化而得到。
例如，具有A 4或A 5作為環形成基的本發明之環狀肽I，係例如可依照以下的方法而得到。
具有末端基D 1及D 2的寡肽，係可藉由使用肽自動合成機，而在固相擔体，由C末端側依序連結以胺基的保護基(例如Fmoc基等)所保護之胺基酸(C末端胺基酸為具有烯烴的胺基酸)，將N末端的胺基酸之胺基脫保護之後，導入用以使環形成基形成之基(例如2-丙烯基等)來製備。 可藉由在製備具有末端基D 1及D 2的寡肽之後，使用合適的觸媒(例如第二代格拉布觸媒(Grubbs’ catalyst))進行烯烴複分解反應，而製備具有A 4作為環形成基的環狀肽。可藉由將該環狀肽在合適的條件下(例如氫、威爾金森觸媒(Wilkinson’s Catalyst))付諸還原反應，而得到具有A 5作為環形成基的環狀肽。
本發明之環狀肽I或其藥學上可容許之鹽，係具有TSP1抑制活性，且藉由本案實施例所示之使用了人類TSP1及血管內皮細胞的細胞黏著抑制試驗所測定之IC 50為500nM以下，較佳為200nM以下。所以，本發明之環狀肽I或其藥學上可容許之鹽可阻礙TSP1與血管內皮細胞的黏著，因此有用於作為血流改善劑。
又，本發明之環狀肽I由於是二環性，因此與單環性之環狀肽比較，而代謝安定性提升。所以，本發明之環狀肽I或其藥學上可容許之鹽，係提供以比先前少的投予頻率來治療或預防能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病或症狀之手段，因此為有用的。
II.包含本發明之環狀肽I或其藥學上可容許之鹽作為有效成分的醫藥組成物 本發明進一步提供包含本發明之環狀肽I或其藥學上可容許之鹽作為有效成分的醫藥組成物(以下稱為本發明之醫藥組成物I)。本發明之醫藥組成物I係具有優異的TSP1抑制活性，且有用於能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病或症狀(例如，可能起因於血管新生抑制之疾病、可能起因於血栓形成亢進之疾病、發炎性疾病、可能起因於腎臟細胞機能降低之疾病、可能起因於血管鬆弛作用的抑制之疾病、缺血性疾病、癌疾病等疾病、鐮刀型紅血球疾病所伴隨的血管阻塞(vaso-occlusive crisis)、血管新生抑制、組織壞死、胰島素抗性、一般的創傷等症狀)之治療或預防。就可能起因於血管新生抑制之疾病而言，可舉出例如嚴重肢體缺血、周邊血管疾病等。就可能起因於血栓形成亢進之疾病而言，可舉出例如心肌梗塞、周邊血管疾病(PAD)等。就發炎性疾病而言，可舉出例如可能因肥胖而誘發的發炎、主動脈瘤中的發炎等。就可能起因於腎臟細胞機能降低之疾病而言，可舉出例如糖尿病性腎病、IgA腎病、慢性腎衰竭、急性腎衰竭等。就可能起因於血管鬆弛作用的抑制之疾病而言，可舉出例如腎損傷、缺血再灌流傷害等。就缺血性疾病而言，可舉出例如心肌梗塞、狹心症等。就癌疾病而言，可舉出例如鱗狀細胞癌、乳癌、胰臟癌等。有報告TSP1會促進鱗狀細胞癌、乳癌、及胰臟癌的發展(參照例如前述非專利文獻21、第39頁左欄、由下方起第14行～右欄第3行、及表4)。
本發明之醫藥組成物I係具有優異的TSP1抑制活性，且可具有血流改善作用。因此，有用於能夠藉由改善血流而治療或預防的疾病之治療或預防。例如就該種之疾病而言，可舉出慢性肢體威脅性缺血、嚴重肢體缺血、周邊動脈疾病、心肌梗塞、狹心症、腎損傷、缺血再灌流傷害。又，就慢性肢體威脅性缺血而言，例如糖尿病性腳病變，就糖尿病性腳病變而言，可舉出例如糖尿病性腳潰瘍。
於較佳態樣中，本發明之醫藥組成物I有用於嚴重肢體缺血、周邊動脈疾病或慢性肢體威脅性缺血之治療或預防，例如有用於嚴重肢體缺血患者之創傷治癒的促進、及對於嚴重肢體缺血之血管內治療之預後的改善。
已知TSP1在嚴重肢體缺血患者之下肢骨骼肌中，其表現係亢進。並不希望被任何理論所拘束，但認為本發明之醫藥組成物I可藉由阻礙TSP1與血管內皮細胞的黏著，而促進因TSP1所阻礙的血管新生或血管擴張。藉此，而本發明之醫藥組成物I可促進嚴重肢體缺血患者之創傷治癒，又可於與利用導管等的血管內治療組合之情形改善該治療之預後(例如預防再狹窄)。
本說明書中，於疾病或症狀之治療或預防中，係包含：該疾病之發病的預防、惡化加劇或發展的抑制或阻礙；罹患該疾病的個體所呈現之一個以上的症狀的減輕、或惡化加劇或是發展的抑制；繼發性疾病(Secondary disease)之治療或預防等。
本發明之醫藥組成物I，係可將本發明之環狀肽I或其藥學上可容許之鹽、與適當的藥學上可容許之添加劑混合，而進行製劑化。例如，本發明之醫藥組成物I可作為錠劑、膠囊劑、顆粒劑等製劑而經口地投予，或作為注射劑、經皮吸收劑等製劑而非經口地投予。
此等之製劑係使用賦形劑、結合劑、崩散劑、潤滑劑、乳化劑、安定劑、稀釋劑、注射劑用溶劑、助溶劑、懸浮劑、等滲劑、緩衝劑、無痛劑(soothing agent)、防腐劑、抗氧化劑等添加劑，而以周知方法製造。
就賦形劑而言，可舉出例如有機系賦形劑或無機系賦形劑。就有機系賦形劑而言，可舉出例如：如乳糖、白糖的糖衍生物；如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉的澱粉衍生物；如結晶纖維素的纖維素衍生物；阿拉伯膠等。就無機系賦形劑而言，可舉出例如：如硫酸鈣的硫酸鹽。
就結合劑而言，可舉出例如：上述賦形劑；明膠；聚乙烯吡咯啶酮；聚乙二醇等。
就崩散劑而言，可舉出例如：上述賦形劑；如交聯羧甲基纖維素鈉、羧甲基澱粉鈉的經化學修飾之澱粉或纖維素衍生物；交聯聚乙烯吡咯啶酮等。
就潤滑劑而言，可舉出例如：滑石；硬脂酸；膠體矽石；如蜂蠟、鯨蠟的蠟類；如硫酸鈉的硫酸鹽；如月桂基硫酸鈉的月桂基硫酸鹽；上述賦形劑中的澱粉衍生物等。
就乳化劑而言，可舉出例如：如膨土、VEEGUM(矽酸鎂鋁)的膠質黏土；如月桂基硫酸鈉的陰離子界面活性劑；如氯化苄烷銨的陽離子界面活性劑；如聚氧乙烯烷基醚的非離子界面活性劑等。
就安定劑而言，可舉出例如：如對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯的對羥苯甲酸酯類；如氯丁醇的醇類；如苯酚、甲酚的酚類等。
就稀釋劑而言，可舉出例如水、乙醇、丙二醇等。
就注射劑用溶劑而言，可舉出例如水、乙醇、甘油等。
就助溶劑而言，可舉出例如聚乙二醇、丙二醇、D-甘露醇、苯甲酸苄酯、乙醇、三(羥甲基)胺基甲烷、膽固醇、三乙醇胺、碳酸鈉、檸檬酸鈉等。
就懸浮劑而言，可舉出例如硬脂酸三乙醇胺鹽、月桂基硫酸鈉、月桂基胺基丙酸、卵磷脂、氯化苄烷銨、氯化苯索寧(benzethonium chloride)、甘油單硬脂酸酯等界面活性劑；例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素等親水性高分子等。
就等滲劑而言，可舉出例如氯化鈉、甘油、D-甘露醇等。
就緩衝劑而言，可舉出例如磷酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽等緩衝液等。
就無痛劑而言，可舉出例如苄醇等。
就防腐劑而言，可舉出例如對羥基苯甲酸酯(p-oxybenzoate)類、氯丁醇、苄醇、苯乙醇、脫水乙酸、山梨酸等。
就抗氧化劑而言，可舉出例如亞硫酸鹽、抗壞血酸等。
投予本發明之醫藥組成物I的對象，係例如哺乳動物，較佳為人類。
就本發明之醫藥組成物I的投予途徑而言，可為經口投予及非經口投予之任一者，可因應對象疾病而選擇適合的投予途徑。又，投予途徑可為全身投予及局部投予之任一者。就非經口投予而言，可舉出例如靜脈內投予、動脈內投予、肌肉內投予、皮內投予、皮下投予、腹腔內投予、經皮投予、骨內投予、關節內投予等。本發明之醫藥組成物I的投予途徑的較佳態樣為靜脈內投予、皮下投予、或經皮投予。
本發明之環狀肽I或其藥學上可容許之鹽，係以對治療或預防有效之量被投予至對象。本說明書中，所謂「對治療或預防有效之量」，係意指對特定疾病、投予形態及投予途徑發揮治療或預防效果之量，因應對象物種、疾病的種類、症狀、性別、年齡、宿疾、其他要素而適當地決定。
本發明之環狀肽I或其藥學上可容許之鹽的投予量，係因應對象物種、疾病的種類、症狀、性別、年齡、宿疾、其他要素而適當地決定，對於人類的成人，通常可將0.1～1000mg/kg、較佳為0.1～10mg/kg，於1～7天投予1次、或1天投予2次或是3次以上。
本發明之醫藥組成物I亦可與至少1個已知的治療劑或治療法併用。例如，於嚴重肢體缺血之治療中，可在導管等血管內治療之前、在之後、或同時地投予本發明之醫藥組成物I。 本發明之環狀肽I或其藥學上可容許之鹽，可藉由塗藥支架(Drug Eluting Stents，DES)來送達。所謂塗藥支架，係指以使支架表面攜帶藥劑且於留置在血管內後藥劑會緩緩地溶出的方式製成的支架。
又，本發明有關於一種用以治療或預防疾病或症狀的方法，此方法包含：將本發明之環狀肽I或其藥學上可容許之鹽的對治療或預防有效之量投予至需要其的對象。
本發明中之「對象」，係例如哺乳動物，較佳為人類。
於本發明中之「投予」中，係包含經口投予及非經口投予，可為全身投予及局部投予之任一者。就非經口投予而言，可舉出例如靜脈內投予、動脈內投予、肌肉內投予、皮內投予、皮下投予、腹腔內投予、經皮投予、骨內投予、關節內投予等。本發明中之「投予」的較佳態樣為靜脈內投予、皮下投予、或經皮投予。
就本發明中之「疾病或症狀」而言，可舉出能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病或症狀。如根據本發明，則可治療或預防例如嚴重肢體缺血、周邊動脈疾病或慢性肢體威脅性缺血。
III.複合體 本發明進一步提供環狀肽與載體分子結合之複合體或其藥學上可容許之鹽。
1.載體分子 於本發明之複合體中，載體分子係作為與環狀肽結合以使藥物動態改善之載體而發揮功用。本發明之載體分子，只要能發揮作為環狀肽的載體的功用，且本發明之複合體可發揮TSP-1抑制效果(即具有TSP-1抑制活性)，則不限定於特定分子，可為例如各種天然高分子、合成高分子，較佳可採用天然或非天然之蛋白質。又，從藥物動態的觀點來看，本發明之載體分子具有與新生兒型Fc受體(FcRn)之結合親和性。因具有與FcRn之結合親和性，而可利用透過FcRn的再循環機制，可拉長本發明之複合體的血中半衰期。所以，本發明之載體分子為能與環狀肽結合的分子，且具有與FcRn之結合親和性。採用蛋白質作為該種具有與FcRn之結合親和性的載體分子之情形，載體分子可為例如人類血清白蛋白或其片段或是變異體、白蛋白結合蛋白、及後述之含Fc分子。載體分子可藉由化學合成、無細胞轉譯系統、使用動物細胞之蛋白質合成系統等公知技術來製造。
載體分子具有與FcRn之結合親和性一事，可使用表面電漿子共振(SPR)技術等而藉由慣用方法來測定。於測定中，可使用市售之裝置，可使用例如Biacore(GE Healthcare)等。本發明中之載體分子，係較佳為與人類血清白蛋白、人類IgG等已知會與FcRn結合的分子具有相同程度的與FcRn之結合親和性。
人類血清白蛋白為血漿中最豐富地存在的蛋白質，由相同性高的3個結構域(結構域I、結構域II、結構域III)所組成，各結構域進一步由2個次結構域(A、B)所構成。已知尤其是人類血清白蛋白的結構域III對人類血清白蛋白與FcRn的結合為重要的(日本特表2019-513724及Structure, 2013, 21, 1966-1978)。人類血清白蛋白由於具有與FcRn之結合親和性，且血中半衰期較長為約20天，因此作為用以改善藥物動態的載體分子而較佳，已開發利用白蛋白之技術。人類血清白蛋白或其片段或是變異體與環狀肽之結合方法，只要能發揮作為環狀肽的載體分子的功用，且本發明之複合體可發揮TSP-1抑制效果，則不特別限定，可使用公知方法。就該種之方法而言，可舉出例如：透過人類血清白蛋白中包含的半胱胺酸殘基來使其結合的方法(Org. Biomol. Chem., 2019, 17, 7870-7873)；利用轉麩醯胺酸酶而透過人類血清白蛋白中包含的麩醯胺酸殘基來使其結合的方法；及透過人類血清白蛋白中包含的離胺酸殘基之結合等。採用人類血清白蛋白之片段或變異體作為本發明之載體分子之情形只要保持著與FcRn之結合親和性及與環狀肽之結合部位，則可為任何片段或變異體，但較佳為包含人類血清白蛋白的結構域III及與環狀肽之結合部位。就本發明之載體分子而言，更佳為全長人類血清白蛋白。
本發明之含Fc分子，係與環狀肽結合而形成複合體，且作為用以在使環狀肽長時間持續在血中的載體而發揮功用。本發明之含Fc分子，係指至少包含源自IgG之Fc區的全部或一部分之分子。就本發明之含Fc分子而言，可舉出全長IgG、全長IgG重鏈、包含Fc區的全部或一部分之IgG的片段、彼等之胺基酸序列有部分缺失或是經修改的變異體等。又，本發明之含Fc分子可僅為重鏈，亦可具有對應於重鏈之結構的輕鏈。IgG為2條重鏈與2條輕鏈透過雙硫鍵結與非共價鍵結而被保持的異二聚體蛋白質。重鏈與輕鏈各自具有可變區與恆定區，且於可變區辨識抗原。又，重鏈之恆定區進一步包含CH1結構域、CH2結構域、及CH3結構域，且CH1結構域與CH2結構域透過鉸鏈部位而連結。IgG具有結構域結構，由包含可變區且具有抗原結合能力的Fab區(antigen-binding fragment)、和會與Fc受體結合的Fc區(fragment crystallizable)所組成。Fc區為IgG重鏈的一部分，係指會受木瓜酶切斷的鉸鏈部位之從N末端到C末端為止的區域，係指由源自IgG重鏈之恆定區之鉸鏈部位的一部分、CH2結構域、及CH3結構域所組成的區域。就相當於人類IgG1之Fc區的胺基酸序列而言，可舉出例如序列識別號148之胺基酸編號1～232、2～232、3～232、4～232、5～232、6～232、7～232、8～232、9～232、10～232、或11～232之序列(在Edelman et al.,(Proc. Natl. Acad. USA, (1969) Vol. 63, pp. 78-85)所特定之Eu索引(Eu INDEX)中各自相當於第216～447位、第217～447位、第218～447位、第219～447位、第220～447位、第221～447位、第222～447位、第223～447位、第224～447位、第225～447位、及第226～447位。)。又，Fc區係具有與FcRn之結合親和性，透過與FcRn之結合而參與IgG的再循環機制。此與FcRn之結合中，有CH2結構域、及CH3結構域的胺基酸殘基參與。所以，本發明之含Fc分子為了保持與FcRn之結合親和性，而較佳為具有CH2結構域及CH3結構域。關於本發明之含Fc分子，於稱為「重鏈」之情形，可包含全長的重鏈、包含Fc區的全部或一部分之IgG的片段中的重鏈、彼等之胺基酸序列有部分缺失或是經修改的變異體等。又，關於本發明之含Fc分子，於稱為「輕鏈」之情形，可包含全長的輕鏈、其胺基酸序列有部分缺失或是經修改的變異體等。
含Fc分子與環狀肽之結合方法，只要能發揮作為環狀肽的載體的功用，且本發明之複合體可發揮TSP-1抑制效果，則不特別限定，可使用公知方法。就該種之方法而言，可舉出例如：透過含Fc分子中包含的糖鏈來使其結合的方法；透過含Fc分子中包含的半胱胺酸殘基來使其結合的方法；使特定位置的胺基酸殘基變異為半胱胺酸殘基，且透過該半胱胺酸殘基來使其結合的方法；利用轉麩醯胺酸酶而透過含Fc分子中包含的麩醯胺酸殘基來使其結合的方法；使特定位置的胺基酸殘基變異為麩醯胺酸殘基，且利用轉麩醯胺酸酶而透過該麩醯胺酸殘基來使其結合的方法等。於較佳態樣中，本發明之含Fc分子，係透過與IgG重鏈之Fc區中被良好地保存之會受N鍵結型糖鏈所致修飾的天門冬醯胺酸殘基(稱為「Asn297」(Eu索引之第297位的Asn))之側鏈鍵結的糖鏈(稱為「N297結合糖鏈」)、或透過IgG重鏈之Fc區的鉸鏈部位中被良好地保存之Cys226(Eu索引之第226位的Cys)及/或是Cys229(Eu索引之第229位的Cys)的硫醇基，而與環狀肽連結。因此，本發明之含Fc分子，係較佳為至少具有相當於Asn297的人類IgG之Fc區中的胺基酸殘基、或相當於Cys226或是Cys229的人類IgG之鉸鏈部位的胺基酸殘基。
採用本發明之含Fc分子作為本發明之載體分子之情形，只要保持著與FcRn之結合親和性及與環狀肽之結合部位，則其序列不特別限定，但較佳為包含相當於CH2結構域及CH3結構域的胺基酸序列、與相當於Asn297的人類IgG之Fc區中的胺基酸殘基或相當於Cys226及/或是Cys229的人類IgG之鉸鏈部位的胺基酸殘基。就該種之含Fc分子而言，可舉出例如全長人類IgG、全長人類IgG重鏈、或包含Fc區的全部或一部分之人類IgG的片段，或者是其胺基酸序列有部分缺失或是經修改的變異體等。又，本發明之含Fc分子可僅為重鏈，亦可具有對應於重鏈之結構的輕鏈。
本發明之含Fc分子中，亦包含含Fc分子受到生物學上的修飾而成之修飾體。於生物學上的修飾中，係包含翻譯後經修飾(例如，對N-鍵結或O-鍵結的糖鏈附加、N端或C端的加工、脫醯胺化、天門冬胺酸的異構化、甲硫胺酸的氧化)者、藉由使用原核生物宿主細胞使其表現而於N端附加甲硫胺酸殘基而成者等。
再者，在以動物細胞所生產的抗體，已知其重鏈的羧基末端之離胺酸殘基缺失(Journal of Chromatography A, 705: 129-134(1995))，又已知相同地重鏈的羧基末端之甘胺酸及離胺酸的2個胺基酸殘基缺失，且新位於羧基末端的脯胺酸殘基被醯胺化(Analytical Biochemistry, 360: 75-83(2007))。但是，此等之重鏈序列的缺失及修飾，對於抗體之抗原結合能力及效應子(effector)機能(補體之活化、抗體依賴性細胞傷害作用等)，並不造成影響。所以，本發明之含Fc分子中亦包含受到該修飾之含Fc分子及該含Fc分子的機能性片段，且亦包含在重鏈的羧基末端有1或2個胺基酸殘基缺失之缺失體、及羧基末端的胺基酸殘基經醯胺化之該缺失體(例如羧基末端部位的脯胺酸殘基經醯胺化之重鏈)等。但是，只要能發揮作為環狀肽的載體的功用，且本發明之複合體可發揮TSP-1抑制效果，則本發明之含Fc分子之重鏈的羧基末端之缺失體並不限定於上述種類。本發明之含Fc分子包含2條重鏈之情形，彼等可為於羧基末端沒有缺失的重鏈及選自由上述缺失體所組成之群組的重鏈中之任一種，亦可為組合任意二種而成者。各缺失體之量比可受到產生本發明之含Fc分子的動物細胞的種類及培養條件影響，但就本發明之含Fc分子而言，可舉出較佳為在2條重鏈雙方有羧基末端的一個胺基酸殘基缺失者。
於一態樣中，本發明之含Fc分子可包含選自由對N-鍵結之糖鏈附加、對O-鍵結之糖鏈附加、N末端的加工、C末端的加工、脫醯胺化、天門冬胺酸的異構化、甲硫胺酸的氧化、對N末端之甲硫胺酸殘基的附加、脯胺酸殘基的醯胺化及重鏈的羧基末端中之1或2個胺基酸殘基的缺失所組成之群組的1或2以上之修飾。
為本發明之含Fc分子之要素的IgG之亞類並不特別限定，可選擇任意之亞類，但較佳為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，更佳為IgG1，進一步更佳為人類IgG1。IgG之恆定區中的胺基酸序列被良好地保存，且於Edelman et al.,(Proc. Natl. Acad. USA, (1969) Vol. 63, pp. 78-85)中各個胺基酸係以Eu索引(Eu INDEX)來特定。例如，於Fc區中N鍵結型糖鏈附加的Asn297，係於Eu索引中相當於第297位，於鉸鏈部位中連接子結構連結的Cys226及Cys229，係於Eu索引中各自相當於第226位及第229位。又，本發明之含Fc分子中可採用的源自人類IgG之Fc區、鉸鏈部位、及重鏈之恆定區，各自相當於Eu索引中之第216～447位、第216～230位、及第118～447位之胺基酸序列的區域。就相當於本發明之含Fc分子中可採用的源自人類IgG1之Fc區、鉸鏈區、輕鏈之恆定區及重鏈之恆定區的具體的胺基酸序列而言，可舉出例如各自為序列識別號129(人類IgG1重鏈恆定區之胺基酸序列；編碼該胺基酸序列的核苷酸序列為序列識別號128)之胺基酸編號118～349之胺基酸序列(但是N末端可縮短至胺基酸編號128為止)、序列識別號129之胺基酸編號118～132之胺基酸序列、序列識別號131(人類IgG1輕鏈恆定區之胺基酸序列；編碼該胺基酸序列的核苷酸序列為序列識別號130)之胺基酸編號21～125之胺基酸序列(胺基酸編號1～20為訊息肽)、及序列識別號129之胺基酸編號20～349之胺基酸序列(胺基酸編號1～19為訊息肽)。即便在因分子的片段化或區域缺失而實際的胺基酸位置有變動之情形，亦能藉由以Eu索引表示而使胺基酸被無歧異地特定。再者，關於本發明之含Fc分子中可採用的人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4之恆定區，於Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242有報告複數個異型序列，但任一者皆可用於本發明之含Fc分子中。例如，於人類IgG1之序列中，於Eu索引所示之第356及358位之胺基酸序列，係各自有D與E、及L與M，但任一者皆可用於本發明之含Fc分子中。
採用全長IgG作為本發明之含Fc分子之情形，只要能發揮作為環狀肽的載體的功用，且本發明之複合體可發揮TSP-1抑制效果者即可。於一態樣中，可採用不會將在可變區中通常存在於人類的體內之物質辨識為抗原的IgG。以非人類動物之蛋白質為抗原的IgG，由於在人類的對應分子/關聯分子存在之情形有對人類的分子顯示交叉反應性之可能性，因此較佳為選擇對於人類不具有對應分子/關聯分子之抗原的單株抗體。又，即使是有將人類體內的成分辨識為抗原之疑慮的IgG，在辨識該抗原係對於本發明之複合體引起的所致TSP-1抑制效果的發揮並無不利影響之情形，可採用該種之IgG。另一方面，即使在辨識該抗原係對於本發明之複合體引起的TSP-1抑制效果的發揮有不利影響之情形，於藉由基因工程之手法而對其可變區導入變異，使該抗原辨識能力減弱或缺失之情形，亦可採用彼等之分子作為本發明之含Fc分子。作為本發明之含Fc分子所使用的全長IgG，較佳為以源自哺乳動物以外之生物的分子為抗原的IgG，更佳為以源自微生物之分子為抗原的IgG。就該種之以源自微生物之分子為抗原的IgG而言，可舉出例如以脂多醣(LPS)為抗原的IgG。此種單株抗體，係例如WO2015/046505等中所記載，具體而言可舉出由以下之重鏈及輕鏈之組合所組成的mAb-A：由序列識別號125之胺基酸編號20～474之胺基酸序列所組成的重鏈(胺基酸編號1～19為訊息肽；編碼該重鏈的核苷酸序列為序列識別號124)；及由序列識別號127之胺基酸編號21～234之胺基酸序列所組成的輕鏈(胺基酸編號1～20為訊息肽；編碼該輕鏈的核苷酸序列為序列識別號126)。
採用包含Fc區的全部或一部分之抗體片段作為本發明之含Fc分子之情形，只要能發揮作為環狀肽的載體的功用，且本發明之複合體可發揮TSP-1抑制效果者即可。可採用例如：僅由使可變區自IgG之重鏈缺失的恆定區所組成的CH、僅由IgG之Fc區所組成的分子、或僅由IgG之Fc區的一部分所組成的分子。 就僅由使可變區自人類IgG1重鏈缺失的恆定區所組成的CH之具體的胺基酸序列而言，可舉出例如序列識別號129之胺基酸編號20～349之胺基酸序列(胺基酸編號1～19為訊息肽；編碼該CH的核苷酸序列為序列識別號128)。選擇CH作為本發明之含Fc分子之情形，可僅採用CH，亦可採用與僅由輕鏈之恆定區所組成的CL組合而成的CLCH。就IgG1輕鏈的CL之具體的胺基酸序列而言，可舉出例如序列識別號131之胺基酸編號21～125(胺基酸編號1～20之胺基酸為訊息肽；編碼該CL的核苷酸序列為序列識別號130)，就CLCH而言，可舉出例如組合序列識別號129所示之CH與序列識別號131所示之CL而成的CLCH。 就由人類IgG1之Fc區的一部分所組成的分子之具體的胺基酸序列而言，可舉出例如序列識別號135之胺基酸編號21～243之胺基酸序列(胺基酸編號1～20為訊息肽；編碼相當於該Fc區的胺基酸序列的核苷酸序列為序列識別號134)。
採用全長IgG、全長IgG重鏈、或包含Fc區的全部或是一部分之IgG的片段、彼等之胺基酸序列有部分缺失或是經修改的變異體作為本發明之含Fc分子之情形，只要為保持著與FcRn之結合親和性及與環狀肽之結合部位者即可。採用以保持對於人類體內之成分的抗原辨識能力之狀態具有可變區的全部或一部分之抗體分子作為本發明之含Fc分子之來源之情形，且辨識該抗原係對於本發明之複合體引起的TSP-1抑制效果的發揮有不利影響之情形，較佳為藉由基因工程之手法而對其可變區導入變異，使該抗原辨識能力減弱或缺失。亦即，於一態樣中，本發明之含Fc分子可為IgG之可變區缺失、或以抗原辨識能力減弱或缺失之方式經修改的變異體。作為該種之變異體，可舉出例如上述之僅由使可變區自人類IgG1重鏈缺失的恆定區所組成的CH、組合僅由輕鏈之恆定區所組成的CL與CH而成的CLCH、及包含Fc區的全部或一部分之IgG的片段。就被採用作為本發明之含Fc分子的胺基酸序列有部分經修改的變異體而言，可舉出例如對於修改前之胺基酸序列具有高的相同性(例如80%以上、90%以上、95%以上、或99%以上之相同性)的胺基酸序列、或具有1至數個(例如2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個)的胺基酸殘基被取代、缺失、插入或附加而成的胺基酸序列，且保持著與FcRn之結合親和性及與環狀肽之結合部位的分子。
採用包含Fc區的全部或是一部分之IgG的片段、或其胺基酸序列有部分缺失或是經修改的變異體作為本發明之含Fc分子之情形，只要為保持著與FcRn之結合親和性及與環狀肽之結合部位者即可。為了保持與FcRn之結合親和性，較佳為具有CH2結構域及CH3結構域，於提高含Fc分子之結構自由度之觀點上，較佳為進一步包含鉸鏈部位的全部或一部分。所以，就該種之含Fc分子而言，可採用例如由IgG之CH2結構域、CH3結構域、及鉸鏈部位的一部分所組成的片段。於不採用鉸鏈部位作為含Fc分子與環狀肽之結合部位之情形，可適當地調整相當於鉸鏈部位的序列之長度而包含在含Fc分子中，但較佳為包含CPPC(相當於Eu索引中之第226～229位的胺基酸序列；例如序列識別號129之胺基酸編號128～131)。就本發明之含Fc分子中包含的鉸鏈部位而言，可舉出例如相當於Eu索引中之第221～230位、第222～230位、第223～230位、第224～230位、第225～230位、及第226～230位的鉸鏈部位之胺基酸序列。於人類IgG1中此等之序列，係各自為DKTHTCPPCP、KTHTCPPCP、THTCPPCP、HTCPPCP、TCPPCP、及CPPCP(各自為序列識別號129之胺基酸編號123～132、122～132、123～132、124～132、125～132、126～132、127～132、及128～132之序列)。包含此種鉸鏈部位的抗體片段之中，就源自人類IgG1者之例而言，可舉出由序列識別號129之第118位Glu～第349位Lys之胺基酸序列中自N末端起連續的1～10個胺基酸可缺失的胺基酸序列所組成的含Fc分子、或其胺基酸序列經修改而成的變異體，較佳為由序列識別號129之第123位Asp～第349位Lys、第124位Lys～第349位Lys、第125位Thr～第349位Lys、第126位His～第349位Lys、第127位Thr～第349位Lys、或第128位Cys～第349位Lys所組成的含Fc分子。又，就源自人類IgG1之抗體片段而言，可例示：由序列識別號135之胺基酸編號22～243之胺基酸序列、序列識別號137之胺基酸編號26～247之胺基酸序列(相當於Eu索引中之第234位的Leu殘基(Leu234)及相當於第235位的Leu殘基(Leu235)被Ala所取代)、或是序列識別號139之胺基酸編號26～247之胺基酸序列(相當於Eu索引中之第234位的Leu殘基(Leu234)及相當於第235位的Leu殘基(Leu235)被Ala所取代，且相當於第329位的Pro殘基(Pro329)被Ala所取代)、或於彼等之N末端有T、HT、THT、KTHT或者是DKTHT附加的胺基酸序列所組成的含Fc分子、或彼等之胺基酸序列經修改而成的變異體。較佳為：本發明之含Fc分子可為由序列識別號135之胺基酸編號21～243之胺基酸序列所組成的多肽(本說明書中，亦稱為Fc-B)、由序列識別號137之胺基酸編號25～247之胺基酸序列所組成的多肽、由序列識別號137之胺基酸編號21～247之胺基酸序列所組成的多肽(本說明書中，亦稱為Fc-A)、由序列識別號139之胺基酸編號25～247之胺基酸序列所組成的多肽、或由序列識別號139之胺基酸編號21～247之胺基酸序列所組成的多肽(本說明書中，亦稱為Fc-C)，或者是其變異體。此等之Fc片段中的Asn297，係在序列識別號135為第93位之Asn，在序列識別號137為第97位之Asn，在序列識別號139為第97位之Asn。此等之Fc片段中的Cys226，係在序列識別號135為第22位之Cys，在序列識別號137為第26位之Cys，在序列識別號139為第26位之Cys。此等之Fc片段中的Cys229，係在序列識別號135為第25位之Cys，在序列識別號137為第29位之Cys，在序列識別號139為第29位之Cys。
又，設計抗體片段或變異體作為本發明之含Fc分子之情形，在保持有助於與環狀肽之結合的Cys226、Cys229、或Asn297及其周邊的胺基酸，且同時無損作為載體蛋白的機能之範圍，可採用於1～數處(較佳為5處以下，更佳為3、2或1處)中使1～數個(每一修改處，較佳為20個以下，更佳為15個以下，進一步較佳為10個以下，進一步更佳為7、6、5、4、3、2或1個)胺基酸經取代、缺失、插入及/或附加而成的變異體。作為胺基酸序列的修改處之例，可於N末端及C末端中進行胺基酸之取代、缺失、插入及/或附加等。尤其是N末端的胺基酸，有於以生物工程之手法使含Fc分子產生之際會造成影響之情形，可修改為適於所期望之生產系之胺基酸序列。就該種之胺基酸序列的變異體而言，可舉出例如於人類IgG重鏈羧基末端中使1或2個胺基酸殘基缺失而成的變異體(例如，使羧基末端部位的按照Eu索引之相當於第447位的離胺酸殘基缺失而成的重鏈、或使該離胺酸殘基及按照Eu索引之相當於第446位的甘胺酸殘基缺失而成的重鏈)等。又，在Eu索引中，已知Leu234-Leu235、或Pro329的胺基酸為對於抗體與Fc受體之結合所致T細胞活化所造成的效應子活性表現產生影響之部位。有可藉由將此Leu234-Leu235取代為Ala(將所得之變異體稱為「LALA體」)或進一步將Pro329取代為Ala(將所得之變異體稱為「LALA-PA體」)，而使此效應子活性消失，且使副作用風險減輕之情形(關於LALA體，請參照美國專利公報US5885573)，可因應需要而施加此種修改。CLCH-B(由以下之重鏈恆定區與輕鏈恆定區所組成的抗體片段：由序列識別號133之胺基酸序列所組成的重鏈恆定區；由對應於其的序列識別號131之胺基酸序列所組成的輕鏈恆定區)，係CLCH-A(由以下之重鏈恆定區與輕鏈恆定區所組成的抗體片段：由序列識別號129之胺基酸序列所組成的重鏈恆定區；由對應於其的序列識別號131之胺基酸序列所組成的輕鏈恆定區)之LALA體，Fc-A為Fc-B之LALA體。已確認：LALA體係作為與肽之複合體中的載體分子而適切地發揮功用(WO 2018/003983)。所以，於一態樣中，本發明之含Fc分子可包含人類IgG重鏈中相當於按照Eu索引之第234位的白胺酸殘基及相當於第235位的白胺酸殘基之被丙胺酸殘基的取代，或可包含相當於第234位的白胺酸殘基、相當於第235位的白胺酸殘基、及相當於第329位的脯胺酸殘基之被丙胺酸殘基的取代。 又，本發明之含Fc分子亦可附加對胺基酸骨架之化學部分的鍵結、N-鍵結或O-鍵結碳水化合物鏈等化學修飾。或亦可以目的分子的表現、純化效率的提升作為目的，而附加訊息序列、肽酶辨識序列、如GST的Tag序列。
於一態樣中，本發明之含Fc分子可為由下述重鏈以及輕鏈之組合所組成的抗體，該重鏈係由選自由(a)～(d)所組成之群組的胺基酸序列組成，該輕鏈係由選自由(e)～(h)所組成之群組的胺基酸序列組成： (a)序列識別號125之胺基酸編號20～474之胺基酸序列、 (b)對於(a)之序列至少具有95%以上(例如96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上)之相同性的胺基酸序列、 (c)於(a)之序列中有1至10個(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、或10個)胺基酸缺失、取代或附加的胺基酸序列、及 (d)於(a)之序列中C末端之胺基酸殘基有1至3個(例如1個、2個、或3個)缺失的胺基酸序列； (e)序列識別號127之胺基酸編號21～234之胺基酸序列、 (f)對於(e)之序列至少具有95%以上(例如96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上)之相同性的胺基酸序列、 (g)於(e)之序列中有1至10個(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、或10個)胺基酸缺失、取代或附加的胺基酸序列、及 (h)於(e)之序列中C末端之胺基酸殘基有1至3個(例如1個、2個、或3個)缺失的胺基酸序列。
於一態樣中，本發明之含Fc分子可為由下述重鏈以及輕鏈之組合所組成的抗體，該重鏈係由選自由(a)～(d)所組成之群組的胺基酸序列組成，該輕鏈係由選自由(f)～(i)所組成之群組的胺基酸序列組成： (a)序列識別號129之胺基酸編號20～349之胺基酸序列、 (b)序列識別號133之胺基酸編號20～349之胺基酸序列、 (c)對於(a)或(b)之序列至少具有95%以上(例如96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上)之相同性的胺基酸序列、 (d)於(a)或(b)之序列中有1至10個(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、或10個)胺基酸缺失、取代或附加的胺基酸序列、及 (e)於(a)或(b)之序列中C末端之胺基酸殘基有1至3個(例如1個、2個、或3個)缺失的胺基酸序列； (f)序列識別號131之胺基酸編號21～234之胺基酸序列、 (g)對於(f)之序列至少具有95%以上(例如96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上)之相同性的胺基酸序列、 (h)於(f)之序列中有1至10個(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、或10個)胺基酸缺失、取代或附加的胺基酸序列、及 (i)於(f)之序列中C末端之胺基酸殘基有1至3個(例如1個、2個、或3個)缺失的胺基酸序列。
於一態樣中，本發明之含Fc分子可為由下述胺基酸序列所組成之CH，該胺基酸序列選自由(a)～(e)所組成之群組： (a)序列識別號129之胺基酸編號20～349之胺基酸序列、 (b)序列識別號133之胺基酸編號20～349之胺基酸序列、 (c)對於(a)或(b)之序列至少具有95%以上(例如96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上)之相同性的胺基酸序列、 (d)於(a)或(b)之序列中有1至10個(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、或10個)胺基酸缺失、取代或附加的胺基酸序列、及 (e)於(a)或(b)之序列中C末端之胺基酸殘基有1至3個(例如1個、2個、或3個)缺失的胺基酸序列。
於一態樣中，本發明之含Fc分子可為由下述胺基酸序列所組成之Fc片段，該胺基酸序列選自由(a)～(f)所組成之群組： (a)序列識別號135之胺基酸編號21～243之胺基酸序列、 (b)序列識別號137之胺基酸編號21～247之胺基酸序列、 (c)序列識別號139之胺基酸編號21～247之胺基酸序列、 (d)對於(a)至(c)之序列至少具有95%以上(例如96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上)之相同性的胺基酸序列、 (e)於(a)至(c)之序列中有1至10個(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、或10個)胺基酸缺失、取代或附加的胺基酸序列、及 (f)於(a)至(c)之序列中C末端之胺基酸殘基有1至3個(例如1個、2個、或3個)缺失的胺基酸序列。
(1)透過N297結合糖鏈而與環狀肽結合的含Fc分子 於一態樣中，本發明之複合體可為透過含Fc分子之N297結合糖鏈而與環狀肽結合而成的化合物。本發明所使用的含Fc分子，於使用動物細胞而產生之情形，可在其過程受到轉譯後修飾，而在Asn297有不均勻糖鏈附加。於較佳態樣中，含Fc分子可為N297結合糖鏈被重塑成由以下任一者之結構所組成的SG型糖鏈者(SG型N297結合糖鏈)。 (式中，(C)表示連結基C與鍵結於唾液酸之第2位的羰基鍵結，(Asn297)表示與含Fc分子的Asn297之側鏈的N醣苷鍵。)
於較佳態樣中，含Fc分子之N297結合糖鏈可為選自N297-(Fuc)SG、N297-(Fuc)MSG1及N297-(Fuc)MSG2的至少1個。更佳為含Fc分子之N297結合糖鏈包含N297-(Fuc)SG，進一步更佳為含Fc分子之N297結合糖鏈可為N297-(Fuc)SG。
通常，於從動物細胞產生時，糖鏈附加在構成二聚體之兩方的單體之Asn297，以每個二聚體的含Fc分子具有2個N297結合糖鏈的通常體產生。但是，依產生條件或含Fc分子之結構，而有以一定之比例產生僅於一方的單體有N297結合糖鏈附加之糖鏈缺失體(每個二聚體的含Fc分子具有1個N297結合糖鏈的分子)的情形。該種之含糖鏈缺失體的含Fc分子亦可用於本發明。
於本發明之複合體中N297結合糖鏈為N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)MSG2之情形，含Fc分子為二聚體，通常於兩方的單體具有N297結合糖鏈，因此複合體係成為2個連接子結構及環狀肽結合而成的分子(2價複合體)(含Fc分子為糖鏈缺失體之情形，僅於一方的單體有N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)MSG2附加，成為1價複合體)。在另一方面，N297結合糖鏈為N297-(Fuc)SG之情形，含Fc分子為二聚體，因此複合體係成為4個連接子結構及環狀肽結合而成的分子(4價複合體)(含Fc分子為糖鏈缺失體之情形，僅於一方的單體有N297-(Fuc)SG附加，成為2價複合體)。本發明之複合體可為通常體與糖鏈缺失體之混合物(於本發明中，方便起見，此種混合物被標記為通常體的複合物)。 又，本發明之複合體可為具有複數種類之N297結合糖鏈的分子之混合物，亦可為具有由任意一個結構所組成之N297結合糖鏈的分子。於較佳態樣中，本發明之複合體為具有由任意一個結構所組成之SG型N297結合糖鏈的分子，更佳為具有N297-(Fuc)SG作為N297結合糖鏈，且可為4個環狀肽結合而成的4價複合體(在糖鏈缺失體為2價複合體)。 又，本發明之複合體1分子中包含複數個環狀肽之情形，彼等可為單一之(1種類的)環狀肽，亦可為複數種類的環狀肽之組合。本發明之複合體較佳為包含單一之環狀肽，更佳為包含單一之二環性肽。
又，於複合體的合成反應中，會有SG型N297結合糖鏈的唾液酸以未反應之狀態殘留之情形。於本發明之複合體中，只要於1個含Fc分子有至少1個環狀肽結合，則可於上述糖鏈中包含未反應的唾液酸。可為例如，構成二聚體之一方的含Fc分子中之N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)MSG2的唾液酸以未反應之狀態殘留，成為1個環狀肽結合而成的複合體(1價複合體)之情形。本發明之複合體可為該種之1價複合體，亦可為1價複合體與2價複合體之混合物。又，可為例如，構成二聚體之一方的含Fc分子中之N297-(Fuc)SG(二唾液酸體(disialo body))的一方或兩方的唾液酸以未反應之狀態殘留，成為1～3個環狀肽結合而成的複合體(1～3價複合體)之情形。本發明之複合體可為1～4價的任意之複合體，亦可為彼等之混合物。
SG型N297結合糖鏈之結構中，還原末端之附加有岩藻醣的GlcNAc(Fucα1,6)GlcNAc，係源自動物細胞所產生的含Fc分子，且較其非還原末端側的糖鏈可為被重塑成與SG同樣之糖鏈結構者。
具有此種SG型N297結合糖鏈的含Fc分子，例如可基於WO2013/120066、WO2018/003983等中記載之方法來製造。基於公知方法，使用動物細胞而使含Fc分子作為基因重組蛋白質產生之情形，N297結合糖鏈係具有附加有岩藻醣之N鍵結型糖鏈結構作為基本結構，但可得到具有由非還原末端之結構或對構成糖進行各樣修飾而成的各種結構所組成之糖鏈的抗體或其片段的混合物。如此地以動物細胞所產生的含Fc分子，係藉由以EndoS等水解酵素進行處理，而還原末端之幾丁二糖結構的GlcNAcβ1-4GlcNAc之間的醣苷鍵被水解，可得到具有作為N297結合糖鏈僅具有(Fucα1,6)GlcNAc的單一之糖鏈結構的含Fc分子(稱為「(Fucα1,6)GlcNAc-含Fc分子」。)。
就此種用於N297結合糖鏈的水解反應之酵素而言，可使用EndoS或保持其水解活性之變異酵素等。可藉由將藉由上述水解反應所得到的(Fucα1,6)GlcNAc-含Fc分子作為糖鏈受體分子，使用如EndoS D233Q變異體的糖轉移酵素使SG型糖鏈供體分子與其反應，而得到具有由上述結構所組成之SG型N297結合糖鏈的含Fc分子。
目的物為具有4價環狀肽的複合體之情形，此糖轉移反應中，可使用具有SG(10)(於SG的糖鏈部分中還原末端的GlcNAc缺失一個之糖鏈)作為糖鏈的糖鏈供體分子。此種SG(10)糖鏈，係例如可使用藉由水解等而自雞卵之卵黃中包含的唾液酸醣肽(以下稱「SGP」)所取得者，可僅使用如市售之二唾液酸八糖(Disialyloctasaccharide)(東京化成工業(股))的SG(10)糖鏈。 目的物為具有2價環狀肽的複合體之情形，可使用具有MSG1(9)(SG(10)之β-Man的支鏈之1-6糖鏈的非還原末端的唾液酸缺失，僅於1-3糖鏈具有唾液酸者)或MSG2(9)(SG(10)之β-Man的支鏈之1-3糖鏈的非還原末端的唾液酸缺失，僅於1-6糖鏈具有唾液酸者)作為糖鏈的糖鏈供體分子。此種糖鏈可以市售之單唾液酸-Asn游離型(monosialo-Asn free)(1S2G/1G2S-10NC-Asn，糖鏈工學研究所(股))為原料，且基於WO2018/003983中記載之方法來分離而採用，亦可不進行分離而以混合物採用。
供體分子中包含的SG型糖鏈之還原末端的GlcNAc，較佳為使用例如以如2-氯-1,3-二甲基-1H-苯并咪唑-3-鎓氯化物處理引起的唑啉化之形式所活化者，但同時使用後述之2種類的酵素之情形沒有活化之需要。
糖鏈供體分子可於非還原末端具有用以形成連接子結構與含Fc分子之鍵結的官能基(例如疊氮基)。例如，糖鏈供體分子中包含的SG型糖鏈可於其非還原末端之唾液酸中包含的羧酸，具有用以形成連接子結構與含Fc分子之鍵結的官能基(例如疊氮基)。
就用於此種糖轉移反應之酵素而言，只要為具有使複合型糖鏈轉移至N297結合糖鏈之活性者，則可採用各式各樣之物，但較佳者為EndoS D233Q，其藉由將EndoS之第233號的Asp取代為Gln而抑制了水解反應的變異體。關於使用EndoS D233Q的糖轉移反應，係記載於WO2013/120066等中。又，亦可利用如對於EndoS D233Q進一步施加了變異而成的EndoS D233Q/Q303L、EndoS D233Q/E350A、EndoS D233Q/E350Q、EndoS D233Q/E350D、EndoS D233Q/E350N、EndoS D233Q/D405A等之變異體酵素。使用了此種EndoS D233Q之變異體的糖轉移反應，係記載於WO2017/010559中。
含Fc分子之糖鏈重塑(糖水解、及糖轉移反應)後的含Fc分子或其中間體之純化操作，係通常以與反應中使用的低分子化合物及酵素的分離為目的而進行。於此種純化，係通常使用凝膠過濾層析法、離子交換層析法、親和性層析法等。亦可進一步進行利用羥磷石灰管柱的純化，尤其從糖轉移反應中之效率提升的觀點來看，較佳為在糖水解後的中間體之純化操作中使用(參照WO2018/003983)。
通常的糖轉移反應有糖鏈供體的還原末端被活化的需要，此種活性型供體的製備需要時間和成本。可藉由同時使用2種類的酵素，而使還原末端未活化的SGP或(SG-)Asn(於Asn之側鏈有SG連結而成的結構)等作為直接糖鏈供體，而糖轉移至含Fc分子之N297結合糖鏈(參照WO2018/003983)。藉此，而從天然所取得、或可將市售的醣肽等使用於直接糖轉移反應，而能夠進行有效率的糖鏈重塑。 所使用之2種類的Endo酵素，係以適切地組合廣泛地以複合型糖鏈為基質之酵素A(類EndoM酵素)與以含Fc分子之N297結合糖鏈為基質之酵素B(類EndoS酵素)為重要的。 就酵素A而言，可例示EndoM、EndoOm、EndoCC、與其水解活性經降低的EndoM變異體、EndoOm變異體、EndoCC變異體等。作為酵素A，較佳者為EndoM N175Q、EndoCC N180H、EndoOm N194Q。 就酵素B而言，可例示EndoS、EndoS2(EndoS49)及彼等之水解活性經降低的EndoS變異體、EndoS2(EndoS49)變異體等。作為酵素B，較佳者為EndoS D233Q 、EndoS D233Q/Q303L、EndoS D233Q/E350A、EndoS D233Q/E350Q、EndoS D233Q/E350D、EndoS D233Q/E350N、EndoS D233Q/D405A等。 糖鏈供體之結構，若為具有所採用之酵素A可辨識的糖鏈結構者，則不特別限定，可使用從天然所取得者、能夠以化學反應或者是酵素反應之組合合成的分子等各式各樣之物。變旋異構部位之取代基R，於R=H以外，可使用任意之物。N鍵結型糖鏈結構之情形(參照下式。變旋異構部位之取代基R為下述結構式之還原末端的R)，可例示醯胺結構或疊氮。 O鍵結型糖鏈結構之情形(參照下式。變旋異構部位之取代基R為下述結構式之還原末端的R)，可例示乙二醇結構或乙醇酸結構，或者是作為變旋異構氫氧基的保護基所使用的苄基、烯丙基、對硝苯基等。 又，關於糖鏈供體的非還原末端之結構，若為酵素A可辨識者則不特別限定，亦可使用天然之糖鏈結構、使非還原末端糖鏈由天然之糖鏈結構缺失而成者、將任意之氫氧基進行磷酸修飾而成者、連接子結構化學性地結合而成者等各式各樣之物。就較佳的糖鏈供體而言，可舉出SGP、(SG-)Asn、([N 3-PEG(3)] 2-SG)-Asn-PEG(3)-N 3等。
就受體分子而言，若為具有N297結合糖鏈的含Fc分子，則無特別限制，可適當地選擇而使用mAb、CLCH、Fc片段等各種形式者。糖轉移反應中的反應溫度，可因應所使用之酵素的最適溫度而適當地選擇，但通常為15～50℃，較佳為25～40℃。在使用2種類的酵素之方法，若於一方的酵素之最適溫度下另一方的酵素卻失活了，則會有轉移反應無法適切地進行之情形。因此，較佳為選擇最適反應溫度等條件相近的酵素之組合。
(2)透過硫醇基而與環狀肽結合的含Fc分子 於一態樣態樣中，本發明之複合體可為透過含Fc分子之硫醇基而與環狀肽結合而成的化合物。具有硫醇基的含Fc分子可利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者周知的方法得到(Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp.56-136, pp.456-493, Academic Press(1996))。可舉出例如下述等方法，但並不限定於此等：使Traut’s試藥對含Fc分子的胺基作用；使N-琥珀醯亞胺基S-乙醯硫基烷酸酯類對含Fc分子的胺基作用之後，使羥胺作用；使N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯作用之後，使還原劑作用；使二硫蘇糖醇、2-巰基乙醇、三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)等還原劑對含Fc分子作用而將含Fc分子內鉸鏈部的雙硫鍵結還原，使硫醇基生成。於較佳態樣中，含Fc分子之硫醇基，可為將含Fc分子內鉸鏈部之雙硫鍵結還原所生成的硫醇基。 作為一例，可藉由以TCEP作為還原劑，對於每一個含Fc分子內鉸鏈部雙硫使用0.3至3莫耳當量，使其在含螯合劑的緩衝液中與含Fc分子反應，而得到含Fc分子內鉸鏈部雙硫被部分或是完全地還原的含Fc分子。就螯合劑而言，可舉出例如乙二胺四乙酸(EDTA)或二乙三胺五乙酸(DTPA)等。可以1mM至20mM的濃度使用此等。就緩衝液而言，可使用磷酸鈉或硼酸鈉、乙酸鈉溶液等。於具體之例中，含Fc分子可藉由使其在4℃至37℃與TCEP反應1至4小時而得到具有部分或是完全地被還原之硫醇基的含Fc分子。所得之含Fc分子可藉由各種層析法、超過濾等而適當地純化。尤其是從防止環狀肽內之雙硫鍵結的還原之觀點來看，較佳為為了去除還原劑，而以超過濾等來純化含Fc分子。 可藉由進行使硫醇基附加於環狀肽-連接子部分的反應(例如與馬來醯亞胺基之麥可加成(Michael addition)反應等)，而使環狀肽-連接子部分藉由硫醚鍵結而結合。
2.環狀肽 本發明之複合體中之環狀肽，係上述I中所記載之本發明之環狀肽I、或下式(X) 所表示之環狀肽(以下稱為本發明之環狀肽II)。於本發明之環狀肽II中，Z aa1～Z aa12之胺基酸，或Z aa1不存在的情形下Z aa2～Z aa12之胺基酸，係藉由醯胺鍵結連結而形成寡肽鏈，N末端胺基酸(Z aa1或Z aa2)與C末端胺基酸(Z aa12)透過環形成基B連結而形成環狀結構。
於式(X)中，B選自包含胺基酸結構之下述環形成基B 1～B 6： B 1、 B 2、 B 3、 B 4、 B 5、及 B 6。
於B中，末端所記載之 表示對Z aa1的N末端胺基之鍵結點，或於Z aa1不存在的情形表示對Z aa2的N末端胺基之鍵結點， 表示對Z aa12的C末端羰基之鍵結點， 表示對Z aa1的α碳之鍵結點，或於Z aa1不存在的情形表示對Z aa2的α碳之鍵結點。上述環形成基中包含的胺基酸結構之非對稱點可為R型亦可為S型。
於一態樣中，B為 (以下稱為B 1)。於環形成基B 1中，bn為0～3的整數(例如0、1、2、或3)，R 101及R 102各自獨立地為氫原子或C 1-3烷基，R 110為胺基或羥基。C 1-3烷基較佳為甲基。
就B 1之較佳態樣而言，可舉出R 101及R 102各自為氫原子，R 110為胺基，且bn為0之環形成基(以下稱為B 1a)。 B 1a係例如可藉由使醯胺鍵結於Z aa12之C末端側的Cys(但是羧基轉變成醯胺基)之-SH、與鍵結於Z aa1或Z aa2之N末端胺基的-COCH 2X(X為Cl等脫離基)反應而得到。此情形，Cys可為L-胺基酸或D-胺基酸。尤其，將B 1a中醯胺鍵結於Z aa12之C末端側的Cys(但是羧基轉變成醯胺基)為L-胺基酸之情形的環形成基，稱為B 1a1。
就B 1之較佳的其他態樣而言，可舉出R 101及R 102各自為氫原子，R 110為胺基，bn為1之環形成基(以下稱為B 1b)。 B 1b係例如可藉由使醯胺鍵結於Z aa12之C末端側的HCY(但是羧基轉變成醯胺基)之-SH、與鍵結於Z aa1或Z aa2之N末端胺基的-COCH 2X(X為Cl等脫離基)反應而得到。此情形，HCY可為L-胺基酸或D-胺基酸。尤其，將B 1b中醯胺鍵結於Z aa12之C末端側的HCY(但是羧基轉變成醯胺基)為L-胺基酸之情形的環形成基，稱為B 1b1。
就B 1之較佳的其他態樣而言，可舉出R 101及R 102各自為甲基，R 110為胺基，且bn為0之環形成基(以下稱為B 1c)。 B 1c係例如可藉由使醯胺鍵結於Z aa12之C末端側的Pen(但是羧基轉變成醯胺基)之-SH、與鍵結於Z aa1或Z aa2之N末端胺基的-COCH 2X(X為Cl等脫離基)反應而得到。此情形，Pen可為L-胺基酸或D-胺基酸。尤其，將B 1c中醯胺鍵結於Z aa12之C末端側的Pen(但是羧基轉變成醯胺基)為L-胺基酸之情形的環形成基，稱為B 1c1。
於其他態樣中，環形成基B為 (以下稱為B 2)。於B 2中，bn為0～3的整數(例如0、1、2、或3)，R 101及R 102各自獨立地為氫原子或C 1-3烷基，R 110為胺基或羥基。
就B 2之較佳態樣而言，可舉出R 101及R 102各自為氫原子，R 110為胺基，且bn為0之環形成基(以下稱為B 2a)。B 2a係例如可藉由使上述B 1a之硫醚基氧化成亞碸而得到。尤其，將使B 1a1之硫醚基氧化成為亞碸之情形的環形成基，稱為B 2a1。
於其他態樣中，B為 (以下稱為B 3)。於B 3中，bn為0～3的整數(例如0、1、2、或3)，R 101及R 102各自獨立地為氫原子或C 1-3烷基，R 110為胺基或羥基。
就B 3之較佳態樣而言，可舉出R 101及R 102各自為氫原子，R 110為胺基，且bn為0之環形成基(以下稱為B 3a)。B 3a係例如可藉由使上述B 1a之硫醚基氧化成碸而得到。尤其，將使B 1a1之硫醚基氧化成為碸之情形的環形成基，稱為B 3a1。
於其他態樣中，B為 (以下稱為B 4)。於B 4中，bi及bj各自獨立地為1～3的整數(例如1、2、或3)，R 110為胺基或羥基。
B為B 4之情形，Z aa1或Z aa2為 [式中，R 9為式-(CH 2) tSH(式中，t為1～3的整數(例如1、2、或3))所表示之基]所表示之胺基酸的殘基。
於B 4之較佳態樣中，bi及bj各自為1，R 110為胺基(以下稱為B 4a)。B 4a係例如可藉由使醯胺鍵結於Z aa12之C末端側的Cys(但是羧基轉變成醯胺基)之-SH、與Z aa1或Z aa2之-SH反應而得到。此情形，Cys可為L-胺基酸或D-胺基酸。尤其，將醯胺鍵結於Z aa12之C末端側的Cys(但是羧基轉變成醯胺基)為L-胺基酸之B 4a，稱為B 4a1。
於其他態樣中，B為 (以下稱為B 5)。於B 5中，bk及bl各自獨立地為0～3的整數(例如0、1、2、或3)，R 110為胺基或羥基。環形成基B 5係例如可藉由醯胺鍵結於Z aa12之C末端側的於側鏈具有-(CH 2) blCH=CH 2的胺基酸(羧基亦可轉變成醯胺基)、與鍵結於Z aa1或Z aa2之N末端胺基的-CO(CH 2) bkCH=CH 2之烯烴複分解而得到。此情形，醯胺鍵結於Z aa12之C末端側的胺基酸可為L-胺基酸及D-胺基酸之任一者。
於其他態樣中，B為 (以下稱為B 6)。於B 6中，bm為1～7的整數(例如1、2、3、4、5、6、或7)，R 110為胺基或羥基。B 6係例如可藉由使B 5之C-C雙鍵還原而得到。
於式(X)中，Z aa1為脂肪族胺基酸、芳香族胺基酸、鹼性胺基酸、中性胺基酸、或酸性胺基酸的殘基，或者是不存在。於較佳態樣中，Z aa1為Arg、Lys、His、Gly、Ala、Asn、Thr、Ser、Met、Leu、Ile、Val、Gln、Phe、Tyr、Trp、或Cys的殘基，或者是不存在，更佳為不存在。
於式(X)中，Z aa2為芳香族胺基酸或中性胺基酸的殘基。於較佳態樣中，Z aa2為芳香族胺基酸的殘基，更佳為Phe、Tyr、Trp、2Nal、4CF、或DCF的殘基，進一步較佳為2Nal殘基。
於式(X)中，Z aa3為脂肪族胺基酸、芳香族胺基酸、或鹼性胺基酸的殘基。於較佳態樣中，Z aa3為Ile、Leu、Nle、Tle、Trp、2Nal、4CF、或Arg的殘基，更佳為Arg或Tle的殘基。
於式(X)中，Z aa4為Ser、Thr、Ala、或 mS的殘基。於較佳態樣中，Z aa4為Ser殘基。
於式(X)中，Z aa5為Gly或Ser的殘基。於較佳態樣中，Z aa5為Gly殘基。
於式(X)中，Z aa6為鹼性胺基酸或中性胺基酸的殘基。於較佳態樣中，Z aa6為Arg、Lys、His、Ser、Cit、或AGB的殘基，更佳為Arg或AGB的殘基。
於式(X)中，Z aa7為中性胺基酸或酸性胺基酸的殘基。於較佳態樣中，Z aa7為Asn或Asp的殘基。
於式(X)中，Z aa8為芳香族胺基酸的殘基。於較佳態樣中，Z aa8為Trp或2Nal的殘基，更佳為Trp殘基。
於式(X)中，Z aa9為脂肪族胺基酸、中性胺基酸、或芳香族胺基酸的殘基。於較佳態樣中，Z aa9為Val、Nle、Ahp、或Met的殘基，更佳為Val或Nle的殘基。
於式(X)中，Z aa10為鹼性胺基酸、脂肪族胺基酸、芳香族胺基酸、或中性胺基酸的殘基。於較佳態樣中，Z aa10為Arg、AGB、Lys、His、AMF、Phg、或Val的殘基，更佳為Arg、AGB、或Val的殘基。
於式(X)中，Z aa11為芳香族胺基酸殘基。於較佳態樣中，Z aa11為Trp或2Nal的殘基，更佳為Trp殘基。
於式(X)中，Z aa12為脂肪族胺基酸、芳香族胺基酸、或鹼性胺基酸的殘基。於較佳態樣中，Z aa12為Val、Tle、CPTG、CHXG、或Phe的殘基，更佳為Val、CPTG、或CHXG的殘基。
就本發明之環狀肽II的較佳態樣而言，可舉出以下之環狀肽，其係於式(X)中， B為環形成基B 1a、B 1b、或B 1c； Z aa1為Arg、Lys、His、Gly、Ala、Asn、Thr、Ser、Met、Leu、Ile、Val、Gln、Phe、Tyr、Trp、或Cys的殘基，或者是不存在； Z aa2為Phe、Tyr、Trp、2Nal、4CF、或DCF的殘基； Z aa3為Ile、Leu、Nle、Tle、Trp、2Nal、4CF、或Arg的殘基； Z aa4為Ser殘基； Z aa5為Gly殘基； Z aa6為Arg、Lys、His、Ser、Cit、或AGB的殘基； Z aa7為Asn或Asp的殘基； Z aa8為Trp或2Nal的殘基； Z aa9為Val、Nle、Ahp、或Met的殘基； Z aa10為Arg、AGB、Lys、His、AMF、Phg、或Val的殘基； Z aa11為Trp或2Nal的殘基；且 Z aa12為Val、Tle、CPTG、CHXG、或Phe的殘基。
就本發明之環狀肽II的更佳態樣而言，可舉出以下之環狀肽，其係於式(X)中， B為環形成基B 1a； Z aa1不存在； Z aa2為2Nal殘基； Z aa3為Arg或Tle的殘基； Z aa4為Ser殘基； Z aa5為Gly殘基； Z aa6為Arg或AGB的殘基； Z aa7為Asn或Asp的殘基； Z aa8為Trp殘基； Z aa9為Val或Nle的殘基； Z aa10為Arg、AGB、或Val的殘基； Z aa11為Trp殘基；且 Z aa12為Val、CPTG、或CHXG的殘基。
就本發明之環狀肽II的更較佳態樣而言，可舉出選自由以下所表示之化合物所組成之群組的環狀肽： 、及 。 此處所示之寡肽，係後述之實施例的複合物-13～複合物-63、複合物-67～複合物-71、複合物-73、複合物-75～複合物-79、複合物-83～複合物-86、複合物-88～複合物-95、及複合物-97中之環狀肽，環形成基B皆為B 1a1。
本發明之環狀肽II可與本發明之環狀肽I同樣地利用化學合成、無細胞轉譯系統等該技術領域中已知的方法來製造(參照WO 2018/052002)。
於較佳態樣中，本發明之複合體中之環狀肽可為本發明之環狀肽I。
3.連接子結構 於本發明之複合體中，環狀肽會透過構成其的胺基酸殘基之側鏈或環形成基之A的R 10或環形成基B的R 110所鍵結之羰基而與載體分子連結。於一態樣中，環狀肽會透過環形成基A的R 10或環形成基B的R 110所鍵結之羰基而與載體分子連結。於一態樣中，本發明之複合體可為前述環狀肽與前述載體分子透過連接子結構連結而成的化合物。環狀肽與連接子結構或載體分子之結合，可依照慣用方法來進行。
若本發明之複合體可發揮TSP-1抑制效果，則連接子結構可為任意之結構。於較佳態樣中，連接子結構可包含選自由聚氧伸烷基鏈、胺基酸殘基、及由2以上之胺基酸殘基所組成的寡肽鏈所組成之群組的至少1個結構。 再者，本說明書中，有將連接子結構之來源的分子稱為「連接子分子」之情形。 又，所謂連接子結構之「主鏈」，係指環狀肽與載體分子的連結所必須要的直鏈狀之部分，所謂連接子結構之「側鏈」，係指由主鏈分支之部分。關於構成連接子結構之各個胺基酸殘基，亦將環狀肽與載體分子的連結所必須要的結合之部分稱為「主鏈」，將由主鏈分支之部分稱為側鏈。例如，一般在胺基酸殘基中，係將鍵結於α碳之基且為直接鍵結於α碳的胺基、羧基、及氫以外之基稱為側鏈(但是，於甘胺酸殘基中，氫成為側鏈)，但有該種側鏈之部分成為本發明之連接子結構之「主鏈」之情形(例如，連接子結構中包含KPEG之情形，KPEG的ε胺基成為「主鏈」，α胺基及鍵結於其的PEG鏈成為「側鏈」)。
就連接子結構中包含的聚氧伸烷基鏈而言，若為藥學上可容許者則不特別限定，可舉出例如聚甲二醇、聚乙二醇鏈、聚丙二醇鏈、聚丁二醇鏈、聚戊二醇鏈、聚己二醇鏈、乙二醇基與丙二醇基經嵌段或無規鍵結而成的聚氧伸烷基鏈等。於較佳態樣中，聚氧伸烷基鏈可為聚乙二醇(PEG)鏈。 此處，連接子結構之主鏈(即環狀肽與載體分子的連結所必須要的直鏈狀之部分)中包含的聚氧伸烷基鏈，可使用來調節環狀肽與載體分子之間的距離。此種連接子結構之主鏈中包含的聚氧伸烷基鏈，可作為P6P、P12P、P24P、P36P等包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸的一部分，而包含在連接子結構中。 連接子結構之主鏈中包含的各聚氧伸烷基鏈之聚合度並不特別限定，但可為2～50、6～50、6～30、或6～12，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24或36，較佳為可為6、12、24、或36，更佳為可為6、12、或24。又，連接子結構之主鏈中包含的聚氧伸烷基鏈之總聚合度(亦即，1個連接子結構之主鏈中僅包含1個聚氧伸烷基鏈之情形時為其聚合度，包含複數個聚氧伸烷基鏈之情形時為彼等全部的總聚合度)可為6～100，更佳為可為6～50，例如6、12、18、24、30、36、42、48、或50。於較佳態樣中，連接子結構之主鏈中包含的聚氧伸烷基鏈為PEG鏈，總聚合度可為6～100，更佳為可為6～50，例如6、12、18、24、30、36、42、48、或50。
連接子結構中包含的胺基酸殘基，可為天然胺基酸的殘基及非天然胺基酸的殘基之任一者，可為右式及左式之任一者。於較佳態樣中，連接子結構中包含的胺基酸殘基可為Gly、N-甲基甘胺酸(NMeG)、Asp、D-Asp(d)、Glu、D-Glu、Lys、D-Lys、β-丙胺酸(bAla)、Ser、D-Ser、側鏈中包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸(亦即，在連接子結構中成為側鏈之部分包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸；例如KPEG)、或側鏈中包含SG鏈等糖鏈之非天然胺基酸(亦即，在連接子結構中成為側鏈之部分包含糖鏈之非天然胺基酸；例如KSG)的殘基。
構成連接子結構中包含的寡肽鏈之胺基酸殘基，可為天然胺基酸的殘基及非天然胺基酸的殘基之任一者，可為右式及左式之任一者。寡肽鏈並不特別限定，但可由2～20個胺基酸殘基，例如由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸殘基所組成。於較佳態樣中，連接子結構中包含的寡肽鏈可包含選自由Gly、N-甲基甘胺酸(NMeG)、Asp、D-Asp、Glu、D-Glu、Lys、D-Lys、β-丙胺酸(bAla)、Ser、D-Ser、側鏈中包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸(亦即，在連接子結構中成為側鏈之部分包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸；例如KPEG)、及側鏈中包含SG鏈等糖鏈之非天然胺基酸(亦即，在連接子結構中成為側鏈之部分包含糖鏈之非天然胺基酸；例如KSG)所組成之群組的1以上之胺基酸殘基。
連接子結構可在環形成基A的R 10或環形成基B的R 110所鍵結之羰基與環狀肽結合。連接子分子與環狀肽之結合，可應用有機合成化學領域中公知的各種方法，並不特別限定。連接子結構中包含胺基酸殘基或寡肽鏈之情形，較佳為：胺基酸殘基或寡肽鏈之N末端胺基係與環形成基A的R 10或環形成基B的R 110所鍵結之羰基形成醯胺鍵結，R 10或R 110被該N末端胺基的NH取代。
於連接子結構與載體分子之結合，可應用有機合成化學領域中公知的各種方法，並不特別限定。可參考一般被應用在抗體-藥物複合物合成的結合法(Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2198-2215)。例如，作為利用疊氮基與乙炔基的Husgen反應之環形成法，可例示形成1,2,3-三唑環的加成環化反應[Cu(I)催化之疊氮化物炔烴環加成(Cu(I) Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition；CuAAC)]、藉由疊氮基與二苄基環辛烯(DBCO)之反應而形成1,2,3-三唑環的加成環化反應[環張力促進之疊氮化物炔烴環加成(Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition；SPAAC)]，在此處亦可利用其他同樣地具有扭曲的環辛炔結構的化合物、雙環[6.1.0]壬-4-烯(BCN)(Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,9422-9425)或於中員環(medium ring)結構上包含雜原子的環炔(Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,1190-1194)等。作為其他的環形成反應，可例示1,2,4,5-四環與扭曲的烯類之狄耳士-阿德爾(Diels-Alder)加成環化反應(Curr.Opin.Chem.Biol.,2014,21,89-95)。又，作為與醛基之皮克特-施彭格勒(Pictet-Spengler)反應型的環化縮合，可例示肼基-皮克特-施彭格勒接合(Bioconjugate Chem. 2013, 24,846-851.)或基於氧胺的(Oxyamine-based)皮克特-施彭格勒接合(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 46-51)。此外，可例示：利用胺基與羧基的醯胺鍵結、硫醇基對馬來醯亞胺基的麥可加成、硫醇基與甲基磺醯基苯基二唑基之反應(Angew. Chem., Int. Ed. 2013, 52, 12592-6.)、硫醇基與碘乙醯基之鍵結、硫醇基與經活化的雙硫之交叉雙硫形成、醛基與醯肼之腙縮合、醛基與胺氧基之肟縮合等。可適當地選擇具有符合此等之結合樣式的官能基者作為本發明中所採用的連接子分子，而用於連接子結構的形成。
於此種鍵結反應中，按照結合樣式，有形成立體異構物、光學異構物、幾何異構物等之情形。此等之異構物可利用公知方法分離而使用，亦可作為混合物使用。由於最終的複合體為巨大分子，因此認為此等部分結構的異構物之結構的差異幾乎不會影響複合體。
於較佳態樣中，連接子結構包含與載體分子結合之連結基C，更佳為連結基C可包含藉由馬來醯亞胺基與硫醇基之反應所形成之硫醚鍵結中的源自馬來醯亞胺基之部分或1,2,3-三唑環。
連結基C包含源自馬來醯亞胺基之部分之情形，較佳為馬來醯亞胺基與載體分子的半胱胺酸殘基之硫醇基藉由馬來醯亞胺縮合而結合，形成硫醚鍵結。此情形，硫醇基較佳為將含Fc分子內鉸鏈部之雙硫鍵結還原所生成的硫醇基。
連結基C包含1,2,3-三唑環之情形，1,2,3-三唑環較佳為與鍵結於含Fc分子的相當於依照Eu索引之第297位的天門冬醯胺酸殘基之糖鏈(N297結合糖鏈)結合。該種之連接子結構可為例如具有以被導入含Fc分子之N297結合糖鏈的疊氮基與結合在連接子分子的DBCO基的點擊反應(Click reaction)所形成之1,2,3-三唑環的結構。以此結構，可形成含Fc分子與三唑環之第1位或第3位結合而成的幾何異構物。含Fc分子每1分子在2～4個疊氮基發生反應之情形，幾何異性結構可於複合體1分子中混合存在。
於較佳態樣中，連結基C可以下式的任一者表示： C 1、 C 2、及 C 3(式中， N297GLY表示與含Fc分子之N297結合糖鏈的非還原末端鍵結， Cys表示與載體分子的半胱胺酸殘基之硫醇基鍵結， Y表示與鄰接的胺基酸殘基之鍵結點)。
於一態樣中，連接子結構可以下式(XX)表示： -L1-L2-L3-C- [式中， L1為包含直鏈狀地鍵結之3～6個中性胺基酸殘基的寡肽； L2為L2a或L2b， L2a為在主鏈包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸殘基，或為包含在主鏈包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸殘基的寡肽，且L2a之主鏈中包含的聚氧伸烷基鏈之總聚合度為6～100的寡肽， L2b為包含直鏈狀地鍵結之10～20個(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個)天然或非天然之α胺基酸殘基的寡肽； L3為下式所表示之胺基酸殘基 (式中，R 201為羥基或胺基， 表示與L2中之鄰接的胺基酸殘基之鍵結點， 表示與連結基C之鍵結點)； C為連結基C； L1之N末端胺基係與環形成基A的R 10或環形成基B的R 110所鍵結之羰基形成醯胺鍵結，R 10或R 110被該N末端胺基的NH取代； L1與L2以醯胺鍵結連結；且 L2與L3以醯胺鍵結連結]。 存在於L1與L2之間的胺基酸殘基可決定為存在於鄰接的L1或L2之任一者，但於以連接子結構整體來看與上述式(XX)之連接子結構一致之情形，該連接子結構包含在上述式(XX)中。
關於連接子結構，所謂胺基酸殘基「直鏈狀地鍵結」，係意指該胺基酸殘基以構成環狀肽與載體分子的連結所必須要的部分之方式連結。中性胺基酸殘基並不一定需要連續。
於較佳態樣中，L1中包含的中性胺基酸殘基可為選自由Gly、Ser、D-Ser、N-甲基甘胺酸(NMeG)、及β-丙胺酸(bAla)所組成之群組的1個以上之胺基酸的殘基。L1可為由3～6個(例如3、4、5、或6個)胺基酸殘基所組成的寡肽，較佳為由4或5個胺基酸殘基所組成的寡肽，更佳為由4個胺基酸殘基所組成的寡肽。
於較佳態樣中，L2a之主鏈中包含的聚氧伸烷基鏈可為PEG鏈。此情形，在主鏈包含PEG鏈之非天然胺基酸殘基可為下式所表示之胺基酸的殘基： [式中，n表示5～40的整數(例如5、11、23、35等)。]。L2a之主鏈中包含的PEG鏈之總聚合度例如為5～100，較佳為6～50，更佳為10～50，進一步更佳為10～40或20～40。或者，L2a之主鏈中包含的PEG鏈之總聚合度可為例如5以上，較佳為6以上，更佳為10以上或20以上，又例如為100以下，較佳為可為50以下，更佳為40以下(例如6、12、18、24、30、36等)。L2a中包含的在主鏈包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸殘基，可為P6P、P12P、P24P、或是P36P的殘基、或此等之非天然胺基酸殘基之組合。於較佳態樣中，L2a中包含的在主鏈包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸殘基，可為P6P、P12P、或是P24P的殘基、或此等之非天然胺基酸殘基之組合。
於較佳態樣中，L2b之α胺基酸可為甘胺酸或N甲基甘胺酸，更佳為N甲基甘胺酸。L2b之寡肽可為N甲基甘胺酸10～50個、較佳為10～20個、更佳為10～15個、進一步更佳為13個連續的寡聚N甲基甘胺酸(本說明書中，亦稱為NMeG13)。
L2可進一步包含側鏈中包含聚氧伸烷基鏈或糖鏈之非天然胺基酸的殘基。就側鏈中包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸而言，可舉出例如KPEG等之在連接子結構中成為側鏈之部分包含PEG之非天然胺基酸，就側鏈中包含糖鏈之非天然胺基酸而言，可舉出例如KSG等之在連接子結構中成為側鏈之部分包含唾液酸糖鏈之非天然胺基酸，但不限定於此等。L2可包含2個以上的側鏈中包含聚氧伸烷基鏈或糖鏈之非天然胺基酸的殘基，但較佳為包含1個的側鏈中包含聚氧伸烷基鏈或糖鏈之非天然胺基酸的殘基。於較佳態樣中，L2可包含1個KPEG殘基或KSG殘基。
於較佳態樣中，於L1及L2之寡肽的主鏈上，於不鄰接環形成基A或環形成基B的1個以上之位置，可進一步合計包含1～3個(例如1、2、或3個)、更佳為2個酸性胺基酸殘基。此處所謂「主鏈」，係意指環狀肽與載體分子的連結所必須要的直鏈狀之部分。酸性胺基酸殘基並不一定需要連續。酸性胺基酸殘基的位置若為鄰接環形成基A或環形成基B的位置以外，則不特別限定，但較佳為存在於L1與L2之間。於L1與L2之間存在酸性胺基酸殘基之情形，該酸性胺基酸殘基可決定為存在於L1與L2之任一者。酸性胺基酸殘基可為選自由Asp、D-Asp、Glu、及D-Glu所組成之群組的1個以上之胺基酸的殘基，較佳為選自由Asp、D-Asp、及Glu所組成之群組的1個以上之胺基酸的殘基，更佳為Asp殘基。最佳為2個Asp殘基存在於L1與L2鄰接的位置。
L1及L2中包含的酸性胺基酸殘基的數目可考慮環狀肽及連接子結構中包含的胺基酸殘基之電荷平衡而決定。此情形，以酸性胺基酸殘基的電荷若為1價則為+1、若為2價則為+2的方式規定，以鹼性胺基酸殘基的電荷若為1價則為-1、若為2價則為-2的方式規定。可以環狀肽及連接子結構中包含的胺基酸殘基的電荷成為-4～+1、更佳為成為-2～0的方式決定L1及L2中包含的酸性胺基酸殘基的數目。環狀肽及連接子結構中包含的胺基酸殘基的電荷成為上述數值範圍之情形，會有成為具有優異的TSP-1抑制效果的複合體之傾向。
於較佳態樣中，L1可為包含Gly-Gly-Gly-Gly、Gly-Ser-Gly-Ser、NMeG-NMeG-NMeG-NMeG、bAla-bAla-bAla-bAla、或Gly-Gly-Glu-Gly-Gly之序列或由該序列所組成的寡肽。更佳為L1係包含Gly-Gly-Gly-Gly或Gly-Ser-Gly-Ser之序列或由該序列所組成的寡肽，進一步更佳為由Gly-Gly-Gly-Gly之序列所組成的寡肽。
L1中包含酸性胺基酸殘基之情形，L1可為由在Gly-Gly-Gly-Gly、Gly-Ser-Gly-Ser、NMeG-NMeG-NMeG-NMeG、或bAla-bAla-bAla-bAla的C末端有2個酸性胺基酸殘基、較佳為有Asp殘基連結之序列所組成的寡肽。
於較佳態樣中，L2可為由Asp-Asp-KPEG-P12P-P12P、KSG-P12P-P12P、Asp-Asp-P12P、Asp-Asp-P12P-P12P、或Asp-Asp-P12P-KPEG-P12P之序列所組成的寡肽。更佳為L2為由Asp-Asp-KPEG-P12P-P12P之序列所組成的寡肽。
於較佳態樣中，L3可為Lys殘基。L3之Lys殘基的羧基可為胺羰基。
於更佳態樣中，連接子結構可為以下之結構： L1為由Gly-Gly-Gly-Gly或是Gly-Ser-Gly-Ser之序列所組成的寡肽，L2a為由Asp-Asp-KPEG-P12P-P12P之序列所組成的寡肽，L3為Lys殘基之結構； L1為由Gly-Gly-Gly-Gly之序列所組成的寡肽，L2a為由KSG-P12P-P12P之序列所組成的寡肽，L3為Lys殘基之結構； L1為由Gly-Gly-Gly-Gly之序列所組成的寡肽，L2a為由Asp-Asp-P12P之序列所組成的寡肽，L3為Lys殘基K之結構； L1為由Gly-Ser-Gly-Ser之序列所組成的寡肽，L2a為由Asp-Asp-P12P-P12P之序列所組成的寡肽，L3為Lys殘基之結構；或 L1為由Gly-Gly-Gly-Gly之序列所組成的寡肽，L2a為由Asp-Asp-P12P-KPEG-P12P之序列所組成的寡肽，L3為Lys殘基之結構。 上述結構中，L3之Lys殘基的羧基可為胺羰基。
就環狀肽及連接子結構的進一步更佳態樣而言，可舉出下式的任一者所表示之結構 、及 (式中， N297GLY表示與含Fc分子之N297結合糖鏈的非還原末端鍵結， Fc表示與含Fc分子的半胱胺酸殘基之硫醇基鍵結)。此處所示之結構，係各自為後述之實施例的複合物-67、複合物-64、複合物-56、複合物-4中之環狀肽及連接子結構。
本發明之複合體可為上述環狀肽、載體分子、及連接子結構的任意之組合。於較佳態樣中，環狀肽及連接子結構為選自上述環狀肽及連接子結構的任意之組合的任一者，載體分子可為選自Fc片段的任一者。 於更佳態樣中，環狀肽為實施例中的胜肽-11、胜肽-115、或胜肽-121，連接子結構可為 Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp-KPEG-P12P-P12P、 Gly-Gly-Gly-Gly-KSG-P12P-P12P、 Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp-P12P、 Gly-Ser-Gly-Ser-Asp-Asp-KPEG-P12P-P12P、 Gly-Ser-Gly-Ser-Asp-Asp-P12P-P12P、或 Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp-P12P-KPEG-P12P。 於更佳態樣中，環狀肽及連接子結構為選自實施例的胜肽-13～胜肽-109之任一者，載體分子可為Fc-A或Fc-C。 於更佳態樣中，環狀肽及連接子結構為選自實施例的胜肽-39、胜肽-75、胜肽-76、及胜肽-79之任一者，載體分子可為Fc-A。 於其他更佳態樣中，環狀肽及連接子結構為選自實施例的胜肽-16、胜肽-22、胜肽-46、胜肽-55、及胜肽-68之任一者，載體分子可為Fc-C。
本發明之複合體具有鹼性基之情形，可與酸組合而形成鹽，此等之鹽包含在本發明中。就該種之鹽而言，可舉出例如無機酸鹽、有機酸鹽、胺基酸鹽、及磺酸鹽。就無機酸鹽而言，可舉出例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等。就有機酸鹽而言，可舉出例如乙酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、酞酸鹽、三氟乙酸鹽等。就胺基酸鹽而言，可舉出例如麩胺酸鹽、天門冬胺酸鹽等。就磺酸鹽而言，可舉出例如甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、2,4-二甲基苯磺酸鹽、2,4,6-三甲基苯磺酸鹽、4-乙基苯磺酸鹽、萘磺酸鹽等。就本發明之複合體的藥學上可容許之鹽的較佳態樣而言，為乙酸鹽、鹽酸鹽、或三氟乙酸鹽，更佳為乙酸鹽。
本發明之複合體具有酸性基之情形，可與鹼組合而形成鹽，此等之鹽包含在本發明中。就此等之鹽而言，可舉出例如金屬鹽、無機胺鹽、有機胺鹽、及胺基酸鹽。就金屬鹽而言，可舉出例如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽等鹼金屬鹽、鈣鹽、鎂鹽等鹼土族金屬鹽、鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等。就無機胺鹽而言，可舉出例如銨鹽。就有機胺鹽而言，可舉出例如啉鹽、葡萄糖胺鹽、乙二胺鹽、胍鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽、二環己胺鹽、二乙醇胺鹽、哌鹽、四甲基銨鹽等。就胺基酸鹽而言，可舉出例如離胺酸鹽、精胺酸鹽等。
本發明之複合體或其藥學上可容許之鹽，可以結晶之形態使用，該結晶可僅由本發明之複合體或其藥學上可容許之鹽形成，亦可形成共結晶或溶劑合物(例如水合物)。本發明之複合體及其藥學上可容許之鹽，可單獨使用任一者或適當地組合2種以上而使用。
本發明之複合體或其藥學上可容許之鹽，可形成構成其之1個以上的原子以非天然之比率被同位素原子取代而成的同位素化合物。同位素原子可為放射性或非放射性，例如氘( 2H；D)、氚( 3H；T)、碳-14( 14C)、碘-125( 125I)等。以放射性的同位素原子所標識的化合物，可使用作為疾病之治療或預防藥、研究用試藥(例如試驗用試藥)、診斷藥(例如影像診斷藥)等。本發明包含放射性或非放射性的同位素化合物。
4.複合體之製造方法 本發明之複合體可藉由適當地利用有機合成化學領域中公知的反應，使上述之環狀肽、連接子分子、載體分子等中間體結合而製造。其製造之順序不特別限定，可配合中間體或目的物的結構，依照慣用方法而採用各種方法。各自之中間體所具有的官能基可因應該製造步驟，而依照慣用方法，適當地進行活化、去活化、保護基的附加、脫保護等。
於各反應步驟中，中間體及最終物係適當地分離/純化且供應至下一個反應，或作為醫藥品前體(drug substance)或者是試藥而利用。
本發明之複合體可藉由例如包含以下之步驟(1)～(6)的方法來製造。 (1)藉由固相合成法，而從C末端側合成下式所表示之寡肽X-A-L或Z-B-L之步驟 X aa1-X aa2-X aa3-X aa4-X aa5-X aa6-X aa7-X aa8-X aa9-X aa10-X aa11-A 0-L1-L2-L3、或 Z aa1-Z aa2-Z aa3-Z aa4-Z aa5-Z aa6-Z aa7-Z aa8-Z aa9-Z aa10-Z aa11-Z aa12-B 0-L1-L2-L3 [式中， X aa1～X aa11係如式(I)中所定義(但是，X aa3及X aa8之結構中，硫醇基並未形成鍵結，各自仍為硫醇基)， L1～L3係如式(XX)中所定義(但是，L2包含側鏈中包含糖鏈之非天然胺基酸的殘基之情形，該殘基被Lys殘基取代)、 Z aa1～Z aa12係如式(X)中所定義， A 0為下式所表示之殘基 A 0a、或 A 0b(式中，(X aa11)表示與X aa11之鍵結點，(L1)表示與L1之N末端的胺基酸殘基之鍵結點，l及n係如式(I)中所定義)， B 0為下式所表示之殘基 B 0a、或 B 0b(式中，(Z aa12)表示與Z aa12之鍵結點，(L1)表示與L1之N末端的胺基酸殘基之鍵結點，bl及bn係如式(X)中所定義)]； (2)藉由 (a)於寡肽X-A-L中連結X aa1之N末端胺基與A 0a而使環形成基A 1～A 3(但是，於R 10的位置與L1連結)之任一者形成、或 (b)於寡肽X-A-L中連結X aa1之N末端胺基與A 0b而使環形成基A 4或A 5(但是，於R 10的位置與L1連結)形成、或 (c)於寡肽Z-B-L中連結Z aa1或Z aa2之N末端胺基與B 0a而使環形成基B 1～B 4(但是，於R 110的位置與L1連結)之任一者形成、或 (d)於寡肽Z-B-L中連結Z aa1或Z aa2之N末端胺基與B 0b而使環形成基B 5或B 6(但是，於R 110的位置與L1連結)形成， 而使步驟(1)中所合成之寡肽環化，而得到環狀肽之步驟； (3)於步驟(1)中合成寡肽X-A-L之情形，於步驟(2)中所環化的寡肽X-A-L之X aa3及X aa8的硫醇基中，使-S-S-、-S-CH 2-S-、或-S-X-S-(式中，X係如式(I)中所定義)所表示之鍵結形成，而得到二環性環狀肽之步驟； (4)L2包含側鏈中包含糖鏈之非天然胺基酸的殘基，且於寡肽X-A-L或Z-B-L中被Lys殘基取代之情形，藉由對該Lys殘基導入糖鏈，而使側鏈中包含糖鏈之非天然胺基酸的殘基形成之步驟； (5)使馬來醯亞胺基或含1,2,3-三唑環的反應基與L3鍵結之步驟；及 (6)透過步驟(5)的反應基而使環狀肽與載體分子結合之步驟。
在步驟(1)中，係將為環狀肽之要素的寡肽與為連接子結構之要素的寡肽作為1個寡肽而從C末端側進行合成。寡肽的合成，係例如可依照使用9-茀基甲氧羰基(Fmoc基)作為胺基的保護基之一般的固相合成法來進行。於固相合成，可使用市售之自動合成機(例如Syro II(Biotage Japan公司)、Liberty Blue(CEM公司)等)。例如，使用肽自動合成機，而在固相擔体(例如Rink Amide Resin AM(Novaviochem公司)、2-氯三苯甲基氯樹脂(Novaviochem公司)等)，由C末端側依序連結以胺基的保護基(例如Fmoc基等)所保護之胺基酸(C末端胺基酸為Y aa10)。胺基的脫保護可藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的方法(例如，Fmoc基之情形為20%哌啶/1-甲基-2-吡咯啶酮等)來進行。連結至N末端之胺基酸為止，得到寡肽X-A-L或Z-B-L。 於寡肽X-A-L或Z-B-L中L2包含側鏈中包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸的殘基之情形，該殘基的連結可藉由慣用方法來進行。例如，可藉由首先將Lys殘基連結於已完成合成之部分，且使包含聚氧伸烷基鏈之化合物(例如實施例的合成法3中記載之PEG O11A等)與該Lys殘基之連接子結構中成為側鏈之部分的胺基(例如於實施例的合成法3中為Lys殘基之α胺基)鍵結，而進行側鏈中包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸的殘基的連結。
在步驟(2)中，係藉由使環形成基A 1～A 5或B 1～B 6形成，使步驟(1)中所合成之寡肽環化，而得到環狀肽。為了形成環形成基，可首先於將寡肽之N末端胺基酸殘基的胺基脫保護之後，若有需要則對胺基導入用以使環形成基形成之基，使環狀肽形成。
於步驟(2)(a)或(c)中，使環形成基A 1～A 3及B 1～B 3之任一者形成之情形，係例如對N末端胺基導入-COCH 2X(X為Cl等脫離基)。具體而言，可使氯乙酸與N末端胺基反應，對胺基導入氯甲基羰基等。-COCH 2X與A 0a或B 0a之硫醇基進行反應，而可得到具有環形成基A 1或B 1的環狀肽。進一步藉由將環形成基A 1或B 1之硫醚基氧化，而可得到具有環形成基A 2、A 3、B 2、或B 3的環狀肽。
於步驟(2)(b)中，使環形成基A 4或A 5形成之情形，係例如對N末端胺基導入-CO(CH 2) kCH=CH 2。藉由-CO(CH 2) kCH=CH 2與A 0b之側鏈-(CH 2) lCH=CH 2的烯烴複分解，而可得到具有環形成基A 4的環狀肽。進一步藉由將環形成基A 4之C-C雙鍵還原，而可得到具有環形成基A 5的環狀肽。
於步驟(2)(c)中，使環形成基B 4形成之情形，藉由使Z aa1或Z aa2之硫醇基與B 0a之硫醇基進行反應，而可得到具有環形成基B 4的環狀肽。雙硫鍵結的形成可藉由慣用方法(例如碘氧化法)來進行。
於步驟(2)(d)中，使環形成基B 5或B 6形成之情形，係例如對N末端胺基導入-CO (CH 2) bkCH=CH 2。藉由-CO(CH 2) bkCH=CH 2與B 0b之側鏈-(CH 2) blCH=CH 2的烯烴複分解，而可得到具有環形成基B 5的環狀肽。進一步藉由將環形成基B 5之C-C雙鍵還原，而可得到具有環形成基B 6的環狀肽。
然後，藉由慣用方法(例如，於使用Rink Amide Resin AM之情形，為使用三氟乙酸-乙二硫醇-三異丙基矽烷-水之條件)，而從肽樹脂將所得之肽切斷。可藉由醚沉澱而回收粗肽後，藉由慣用方法(例如逆相高效能液相層析法)而純化目的物。
步驟(3)係用以於步驟(1)中合成寡肽X-A-L之情形，形成二環性環狀肽之步驟。關於步驟(2)中所得到的環狀肽，可藉由慣用方法(例如碘氧化法)而使X aa3與X aa8之間的雙硫鍵結等鍵結形成，得到二環性環狀肽。可藉由醚沉澱而回收粗肽後，藉由慣用方法(例如逆相高效能液相層析法)而純化目的物。
步驟(4)係用以於寡肽X-A-L或Z-B-L中L2之側鏈中包含糖鏈之非天然胺基酸的殘基被Lys殘基取代之情形，形成側鏈中包含糖鏈之非天然胺基酸的殘基之步驟。Lys殘基的轉變，可藉由利用慣用方法而使包含糖鏈的化合物(例如實施例的合成法5中記載之SGA等)與Lys殘基之ε胺基鍵結來進行。可在反應後藉由慣用方法(例如逆相高效能液相層析法)而純化目的物。
在步驟(5)中，係將用以使寡肽X-A-L或Z-B-L與載體分子結合之馬來醯亞胺基或可形成1,2,3-三唑環的反應基，鍵結於L3。馬來醯亞胺基與寡肽的鍵結，係例如可使用3-馬來醯亞胺丙酸-N-琥珀醯亞胺酯等試藥，而藉由慣用方法來進行。為了形成1,2,3-三唑環，係可利用例如CuAAC、SPAAC等的加成環化反應。因應所利用的反應，而選擇乙炔基、含DBCO的反應基等作為可形成1,2,3-三唑環的反應基。於較佳態樣中，利用SPAAC而形成1,2,3-三唑環，此情形，可選擇含DBCO的反應基作為可形成1,2,3-三唑環的反應基。含DBCO的反應基與寡肽的鍵結，係例如可使用二苯并環辛炔-N-羥基琥珀醯亞胺酯等試藥，而藉由慣用方法來進行。
步驟(6)中之載體分子，係依照上述III之「1.載體分子」中記載之方法製備。可因應步驟(5)中與寡肽鍵結的反應基，而以具有合適的反應基之方式來製備載體分子。例如，使其與具有馬來醯亞胺基的寡肽結合之情形，可製備具有硫醇基的載體分子。於使其與具有可形成1,2,3-三唑環的反應基的寡肽之情形，係例如可對經糖鏈重塑的含Fc分子之非還原末端的唾液酸之第2位導入含疊氮基的反應基。於N297結合糖鏈的非還原末端具有疊氮基等反應基的分子，可在含Fc分子之糖鏈重塑步驟合成。例如，可使用非還原末端的唾液酸之第2位有疊氮基鍵結的糖鏈供體分子而進行糖鏈重塑。 於環狀肽與載體分子之結合，可應用上述III之「3.連接子結構」中記載之方法等公知方法，例如可基於實施例之合成法8～10來進行。
本發明之複合體或其藥學上可容許之鹽，係具有TSP1抑制活性，且藉由本案實施例所示之使用了人類TSP1及血管內皮細胞的細胞黏著抑制試驗所測定之IC 50為500nM以下，較佳為200nM以下。所以，本發明之複合體或其藥學上可容許之鹽可阻礙TSP1與血管內皮細胞的黏著，因此有用於作為血流改善劑。再者，載體分子為含Fc分子且2分子的含Fc分子交聯而形成1分子的複合體(即二聚體)之情形，IC 50之計算中的莫耳濃度係使用二聚體的分子量來計算。載體分子為含Fc分子但含Fc分子並未交聯而複合體仍為單體之情形(例如，透過還原含Fc分子的鉸鏈部之雙硫鍵結所生成的硫醇基而與環狀肽結合之情形)，IC 50之計算中的莫耳濃度係使用單體的分子量之2倍的值來計算。又，載體分子為含Fc分子且為透過還原其鉸鏈部之雙硫鍵結所生成的硫醇基而與環狀肽結合的含Fc分子之情形，於含Fc分子可鍵結各式各樣種類的糖鏈。該情形，IC 50之計算中的莫耳濃度係使用脫糖鏈體的分子量來計算。
5.醫藥組成物 本發明進一步提供包含本發明之複合體或其藥學上可容許之鹽作為有效成分的醫藥組成物(以下稱為本發明之醫藥組成物II。)。本發明之醫藥組成物II係具有優異的TSP1抑制活性，且藉由本案實施例所示之使用了人類TSP1及血管內皮細胞的細胞黏著抑制試驗所測定之IC 50為500nM以下，較佳為200nM以下。所以，本發明之醫藥組成物II有用於能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病或症狀(例如，可能起因於血管新生抑制之疾病、可能起因於血栓形成亢進之疾病、發炎性疾病、可能起因於腎臟細胞機能降低之疾病、可能起因於血管鬆弛作用的抑制之疾病、缺血性疾病、癌疾病等疾病、及鐮刀型紅血球疾病所伴隨的血管阻塞(vaso-occlusive crisis)、血管新生抑制、組織壞死、胰島素抗性、一般的創傷等症狀)之治療或預防。上述疾病或症狀之具體例係如關於本發明之醫藥組成物I之記載所述。
本發明之醫藥組成物II係具有優異的TSP1抑制活性，且可具有血流改善作用。因此，有用於能夠藉由改善血流而治療或預防的疾病之治療或預防。例如就該種之疾病而言，可舉出慢性肢體威脅性缺血、嚴重肢體缺血、周邊動脈疾病、心肌梗塞、狹心症、腎損傷、缺血再灌流傷害。又，就慢性肢體威脅性缺血而言，可舉出例如糖尿病性腳病變，就糖尿病性腳病變而言，可舉出例如糖尿病性腳潰瘍。
於較佳態樣中，本發明之醫藥組成物II有用於嚴重肢體缺血、周邊動脈疾病或慢性肢體威脅性缺血之治療或預防，有用於例如嚴重肢體缺血患者之創傷治癒的促進、及對於嚴重肢體缺血之血管內治療之預後的改善。
已知TSP1在嚴重肢體缺血患者之下肢骨骼肌中，其表現係亢進。並不希望被任何理論所拘束，但認為本發明之醫藥組成物II可藉由阻礙TSP1與血管內皮細胞的黏著，而促進因TSP1所阻礙的血管新生或血管擴張。藉此，而本發明之醫藥組成物II可促進嚴重肢體缺血患者之創傷治癒，又可於與利用導管等的血管內治療組合之情形改善該治療之預後(例如預防再狹窄)。
本發明之醫藥組成物II，係可將本發明之環狀肽或其藥學上可容許之鹽、與適當的藥學上可容許之添加劑混合，而進行製劑化。例如，本發明之醫藥組成物II可作為錠劑、膠囊劑、顆粒劑等製劑而經口地投予，或作為注射劑、經皮吸收劑等製劑而非經口地投予。
此等之製劑係使用賦形劑、結合劑、崩散劑、潤滑劑、乳化劑、安定劑、稀釋劑、注射劑用溶劑、助溶劑、懸浮劑、等滲劑、緩衝劑、無痛劑、防腐劑、抗氧化劑等添加劑，而以周知方法製造。添加劑之具體例係如關於本發明之醫藥組成物I之記載所述。
投予本發明之醫藥組成物II的對象，係例如哺乳動物，較佳為人類。
就本發明之醫藥組成物II的投予途徑而言、經口投予及非經口投予之任一者，可因應對象疾病而選擇適合的投予途徑。又，投予途徑可為全身投予及局部投予之任一者。就非經口投予而言，可舉出例如靜脈內投予、動脈內投予、肌肉內投予、皮內投予、皮下投予、腹腔內投予、經皮投予、骨內投予、關節內投予等。本發明之醫藥組成物II的投予途徑的較佳態樣為靜脈內投予、皮下投予、或經皮投予。
本發明之複合體或其藥學上可容許之鹽，係以對治療或預防有效之量被投予至對象。所謂「對治療或預防有效之量」，係意指對特定疾病、投予形態及投予途徑發揮治療或預防效果之量，因應對象物種、疾病的種類、症狀、性別、年齡、宿疾、其他要素而適當地決定。
本發明之環狀肽I或是II或其藥學上可容許之鹽的投予量，係因應對象物種、疾病的種類、症狀、性別、年齡、宿疾、其他要素而適當地決定，對於人類的成人，通常可將0.1～1000mg/kg、較佳為0.1～10mg/kg，於1～7天投予1次、或1天投予2次或是3次以上。
本發明之醫藥組成物II亦可與至少1個已知的治療劑或治療法併用。例如，於嚴重肢體缺血之治療中，可在導管等血管內治療之前、在之後、或同時地投予本發明之醫藥組成物II。 本發明之複合體或其藥學上可容許之鹽，可藉由塗藥支架(DES)而送達。所謂塗藥支架，係指以使支架表面攜帶藥劑且於留置在血管內後藥劑會緩緩地溶出的方式製成的支架。
又，本發明有關於一種用以治療或預防疾病或症狀的方法，此方法包含：將本發明之複合體或其藥學上可容許之鹽的對治療或預防有效之量投予至需要其的對象。
本發明中之所謂「對治療或預防有效之量」，係意指對特定疾病或症狀、投予形態及投予途徑發揮治療或預防效果之量，因應對象物種、疾病或症狀的種類、症狀、性別、年齡、宿疾、其他要素而適當地決定。
本發明中之「對象」，係例如哺乳動物，較佳為人類。
於本發明中之「投予」中，係包含經口投予及非經口投予，可為全身投予及局部投予之任一者。就非經口投予而言，可舉出例如靜脈內投予、動脈內投予、肌肉內投予、皮內投予、皮下投予、腹腔內投予、經皮投予、骨內投予、關節內投予等。本發明中之「投予」的較佳態樣為靜脈內投予、皮下投予、或經皮投予。
就本發明中之「疾病或症狀」而言，可舉出能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病或症狀。該疾病或症狀之具體例係如關於本發明之醫藥組成物I之記載所述。於較佳態樣中，本發明之治療或預防方法有用於嚴重肢體缺血、周邊動脈疾病或慢性肢體威脅性缺血之治療或預防，有用於例如嚴重肢體缺血患者之創傷治癒的促進、及對於嚴重肢體缺血之血管內治療之預後的改善。
本發明之複合體係與本發明之環狀肽I或II比較，而可改善PK-PD特徵。所以，若藉由使用本發明之醫藥組成物II及本發明之複合體或其藥學上可容許之鹽的治療或預防方法，則可以較少的投予頻率來治療或預防能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病或症狀。
以下，舉出實施例及試驗例，進一步詳細地說明本發明，但本發明之範圍並不限定於此等。 [實施例]
[合成例] 1.胜肽-1～胜肽-12的合成、以及胜肽-115、胜肽-119及胜肽-125～胜肽-139的合成 如下表所示地，藉由後述合成法1(產率19%)及合成法4(產率16%)合成胜肽-1。產率表示各合成法之代表化合物的結果。 胜肽-2～胜肽-12亦使用同樣的手法合成。 如下表所示地，藉由後述合成法1合成胜肽-115及胜肽-119。 如下表所示地，藉由後述合成法1、合成法11及合成法14合成胜肽-125。 如下表所示地，藉由後述合成法1、合成法11及合成法12合成胜肽-126、胜肽-128、胜肽-129、胜肽-134、胜肽-135、及胜肽-138。 如下表所示地，藉由後述合成法1、合成法11及合成法13合成胜肽-127、胜肽-130～胜肽-133、胜肽-136、胜肽-137、及胜肽-139。 [表1]
胜肽- 分子量 方法1 方法2 方法3 LC-MS 條件 MS 實測值 MS 價數 Rt (分)
1 1713.02 合成法1 合成法4    條件1 856.88 2 1.51
2 1699.00 合成法1 合成法4    條件1 849.87 2 1.52
3 1689.98 合成法1 合成法4    條件1 845.35 2 2.09
4 1689.98 合成法1 合成法4    條件1 845.35 2 1.72
5 1705.00 合成法1 合成法4    條件1 852.86 2 1.50
6 1643.96 合成法1 合成法4    條件1 822.36 2 1.55
7 1669.99 合成法1 合成法4    條件1 835.37 2 1.66
8 1684.02 合成法1 合成法4    條件1 842.38 2 1.57
9 1714.01 合成法1 合成法4    條件1 857.37 2 1.53
10 1727.05 合成法1 合成法4    條件1 863.87 2 1.52
11 1728.03 合成法1 合成法4    條件1 864.38 2 1.53
12 1701.01 合成法1 合成法4    條件1 850.88 2 2.07
125 1784.10 合成法1 合成法11 合成法14 條件1 892.39 2 1.78
126 1714.01 合成法1 合成法11 合成法12 條件1 857.37 2 1.77
127 1742.06 合成法1 合成法11 合成法13 條件1 871.39 2 1.78
128 1699.98 合成法1 合成法11 合成法12 條件1 850.36 2 1.70
129 1714.01 合成法1 合成法11 合成法12 條件1 857.37 2 1.80
130 1714.01 合成法1 合成法11 合成法13 條件1 857.37 2 1.74
131 1728.03 合成法1 合成法11 合成法13 條件1 864.38 2 1.75
132 1728.03 合成法1 合成法11 合成法13 條件1 864.38 2 1.72
133 1756.09 合成法1 合成法11 合成法13 條件1 878.39 2 1.81
134 1742.06 合成法1 合成法11 合成法12 條件1 871.39 2 1.85
135 1742.06 合成法1 合成法11 合成法12 條件1 871.39 2 1.82
136 1756.09 合成法1 合成法11 合成法13 條件1 878.39 2 1.83
137 1742.06 合成法1 合成法11 合成法13 條件1 871.39 2 1.80
138 1728.03 合成法1 合成法11 合成法12 條件1 864.38 2 1.77
139 1742.06 合成法1 合成法11 合成法13 條件1 871.39 2 1.81
115 1666.91 合成法1       條件1 1666.91 1 1.47
119 1667.89 合成法1       條件1 834.40 2 1.48
於下表呈示構成二環性環狀肽胜肽-1～胜肽-12之殘基。再者，第12號的半胱胺酸殘基於環狀肽中，係轉變成環形成基。又，第3及8號的HCY殘基形成雙硫鍵結。 於下表呈示構成胜肽-115及胜肽-119之殘基。再者，第12號的半胱胺酸殘基於環狀肽中，係轉變成環形成基。 於下表呈示構成二環性環狀肽胜肽-125之殘基。再者，第12號的半胱胺酸殘基於環狀肽中，係轉變成環形成基。又，第3及8號的HCY殘基形成硫醇基以-S-CH 2-CO-CH 2-S-所表示之鍵結(亦稱為丙酮交聯)。 於下表呈示構成二環性環狀肽胜肽-126、胜肽-128、胜肽-129、胜肽-134、胜肽-135、及胜肽-138之殘基。再者，第12號的半胱胺酸殘基於環狀肽中，係轉變成環形成基。又，第3及8號的半胱胺酸殘基、HCY殘基、或Pen殘基形成雙硫鍵結。 於下表呈示構成二環性環狀肽胜肽-127、胜肽-130～胜肽-133、胜肽-136、胜肽-137、及胜肽-139之殘基。再者，第12號的半胱胺酸殘基於環狀肽中，係轉變成環形成基。又，第3及8號的半胱胺酸殘基、HCY殘基、或Pen殘基形成硫醇基以-S-CH 2-S-所表示之鍵結(亦稱為亞甲基交聯)。 [表2]
胜肽- 環形成基 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 IC50 (nM)
1 A 1a1 2NAL R HCY G AGB N W HCY R W CPTG C 12.6
2 A 1a1 2NAL AGB HCY G AGB N W HCY R W CPTG C 20.0
3 A 1a1 2NAL PHG HCY G AGB N W HCY R W CPTG C 29.9
4 A 1a1 2NAL R HCY G AGB N W HCY PHG W CPTG C 33.8
5 A 1a1 2NAL R HCY G AGB N W HCY 4PAL W CPTG C 23.6
6 A 1a1 2NAL R HCY G R N W HCY V W V C 32.1
7 A 1a1 2NAL R HCY G R N W HCY V W CPTG C 31.1
8 A 1a1 2NAL TLE HCY G R N W HCY R W CPTG C 12.6
9 A 1a1 2NAL R HCY G AGB D W HCY R W CPTG C 22.4
10 A 1a1 2NAL R HCY G R N W HCY R W CPTG C 14.3
11 A 1a1 2NAL R HCY G R D W HCY R W CPTG C 26.0
12 A 1a1 2NAL R HCY G R N W HCY R W V C 18.6
125 A 1a1 2NAL R HCY G R D W HCY R W CPTG C 305.2
126 A 1a1 2NAL R C G R D W HCY R W CPTG C 10.8
127 A 1a1 2NAL R HCY G R D W HCY R W CPTG C 11.6
128 A 1a1 2NAL R C G R D W C R W CPTG C 8.4
129 A 1a1 2NAL R HCY G R D W C R W CPTG C 43.7
130 A 1a1 2NAL R C G R D W C R W CPTG C 7.7
131 A 1a1 2NAL R C G R D W HCY R W CPTG C 14.2
132 A 1a1 2NAL R HCY G R D W C R W CPTG C 7.0
133 A 1a1 2NAL R Pen G R D W HCY R W CPTG C 125.3
134 A 1a1 2NAL R HCY G R D W Pen R W CPTG C 102.0
135 A 1a1 2NAL R Pen G R D W HCY R W CPTG C 207.7
136 A 1a1 2NAL R HCY G R D W Pen R W CPTG C 161.6
137 A 1a1 2NAL R Pen G R D W C R W CPTG C 80.6
138 A 1a1 2NAL R C G R D W Pen R W CPTG C 92.5
139 A 1a1 2NAL R C G R D W Pen R W CPTG C 30.9
115 B 1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C 17.5
119 B 1a1 2NAL R S G AGB D W V R W CPTG C 22.0
2.胜肽-13～胜肽-24的合成 如下表所示地，藉由後述合成法1(產率6%)、合成法4(產率44%)、及合成法6(產率50%)合成胜肽-13。 胜肽-14亦使用同樣的手法合成。 如下表所示地，藉由後述合成法2(產率3%)、合成法4(產率84%)、及合成法6(產率60%)合成胜肽-15。 如下表所示地，藉由後述合成法3(產率13%)、合成法4(產率28%)、及合成法6(產率53%)合成胜肽-16。 胜肽-17～胜肽-24亦使用同樣的手法合成。 [表3]
胜肽- 分子量 方法1 方法2 方法3 LC-MS 條件 MS 實測值 MS 價數 Rt (分)
13 3165.49 合成法1 合成法4 合成法6 條件1 1055.46 3 1.45
14 3051.39 合成法1 合成法4 合成法6 條件1 1017.45 3 1.51
15 2937.29 合成法2 合成法4 合成法6 條件1 1468.65 3 1.49
16 4305.88 合成法3 合成法4 合成法6 條件1 1435.37 3 2.10
17 4365.94 合成法3 合成法4 合成法6 條件1 1455.38 3 1.57
18 4305.88 合成法3 合成法4 合成法6 條件1 1435.37 3 1.59
19 4305.88 合成法3 合成法4 合成法6 條件1 1435.37 3 2.10
20 4361.99 合成法3 合成法4 合成法6 條件1 1454.06 3 1.92
21 4361.99 合成法3 合成法4 合成法6 條件1 1454.06 3 1.65
22 4365.94 合成法3 合成法4 合成法6 條件1 1455.37 3 1.58
23 4365.94 合成法3 合成法4 合成法6 條件1 1455.37 3 1.57
24 4361.99 合成法3 合成法4 合成法6 條件1 1454.05 3 1.63
於下表呈示構成具有連接子結構的二環性環狀肽胜肽-13～胜肽-24之殘基。再者，第12號的半胱胺酸殘基於環狀肽中，係轉變成環形成基。環形成基係於胺羰基與連接子結構形成醯胺鍵結，該胺羰基中的NH 2被連接子結構之N末端胺基酸殘基之N末端胺基的NH取代。又，第3及8號的HCY殘基形成雙硫鍵結。C末端之離胺酸殘基係藉由合成法6而被馬來醯亞胺化。 [表4]
胜肽- 環形成基 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
13 A1a1 2NAL R HCY G AGB N W HCY R W CPTG C G G G G D D D P12P K 　
14 A1a1 2NAL R HCY G AGB D W HCY R W CPTG C G G G G D D P12P K 　
15 A1a1 2NAL R HCY G AGB D W HCY R W CPTG C G G G G D P12P K 　 　
16 A1a1 2NAL R HCY G R D W HCY R W CPTG C G G G G D D KPEG P12P P12P K
17 A1a1 2NAL R HCY G R D W HCY R W CPTG C G S G S D D P12P P12P KPEG K
18 A1a1 2NAL R HCY G R D W HCY R W CPTG C G G G G D D P12P P12P KPEG K
19 A1a1 2NAL R HCY G R D W HCY R W CPTG C G G G G D D P12P KPEG P12P K
20 A1a1 2NAL R HCY G R D W HCY R W CPTG C NMeG NMeG NMeG NMeG D D KPEG P12P P12P K
21 A1a1 2NAL R HCY G R D W HCY R W CPTG C NMeG NMeG NMeG NMeG D D P12P KPEG P12P K
22 A1a1 2NAL R HCY G R D W HCY R W CPTG C G S G S D D KPEG P12P P12P K
23 A1a1 2NAL R HCY G R D W HCY R W CPTG C G S G S D D P12P KPEG P12P K
24 A1a1 2NAL R HCY G R D W HCY R W CPTG C NMeG NMeG NMeG NMeG D D P12P P12P KPEG K
3.胜肽-25～胜肽-72的合成 如下表所示地，藉由後述合成法1(產率13%)及合成法6(產率71%)合成胜肽-25。 胜肽-26～胜肽-35、胜肽-37～胜肽-50、及胜肽-57～胜肽-59亦使用同樣的手法合成。 如下表所示地，藉由後述合成法2(產率6%)及合成法6(產率71%)合成胜肽-36。 如下表所示地，藉由後述合成法3(產率9%)及合成法6(產率32%)合成胜肽-51。於C末端之Lys，係使用Fmoc-Lys(Boc)-OH，於其以外的Lys(轉變成KPEG)，係使用Fmoc-Lys(ivDde)-OH。 胜肽-52～胜肽-56及胜肽-70～胜肽-72亦使用同樣的手法合成。 如下表所示地，藉由後述合成法1(產率15%)、合成法5(產率23%)、及合成法6(產率50%)合成胜肽-60。於C末端之Lys，係使用Fmoc-Lys(ivDde)-OH，於其以外的Lys(轉變成KSG)，係使用Fmoc-Lys(Boc)-OH。 胜肽-61～胜肽-69亦使用同樣的手法合成。 [表5]
胜肽- 分子量 方法1 方法2 方法3 LC-MS 條件 MS實測值 MS 價數 Rt (分)
25 2705.05 合成法1 合成法6 條件1 1353.18 2 1.48
26 2762.11 合成法1 合成法6 條件1 1381.69 2 1.42
27 3004.29 合成法1 合成法6 條件1 1001.81 3 1.49
28 2774.11 合成法1 合成法6 條件1 925.13 3 1.47
29 3004.29 合成法1 合成法6 條件1 1001.81 3 1.47
30 3060.39 合成法1 合成法6 條件1 1020.49 3 1.46
31 3004.29 合成法1 合成法6 條件1 1001.81 3 1.46
32 3060.39 合成法1 合成法6 條件1 1020.48 3 1.45
33 2759.14 合成法1 合成法6 條件1 1379.68 2 1.69
34 2989.31 合成法1 合成法6 條件1 1494.72 2 1.65
35 2890.19 合成法1 合成法6 條件1 963.80 3 1.48
36 2776.08 合成法2 合成法6 條件1 925.79 3 1.49
37 2745.11182 合成法1 合成法6 條件1 915.4669 3 1.703
38 2975.28662 合成法1 合成法6 條件1 992.1473 3 1.661
39 3032.34131 合成法1 合成法6 條件1 1011.1617 3 1.565
40 2904.21216 合成法1 合成法6 條件1 968.4718 3 1.533
41 3018.3147 合成法1 合成法6 條件1 1006.474 3 2.081
42 2904.21216 合成法1 合成法6 條件1 968.4725 3 1.532
43 3560.972 合成法1 合成法6 條件1 1187.2642 3 2.097
44 3632.0499 合成法1 合成法6 條件1 1210.9423 3 2.1
45 3688.1563 合成法1 合成法6 條件1 1229.6301 3 1.823
46 3692.1019 合成法1 合成法6 條件1 1230.9509 3 1.596
47 3660.1031 合成法1 合成法6 條件1 1220.2886 3 1.598
48 3632.0499 合成法1 合成法6 條件1 1210.942 3 1.591
49 3632.0499 合成法1 合成法6 條件1 1210.9407 3 1.599
50 3632.0499 合成法1 合成法6 條件1 1210.9404 3 1.59
51 4272.8105 合成法3 合成法6 條件1 1424.4027 3 1.684
52 4272.8105 合成法3 合成法6 條件1 1424.4024 3 1.68
53 4272.8105 合成法3 合成法6 條件1 1424.396 3 1.685
54 4244.7573 合成法3 合成法6 條件1 1415.0577 3 1.568
55 4244.7573 合成法3 合成法6 條件1 1415.056 3 1.533
56 4244.7573 合成法3 合成法6 條件1 1415.0559 3 1.534
57 3075.3661 合成法1 合成法6 條件1 1025.4912 3 1.444
58 3075.3661 合成法1 合成法6 條件1 1025.4925 3 1.445
59 3075.3661 合成法1 合成法6 條件1 1025.4922 3 1.443
60 6024.2405 合成法1 合成法5 合成法6 條件1 1506.1701 4 1.476
61 6024.2405 合成法1 合成法5 合成法6 條件1 1506.1697 4 1.468
62 5794.0657 合成法1 合成法5 合成法6 條件1 1931.2051 3 1.486
63 5794.0657 合成法1 合成法5 合成法6 條件1 1448.6553 4 1.489
64 5794.0657 合成法1 合成法5 合成法6 條件1 1931.2045 3 1.495
65 5996.1874 合成法1 合成法5 合成法6 條件1 1499.1625 4 2.071
66 5996.1874 合成法1 合成法5 合成法6 條件1 1499.1659 4 2.07
67 5996.1874 合成法1 合成法5 合成法6 條件1 1998.5501 3 1.408
68 5766.0126 合成法1 合成法5 合成法6 條件1 1441.6496 4 1.421
69 5766.0126 合成法1 合成法5 合成法6 條件1 1441.6473 4 1.412
70 4328.9168 合成法3 合成法6 條件1 1443.0842 3 1.666
71 4332.8624 合成法3 合成法6 條件1 1444.4025 3 1.647
72 4332.8624 合成法3 合成法6 條件1 1444.4083 3 1.984
於下表呈示構成具有連接子結構的環狀肽胜肽-25～胜肽-72之殘基。再者，於下表中，胜肽-25～胜肽-72之環狀肽之第1～11號的胺基酸殘基相當於本發明之環狀肽II中之Z aa2～Z aa12，且Z aa1不存在。第12號的半胱胺酸殘基於環狀肽中，係轉變成環形成基。環形成基係於胺羰基與連接子結構形成醯胺鍵結，該胺羰基中的NH 2被連接子結構之N末端胺基酸殘基之N末端胺基的NH取代。C末端之離胺酸殘基係藉由合成法6而被馬來醯亞胺化。 [表6]
胜肽- 環形成基 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
25 B1a1 2NAL R S G R N W V V W V C G G G G P12P K 　 　 　 　
26 B1a1 2NAL R S G R N W V R W V C G G G G P12P K 　 　 　 　
27 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G D D P12P K 　 　
28 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G P12P K 　 　 　 　
29 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G P12P D D K 　 　
30 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C bAla bAla bAla bAla D D P12P K 　 　
31 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G d d P12P k 　 　
32 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C bAla bAla bAla bAla d d P12P k 　 　
33 B1a1 2NAL R S G R N W NLE V W CHXG C G G G G P12P K 　 　 　 　
34 B1a1 2NAL R S G R N W NLE V W CHXG C G G G G D D P12P K 　 　
35 B1a1 2NAL R S G AGB D W V R W CPTG C G G G G D P12P K 　 　 　
36 B1a1 2NAL R S G AGB D W V R W CPTG C G G G G P12P K 　 　 　 　
37 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE V W CHXG C G G G G P12P K 　 　 　 　
38 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE V W CHXG C G G G G D D P12P K 　 　
39 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C G G G G D D P12P K 　 　
40 B1a1 2NAL R S G AGB D W NLE R W CPTG C G G G G D P12P K 　 　 　
41 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CPTG C G G G G P12P D D K 　 　
42 B1a1 2NAL R S G AGB D W NLE R W CPTG C G G G G P12P D K 　 　 　
43 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C G G G G D D P24P K 　 　
44 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C G G G G D D P12P P12P K 　
45 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C NMeG NMeG NMeG NMeG D D P12P P12P K 　
46 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C G S G S D D P12P P12P K 　
47 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C G G E G G E P12P P12P K 　
48 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C G G G G D P12P D P12P K 　
49 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C G G G G D P12P P12P D K 　
50 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C G G G G P12P D P12P D K 　
51 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C G G G G D D KPEG P12P P12P K
52 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C G G G G D D P12P KPEG P12P K
53 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C G G G G D D P12P P12P KPEG K
54 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G D D KPEG P12P P12P K
55 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G D D P12P KPEG P12P K
56 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G D D P12P P12P KPEG K
57 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G D P6P D P6P K 　
58 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G P6P D D P6P K 　
59 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G P6P D P6P D K 　
60 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C G G G G D D KSG P12P P12P K
61 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C G G G G D D P12P KSG P12P K
62 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C G G G G KSG P12P P12P K 　 　
63 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C G G G G P12P KSG P12P K 　 　
64 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C G G G G P12P P12P KSG K 　 　
65 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G D D KSG P12P P12P K
66 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G D D P12P KSG P12P K
67 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G D D P12P P12P KSG K
68 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G KSG P12P P12P K 　 　
69 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G P12P KSG P12P K 　 　
70 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C NMeG NMeG NMeG NMeG D D P12P KPEG P12P K
71 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C G S G S D D KPEG P12P P12P K
72 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C G S G S D D P12P KPEG P12P K
4.胜肽-73～胜肽-109的合成 如下表所示地，藉由後述合成法1(產率13%)及合成法7(產率76%)合成胜肽-73。 胜肽-74、胜肽-75、胜肽-79～胜肽-83、胜肽-85、胜肽-87～胜肽-91、胜肽-95、胜肽-96、胜肽-98、胜肽-100～胜肽-106、及胜肽-109亦使用同樣的手法合成。 如下表所示地，藉由後述合成法1(產率20%)、合成法4(產率14%)、及合成法7(產率73%)合成胜肽-76。 胜肽-77、胜肽-78、胜肽-84、胜肽-86、及胜肽-92～胜肽-94亦使用同樣的手法合成。 如下表所示地，藉由後述合成法2(產率6%)及合成法7(產率60%)合成胜肽-97。 胜肽-107亦使用同樣的手法合成。 如下表所示地，藉由後述合成法2(產率20%)、合成法4(產率14%)、及合成法7(產率73%)合成胜肽-99。 胜肽-108亦使用同樣的手法合成。 [表7]
胜肽- 分子量 方法1 方法2 方法3 LC-MS 條件 MS 實測值 MS 價數 Rt (分)
73 2841.24 合成法1 合成法7 條件1 1421.21 2 1.90
74 2910.31 合成法1 合成法7 條件1 1455.23 2 1.78
75 3140.48 合成法1 合成法7 條件1 1047.17 3 1.74
76 3201.61 合成法1 合成法4 合成法7 條件1 1067.48 3 1.77
77 3301.68 合成法1 合成法4 合成法7 條件1 1100.83 3 1.75
78 3187.58 合成法1 合成法4 合成法7 條件1 1062.81 3 1.76
79 3168.53 合成法1 合成法7 條件1 1056.51 3 1.79
80 3186.50 合成法1 合成法7 條件1 1593.25 2 1.72
[表8]
胜肽- 分子量 方法1 方法2 方法3 LC-MS 條件 MS 實測值 MS 價數 Rt (分)
81 2924.33 合成法1 合成法7 　 條件1 975.49 3 1.74
82 3165.54 合成法1 合成法7 　 條件1 1582.77 2 1.61
83 2911.29 合成法1 合成法7 　 條件1 1455.72 2 1.74
84 2887.36 合成法1 合成法4 合成法7 條件1 1443.68 2 1.76
85 2881.30 合成法1 合成法7 　 條件1 960.82 3 1.85
86 2956.42 合成法1 合成法4 合成法7 條件1 985.80 3 1.78
87 2881.30 合成法1 合成法7 　 條件1 960.82 3 1.78
88 3370.66 合成法1 合成法7 　 條件1 1123.86 3 1.72
89 3255.5681 合成法1 合成法7 　 條件1 1085.5172 3 1.727
90 3025.3933 合成法1 合成法7 　 條件1 1008.8277 3 1.746
91 3154.5073 合成法1 合成法7 　 條件1 1051.8421 3 1.749
92 3186.5954 合成法1 合成法4 合成法7 條件1 1062.481 3 1.759
93 3071.508 合成法1 合成法4 合成法7 條件1 1024.1387 3 1.765
94 3186.5954 合成法1 合成法4 合成法7 條件1 1062.48 3 1.747
95 3154.5073 合成法1 合成法7 　 條件1 1051.8465 3 1.726
96 3040.4046 合成法1 合成法7 　 條件1 1013.8938 3 1.75
97 3040.4046 合成法2 合成法7 　 條件1 1013.8308 3 1.755
98 3182.5604 合成法1 合成法7 　 條件1 1061.1877 3 1.732
99 3201.6067 合成法2 合成法4 合成法7 條件1 1067.4832 3 1.767
100 3140.4807 合成法1 合成法7 　 條件1 1047.173 3 1.731
101 3196.587 合成法1 合成法7 　 條件1 1065.8611 3 1.731
102 3140.4807 合成法1 合成法7 　 條件1 1047.172 3 1.74
103 3196.587 合成法1 合成法7 　 條件1 1065.8563 3 1.729
104 2895.331 合成法1 合成法7 　 條件1 965.491 3 1.885
105 3125.5058 合成法1 合成法7 　 條件1 1042.1788 3 1.852
106 3026.378 合成法1 合成法7 　 條件1 1009.1514 3 1.744
107 2912.2754 合成法2 合成法7 　 條件1 971.142 3 1.764
108 3073.4775 合成法2 合成法4 合成法7 條件1 1024.7938 3 1.778
109 3154.5073 合成法1 合成法7 　 條件1 1051.8419 3 1.772
於下表呈示構成具有連接子結構的環狀肽胜肽-73～胜肽-109之殘基。再者，於下表中，胜肽-73～胜肽-75、胜肽-79～胜肽-83、胜肽-85、胜肽-87～胜肽-91、胜肽-95～胜肽-98、胜肽-100～胜肽-107、及胜肽-109之環狀肽之第1～11號的胺基酸殘基相當於本發明之環狀肽II中之Z aa2～Z aa12，且Z aa1不存在。第12號的半胱胺酸殘基於環狀肽中，係轉變成環形成基。環形成基係於胺羰基與連接子結構形成醯胺鍵結，該胺羰基中的NH 2被連接子結構之N末端胺基酸殘基之N末端胺基的NH取代。又，胜肽-76～胜肽-78、胜肽-84、胜肽-86、胜肽-92～胜肽-94、胜肽-99、及胜肽-108之第3及8號的HCY殘基形成雙硫鍵結。C末端之離胺酸殘基係藉由合成法7而被DBCO化。 [表9]
胜肽- 環形成基 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
73 B1a1 2NAL R S G R N W V V W V C G G G G P12P K 　 　 　
74 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G P12P K 　 　 　
75 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G D D P12P K 　
76 A1a1 2NAL R HCY G R D W HCY R W CPTG C G G G G D D P12P K 　
77 A1a1 2NAL R HCY G AGB N W HCY R W CPTG C G G G G D D D P12P K
78 A1a1 2NAL R HCY G AGB D W HCY R W CPTG C G G G G D D P12P K 　
79 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CHXG C G G G G D D P12P K 　
80 B1a1 2NAL R S G R N W V V W V C G G G G D D D P12P K
[表10]
胜肽- 環形成基 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
81 B1a1 2NAL R S G R N W V R W CPTG C G G G G P12P K 　 　 　 　
82 B1a1 2NAL R S G R N W V V W V C G G G G NMeG13 K 　 　 　 　
83 B1a1 2NAL R S G R D W V AGB W CPTG C G G G G P12P K 　 　 　 　
84 A1a1 2NAL R HCY G R N W HCY V W V C G G G G P12P K 　 　 　 　
85 B1a1 2NAL R S G R N W NLE V W CPTG C G G G G P12P K 　 　 　 　
86 A1a1 2NAL R HCY G AGB N W HCY R W CPTG C G G G G P12P K 　 　 　 　
87 B1a1 2NAL TLE S G R N W V R W CPTG C G G G G P12P K 　 　 　 　
88 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G D D D D P12P K
89 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G D D D P12P K 　
90 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G D P12P D K 　 　
91 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CHXG C G G G G D D P12P K 　 　
92 A1a1 2NAL R HCY G AGB N W HCY R W CPTG C G G G G D D P12P K 　 　
93 A1a1 2NAL R HCY G AGB N W HCY R W CPTG C G G G G D P12P K 　 　 　
94 A1a1 2NAL R HCY G AGB N W HCY R W CPTG C G G G G D P12P D K 　 　
95 B1a1 2NAL R S G R N W V R W CPTG C G G G G D D P12P K 　 　
96 B1a1 2NAL R S G R D W V R W CPTG C G G G G D P12P K 　 　 　
97 B1a1 2NAL R S G R N W V R W CPTG C G G G G D P12P K 　 　 　
98 B1a1 2NAL R S G R N W V R W CPTG C G G E G G E P12P K 　 　
99 A1a1 2NAL R HCY G R N W HCY R W CPTG C G G G G D D P12P K 　 　
100 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G P12P D D K 　 　
101 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C bAla bAla bAla bAla D D P12P K 　 　
102 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C G G G G d d P12P k 　 　
103 B1a1 2NAL R S G AGB N W V R W CPTG C bAla bAla bAla bAla d d P12P k 　 　
104 B1a1 2NAL R S G R N W NLE V W CHXG C G G G G P12P K 　 　 　 　
105 B1a1 2NAL R S G R N W NLE V W CHXG C G G G G D D P12P K 　 　
106 B1a1 2NAL R S G AGB D W V R W CPTG C G G G G D P12P K 　 　 　
107 B1a1 2NAL R S G AGB D W V R W CPTG C G G G G P12P K 　 　 　 　
108 A1a1 2NAL R HCY G AGB D W HCY R W CPTG C G G G G D P12P K 　 　 　
109 B1a1 2NAL R S G AGB N W NLE R W CPTG C G G G G D D P12P K 　 　
5.含Fc分子之製備 (1)Fc-A(LALA體)之製備 依照WO 2018/003983之實施例2-5的記載而製備Fc-A。Fc-A係為由IgG1之Fc片段所組成的部分抗體分子之Fc-B(序列識別號135)的LALA體，且N末端被延長(序列識別號137)。 (2)Fc-C(LALA-PA體)之製備 (i)Fc-C H鏈表現載體(expression vector)之建構 合成包含編碼Fc-C之胺基酸序列的核苷酸序列的DNA片段(序列識別號138)(Thermo Fisher Scientific公司)作為載體分子，該Fc-C為由人類IgG1之Fc片段所組成的部分抗體。使用所合成的DNA片段，將WO 2015/046505中記載之表現載體pCMA-LK以XbaI及PmeI消化後，使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Takara Bio USA公司製)結合，而建構Fc-C表現載體。將所得之表現載體命名為「pCMA/Fc-C」。編碼Fc-C之胺基酸序列的核苷酸序列為序列識別號165之核苷酸編號61～741(核苷酸編號1～60為編碼訊息序列的序列)。Fc-C之胺基酸序列為序列識別號139之胺基酸編號21～247之序列(胺基酸編號1～20為訊息序列)。 (ii)Fc-C之生產 FreeStyle 293F細胞(Thermo Fisher Scientific公司製)，係使用BCP型動物細胞培養裝置(Biott股份有限公司製)，以旋轉燒瓶於37℃、8%CO 2進行繼代、培養。其後的培養，係依照手冊，以WAVE BIOREACTOR(生物反應器)(GE HealthCare公司製)實施。將對數增殖期之FreeStyle 293F細胞以FreeStyle293表現培養基(Thermo Fisher Scientific公司製)稀釋，調整為2.0～2.4×10 6細胞/mL，將6L移入50L培養用WAVE袋(cytiva公司製)。然後，亦移入6L之FreeStyle293表現培養基，於37℃、8%CO 2搖動而培養一夜。於Opti-Pro SFM培養基(Thermo Fisher Scientific公司製)400mL中添加37.5mg之聚乙烯亞胺(Polysciences公司製)。然後於400mL之Opti-Pro SFM培養基中添加12.5mg之表現載體pCMA/Fc-C。於聚乙烯亞胺/Opti-Pro SFM混合液中加入表現載體/Opti-Pro SFM混合液而和緩地攪拌，進一步於靜置5分鐘之後將全量添加到FreeStyle 293F細胞培養中的50L培養用WAVE袋中。於37℃、8%CO 2搖動而培養4小時之後，添加12L之EX-CELL VPRO培養基(SAFC Biosciences公司製)、及43.4g/L之BD Recharge CD(BD Biosciences公司製)500mL，於37℃、8%CO 2搖動而培養6天。所得之培養上清液通入深層過濾器(孔徑：5μm，GE HealthCare公司製)，然後以囊匣式(capsule cartridge)過濾器(孔徑：0.45μm，ADVANTEC TOYO公司製)進行過濾。 (iii)Fc-C之純化 Fc-C之純化係以與WO 2018/003983之實施例2-4(2-4C)中所記載之Fc-B的純化法同樣的方法實施，以蛋白質A親和性層析法與陶瓷羥磷石灰的2階段步驟進行純化。
6.複合物-1～複合物-12的合成 如下表所示地，使用胜肽-13～胜肽-24而藉由後述合成法8合成複合物-1～複合物-12。複合物-1～複合物-12係各自使胜肽-13～胜肽-24與含Fc分子之Cys226及Cys229(各自為Eu索引之第226位及第229位的Cys)結合。再者，於表11～表14中，在糖鏈複合體複合物-61～複合物-97，環狀肽所接合之含Fc分子2分子藉由雙硫鍵結而交聯，成為1分子，相對於此，在馬來醯亞胺複合體複合物-1～複合物-60，含Fc分子(單體)彼此並未交聯。又，馬來醯亞胺複合體係以各式各樣種類的糖鏈不均勻地鍵結於含Fc分子而成的混合物存在，但在表11～表14中之馬來醯亞胺複合體的分子量之計算及LC-MS之測定，係排除含Fc分子的糖鏈。亦即，於馬來醯亞胺複合體的分子量之計算中，並不考慮糖鏈的分子量，而且於MS測定中，係於 LC-MS測定前進行脱糖鏈處理。 [表11]
複合物 前驅物 載體 連結基C 分子量 方法 LC-MS 條件 MS (解迴旋) Rt (分) IC 50 (nM)
1 胜肽-13 Fc-A C3 31663.4 合成法8 條件4 31662.30 2.21 205.5
2 胜肽-14 Fc-A C3 31435.2 合成法8 條件4 31434.13 2.32 207
3 胜肽-15 Fc-A C3 31207 合成法8 條件4 31205.80 2.36 116
4 胜肽-16 Fc-C C3 33949.7 合成法8 條件4 33949.09 2.39 20.1
5 胜肽-17 Fc-C C3 34069.7 合成法8 條件4 34069.23 2.37 28.75
6 胜肽-18 Fc-C C3 33949.7 合成法8 條件4 33948.96 2.39 38.15
7 胜肽-19 Fc-C C3 33949.7 合成法8 條件4 33949.19 2.38 21.95
8 胜肽-20 Fc-C C3 34061.9 合成法8 條件4 34061.42 2.43 38.2
9 胜肽-21 Fc-C C3 34061.9 合成法8 條件4 34061.50 2.42 43.55
10 胜肽-22 Fc-C C3 34069.7 合成法8 條件4 34069.45 2.36 12.75
11 胜肽-23 Fc-C C3 34069.7 合成法8 條件4 34069.38 2.36 17.0
12 胜肽-24 Fc-C C3 34061.9 合成法8 條件4 34061.25 2.42 44.65
7.複合物-13～複合物-97的合成 如下表所示地，使用胜肽-25～胜肽-109(由環狀肽及連接子結構所組成的化合物)，而藉由後述合成法9或合成法10合成複合物-13～複合物-97。複合物-13～複合物-60係各自使胜肽-25～胜肽-72與含Fc分子之Cys226及Cys229(各自為Eu索引之第226位及第229位的Cys)結合。又，複合物-61～複合物-97中之含Fc分子之N297結合糖鏈被糖鏈重塑為N297-(Fuc)SG。再者，相當於複合物-65、74、及80～82之環狀肽部分的環狀肽為胜肽-1。相當於複合物-64之環狀肽部分的環狀肽為胜肽-11。相當於複合物-66及96之環狀肽部分的環狀肽為胜肽-9。相當於複合物-72之環狀肽部分的環狀肽為胜肽-6。相當於複合物-87之環狀肽部分的環狀肽為胜肽-10。如下所示，將相當於其他複合體之環狀肽部分的環狀肽稱為胜肽-110～124。 複合物-13、61、68、70：胜肽-110 複合物-14：胜肽-111 複合物-69、83、85、86：胜肽-112 複合物-29、97：胜肽-113 複合物-73：胜肽-114 複合物-15～20、42～47、53～57、62、63、76～78、88～91：胜肽-115 複合物-21、22、92、93：胜肽-116 複合物-75：胜肽-117 複合物-71：胜肽-118 複合物-23、24、94、95：胜肽-119 複合物-25、26：胜肽-120 複合物-27、31～41、48～52、58～60、67：胜肽-121 複合物-79：胜肽-122 複合物-28、30：胜肽-123 複合物-84：胜肽-124 [表12]
複合物 前驅物 載體 連結基C 分子量 方法 LC-MS 條件 MS (解迴旋) Rt (分) IC 50 (nM)
13 胜肽-25 Fc-A C3 30742.5 合成法9 條件4 30741.70 2.19 36.5
14 胜肽-26 Fc-A C3 30856.6 合成法9 條件4 30855.70 2.06 12.8
15 胜肽-27 Fc-A C3 31341 合成法9 條件4 31340.20 2.09 23.7
16 胜肽-28 Fc-A C3 30880.6 合成法9 條件4 30880.00 2.11 11.7
17 胜肽-29 Fc-A C3 31341 合成法9 條件4 31340.00 2.21 24.9
18 胜肽-30 Fc-A C3 3145.3 合成法9 條件4 31452.00 2.2 23.5
19 胜肽-31 Fc-A C3 31341 合成法9 條件4 31340.00 2.21 52.6
20 胜肽-32 Fc-A C3 31453.2 合成法9 條件4 31452.60 2.18 31.9
21 胜肽-33 Fc-A C3 30860.6 合成法9 條件4 30849.70 2.53 41.0
22 胜肽-34 Fc-A C3 31311 合成法9 條件4 31310.20 2.5 43.8
23 胜肽-35 Fc-A C3 31112.8 合成法9 條件4 31111.80 2.23 34.9
24 胜肽-36 Fc-A C3 30884.6 合成法9 條件4 30883.70 2.27 56.5
25 胜肽-37 Fc-A C3 30822.6 合成法9 條件4 30821.5 2.56 40.6
26 胜肽-38 Fc-A C3 31283 合成法9 條件4 31282.6 2.53 115.0
27 胜肽-39 Fc-A C3 31397 合成法9 條件4 31396 2.38 79.8
28 胜肽-40 Fc-A C3 31141 合成法9 條件4 31140.1 2.32 97.3
29 胜肽-41 Fc-A C3 31371 合成法9 條件4 31368 2.3 30.3
30 胜肽-42 Fc-A C3 31140.8 合成法9 條件4 31140 2.34 36.5
31 胜肽-43 Fc-C C3 32459.9 合成法9 條件4 32459.4 2.34 44.2
32 胜肽-44 Fc-C C3 32601.9 合成法9 條件4 32601.4 2.31 35.2
33 胜肽-45 Fc-C C3 32713.9 合成法9 條件4 32713.8 2.31 27.3
34 胜肽-46 Fc-C C3 32721.9 合成法9 條件4 32721.6 2.27 25.2
35 胜肽-47 Fc-C C3 32657.9 合成法9 條件4 32657.5 2.28 31.2
36 胜肽-48 Fc-C C3 32601.9 合成法9 條件4 32601.6 2.29 24.7
37 胜肽-49 Fc-C C3 32601.9 合成法9 條件4 32601.5 2.3 22.0
38 胜肽-50 Fc-C C3 32601.9 合成法9 條件4 32601.6 2.28 16.5
39 胜肽-51 Fc-C C3 33833.5 合成法9 條件4 33883 2.41 31.6
40 胜肽-52 Fc-C C3 33833.5 合成法9 條件4 33883 2.4 30.1
41 胜肽-53 Fc-C C3 33833.5 合成法9 條件4 33883 2.41 28.6
42 胜肽-54 Fc-C C3 33827.5 合成法9 條件4 33827 2.26 16.9
43 胜肽-55 Fc-C C3 33827.5 合成法9 條件4 33827 2.25 15.9
44 胜肽-56 Fc-C C3 33827.5 合成法9 條件4 33826.9 2.26 20.1
45 胜肽-57 Fc-C C3 31488.7 合成法9 條件4 31488.1 2.05 16.2
46 胜肽-58 Fc-C C3 31488.7 合成法9 條件4 31288.2 2.05 14.5
47 胜肽-59 Fc-C C3 31488.7 合成法9 條件4 31488.2 2.05 11.8
48 胜肽-60 Fc-C C3 37386.3 合成法9 條件4 37385.7 2.21 27.0
49 胜肽-61 Fc-C C3 37386.3 合成法9 條件4 37385.7 2.21 26.9
50 胜肽-62 Fc-C C3 36926.1 合成法9 條件4 36925.2 2.25 21.2
51 胜肽-63 Fc-C C3 36926.1 合成法9 條件4 36925.2 2.28 15.7
52 胜肽-64 Fc-C C3 36926.1 合成法9 條件4 36925.1 2.28 26.7
53 胜肽-65 Fc-C C3 37330.3 合成法9 條件4 37329.5 2.09 12.2
54 胜肽-66 Fc-C C3 37330.3 合成法9 條件4 37329.6 2.08 11.3
55 胜肽-67 Fc-C C3 37330.3 合成法9 條件4 37329.5 2.1 14.0
56 胜肽-68 Fc-C C3 36869.9 合成法9 條件4 36869.2 2.12 6.4
57 胜肽-69 Fc-C C3 36869.9 合成法9 條件4 36869.4 2.1 6.9
58 胜肽-70 Fc-C C3 33995.7 合成法9 條件4 33995.4 2.42 23.7
59 胜肽-71 Fc-C C3 34003.7 合成法9 條件4 34003.2 2.39 22.1
60 胜肽-72 Fc-C C3 34003.7 合成法9 條件4 34003.2 2.38 21.9
[表13]
複合物 前驅物 載體 連結基C 分子量 方法 LC-MS  條件 MS (解迴旋) Rt (分) IC 50(nM)
61 胜肽-73 Fc-A C1,C2 67770.8 合成法10 條件3 33767.81 2.17 25.1
62 胜肽-74 Fc-A C1,C2 67804.2 合成法10 條件2 67804.21 2.17 7.1
63 胜肽-75 Fc-A C1,C2 68724.9 合成法10 條件2 68724.88 2.17 14.0
64 胜肽-76 Fc-A C1,C2 68970.4 合成法10 條件2 68968.15 2.26 15.8
65 胜肽-77 Fc-A C1,C2 69369.8 合成法10 條件2 69370.16 2.25 26.3
66 胜肽-78 Fc-A C1,C2 68914.3 合成法10 條件2 68912.06 2.48 36.5
67 胜肽-79 Fc-A C1,C2 68838 合成法10 條件2 68837.88 2.53 44.6
68 胜肽-80 Fc-A C1,C2 68909 合成法10 條件3 34459.22 2.11 451.1
[表14]
複合物 前驅物 載體 連結基C 分子量 方法 LC-MS 條件 MS (解迴旋) Rt (分) IC 50(nM)
69 胜肽-81 Fc-A C1,C2 67860.2 合成法10 條件2 67860.70 2.17 5.1
70 胜肽-82 Fc-A C1,C2 68825 合成法10 條件2 68824.60 2.19 32.1
71 胜肽-83 Fc-A C1,C2 67809.2 合成法10 條件2 67807.50 2.22 9.3
72 胜肽-84 Fc-A C1,C2 67712.6 合成法10 條件2 67712.80 2.36 14.3
73 胜肽-85 Fc-A C1,C2 67688.2 合成法10 條件2 67688.13 2.56 13.3
74 胜肽-86 Fc-A C1,C2 67988.6 合成法10 條件2 67989.11 2.35 15.8
75 胜肽-87 Fc-A C1,C2 67688.2 合成法10 條件2 67689.11 2.34 11.4
76 胜肽-88 Fc-A C1,C2 69645 合成法10 條件2 69646.95 2.16 14.5
77 胜肽-89 Fc-A C1,C2 69185.4 合成法10 條件2 69185.945 2.18 26.9
78 胜肽-90 Fc-A C1,C2 68725 合成法10 條件2 68725.5 2.17 9.2
79 胜肽-91 Fc-A C1,C2 68781 合成法10 條件2 68780.859 2.2 17.1
80 胜肽-92 Fc-A C1,C2 68909.4 合成法10 條件2 68908.984 2.25 11.2
81 胜肽-93 Fc-A C1,C2 68449 合成法10 條件2 68449.875 2.27 10.2
82 胜肽-94 Fc-A C1,C2 68909.4 合成法10 條件2 68910.289 2.25 10.2
83 胜肽-95 Fc-A C1,C2 68782 合成法10 條件2 68780.68 2.08 9.5
84 胜肽-96 Fc-A C1,C2 68326 合成法10 條件2 68325.148 2.15 8.1
85 胜肽-97 Fc-A C1,C2 68326 合成法10 條件2 68323.922 2.16 7.1
86 胜肽-98 Fc-A C1,C2 68894 合成法10 條件2 68893.117 2.1 8.5
87 胜肽-99 Fc-A C1,C2 68970 合成法10 條件2 68969.18 2.26 15.7
88 胜肽-100 Fc-A C1,C2 68726 合成法10 條件2 68724.961 2.27 17.3
89 胜肽-101 Fc-A C1,C2 68950.4 合成法10 條件2 68948.516 2.26 18.3
90 胜肽-102 Fc-A C1,C2 68726 合成法10 條件2 68724.57 2.26 41.5
91 胜肽-103 Fc-A C1,C2 68950.4 合成法10 條件2 68948.234 2.24 22.9
92 胜肽-104 Fc-A C1,C2 67745.2 合成法10 條件2 67743.961 2.67 35.6
93 胜肽-105 Fc-A C1,C2 68666 合成法10 條件2 68664.492 2.63 73.4
94 胜肽-106 Fc-A C1,C2 68269.6 合成法10 條件2 68269.688 2.38 31.4
95 胜肽-107 Fc-A C1,C2 67813.2 合成法10 條件2 67812.203 2.42 28.1
96 胜肽-108 Fc-A C1,C2 68458 合成法10 條件2 68457.031 2.53 44.8
97 胜肽-109 Fc-A C1,C2 68782 合成法10 條件2 68781.586 2.45 47.2
合成法1 使用自動合成機Syro II(Biotage Japan公司)，依照使用9-茀基甲基氧基羰基(Fmoc基)作為α胺基的保護基之一般的固相合成法進行。 將Rink Amide Resin AM(Novaviochem公司)88μmol當量加入反應用容器，在1-甲基-2-吡咯啶酮中，將O-(7-氮雜苯並三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、N,N-二異丙胺、及以Fmoc基所保護之胺基酸各自加入3當量而使反應進行。 Fmoc基的脫保護係以20%哌啶/1-甲基-2-吡咯啶酮進行。 連結N末端的胺基酸，且將Fmoc基脫保護之後，在1-甲基-2-吡咯啶酮中，將N,N-二異丙基碳二亞胺、1-羥基-7-氮雜苯並三唑(HOAt)、及氯乙酸各自加入3當量而使反應進行。 所得之肽樹脂以1-甲基-2-吡咯啶酮清洗3次，以二氯甲烷清洗3次而進行乾燥，加入三氟乙酸-乙二硫醇-三異丙基矽烷-水(以體積比92.5: 2.5: 2.5: 2.5)2mL而在室溫攪拌3小時。 藉由醚沉澱而回收被切斷的粗肽，以三級丁基甲基醚清洗2次而進行乾燥之後，溶解於二甲基亞碸(8mL)中，加入正丙胺(80μL)而靜置整夜。加入乙酸(80μL)之後，以V10(Biotage Japan公司)濃縮反應液，以使用Kinetex5u XB-C18(150×21.2mm，Phenomenex公司)的逆相高效能液相層析法純化目的物。使用含0.1%三氟乙酸之水-乙腈作為移動相。將目的物之餾分冷凍乾燥，而以三氟乙酸鹽的形式得到目的物。
合成法2 將2-氯三苯甲基氯樹脂(100-200網眼)、1%DVB(MERCK公司)之88μmol當量加入反應用容器，使其懸浮於二氯甲烷2mL而使樹脂膨潤。抽氣過濾後，加入樹脂可攜帶之以Fmoc基所保護的胺基酸1.5當量的二氯甲烷溶液1.5mL之後，加入N,N-二異丙胺5當量而進行攪拌。進行過濾，以二氯甲烷/甲醇/N,N-二異丙胺=17/2/1的混合溶液清洗樹脂。其後的胺基酸延伸，係使用自動合成機Syro II(Biotage Japan公司)，依照使用9-茀基甲氧羰基(Fmoc基)作為α胺基的保護基之一般的固相合成法進行。在1-甲基-2-吡咯啶酮中，將O-(7-氮雜苯並三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、N,N-二異丙胺、以Fmoc基所保護之胺基酸各自加入3當量而使反應進行。 Fmoc基的脫保護係以20%哌啶/1-甲基-2-吡咯啶酮進行。 連結N末端的胺基酸，且將Fmoc基脫保護之後，在1-甲基-2-吡咯啶酮中，將N,N-二異丙基碳二亞胺、1-羥基-7-氮雜苯並三唑(HOAt)、氯乙酸各自加入3當量而使反應進行。 將所得之肽樹脂以1-甲基-2-吡咯啶酮清洗3次，以二氯甲烷清洗3次而進行乾燥，加入三氟乙酸-乙二硫醇-三異丙基矽烷-水(以體積比92.5: 2.5: 2.5: 2.5)2mL而在室溫攪拌3小時。 藉由醚沉澱而回收被切斷的粗肽，以三級丁基甲基醚清洗2次而進行乾燥，溶解於二甲基亞碸(8mL)中，加入正丙胺(80μL)而靜置整夜。加入乙酸(80μL)之後，以V10(Biotage Japan公司)濃縮反應液，以使用Kinetex5u XB-C18(150×21.2mm，Phenomenex公司)的逆相高效能液相層析法純化目的物。使用含0.1%三氟乙酸之水-乙腈作為移動相。將目的物之餾分冷凍乾燥，而以三氟乙酸鹽的形式得到目的物。
合成法3 使用自動合成機Syro II(Biotage Japan公司)，依照使用9-茀基甲氧羰基(Fmoc基)作為α胺基的保護基之一般的固相合成法進行。 將Rink Amide Resin AM(Novaviochem公司)之88μmol當量加入反應用容器，在1-甲基-2-吡咯啶酮中，將O-(7-氮雜苯並三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、N,N-二異丙胺、及以Fmoc基所保護之胺基酸或PEG O11A各自加入3當量而使反應進行。 Fmoc基的脫保護係以20%哌啶/1-甲基-2-吡咯啶酮進行。 對ε胺基被(4,4-二甲基-2,6-二氧環己基-1-亞基)-3-甲基丁基(ivDde基)所保護的Lys之α胺基導入O11A之後，依照以下的方法進行ivDde基的脫保護。 在固相上之ivDde基的切斷係以3%聯胺/二甲基甲醯胺進行。對於肽樹脂100mg加入1mL之3%聯胺/二甲基甲醯胺而進行攪拌。反覆進行此操作3次，以去除ivDde基。接著，與上述同樣的方法延伸肽鏈。 連結N末端的胺基酸，且將Fmoc基脫保護之後，在1-甲基-2-吡咯啶酮中，將N,N-二異丙基碳二亞胺、1-羥基-7-氮雜苯並三唑(HOAt)、氯乙酸各自加入3當量而使反應進行。 將所得之肽樹脂以1-甲基-2-吡咯啶酮清洗3次，以二氯甲烷清洗3次而進行乾燥，加入三氟乙酸-乙二硫醇-三異丙基矽烷-水(以體積比92.5: 2.5: 2.5: 2.5)2mL而在室溫攪拌3小時。 藉由醚沉澱而回收被切斷的粗肽，以三級丁基甲基醚清洗2次而進行乾燥之後，溶解於二甲基亞碸(8mL)中，加入正丙胺(80μL)而靜置整夜。加入乙酸(80μL)之後，以V10(Biotage Japan公司)濃縮反應液，以使用Kinetex5u XB-C18(150×21.2mm，Phenomenex公司)的逆相高效能液相層析法純化目的物。使用含0.1%三氟乙酸之水-乙腈作為移動相。將目的物之餾分冷凍乾燥，而以三氟乙酸鹽的形式得到目的物。 PEG O11A
合成法4 將5μmol之肽溶解於乙酸1.4mL中。於其中加入25mg/mL碘/乙酸溶液300μL而進行攪拌。以HPLC確認原料消失之後，加入200mg/mL抗壞血酸水溶液300μL而使反應停止。以V10(Biotage Japan公司)濃縮反應液，以使用Kinetex5u XB-C18(150×21.2mm，Phenomenex公司)的逆相高效能液相層析法純化目的物。使用含0.1%三氟乙酸之水-乙腈作為移動相。將目的物之餾分冷凍乾燥，而以三氟乙酸鹽的形式得到目的物。
合成法5 將SGA 1.15當量溶解於二甲基甲醯胺300μL中，對其添加O-(N-琥珀醯亞胺基)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸鹽1.15當量、N,N-二異丙基乙基胺4.6當量而攪拌1小時。將5μmol之肽溶解於二甲基甲醯胺200μL中，且添加N,N-二異丙基乙基胺4.6當量。對其加入SGA的反應溶液而進行攪拌。以HPLC確認原料消失之後，加入聯胺一水合物18.5μL而進行攪拌。以HPLC確認原料消失之後，以使用Kinetex5u XB-C18(150×21.2mm，Phenomenex公司)的逆相高效能液相層析法純化目的物。使用含0.1%三氟乙酸之水-乙腈作為移動相。將目的物之餾分冷凍乾燥，而以三氟乙酸鹽的形式得到目的物。 SGA
合成法6 將5μmol之肽溶解於二甲基甲醯胺250μL中。然後將3-馬來醯亞胺丙酸-N-琥珀醯亞胺酯1.5當量溶解於二甲基甲醯胺400μL中，往肽溶液加入。在最後加入N,N-二異丙基乙基胺2μL，使反應進行。以HPLC確認原料消失之後，以使用Kinetex5u XB-C18(150×21.2mm，Phenomenex公司)的逆相高效能液相層析法純化目的物。使用含0.1%三氟乙酸之水-乙腈作為移動相。將目的物之餾分冷凍乾燥，而以三氟乙酸鹽的形式得到目的物。
合成法7 將5μmol之肽溶解於二甲基甲醯胺250μL中。然後將二苯并環辛炔-N-羥基琥珀醯亞胺酯1.5當量溶解於二甲基甲醯胺800μL中，往肽溶液加入。在最後加入N,N-二異丙基乙基胺2μL，使反應進行。以HPLC確認原料消失之後，以使用Kinetex5u XB-C18(150×21.2mm，Phenomenex公司)的逆相高效能液相層析法純化目的物。使用含0.1%三氟乙酸之水-乙腈作為移動相。將目的物之餾分冷凍乾燥，而以三氟乙酸鹽的形式得到目的物。
合成法8 於10.2mg/ml Fc溶液(5%山梨醇/10mM乙酸緩衝液(pH5.5))(1.2ml)中加入10mg/mL三(2-羧乙基)膦(TCEP)鹽酸鹽溶液(5%山梨醇/10mM乙酸緩衝液(pH5.5))(28μL)，還原鉸鏈部分之雙硫鍵結。反應結束後，以NAP25(GE HealthCare製)、(5%山梨醇/10mM乙酸緩衝液(pH5.5))除去未反應之TCEP。然後加入馬來醯亞胺化肽(8當量)的二甲基亞碸溶液，於30℃保溫1小時。以NAP25(GE HealthCare製)、(5%山梨醇/10mM乙酸緩衝液(pH5.5))將反應液粗純化。以下述條件的疏水性交互作用層析法確認反應進行的狀況後，以Amicon Ultra-15(30K)(MERCK公司)進行緩衝液交換，除去未反應之肽。
合成法9 於10.2mg/ml Fc溶液(5%山梨醇/10mM乙酸緩衝液(pH5.5))(1.2ml)中加入10mg/mL三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽溶液(5%山梨醇/10mM乙酸緩衝液(pH5.5))(28μL)，還原鉸鏈部分之雙硫鍵結。反應結束後，加入馬來醯亞胺化肽(8當量)的二甲基亞碸溶液，於30℃保溫1小時。以NAP25(GE HealthCare製)、(5%山梨醇/10mM乙酸緩衝液(pH5.5))將反應液粗純化。以下述條件的疏水性交互作用層析法確認反應進行的狀況後，以Amicon Ultra-15(30K)進行緩衝液交換，除去未反應之肽。
合成法10 於包含有依照WO2018/003983而經糖鏈重塑之SG型N297結合糖鏈(疊氮基被導入非還原末端的唾液酸)附加之Fc的溶液(5.00mg/mL)(5%山梨醇/10mM乙酸緩衝液(pH5.5))(7.74ml)中，加入DBCO化肽(7當量)的二甲基亞碸溶液(1.93ml)，於30℃保溫16小時。以NAP25(GE HealthCare製)、(5%山梨醇/10mM乙酸緩衝液(pH5.5))將反應液粗純化。以下述條件的疏水性交互作用層析法確認反應進行的狀況後，以Amicon Ultra-15(30K)進行緩衝液交換，除去未反應之肽。再者，合成方法10中所得到的複合體中之含Fc分子之N297結合糖鏈，為N297-(Fuc)SG。
合成法11 將44μmol之肽溶解於水29.17mL中。於其中加入乙酸銀292mg而在室溫攪拌3小時。以LC/MS確認原料消失之後，加入10mg/mL(±)-二硫蘇糖醇/含0.1%三氟乙酸之水-乙腈(1:1)混合溶液40.44mL而使反應停止。將所產生的懸浮液移至離心管(Falcon cube)，進行離心分離(2500rpm，5分鐘)。回收上清液之後，以含0.1%三氟乙酸之水-乙腈(1:1)混合溶液10mL使沉澱再度懸浮，且進行離心分離(2500rpm，5分鐘)而回收上清液。再次進行此清洗/回收操作。將所回收的上清液集中，進行冷凍乾燥，並將所得之粗製物供至中壓逆相急速層析法，純化目的物。管柱使用通用管柱ODS-SM(50μm、3.0×16.5cm、37g，山善股份有限公司)，移動相使用含0.1%三氟乙酸之水-乙腈。將目的物之餾分冷凍乾燥，而以三氟乙酸鹽的形式得到目的物。
合成法12 將5μmol之肽溶解於水-乙腈(1:1)混合溶液5.24mL中。於其中加入三乙胺14.5μL而在室溫攪拌2天。以LC/MS、HPLC確認原料消失之後，將反應溶液直接藉由中壓逆相急速層析法進行純化。管柱使用通用管柱ODS-SM(50μm、3.0×16.5cm、37g，山善股份有限公司)，移動相使用含0.1%三氟乙酸之水-乙腈。將目的物之餾分冷凍乾燥，而以三氟乙酸鹽的形式得到目的物。
合成法13 將6μmol之肽溶解於水5.95mL、四氫呋喃1.19mL之混合溶液中。於其中加入三乙胺16.5μL與二碘甲烷3.8μL而在室溫攪拌7小時。以LC/MS、HPLC確認原料消失之後，將反應溶液冷凍乾燥。將所得之粗製物供至中壓逆相急速層析法，純化目的物。管柱使用通用管柱ODS-SM(50μm、3.0×16.5cm、37g，山善股份有限公司)，移動相使用含0.1%三氟乙酸之水-乙腈。將目的物之餾分冷凍乾燥，而以三氟乙酸鹽的形式得到目的物。
合成法14 將9μmol之肽溶解於50mM之碳酸氫銨水溶液8.96mL中。將1,3-二氯丙酮3.4mg溶解於DMF 1mL中，將其加入肽溶液中而在室溫攪拌3小時。以LC/MS確認原料消失之後，將反應溶液冷凍乾燥。將所得之粗製物供至中壓逆相急速層析法，純化目的物。管柱使用通用管柱ODS-SM(50μm、3.0×16.5cm、37g，山善股份有限公司)，移動相使用含0.1%三氟乙酸之水-乙腈。將目的物之餾分冷凍乾燥，而以三氟乙酸鹽的形式得到目的物。
LC-MS條件1 使用Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS(Agilent Tecnology公司)進行測定。 管柱：Kinetex 1.7u XB-C18(50×2.1mm) 移動相：A: 0.1%TFA-水　B: 0.1%TFA-乙腈 溫度：40℃ 流速：0.6ml/分鐘 梯度：0.01分(B10%)、0.33分(B10%)、0.34分(B20%)、0.66分(B20%)、0.67分(B30%)、0.99分(B30%)、1.00分(B40%)、1.33分(B40%)、1.34分(B50%)、1.66分(B50%)、1.67分(B80%)、2.50分(B80%)
LC-MS條件2 使用LC：Ultimate3000(Thermo Fisher)、MS：Q-Exactive(Thermo Fisher)進行測定。於測定前，加入與試料溶液等量的8M-胍-HCl，於37℃使反應進行30分鐘之後，進行測定。 管柱：PLRP-S 1000A 8μm 2.1×50mm(Agilent) 移動相：A: H 2O(0.02%TFA、0.1%HCO 2H)B:乙腈 溫度：60℃ 流速：0.6ml/分鐘 梯度：0分(B20%)、4分(B50%)、4.2分(B50%)
LC-MS條件3 使用LC：Ultimate3000(Thermo Fisher)、MS：Q-Exactive(Thermo Fisher)進行測定。於測定前，加入與試料溶液等量的8M-胍-HCl及TCEP(終濃度10mM)，於37℃使反應進行30分鐘之後，進行測定。 管柱：PLRP-S 1000A 8μm 2.1×50mm(Agilent) 移動相：A: H 2O(0.02%TFA、0.1%HCO 2H)B:乙腈 溫度：60℃ 流速：0.6ml/分鐘 梯度：0分(B20%)、4分(B50%)、4.2分(B50%)
LC-MS條件4 使用LC：Ultimate3000(Thermo Fisher)、MS：Q-Exactive(Thermo Fisher)進行測定。於測定前，於試料溶液16uL中加入Rapid PNGase F緩衝液(非還原型式)4uL，使其於90℃反應3分鐘。接著，加入Rapid PNGase F 1uL，使其於50℃反應10分鐘後，進行測定。 管柱：PLRP-S 1000A 8μm 2.1×50mm(Agilent) 移動相：A: H 2O(0.02%TFA、0.1%HCO 2H)B:乙腈 溫度：60℃ 流速：0.6ml/分鐘 梯度：0分(B20%)、4分(B50%)、4.2分(B50%)
[試驗例1] 細胞黏著抑制試驗(Cell adhesion inhibition assay) 1.材料/試藥 ・384孔低邊黑色平底聚苯乙烯未處理微孔盤(Corning，3573) ・PROTEOSAVE(註冊商標)SS 15mL(住友Bakelite MS-52150) ・血小板反應蛋白(Thrombospondin)人類血小板(Calbiochem 605225) ・HUVEC (KURABO KE-4109P10) ・EGM-2 MV (Lonza, CC-3202): HUVEC繼代用 ・膠原蛋白塗覆培養皿(IWAKI 4020-010)：HUVEC繼代用 ・Lipidure(註冊商標)-BL802(日油)5%溶液 ・DMEM低葡萄糖(GIBCO 11054-020) ・牛血清白蛋白(BSA)溶液30%(Sigma A9205) ・CellTiter-Glo 2.0(Promega G9242)
2.試驗 ＜盤塗覆(Plate coat)＞ 將血小板反應蛋白-1小瓶(25μg)溶解於Tris緩衝生理食鹽水(TBS)(+2mM CaCl 2，以下皆同)中，製備200μg/ml溶液，以TBS在PROTEOSAVE(註冊商標)15mL管中稀釋，使其成為10μg/mL。將10μg/mL溶液以12μL/孔分注於384孔盤中，於4℃靜置一夜。 ＜盤阻斷(Plate blocking)＞ 製備以TBS將Lipidure(註冊商標)稀釋10倍的0.5%溶液。丟棄上述＜盤塗覆＞中已塗覆好之盤的緩衝液，將0.5%溶液以25μL/孔分注於所使用之全部的孔中，在室溫靜置1小時。 ＜試樣之稀釋＞ 使用稀釋緩衝液(DMEM+0.5%BSA)，針對各試樣製備0.2μM溶液。將0.2μM溶液2μL以稀釋緩衝液500μL稀釋，製備稀釋試樣。使用DMSO作為媒劑對照，與試樣同樣地進行稀釋。 ＜試樣分注＞ 丟棄上述＜盤阻斷＞之盤的阻斷液，以TBS 50μL/孔清洗3次。除去第3次的清洗液，以10μL/孔分注稀釋試樣，在室溫靜置15～30分鐘。 ＜HUVEC接種＞ 於人類臍帶靜脈內皮細胞HUVEC之維持，係使用EGM2-MV、膠原蛋白塗覆培養皿(增殖會在10～11繼代降低，因此在那時結束使用)。以0.05%胰蛋白酶EDTA使細胞分散，以DMEM 0.5%BSA回收，並以1000 rpm離心3分鐘。除去上清液，使細胞再懸浮於DMEM緩衝液中，計算細胞數，並稀釋為6000個細胞/10μL。將細胞懸浮液以10μL/孔分注於已分注試樣之盤中，輕輕地混合，於37℃保溫2.5小時。 ＜清洗/偵測＞ 除去培養基，以30μL/孔之HBSS/Hepes 0.5%BSA清洗2次。以20μL/孔分注以HBSS/Hepes 0.5%BSA稀釋2倍的CellTiter-Glo 2.0(註冊商標)，攪拌之後，在室溫靜置15分鐘。利用EnVision Xcite Multilabel Reader(Perkin Elmer公司)而偵測發光。
3.結果 針對各環狀肽及複合體引起的細胞黏著抑制，從發光的測定值來計算IC50(nM)。再者，在糖鏈複合體複合物-61～複合物-97，環狀肽所接合的含Fc分子2分子藉由雙硫鍵結而交聯，成為1分子，相對於此，在馬來醯亞胺複合體複合物-1～複合物-60，含Fc分子(單體)彼此並未交聯。所以，於IC50(nM)之計算中的馬來醯亞胺複合體之莫耳濃度，係為了與糖鏈複合體的比較，而使用單體的分子量之2倍的數值。又，由於馬來醯亞胺複合體為各式各樣種類的糖鏈不均勻地鍵結於含Fc分子而成的混合物，因此使用脫糖鏈體的分子量進行計算。 於表2及11～14呈示所得之結果。由上述試驗結果顯示：胜肽-1～胜肽-12、胜肽-115、胜肽-119及胜肽-125～胜肽-139、以及複合物-1～複合物-97具有TSP1與血管內皮細胞的黏著抑制作用，有用於嚴重肢體缺血、周邊動脈疾病或慢性肢體威脅性缺血之治療或預防。
[試驗例2] 血流改善測定試驗 從Charles River Laboratories Japan, Inc.購入6-7週齡的C57BL/6小鼠，供給FR-2固形飼料(Funabasi Farm Co.)，使其進行馴化6天以上。飼育室係進行下午7時熄燈、上午7時點燈之12小時週期的明暗切換。於異氟醚吸入麻醉下，切開小鼠的左大腿部，將淺股動脈及靜脈(從深股動脈的正下方到膕動脈及靜脈為止)結紮並切除。製作模型後，將受試物質(複合物-4、複合物-10、複合物-27、複合物-34、複合物-43、複合物-56、複合物-63、複合物-64、複合物-67)溶解於10mM醋酸鹽緩衝液5%山梨醇(pH5.5)中，以5mL/kg的用量進行單次靜脈內投予。針對各投予群使用5隻小鼠。
(試驗1) 媒劑投予群 複合物-63(0.3、1、3mg/kg)投予群 試驗期間：20日 (試驗2) 媒劑投予群 複合物-64(0.3、1、3mg/kg)投予群 試驗期間：16日 (試驗3) 媒劑投予群 複合物-67(0.3、1mg/kg)投予群 試驗期間：13日 (試驗4) 媒劑投予群 複合物-27(1、3mg/kg)投予群 試驗期間：13日 (試驗5) 媒劑投予群 複合物-34(0.3、1mg/kg)投予群 複合物-43(0.3、1mg/kg)投予群 試驗期間：15日 (試驗6) 媒劑投予群 複合物-56(0.3、1mg/kg)投予群 複合物-4(0.3、1mg/kg)投予群 複合物-10(0.3、1mg/kg)投予群 試驗期間：14日
使用雷射都卜勒血流影像化裝置(PeriScan PIM III、Moor LD12-HR)，測定缺血肢(左)及非缺血肢(右)的血流。以缺血肢對非缺血肢之比來評價血流之改善。數值係以5隻的測定值之平均值±標準誤差表示。又，計算血流AUC，求出受試物質投予群的平均值對媒劑投予群的平均值之比例(%)。 小鼠的血流在手術後即刻呈示最低值，然後，經時性地恢復。藉由以本動物模型所探討之受試物質的處置，係與媒劑處置比較而手術後的血流恢復更為改善。於表15呈示測定最終日的血流(%)及測定從開始到結束為止的血流AUC(vs.媒劑投予群)之結果。 [表15]
　 %、缺血/非缺血 %改變AUC (vs.媒劑)
試驗1 媒劑投予群 19.8 ± 3.2 　
複合物-63投予群(0.3mg/kg) 38.3 ± 9.9 201.4
複合物-63投予群(1mg/kg) 54.6 ± 15.9 304.4
複合物-63投予群(3mg/kg) 89.8 ± 13.9 371.4
試驗2 媒劑投予群 22.2 ± 5.7 　
複合物-64投予群(0.3mg/kg) 43.2 ± 4.6 217.2
複合物-64投予群(1mg/kg) 70.5 ± 3.7 319.2
複合物-64投予群(3mg/kg) 67.6 ± 10.9 338.6
試驗3 媒劑投予群 19.1 ± 4.6 　
複合物-67投予群(0.3mg/kg) 86.4 ± 21.3 244.4
複合物-67投予群(1mg/kg) 75.5 ± 5.2 304.3
試驗4 媒劑投予群 20.6 ± 2.5 　
複合物-27投予群(1mg/kg) 23.4 ± 4.4 110.2
複合物-27投予群(3mg/kg) 41.8 ± 4.7 174.8
試驗5 媒劑投予群 20.0 ± 2.5 　
複合物-34投予群(0.3mg/kg) 46.3 ± 4.9 199.0
複合物-34投予群(1mg/kg) 71.9 ± 6.2 349.0
複合物-43投予群(0.3mg/kg) 50.5 ± 4.2 227.0
複合物-43投予群(1mg/kg) 70.7 ± 10.1 347.7
試驗6 媒劑投予群 15.2 ± 3.0 　
複合物-56投予群(0.3mg/kg) 40.2 ± 5.6 187.6
複合物-56投予群(1mg/kg) 74.8 ± 11.0 318.4
複合物-4投予群(0.3mg/kg) 54.5 ± 10.2 263.9
複合物-4投予群(1mg/kg) 76.1 ± 11.2 346.8
複合物-10投予群(0.3mg/kg) 42.3 ± 7.2 241.8
複合物-10投予群(1mg/kg) 51.6 ± 2.5 324.1
[試驗例3] 血清安定性試驗 I.材料/試藥 ・小鼠血清(BALB/c CrSlc，雄性，日本SLC) ・猴血清(食蟹猴 雄性，日本SLC) ・人類血清(高加索人，男性5名、女性5名之群，KAC Co., Ltd.) ・非那西汀(NACALAI TESQUE, INC.) ・尼氟滅酸(Niflumic acid)(NACALAI TESQUE, INC.) ・呋塞米(Furosemide)(NACALAI TESQUE, INC.) ・乙腈(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) ・甲醇(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) ・甲酸(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) ・二甲亞碸(DMSO)(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)
II.評價 ＜內部標準(IS)溶液＞ 將非那西汀、尼氟滅酸及呋塞米以DMSO各自製備10μg/ml、150μg/ml及200μg/ml溶液。將非那西汀10μg/ml DMSO溶液、尼氟滅酸150μg/ml DMSO溶液、呋塞米200μg/ml DMSO溶液溶解於乙腈/甲醇混液(75/25,v/v)中(終濃度：非那西汀：1ng/mL，尼氟滅酸：15ng/mL，呋塞米20ng/mL)，於所製備的試液中加入甲酸(終濃度：1%(v/v))，製備含甲酸之IS溶液。 ＜受試物質溶液＞ 將受試物質以DMSO各自製備成10mM。進一步以DMSO稀釋成2mM，作為受試物質溶液。 ＜試驗＞ 將各種血清於37℃預保溫5分鐘之後，添加受試物質溶液，使終濃度為20μM而使反應開始。將受試物質添加血清於37℃保溫，於反應開始0及4小時後抽取血清的一部分，添加到含甲酸之IS溶液中以停止反應，作為測定試料。 ＜測定＞ 將測定試料中的受試物質及IS(非那西汀、尼氟滅酸及呋塞米)藉由LC-MS/MS來測定，計算受試物質與IS(非那西汀、尼氟滅酸及呋塞米之任一者)的波峰面積比(IS比)。再者，IS係於每個試驗選擇測定值最安定者。
III.結果 以反應開始4小時後的IS比對反應開始0小時後的IS比之百分率作為殘存率，評價血清安定性。於表16呈示所得之結果。二環性環狀肽胜肽-1、胜肽-9、胜肽-11、胜肽-126～胜肽-128、胜肽-130及胜肽-131皆顯示高的血清安定性。 胜肽-115及胜肽-119，係各自具有與胜肽-1及胜肽-9僅第3及8號的殘基不同之胺基酸序列的單環性環狀肽。胜肽-1及胜肽-9係各自與胜肽-115及胜肽-119比較，而顯示高的血清安定性。此等之結果表示：與單環性環狀肽比較，而二環性環狀肽的代謝安定性提升；又暗示：與單環性環狀肽比較，而二環性環狀肽血中滞留性高，更適於持續性高的醫藥之製造。
[表16]
胜肽 小鼠血清中安定性 (4h時點) 猴血清中安定性 (4h時點) 人類血清中安定性 (4h時點)
1 100.8 90.6 93.9
9 95.8 93 117.5
11 88 89.9 105.1
126 98.3 100.4 99.6
127 90 95.1 97.5
128 98.1 98.6 99
130 98 93.5 88
131 89.2 89.2 100.9
115 64.5 14.9 78.2
119 70.9 21.1 88.5
[產業上利用之可能性]
本發明之環狀肽I可與TSP1結合，阻礙TSP1與血管內皮細胞等細胞的黏著。所以，本發明之環狀肽I或其藥學上可容許之鹽有用於能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病或症狀之治療或預防。又，本發明之環狀肽或其藥學上可容許之鹽有用於作為血流改善劑。進而，本發明之複合體或其藥學上可容許之鹽，係於提供以較少的投予頻率來治療或預防能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病或症狀之手段的觀點上為有用的。又，本發明之複合體或其藥學上可容許之鹽有用於作為血流改善劑。 [序列表非關鍵詞文字]
序列識別號1～123：胜肽-1～胜肽-123 序列識別號124：編碼抗LPS mAb-A之重鏈的核苷酸序列 序列識別號126：編碼抗LPS mAb-A之輕鏈的核苷酸序列 序列識別號128：編碼CLCH-A之重鏈的核苷酸序列 序列識別號130：編碼CLCH-A之輕鏈的核苷酸序列 序列識別號132：編碼CLCH-B(LALA體)之重鏈的核苷酸序列 序列識別號134：編碼Fc片段(野生型)的核苷酸序列 序列識別號136：編碼Fc-A(LALA體)的核苷酸序列 序列識別號138：包含編碼Fc-C(LALA-PA體)的核苷酸序列之DNA片段 序列識別號140～144：連接子L1 序列識別號145～147：連接子L2a 序列識別號148：由人類IgG重鏈之鉸鏈、CH2結構域、及CH3結構域所組成的多肽 序列識別號149：胜肽-124 序列識別號150～164：胜肽-125～胜肽-139 序列識別號165：編碼Fc-C(LALA-PA體)的核苷酸序列 序列識別號166：Fc-C(LALA-PA體)的胺基酸序列
無
無。
TW202344264A_112101731_SEQL.xml
無。

Claims (66)

  1. 一種式(I) 所表示之環狀肽或其藥學上可容許之鹽 [式中，A選自環形成基 A 1、 A 2、 A 3、 A 4、及 A 5， 其中 表示對X aa1的N末端胺基之鍵結點， 表示對X aa11的C末端羰基之鍵結點， R 1及R 2各自獨立地為氫原子或C 1-3烷基， R 10為胺基或羥基， n為0～3的整數， k及l各自獨立地為0～3的整數， m為1～7的整數； X aa1為芳香族胺基酸的殘基； X aa2為芳香族胺基酸、鹼性胺基酸或脂肪族胺基酸的殘基； X aa3及X aa8為各自獨立地選擇之以下之式(III) [式中，R a為式-(CH 2) tSH(式中，t為1～3的整數)所表示之基]、或 式(III’) [式中，R b為式-CH v(CH 3) 2-vCH w(CH 3) 2-wSH(式中，v為0～2的整數，v為0或1時，w為2，v為2時，w為0或1)、或-CH x(CH 3) 2-xSH(式中，x為0或1)所表示之基] 所表示之胺基酸的殘基中X aa3及X aa8的硫醇基形成-S-S-、-S-CH 2-S-、或-S-X-S-(式中，X選自 、 、或 (式中， 表示對S之鍵結點))所表示之鍵結的結構，且X aa3及X aa8之至少任意一者為式(III)所表示之胺基酸的殘基； X aa4為中性胺基酸的殘基； X aa5為鹼性胺基酸的殘基； X aa6為中性胺基酸或酸性胺基酸的殘基； X aa7為芳香族胺基酸的殘基； X aa9為芳香族胺基酸、脂肪族胺基酸或鹼性胺基酸的殘基； X aa10為芳香族胺基酸的殘基； X aa11為脂肪族胺基酸的殘基； 其中， 脂肪族胺基酸為式(IIa)所表示之胺基酸 (IIa) (式中，R 3為C 1-6烷基、C 2-6烯基或C 3-6環烷基)； 芳香族胺基酸為式(IIb)所表示之胺基酸 (IIb) (式中，R 4為選自苯基、噻吩基、吡啶基、萘基、吲哚基、苯并呋喃基、及苯并噻吩基的芳香族基，該芳香族基可由獨立地選自由C 1-3烷基、鹵素原子、羥基、C 1-3烷氧基所組成之群組的1以上之取代基所取代，p為0～3的整數)； 鹼性胺基酸為式(IIc)所表示之胺基酸 (IIc) [式中，R 5為 式-(CH 2) qaNH 2(式中，qa為1～6的整數)、 式 (式中，R 6為氫原子或C 1-3烷基，qb為1～6的整數)、 式-(CH 2) qcNHC(=NH)NH 2(式中，qc為1～6的整數)、或 式 (式中，qd及qe各自獨立地為1～3的整數)所表示之基]； 中性胺基酸為式(IId)所表示之胺基酸、Gly、Met、Pro、3HyP、Asn、Gln、Ser、 mS、MS、或Thr (IId) [式中，R 7為式-(CH 2) raNHCONH 2(式中，ra為1～6的整數)或式-(CH 2) rbSH(式中，rb為1～3的整數)所表示之基]； 酸性胺基酸為式(IIe)所表示之胺基酸 (IIe) [式中，R 8為式-(CH 2) sCOOH(式中，s為1～6的整數)所表示之基]]。
  2. 如請求項1之環狀肽或其藥學上可容許之鹽，其中 X aa1為2Nal殘基， X aa2為Arg、AGB、PHG或Tle的殘基， X aa3及X aa8之結構中，式(III)或(III’)所表示之胺基酸的殘基為HCY或Cys的殘基， X aa4為Gly殘基， X aa5為Arg或AGB的殘基， X aa6為Asn或Asp的殘基， X aa7為Trp殘基， X aa9為Val、Arg、PHG、4PAL或AGB的殘基， X aa10為Trp殘基，且 X aa11為Val、CPTG、或CHXG的殘基。
  3. 如請求項1或2之環狀肽或其藥學上可容許之鹽，其中A為環形成基： A 1a、 A 1b、或 A 1c。
  4. 如請求項3之環狀肽或其藥學上可容許之鹽，其中A為環形成基： A 1a。
  5. 如請求項1至4中任一項之環狀肽或其藥學上可容許之鹽，其中X aa3及X aa8之結構中，硫醇基形成-S-S-或-S-CH 2-S-所表示之鍵結。
  6. 如請求項1至5中任一項之環狀肽或其藥學上可容許之鹽，其選自由下列所表示之化合物所組成之群組： 。
  7. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至6中任一項之環狀肽或其藥學上可容許之鹽作為有效成分。
  8. 如請求項7之醫藥組成物，其用以治療或預防能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病。
  9. 如請求項8之醫藥組成物，其用以治療或預防嚴重肢體缺血、周邊動脈疾病或慢性肢體威脅性缺血。
  10. 一種血流改善劑，其包含如請求項1至6中任一項之環狀肽或其藥學上可容許之鹽作為有效成分。
  11. 一種複合體或其藥學上可容許之鹽，其係如請求項1至6中任一項之環狀肽或下式(X)所表示之環狀肽、與載體分子結合而成， [式中， B選自環形成基： B 1、 B 2、 B 3、 B 4、 B 5、及 B 6，其中 表示對Z aa1的N末端胺基之鍵結點、或於Z aa1不存在的情形表示對Z aa2的N末端胺基之鍵結點， 表示對Z aa12的C末端羰基之鍵結點， 表示對Z aa1的α碳之鍵結點、或於Z aa1不存在的情形表示對Z aa2的α碳之鍵結點， R 101及R 102各自獨立地為氫原子或C 1-3烷基， R 110為胺基或羥基， bn為0～3的整數， bi及bj各自獨立地為1～3的整數， bk及bl各自獨立地為0～3的整數， bm為1～7的整數； Z aa1為脂肪族胺基酸、芳香族胺基酸、鹼性胺基酸、中性胺基酸、或酸性胺基酸的殘基，或者是不存在； Z aa2為芳香族胺基酸或中性胺基酸的殘基； Z aa3為脂肪族胺基酸、芳香族胺基酸、或鹼性胺基酸的殘基； Z aa4為Ser、Thr、Ala、或 mS； Z aa5為Gly或Ser； Z aa6為鹼性胺基酸或中性胺基酸的殘基； Z aa7為中性胺基酸或酸性胺基酸的殘基； Z aa8為芳香族胺基酸的殘基； Z aa9為脂肪族胺基酸、中性胺基酸、或芳香族胺基酸的殘基； Z aa10為鹼性胺基酸、脂肪族胺基酸、芳香族胺基酸、或中性胺基酸的殘基； Z aa11為芳香族胺基酸的殘基； Z aa12為脂肪族胺基酸、芳香族胺基酸、或鹼性胺基酸的殘基； 其中，脂肪族胺基酸、芳香族胺基酸、鹼性胺基酸、中性胺基酸、及酸性胺基酸係如請求項1中所定義]。
  12. 如請求項11之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中 Z aa1為Arg、Lys、His、Gly、Ala、Asn、Thr、Ser、Met、Leu、Ile、Val、Gln、Phe、Tyr、Trp、或Cys的殘基，或者是不存在； Z aa2為Phe、Tyr、Trp、2Nal、4CF、或DCF的殘基； Z aa3為Ile、Leu、Nle、Tle、Trp、2Nal、4CF、或Arg的殘基； Z aa4為Ser殘基； Z aa5為Gly殘基； Z aa6為Arg、Lys、His、Ser、Cit、或AGB的殘基； Z aa7為Asn或Asp的殘基； Z aa8為Trp或2Nal的殘基； Z aa9為Val、Nle、Ahp、或Met的殘基； Z aa10為Arg、AGB、Lys、His、AMF、Phg、或Val的殘基； Z aa11為Trp或2Nal的殘基； Z aa12為Val、Tle、CPTG、CHXG、或Phe的殘基； B為環形成基： B 1a、 B 1b、或 B 1c。
  13. 如請求項12之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中 Z aa1不存在； Z aa2為2Nal殘基； Z aa3為Arg或Tle的殘基； Z aa4為Ser殘基； Z aa5為Gly殘基； Z aa6為Arg或AGB的殘基； Z aa7為Asn或Asp的殘基； Z aa8為Trp殘基； Z aa9為Val或Nle的殘基； Z aa10為Arg、AGB、或Val的殘基； Z aa11為Trp殘基； Z aa12為Val、CPTG、或CHXG的殘基； B為 B 1a。
  14. 如請求項13之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中式(X)所表示之環狀肽選自由下列所表示之化合物所組成之群組： 、及 。
  15. 如請求項11至14中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該載體分子為人類血清白蛋白或其片段或是變異體。
  16. 如請求項11至14中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該載體分子為含Fc分子。
  17. 如請求項16之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該含Fc分子為全長IgG、全長IgG重鏈、或包含Fc區的全部或是一部分之IgG的片段，或者是其變異體。
  18. 如請求項16或17之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該含Fc分子包含IgG重鏈之恆定區的CH2結構域及CH3結構域。
  19. 如請求項16至18中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該含Fc分子包含人類IgG重鏈中相當於按照Eu索引(Eu index)之第226位的半胱胺酸殘基、相當於第229位的半胱胺酸殘基、或相當於第297位的天門冬醯胺酸殘基之至少任意一個胺基酸殘基。
  20. 如請求項16至19中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該含Fc分子包含人類IgG重鏈中相當於按照Eu索引之第221～230位、第222～230位、第223～230位、第224～230位、第225～230位、或第226～230位的胺基酸序列。
  21. 如請求項16至20中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該含Fc分子包含人類IgG重鏈中相當於按照Eu索引之第234位的白胺酸殘基及相當於第235位的白胺酸殘基之被丙胺酸殘基的取代，或包含相當於第234位的白胺酸殘基、相當於第235位的白胺酸殘基、及相當於第329位的脯胺酸殘基之被丙胺酸殘基的取代。
  22. 如請求項16至21中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該含Fc分子為由人類IgG重鏈之恆定區所組成的CH、由人類IgG之恆定區所組成的CLCH、或由人類IgG之Fc區所組成的分子或是其片段，或者是其變異體。
  23. 如請求項22之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該含Fc分子為： 由重鏈及輕鏈之組合所組成的抗體(mAb-A)，該重鏈由序列識別號125之胺基酸編號20～474之胺基酸序列所組成，該輕鏈由序列識別號127之胺基酸編號21～234之胺基酸序列所組成； 由序列識別號129之胺基酸編號20～349之胺基酸序列所組成的CH(CH-A)； 由序列識別號133之胺基酸編號20～349之胺基酸序列所組成的CH(CH-B)； 由重鏈及輕鏈之組合所組成的CLCH(CLCH-A)，該重鏈由序列識別號129之胺基酸編號20～349之胺基酸序列所組成，該輕鏈由序列識別號131之胺基酸編號21～125之胺基酸序列所組成； 由重鏈及輕鏈之組合所組成的CLCH(CLCH-B)，該重鏈由序列識別號133之胺基酸編號20～349之胺基酸序列所組成，該輕鏈由序列識別號131之胺基酸編號21～125之胺基酸序列所組成； 由序列識別號135之胺基酸編號21～243之胺基酸序列所組成的Fc片段(Fc-B)； 由序列識別號137之胺基酸編號21～247之胺基酸序列所組成的Fc片段(Fc-A)；或 由序列識別號139之胺基酸編號21～247之胺基酸序列所組成的Fc片段(Fc-C)；或者是 其變異體。
  24. 如請求項16至23中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中含Fc分子包含選自由以下所組成之群組的1或2以上之修飾：對N-鍵結之糖鏈附加、對O-鍵結之糖鏈附加、N端的加工、C端的加工、脫醯胺化、天門冬胺酸的異構化、甲硫胺酸的氧化、於N端之甲硫胺酸殘基的附加、脯胺酸殘基的醯胺化及重鏈的羧基末端中之1或2個胺基酸殘基的缺失。
  25. 如請求項24之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中於含Fc分子之重鏈的羧基末端有1或2個胺基酸殘基缺失。
  26. 如請求項25之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中在含Fc分子之2條重鏈雙方於羧基末端有1個胺基酸殘基缺失。
  27. 如請求項24至26中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中含Fc分子之重鏈的羧基末端的脯胺酸殘基進一步經醯胺化。
  28. 如請求項11至27中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該環狀肽與該載體分子透過連接子(linker)結構而結合。
  29. 如請求項28之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該連接子結構包含選自由聚氧伸烷基鏈、胺基酸殘基、及由2以上之胺基酸殘基所組成的寡肽鏈所組成之群組的至少1個結構。
  30. 如請求項29之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該連接子結構中包含的聚氧伸烷基鏈為聚乙二醇(PEG)鏈。
  31. 如請求項30之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該連接子結構之主鏈中包含的PEG鏈之總聚合度為6～100。
  32. 如請求項29之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該連接子結構中包含的胺基酸殘基係Gly、N-甲基甘胺酸、Asp、D-Asp、Glu、D-Glu、Lys、D-Lys、β-丙胺酸、Ser、D-Ser、側鏈中包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸、或側鏈中包含SG鏈之非天然胺基酸的殘基。
  33. 如請求項29之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該連接子結構中包含的寡肽鏈由2～20個胺基酸殘基所組成。
  34. 如請求項29之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該連接子結構中包含的寡肽鏈，包含選自由Gly、N-甲基甘胺酸、Asp、D-Asp、Glu、D-Glu、Lys、D-Lys、β-丙胺酸、Ser、D-Ser、側鏈中包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸、及側鏈中包含SG鏈之非天然胺基酸所組成之群組的1以上之胺基酸殘基。
  35. 如請求項29之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該連接子結構中包含的胺基酸殘基或寡肽鏈之N末端胺基、與環形成基A的R 10或環形成基B的R 110所鍵結之羰基形成醯胺鍵結，R 10或R 110被該N末端胺基的NH取代。
  36. 如請求項28至35中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該連接子結構包含與載體分子結合之連結基C。
  37. 如請求項36之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該連結基C包含藉由馬來醯亞胺基與硫醇基之反應所形成之硫醚鍵結中的源自馬來醯亞胺基之部分或1,2,3-三唑環。
  38. 如請求項37之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中馬來醯亞胺基與載體分子的半胱胺酸殘基之硫醇基鍵結而形成硫醚鍵結。
  39. 如請求項37之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該載體分子為含Fc分子，且該連結基C中包含的1,2,3-三唑環、與鍵結於含Fc分子的相當於按照Eu索引之第297位的天門冬醯胺酸殘基之糖鏈(N297結合糖鏈)結合。
  40. 如請求項36至39中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該連結基C係以下式的任一者表示： C 1、 C 2、及 C 3(式中， N297GLY表示與含Fc分子之N297結合糖鏈的非還原末端鍵結， Cys表示與載體分子的半胱胺酸殘基之硫醇基鍵結， Y表示與連接子結構中之鄰接的胺基酸殘基之鍵結點)。
  41. 如請求項39或40之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中含Fc分子之N297結合糖鏈為選自具有下式所表示之結構的糖鏈N297-(Fuc)SG、N297-(Fuc)MSG1及N297-(Fuc)MSG2的至少1個， 、及 [式中，(C)表示與連結基C之鍵結點，(Asn297)表示與含Fc分子的相當於按照Eu索引之第297位的天門冬醯胺酸殘基之鍵結點]。
  42. 如請求項41之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中含Fc分子之N297結合糖鏈為N297-(Fuc)SG。
  43. 如請求項36至42中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該連接子結構為下式(XX)： -L1-L2-L3-C- [式中， L1為包含直鏈狀地鍵結之3～6個中性胺基酸殘基的寡肽； L2為L2a或L2b， L2a為在主鏈包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸殘基，或為包含在主鏈包含聚氧伸烷基鏈之非天然胺基酸殘基的寡肽，且L2a之主鏈中包含的聚氧伸烷基鏈之總聚合度為6～100的寡肽， L2b為包含直鏈狀地鍵結之10～20個天然或非天然之α胺基酸殘基的寡肽； L3為下式所表示之胺基酸殘基 (式中，R 201為羥基或胺基， 表示與L2中之鄰接的胺基酸殘基之鍵結點， 表示與連結基C之鍵結點)； C為連結基C； L1之N末端胺基係與環形成基A的R 10或環形成基B的R 110所鍵結之羰基形成醯胺鍵結，R 10或R 110被該N末端胺基的NH取代； L1與L2以醯胺鍵結連結；且 L2與L3以醯胺鍵結連結]。
  44. 如請求項43之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L1中包含的中性胺基酸殘基為選自由Gly、Ser、D-Ser、N-甲基甘胺酸(NMeG)、及β-丙胺酸(bAla)所組成之群組的1個以上之胺基酸的殘基。
  45. 如請求項39或44之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L2a中包含的主鏈之聚氧伸烷基鏈為PEG鏈。
  46. 如請求項45之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L2a中包含的在主鏈包含PEG鏈之非天然胺基酸殘基，為下式所表示之胺基酸的殘基： [式中，n表示5～40的整數]。
  47. 如請求項46之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該PEG鏈之總聚合度為10～40。
  48. 如請求項43或44之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L2b之α胺基酸為甘胺酸或N-甲基甘胺酸。
  49. 如請求項48之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L2b之寡肽為N-甲基甘胺酸13個連續的寡聚N-甲基甘胺酸。
  50. 如請求項43至49中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L2包含側鏈中包含PEG鏈之非天然胺基酸殘基、或側鏈中包含SG鏈之非天然胺基酸殘基。
  51. 如請求項50之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該側鏈中包含PEG鏈之非天然胺基酸為KPEG。
  52. 如請求項50之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該側鏈中包含SG鏈之非天然胺基酸為KSG。
  53. 如請求項43至52中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽，其係於L1及L2之寡肽的主鏈上，於不鄰接該環形成基A或環形成基B的1個以上之位置合計包含1～3個酸性胺基酸殘基。
  54. 如請求項53之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該酸性胺基酸殘基為選自由Asp、D-Asp、Glu、D-Glu所組成之群組的胺基酸。
  55. 如請求項43至54中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L1係包含以下之序列或由該序列所組成的寡肽： Gly-Gly-Gly-Gly、 Gly-Ser-Gly-Ser、 NMeG-NMeG-NMeG-NMeG、 bAla-bAla-bAla-bAla、或 Gly-Gly-Glu-Gly-Gly。
  56. 如請求項55之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L1為 由Gly-Gly-Gly-Gly、 Gly-Ser-Gly-Ser、 NMeG-NMeG-NMeG-NMeG、或 bAla-bAla-bAla-bAla 的C末端有2個酸性胺基酸殘基連結之序列所組成的寡肽。
  57. 如請求項56之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該酸性胺基酸殘基為Asp殘基。
  58. 如請求項43至55中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L2為由以下之序列所組成的寡肽： Asp-Asp-KPEG-P12P-P12P、 KSG-P12P-P12P、 Asp-Asp-P12P、 Asp-Asp-P12P-P12P、或 Asp-Asp-P12P-KPEG-P12P。
  59. 如請求項43至58中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中L3為Lys殘基。
  60. 如請求項43之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中該連接子結構為以下之結構： L1為由Gly-Gly-Gly-Gly或是Gly-Ser-Gly-Ser之序列所組成的寡肽，L2a為由Asp-Asp-KPEG-P12P-P12P之序列所組成的寡肽，L3為Lys殘基之結構； L1為由Gly-Gly-Gly-Gly之序列所組成的寡肽，L2a為由KSG-P12P-P12P之序列所組成的寡肽，L3為Lys殘基之結構； L1為由Gly-Gly-Gly-Gly之序列所組成的寡肽，L2a為由Asp-Asp-P12P之序列所組成的寡肽，L3為Lys殘基之結構； L1為由Gly-Ser-Gly-Ser之序列所組成的寡肽，L2a為由Asp-Asp-P12P-P12P之序列所組成的寡肽，L3為Lys殘基之結構；或 L1為由Gly-Gly-Gly-Gly之序列所組成的寡肽，L2a為由Asp-Asp-P12P-KPEG-P12P之序列所組成的寡肽，L3為Lys殘基之結構。
  61. 如請求項11之複合體或其藥學上可容許之鹽，其中 環狀肽及連接子結構係以下述的任一者表示： 、及 (式中， N297GLY表示連結基C中包含的1,2,3-三唑環與含Fc分子之N297結合糖鏈的非還原末端鍵結， Fc表示連結基C中包含的馬來醯亞胺基與含Fc分子的半胱胺酸殘基之硫醇基鍵結)。
  62. 一種醫藥組成物，其含有如請求項11至61中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽作為有效成分。
  63. 如請求項62之醫藥組成物，其用以治療或預防能夠藉由阻礙TSP1的機能而治療或預防的疾病。
  64. 如請求項63之醫藥組成物，其用以治療或預防嚴重肢體缺血、周邊動脈疾病或慢性肢體威脅性缺血。
  65. 一種血流改善劑，其包含如請求項11至61中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽作為有效成分。
  66. 一種製造如請求項11至61中任一項之複合體或其藥學上可容許之鹽的方法，該方法包含以下之步驟： (1)藉由固相合成法，而從C末端側合成下式所表示之寡肽X-A-L或Z-B-L之步驟 X aa1-X aa2-X aa3-X aa4-X aa5-X aa6-X aa7-X aa8-X aa9-X aa10-X aa11-A 0-L1-L2-L3或 Z aa1-Z aa2-Z aa3-Z aa4-Z aa5-Z aa6-Z aa7-Z aa8-Z aa9-Z aa10-Z aa11-Z aa12-B 0-L1-L2-L3 [式中， X aa1～X aa11係如請求項1中所定義(但是，X aa3及X aa8之結構中，硫醇基並未形成鍵結，各自仍為硫醇基)， L1～L3係如請求項43中所定義(但是，L2包含側鏈中包含糖鏈之非天然胺基酸的殘基之情形，該殘基被Lys殘基取代)， Z aa1～Z aa12係如請求項11中所定義， A 0為下式所表示之殘基 A 0a、或 A 0b(式中，(X aa11)表示與X aa11之鍵結點，(L1)表示與L1之N末端的胺基酸殘基之鍵結點，l及n係如請求項1中所定義)， B 0為下式所表示之殘基 B 0a、或 B 0b(式中，(Z aa12)表示與Z aa12之鍵結點，(L1)表示與L1之N末端的胺基酸殘基之鍵結點，bl及bn係如請求項11中所定義)]； (2)藉由 (a)於寡肽X-A-L中連結X aa1之N末端胺基與A 0a而使環形成基A 1～A 3(但是，於R 10的位置與L1連結)之任一者形成、或 (b)於寡肽X-A-L中連結X aa1之N末端胺基與A 0b而使環形成基A 4或A 5(但是，於R 10的位置與L1連結)形成、或 (c)於寡肽Z-B-L中連結Z aa1或Z aa2之N末端胺基與B 0a而使環形成基B 1～B 4(但是，於R 110的位置與L1連結)之任一者形成、或 (d)於寡肽Z-B-L中連結Z aa1或Z aa2之N末端胺基與B 0b而使環形成基B 5或B 6(但是，於R 110的位置與L1連結)形成， 而使步驟(1)中所合成之寡肽環化，而得到環狀肽之步驟； (3)於步驟(1)中合成寡肽X-A-L之情形，於步驟(2)中所環化的寡肽X-A-L之X aa3及X aa8的硫醇基中，使-S-S-、-S-CH 2-S-、或-S-X-S-(式中，X係如請求項1中所定義)所表示之鍵結形成，而得到二環性環狀肽之步驟； (4)L2包含側鏈中包含糖鏈之非天然胺基酸的殘基，且於寡肽X-A-L或Z-B-L中被Lys殘基取代之情形，藉由對該Lys殘基導入糖鏈，而使側鏈中包含糖鏈之非天然胺基酸的殘基形成之步驟； (5)使馬來醯亞胺基或可形成1,2,3-三唑環的反應基與L3鍵結之步驟；及 (6)透過步驟(5)的反應基而使環狀肽與載體分子結合之步驟。
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