MXPA06005672A - Composiciones y metodos para la diagnosis y tratamiento de tumor. - Google Patents

Composiciones y metodos para la diagnosis y tratamiento de tumor.

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Abstract

La presente invencion es concerniente con composiciones de materia utiles para la diagnosis y tratamiento de tumor en mamiferos y con metodos de uso de tales composiciones de materia para los mismos.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA LA DIAGNOSIS Y TRATAMIENTO DE TUMOR CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente con composiciones de materia útiles para la diagnosis y tratamientos de tumor en mamíferos y con métodos para usar aquellas composiciones de materia para los mismos .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los tumores malignos (cánceres) son la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos de América, después de la enfermedad de corazón (Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993)). El cáncer está caracterizado por el incremento en el número de células anormales o neoplásicas derivadas de un tejido normal que proliferan para formar una masa de tumor, la invasión de tejidos adyacentes por estas células de tumor neoplásicas y la generación de células malignas que inevitablemente se esparcen vía la sangre o sistema linfático a nodos linfáticos regionales y a sitios distantes vía un proceso llamado metástasis. En estado canceroso, una célula prolifera bajo condiciones en las cuales las células normales no crecerían. El cáncer se manifiesta por si mismo en una amplia variedad de formas, caracterizadas por diferentes grados de invasividad y agresividad. En intentos por descubrir objetivos celulares efectivos para la diagnosis y terapia de cáncer, los investigadores han buscado identificar polipéptidos de transmembrana o polipéptidos asociados a membrana de otra manera que son expresados específicamente sobre la superficie de uno o más ti?o(s) particular de células de cáncer en comparación con una o más célula (s) no cancerosas normales. Frecuentemente, tales polipéptidos asociados a membrana son expresados más abundantemente sobre la superficie de las células de cáncer en comparación con sobre la superficie de las células no cancerosas. La identificación de tales polipéptidos de antígeno de superficie celular asociado al tumor ha dado elevación para la capacidad para apuntar específicamente células de cáncer para destrucción vía terapias a base de anticuerpo. A este respecto, se notará que la terapia a base de anticuerpo ha probado ser muy efectiva en el tratamiento de ciertos cánceres. Por ejemplo, HERCEPTIN® y RITUXAN® (ambos de Genentech Inc., South San Francisco, California) son anticuerpos que han sido usados exitosamente para tratar cáncer de pecho y linfoma que no es de Hodgkin, respectivamente. Más específicamente, HERCEPTIN® es un anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que se enlace selectivamente al dominio extracelular del proto-oncógeno (HER2) del receptor de factor de crecimiento epidérmico humano 2. La sobreexpresión de proteína HER2 es observada en 25-30% de cánceres de pecho primarios . RITUXAN® es un anticuerpo monoclonal murino-humano quimérico diseñado genéticamente dirigido contra el antígeno CD20 encontrado sobre la superficie de linfocitos normales y malignos B. Ambos de estos anticuerpos son producidos recombinantemente en células CHO. En otros intentos por descubrir objetivos celulares efectivos para la diagnosis y terapia de cáncer, los investigadores han buscado identificar (1) polipéptidos no asociados a membrana que son producidos específicamente por uno o más tipo(s) particular de célula (s) de cáncer en comparación por uno o más tipo(s) particular (es) de célula (s) normales no cancerosas, (2) polipéptidos que son producidos por células de cáncer a un nivel de expresión que es significativamente más alto que aquel de una o más célula (s) no cancerosas normales o (3) polipéptidos cuya expresión es limitada específicamente a solo un tipo(s) de tejido (o un número muy limitado de diferente) tanto en estado canceroso y no canceroso (por ejemplo, próstata normal y tejido de tumor de próstata) . Tales polipéptidos siguen estando ubicados intracelularmente o pueden ser secretados por la célula de cáncer. Además, tales polipéptidos pueden ser expresados no por la célula de cáncer misma, sino más bien por células que producen y/o segregan polipéptidos que tiene un efecto de potenciación o que mejora el crecimiento sobre células de cáncer. Tales polipéptidos secretados son frecuentemente proteínas que proporcionan células de cáncer con una ventaja de crecimiento con respecto a células normales e incluyen tal cosas tales como por ejemplo factores angiogénicos, factores de adhesión celular, factores de crecimiento y los semejantes. Se esperaría que la identificación de antagonistas de tales polipéptidos no asociados a membrana sirvan como agentes terapéuticos efectivos para el tratamiento de tales cánceres. Además, la identificación del patrón de expresión de tales polipéptidos sería útil para la diagnosis de cánceres particulares en mamíferos. A pesar de los avances identificados anteriormente en terapia de cáncer de mamíferos, hay una gran necesidad por agentes de diagnóstico y terapéuticos adicionales capaces de detectar la presencia de tumor en un mamífero y para inhibir efectivamente el crecimiento de célula neoplásica, respectivamente. Así, es un objetivo de la presente invención identificar: (1) polipéptidos asociados a membrana celular que son expresados más abundantemente sobre uno o más tipo(s) de célula (s) de cáncer en comparación con sobre células normales o sobre otras células de cáncer diferentes, (2) polipéptidos no asociados a membrana que son producidos específicamente por uno o más tipo(s) particular (es) de célula (s) de cáncer (o por otras células que producen polipéptidos que tienen un efecto de potenciación sobre el crecimiento de células de cáncer) en comparación con por uno o más tipo(s) particular (es) de célula (s) normal (es) no cancerosa (s) , (3) polipéptidos no asociados a membrana que son producidos por células de cáncer a un nivel de expresión que es significativamente más alto que aquel de una o más célula (s) no cancerosa normales o (4) polipéptidos cuya expresión está limitada específicamente a solo un tipo(s) de tejido (o número muy limitado de diferentes) tanto en estado canceroso como no cancerosos (por ejemplo, tejido de próstata normal y tejido de tumor de próstata) , y con el uso de tales polipéptidos y con sus ácidos nucleicos de codificación, para producir composiciones de materia útiles en el tratamiento terapéutico y detección de diagnóstico de cáncer en mamíferos. También es un objetivo de la presente invención identificar polipéptidos secretados o intracelulares asociados a membrana celular cuya expresión está limitada a un solo o un número muy limitado de tejidos y con el uso de aquellos polipéptidos y sus ácidos nucleicos de codificación, para producir composiciones de materia útiles en el tratamiento terapéutico y detección de diagnóstico de cáncer en mamíferos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN A. Modalidades En la presente especificación, se describe por primera vez la identificación de varios polipéptidos celulares (y sus ácidos nucleicos de codificación o fragmentos' de los mismos) que son expresados a un grado mayor sobre la superficie de o por uno o más tipos de célula (s) de cáncer en comparación con sobre la superficie de o por uno o más tipos de células que no son de cáncer normales. Alternativamente, tales polipéptidos son expresados por células que producen y/o segregan polipéptidos que tienen un efecto de potenciación o que mejora el crecimiento sobre las células de cáncer. Otra vez alternativamente, tales polipéptidos pueden no ser sobreexpresados por células de tumor en comparación con células normales del mismo tipo de tejido, sino más bien pueden ser expresados específicamente tanto por células de tumor como células normales de solamente uno o un número muy limitado de tipos de tejido (preferiblemente tejidos que no son esenciales para la vida, por ejemplo próstata, etc.). Todos los polipéptidos anteriores son denominados en la presente como polipéptidos objetivo antigénicos asociados a tumor (polipéptidos "TAT") y se espera que sirvan como objetivos efectivos para la terapia de cáncer y diagnosis en mamíferos. Así, en una modalidad de la presente invención, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido objetivo antigénico asociado al tumor o fragmento del mismo (un polipéptido "TAT") . En ciertos aspectos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente por lo menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de identidad de secuencia de ácido nucleico, a (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido TAT de plena longitud que tiene una secuencia de aminoácidos como se revela en la presente, una secuencia de aminoácidos de polipéptido de TAT que carece de polipéptido de señal como se revela en la presente, un dominio extracelulares de un polipéptido de TAT de transmembrana, con o sin el péptido de señal, como se revela en la presente o cualquier otro fragmento definido específicamente de una secuencia de aminoácidos de polipéptido de TAT de plena longitud como se revela en la presente, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) .
En otros aspectos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente por lo menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de identidad de secuencia de ácido nucleico a (a) una molécula de ADN que comprende la secuencia de codificación de un cADN de polipéptido de TAT de plena longitud como se revela en la presente, la secuencia de codificación de un polipéptido de TAT que carece del polipéptido de señal como se revela en la presente, la secuencia de codificación de un dominio extracelular de un polipéptido de TAT de transmembrana, con o sin el péptido de señal, como se revela en la presente o la secuencia de codificación de cualquier otro fragmento definido específicamente de la secuencia de aminoácidos de polipéptido de TAT de plena longitud como se revela en la presente o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) . En aspectos adicionales, la invención es concerniente con una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente, por lo menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de identidad de secuencia de ácido nucleico a (a) una molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado por la región de codificación de plena longitud de cualquiera de los cADN de proteína humana depositados con ATCC como se revela en la presente, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) . Otro aspecto de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de TAT que es ya sea cancelado en dominio de transmembrana o inactivado en dominio de transmembrana o es complementario con tal secuencia de nucleótidos de codificación, en donde el (los) dominio (s) de transmembrana de tal (es) polipéptido (s) son revelados en la presente. Por consiguiente, se contemplan dominios extracelulares solubles de los polipéptidos de TAT descritos en la presente. En otros aspectos, la presente invención es concerniente con moléculas de ácido nucleico aisladas que se hibridan a (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de TAT que tiene una secuencia de aminoácidos de plena longitud como se revela en la presente, una secuencia de aminoácidos de polipéptido de TAT que carece del péptido de señal como se revela en la presente, un dominio extracelulares de un polipéptido de TAT de transmembrana, con o sin el péptido de señal, como se revela en la presente o cualquier otro fragmento definido específicamente de una secuencia de aminoácidos de polipéptido de TAT de plena longitud como se revela en la presente o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) . A este respecto, una modalidad de la presente invención es concerniente con fragmentos de una secuencia de codificación de polipéptido de TAT de plena longitud o el complemento del mismo como se revela en la presente que puede encontrar uso como por ejemplo sondas de hibridización útiles como por ejemplo sondas de diagnósticos, sondas de oligonucleótido antisentido o para codificar fragmentos de un polipéptido de TAT de plena longitud que puede codificar opcionalmente un polipéptido que comprende un sitio de enlace para un anticuerpo de polipéptido de anti-TAT, un oligopéptido de enlace de TAT u otra molécula orgánica pequeña que se enlaza a un polipéptido de TAT. Tales fragmentos de ácido nucleico son usualmente de por lo menos de alrededor de 5 nucleótidos de longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, ó 1000 nucleótidos de longitud, en donde en este contexto el término "aproximadamente" significa la longitud de secuencia de nucleótido de referencia más o menos 10% de aquella longitud a la que se hace referencia. Se notará que nuevos fragmentos de una secuencia de nucleótidos que codifica polipéptido de TAT pueden ser determinados de una manera de rutina mediante alineación de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de TAT con otras secuencias de nucleótidos conocidas utilizando cualquiera de un número de programas de alineación de secuencia bien conocidas y determinar cual (es) fragmento (s) de secuencia de nucleótidos que codifica polipéptido son novedosas. Todos de tales fragmentos novedosos de secuencias de nucleótidos que codifican polipéptido de TAT son contemplados en la presente. También se contempla que fragmentos de polipéptido de TAT codificados por estos fragmentos de molécula de nucleótido, preferiblemente aquellos fragmentos de polipéptido de TAT que comprenden un sitio de enlace para un anticuerpo anti-TAT, un oligopéptido de enlace de TAT u otra molécula orgánica pequeña que se enlaza a un polipéptido de TAT. En otra modalidad, la invención proporciona polipéptidos de TAT aislados codificados por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico aisladas identificadas anteriormente en la presente. En un cierto aspecto, la invención es concerniente con un polipéptido de TAT aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácido, alternativamente por lo menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de identidad de secuencia de aminoácidos, a un polipéptido de TAT que tiene una secuencia de aminoácidos de plena longitud como se revela en la presente, una secuencia de aminoácidos de polipéptido de TAT que carece del péptido de señal como se revela en la presente, un dominio extracelular de una proteína de polipéptido de TAT de transmembrana, con o sin el péptido de señal, como se revela en la presente, una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos reveladas en la presente o cualquier otro fragmento definido específicamente de una secuencia de aminoácidos de polipéptido de TAT de plena longitud como se revela en la presente. En un aspecto adicional, la invención es concerniente con un polipéptido de TAT aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de los cADN de proteína humanos depositados con la ATCC como se revela en la presente. En un aspecto específico, la invención proporciona un polipéptido de TAT aislado sin la secuencia de señal N-terminal y/o sin la metionina de iniciación y es codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica tal secuencia de aminoácidos como se describe anteriormente en la presente. También se describen en la presente procesos para producir los mismos, en donde estos procesos comprenden cultivar una célula huésped que comprenden un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de codificación apropiada bajo condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido de TAT y recuperar el polipéptido de TAT del cultivo celular. Otro aspecto de la invención proporciona un polipéptido de TAT aislado que es ya sea cancelado en el dominio de transmembrana o inactivado en el dominio de transmembrana. También se describen en la presente procesos para producir los mismos, en donde aquellos procesos comprenden cultivar una célula huésped que comprenden un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de codificación apropiada bajo condiciones apropiadas para expresión de polipéptido de TAT y recuperar el polipéptido de TAT del cultivo celular. En otras modalidades de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente. Células huésped que comprenden cualquiera de tales factores son también provistas. Como ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, células E. coli o células de levadura. ün proceso para producir cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente es provisto adicionalmente y comprende cultivar células huésped bajo condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido deseado y recuperar el polipéptido deseado del cultivo celular. En otras modalidades, la invención proporciona polipéptidos quiméricos aislados que comprenden cualquiera de los polipéptidos de TAT descritos en la presente fusionados a un polipéptido heterólogo (no TAT) . Ejemplos de tales moléculas quiméricas comprenden cualquiera de los polipéptidos de TAT descritos en la presente fusionados a un polipéptido heterólogo tal como por ejemplo una secuencia de etiqueta de epítopo o una región Fc de una inmunoglobulina. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo que se enlaza, de preferencia específicamente, a cualquiera de los polipéptidos anteriores o descritos posteriormente en la presente. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo de una sola cadena o anticuerpo que inhibe competitivamente el enlace de un anticuerpo de polipéptido anti-TAT a su respectivo epítopo antigénico. Anticuerpos de la presente invención pueden opcionalmente ser conjugados a un agente inhibidor del crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina en las que se incluyen por ejemplo un maitansinoide o calicheamicina, un antibiótico, un isótopo radiactivo, una enzima nucleolítica o los semejantes. Los anticuerpos de la presente invención pueden opcionalmente ser producidos en células CHO o células bacterianas e inducen preferiblemente la muerte de una célula a la cual se enlazan. Por propósitos de diagnósticos, los anticuerpos de la presente invención pueden ser marcados detectablemente, anexados a un soporte sólido o los semejantes.
En otras modalidades de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente. También se proporcionan células huésped que comprenden cualquiera de tales vectores. Como ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, células E. coli o células de levadura. Se proporciona además un proceso para producir cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente y comprende cultivar células huésped bajo condiciones apropiadas para expresión del anticuerpo deseado y recuperar el anticuerpo deseado del cultivo celular. En otra modalidad, la invención proporciona oligopéptidos ("oligopéptidos de enlace de TAT") que se enlazan, de preferencia específicamente, a cualquiera de los polipéptidos de TAT anteriores o descritos posteriormente en la presente. Opcionalmente, los oligopéptidos de enlace de TAT de la presente invención pueden ser conjugados a un agente inhibidor de crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina en los que se incluyen por ejemplo un maitansinoide o calicheamicina, un antibiótico, un isótopo radiactivo, un enzima nucleolítica o los semejantes. Los oligopéptidos de enlace de TAT de la presente invención pueden opcionalmente ser producidos en células CHO o células bacterianas e inducen preferiblemente la muerte de una célula a la cual se enlazan. Por propósitos de diagnóstico, los oligopéptidos de enlace TAT de la presente invención pueden ser marcados detectablemente, anexados a un soporte sólido o los semejantes. En otras modalidades de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los oligopéptidos de enlace de TAT descritos en la presente. También se proporcionan células huésped que comprenden cualquiera vectores. Como ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, células E. coli o células de levadura. Se proporciona además un proceso para producir cualquiera de los oligopéptidos de enlace de TAT descritos en la presente y comprende cultivar células huésped bajo condiciones apropiadas para la expresión del oligopéptido deseado y recuperar el oligopéptido deseado del cultivo celular. En otra modalidad, la invención proporciona moléculas orgánicas pequeñas ("moléculas orgánicas de enlace de TAT" que se enlazan, de preferencia específicamente, a cualquiera de los polipéptido de TAT anteriores o descritos posteriormente en la presente. Opcionalmente, las moléculas orgánicas de moléculas de TAT de la presente invención pueden ser conjugadas a un agente inhibidor del crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, en los que se incluyen, por ejemplo un maitansinoide o calicheamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o los semejantes. Las moléculas orgánicas de enlace de TAT de la presente invención inducen preferiblemente la muerte de una célula a la cual se enlazan. Por propósitos de diagnóstico, las moléculas orgánicas de enlace de TAT de la presente invención pueden ser marcadas detectablemente, anexadas a un soporte sólido o los semejantes. En todavía una modalidad adicional, la invención es concerniente con una composición de materia que comprende un polípéptido de TAT como se describe en la presente, un polipéptido de TAT quimérico como se describe en la presente, un anticuerpo anti-TAT como se describe en la presente, un oligopéptido de enlace de TAT como se describe en la presente o una molécula orgánica de enlace de TAT como se describe en la presente, en combinación con un portador. Opcionalmente, el portador es un portador aceptable farmacéuticamente. En todavía otra modalidad, la invención es concerniente con un artículo de manufactura que comprende un recipiente y una composición de materia contenida dentro del recipiente, en donde la composición de materia puede comprender un polipéptido de TAT como se describe en la presente, un polipéptido de TAT quimérico como se describe en la presente, un anticuerpo anti-TAT como se describe en la presente, un oligopéptido de enlace de TAT como se describe en la presente o una molécula orgánica de enlace de TAT como se describe en la presente. El artículo puede comprender además opcionalmente una etiqueta fija al recipiente o un inserto de paquete incluido con el recipiente, que se refiere al uso de la composición de materia para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un tumor. Otra modalidad de la presente invención es concerniente con el uso de un polipéptido de TAT como se describe en la presente, un polipéptido de TAT quimérico como se describe en la presente, un anticuerpo de polipéptido anti-TAT como se describe en la presente, un oligopéptido de enlace de TATA como se describe en la presente o una molécula orgánico de enlace de TAT como se describe en la presente, para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una condición que es sensible al polipéptido de TAT, polipéptido de TAT quimérico, anticuerpo de polipéptido de anti-TAT, oligopéptido de enlace de TAT o molécula orgánica de enlace de TAT.
B. Modalidades Adicionales Otra modalidad de la presente invención es concerniente con un método para inhibidor el crecimiento de una célula que expresa un polipéptido de TAT, en donde el método comprende poner en contacto la célula con un anticuerpo, un oligopéptido o una molécula orgánica pequeña que se enlaza al polipéptido de TAT y en donde el enlace del anticuerpo, oligopéptido o molecular orgánica al polipéptido de TAT provoca la inhibición del crecimiento de la célula que expresa el polipéptido de TAT . En modalidades preferidas, la célula es una célula de cáncer y el enlace del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica al polipéptido de TAT provoca la muerte de la célula que expresa el polipéptido de TAT. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o anticuerpo de una sola cadena. Anticuerpos, oligopéptidos de enlace de TAT y moléculas orgánicas de enlace de TAT empleadas en los métodos de la presente invención pueden opcionalmente ser conjugados a un agente inhibidor de crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina en los que se incluyen por ejemplo un maitansinoide o calicheamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o los semejantes. Los anticuerpos y oligopéptidos de enlace de TAT empleados en el método de la presente invención pueden opcionalmente se producidos en células CHO o células bacterianas. Todavía otra modalidad de la presente invención es concerniente con un método para tratar terapéuticamente un mamífero que tiene un tumor canceroso que comprende células que expresan un polipéptido de TAT, en donde el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo, un oligopéptido o una molécula orgánica pequeña que se enlaza el polipéptido de TAT, dando como resultado mediante esto el tratamiento terapéutico efectivo del tumor. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o anticuerpo de una sola cadena. Anticuerpos, oligopéptidos de enlace de TAT y moléculas orgánicas de enlace de TAT empleados en el método de la presente invención pueden opcionalmente ser conjugados a un agente inhibidor del crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, en los que se incluyen por ejemplo un maitansinoide o calicheamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o los semejantes. Los anticuerpos y oligopéptidos empleados en los métodos de la presente invención pueden opcionalmente ser producidos en célula CHO o célula bacterianas . Todavía otra modalidad de la presente invención es concerniente con un método para determinar la presencia de un polipéptido de TAT en una muestra que se sospecha que contiene el polipéptido de TAT, en donde el método comprende exponer la muestra a un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pequeña que se enlaza al polipéptido de TAT y determinar el enlace del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica al polipéptido de TAT en la muestra, en donde la presencia de tal enlace es indicadora de la presencia del polipéptido de TAT en la muestra. Opcionalmente, la muestra puede contener células (que pueden ser células de cáncer) que se sospecha que expresan el polipéptido de TAT. El anticuerpo, oligopéptido de enlace de TAT o molécula orgánica de enlace de TAT empleados en el método pueden opcionalmente ser marcados detectablemente, anexados a un soporte sólido o los semejantes. Una modalidad adicional de la presente invención es concerniente con un método para diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, en donde el método comprende detectar el nivel de expresión de un gen que codifica un polipéptido de TAT (a) en una muestra de prueba de células de tejido obtenidas del mamífero y (b) en una muestra de control de células no cancerosas normales conocidas del mismo origen o tipo de tejido, en donde un nivel de expresión más alto del polipéptido de TAT en la muestra de prueba, en comparación con la muestra de control, es indicadora de la presencia de tumor en el mamífero del cual se obtuvo la muestra de prueba. Otra modalidad de la presente invención es concerniente con un método para diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, en donde el método comprende: (a) poner en contacto una muestra de prueba que comprende células de tejido obtenidas del mamífero con un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pequeña que se enlaza a un polipéptido de TAT y (b) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pequeña y el polipéptido de TAT en la muestra de prueba, en donde la formación de un complejo es indicadora de la presencia de un tumor en el mamífero. Opcionalmente, el anticuerpo, oligopéptido de enlace de TAT o molécula orgánica de TAT empleados son marcados detectablemente, anexados a un soporte sólido o los semejantes y/o la muestra de prueba de células de tejido es obtenida de un individual que se sospecha de tener un tumor canceroso. Todavía otra modalidad de la presente invención es concerniente con un método para el tratamiento o prevención de un desorden o alteración proliferativa celular asociada con la expresión o actividad alterada, preferiblemente incrementada de un polipéptido de TAT, el método comprende administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento una cantidad efectiva de un antagonista de un polipéptido de TAT. Preferiblemente, la alteración proliferativa celular es cáncer y el antagonista del polipéptido de TAT es un anticuerpo de polipéptido anti-TAT, oligopéptido de enlace de TAT, molécula orgánica de enlace de TAT u oligonucleótido antisentido. El tratamiento efectivo o prevención de la alteración proliferativa celular puede ser el resultado del exterminio directo o inhibición de crecimiento de células que expresan un polipéptido de TAT o al antagonizar la actividad de potenciación de crecimiento celular de un polipéptido de TAT. Todavía otra modalidad de la presente invención es concerniente con un método de enlace de un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pequeña a una célula que expresa un polipéptido de TAT, en donde el método comprende poner en contacto una célula que expresa un polipéptido de TAT con el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pequeña bajo condiciones que son apropiadas para el enlace del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pequeña al polipéptido de TAT y permitir el enlace entre los mismos. Otras modalidades de la presente invención son concernientes con el uso de: (a) un polipéptido de TAT, (b) un ácido nucleico que codifica un polipéptido de TAT o un vector o célula huésped que comprende aquel ácido nucleico, (c) un anticuerpo de polipéptido anti-TAT, (d) un oligopéptido de enlace de TAT o (e) una molécula orgánica pequeña de enlace de TAT en la preparación de un medicamento útil para: (i) el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer o tumor, o (ii) el tratamiento terapéutico o prevención de una alteración proliferativa celular. Otra modalidad de la presente invención es concerniente con un método para inhibidor el crecimiento de una célula de cáncer, en donde el crecimiento de la célula de cáncer es por lo menos en parte dependiente del (los) efecto (s) de potenciación de crecimiento de un polipéptido de TAT (en donde el polipéptido de TAT puede ser expresado ya sea por la célula de cáncer misma o una célula que produce polipéptido (s) que tiene (n) un efecto de potenciación del crecimiento sobre células de cáncer) , en donde el método comprende poner en contacto el polipéptido de TAT con un anticuerpo, un oligopéptido o una molécula orgánica pequeña que se enlaza el polipéptido de TAT, antagonizando mediante esto la actividad potenciadora del crecimiento del polipéptido de TAT y a su vez, inhibir el crecimiento de la célula de cáncer. Preferiblemente, el crecimiento de la célula de cáncer es inhibido completamente. Aún más preferiblemente, el enlace del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pequeña al polipéptido de TAT induce la muerte de la célula de cáncer. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o anticuerpo de una sola cadena. Anticuerpos, oligopéptidos de enlace de TAT y moléculas orgánicas de enlace de TAT usados en los métodos de la presente invención pueden opcionalmente ser conjugados a un agente inhibidor de crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina en los que se incluyen por ejemplo un maitansinoide o calicheamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o los semejantes. Los anticuerpos y oligopéptido de enlace de TAT empleados en los métodos de la presente invención pueden opcionalmente ser producidos en células CHO o células bacterianas. Todavía otra modalidad de la presente invención es concerniente con un método para tratar terapéuticamente un tumor en un mamífero, en donde el crecimiento del tumor es por lo menos en parte dependiente del (de los) efecto (s) de potenciación del crecimiento de un polipéptido de TAT, en donde el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo, un oligopéptido o molécula orgánica pequeña que se enlaza al polipéptido de TAT, antagonizando mediante esto la actividad potenciadora del crecimiento del polipéptido de TAT y dando como resultado el tratamiento terapéutico efectivo del tumor. Opcionalmente, el tumor es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o anticuerpo de una sola cadena. Anticuerpos, oligopéptidos de enlace de TAT y moléculas orgánicas de enlace de TAT empleados en los métodos de la presente invención pueden opcionalmente ser conjugados a un agente inhibidor de crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina en los que se incluyen por ejemplo un maitansinoide o calicheamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o los semejantes. Los anticuerpos y oligopéptidos empleados en el método de la presente invención pueden opcionalmente ser producidos en células CHO o células bacterianas.
C . Modalidades Adicionales En todavía modalidades adicionales, la invención es concerniente con el siguiente conjunto de reivindicaciones potenciales para esta solicitud: 1. Ácido nucleico aislado que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico a: (a) una molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10) ; (b) una molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10) , que carece de su péptido de señal asociado; (c) una molécula de ADN que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10), con su péptido de señal asociado; (d) una molécula de ADN que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10), que carece de sus péptido de señal asociado, (e) la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); (f) la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (g) el complemento de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) ó (f) - 2. Un ácido nucleico aislado que tiene: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), (b) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), con su péptido de señal asociado; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelulares del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NO: 1-5); (f) la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (g) el complemento de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) ó (f) . 3. Ácido nucleico aislado que se hibridiza a: (a) un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10) ; (b) un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un ácido nucleico que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), con su péptido de señal asociado; (d) un ácido nucleico que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); (f) la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (g) el complemento de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) ó (f) - 4. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la hibridización ocurre bajo condiciones severas. 5. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque es de por lo menos aproximadamente 5 nucleótidos de longitud. 6. Un vector de expresión caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3. 7. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el ácido nucleico está enlazado operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector. 8. Una célula huésped caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 7. 9. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque es una célula CHO, una célula de E. coli o una célula de levadura. 10. Un proceso para producir un polipéptido caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 8 bajo condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido y recuperar el polipéptido del cultivo celular. 11. Un polipéptido aislado caracterizado porque tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácido a : (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10) , con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en la cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NO: 1-5) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5). 12. Un polipéptido aislado caracterizado porque tiene : (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), con su secuencia de péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5) . 13. Un polipéptido quimérico caracterizado porque comprende el polipéptido de la reivindicación 11 ó 12 fusionado a un polipéptido heterólogo. 14. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el polipéptido heterólogo es una secuencia de etiqueta de epítopo o una región Fc de una inmunoglobulina. 15. Un anticuerpo aislado caracterizado porque se enlaza a un polipéptido que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos a: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6- 10), con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10) , que carece de su péptido de señal asociado, (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5). 16. Un anticuerpo aislado caracterizado porque se enlaza a un polipéptido que tiene: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), con su secuencia de péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5) . 17. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, caracterizada porque es un anticuerpo monoclonal . 18. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque es un fragmento de anticuerpo. 19. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque es un anticuerpo quimérico o anticuerpo humanizado. 20. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque es conjugado a un agente inhibidor del crecimiento. 21. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque es conjugado a un agente citotóxico. 22. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el agente citotóxicos es seleccionado del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 23. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el agente citotóxico es una toxina. 24. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la toxina es seleccionada del grupo que consiste de maitansinoide y calicheamicina. 25. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la toxina es un maitansinoide . 26. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque es producidos en bacterias . 27. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque es producido en células CHO. 28. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque induce la muerte de la célula a la cual se enlaza. 29. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque es marcado detectablemente . 30. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque tiene una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 ó 16. 31. Un vector de expresión caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 30, enlazado operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector. 32. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 31. 33. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque es una célula CHO, una célula de E. coli o una célula de levadura. 34. Un proceso para producir un anticuerpo caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 32 bajo condiciones apropiadas para la expresión del anticuerpo y recuperar el anticuerpo del cultivo celular. 35. Un oligopéptido aislado caracterizado porque se enlaza a un polipéptido que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácido a: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10) , con su péptido de señal asociado, (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10) , que carece de su péptido de señal asociado, (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5). 36. Un oligopéptido aislado caracterizado porque se enlaza a un polipéptido que tiene: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelulares del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), con su secuencia de péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de sus secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5) . 37. El oligopéptido de conformidad con la reivindicación 35 ó 36, caracterizado porque es conjugado a un agente inhibidor del crecimiento. 38. El oligopéptido de conformidad con la reivindicación 35 ó 36, caracterizado porque es conjugado a un agente citotóxico. 39. El oligopéptido de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el agente citotóxico es seleccionado del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 40. El oligopéptido de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el agente citotóxico es una toxina. 41. El oligopéptido de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la toxina es seleccionada del grupo que consiste de maitansinoide y calicheamicina . 42. El oligopéptido de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la toxina es un maitansinoide. 43. El oligopéptido de conformidad con- la reivindicación 35 ó 36, caracterizado porque induce la muerte de una célula a la cual se enlaza. 44. El oligopéptido de conformidad con la reivindicación 35 ó 36, caracterizado porque es marcado detectablemente . 45. Una molécula orgánica de enlace de TAT caracterizada porque se enlaza a un polipéptido que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos a: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6- 10) , con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6- 10) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5) . 46. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque se enlaza a un polipéptido que tiene : (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), con su secuencia de péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelulares del péptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5) . 47. La molecular orgánica de conformidad con la reivindicación 45 ó 46, caracterizada porque es conjugada a un agente inhibidor del crecimiento. 48. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 45 ó 46, caracterizada porque es conjugada a un agente citotóxico. 49. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque el agente citotóxico es seleccionado del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 50. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque el agente citotóxico es una toxina. 51. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la toxina es seleccionada del grupo que consiste de maitansinoide y calicheamicina . 52. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada porque la toxina es un maitansinoide . 53. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 45 ó 46, caracterizada porque induce la muerte de una célula a la cual se enlaza. 54. La molecular orgánica de conformidad con la reivindicación 45 ó 46, caracterizada porque es marcada detectablemente . 55. Una composición de materia caracterizada porque comprende : (a) el polipéptido de conformidad con la reivindicación 11; (b) el polipéptido de conformidad con la reivindicación 12; (c) el polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 13; (d) el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15; (e) el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16; (f) el oligopéptido de conformidad con la reivindicación 35; (g) el oligopéptido de conformidad con la reivindicación 36; (h) la molécula orgánica de enlace de TAT de conformidad con la reivindicación 45; o (i) la molécula orgánica de enlace de TAT de conformidad con la reivindicación 46; en combinación con un portador. 56. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 55, caracterizada porque el portador es un portador aceptable farmacéuticamente. 57. Un artículo de manufactura caracterizado por que comprende : (a) un recipiente; y (b) la composición de materia de conformidad con reivindicación 55 contenida dentro del recipiente. 58. El artículo de manufactura de conformidad contra la reivindicación 57 caracterizado por que comprende además una etiqueta fija al recipiente o un inserto de paquete incluido con el recipiente, que hace referencia al uso de la composición de materia para el tratamiento terapéutico de o la detección de diagnóstico de un cáncer. 59. Un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa una proteína que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos a: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6- 10) , con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrado por cualquiera de las figuras 1-5 (SEQ ID NOS:l-5) , o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5), el método comprende poner en contacto la célula con un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica que se enlaza a la proteína, el enlace del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica a la proteína provocando mediante esto una inhibición del crecimiento de la célula. 60. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado por que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . 61. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado por que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 62. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado por que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o anticuerpo humanizado. 63. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado por que el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es conjugado a un agente inhibidor del crecimiento. 64. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado por que el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es conjugado a un agente citotóxico. 65. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado por que el agente citotóxico es seleccionado del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radiactivos y enzimas núcleolíticas . 66. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado por que el agente citotóxico es una toxina. 67. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado por que la toxina es seleccionada de grupo porque consiste que maitansinoide y calicheamicina. 68. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado por que la toxina es un maitansinoide. 69. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado por que el anticuerpo es producido en bacterias . 70. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado por que el anticuerpo es producido en células CHO. 71. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado por que la célula es una célula de cáncer. 72. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado por que la célula de cáncer es expuesta adicionalmente a tratamiento de radiación o un agente de quimioterapéutico . 73. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado por que la célula de cáncer es seleccionada del grupo que consiste de célula de cáncer de pecho, célula de cáncer colorrectal, célula de cáncer de pulmón, célula de cáncer de ovario, célula de cáncer del sistema nervioso central, célula de cáncer de hígado, célula de cáncer de vejiga, célula de cáncer pancreática, célula de cáncer cervical, célula de melanoma y célula de leucemia. 74. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado por que la proteína es expresada más abundantemente por la célula de cáncer en comparación con célula normal del mismo origen del tejido. 75. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado por que provoca la muerte de la célula. 76. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado por que la proteína tiene: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de la figura 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de la figura 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), con su secuencia de péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las figuras 1-5 (SEQ ID N0S:l-5) . 77. Un método para tratar terapéuticamente a un mamífero que tiene un tumor canceroso que comprende células que expresan una proteína que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos a: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6- 10) , con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia del nucleótido mostrado en cualquiera de las figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de plena longitud de la secuencia del nucleótidos mostrada en cualquiera de las figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5), el método esta caracterizado por que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica que se enlaza a la proteína, tratando mediante esto efectivamente al mamífero. 78. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado por que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . 79. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado por que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo . 80. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado por que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o anticuerpo humanizado. 81. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado por que el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es conjugado a un agente inhibidor del crecimiento. 82. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado por que el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es conjugado a un agente citotóxico. 83. El método de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado por que el agente citotóxico es seleccionado del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radiactivos y enzimas nucleolíticas . 84. El método de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado por que el agente citotóxico es una toxina. 85. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado por que la toxina es seleccionada del grupo que consiste de maitansinoide y calicheamicina. 86. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado por que la toxina es un maitansinoide. 87. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado por que el anticuerpo es producido en bacterias . 88. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado por que el anticuerpo es producido en células CHO. 89. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado por que el tumor es expuesto adicionalmente a tratamientos de radiación o un agente quimioterapéutico. 90. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado por que el tumor es tumor de pecho, tumor colorrectal, tumor de pulmón, tumor de ovarios, tumor del sistema nervioso central, tumor de hígado, tumor de vejiga, tumor pancreático, o tumor cervical. 91. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado por que la proteína es expresada más abundantemente por las células cancerosas al tumor en comparación con una célula normal del mismo origen de tejido. 92. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado por que la proteína tiene: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrada en cualquiera de las figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), con su secuencia de péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrada en cualquiera de las figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5) o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las figuras 1-5 (SEQ ID NOS.1-5) . 93. Un método para determinar la presencia de una proteína en una muestra que sospecha de contener la proteína, en donde la proteína tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácido a: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10) , con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6- 10) , que carece de su péptido de señal asociado, (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5), el método está caracterizado porque comprende exponer la muestra a un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica que se enlaza a la proteína y determinar el enlace del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica a la proteína en la muestra, en donde el enlace del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica a la proteína es indicador de la presencia de la proteína en la muestra. 94. El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque la muestra comprende una célula que se sospecha de expresar la proteína. 95. El método de conformidad con la reivindicación 94, caracterizada porque la célula es una célula de cáncer. 96. El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es marcado detectablemente. 97. El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque la proteína tiene: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelulares del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), con su secuencia de péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelulares, del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de sus secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5) . 98. Un método para diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, el método está caracterizado porque comprende determinar el nivel de expresión de un gen que codifica una proteína que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos a: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10) , con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrado en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5), en una muestra de prueba de células de tejido obtenido del mamífero y en una muestra de control de células normales conocidas del mismo origen de tejido, en donde un nivel más alto de expresión de proteína en la muestra de prueba, en comparación con la muestra de control, es indicador de la presencia de tumor en el mamífero en el cual la muestra de prueba fue obtenida. 99. El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque la etapa de determinar el nivel de expresión de gen que codifica la proteína comprende emplear un oligonucleótido en una hibridización in situ o análisis de RT-PCR. 100. El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque la etapa de determinar el nivel de expresión de un gen que codifica la proteína comprende emplear un anticuerpo en un análisis de inmunohistoquímica o de bandas de proteína. 101. El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque la proteína tiene: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) la secuencia de aminoácido mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), con su secuencia de péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5), o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5) . 102. Un método para diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, el método está caracterizado porque comprende poner en contacto una muestra de células de tejido obtenidas del mamífero con un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica que se enlaza a una proteína que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos a: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10) , con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (f) un polipéptido codificado por la secuencia de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5), y detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica y la proteína en la muestra de prueba, en donde la formación del complejo es indicadora de la presencia de un tumor en el mamífero. 103. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es marcado detectablemente. 104. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque la muestra de prueba de células de tejido es obtenida de un individuo que se sospecha de tener tumor canceroso. 105. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque la proteína tiene: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10) , que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), con su secuencia de péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5) . 106. Un método para tratar o prevenir una alteración proliferativa celular asociada con la expresión o actividad incrementada de una proteína que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos a: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10) , con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en la cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NO: 1-5) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5), el método está caracterizado porque comprende administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento una cantidad efectiva de un antagonista de la proteína, tratando o impidiendo mediante esto efectivamente la alteración proliferativa celular. 107. El método de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado porque la alteración proliferativa celular es cáncer. 108. El método de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado porque el antagonista es un anticuerpo de polipéptido de anti-TAT, oligopéptido de enlace de TAT, molécula orgánica de enlace de TAT u oligonucleótido antisentido. 109. Un método para enlazar un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica una célula que expresa una proteína que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos a: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6- 10) , con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en la cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NO: 1-5) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5), el método está caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica que se enlaza a la proteína y permitir que ocurra el enlace del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica a la proteína, enlazando mediante esto el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica a la célula. 110. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . 111. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 112. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado. 113. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es conjugado a un agente inhibidor del crecimiento. 114. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es conjugado a un agente citotóxico. 115. El método de conformidad con la reivindicación 114, caracterizado porque el agente citotóxico es seleccionado del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 116. El método de conformidad con la reivindicación 114, caracterizado porque el agente citotóxico es una toxina. 117. El método de conformidad con la reivindicación 116, caracterizado porque la toxina es seleccionada del grupo que consiste de maitansinoide y calicheamicina. 118. El método de conformidad con la reivindicación 116, caracterizado porque la toxina es un maitansinoide. 119. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque el anticuerpo es producido en bacterias . 120. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque el anticuerpo es producido en células CHO. 121. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque la célula es una célula de cáncer. 122. El método de conformidad con la reivindicación 121, caracterizado porque la célula de cáncer es expuesta adicionalmente a tratamiento de radiación o un agente quimioterapéutico . 123. El método de conformidad con la reivindicación 121, caracterizado porque la célula de cáncer es seleccionada del grupo que consiste de célula de cáncer de pecho, célula de cáncer colorectal, célula de cáncer de pulmón, célula de cáncer de ovarios, célula de cáncer del sistema nervioso central, célula de cáncer de hígado, célula de cáncer de vejiga, célula de cáncer pancreático, célula de cáncer cervical, célula de melanoma y célula de leucemia. 124. El método de conformidad con la reivindicación 123, caracterizado porque la proteína es expresada más abundantemente por la célula de cáncer en comparación con una célula normal del mismo origen de tejido. 125. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque provoca la muerte de la célula. 126. El uso de un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 30, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer. 127. El uso de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 30, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor. 128. El uso de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 30, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para tratamiento o prevención de una alteración proliferativa celular. 129. El uso de un vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 o 31, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer. 130. El uso de un vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 o 31, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor. 131. El uso de un vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 o 31, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una alteración proliferativa celular. 132. El uso de una célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 32 o 33, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer. 133. El uso de una célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 32 o 33, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor. 134. El uso de una célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 32 o 33, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una alteración proliferativa celular. 135. El uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer . 136. El uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor. 137. El uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una alteración proliferativa celular. 138. El uso de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 29, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer. 139. El uso de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 29, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor. 140. El uso de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 29, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una alteración proliferativa celular. 141. El uso de un oligopéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 44, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer. 142. El uso de un oligopéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 44, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor. 143. El uso de un oligopéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 44, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una alteración proliferativa celular. 144. El uso de una molécula orgánica que se enlaza a TAT de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45 a 54, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer. 145. El uso de una molécula orgánica que se enlaza a TAT de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45 a 54, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor. 146. El uso de una molécula orgánica que se enlaza a TAT de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45 a 54, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una alteración proliferativa celular. 147. El uso de una composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55 o 56, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer. 148. El uso de una composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55 o 56, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor. 149. El uso de una composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55 o 56, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una alteración proliferativa celular. 150. El uso de un artículo de manufactura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 57 o 58, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer. 151. El uso de un artículo de manufactura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 57 o 58, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor. 152. El uso de un artículo de manufactura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 57 o 58, caracterizado porque se usa en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una alteración proliferativa celular. 153. Un método para inhibir el crecimiento de una célula, caracterizado porque el crecimiento de la célula es por lo menos en parte dependiente de un efecto potenciador del crecimiento de una proteína que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6- 10) , con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en la cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NO: 1-5) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5), el método está caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica que se enlaza a la proteína, para inhibir mediante esto el crecimiento de la célula. 154. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque la célula es una célula de cáncer. 155. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque la proteína es expresada por la célula. 156. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el enlace del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica a la proteína antagoniza la actividad potenciadota del crecimiento de la proteína. 157. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el enlace del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica a la proteína induce la muerte de la célula. 158. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . 159. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 160. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado. 161. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es conjugado con un agente inhibidor del crecimiento. 162. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es conjugado a un agente citotóxico. 163. El método de conformidad con la reivindicación 162, caracterizado porque el agente citotóxico es seleccionado del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 164. El método de conformidad con la reivindicación 162, caracterizado porque el agente citotóxico es una toxina. 165. El método de conformidad con la reivindicación 164, caracterizado porque la toxina es seleccionada del grupo que consiste de maitansinoide y calicheamicina. 166. El método de conformidad con la reivindicación 164, caracterizado porque la toxina es un maitansinoide. 167. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el anticuerpo es producido en bacterias. 168. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el anticuerpo es producido en células CHO. 169. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque la proteína tiene: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10) , que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), con su secuencia de péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5) . 170. Un método para tratar terapéuticamente un tumor en un mamífero, en donde el crecimiento del tumor es por lo menos en parte dependiente del efecto potenciador del crecimiento de una proteína que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10) , con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en la cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NO: 1-5) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5), el método está caracterizado porque comprende poner en contacto la proteína con un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica que se enlaza a la proteína, para tratar mediante esto de manera efectiva el tumor. 171. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque la proteína es expresada por las células del tumor. 172. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque el enlace del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica a la proteína antagoniza la actividad potenciadota del crecimiento de la proteína. 173. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . 174. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 175. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado. 176. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es conjugado a un agente inhibidor del crecimiento. 177. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es conjugado a un agente citotóxico. 178. El método de conformidad con la reivindicación 177, caracterizado porque agente citotóxico es seleccionado del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 179. El método de conformidad con la reivindicación 177, caracterizado porque el agente citotóxico es una toxina. 180. El método de conformidad con la reivindicación 179, caracterizado porque la toxina es seleccionada del grupo que consiste de maitansinoide y calicheamicina. 181. El método de conformidad con la reivindicación 179, caracterizado porque la toxina es un maitansinoide. 182. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque el anticuerpo es producido en bacterias . 183. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque el anticuerpo es producido en células CHO. 184. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque la proteína tiene: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), con su secuencia de péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5) . Todavía modalidades adicionales de la presente invención serán evidentes para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica después de la lectura de la presente especificación .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) de un TAT501 cADN, en donde SEQ ID NO : 1 es un clon designado en la presente como "DNA62877". La figura 2 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 2) de un TAT502 cADN, en donde SEQ ID NO: 2 es un clon designado en la presente como "DNA279661". La figura 3 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) de un TAT503 cADN, en donde SEQ ID NO: 3 es un clon designado en la presente como "DNA66667". La figura 4 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 4) de un TAT504 cADN, es un clon designado en la presente como "DNA347767" . La figura 5 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 5) de un TAT505 cADN, es un clon designado en la presente como "DNA48606". La figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO:l mostrada en la figura 1. La figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 2 mostrada en la figura 2. La figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 3 mostrada en la figura 3. La figura 9 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 4 mostrada en la figura 4. La figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 5 mostrada en la figura 5.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS I . Definiciones Los términos "polipéptido de TAT" y "TAT" como se usan en la presente y cuando son seguidos inmediatamente por una designación numérica, se refieren a varios polipéptidos, en donde la designación completa (esto es, TAT/número) se refiere a secuencias de polipéptidos específicas como se describe en la presente. Los términos "TAT/polipéptido número" y "TAT/número" en donde el término "número" es provisto como una designación numérica real, como se usa en la presente, abarcan polipéptidos de secuencia natural, variantes de polipéptidos y fragmentos de polipéptidos de secuencia natural y variantes de polipéptidos (que son definidos adicionalmente en la presente) . Los polipéptidos de TAT descritos en la presente pueden ser aislados de una variedad de fuentes, tales como de tipos de tejido humano o de otra fuente o preparados mediante métodos recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido de TAT" se refiere a cada TAT/polipéptido número individual revelado en la presente. Todas las revelaciones en esta especificación que se refieren a "polipéptido de TAT" se refieren a cada uno de los polipéptidos individuales también como conjuntamente. Por ejemplo, descripciones de la preparación de, purificación de, derivación de, formación de anticuerpos a o contra, formación de oligopéptidos de enlace de TAT a o contra, formación de moléculas orgánicas de enlace de TAT a o contra, formación de moléculas orgánicas de enlace de TAT a o contra, administración de, composiciones que contienen, tratamiento de una enfermedad con, etc., pertenecen a cada polipéptido de la invención individualmente. El término "polipéptido de TAT" también incluye variantes de los polipéptidos de TAT/número revelados en la presente. Un "polipéptido de TAT de secuencia natural" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos como el polipéptido de TAT correspondiente derivado de la naturaleza. Tales polipéptidos de TAT de secuencia natural pueden ser aislados de la naturaleza o pueden ser reproducidos mediante medios recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido de TAT de secuencia natural" abarca específicamente formas truncadas que se presentan de manera estable en la naturaleza o formas secretadas del polipéptido de TAT específico (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular) , formas variantes que se presentan de manera estable en la naturaleza (por ejemplo, formas alternativamente divididas) y variantes alélicos que se presentan de manera estable en la naturaleza del polipéptido. En ciertas modalidades de la invención, los polipéptidos de TAT de secuencia natural revelados en la presente son polipéptidos de secuencia natural maduros o de plena longitud que comprenden las secuencias de aminoácidos de plena longitud mostrados en las figuras adjuntas. Los codones de inicio y parada (si son indicados) son mostrados en fuentes en negritas y subrayados en las figuras . Los residuos de ácido nucleico indicados como "N" o "X" en las figuras adjuntas son cualquier residuo de ácido nucleico. Sin embargo, en tanto que se muestra que los polipéptidos de TAT revelados en las figuras adjuntas comienzan con residuos de metionina designados en la presente como posición de aminoácido 1 en las figuras, es concebible y posible que otros residuos de metionina ubicados ya sea corriente arriba o corriente debajo de la posición de aminoácido 1 en las figuras pueda ser usado como el residuo de aminoácido de partida para los polipéptidos de TAT. El "dominio extracelular" de polipéptido de TAT o "ECD" se refiere a una forma del polipéptido de TAT que está esencialmente libre de los dominios de transmembrana y citoplásmicos . Ordinariamente, un ECD de polipéptido de TAT tendrá menos de 1% de tales dominios de transmembrana y/o citoplásmicos y preferiblemente tendrá menos de 0.5% de tales dominios. Se comprenderá que cualesquier dominios de transmembrana identificados por los polipéptidos de TAT de la presente invención son identificados de acuerdo con criterios usados sistemáticamente en el arte para identificar aquel tipo de dominio hidrofóbico. Las fronteras exactas de un dominio de transmembrana pueden variar, pero más probablemente por no más de aproximadamente 5 aminoácidos, ya sea en un extremo u otro del dominio como se identifica inicialmente en la presente. Por consiguiente, opcionalmente, un dominio extracelular de un polipéptido de TAT puede contener de aproximadamente 5 o menos aminoácidos ya sea en un lado u otro de la frontera de dominio de transmembrana/dominio extracelular, como se identifica en los ejemplos o especificación y tales polipéptidos, con o sin el péptido de señal asociado y ácido nucleico que los codifica, son contemplados por la presente invención.
La ubicación aproximada de los "péptidos de señal" de los varios polipéptidos de TAT revelados en la presente puede ser mostrada en la presente especificación y/o las figuras adjuntas. Sin embargo, se notará que la frontera C-terminal de un péptido de señal puede variar, pero más probablemente por no más de aproximadamente 5 aminoácidos, ya sea en un lado u otro de la frontera C-terminal del péptido de señal, como se identifica inicialmente en la presente, en donde la frontera C-terminal del péptido de señal puede ser identificado de acuerdo con criterios usados sistemáticamente en el arte para identificar aquel tipo de elemento de secuencia de aminoácidos (por ejemplo, Nielsen et al., Prot . Eng. 10:1-6 (1997) y von Heinje et al., Nucí. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)). Además, también se reconoce que, en algunos casos, la escisión de una secuencia de señal de un polipéptido secretado no es completamente uniforme, dando como resultado más de una especie secretada. Estos polipéptidos maduros, en donde el péptido de señal es escindido dentro de no más de aproximadamente 5 aminoácidos ya sea en un lado u otro de la frontera C-terminal del péptido de señal como se identifica en la presente y los polinucleótidos que los codifican, son contemplados por la presente invención. "Variante de polipéptido de TAT" significa un polipéptido de TAT, preferiblemente un polipéptido de TAT activo, como se identifica en la presente, que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácido con una secuencia de polipéptido de TAT de secuencia natural de plena longitud, como se revela en la presente, una secuencia de polipéptido de TAT que carece del péptido de señal como se revela en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido de TAT, con o sin el péptido de señal, como se revela en la presente o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptidos de TAT de plena longitud como se revela en la presente (tal como aquellos codificados por un ácido nucleico que representa solo una porción de la secuencia de codificación completa para un polipéptido de TAT de plena longitud) . Tales variantes de polipéptido de TAT incluyen, por ejemplo, polipéptidos de TAT en donde uno o más residuos de aminoácidos son agregados o cancelados, en el término N- o C- de la secuencia de aminoácidos natural de plena longitud. Ordinariamente, una variante de polipéptido de TAT tendrá por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, con una secuencia de polipéptidos de TAT de secuencia natural de plena longitud como se revela en la presente, una secuencia de polipéptido de TAT que carece del péptido de señal como se revela en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido de TAT, con o sin el péptido de señal, como se revela en la presente o cualquier otro fragmento definido específicamente de una secuencia de . polipéptidos de TAT de plena longitud como se revela en la presente. Ordinariamente, los polipéptidos variantes de TAT son de por lo menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 aminoácidos de longitud o más. Opcionalmente, los polipéptidos variantes de TAT tendrán no más que una sustitución de aminoácido conservadora, en comparación con la secuencia de polipéptidos de TAT natural, alternativamente no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoácidos conservadoras, en comparación con la secuencia de polipéptidos de TAT natural . "Por ciento (%) de unidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a la secuencia de polipéptidos TAT identificadas en la presente se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidato que son idénticas con los residuos de aminoácidos en la secuencia de polipéptidos TAT específicos, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para obtener el máximo porcentaje de identidad de secuencia y no considerando ninguna subdivisión conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación por propósitos de determinar el % de identidad de secuencia de aminoácidos se puede obtener de varias maneras que están dentro de la habilidad de aquel de habilidad en la técnica, por ejemplo utilizando elementos de programación de computadoras disponibles públicamente tales como copia datos o copiar datos. Aquellos experimentados en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, en los que se incluyen cuales quiera algoritmos necesarios para obtener una alineación máxima sobre la plena longitud de las secuencias que son comparadas. Por propósitos de la presente, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos son generados utilizando el programa de computadora de comparación de secuencias ALIGN-2, en donde el código de fuente completo para el programa copiar ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 a continuación. El programa de computadora de comparación de secuencias ALIGN-2 fue autorizado por Genentech y el código fuente mostrado en la Tabla 1 a continuación a sido presentado con recomendación del usuario en la oficina de derechos reservados de los Estados Unidos, Washington D.C., 20559, en donde esta registrado bajo el numero de registro de derechos reservados de los Estados Unidos No. TXU510087. El programa ALIGN-2 esta disponible públicamente por medio de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede ser compilado del código fuente proporcionado en la Tabla 1 a continuación. El programa ALIGN-2 debe ser compilado para uso en un sistema operativo UNÍX, V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencias son ajustados por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones en donde se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A, con o contra una secuencia de aminoácidos B (la cual pude ser expresada alternativamente como una secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un cierto porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos A, con o contra una secuencia de aminoácidos B) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácidos clasificados como correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en que la alineación del programa A y B y en donde Y es el numero total de residuos de aminoácido en B . Se apreciara que en donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A. Como ejemplos de cálculos de % de identidad de secuencia de aminoácidos utilizando este método, las tablas 2 y 3 demuestran como calcular el % de identidad de secuencias de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos designada "Proteína de Comparación" con la secuencia de aminoácidos designada "TAT", en donde "TAT" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de TAT hipotético de interés, "Proteína de Comparación" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido contra la cual el polipéptido "TAT" de interés es comparado y cada " X", "Y" y "Z" representan residuos de aminoácidos hipotéticos diferentes. A no ser que se afirme específicamente de otra manera, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos utilizados en la presente son obtenidos como se describe en el párrafo inmediatamente precedente utilizando el programa de computadora ALIGN-2.
"Polínucleotido variante de TAT" O "secuencia de ácido nucleico variante de TAT" significa una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido TAT, preferiblemente un polipéptido TAT activo, como se define en la presente y que tiene en promedio aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con una secuencia de ácidos nucleótidos que codifican una secuencia de polipéptidos de TAT de secuencia natural de plena longitud como se revela en la presente, una secuencia de polipéptidos de TAT de secuencia natural de plena longitud que carece de péptido de señal como se revela en la presente, un dominio extracelular de un polipéptidos de TAT, con o sin el péptido de señal, como se revela en la presente o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptidos TAT de plena longitud como se revela en la presente (tales como aquellos codificados por un ácido nucleico que representa solamente una porción de la secuencia de codificación completa para un polipéptido de TAT de plena longitud) ordinariamente, un polinucleotido variante TAT tendrá por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, y 99% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de polipéptidos TAT de secuencia natural de plena longitud como se revela en la presente, una secuencia de polipéptidos TAT de secuencia natural de plena longitud que carece del péptido de señal como se revela en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido TAT, con o sin la secuencia de señal, como se revela en la presente o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptidos de TAT de plena longitud que se revela en la presenta. Las variantes no abarcan las secuencias de nucleótidos natural. Ordinariamente, los polinucleotidos de variantes TAT son de por lo menos aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, y 1000 nucleótidos de longitud en donde este contexto, el término "aproximadamente" significa la secuencia de nucleótidos a la que se hace referencia mas o menos 10 % de aquella longitud a la que se hace referencia. "Por ciento (%) de identidad de secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a secuencias de ácidos nucleicos que codifican mezclas TAT identificadas en la presente se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidato que son idénticas con los nucleótidos en la secuencia de ácido nucleico de TAT de interés, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para obtener el máximo porcentaje de identidad de secuencia. La aleación por propósito de determinar el % de identidad de secuencia de ácido nucleico se puede obtener de varias maneras que están dentro de la habilidad de aquel experimentado en la técnica, por ejemplo utilizando elementos de programación de computadora disponibles públicamente tales como BLAST, BLAST-2, ALIGN o elementos de programación Megalígn (DNASTAR. Por propósitos de la presente, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de ácido nucleico son generados utilizando el programa de computadora de comparación de secuencias ALIGN-2, en donde el código suelte completo para el programa ALING-2 es proporcionada en la Tabla 1 a continuación. El programa de computadora de comparación de secuencias ALIGN-2 fue utilizado por Genentech, Inc y el código fuente mostrado en la Tabla 1 a continuación a sido presentado con documentación del usuario en la oficina de derechos reservados de los Estados Unidos de América, Washington D.C., 20559, en donde esta registrado bajo el No. Re registro de derechos reservados de los Estados Unidos de América No. TXU510087. El programa ALIGN-2 esta disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede ser compilado del código fuente provisto en la Tabla 1 a continuación. El programa ALIGN-2 debe ser compilado para uso en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4. OD digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son ajustados por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones en donde se emplea ALIGN-2 para las conversiones de secuencias de ácido nucleico, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de una secuencia de ácidos nucleicos C a, con o contra una secuencia de ácidos nucleicos D (la cual puede ser denominada alternativamente como una secuencia de ácidos nucleicos dada C que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos A, con o contra una secuencia de ácidos nucleicos dada D) se calcula como sigue: 100 veces la fracción W/Z en donde W es el numero de nucleótidos clasificados como correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 e que la alineación del programa C y D, y en donde Z es el numero total de nucleótidos D. Se apreciara que en donde la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad de secuencias de ácidos nucleicos de C a D no será igual al % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos D a C. Como ejemplos de cálculos de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, las tablas 4 y 5 demuestran como calcular el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ácidos nucleicos designada "ADN de Comparación" con la secuencia de ácido nucleico designada "TAT-ADN", en donde "TAT-ADN" representan una secuencia de ácidos nucleicos de codificación TAT hipotética de interés, "ADN de Comparación" representa la presencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico contra la cual la molécula de ácido nucleico de "TAT-ADN" de interés es comparada y cada uno de "N", "L" y "V" representan diferentes nucleótidos hipotéticos . A no ser que se afirme de otra manera específicamente, todos los valores de % de identidad de secuencia de ácido nucleico utilizados en la presente son obtenidos como se describe en el párrafo inmediatamente precedente utilizando el programa de computadora ALIGN-2. En otras modalidades, los polinucleotidos variantes TAT son moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de TAT y que son capaces de hibridizar, de preferencia bajo condiciones de hibridización y lavado severa, a secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptidos TAT de plena longitud como se revela en la presente. Polipéptidos variantes TAT pueden ser aquellos que son codificados por un polinucleotido variante de TAT. El término "región de codificación de plena longitud" cuando se usa en referencia con un ácido nucleico que codifica un polipéptido de TAT se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifican el polipéptido TAT de plena longitud de la invención (que esta frecuentemente mostrado entre los codones de inicio y retención, inclusive de las mismas figuras adjuntas) . El término "región de codificación de plena longitud" cuando se usan referencia con el ácido nucleico depositado en ATCC se refiere a la porción de codificación de polipéptidos TAT cADN que es insertado al vector depositado con la ATCC (que es frecuentemente mostrado entre los codones de inicio de retención, inclusive de los mismos, en las figuras adjuntas) . "Aislado" cuando se use en la presente para describir los varios polipéptidos TAT revelados en la presente, significa un polipéptido que ha sido identificado y separado o recuperado de un componente de su ambiente natural. Componentes determinantes de su ambiente natural son materiales que comúnmente interferirían con los usos de diagnostico o terapéuticos para el polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En modalidades preferidas, el polipéptido será purificado (1) a un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciado de copa de centrifugación o (2) a homogeneidad mediante SDA-PAGE bajo condiciones no reductoras o reducturas utilizando azul de comasio o preferiblemente teñido de plata. El polipéptido aislado incluye polipéptido in-situ dentro de células recombinantes, puesto que por lo menos un componente del ambiente natural del polipéptido TAT no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el polipéptido aislado será preparado mediante por lo menos una etapa de purificación. Un ácido nucleico que codifica polipéptido TAT "aislado" u otro ácido nucleico que codifica el polipéptido es una molécula de ácido nucleico que es identificada y separada de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual esta ordinariamente asociada en la fuente natural en el ácido nucleico que codifica el polipéptido. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido aislada es diferente que en forma o ajuste en la cual se encuentra en la naturaleza. Por consiguiente, las moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptido aisladas son distinguidas de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido especifico ya que existen células naturales . Sin embargo una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido aislada incluye moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos contenidas en las células que expresan ordinariamente en el polipéptido en donde por ejemplo, la molécula de ácido nucleico, esta en un sitio como su mal diferente a aquel que de las células naturales. El teérmino "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación enlazada operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son apropiadas para procariontes, por ejemplo incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador y un sitio de enlace de ribosoma. Las células Eucarióticas son conocidas para utilizar como promotores, señales de poliadimilacion y mej oradores . Ácido nucleico esta "enlazado operativamente" cuando esta colocado en relación funcional con otras secuencias de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una pre- secuencia o líder secretorio es enlazada operativamente ADN para un polipéptido si es enlazada como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador esta enlazado operativamente a una secuencia de codificación si ha afecta la transcripción de la secuencia o un sitio de enlace de ribosoma esta enlazado operativamente a una secuencia de codificación si esta colocado para facilitar la traducción. En general, "enlazado operativamente" significa que las secuencias de ADN que son enlazadas son contiguas y en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los mej oradores no tienen que ser contiguos. El enlace se lleva a cabo mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de ologonucleoticos sintéticos son usados de acuerdo con la practica convencional . La "severidad" de reacciones de hibridización es determinable fácilmente por aquel de habilidad ordinaria en la técnica y en general es un calculo empírico dependiente de la longitud de sonda, temperatura de lavado y concentración de la sal. En general, las sondas mas largas requieren temperaturas mas altas para un recosido apropiado, en tanto que las sondas mas cortas necesitan temperaturas más bajas.
La hibridización depende en general de la capacidad ADN desnaturalizado al recocido cuando hebras complementarias están presentes en el ambiente de bajo de su temperatura de fusión. Mientras más alto es el grado de homología deseado entre la sonda y secuencia hibridaberma más alta la temperatura relativa que puede ser usada. Como resultado, se sigue que las temperaturas relativas más altas tenderían a ser las condiciones de reacción más severas, en tanto que las temperaturas más bajas menos. Para detalles adicionales y explicación de la severidad de las reacciones de hibridización, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995) . "Condiciones Severas" o "Condiciones de alta severidad", como se definen en la presente, pueden ser identificadas como aquellas que: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/dodecil sulfato de sodio al 0.1% a 50° C; (2) emplean durante la hibridización un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo 50% (v/v) de formamida con albúmina se suero bovino al 0.1%/0.1% Ficoll/0.1% de polivinilpirrolidona/solución reguladora de pH fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C o (3) hibridización durante toda la noche en una solución que emplea 50% de formamida, 5 x SSC (0.75 M NaCl) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1%, 5 x de solución de Denhardt' s, ADN de esperma de salmón solificada (50 µg/ml), SDS al 0.1% y sulfato de dextran a 10% a 42°C, con un lavado de 10 minutos a 42 °C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio / citrato de sodio) seguido por un lavado de alta severidad de 10 minutos que consiste de 0.1 x SSC que contiene EDTA a 55 °C. "Condiciones moderadamente severas" pueden ser identificadas como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de una solución de lavado y condiciones de hibridización (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % SDS) menos severas que aquellas descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente severas son incubación durante toda la noche a 37 °C en una solución que comprende: 20% de formamida, 5 x SSC (150 mM NaCl) citrato de trisodio 15 mM, fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), 5 x de solución Denhardt ' s, 10% de sulfato de dextrina y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros en 1 x SSC aproximadamente a 37-50°C. El experimentar una técnica reconocerá como ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. para acomodar factores tales como longitud sonda y los semejantes. El término "Epitopo etiquetado" cuando se use la presente se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido de TAT o anti-cuerpo TAT fusionado a un "polipéptido de etiqueta". El polipéptido de etiqueta tiene suficiente residuo para proporcionar un Epitopo contra el cual un anti-cuerpo puede ser elaborado, y aun esta vía lo suficientemente corto de tal manera que no interfiere con la actividad del polipéptido al cual es fusionado. El polipéptido de etiqueta preferiblemente también es bastante único de tal manera que los anticuerpos no reaccionan totalmente de manera cruzada con otros Epitopos . Polipéptidos de etiqueta apropiados tienen en general por lo menos 6 residuos de aminoácidos y usualmente y entre aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoácidos (preferiblemente, entre alrededor de 10 y 20 residuos de aminoácidos) . "Activo" o " Actividad" para los propósitos de la presente se refiere a forma (s) de un polipéptido de TAT que retiene una actividad biológica o un actividad inmunológica de TAT natural o que se presentan de manera estable en la naturaleza, en donde actividad "biológica" se refiere a una función biológica (ya sea inhibidora o estimuladora) provocada por un TAT natural o que se presenta de una manera estable en la naturaleza diferente a la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un Epitopo antihigiénico poseído por un TAT natural o que se presenta de manera estable en la naturaleza y una actividad "inmunológico" se • refiere a la capacidad de inducir la producción de un anti-cuerpo contra un Epitopo antihigiénico poseído por un TAT natural o que se presenta de manera estable en la naturaleza. El término "Antagonista" es usado en el sentido mas amplio e incluye cualquier molécula que bloque parcial o plenamente, inhibe o neutraliza una actividad biológica de un polipéptido de moléculas TAT natural revelado en la presente. De manera similar, el término "agonista" es usado en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita una actividad biológica de un polipéptido TAT natural revelado en la presente. Moléculas agonistas o antagonistas apropiadas incluyen específicamente anti-cuerpos agonistas o antagonistas o fragmentos de anti-cuerpos, fragmentos o variantes de secuencias de aminoácidos de polipéptidos TAT naturales, peptidos, oligo nucleotidos antisentido, moléculas orgánicas pequeñas, etc. Los métodos para identificar agonista o antagonistas de un polipéptido TAT pueden comprender poner en contacto un polipéptido TAT con una, molécula agonista o antagonista candidato y medir un cambio detectable en una o mas actividades biológicas normalmente asociadas polipéptido TAT. "Tratar" o "Tratamiento" o "Alivio" se refiere tanto a medidas de tratamiento terapéutico como medidas profilácticas o preventivas, en donde el objeto es prevenir o disminuir (acortar) la condición o alteración patológica apuntada. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con la alteración también como aquellos propensos a tener la alteración o aquellos en quienes la alteración va a ser impedida. Un sujeto o mamífero es "tratado" exitosamente en cuanto a un cáncer que expresa polipéptido de moléculas TAT si, después de recibir una cantidad terapéutica de un anti-cuerpo Anti-TAT, el oligopéptido de enlace de TAT o molécula orgánica de enlace de TAT de acuerdo con los métodos de la presente invención, el paciente muestra una reducción observable y/o mensurable en ausencia de uno o más de los siguientes: reducción en el numero de células de cáncer o ausencia de células de cáncer; reducción en el tamaño de tumor; inhibición (esto es, frenado a alguna extensión y de preferencia retención) de infiltración de células de cáncer a órganos periféricos en los que se incluyen la dispersión del cáncer al tejido blando y hueso; inhibición (esto es, frenado a alguna extensión y preferiblemente retención) de metástasis de tumor, inhibición, a alguna extensión, de crecimiento de tumor y de alivio a alguna extensión, de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer especifico; morbides y mortandad reducida en mejora de calidad de las cuestiones de vida. A la extensión del anti-cuerpo anti-TAT u oligopéptido de enlace de TAT pueden impedir el crecimiento y/o exterminar células de cáncer existentes, puede ser citostatico y/o citotóxico. La reducción de estas señales o síntomas puede también ser sentida por el paciente. Los parámetros anteriores para determinar el tratamiento exitoso y mejora en la enfermedad ya son mensurables por procedimientos sistemáticos familiares para el medico. Para la terapia del cáncer, la eficacia puede ser medida, por ejemplo al determinar el tiempo del avance de la enfermedad (TTP) y/o determinar la velocidad de respuesta (RR) . La metástasis puede ser determinada mediante escalamiento de pruebas, mediante exploración de hueso y pruebas en cuanto a nivel de calcio y otras encimas para determinar la dispersión o esparcimiento al hueso. Exploraciones CT también se pueden realizar para el esparcimiento a la pelvis y nodos linfáticos en el área. Rayos X de pecho y medición de niveles de encima del hígado mediante métodos conocidos son usados para buscar metástasis a los pulmones e hígado, respectivamente. Otros métodos sistemáticos para verificar la enfermedad incluyen ultrasonografia transrectal (TRUS) y biopsia de aguja transrectal (TRNB) . Para cáncer de vejiga, que es un cáncer mas localizado, los métodos para determinar el avance de la enfermedad incluyen evaluación citológica urinaria mediante citoscopía, verificación en cuanto a la presencia de sangre en la orina, visualización del sistema urotelial mediante sonografia o un pielograma intravenoso, tomografía computarizada (CT) y formación de imagen de resonancia magnética (MRI) . La presencia de metástasis distantes puede ser determinada mediante CT del abdomen, rayos x de pecho o formación de imagen de radio nucleótidos del esqueleto. Administración "Crónica" se refiere a la administración del agente (S) el modo continuo en oposición o un modo agudo, para mantener el efecto terapéutico inicial (actividad) por un periodo de tiempo extenso. Administración "intermitente" es tratamiento que no se hace consecutivamente sin interrupción, si no mas bien es cíclica por naturaleza. "Mamífero" por propósitos de tratamiento de aliviar los síntomas de o diagnosis de un cáncer se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, en los que se incluyen humanos, animales domésticos y de granja, y de zoológico, animales deportivos o mascotas tales como perros, gatos, ganado, caballos, ovejas, puercos, cabras, conejos, etc. Preferiblemente, el mamífero es humano. Administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluyen la administración simultanea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden. "Portadores" como se usa en la presente incluyen portadores, incipientes o estabilizadores aceptables farmacéuticamente que no son tóxicos a la célula o mamífero al que es expuesto a las verificaciones y consideraciones empleadas . Frecuentemente el portador aceptable fisiológicamente es una solución acuosa de pH regulado. Ejemplos de portadores aceptables fisiológicamente incluyen soluciones reguladoras del pH tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes en los que se incluyen ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrodilona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, argimina o glicina; monosecaridos, disacáridos y otros carbohidratos en los que se incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes gelantes tales como moléculas EDTA; alcohol de azúcar tales como manitol o sorbitol; contrallones formadores de sal tales como sodio y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN, polietielglicol (PEG), y PLURONICS. "Fase Sólida" o " Soporte Sólido" significa una matriz no acuosa a la cual un anti-cuerpo, oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica de enlace TAT de la presente invención se puede adherir o anexar. Ejemplos de fase sólida abarcadas en la presente incluyen aquellas formadas parcial o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado) , polisacaridos (por ejemplo agarosa) , poliaclamidas, poliestireno, alcohol polivinilico y siliconas. En ciertas modalidades, dependiendo del contexto sólida puede comprender la cavidad de una placa de análisis; en otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad) .Este término también incluye fases solidad discontinua de partículas discretas, tal como aquella revelada en la patente estadounidense No. 4,275,149. Un "Liposoma" es un vesiculo pequeño compuesto de varios tipos de lípidos, fosfolipidos y/o surfactante que es útil para la administración de un fármaco (tal como un polipéptido TAT, un anti-cuerpo del mismo o un oligopéptido de enlace TAT) a un mamífero. Los componentes del liposoma son arengados comúnmente en una formación de bicapa, similar al arreglo de lípidos de las membranas biolologicas . Una molécula "pequeña" o molécula orgánica "pequeña" es definida en la presente por tener un peso molecular menor aproximadamente Daltons . Una "cantidad efectiva" de un polipéptido, anticuerpo, oligopéptido, de enlace TAT, molécula orgánica de enlace TAT o un agonista o antagonista de la misma como se revela en la presente es una cantidad suficiente para llevar a cabo un propósito afirmado específicamente. Una "cantidad efectiva" puede ser determinada empíricamente y de manera sistemática, en relación con el propósito afirmado. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un anticuerpo, polipéptido, oligopéptido de enlace TAT, molécula orgánica de enlace TAT u otro fármaco efectivo para "tratar" una alteración o enfermedad en un sujeto mamífero. En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede reducir el numero de células de cáncer; reducir el tamaño del tumor; inhibir (esto es, frenar alguna extensión y preferiblemente detener) la infiltración de células de cáncer a órganos periféricos; inhibir (esto es, frenar una extensión y preferiblemente detener) la metástasis del tumor; inhibir una extensión el crecimiento del tumor y/o aliviar alguna extensión uno o mas de los síntomas asociados con el cáncer. Véase la definición en la presente de "tratar". A la extensión que el fármaco puede impedir el crecimiento y/o exterminar células de cáncer existentes, puede ser citostatico y/o citotóxico. Una "cantidad inhibidora del crecimiento" de un anti-cuerpo, anti-molecula TAT, polipéptido de moléculas TAT, oligopéptido de enlace TAT, o molécula orgánica de enlace TAT es una cantidad capaz de inhibir el crecimiento de una célula, especialmente tumor, por ejemplo célula de cáncer, ya sea in vitro o in vivo. Una "cantidad" inhibidora de crecimiento "de un anti-cuerpo anti-moleculas TAT, polipéptidos de moléculas TAT, oligopéptido de enlace de moléculas TAT o molécula orgánica de enlace de moléculas TAT por propósitos de inhibir el crecimiento de células neoplásicas pude ser determinada empíricamente y de manera sistemática. Una "Cantidad Citotóxica" de un anti-cuerpo anti- TAT, polipéptido de TAT, oligopéptido de enlace de TAT o molécula de enlace TAT es una cantidad capaz de provocar la destrucción de una célula, especialmente de tumor, por ejemplo célula de cáncer ya sea in vitro o in vivo. Una "cantidad citotóxica" de un anti-cuerpo anti-TAT, polipéptido TAT, oligopéptido de enlace de TAT o molécula orgánica de enlace TAT por propósitos de inhibir el crecimiento de células neoplásicas puede ser determinada empíricamente y de manera sistemática.
El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente por ejemplo, anti-cuerpos monoclonales anti-TAT individuales (en lo que se incluyen anti-cuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes) , composiciones de anti-cuerpo anti-TAT con especialidad poliepitopica, anti-cuerpos policlonales, anticuerpos anti-TAT de una sola cadena y fragmentos de anticuerpos anti-TAT (véase a continuación) en tanto que exhiban la actividad biológica o inmunológica deseada. El término "inmunoglobulina" (Ig) se usa intercambiablemente con anticuerpo en la presente. Un "anticuerpo aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales los cuales interferirían con los usos de diagnostico o terapéuticos para el anti-cuerpo y pueden incluir encimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En modalidades preferidas, el anti-cuerpo será purificado (1) a mas del 95% en peso del anticuerpo tal como se determina por el método de Lowry y más preferentemente mas del 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante del uso de un secuenciador o (3) a homogeneidad mediante SDA-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomasie o preferiblemente teñido de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes puesto que por lo menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado será preparado mediante por lo menos una etapa de purificación. La unidad de anticuerpos de 4 cadenas básicas es una glicoproteina heterotetamerica compuesta de dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H) (un anticuerpo IgM consiste de 5 de las unidades de heterotetramero básicas junto con polipéptido adicional llamado cadena J y por consiguiente contiene 10 sitios de enlace de antígeno, en tanto que los anticuerpos IgA secretados pueden polimerizar para formar conjuntos polivalentes que comprenden 2-5 de las unidades de 4 cadenas básicas junto con la cadena J) . En el caso de IgGs, la unidad de 4 cadenas es en general aproximadamente de 150,000 Daltons . Cada cadena L es enlazada a una cadena H mediante un enlace de disulfuro covalente, en tanto que las dos cadenas H son enlazadas entre si mediante uno o mas enlaces de disulfuro dependiendo del tipo de cadena H. Cada cadena H y L también tiene puentes de disulfuro de intracadena espaciados regularmente. Cada cadena H tiene en el termino N un dominio variable (VH) ) seguido por tres dominios constantes (CH) para cada una de las cadenas al a y y a y 4 dominios CH subíndice H para los isotipos µ y. Cada cadena L tiene en cada termino N, un dominio variable (VL) seguido por un dominio constante (Cu en su otro extremo. El VL esta alineado con el VH y CL y esta alineado con el primer dominio de constante de la cadena pesada (CH1) . Los residuos de aminoácidos particulares que se cree que forman una interfase entre los dominios variable de cadena ligera y cadena pesada. El apareamiento de un VH y V forma conjuntamente un solo sitio de enlace de antígeno. Para la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, véase por ejemplo Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 y capítulo 6. La cadena L de cualquier de especie de vertebrados puede ser asignada a uno de 2 tipos claramente distintos, llamados kappa y lambda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes . Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de dominio constante de sus cadenas pesadas (CH) las inmunoglobulinas pueden ser asignadas a diferentes clases o isotipos. Hay 5 clases de inmunoglobinas : IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, que tienen cadenas pesadas designadas , d, e, y, y µ, respectivamente. Las clases ? y a son divididas además en subclases en base a diferencias relativamente menores en secuencia de CH y función , por ejemplo los humanos expresan las siguientes subclases: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, and IgA2. El termino "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren extensamente en secuencias entre anticuerpos. El dominio V modera el enlace de antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no esta distribuida igualmente a través del barrido de 110 aminoácidos de los dominios variables . En lugar de esto, las regiones V consisten de estiramientos relativamente invariantes llamadas regiones de estructura (SFR) de 15-30 aminoácidos separadas por regiones mas cortas de variabilidad extrema llamadas "hipervariables" que son cada una de 9-12 aminoácidos de largo. Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden cada una cuatro SFR, que adoptan extensamente una con liberación de hoja ß, conectada con tres regiones hipervariables que forman bucles que se conectan y en algunos casos forman arte de la estructura de ß-hoja. Las regiones hipervariable en cada cadena son mantenidas con untamente en proximidad mediante los SFR y con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen en la formación del sitio de enlace anfígeno de anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) ) ; los dominios constantes no están involucrados directamente en el enlace de un anticuerpo a un anfígeno, pero eximen varias funciones efectoras tales como participación del anticuerpo en la cistotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . El termino "región hipervariable" cuando se usa la presente se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables por el enlace de antígeno. La región hipervariable comprende en general residuos de aminoácidos de una "región que determina la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, alrededor de aproximadamente residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) y alrededor de aproximadamente 1-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el VL VH; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, residuo 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el VL, y 26-32 (Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el VH; Chothia and Lesk J^ Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).
El termino "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se presentan de manera estable en la naturaleza que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, son dirigido contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con comparaciones de anticuerpo policlonal que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos) , cambian a anticuerpo monoclonal es dirigido contra un solo determinante sobre al anfígeno. Además de su especifidad los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que pueden ser sintetizados sin contaminar por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" no será interpretado que requiere la producción del anticuerpo mediante algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención pueden ser preparados mediante la metodología de hibridoma descrita primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) o pueden ser elaborados utilizando métodos de ADN recombinantes en células de animales o plantas bacterianas eucarionticas (véase, por ejemplo, patente Estado Unidense No, 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" pueden ser también aislados de vidriotecas de anticuerpos de fago utilizando las técnicas descritas Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales de la presente incluyen anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa con secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie en particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, en tanto que el resto de la (S) cadena (S) es idéntica con u homologa con secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, también como fragmentos de tales anticuerpos, en tanto que eximan la actividad biológica deseada (véase patente Estadounidense No. 4,816,567; and Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de clase de anfígeno de dominio variable derivado de un primate no humanos (por ejemplo, mono del viejo mundo, simio, etc.) y secuencias de región constante humanas. Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende un sitio de enlace de anfígeno también como un CL y por menos dominios constantes de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser de secuencia natural (por ejemplo, dominios constantes de secuencia natural humanos) o variantes de secuencias de aminoácidos de los mismos. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene uno más funciones efectoras. "Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente, el enlace de anfígeno o región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmento de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab',. F(ab')2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (véase patente Estadounidense No. 5,641,870, ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpos de una sola cadena y anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. La digestión de papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de enlace de anfígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab" y un fragmento "Fc" residual, una designación que refleja la capacidad para cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consiste de toda una cadena L junto con el dominio de región variable de la cadena H (VH y el primer dominio constante de una cadena pesada (CH1) ) . Cada fragmento Fab es monovalente con respecto al enlace de anfígeno, esto es, tiene un solo sitio de enlace de anfígeno.
El tratamiento con pepsina de un anticuerpo produce un solo fragmento grande F(ab')2 que corresponde aproximadamente a 2 fragmentos de Fab enlazados por disulfuro que tienen actividad de enlace de anfígeno divalente y es todavía capaz de reticulación del anfígeno. Los fragmentos de Fab' difieren de los términos Fab por tener pocos residuos adicionales en el termino carboxy del dominio CH1 en los que se incluyen una o más cisteinas de la región de engosne del anticuerpo. Fab ' -SH es la de la designación de la presente para Fab' en la cual (lo) residuo (s) de cisteina de los dominios constantes portan un grupo diol libre . Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente eran producidos como pares de fragmentos Fab' que tiene cisteinas de engosne entre ellos. Otros acoplamientos de sus químicos de fragmentos de anticuerpos son también conocidos. El fragmento Fc comprende las porciones carboxy-terminales de ambas cadenas H retenidas mediante disulfuros. Las fuciones efectuoras de los anticuerpos son determinadas por secuencias en la región Fc, tales regiones también la parte reconocida por los receptores Fc (FcR) encontrado en ciertos tipos de células. "Fv" Es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un reconocimiento de antígeno y sitio de enlace completo. Este fragmento consiste en un de un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y una ligera en fuerte no covalente. A partir del pliegue de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno de la cadena H y L) que contribuyen a los residuos de aminoácidos para el enlace de antígeno y confieren especifidad de enlace de antígeno la anticuerpo. Sin embargo, a un solo dominio variable (o la mitad Fv que comprende solamente tres CDRs específicos para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y enlazar el antígeno, aunque a una afinidad más baja que todo el sitio de enlace. "Fv de una sola cadena" también abreviado "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios de anticuerpo VH o VL conectados a una sola cadena de polipéptidos. Preferiblemente, el polipéptido de sFv comprende además un enlazador de polipéptido entre los dominios VH ay VLa que permite que sFv forme la estructura deseada para el enlace de antígeno. Para una revisión sFv, véase Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995. El termino "diacuerpo" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños preparados al construir fragmentos de sFv (véase párrafo precedente) con enlazadores cortos (5-10 residuos) entre los dominios VH y VL, de tal manera que el apareamiento de inter-cadena pero no intra-cadena de los dominios V se obtiene, dando como resultado un fragmento divalente, esto es, fragmento que tiene dos sitios de enlace de antígeno. Los diacuerpos biespecificos son heterodimeros de dos fragmentos sFv "cruzados" en los cuales los dominios de VH y VL de los dos anticuerpos están presentes diferentes cadenas de anticuerpos. Los diacuerpos son descritos mas plenamente por ejemplo en EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al-, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) . Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. Por la mayor parte, los anticuerpo humanizados son inmunuglobinas humanas (anticuerpo receptor) en los cuales los residuos de una región hipervariable de receptor son reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad de anticuerpo deseados. En algunas instancias, los residios de región de estructura (FR) de la inmunoglobina humana son remplazados por residuos no humanos correspondientes, además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residios que no son encontrados en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de por lo menos uno y comúnmente dos dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobina no humana y todos o sustancialmente todos de las FRs son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc) , comúnmente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) . Un "anticuerpo dependiente de la especie", por ejemplo IgE anti-hu ano mamífero, es un anticuerpo que tiene una afinidad de enlace mas fuerte para un antígeno de una primera especie de mamífero que tiene para un homologo de aquel antígeno de una segunda especie de mamífero. Normalmente el anticuerpo dependiente de la especie "se enlaza específicamente" a un antígeno humano (esto es , tiene un valor de afinidad de enlace) (Kd) de no mas aproximadamente 1 x 10~7 M, preferiblemente no más de aproximadamente 1 x 10-8 y más preferiblemente no mas 1 x 10-9 M) pero tiene una afinidad de enlace por un homologo del antígeno de una segunda especie de mamíferos no humana que es por lo menos aproximadamente 50 veces o por lo menos aproximadamente 500 veces o por lo menos aproximadamente 1000 veces mas débil que su afinidad de enlace por el antígeno humano. El anticuerpo dependiente de la especie puede ser de cualquiera de los varios tipos de anticuerpos como se definen anteriormente, pero preferiblemente es un anticuerpo humanizado o humano. Un "oligopéptido de enlace TAT" es un oligopéptido que se enlaza, de preferencia específicamente, a un polipéptido de TAT como se describe en la presente. Los oligopéptidos de enlace de TAT pueden ser sintetizados químicamente utilizando metodología de síntesis de oligopéptidos conocida o pueden ser preparados o purificados utilizando tecnología recombinante. Los oligopéptidos de enlace de TAT son usualmente de por lo menos aproximadamente 5 aminoácidos de longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 aminoácidos de longitud o mas, en donde tales oligopéptidos que son aptos de enlace, de preferencia específicamente, a un polipéptido TAT como se describe en la presente. Los oligopéptido de enlace TAT pueden ser identificados sin experimentación indebida utilizando técnicas bien conocidas. A este respecto, se - notara que técnicas para seleccionar bibliotecas de oligopéptidos en cuanto a oligopéptidos que son aptos de enlace específicamente a un polipéptido objetivo son bien conocidos en la técnica (véanse, patentes estadounidenses Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; publicaciones PCT Nos. WO 84/03506 and WO84/03564; Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986) ; Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363, y Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668) . Una "molécula orgánica de enlace TAT" es una molécula orgánica diferente a un oligopéptido o anticuerpo como se define en la presente que se enlaza, de preferencia, específicamente, a un polipéptido TAT como se describe en la presente. Las moléculas orgánicas de enlace TAT pueden ser identificadas y sintetizadas químicamente utilizando metodologías bien conocidas (véase, por ejemplo publicaciones de PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585) . Las moléculas orgánicas de enlace TAT son usualmente menores de aproximadamente 2000 daltons de tamaño, alternativamente menos de aproximadamente 1500, 750, 500, 250 o 200 daltons de tamaño, en donde tales moléculas orgánicas que son aptas de enlace, de preferencia específicamente, a un polipéptido TAT como se describe en la presente pueden ser identificadas sin experimentación indebida utilizando técnicas bien conocidas. A este respecto, se notara que las técnicas para seleccionar bibliotecas de moléculas orgánicas en cuanto a moléculas que son aptas de enlace a un objetivo de polipéptido son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo publicaciones de PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585) . Un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica "que se enlaza" a un anticuerpo de interés, por ejemplo un objetivo de antígeno de polipéptido asociado a tumor es uno que se enlaza al antígeno con suficiente afinidad de tal manera que el anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica es útil como agente de diagnostico y/o terapéutico para apuntar a una célula o tejido que expresa el antígeno y no reacciona de manera cruzada significativamente con otras proteínas. En tales modalidades, la extensión del enlace del anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica a una proteína "no-objetivo" será menor aproximadamente de 10% del enlace del anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica a su proteína objetivo particular tal como se determina mediante análisis de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitacion (RÍA) . Con respecto a un enlace de un anticuerpo oligopéptido u otra molécula orgánica a una molécula objetivo, el termino "enlace especifico" o "enlace específicamente" o es "especifico por" un polipéptido particular o un epitopo según objetivo de polipéptido particular significa enlace que es mensurable diferente de una interacción no especifica. El enlace especifico puede ser medido, por ejemplo al terminar el enlace de una molécula comparada con el enlace de una molécula de control, que en general es una molécula de estructuras similar que no tiene actividad de enlace. Por ejemplo, el enlace específico puede ser determinado por competencia con una molécula de control que es similar al objetivo, por ejemplo un exceso de objetivo sin marcar. En este caso, el enlace especifico es indicado si el enlace del objetivo marcado a una sonda es inhibido competivamente mediante el objetivo sin marcar en exceso. El termino "enlace especifico" o "enlaza específicamente a" o es " especifico por" un polipéptido particular o un epitopo sobre un objetivo de polipéptido particular como se usa en la presente puede ser exhibido, por ejemplo por una molécula que tiene una Kd por el objetivo de por lo menos aproximadamente 10" M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10 -5 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10" M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10 -7 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10" M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10" M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10 -10 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10 -11 M, alternativamente por lo menos aproximadamente M, o mayor. En una modalidad el termino "enlace especifico" se refiere al enlace en donde una molécula se enlaza a un polipéptido o epitopo particular sobre un polipéptido particular sin enlazarse sustancialmente a cualquier otro polipéptido o epitopo de polipéptido. Un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que "inhibe el crecimiento de células de tumor que expresan un polipéptido de TAT" o un anticuerpo "inhibidor de crecimiento", oligopéptido u otra molécula orgánica en la cual se obtiene como resultado una inhibición de crecimiento mensurable de células de cáncer que expresan o sobre expresan el polipéptido de TAT apropiado. El polipéptido de TAT pude ser un polipéptido de transmembrana expresado sobre la superficie de una célula de cáncer o puede ser un polipéptido que es producido y segregado por una célula de cáncer. Los anticuerpos anti-TAT inhibidores del crecimiento preferidos, oligopéptidos o moléculas orgánicas inhiben el crecimiento de células de tumor que expresan TAT por más del 20%, preferiblemente de alrededor del 20% a aproximadamente 50% y aún más preferiblemente, por más del 50% (por ejemplo, de aproximadamente 50% a aproximadamente 100%) en comparación con el control apropiado, el control comúnmente son células de tumor no tratadas con el anticuerpo, oligopéptidos u otra molécula orgánica que es probada. En una modalidad, la inhibición de crecimiento puede ser medida a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.1 a 30 µg/ml o aproximadamente 0.5 nM a 200 nM en cultivo celular, en donde la inhibición del crecimiento es determinada 1-10 días después de la exposición de las células de tumor al anticuerpo. La inhibición del crecimiento de células de tumor in vivo puede ser determinada de varias maneras, tal como se describe en la sección de Ejemplos Experimentales posteriormente en la presente. El anticuerpo es inhibidor del crecimiento in vivo sin la administración del anticuerpo anti-TAT a aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 100 µg/kg de peso corporal da como resultado reducción del tamaño del tumor o proliferación de la célula del tumor en aproximadamente 5 días a dos meses a partir de la primera administración del anticuerpo, de preferencia en el transcurso de aproximadamente 5 a 30 días. Un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que "induce apoptosis" es una que induce la muerte celular programada tal como se determina mediante enlaces de anexina V, fragmentación de ADN, encogimiento o contracción celular, dilatación del retículo endoplásmico, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membranas (llamados cuerpos apoptóticos) . La célula es usualmente una que sobreexpresa un polipéptido de TAT. Preferiblemente, la célula es una célula de tumor, por ejemplo una célula de próstata, pecho, ovario, estómago, célula endometrial, de pulmón, riñon, colon, vejiga. Varios métodos están disponibles para evaluar los eventos celulares asociados con la apoptosis. Por ejemplo, la translocación de fosfatidilserina (PS) puede ser medida mediante enlace de anexina; la fragmentación de ADN puede ser evaluada por medio de escalonamiento de ADN y la condensación nuclear/cromatina junto con la fragmentación de ADN puede ser evaluada por cualquier implemento en células hipodiploides . Preferiblemente, el anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que induce apoptosis es una que da como resultado aproximadamente 2 a 50 veces, de preferencia aproximadamente de 5 a 50 veces y con mayor preferencia de aproximadamente 10 a 50 veces, la inducción de enlaces de anexina en relación con las células sin tratar en un análisis de enlace de anexina. "Funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región de Fc de secuencia natural o región de Fc variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo y varían con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones aceptoras de anticuerpo incluyen: enlace de Clq y citotoxicidad dependiente del complemento; enlace del receptor Fc; citotoxicidad moderada por la célula dependiente de anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; regulación descendente de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B) y activación de célula B. "Citotoxicidad moderada por la célula dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la cual Ig secretado enlazado sobre receptores de (FcRS) presentes sobre ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células exterminadoras naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se enlacen específicamente a una célula objetivo que lleva antígeno y sustancialmente exterminen la célula objetivo con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" las células citotóxicas y son absolutamente requeridos para tal exterminio. Las células primarias para moderar ADCC, células NK, expresan Fc?RIII solamente, mientras que los monocitos expresan Fc?RI, Fc?RII y Fc?RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas es resumida en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991) . Para determinar la actividad de ADCC de una molécula de interés, un análisis ADCC in vitro, tal como aquel descrito en la Patente estadounidense No. 5,500,362 ó 5,821,337 se puede llevar a cabo. Las células efectoras útiles para tales análisis incluyen células mononucleares sanguíneas perriféricas (PBMC) y células exterminadoras naturales (NK) . Alternativa o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede ser determinada in vivo, por ejemplo, en un modelo de animal tal como aquel revelado en Clynes et al. (EUA) 95:652-656 (1998). "Receptor Fc" o "FcR" describe un receptor que se enlaza a la región de Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un Fc humano de secuencia natural. Además, un FcR preferido es uno que enlaza un anticuerpo FcR (receptor gamma) e incluye receptores de las subclases Fc?RI, Fc?RII y Fc?RIII, incluyendo variantes alélicas y formas alternativamente rebanadas de estos receptores. Los receptores Fc?RII incluyen Fc?RIIA (un "receptor de activación") y Fc?RIIB (un "receptor inhibidor") , que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor activador Fc?RIIA contiene una porción de activación a base de tirosina inmunorreceptora (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición Fc?RIIB contiene una porción de inhibición a base de tirosina inmunorreceptora (ITIM) en su dominio citoplásmico. (Véase revisión M. in Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) ) . Los FcRs son revisados en Ravetch y Kinet, Annu.
Rev. Immunol . 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330- 41 (1995) . Otros FcRs, de los que se incluyen aquellos a ser identificados en el futuro, son abarcados por el término "FcR" en la presente. El término también incluye el receptor neonatal FcRn, que es responsable de la transferencia de IgGs al feto (Guyer et al., J. Immunol . 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).
"Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs que llevan cabo funciones efectoras . Preferiblemente, las células expresan por lo menos Fc?RIII y llevan a cabo la función efectora de ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que moderan ADCC incluyen células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) , células exterminadoras naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; los PBMC y células NK son preferidos. Las células efectoras pueden ser aisladas a partir de una fuente natural, por ejemplo, de la sangre. "Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula objetivo en presencia de complemento. La activación de la ruta de complemento clásica es iniciada por el enlace del primer componente del sistema de complemento (Clq) a anticuerpos (de la subclase apropiada) que son enlazados a su antígeno cognato. Para determinar la activación del complemento, un análisis CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202:163 (1996), se puede llevar a cabo. Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que está caracterizada comúnmente por el crecimiento celular sin regular. Ejemplos de cáncer incluyen pero no están limitados a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o malignidades linfoides. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de célula escamosa (por ejemplo, cáncer de célula escamosa epitelial) , cáncer de pulmón en los que se incluyen cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de células pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o estomacal en los que se incluyen cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del sistema urinario, hepatoma, cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma penil, melanoma, mieloma múltiple y linfoma de células B, cerebro, también como cáncer de cabeza y cuello y metástasis asociadas . Los términos "alteración proliferativa celular" y "alteración proliferativa" se refieren a alteraciones que están asociadas con algún grado de proliferación celular anormal. En una modalidad, la alteración proliferativa celular es cáncer. "Tumor" como se usa en la presente se refiere a todo el crecimiento celular y proliferación neoplásica, ya sea maligno o benigno y todas las células y tejidos pre- cancerosos y cancerosos. Un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que "induce muerte celular" es una que provoca que una célula viable se convierta en no viable. La célula es una que expresa un polipéptido TAT, preferiblemente una célula que sobreexpresa un polipéptido TAT en comparación con una célula normal del mismo tipo de tejido. El polipéptido de TAT puede ser un polipéptido de transmembrana expresado sobre la superficie de una célula de cáncer o puede ser un polipéptido que es producido y secretado por una célula de cáncer. Preferiblemente, la célula es una célula de cáncer, por ejemplo célula de pecho, ovario, estómago, endometrial, de glándula saliva, pulmón, riñon, colon, tiroides, pancreática o célula de vejiga. La muerte celular in vitro puede ser determinada en ausencia de complemento y células efectoras inmunes para distinguir la muerte celular inducida por la citotoxicidad moderada por la célula dependiente de anticuerpo (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . Así, el análisis en cuanto a la muerte celular se puede efectuar utilizando suero dinactivado por calor (esto es, en ausencia de complemento) y en ausencia de células efectoras inmunes. Para determinar si el anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica es apta de inducir muerte celular, la pérdida de integridad de membrana es evaluada mediante la absorción de yoduro de propidio (PI) , azul de tritán (véase Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995) ) o 7AAD puede ser determinado en relación con las células sin tratar. Anticuerpos que inducen muerte celular preferidos, oligopéptidos u otras moléculas orgánicas son aquellos que inducen la absorción de PI en el análisis de absorción PI en células BT474. Una "célula que expresa TAT" es una célula que expresa un polipéptido TAT endógeno o transfectado ya sea sobre la superficie celular o en una forma secretada. Un "cáncer que expresa para TAT" es un cáncer que comprende células que tienen un polipéptido de TAT presente sobre las superficie celular o que producen y segregan un polipéptido de TAT. Un "cáncer que expresa TAT" produce opcionalmente niveles suficientes de polipéptido TAT sobre la superficie de las células del mismo, de tal manera que un anticuerpo de anti-TAT, oligopéptido u otra molécula orgánica se puede enlazar al mismo y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer. En otra modalidad, un "cáncer que expresa TAT" produce opcionalmente y segrega niveles suficientes de polipéptidos de TAT, de tal manera que un antagonista de anticuerpo anti-TAT, oligopéptido u otra molécula orgánica se puede enlazar al mismo y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer. Con respecto a lo último, el antagonista puede ser un oligonucleótido antisentido que reduce, inhibe o impide la producción y secreción del polipéptido TAT secretado por las células del tumor. Un cáncer que "sobreexpresa" un polipéptido de TAT es uno que tiene niveles significativamente más alto de polipéptido de TAT en la superficie celular del mismo o produce y segrega, en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Tal sobreexpresión puede ser provocada por amplificación genética o por transcripción o traducción incrementada. La sobreexpresión del polipéptido de TAT puede ser determinada en un análisis de diagnóstico o prognóstico al evaluar niveles incrementados de la proteína de TAT presentes sobre la superficie de una célula o secretada por la célula (por ejemplo, vía un análisis de inmunohistoquímica utilizando anticuerpos anti-TAT preparados contra un polipéptido de TAT aislado que puede ser preparado utilizando tecnología de ADN recombinante de un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de TAT; análisis de FACS, etc.). Alternativa o adicionalmente, se pueden medir niveles de ácido nucleico que codifica polipéptidos de TAT o ARNm en la célula, por ejemplo vía hibridación in situ fluorescente utilizando una sonda a base de ácido nucleico correspondiente a un ácido nucleico que codifica TAT o el complemento del mismo; (FISH; véase W098/45479 publicado en octubre, 1998), transferencia Southern, transferencia Northern o técnicas de reacción en cadenas de polimerasa (PCR) tales como PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) . También se puede estudiar la sobreexpresión del polipéptido TAT al medir el antígeno cortado en un fluido biológico tal como suero, por ejemplo, utilizando análisis a base de anticuerpo (véase también, por ejemplo Patente estadounidense No. 4,933,294 expedida el 12 de junio de 1990; WO91/05264 publicada el 18 de abril de 1991; Patente estadounidense 5,401,638 expedida el 28 de marzo de 1995; y Sias et al., J. Immunol . Methods 132:73-80 (1990)). Además de los análisis anteriores, varios análisis in vivo están disponibles para el experimentado en la técnica. Por ejemplo, se pueden exponer las células en el cuerpo del paciente a un anticuerpo que está opcionalmente marcado con una etiqueta detectable, por ejemplo un isótopo radioactivo y el enlace del anticuerpo a las células en el paciente se puede evaluar, por ejemplo mediante exploración externa n cuanto a radioactividad o mediante un análisis de una biopsia tomada de un paciente previamente expuesto al anticuerpo. Como se usa en la presente, el término "inmunoadhesión" designa moléculas semejantes a anticuerpo que combinan la especificidad de enlace a una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de enlace deseada que es diferente al sitio de reconocimiento y enlace de antígenos de un anticuerpo (esto es, "heterólogo") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina es comúnmente una secuencia de aminoácidos contigua que comprende por lo menos el sitio de enlace de un receptor o un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede ser obtenida de cualquier inmunoglobulina, tales como subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3, o IgG-4, IgA (en los que se incluyen IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD or IgM. La palabra "etiqueta" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto o composición detectable que es conjugado directa o indirectamente al anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica para generar un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica "marcada". La etiqueta puede ser detectable por sí misma (por ejemplo, etiquetas de radioisótopo o etiquetas fluorescentes) o en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable. El término "agente citotóxico" como se usa en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de las células y/o provoca destrucción de las células. Se propone que el término incluya isótopos rad ,i.oact,i.vos (,por ej.emplpo, A-?Jt-211, ,I131, ,l125, vY90, -R,e186, ,R-,e188, S0m153, DB¡i212, -P,32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos por ejemplo metotrexato, adriamicina, alcaloides vinca (vincristina, vinblastina, etopósido) , doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes de intercalación, enzimas y fragmentos de los mismos tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de plantas o de origen animal, en los que se incluyen fragmentos y/o variantes de los mismos y los varios agentes antitumor o anticáncer revelados posteriormente en la presente. Otros agentes citotóxicos son descritos posteriormente en la presente. Un agente tumoricida provoca la destrucción de las células de tumor. Un "agente inhibidor de crecimiento" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula de cáncer que expresa TAT, ya sea in vitro o in vivo . Así, el agente inhibidor de crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células que expresan TAT en fase S. Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean el avance del ciclo celular (en un lugar diferente a la fase S) , tales como agentes que inducen la detención de Gl y detención de fase M. los bloqueadores de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , taxanos e inhibidores de topoisomerasa II e inhibidores tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido y bleomicina. Aquellos agentes que detienen Gl también se derraman sobre la detención de fase S, por ejemplo, agentes de alquilación de ADN, tales como tamoxifen, prednisona, dacarbacina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Información adicional se puede encontrar en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders : Filadelfia, 1995), especialmente página 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticáncer ambos derivados del árbol de tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulongitudc Rorer) derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . Paclitaxel y docetaxel promueven el montaje de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos al impedir la despolimerización, que da como resultado la inhibición de mitosis en las células. "Doxorubicina" es un antibiótico de antraciclina. El nombre químico completo de doxorubicina es 8S-cis) -10- [ (3-amino-2, 3, 6-trideoxi-oí-L-lixo-hexapiranosil) oxi] -7, 8, 9, 10-tetrahidro-6, 8, ll-trihidroxi-8- (hidroxiacetil) -l-metoxi-5, 12-naftacendiona . El término "citocina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúa sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas de polipéptidos tradicionales. Incluidas entre las citocinas están la hormona del crecimiento tal como hormona del crecimiento humana, hormona del crecimiento humana de N-metionil y hormona del crecimiento bovino; hormona para tiroides; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas de glicoproteína tales como hormona estimuladora de folículo (FSH) ; hormona estimuladora de tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH) ; factor del crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblasto; prolactina; lactógeno placental; factor a y ß de necrosis de tumor; sustancia inhibidora muleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO) ; factores de crecimiento de nervio tales como NGF-ß; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformantes (TGF) tales como TGF- y TGF-ß; factores I y II de crecimiento semejante a insulina; eritropoyetina (EPO) ; factores osteoinductivos; interferones tales como interferón -a, -ß, y ~?; factores estimuladores de colonias (CSF) tales como CSF de macrófago (M-CSF) ; CSF de macrófago de granulocito (GM-CSF) y CSF de granulocito (G-CSF) ; interleucinas (IL) tales como IL-1, IL- la, IL-2, IL-3,- IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; factor de necrosis tumoral tal como TNF-a o TNF-ß y otros factores de polipéptido en los que se incluyen LSI y ligando de kit (KL) . Como se usa en la presente, el término citocina incluye proteínas a partir de fuentes naturales o a partir de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia natural. El término "inserto de paquete" se usa en la presente para referirse a instrucciones acostumbradamente incluidas en paquetes comerciales de productos terapéuticos que contienen información acerca de las indicaciones, uso dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias concernientes con el uso de tales productos terapéuticos .
Tabla 1 *C-C incrementado de 12 a 15 *Z es promedio de EQ *B es promedio de ND * correspondencia con parada es_M; parada-parada = 0; J (joker) coincidencia = 0 */ #define _M -8 /* valor de coincidencia con una parada*/ int _día[26] [26] = { /* A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z */ /* A */ { 2, 0,-2, 0, 0,-4, 1,-1,-1, 0,-1,-2,-1, 0,_M, 1, 0,-2, 1, 1, 0, 0,-6, 0,-3, 0}, /* B */ { 0, 3,-4, 3, 2,-5, 0, 1,-2, 0, 0,-3,-2, 2,_M,-1, 1, 0, 0, 0, 0,-2,-5, 0,-3, 1}, /* C */ {-2,-4,15,-5,-5,-4,-3,-3,-2, 0,-5,-6,-5,-4,_M,-3,-5,-4, 0,-2, 0,-2,-8, 0, 0,-5}, /* D */ { 0, 3,-5, 4, 3,-6, 1, 1,-2, 0, 0,-4,-3, 2,_M,-1, 2,-1, 0, 0, 0,-2,-7, 0,-4, 2}, /* E */ { 0, 2,-5, 3, 4,-5, 0, 1,-2, 0, 0,-3,-2, 1,_M,-1, 2,-1, 0, 0, 0,-2,-7, 0,-4, 3}, /* F */ {-4,-5,-4,-6,-5, 9,-5,-2, 1, 0,-5, 2, 0,-4,_M,-5,-5,-4,-3,-3, 0,-1, 0, 0, 7,-5}, /* G */ { 1, 0,-3, 1, 0,-5, 5,-2,-3, 0,-2,-4,-3, 0,_M,-l,-l,-3, 1, 0, 0,-1,-7, 0,-5, 0}, /* H */ {-1, 1,-3, 1, 1,-2,-2, 6,-2, 0, 0,-2,-2, 2,_M, 0, 3, 2,-1,-1, 0,-2,-3, 0, 0, 2}, /* I */ {-1,-2,-2,-2,-2, 1,-3,-2, 5, 0,-2, 2, 2, -2, _M, -2,-2, -2,-1, 0, 0, 4,-5, 0,-1,-2}, /* J */ { 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_M, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0}, /* K */ {-1, 0,-5, 0, 0,-5,-2, 0,-2, 0, 5,-3, 0, 1,_M,-1, 1, 3, 0, 0, 0,-2,-3, 0,-4, 0}, /* L */ {-2,-3,-6,-4,-3, 2,-4,-2, 2, 0,-3, 6, 4,-3, _M, -3, -2,-3,-3,-1, 0, 2,-2, 0,-1,-2}, /* M */ {-1,-2,-5,-3,-2, 0,-3,-2, 2, 0, 0, 4, 6, -2, _M, -2,-1, 0,-2,-1, 0, 2,-4, 0,-2,-1}, /* N */ { 0, 2,-4, 2, 1,-4, 0, 2,-2, 0, 1,-3,-2, 2,_M,-1, 1, 0, 1, 0, 0,-2,-4, 0,-2, 1}, /* O */ {_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M, 0 ,_M, _M, _M, _M, _M, _M, _M, _M, _M, _M, _M} , /* P */ { 1,-1,-3,-1,-1,-5,-1, 0,-2, 0,-1,-3, -2,-1, _ , 6, 0, 0, 1, 0, 0,-1,-6, 0,-5, 0}, /* Q */ { 0, 1,-5, 2, 2,-5,-1, 3,-2, 0, 1,-2,-1, 1,_M, 0, 4, 1,-1,-1, 0,-2,-5, 0,-4, 3}, /* R */ {-2, 0,-4,-1,-1,-4,-3, 2,-2, 0, 3,-3, 0, 0, M, O, 1, 6, 0,-1, 0,-2, 2, 0,-4, 0}, /* S */ { 1, 0, 0, 0, 0,-3, 1,-1,-1, 0, 0,-3,-2, 1,_M, 1,-1, 0, 2, 1, 0,-1,-2, 0,-3, 0}, /* T */ { 1, 0,-2, 0, 0,-3, 0,-1, 0, 0, 0,-1,-1, 0,_M, 0,-1,-1, 1, 3, 0, 0,-5, 0,-3, 0}, /* U */ { 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_M, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0}, /* V */ { 0,-2,-2,-2,-2,-1,-1,-2, 4, 0,-2, 2, 2,-2,_M,-l,-2,-2,-l, 0, 0, 4,-6, 0,-2,-2}, /* W */ {-6,-5,-8,-7,-7, 0,-7,-3,-5, 0,-3,-2,-4,-4,_M,-6,-5, 2,-2,-5, 0,-6,17, 0, 0,-6}, /* X */ { 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_M, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0}, /* Y */ í-3,-3, 0,-4,-4, 7,-5, 0,-1, 0, -4, -1,-2, -2, _M, -5, -4, -4, -3, -3, 0,-2, 0, 0,10,-4}, /* Z */ { 0, 1,-5, 2, 3,-5, 0, 2,-2, 0, 0,-2,-1, 1,_M, 0, 3, 0, 0, 0, 0,-2,-6, 0,-4, 4} }; Tabla 1 (continuación) /* */ #incluye <stdio.h> #incluye <ctype . h> #define MAXJMP 16 /* brincos máximos en un diag*/ #define MAXGAP 24 /* no continúe para penalizar espacios más grandes que éste */ #define BRINCOS 1024 /* brincos máximos en una trayectoria */ #define MX 4 /* guardar si hay por lo menos MX-1 bases desde último brinco */ #define DMAT 3 /* valor de bases coincidentes */ #define DMIS 0 /* penalidad por bases que no coinciden */ #define DINSO 8 /* penalidad por un espacio */ #define DINS1 1 /* penalidad por base */ #define PINSO 8 /* penalidad por espacio */ #define PINS1 4 /* penalidad por residuo */ struct jmp { short n [MAXJMP]; /* tamaño de brinco (negligencia por delegar) */ unsigned short x [MAXJMP] ; /* número de base de brinco en secuencia */ }; /* límite de secuencia de 216 -1 */ struct diag { int snúcleo; /* puntuación en último brinco */ long offset; /* desplazamiento de bloque previo */ short ijmp; /* índice de brinco actual */ struct jmp jp; /* lista de brincos */ }; struct path { int spe; /* número de espacios delanteros */ short n [BRINCOS]; /* tamaño de brinco (espacio) */ int x [BRINCOS]; /* loe of jmp (último elemento antes de espacio) */ }; char *oarchivo; /* nombre de archivo de salida */ char *namex [2] ; nombres de secuencias: obtener secuencias () */ char *prog; nombre de programa por mensajes de error */ char *seqx [2] ; secuencias : obtener secuencias ( ) */ int dmax; /* mejor diag: nw ( ) */ int dmaxO; /* diag final */ int adn; /* fijar si ADN: principal () */ int endgaps ; /* fijar si se penalizan espacios finales */ int gapx, gapy; espacios totales en secuencias */ int longitudO, longitudl; /* longitudes de secuencia */ int ngapx, ngapy; /* tamaño total de espacios */ int smax; /* puntuación máxima: nw ( ) */ int *xbm; /* mapa de bits en cuanto a coincidencia */ long offset; /* desplazamiento actual en archivo de brinco */ struct diag *dx; /* retener diagonales */ struct path pp[2]; /* retener trayectoria por secuencias */ char *calloc(), *malloc ( ) , *index(), *strcpy(); char *getseq(), *g_calloc(); Tabla 1 (continuación) /* programa de alineación de Needleman-Wunsch * usos : programas archivol archivo2 * en donde archivol y archivo2 son dos secuencias AND o secuencias de proteínas . * Las secuencias pueden estar en mayúsculas o minúsculas y pueden contener ambigüedad * Cualesquier líneas que comienzan con ';', '>' ó '<' son ignoradas * Longitud de archivo máximo es 65535 (limitado por x corta sin firmar en la estructura de brinco) * Una secuencia con 1/3 o más de sus elementos ACGTU se asume que es ADN * El resultado está en el archivo "align.out" * El programa puede crear un archivo tmp en in /tmp para retener información acerca de rastreo. * Versión original desarrollada bajo BSD 4.3 en una vax 8650 */ #incluye "nw.h" #incluye "day.h" estático _dbval[26] = { 1,14,2,13,0,0,4,11,0,0,12,0,3,15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0,10,0 }; estático _pbval[26] = { 1, 2| (1«( *D'-'A' ) ) | (1«( 'N'-'A' ) ) , 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, OxFFFFFFF, 1«10, 1«11, 1«12, 1«13, 1«14, 1«15, 1«16, 1«17, 1«18, 1«19, 1«20, 1«21, 1«22, 1«23, 1«24, 1«25| (1«('E'-,A' ) ) | (1«('Q'-'A') ) }; main(ac, av) main int aechar * a v [ ] ; { prog = av [0] ; si (ac != 3) { fprintf (stderr, "usos: %s archivol archivo2\n", programa); fprintf (stderr, "donde archivol y archivo2 son dos AND o dos secuencias de proteínas . \n" ) ; fprintf (stderr, "Las secuencias pueden estar en el caso superior- o inferior \n"); fprintf (stderr, "Cualesquier párrafo que empieza con ';' o '<' será ignorado \n"); fprintf (stderr, "La salida está en el archivo \"align.out\"\n") ; salida (1) ; } namex[0] = av[l]; namex[l] = av[2]; seqx[0] = getseq (namex [0] , &longitud0) ; seqx[l] = getseq (namex [1] , &longitudl) ; xbm = (adn) ? _dbval : _pbval; endgaps = 0; /* 1 para penalizar espacios finales */ oarchivo = "align.out"; /* archivo de salida */ nw(); /* llongitudar en la matriz, obtener los brincos posibles */ readbrincos ( ) ; /* obtener los brincos reales */ print () ; /* imprimir estadística, alíneaación */ limpieza (0); /* desenlazar cualesquiera archivos tmp */} Tabla 1 (continuación) /* realizar la alíneaación, devolver mejor puntuación: principal ( ) * adn: valores en Fitch y Smith, PNAS, 80, 1382-1386, 1983 * pro: valores en PAM 250 * Cuando las puntuaciones son iguales, se prefieren las desadaptaciones a cualesquier espacio, prefiere * un nuevo espacio para extender un espacio en marcha y se prefiere un espacio en secuencia x * a un espacio en secuencia y. */ n ( ) nw { char *px, *py; /* secuencias e impresiones */ int *ndely, *dely; /* mantener seguimiento de cancelación y*/ int ndelx, delx; /* mantener seguimiento de cancelación x */ int *tmp; /* para barrido hileraO, hileral */ int mis; /* puntuación para cada tipo */ int insO, insl; /* inserción de penalidades */ register id; /* índice diagonal */ register ij ; /* índice de brinco */ register *col0, *coll; /* puntuación por actuar, última hilera */ register xx, yy; /* índice a secuencias */ dx = (struct diag *) g_calloc ("to get diags", longitudO+longitudl+1, sizeof (struct diag)); ndely = (int * ) g_calloc ( "to get ndely", longitudl+1, sizeof (int) ) ; dely = (int *) g_calloc ( "to get dely", longitudl+1, sizeof (int) ) ; colO = (int *)g calloc("to get colO", longitudl+1, sizeof (int) ) ; coll = (int *) g_calloc ( "to get coll", longitudl+1, sizeof (int) ) ; insO = (adn)? DINSO : PINSO; insl = (adn)? DINSl : PINSl; smax = -10000; si (endgaps) { for (col0[0] = dely[0] = -insO, yy = 1; yy <= longitudl; yy++) { colO [yy] = dely[yy] = colO [yy-1] - insl; ndel [yy] = yy; } col0[0] = 0; /* Waterman Bull Math Biol 84 */ } en vez de for (yy = 1; yy <= longitudl; yy++) dely[yy] = -insO; /* fill in match matríx */ for (px = seqx[0], xx = 1; xx <= longitudO; px++, xx++) { /* inicia primera entrada en columna */ si (endgaps) { si (xx == 1) coll[0] = delx = - (insO+insl) ; en vez de coll[0] = delx = colO[0] - insl; ndelx = xx; } en vez de { coll[0] = 0; delx = -insO; ndelx = 0; } Tabla 1 (continuación) ...nw for (py = seqx[l], yy = 1; yy <= longitudl; py++, yy++) { mis = col0[yy-l]; si (adn) mis += (xbm[*px-'A' ] &xbm[*py-'A' ] ) ? DMAT : DMIS; en vez de mis += _day [*px-'A' ] [*py-'A' ] ; /* penalidad de actualización para cancelación en secuencia x * favorecer nueva cancelación con respectiva cancelación en marcha * ignorar MAXGAP si se ponderan espacios finales */ si (endgaps | | ndely [yy] < MAXGAP) { si (col0[yy] - insO >= dely[yy]) { dely[yy] = colO [yy] - (insO+insl) ; ndely [yy] = 1; } en vez de { delyfyy] -= insl; ndely [yy] ++; } } en vez de { si (colO[yy] - (insO+insl) >= dely[yy]) { dely[yy] = colO [yy] - (insO+insl); ndely [yy] = 1; } en vez de ndely [yy]++; } /* actualizar penalidad en cuanto a cancelación en secuencia y; * favorecer nueva cancelación con respecto a cancelación en marcha */ si (endgaps | | ndelx < MAXGAP) { si (coll[yy-l] - insO >= delx) { delx = coll[yy-l] - (insO+insl) ; ndelx = 1; } en vez de { delx -= insl; ndelx++; } } en vez de { si (coll[yy-l] - (insO+insl) >= delx) { delx = coll [yy-1] - (insO+insl) ; ndelx = 1; } en vez de ndelx++; } /* recoger la puntuación máxima; se favorece * desadaptación con respecto a cualquier cancelación en cancelación x con respecto a cancelación y; */ ...nw id = xx - yy + longitudl - 1; si (mis >= delx && mis >= dely[yy]) coll [yy] = mis; Tabla 1 (continuación) en vez de si (delx >= dely[yy]) { coll [yy] = delx; ij = dx [id] .ijmp; si (dx [id] . jp.n[0] && ( ! adn (ndelx >= MAXJMP && xx > dx[id] . jp.x[ij]+MX) mis > dx[id] .snúcleo+DINSO) ) { dx [id] . ijmp++; si (++ij >= MAXJMP) { escribir brincos (id) ; ij = dx[id].ijmp = 0; dx [id] . offset = offset; offset += sizeof (struct jmp) + sizeof (offset) ; } } dx [id] . jp.n [ij ] = ndelx; dx [id] . jp.x [ij ] = xx; dx [id] . snúcleo = delx; } en vez de { coll[yy] = delyfyy]; ij = dx[id] .ijmp; si (dx[id] . jp.n [0] && ( ! adn (ndely [yy] >= MAXJMP && xx > dx [id] . jp.x [ij ] +MX) mis > dx[id] .snúcleo+DINSO) ) { dx [id] . ijmp++; si (++ij >= MAXJMP) { escribir brincos (id); ij = dx [id]. ijmp = 0; dx [id] . offset = offset; offset += sizeof (struct jmp) + sizeof (offset) ; } } dx [id] . jp.n[ij] = -ndely [yy]; dx [id] . jp . [ij ] = xx; dx [id] . snúcleo = delytyy]; } si (xx == longitudO && yy < longitudl) { /* last col */ si (endgaps) coll [yy] -= insO+insl* (longitudl-yy) ; si (coll[yy] > smax) { smax = coll [yy] ; dmax = id; } } } si (endgaps && xx < longitudO) coll[yy-l] -= insO+insl* (longitudO-xx) ; si (coll[yy-l] > smax) { smax = coll [yy-l ] ; dmax = id; } tmp = colO; colO = coll; coll = tmp; (void) free((char *)ndely); (void) free ((char *)dely); (void) free ((char *)colO); (void) free ((char *)coll); Tabla 1 (continuación) /' * print ( ) - rutina visible al exterior de este módulo * * estático: * getmat ( ) - dar seguimiento a mejor trayectoria, contar correspondencia: imprimir () * pr_align ( ) - imprimir alíneaación de descrito en arreglo p [] : imprimir ( ) * bloque de 1 longitud dado ( ) - 1 longitud de un bloque de líneas con números, estrellas: pr_align() * nums ( ) - poner una línea de número: bloque de 1 longitud dado ( ) * poner línea () - poner una línea (nombre, [num] , seq, [num] ) : bloque de 1 longitud dado ( ) * estrellas () - -poner una línea -de estrellas: bloque de 1 longitud dado ( ) * stripname() - retirar cualquier trayectoria y prefijo de un nombre de secuencia */ #include "nw . h" #define SPC 3 #define P_LÍNEA 256 /* línea de salida máxima */ #define P_SPC 3 /* espacio entre nombre y número y secuencia */ externo _día [26] [26] ; int o longitud; /* fijar longitud de línea de salida */ ARCHIVO *fx; /* archivo de salida */ print ( ) print { int lx, ly, primer espacio, último espacio ; /* sobreponer */ si ( (fx = fabierto (oarchivo, "w")) == 0) { fprintf (stderr, "%s : can't write %s\n", prog, oarchivo) ; limpieza (1) ; } fprintf (fx, "<primera secuencia: %s (longitud = %d) \n", namex [0], longitudO); fprintf (fx, "<segunda secuencia: %s (longitud = %d)\n", namex [1], longitudl) ; olongitud = 60; lx = longitudO; ly = longitudl; primer espacio = último espacio = 0; si (dmax < longitudl - 1) { /* espacio delantero en x */ pp[0] . spe = primer espacio = longitudl - dmax - 1; ly -= pp[0] .spc; } en vez de si (dmax > longitudl - 1) { /* espacio delantero en y */ pp[l].spc = primer espacio = dmax - (longitudl - 1) ; Ix -= pp[l] .spc; } si (dmaxO < longitudO - 1) { /* trailing gap in x */ último espacio = longitudO - dmaxO -1; lx -= último espacio; } en vez de si (dmaxO > longitudO - 1) { /* llevar espacio en y */ último espacio = dmaxO - (longitudO - 1) ; ly -= último espacio; } getmat(lx, ly, primer espacio, último espacio); pr_align ( ) ; } Tabla 1 (continuación) /* * rastrear la mejor trayectoria, contar coincidencias */ estática getmat(lx, ly, primer espacio, último espacio) getmat int Ix, ly; /* "núcleo" (menos espacios finales) */ int primer espacio, último espacio; /* superposición trasera delantera */ { int nm, iO, il, sizO, sizl; char outx[32]; double pet; register nO, ni; register char *p0, *pl; /* obtener coincidencias totales, puntuación */ iO = il = sizO = sízl = 0; pO = seqx[0] + pp[l] .spc; pl = seqx[l] + pp[0] .spc; nO = pp[l] .spc + 1; ni = pp[0] .spc + 1; nm = 0; while ( *p0 && *pl ) { si (sizO) { pl++; nl++; sizO — ; } en vez de si (sizl) { p0++; n0++; sizl—; } en vez de { si (xbm[*pO-'A'] &xbm[*pl-'A'] nm++; si (n0++ == pp[0] .x[i0] ) sizO = pp[0] .n[iO++] ; si (nl++ == pp[l] .x[il] ) sizl = pp [1] .n [il++] ; pO++; pl++; } } /* homología pet: * si se penalizan espacios finales, la base es la secuencia más corta * de otra manera, se expulsan los residuos y se toma el núcleo más corto */ si (endgaps) lx = (longitudO < longitudl)? longitudO : longitudl; en vez de lx = (lx < ly) ? Ix : ly; pet = 100.* (double) nm/ (double) lx; fprintf (fx, "\n"); fprintf (fx, "<%d match%s in an overlap of %d: %.2f percent similarity\n", nm, (nm == 1)? "" : "es", Ix, pet); Tabla 1 (continuación) fprintf (fx, "<espacios en primera secuencia: %d", gapx) ; ...get at si (gapx) { (void) sprintf (outx, " (%d %s%s)", ngapx, (adn)? "base" : "residuo", (ngapx == 1)? "":"s"); fprintf (fx, "%s", outx); fprintf (fx, ", espacios en segunda secuencia: %d", gapy); si (gapy) { (void) sprintf (outx, " (%d %s%s)", ngapy, (adn)? "base" : "residuo", (ngapy == 1)? "":"s"); fprintf (fx, "%s", outx); } si (adn) fprintf (fx, "\n<snúcleo: %d (match = %d, mismatch = %d, espacios penalizados - %d + %d por base)\n", smax, DMAT, DMIS, DINSO, DINS1); en vez de fprintf (fx, "\n<snúcleo: %d (Dayhoff PAM 250 matriz, penalización d espacios = %d + %d por residuo) \n", smax, PINSO, PINS1) ; si (endgaps) fprintf (fx, "<espacios finales penalizados. Espacio final izquierdo: %d %s%s, espacio final derecho: %d %s%s\n", primer espacio, (adn) ? "base" : "residuo", (primer espacio == 1) último espacio, (adn) ? "base" : "residuo", (último espacio == 1)? "" : "s"); en vez de fprintf (fx, "<espacios finales no penalizados\n") ; } estático nm; /* coincidencias en núcleo - por verificar */ estático lmax; /* longitudes de nombres de archivo eliminados */ estático ij [2] ; /* índice de brincos por una trayectoria */ estático nc[2]; /* número al inicio de línea actual */ estático ni [2]; /* número de elemento actual para espacios */ estático tamaño [2] ; estático char *ps [2] ; /* imprimir al elemento actual */ estático char *po[2]; /* imprimir a siguiente ranura de tabla de salida */ estático char out [2] [P_LÍNEA] ; /* línea de salida */ carácter estático estrella [P_LÍNEA] ; /* fijar por estrellas () */ /* * imprimir alíneaación de lo escrito en trayectoria de estructura pp[] */ estático pr_align ( ) pr_align { int nn; /* char count */ int más; register i; for (i = 0, lmax = 0; i < 2; i++) { nn = stripname (namex [i] ) ; si (nn > lmax) lmax = nn; nc[i] = 1; ni [i] = 1; siz [i] = ij [i] = 0; ps [i] = seqx [i] ; po [i] = out [i] ; } Tabla 1 (continuación) or (nn = nm = 0, más = 1; más; ) { ...pr_align or (i = más = 0; i < 2; i++) { /* * ¿se tiene más de esta secuencia? */ si ( ! *ps [i] ) continuar; más++; si (pp[i].spc) { /* espacio delantero */ *po[i]++ = ' * ; pp[i] .spc—; } en vez de si (siz[i]) { /* en un espacio */ *po[i]++ = '-' ; siz [i] —; } en vez de { /* se pone un elemento de secuencia */ *po [i] = *ps [i] ; si (es menor (*ps [i] ) ) *ps[i] = toupper (*ps [i] ) ; po[i]++; ps [i]++; /* * ¿estamos en el siguiente espacio para esta secuencia? */ si (ni[i] == pp[i] .x[ij [i] ] ) { /* * se necesitan fusionar todos los espacios * en este sitio */ siz[i] = pp[i] .n[ij [i]++] ; while (ni [i] == pp [i] .x [ij [i] ] ) siz[i] += pp[i] .n[ij [i]++] ; } ni[i]++; } } si (++nn == olongitud | | !más && nn) { bloque de 1 longitud dado ( ) ; for (i = 0; i < 2; i++) po [i] = out [i] ; nn = 0; } } } /* * se 1 longitud a un bloque de líneas, incluyendo números, estrellas: pr_align() */ estático bloque de 1 longitud dado ( ) bloque de 1 longitud dado { register i; for (i = 0; i < 2; i++) *po[i]— = ' \0'; Tabla 1 (continuación) ...bloque de 1 longitud dado (void) putc('\n', fx) ; for (i = 0; i < 2; i++) { si (*out[i] && (*out[i] != ' ' || *(po[i]) != ' ')) { si (i == 0) nums (i) ; si (i == 0 && *out [1] ) estrellas ( ) ; putlínea (i) ; si (i == 0 && *out [1] ) fprintf (fx, star); si (i == 1) nums (i ) ; } } } /* * se pone una línea de números: bloque de 1 longitud dado ( ) */ estático nums (ix) nums int ix; /* índice en línea de secuencia de retención de salida [] */ { char nlínea[P_LÍNEA] ; register i, j; register char *pn, *px, *py; for (pn = nlínea, i = 0; i < lmax+P_SPC; i++, pn++) *pn = ' '; for (i = nc[ix], py = out[ix]; *py; py++, pn++) { si (*py == ' ' || *py == '-') *pn = ' ' ; en vez de { si (i%10 == 0 | | (i == 1 && nc[ix] != 1) ) { j = (i < 0) ? -i : i; for (px = pn; j; j /= 10, p — ) *px = j%10 + '0'; si (i < 0) *px = ' - ' ; } en vez de *pn = ' ' ; i++; } } *pn = '\0'; nc[ix] = i; for (pn = nlínea; *pn; pn++) (void) putc(*pn, fx) ; (void) putc ( ' \n ' , fx) ; } /* * se pone una línea (nombre, [num] , secuencia, [número] ) : bloque de 1 longitud dado ( ) */ estático putlínea(ix) putl nea int ix; { Tabla 1 (continuación) ...putlinea int i; register char *px; for (px = namex [ix], i = 0; *px && *px != ':'; px++, i++) (void) putc(*px, fx) ; for (; i < lmax+P_SPC; i++) (void) putcC ', fx) ; /* éstos cuentan desde 1 : * ni[] es el elemento actual (desde 1) * nc[] es el número al inicio de línea actual */ for (px = out[ix]; *px; px++) (void) putc(*px&0x7F, fx) ; (void) putc('\n', fx) ; } /* * se pone una línea de estrellas (secuencias siempre en salida [0], salida[l]): bloque de 1 longitud dado ( ) */ estático estrellas () estrellas { int i; register char *p0, *pl, ex, *px; si (!*out[0] M (*out[0] == ' ' && *(po[0]) == ' ') || !*out[l] || (*out[l] == ' ' && *(po[l]) == ' ')) regresar; px = star; for (i = lmax+P_SPC; i; i— ) *px++ = ' ' ; for (pO = out[0], pl = out[l]; *p0 && *pl; p0++, pl++) { si (isalpha (*p0) && isalpha (*pl) ) { si (xbm[*pO-'A'] &xbm[*pl-'A' ] ) { ex — 1 * 1 . nm++; } en vez de si ( ! adn && _day [*p0- 'A' ] [*pl- ' A' ] > 0) ex = ' . ' ; en vez de ex = ' ' ; } en vez de ex = ' * ; *px++ = ex; } *px++ = ' \n ' ; *px = '\0*; } Tabla 1 (continuación) * se separa trayectoria o prefijo de pn, longitud de retorno: pr_align() */ estático stripname (pn) stripname char *pn; /* nombre de archivo (puede ser trayectoria) */ { register char *px, *py; py = 0; for (px = pn; *px; px++) si (*px == ' / ' ) py = px + 1; si (py) (void) strcpyípn, py) ; regresar (strlongitud (pn) ) ; Tabla 1 (continuación) /* * limpieza () -- limpieza de cualquier archivo tmp * getseq () - se lee en secuencia, se fija adn, longitud, longitud max * g_calloc ( ) -- calloc() con verificación de error * readbrincos ( ) - se obtienen los brincos buenos, del archivo tmp si es necesario * escribir brincos () - se escribe un arreglo 1 longitud o de brincos a un archivo tmp: n ( ) */ #include "nw.h" #include <sys/archivo . > char *jname = "/tmp/homgXXXXXX"; /* tmp archivo de brincos */ ARCHIVO *fj ; int limpieza (); /* limpieza del archivo tmp */ long lseek ( ) ; /* * retirar cualquier archivo tmp archivo si es soplado */ limpieza (i) limpieza int i; { si ( fj ) (void) unlink ( jname ) ; salida ( i ) ; } /* * se lee, se regresa impresión a secuencia, se fija adn, longitud, longitud máxima * se omiten líneas que comienzan con';', '<', ó '>' * secuencias en mayúsculas o minúsculas */ char * getseq (archivo, longitud) getseq char *archivo; /* nombre de archivo */ int *longitud; /* longitud de secuencia*/ { char línea [1024], *pseq; register char *px, *py; int natgc, tlongitud; ARCHIVO *fp; si ( (fp = fopen (archivo, "r") ) == 0) { fprintf (stderr, "%s : no se puede leer %s\n", prog, archivo); salida (1) ; } tlongitud = natgc = 0; while (fgets (línea, 1024, fp) ) { si (*línea == ' ; ' || *línea == '<' || *línea == '>') continuar; for (px = línea; *px != '\n'; px++) si (es superior (*px) || es menor (*px) ) tlongitud++; } si ( (pseq = malloc ( (unsigned) (tlongitud+6) ) ) == 0) { fprintf (stderr, "%s : malloc ( ) failed to get %d bytes for %s\n", prog, tlongitud+6, archivo) ; salida (1) ; } pseq[0] = pseq[l] = pseq[2] = pseq[3] = '\0'; Tabla 1 (continuación) . getseq py = pseq + 4; *longitud = tlongitud; rewind (fp) ; while (fgets (línea, 1024, fp) ) { si (*línea == ' ; ' || *línea == ' < ' || *línea == '>' continuar; for (px = línea; *px != '\n'; px++) { si (es superior (*px) ) *py++ = *px; en vez de si (es menor (*px) ) *py++ = toupper (*px) ; si (index ("ATGCU", * (py-1) ) ) natgc++; } } *py++ = ' \0' ; *py = '\0'; (void) fclose(fp); adn = natgc > (tlongitud/3) ; regresar (pseq+4 ) ; } char * g_calloc (msg, nx, sz) g__calloc char *msg; /* programa, rutina de llamado */ int nx, sz; /* número y tamaño de elementos */ { char *px, *calloc(); si ( (px = calloc ( (unsigned) nx, (unsigned) sz) ) == 0) { si (*msg) { fprintf (stderr, "%s: g_calloc() failed %s (n=%d, sz=%d) \n", prog, msg, nx, sz) ; salida (1) ; } } regresar (px) ; } /* * se obtienen brincos finales de dx[] or archivo tmp, se fija pp[], se restablece dmax: principal ( ) */ leer brincos () leer brincos { int fd = -1; int siz, iO, il; registro i, j, xx; si (fj) { (void) fcióse (fj ) ; si ( (fd = open(jname, 0_RDONLY, 0)) < 0) { fprintf (stderr, "%s: can't open ( ) %s\n", prog, jname) ; limpieza (1) ; } } for (i = iO = il = 0, dmaxO = dmax, xx = longitudO; ; i++) { while (1) { for (j = dx [dmax] . ijmp; j >= 0 && dx [dmax] . jp.x [j ] >= xx; : —J Tabla 1 (continuación) ...readbrincos si (j < 0 && dx [dmax] .offset && fj ) { (void) lseek(fd, dx [dmax] . offset, 0); (void) read(fd, (char *) &dx{dmax] . jp, sizeof (struct jmp)); (void) read(fd, (char *) &dx [dmax] .offset, sizeof (dx [dmax] .offset) ) ; dx [dmax] .ijmp = MAXJMP-1; } en vez de break; } si (i >= BRINCOS) { fprintf (stderr, "%s: demasiados espacios en alineación \n", prog) ; limpieza (1) ; } si (j >= 0) { siz = dx [dmax] . jp.n [j ] ; xx = dx [dmax] .jp.x [j ] ; dmax += siz; si (siz < 0) { /* espacio en segunda secuencia */ pp[l] .n[il] = -siz; xx += siz; /* id = xx - yy + longitudl - 1 */ pp[l] .x[il] = xx - dmax + longitudl - 1; gapy++; ngapy -= siz; /* se ignora MAXGAP cuando se realizan espacios finales */ siz = (-siz < MAXGAP || endgaps)? -siz : MAXGAP; il++; } en vez de si (siz > 0) { /* gap in first seq */ pp[0] .n[i0] = siz; pp[0] .x[i0] = xx; gapx++; ngapx += siz; /* se ignora MAXGAP cuando se realizan espacios finales */ siz = (siz < MAXGAP || endgaps)? siz : MAXGAP; Í0++; } } en vez de break; } /* se invierte el orden de brincos */ for (j = 0, iO—; j < iO; j++, iO—) { i = pp[0] .n[j]; pp[0] .n[j] = pp[0] .n[i0]; pp[0] .n[i0] = i; i = pp[0] .x[j]; pp[0] .x[j] = pp[0] .x[iO]; pp[0] .x[iO] = i; } for (j = 0, il— ; j < il; j++, il— ) { i = pp[l] .n[j] ; pp[l] .n[j] = pp[l] .n[il] ; pp[l] .n[il] = i; i = pp[l] .x[j] ; pp[l] .x[j] = pp [1] .x[il] ; pp[l] .x[il] = i; } si (fd >= 0) (void) cerrar (fd); si (fj) { (void) unlink ( jname) ; fj = 0; offset = 0; } } Tabla 1 (continuación) /* * se escribe un desplazamiento de estructura de brinco lleno de la previa (si la hay) : nw ( ) */ escribe brincos (ix) escribe brincos int ix; { char *mktemp ( ) ; si (!fj) { si (mktemp (jname) < 0) { fprintf (stderr, "%s: can ' t mktemp ( ) %s\n", prog, jname); limpieza (1) ; } si ( (fj = fopen (jname, "w")) == 0) { fprintf (stderr, "%s: can ' t write %s\n", prog, jname); salida (1) ; } } (void) fwrite((char *) &dx [ix] . jp, sizeof (struct jmp), 1, fj ) ; (void) fwrite ( (char *) &d [ix] .offset, sizeof (dx [ix] . offset) , 1 , fj); } Tabla 2 TAT XXXXXXXXXXXXXXX (Longitud = 15 aminoácidos) Proteína de Comparación XXXXXYYYYYYY (Longitud = 12 aminoácidos) % de identidad de secuencia de aminoácidos= (el número de residuos de aminoácidos idénticamente coincidentes entre las dos secuencias de polipéptidos tal como se determina por ALIGN-2) dividido por (el número total de residuos de aminoácidos del polipéptido TAT) = dividido por 15 = 33.3% Tabla 3 TAT XXXXXXXXXX (Longitud = 10 aminoácidos) Proteína de Comparación XXXXXYYYYYYZZYZ (Longitud = 15 aminoácidos) % identidad de secuencia de aminoácidos = (el número de residuos de aminoácidos idénticamente coincidentes entre las dos secuencias de polipéptidos tal como se determina mediante ALIGN-2) divididos por (el número total de residuos de aminoácidos del polipéptido TAT) = 5 dividido por 10 = 50% Tabla 4 TAT-ADN NNNNNNNNNNNNNN (Longitud = 14 nucleótidos) Comparación ADN NNNNNNLLLLLLLLLL (Longitud = 16 nucleótidos) % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos= (el número de nucleótidos idénticamente coincidentes entre las dos secuencias de ácidos nucleicos es tal como se determina por ALIGN-2) dividido por (el número total de nucleótidos de la secuencia de ácidos nucleicos TAT-ADN) = 6 dividido por 14 = 42.9% Tabla 5 TAT-ADN NNNNNNNNNNNN (Longitud = 12 nucleótidos) Comparación ADN NNNNLLLW (Longitud = 9 nucleótidos) % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos = (el número de nucleótidos idénticamente coincidentes entre las dos secuencias de ácidos nucleicos es tal como se determina por ALIGN-2) dividido por (el número total de nucleótidos de la secuencia de ácidos nucleicos TAT-ADN) = 4 dividido por 12 = 33.3% II . Composiciones y métodos de la invención A. Anticuerpos anti-TAT En una modalidad, la presente invención proporciona anticuerpos anti-TAT que pueden encontrar uso en la presente como agentes terapéuticos y/o de diagnóstico. Anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, bis-específicos y heteroconjugados . 1. Anticuerpos policlonales los anticuerpos policlonales son preferiblemente cultivados en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante (especialmente cuando se usan péptidos sintéticos) a una proteína que es inmunógena en la especie a ser inmunizada. Por ejemplo, el antígeno puede ser conjugado a hemocianina de lapa de bocallave (KLH) , albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soya, utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación por medio de residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (por medio de residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12, o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes . Los animales son inmunizados contra el antígeno, conjugados inmunógenos o derivados al combinar, por ejemplo 100 µg ó 5 µg de la proteína por conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectar la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes más tarde, los animales son reforzados con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 días más tarde, los animales son sangrados y el suero es analizado en cuanto a título de anticuerpos. Los animales son reforzados hasta la meseta del título. Los conjugados también pueden ser elaborados en cultivo celular recombinante como fusiones de proteína. También, agentes de agregación tales como alhumbre son usados apropiadamente para mejorar la respuesta inmune. 2. Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales pueden ser elaborados usando el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden ser elaborados mediante métodos de ADN recombinantes (Patente estadounidense No. 4,816,567). En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, es inmunizado como se describe anteriormente para producir linfocitos que producen o son aptos de producir anticuerpos que se enlazarán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro . Después de la inmunización, los linfocitos son aislados y luego fusionados con una línea celular de mieloma utilizando un agente de fusión apropiado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Las células de hibridoma así preparadas son sembradas y cultivadas en un medio de cultivo apropiado, tal medio contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o sobrevivencia de las células de mieloma parenterales sin fusionar (también denominado como socio de fusión). Por ejemplo, si las células de mieloma parenterales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo selectivo para los hibridomas incluirá comúnmente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , tales sustancias inhiben el crecimiento de células deficientes HGPRT . Las células de mieloma socias de fusión referidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la producción a alto nivel estable de anticuerpos mediante las células que producen anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio selectivo que selecciona contra las células parenterales sin fusionar. Las líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma murinas tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EUA y SP-2 y derivados, por ejemplo, células X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, EUA. Líneas celulares de mieloma humano y líneas celulares de heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)). El medio de cultivo en el cual las células de hibridoma son cultivadas se analiza en cuanto a la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de enlace de anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma es determinada mediante inmunoprecipitación o mediante un análisis de enlace in vitro, tal como inmunorradioanálisis (RÍA) o análisis inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) . La afinidad de enlaces del anticuerpo monoclonal se puede determinar por ejemplo mediante el análisis de escarcha descrito en Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980). Una vez que las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas son identificadas, los clones pueden ser subclonados al limitar los procedimientos de dilución y cultivo mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden ser cultivadas in vivo como tumores ascites en un animal, por ejemplo, mediante inyección i.p. de las células a ratones . Los anticuerpos monoclonales segregados por los subclones son separados apropiadamente del medio de cultivo, fluido de ascites o solo mediante procedimientos de purificación de anticuerpos monoclonales tales como por ejemplo, cromatografía de afinidad (por ejemplo, utilizando proteína A o proteína g-Sepharose) o cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, etc. El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales el fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos adicionales (por ejemplo, al utilizar sondas de oligonucleótidos que son aptos de enlazarse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos) . Las células de hibridoma sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede ser colocado en vectores de expresión, los cuales son luego transfectados a células huésped tales como células E. coli, células COS de simio, células de Ovario de Hámster Chino (CHO) , o células de mieloma que de otra manera no producen proteína de anticuerpo,, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Una revisión de artículos en la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican el anticuerpo se incluyen en Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol., 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol . Revs . 130:151-188 (1992) . En una modalidad adicional, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos pueden ser aislados de bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos respectivamente utilizando bibliotecas de fagos. Publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (en el intervalo de nM) mediante surtido de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), también como infección combinatoria y recombinación in vivo como estrategia para la construcción de bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993) ) . Así, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales . El ADN que codifica el anticuerpo puede ser modificad para producir polipéptidos de anticuerpo quimérico o de fusión, por ejemplo al sustituir las secuencias de dominio constante y de cadena pesada y cadena ligera humanas (CH y CL) por las secuencias murinas homologas (Patentes estadounidenses No. 4,816,567 y Morrison, et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o mediante fusión de la secuencia de codificación de inmunoglobulina con toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido que no es de inmunoglobulina (polipéptido heterólogo) . Las secuencias de polipéptidos que no son de inmunoglobulina pueden sustituir los dominios constantes de un anticuerpo o son sustituidas por los dominios variables de un sitio de combinación asincrono de un anticuerpo para crear un anticuerpo de agente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente. 3. Anticuerpos humanos y humanizados Los anticuerpos anti-TAT de la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de enlace de antígeno de anticuerpos) que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los cuales los residuos de una región que determina la complementariedad (CDR) del receptor son reemplazados por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad deseada, afinidad y capacidad. En algunas instancias, los residuos de estructura de Fv de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados pueden también comprender residuos que no son encontrados ni en e anticuerpo receptor ni en la CDR importada o las secuencias de estructura. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno y comúnmente dos dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc) , comúnmente aquella de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op . Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]. Métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. En general, un anticuerpo humanizado contiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos al mismo de una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos son determinados frecuentemente como residuos de "importación", que son tomados comúnmente de un dominio variable de "importación". La humanización se puede efectuar precisamente siguiendo el método de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], al sustituir secuencias de CDR o CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Así, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente estadounidense No. 4,816,567), en donde sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto ha sido sustituido pOor la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son comúnmente anticuerpos humanos de los cuales algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a ser usados en la elaboración de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad y respuesta de HAMA (anticuerpo anti-ratón humano) cuando el anticuerpo está diseñado para uso terapéutico humano. De acuerdo con el llamado método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor es seleccionado contra toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humanas conocidas . La secuencia de dominio humano V que es más cercana de aquella de roedor es identificada y la región de estructura humana (FR) dentro de la misma aceptada para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro método utiliza una región de estructura particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura puede ser usada para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol . 151:2623 (1993) ) . Es además importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad de enlace por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para obtener este objetivo, de acuerdo con un método preferido, anticuerpos humanizados son preparados mediante un proceso de análisis de las secuencias parenterales y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parenterales y humanizadas. Modelos de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles comúnmente y son familiares para aquellos experimentados en la técnica. Programas de computadora están disponibles que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas . La inspección de esas exhibiciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, esto es, el análisis de residuos que influencia la capacidad de la inmunoglobulina candidata para enlazarse a su antígeno. De esta manera, los residuos FR pueden ser seleccionados y combinados del receptor y secuencias de importación de tal manera que la característica de anticuerpo deseada tal como afinidad incrementada por el (los) antígeno (s) objetivo se obtiene. En general, los residuos de región hipervariable están directa y más sustancialmente involucrados en la influencia del enlace de antígeno. Se contemplan varias formas de un anticuerpo anti-TAT humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo tal como un Fab, que es conjugado opcionalmente con uno o más agente (s) citotóxico (s) con el fin de generar un inmunoconjugado.
Alternativamente, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgGl intacto. Como una alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, es ahora posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son aptos para producir la inmunización, de producir un pleno repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la cancelación homóciga del gen de región de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH) y los ratones mutantes de línea de germinación dan como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógena. La transferencia del arreglo genético de inmunoglobulina de línea de germinación humana a tales ratones mutantes de línea de germinación dará como resultado la producción de anticuerpos humanos después del desafío de antígeno. Véase , por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno . 7:33 (1993); Patentes estadounidenses Nos. 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (all of GenPharm) ; 5,545,807; y WO 97/17852. Alternativamente, se puede usar tecnología de exhibición de fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 [1990] ) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de repertorios genéticos de dominio variable de inmunoglobulina (V) a partir de donadores sin inmunizar. De acuerdo con esta técnica, los genes de dominio V de anticuerpo son clonados en cuadro ya sea a un gen de proteína de recubrimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 ó fd y mostraron como fragmentos de de anticuerpo funcional sobre la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una sola hebra del genoma de fago, las selecciones a base de las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe aquellas propiedades. Así, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. la exhibición de fagos se puede efectuar en una variedad de formatos, revisados por ejemplo en Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Varias fuentes de segmentos de gen V pueden ser usados para la exhibición de fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron un arreglo diverso de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una biblioteca combinatoria aleatoria pequeña de genes V derivados de los vasos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V a partir de donadores humanos sin inmunizar pueden ser construidos y anticuerpos a un diverso arreglo de antígenos (en los que se incluyen auto-antígenos) pueden ser aislados siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver también Patentes estadounidenses Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Como se discute anteriormente, anticuerpos humanos pueden también ser generados mediante células B activadas in vitro (Patentes estadounidenses Nos. 5,567,610 y 5,229,275). 4. Fragmentos de anticuerpos En ciertas circunstancias hay ventajas de utilizar fragmentos de anticuerpos en lugar de anticuerpos enteros. El tamaño más pequeño de los fragmentos permite un despeje rápido y puede conducir a un acceso mejorado a tumores sólidos . Varias técnicas han sido desarrolladas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos eran derivados vía una digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al . , Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985) ) . Sin embargo, estos fragmentos pueden ahora ser producidos directamente mediante células huésped recombinantes. Fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv pueden todos ser expresados en y secretados de E. coli, permitiendo así la producción fácil de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados de las bibliotecas de fagos de anticuerpo discutidas anteriormente. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH pueden ser recuperados directamente de E. coli y acoplados químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro procedimiento, anticuerpos F(ab')2 pueden ser aislados directamente de cultivo de células huésped recombinante. El fragmento Fab y F(ab')2 con vida media in vivo incrementada que comprende residuos de epítopo de enlace de receptor de recuperación son descritos en la Patente estadounidense No. 5,869,046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el experimentado en la técnica. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento de Fv de una sola cadena (ScFv) . Véase WO 93/16185; Patente estadounidense No. 5,571,894; y Patente estadounidense No. 5,587,458. Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que están desprovistos de regiones constantes; así, son apropiadas para el enlace no específico reducido durante el uso in vivo . Proteínas de fusión sFv pueden ser construidas para producir la fusión de una proteína efectora ya sea en el término amino o carboxil de un sFv. Véase Antibody Engineering, ed.
Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo puede también ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo como se describe en la Patente estadounidense 5,641,870 por ejemplo. Tales fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespecíficos o bis-específicos .
. Anticuerpos bis-específicos Los anticuerpos bis-específicos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace para por lo menos dos epítopos diferentes. Anticuerpos bis-específicos ejemplares se pueden enlazar a dos epítopos diferentes de una proteína TAT como se describe en la presente. Otros de tales anticuerpos pueden combinar un sitio de enlace de TAT con un sitio de enlace por otra proteína. Alternativamente, un brazo anti-TAT puede ser combinado con un brazo que se enlaza a una molécula de activación sobre un leucocito tal como una molécula receptora de célula T (por ejemplo, CD3) o receptores Fc por IgG (Fc?R), tales como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) , para enfocar y localizar mecanismos de defensa celular a las células que expresan TAT. Anticuerpos bis-específicos pueden también ser usados para localizar agentes citotóxicos a células que expresan TAT. Estos anticuerpos poseen un brazo de enlace TAT y un brazo que se enlaza al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-a, vinca alcalide, cadena de resina A, metotrexato o hapteno de isótopos radioactivos) . Anticuerpos bis-específicos pueden ser preparados como anticuerpos de plena longitud o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos F(ab')2 bis-específicos). WO 96/16673 describe un anticuerpo anti-ErbB2/anti-FcyRIII y la Patente estadounidense No. 5,837,234 revela un anticuerpo anti-ErbB2/anti-Fc?RI bis-específico. Un anticuerpo anti-ErbB2/anti-Fca bis-específico es mostrado en WO98/02463. La Patente estadounidense No. 5,821,337 enseña un anticuerpo anti-ErbB2/anti-CD3 bis-específico. Métodos para elaborar anticuerpos bis-específicos son conocidos en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos bis-específicos de plena longitud está basada en la co-expresión de dos pares de cadena ligera cadena pesada de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983) ) . Debido a la clasificación aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial 10 diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales solamente una tiene la estructura bis-específica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se hace usualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad es más bien molesta y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares son revelados en (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). De acuerdo con un diferente procedimiento, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) son fusionados a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. Preferiblemente, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada Ig, que comprende por lo menos parte de las regiones de articulación CH2 y CH3. Es preferido tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para el enlace de cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina son insertadas a vectores de expresión separados y son co-transfectados a una célula huésped apropiada. Esto proporciona mayor flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en modalidades cuando se usan proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido en la construcción proporcionan el rendimiento óptimo del anticuerpo bis-específico deseado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas de polipéptido a un solo vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas de polipéptido en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no tienen ningún efecto significativo sobre el rendimiento de la combinación de cadena deseada. En una modalidad preferida de este procedimiento, los anticuerpos bis-específicos son compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de enlace en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de enlace) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto bis-específico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina indeseables, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo la mitad de la molécula bis-específica proporciona una manera fácil de separación. Este procedimiento es revelado en WO 94/04690. Para detalles adicionales para generar anticuerpos bis-específicos. Véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986). De acuerdo con otro procedimiento descrito en la Patente estadounidense No. 5,731,168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo puede ser diseñada para maximizar el porcentaje de heterodímeros que son recuperados del cultivo de células recombinante. La interfase preferida comprende por lo menos parte del dominio de CH3. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácido pequeñas de interfase de la primera molécula del cuerpo son reemplazadas con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, la tirosina o triptófano) . "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la (s) cadena (s) lateral grande son creadas en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo al remplazar cadenas laterales de aminoácidos grandes con más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero con respecto a otros productos finales indeseables tales como homodímeros . Anticuerpos bis-específicos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado acoplado a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos han sido por ejemplo propuestos para contar células del sistema inmune a células indeseables (Patente estadounidense No. 4,676,980) y para el tratamiento de infección de HIV (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados pueden ser elaborados utilizando cualesquier métodos de reticulación convenientes. Agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica y son revelados en la Patente estadounidense No. 4,676,980, junto con un número de técnicas de reticulación. Técnicas para generar anticuerpos bis-específicos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos bis-específicos pueden ser preparados utilizando enlace químico. (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089) describen un procedimiento en donde anticuerpos intactos son escindidos proteolíticamente para señalar fragmentos de F(ab)2. Estos fragmentos son reducidos en presencia del agente acomplejante de ditiol, arsenita de sodio para estabilizar ditioles vecinales e impedir ka formación de bisulfuro molecular. Luego los fragmentos de Fab' son convertidos a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Luego, uno de los derivados Fab' -TNB es reconvertido al Fab' -tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y es mezclado con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo bis-especifico. Los anticuerpos bis-específicos producidos pueden ser usados como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas . El avance reciente ha facilitado la recuperación directa de fragmentos de Fab'-SH a partir de E. coli que puede ser acoplado químicamente para formar anticuerpos bis-específicos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo bis- específica plenamente humanizada F(ab')2 . Cada fragmento de Fab' fue secretado separadamente de E. coli . Coli y sometido a acoplamiento químico directo in vitro para formar el anticuerpo bis-específico. En anticuerpo bis-específico así formado fue apto de enlazarse a células que sobreexpresan el sector ErbB2 y células T humanas normales, también como disparar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos de tumor de pecho humano. Varias técnicas para elaborar y aislar fragmentos de anticuerpo bis-específicos directamente de cultivo celular recombinante también se han descrito. Por ejemplo, anticuerpos bis-específicos han sido producidos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol . 148 (5) : 1547-1553 (1992) . Los péptidos de cremallera de leucina a partir de las proteínas de Fos y Jun fueron enlazados a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión genética. Los homodímeros de anticuerpo fueron reducidos en la región de articulación para formar monómeros y luego reoxidar para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método pude también ser utilizado para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para elaborar fragmentos de anticuerpo bis-específicos. Estos fragmentos comprenden un VH conectado a un VL mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena. Así, los dominios VH y VL de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios VL y VH de otros fragmentos, formando mediante esto dos sitios de enlace de antígeno. Otra estrategia para elaborar fragmentos de anticuerpo bis-específicos mediante el uso de dímeros Fv (sFv) de una sola cadena se ha reportado. Véase Gruber et al., J. Immunol . , 152:5368 (1994) . Anticuerpos con más de dos valencias son contemplados. Por ejemplo, anticuerpos tris-específicos pueden ser preparados. Tutt et al., J. Immunol . 147:60 (1991) . 6. Anticuerpos heteroconjugados Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Tales anticuerpos han sido propuestos por ejemplos para apuntar células del sistema inmune a células indeseables [Patente estadounidense No. 4,676,980] y para el tratamiento de infección por HIV [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089] . Se contempla que los anticuerpos pueden ser preparados in vitro utilizando métodos conocidos en química de proteína sintética, en los que se incluyen aquellos que se involucran agentes de reticulación. Por ejemplo, inmunotoxinas pueden ser construidas utilizando reacción de intercambio de disulfuro mediante formación de un enlace de tioéter. Ejemplos de reactivos soportados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y aquellos revelados por ejemplo en la Patente estadounidense No. 4,676,980. 7. Anticuerpos multivalentes Un anticuerpo multivalente puede ser internalizado (y/o catabolizado) más rápido que un anticuerpo divalente mediante una célula que expresa un antígeno al cual los anticuerpos se enlazan. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que con diferentes de la clase IgM) con tres o más sitios de enlace de antígeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes) los cuales pueden ser producidos fácilmente mediante expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de enlace de antígeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste de) una región Fc o una región de articulación. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fc y tres o más sitios de enlace de antígeno amino-terminales a la región Fc. El anticuerpo multivalente preferido en la presente comprende (o consiste de) tres a aproximadamente ocho, pero de preferencia cuatro sitios de enlace de antígeno. El anticuerpo multivalente comprende por lo menos una cadena de polipéptido (y preferiblemente dos cadenas de polipéptido) , en donde la (s) cadena (s) de polipéptido comprende dos o más dominios variables. Por ejemplo, la (s) cadena (s) de polipéptido puede comprender VD1- (Xl)n-VD2- (X2)n-Fc, donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena de polipéptido de una región Fc, XI y X2 representan un aminoácido o polipéptido y n es 0 ó 1. Por ejemplo, la (s) cadena (s) de polipéptido puede comprender: la cadena de VH-CHl-enlazados flexible-cadena de región VH-CHl-Fc o cadena de región VH-CHl-VH-CHl-Fc. El anticuerpo multivalente en la presente comprende además preferiblemente por lo menos dos (y preferiblemente cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente en la presente puede por ejemplo comprender aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominios variable de cadena ligera contemplados en la presente comprenden un dominio variable de cadena ligera y opcionalmente comprenden además un dominio CL. 8. Diseño de Función Efectora Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo para mejorar la citotoxicidad moderada por la célula dependiente del antígeno (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede obtener al introducir una o más sustituidos de aminoácido en la región Fc del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, residuo (s) de cisteína pueden ser introducidos en la región Fc, permitiendo mediante esto la formación de enlace de disulfuro intercadena en esta región. El anticuerpo homodiméricos así generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o exterminio de célula moderado por complemento incrementado y citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC). Véase Carón et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Im unol. 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor mejorada pueden también ser preparados utilizando reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo puede ser diseñado que tenga regiones Fc duales y puede mediante tener lisis de complemento mejorada y capacidad ADCC. Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Para incrementar la vida media en el suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítopo de enlace de receptor de salvamento al anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como de describe en la patente estadounidense 5,739,277, por ejemplo. Como se usa en la presente, el término "epítopo de enlace de receptor de salvamento" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula IgG (por ejemplo IgGi, IgG2, IgG3 ó IgG4) que es responsable de incrementar la vida media en el suero in vivo de la molécula de IgG. 9. Inmunoconjugados La invención también es concerniente con inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, una toxina (por ejemplo una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fungal, de planta o animal o fragmentos de la misma) o un isótopo radioactivo (esto es, un radioconjugado) . Agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados han sido descritos anteriormente.
Toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden ser usadas incluyen difteria de cadena A, fragmentos activos sin enlace de toxina de difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-s) , inhibidor de charanda momordica, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria oficinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Una variedad de radionucleótidos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados . Ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y, y 186Re. Conjugados del anticuerpo y agente citotóxico son elaborados utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCL) , esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexandiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazonioumbenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como 2, 6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2, 4- dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricino puede ser preparada como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminpentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Véase WO 94/11026. Conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña tales como calicheamicina, maitansinoides, un tricoteno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, son también contemplados en la presente .
Maitansina y maitansinoides En una modalidad preferida, un anticuerpo anti-TAT (de plena longitud o fragmentos) de la invención es conjugado a una o más moléculas maitansinoides. Los maitansinoides son inhibidores mitotóticos que actúan al inhibir la polimerización de tubulina. La maitansina fue aislada por primera vez a partir de arbusto africano del este Maytenus serrata (patente estadounidense No. 3,896,111). Subsecuentemente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y esteres de maitansiol C-3 (patente estadounidense No. 4,151,042). Maitansinol sintético y derivados y análogos de los mismos son revelados por ejemplo, en las patentes estadounidenses Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533, las revelaciones de las cuales son incorporadas expresamente en la presente por referencia.
Conjugados de maitansinoide-anticuerpo En un intento por mejorar su índice terapéutico, maitansina y maitansinoides han sido conjugados a anticuerpos que se enlazan específicamente a antígenos de células de tumor. Inmunoconjugados que contienen maitansinoides y su uso terapéutico son revelados por ejemplo en las patentes estadounidenses Nos. 5,208,020, 5,416,064 y patente europea EP 0 425 235 Bl, las revelaciones de las cuales son expresamente incorporadas en la presente por referencia. Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describe inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide designado como DM1 enlazado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra cáncer colorrectal humano. Se encontró que el conjugado era altamente citotóxico hacia células de cáncer de colon cultivadas y mostró actividad anti-tumor en un análisis de crecimiento de tumor in vivo. Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992) describen inmunoconjugados en las cuales un maitansinoide fue conjugado vía un enlazador de disulfuro al anticuerpo murino A7 que se enlaza a un antígeno sobre líneas celulares de cáncer de colon humano o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.l que se enlaza al oncógeno HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado TA.1-maitansinoide fue probada in vitro en la línea celular de cáncer de pecho humano SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antígenos superficiales de HER-2 por célula. El conjugado de fármaco obtuvo un grado de citotoxicidad similar a la formación de maitansinoide libre, el cual podría ser incrementado al incrementar el número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado A7-maitansinoide mostró baja citotoxicidad sistémica en ratones.
Conjugados de anticuerpo de polipéptido anti-TAT-maitansinoide (inmunoconjugados) Conjugados de anticuerpo anti-TAT-maitansinoides son preparados al enlazar químicamente un anticuerpo anti-TAT a una molécula de maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica de ya sea uno u otro del anticuerpo o la molécula maitansinoide. Un promedio de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo han mostrado eficacia para mejorar la citotoxicidad de células objetivo sin afectar negativamente la función o solubilidad del anticuerpo, aunque aún una molécula de toxina/anticuerpo se esperaría que mejore la citotoxicidad con respecto al uso del anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son bien conocidos en la técnica y pueden ser sintetizados mediante técnicas conocidas o aislados a partir de fuentes naturales. Maitansinoides apropiados son revelados por ejemplo en la patente estadounidense No. 5,208,020 y en las otras patentes y publicaciones que no son patentes a las que se hace referencia anteriormente. Los maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tal como varios esteres de maitansinol. Hay muchos grupos enlazantes conocidos en la técnica para elaborar conjugados de anticuerpo-maitansinoide en los que se incluyen por ejemplo aquellos revelados en la patente estadounidense No. 5,208,020 ó patente EP 0 425 235 Bl, y Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992). Los grupos enlazantes incluyen grupos de disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles de peptidasa o grupos lábiles de esterasa, tal como se revela en las patentes identificadas anteriormente, los grupos disulfuro y tioéter son preferidos. Conjugados del anticuerpo y maitansinoide pueden ser elaborados utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3- (2-piridiltio) (SPDP), succinidimil-4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCL) , esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexandiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como 2, 6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno) . Agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen propionato de N-succinimidil-3- (2-piridiltio) (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]) y N-succinimidil-4- (2-piridiltio) pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace de disulfuro. El enlazador puede ser anexado a la molécula maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo del enlace. Por ejemplo, un enlace de éster puede ser formado mediante reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamiento convencionales . La reacción puede ocurrir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una modalidad preferida, el enlace es formado en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol .
Calicheamicina Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo anti-TAT conjugado a una o más moléculas de calicheamicina. La familia de calicheamicina de antibióticos son aptos de producir rupturas de ADN de doble hebra a concentraciones sub-picomolar . Para la preparación de conjugados de la familia de calicheamicina, véanse patentes estadounidenses 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (todas de American Cyanamid Company) . Análogos estructurales de calicheamicina que pueden ser usados incluyen pero no están limitados a Yi1, c¿21, OÍ31, N-acetil-yi1, PSAG y ?1! (Hinman et al., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes estadounidenses mencionadas anteriormente en la presente de American Cyanamid) . Otra formación anti-tumor que el anticuerpo puede ser conjugado es QFA que es un antifolato. Tanto la calicheamicina como QFA tienen sitios de acción intracelulares y no cursan fácilmente la membrana del plasma. Por consiguiente, la absorción celular de estos agentes por medio de internalización moderada por anticuerpo mejora extensamente sus efectos citotóxicos.
Otros agentes citotóxicos Otros agentes anti-tumor que pueden ser conjugados a los anticuerpos anti-TAT de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos conjuntamente como complejo LL-E33288 descrita en las patentes estadounidenses Nos. 5,053,394, 5,770,710, también como esperamicinas (patente estadounidense 5,877,296) . Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden ser usadas incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos sin enlazar de toxina de difteria, cadena de exotoxina A, (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricino A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos .
Véase, por ejemplo WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993. La presente invención contempla además un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN tal como desoxiribonucleasa; DNasa) . Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Una variedad de isótopos radioactivos están disponibles para la producción de anticuerpos anti-TAT radioconjugados . Ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando el conjugado es usado para diagnosis, puede comprender un átomo radioactivo para estudios scintigráficos, por ejemplo, tc99m o I123, o una etiqueta de centrifugación para la formación de imagen de resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como formación de imagen por resonancia magnética, mri) , tal como yodo-123 otra vez, yodo-133, indio-111, fluoro-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Radiomarcadores u otros marcadores pueden ser incorporados en el conjugado de maneras conocidas. Por ejemplo, el péptido puede ser biosintetizado o puede ser sintetizado mediante síntesis de aminoácido química utilizando precursores de aminoácido apropiados que involucran por ejemplo fluoro-19 en lugar de hidrógeno. Marcadores o etiquetas tales como tc99m o I123, .Re186, Re188 y In111 pueden ser anexados vía un residuo de cisteína en el péptido. Itrio-90 puede ser anexado vía un residuo de lisina. El método de IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 puede ser usado para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal,CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle. Conjugados del anticuerpo y agente citotóxico pueden ser elaborados utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3- (2-piridiltio) (SPDP), succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como dimetil adipimidato HCL) , esteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexandiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricino puede ser preparada como de describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminpentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Véase WO 94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, un enlazador ácido-lábil, enlazador peptidasa-sensible, enlazador fotolábil, enlazador de dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992); U.S. Patent No. 5,208,020) pueden ser usados. Alternativamente, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo anti-TAT y agente citotóxico pueden ser elaborados por ejemplo mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptido. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado ya sea adyacentes entre sí o separados por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado. En todavía otra modalidad, el anticuerpo puede ser conjugado a un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilización en presente-apuntamiento de tumor en donde el conjugado anticuerpo-receptor es administrado al paciente, seguido por remoción del conjugado sin enlazar de la circulación utilizando un agente de limpieza y luego administración de un "ligando" (por ejemplo avidina) que es conjugado a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido) .
. Inmunoliposomas Los anticuerpos anti-TAT revelados en la presente pueden también ser formulados como inmunoliposomas. Una "liposoma" es un vesículo pequeño compuesto de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactante que es útil para la administración de un fármaco a un mamífero. Los componentes de liposoma son arreglados comúnmente en una formación de bicapa, similar al arreglo de lípidos de membranas biológicas. Liposomas que contienen el anticuerpo son preparados mediante métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); Patentes estadounidenses Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y W097/38731 publicado el 23 octubre de 1997. Liposomas con tiempo de circulación mejorado son revelados en la patente estadounidense No. 5,013,556. Los liposomas particularmente útiles pueden ser generados mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípidos que comprenden fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina PEG-derivada (PEG-PE) . Los liposomas son extruidos a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Fragmentos de Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden ser conjugados a los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) vía una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico está contenido opcionalmente dentro del liposoma. Véase Gabizon et al., J. National Cáncer Inst. 81(19) :1484 (1989) .
B. Oligopéptidos de enlace de TAT Los oligopéptidos de enlace de TAT de la presente invención son oligopéptidos que se enlaza, de preferencia específicamente, a un polipéptido de TAT como se describe en la presente. Los oligopéptidos de enlace de TAT pueden ser sintetizados químicamente utilizando metodología de síntesis de oligopéptidos conocida o pueden ser preparados y purificados utilizando tecnología recombinante. Los oligopéptido de enlace de TAT son usualmente de por lo menos alrededor de 5 aminoácidos de longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ó 100 aminoácidos de longitud o más, en donde tales oligopéptido que son aptos de enlace, de preferencia específicamente a un polipéptido de TAT como se describe en la presente. Los oligopéptidos de enlace de TAT pueden ser identificados sin experimentación indebida utilizando técnicas bien conocidas. A este respecto, se notará que técnicas para la selección de bibliotecas de oligopéptidos para oligopéptidos que son aptos de enlazarse específicamente a un objetivo de polipéptido son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo patentes estadounidenses Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; Publicación de PCT Nos. WO 84/03506 y WO84/03564; Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol . Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol . , 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363, y Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). A este respecto, la exhibición de bacteriófago (fago) es una técnica bien conocida que permite seleccionar bibliotecas de oligopéptidos grandes para identificar miembro (s) de aquellas bibliotecas que son aptos de enlazarse específicamente a un objetivo de polipéptido. La exhibición de fago es una técnica mediante la cual polipéptidos variantes son exhibidos como proteínas de fusión a la proteína de recubrimiento sobre la superficie de partículas de bacteriófago (Scott, J.K. y Smith, G. P. (1990) Science 249: 386) . La utilidad de la exhibición de fago radica en el hecho de que bibliotecas grandes de variantes de proteína selectivamente aleatorizadas (o cADN aleatoriamente clonados) pueden ser clasificados rápida y eficientemente para aquellas secuencias que se enlazan a una molécula objetivo con alta afinidad. La exhibición de bibliotecas de péptidos (Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378) o bibliotecas de proteína (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363) sobre el fago se han utilizado para seleccionar millones de polipéptidos u oligopéptidos por unos con propiedades de enlace específicas (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). La clasificación de bibliotecas de fago de mutantes aleatorios requiere una estrategia para construir y propagar un gran número de variantes, un procedimiento para purificación de afinidad utilizando el receptor objetivo y un medio para evaluar los resultados de enriquecimientos de enlace. Patentes estadounidenses Nos. 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, y 5, 663,143. Aunque la mayoría de los métodos de exhibición de fago han utilizado fago filamentoso, sistemas de exhibición de fago lamboides (WO 95/34683; U.S. 5,627,024), sistemas de exhibición de fago T4 (Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Cáncer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195 (2) : 303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)) y sistemas de exhibición de fago T7 (Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); U.S. 5,766,905) son también conocidos . Muchas otras mejoras y variaciones del concepto de exhibición de fago básico han sido ahora desarrollados . Estas mejoras realzan la capacidad de los sistemas de exhibición para seleccionar bibliotecas de péptidos para enlace a moléculas objetivo seleccionadas y para mostrar proteínas funcionales con el potencial de seleccionar estas proteínas en cuanto a propiedades deseadas. Dispositivos de reacción de combinación para reacciones de exhibición de fago han sido desarrollados (WO 98/14277) y bibliotecas de exhibición de fago han sido utilizada para analizar y controlar interacciones bimoleculares (WO 98/20169; WO 98/20159) y propiedades de péptidos helicoidales restringidos (WO 98/20036) . WO 97/35196 describe un método para aislar un ligando de afinidad en el cual una biblioteca de exhibición de fagos se pone en contacto con una solución en la cual el ligando se enlazará a una molécula objetivo y una segunda solución en la cual el ligando de afinidad no se enlazará a la molécula objetivo, para aislar selectivamente ligandos de enlace. WO 97/46251 describe un método de bioamplificación de una biblioteca de exhibición de fago aleatoria con anticuerpo purificado de afinidad y luego aislamiento del fago de enlace, seguido por un proceso de micro-amplificación utilizando cavidades de microplaca para aislar el fago de enlace de alta afinidad. El uso de proteína Staphlylococcus aureus A como etiqueta de afinidad también se ha reportado (Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187). WO 97/47314 describe el uso de bibliotecas de substracción de sustrato para distinguir especificidades de enzima utilizando una biblioteca de combinación que puede ser una biblioteca de exhibición de fago. Un método para seleccionar enzimas apropiadas para uso en detergentes utilizando exhibición de fago se describe en WO 97/09446. Métodos adicionales para seleccionar proteínas de enlace específicas son descritos en las patentes estadounidenses Nos. 5,498,538, 5,432,018, y WO 98/15833. Métodos para generar bibliotecas de péptidos y seleccionar estas bibliotecas son también revelados en las patentes estadounidenses Nos. 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192, y 5,723,323.
C. Moléculas orgánicos de enlace de TAT Las moléculas orgánicas de enlace de TAT son moléculas orgánicas diferentes a los oligopéptidos o anticuerpos como se define en la presente que se enlaza, de preferencia específicamente, a un polipéptido de TAT como se describe en la presente. Moléculas orgánicas de enlace de TAT pueden ser identificadas y sintetizadas químicamente utilizando metodología conocida (véase, por ejemplo Publicaciones de PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585) . Moléculas orgánicas de enlace de TAT son de usualmente de menos de alrededor de 2000 Daltons de tamaño, alternativamente, menos de alrededor de 1500, 750, 500, 250 ó 200 daltones de tamaño, en donde tales moléculas orgánicas son aptas de enlazarse, de preferencia específicamente, a un polipéptido de TAT como se describe en la presente pueden ser identificados sin experimentación indebida utilizando técnicas bien conocidas. A este respecto se notará que las técnicas para seleccionar bibliotecas de moléculas orgánicas en cuanto a moléculas que son capaces de enlazarse a un objetivo de polipéptido son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, publicaciones de PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585) . Las moléculas orgánicas de enlace de TAT pueden ser por ejemplo aldehidos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas, carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hidrazinas N-sustituidas, hidrazidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéteres, disulfuros, ácidos carboxílicos, esteres, amidas, ureas, carbamato, carbonatos, cetales, tiocetales, acétales, tioacetales, haluros de arilo, aril sulfonatos, alquil haluros, alquil sulfonatos, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, anilinas, alquenos, alquino, dioles, aminoalcoholes, oxazolidinas, oxazolinas, tioazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, epóxidos, aziridinas, isocianatos, cloruros de sulfonilo, compuestos diazo, cloruros de ácido o los semejantes.
D. Selección en cuanto anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos de enlace de TAT y moléculas orgánicas de enlace de TAT con las propiedades deseadas Técnicas para generar anticuerpos, oligopéptidos y moléculas orgánicas, que se enlazan a polipéptidos de TAT han- sido descritas anteriormente. Se pueden seleccionar además anticuerpos, oligopéptidos u otras moléculas orgánicas con ciertas características biológicas, como se desee. Los efectos inhibidores de crecimiento de un anticuerpo anti-TAT oligopéptido u otra molécula orgánica de la invención puede ser determinado mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo utilizando células que expresan un polipéptido de TAT ya sea endógenamente o enseguida de transfección con el gen TAT. Por ejemplo, líneas de célula de tumor apropiadas y células TAT-transfectadas pueden ser tratadas con un anticuerpo monoclonal anti-TAT, oligopéptido u otra molécula orgánica de la invención a varias concentraciones por unos pocos días (por ejemplo 2-7 días) y teñidas con violeta cristal o MTT o analizados mediante algún otro análisis colorimétrico. Otro método para medir la proliferación sería al comparar la absorción de 3H-timidina por las células tratadas en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido de enlace de TAT o molécula orgánica de enlace de TAT de la invención. Después del tratamiento, las células son cosechadas y la cantidad de radioactividad incorporada al ADN cuantificada en un contador de centelleo. Controles positivos apropiados incluyen el tratamiento de una línea celular seleccionada con un anticuerpo inhibitorio de crecimiento que se sabe que inhibe el crecimiento de aquella línea celular. La inhibición del crecimiento de células de tumor in vivo puede ser determinada de varias maneras conocidas en la técnica, preferiblemente, las célula de tumor es una que sobreexpresa un polipéptido de TAT. Preferiblemente, el anticuerpo anti-TAT, oligopéptido de enlace de TAT o molécula orgánica de enlace de TAT inhibirá la proliferación celular de una célula de tumor que expresa TAT in vitro o in vivo por aproximadamente 25-100%, en comparación con la célula del tumor sin tratar, más preferiblemente, por alrededor de 30-100%, y aún más preferiblemente por alrededor de 50-100% o 70-100%, en una modalidad, a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 µg/ml. La inhibición de crecimiento puede ser medida a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 µg/ml o aproximadamente 0.5 nM a 200 nM en cultivo celular, en donde la inhibición de crecimiento es determinada 1-10 días después de la exposición de las células del tumor al anticuerpo. El anticuerpo es inhibidor del crecimiento in vivo si la administración del anticuerpo anti-TAT a aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal da como resultado la reducción del tamaño de tumor o reducción de la proliferación de las células de tumor en el transcurso de aproximadamente 5 días a 3 meses a partir de la primera administración del anticuerpo, preferiblemente en el transcurso de aproximadamente 5 a 30 días . Para seleccionar un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido de enlace de TAT o molécula orgánica de enlace de TAT que induce muerte cloruro, pérdida de integridad de membrana como se indica por ejemplo mediante yoduro de propidio (PI) , azul de triptano o absorción de 7AAD puede ser determinada en relación con el control. El análisis de absorción de PI se puede efectuar en ausencia de complemento y células efectoras inmune. Las células de tumor que expresan polipéptido de TAT son incubadas con el medio solo o el medio que contiene el anticuerpo anti-TAT apropiado (por ejemplo, a aproximadamente 10 µg/ml) , oligopéptido de enlace de TAT o molécula orgánica de enlace de TAT. Las células son incubadas durante un período de tiempo de 3 días. Enseguida de cada tratamiento, las células son lavadas y se toman alícuotas a tubos de 12 x 75 tapados con colador (1 ml/tubo, 3 grupos/grupo de tratamiento) para la remoción de grupos de células. Luego los tubos reciben PI (10 µg/ml) . Las muestras pueden ser analizados utilizando un citómetro de flujo FACSCAN® y elmentos de programación CellQuest FACSCONVERT® . Aquellos anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos de enlace de TAT o moléculas orgánicos de TAT que inducen niveles estadísticamente significativos de muerte celular tal como se determina mediante absorción de PI pueden ser seleccionadas como anticuerpos anti-TAT que inducen muerte celular, oligopéptidos de TAT o moléculas orgánicas de enlace de TAT. Para seleccionar anticuerpos, oligopéptidos u otras moléculas orgánicas que se enlazan a un epítopo sobre un polipéptido de TAT enlazado por un anticuerpo de interés, un análisis de bloqueo cruzado de rutina tal como aquel descrito en in Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988), se puede efectuar. Este análisis puede ser usado para determinar si un anticuerpo de prueba, oligopéptido u otra molécula orgánica se enlaza al mismo sitio o epítopo como un anticuerpo anti-TAT conocido. Alternativa o adicionalmente, el mapeo de epítopo se puede efectuar mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la secuencia de anticuerpo puede ser mutagenizada tal como mediante exploración de alanina, para identificar residuos de contacto. El anticuerpo mutante es probado inicialmente en cuanto a enlace con anticuerpo policlonal para asegurar el pliegue apropiado. En un método diferente, péptidos correspondientes a diferentes regiones de un polipéptido de TAT pueden ser usados en análisis de competencia con los anticuerpos de prueba o con un anticuerpo de prueba y un anticuerpo con un epítopo caracterizado o conocido.
E. Terapia de profármaco moderado por enzima dependiente de anticuerpo (ADEPT) Los anticuerpos de la presente invención pueden también ser usados en ADEPT al conjugar el anticuerpo a una enzima activadora del profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente de peptidilo quimioterapéutico, véase WO81/01145) a un fármaco anti-cáncer activo. Véase, por ejemplo, WO 88/0737 y patente estadounidense No. 4,975,278. El componente de enzima del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de tal manera para convertirlo a su forma citotóxica más activa. Enzimas que son útiles en el método de la invención incluyen, pero no están limitados a, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato a fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; citocina desaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica al fármaco anti-cáncer, 5-fluorouracilo; proteasas, tales como proteasa serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como captesinas B y L) , que son útiles para convertir profármacos que contienen péptido en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes D-aminoácidos; enzimas de escisión de carbohidrato tales como ß-galactosidasa y neuraminidas, útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; ß-lactamasa útil para convertir fármacos derivados con ß-lactamas en fármacos libres y penicilinamidasas, tales como penicilin V amidasa o penicilin G amidasa, útiles para convertir fármacos derivados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzymas", pueden ser usados para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Los conjugados de anticuerpo-abzyma pueden ser preparados como se describe en la presente para administración de la abzyma a una población de células de tumor . Las enzimas de esta invención pueden ser enlazadas covalentemente, a los anticuerpos anti-TAT mediante técnicas bien conocidas en el arte tal como el uso de reactivos de reticulación heterobifuncionales discutidos anteriormente. Alternativamente, proteínas de fusión que comprenden por lo menos una región de enlace de anticuerpo de la invención enlazados a por lo menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención pueden ser construidos utilizando técnicas de ADN recombinantes bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984) .
F. Polipéptidos de TAT de plena longitud La presente invención también proporciona secuencias de nucleótidos recién identificadas y aisladas que codifican polipéptidos a los que se hace referencia en la presente solicitud como polipéptido de TAT. En particular, cADN (de longitud parcial y de plena longitud) que codifican varios polipéptidos de TAT han sido identificados y aislados como se revela en detalle adicional en los ejemplos posteriormente en la presente. Como se revela en los ejemplos posteriormente en la presente, varios clones de cADN han sido depositados con la ATCC. Las secuencias de nucleótidos reales de aquellos clones se pueden determinar fácilmente por el experimentado en la técnica mediante secuencia del clon depositado utilizando métodos sistemáticos de la técnica. La secuencia de aminoácidos predecida puede ser determinada a partir de la secuencia de nucleótidos utilizando habilidad de rutina. Para los polipéptido de TAT y codificación de ácidos nucleicos como se describe en la presente, en algunos casos, se identificado lo que se cree ser el mejor marco de lectura identificable con la información de secuencia disponible al momento .
G. Variantes de anticuerpo anti-TAT y polipéptido de TAT Además de los anticuerpos anti-TAT y polipéptidos de TAT de secuencia natural de plena longitud descritos en la presente, se contempla que se pueden preparar variantes de anticuerpo anti-TAT y polipéptido de TAT. Las variantes de anticuerpo anti-TAT y polipéptido de TAT pueden ser preparadas al introducir cambios de nucleótidos apropiados al ADN de codificación, y/o mediante síntesis del anticuerpo o polipéptido deseado. Aquellos experimentados en la técnica apreciarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos de post-traducción del anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT, tales como cambiar el número o posición de sitios de glicosilación o alterar las características de afianzamiento de membrana. Las variaciones en los anticuerpos anti-TAT y polipéptidos de TAT descritos en la presente se puede hacer por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservadoras y no conservadores resumidas por ejemplo en la patente estadounidense No. 5,364,934. Las variaciones pueden ser una sustitución, cancelación o inserción de uno o más codones que codifican el anticuerpo o polipéptido que dan como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos en comparación con el anticuerpo o polipéptido de secuencia natural. Opcionalmente, la variación es mediante la sustitución de por lo menos un aminoácido con cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT. La guía para la determinación de cual residuo de aminoácido puede se insertado, sustituido o cancelado sin afectar adversamente la actividad deseada se puede encontrar al comparar la secuencia del anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT con aquella de moléculas de proteína conocidas homologas y minimizar el número de cambios de secuencias de aminoácidos efectuados en regiones de alta homología. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como el reemplazo de una leucina con una serina, esto es, reemplazos de aminoácido conservadores. Las inserciones o cancelaciones pueden opcionalmente estar en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos . La variación permitida puede ser determinada al efectuar sistemáticamente inserciones, cancelaciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y probar las variantes resultantes en cuanto a la actividad exhibida por la secuencia natural de plena longitud o madura. Se proporcionan en la presente fragmentos de anticuerpo anti-TAT y polipéptido de TAT. Tales fragmentos pueden ser truncados en el término N o término C, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con un anticuerpo o proteína natural de plena longitud. Ciertos fragmentos carecen de residuos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada del anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT. Los fragmentos de anticuerpo anti-TAT y polipéptido de TAT pueden ser preparados mediante cualquiera de una diversidad de técnicas convencionales. Los fragmentos de péptidos deseados pueden ser sintetizados químicamente. Un procedimiento alternativo involucra generar fragmentos de anticuerpo o polipéptido mediante digestión enzimática, por ejemplo mediante tratamiento de la proteína con una enzima que se sabe escinde las proteínas en sitios definidos por residuos de aminoácidos particulares o mediante digestión del ADN con enzimas de restricción apropiadas y aislamiento del fragmento deseado. Todavía otra técnica apropiada involucra el aislamiento y amplificación de un fragmento de ADN que codifica un fragmento de anticuerpo o polipéptido deseado, mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Los oligonucleótidos que definen los términos deseados del fragmento de ADN son empleados en los cebadores 5' y 3' en la PCR. Preferiblemente, los fragmentos de anticuerpo anti-TAT y polipéptido de TAT comparten por lo menos una actividad biológica y/o inmunológica con el anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT natural revelado en la presente. En modalidades particulares, sustituciones conservadores de interés son mostradas en la Tabla 6 bajo el encabezado de sustituciones preferidas. Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en actividad biológica, entonces cambios más sustanciales, denominados sustituciones ejemplares en la Tabla 6 o como se describe adicionalmente posteriormente en la presente en referencia a clases de aminoácidos, son introducidos y los productos seleccionados .
Tabla 6 Residuo Sustituciones Sustituciones Original Ejemplares Preferidas Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gln; asn lys Asn (N) gln; his; lys; arg gln Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gln (Q) asn asn Glu (E) asp asp Giy (G) pro; ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg He (1) leu; val; met; ala; phe; norleucine leu Leu (L) norleucine; iie; val; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu PPhhee ( (FF)) lleeuu;; vvaall;; iillee;; aallaa;; ttyyrr leu Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr TTyyrr ((YY)) ttrrpp;; pphhee;; tthhrr;; sseerr phe Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucine leu Modificaciones sustanciales en función o identidad inmunológica del anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT se llevan a cabo al seleccionar sustituciones que difieren significativamente en su efecto en mantener (a) la estructura de la cadena fundamental del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo o (c) el volumen de la cadena lateral. Residuos que se presentan de manera estable en la naturaleza son divididos en grupos a base de sus propiedades de cadena lateral común: (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que influencian la orientación de cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe. Las sustituciones no conservadoras abarcarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Tales residuos sustituidos también pueden ser introducidos a los sitios de sustitución conservadores o más preferiblemente, a los sitios restantes (no conservados) . Las variaciones se pueden efectuar utilizando métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis moderada por oligonucleótido (dirigida al sitio) , exploración de alanina y mutagénesis de PCR. La mutagénesis dirigida a sitio [Cárter et al., Nucí. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucí. Acids Res., _10:6487 (1987)], mutagénesis de caset [Wells et al., Gene, 3^:315 (1985)], mutagénesis de colocación de restricción [Wells et al., Philos . Trans. R. Soc. London SerA, 317 : 415 (1986)] u otras técnicas conocidas se pueden efectuar en el ADN clonado para producir el ADN variante de anticuerpo de TAT o ADN variante de polipéptido de TAT. El análisis de aminoácidos de barrido también se puede emplear para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de barrido o exploración preferidos están los aminoácidos neutro relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es comúnmente un aminoácido de barrido o exploración preferido entre este grupo, debido a que elimina la cadena lateral más allá del beta-carbono y es menos probable que altere la conformación de cadena principal de la variante [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. La alanina es también comúnmente preferida debido a que es el aminoácido más común. Además, es frecuentemente encontrada tanto en posiciones enterrada y expuesta [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no produce cantidades apropiadas de variante, se puede usar un aminoácido isotérico.
Cualquier residuo de cisteína no involucrado en mantener la conformación apropiada del anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT puede también ser sustituido, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidante de la molécula e impedir la reticulación aberrante. Inversamente, enlace (s) de cisteína pueden ser agregados al anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento de Fv) . Un tipo particularmente preferido de variante de sustitución involucra sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante (s) resultante seleccionada para desarrollo adicional tendrá propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo original del cual son generadas . Una manera conveniente para generar tales variantes de sustitución involucra maduración de afinidad utilizando exhibición de fago. Brevemente, varios sitios de región hipervariable (por ejemplo 6-7 sitios) son mutados para generar todas las sustituciones de amino posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas son mostradas de manera monovalente a partir de partículas de fago filamentosas como fusiones al producto de gen III de M13 empacado dentro de cada partícula. Las variantes mostradas en fago son luego seleccionadas en cuanto a su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de enlace) como se revela en la presente. Con el fin de identificar sitios de región hípervariable candidatas para modificación se puede efectuar mutagénesis dé barrido de alanina para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente al enlace de antígeno. Alternativa o adicionalmente, puede ser benéfico analizar una estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y polipéptido de TAT humano. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente. Una vez que tales variantes son generadas, el panel de variantes es sometido a selección como se describe en la presente y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más análisis relevantes pueden ser seleccionados para desarrollo adicional . Moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-TAT son preparados mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen pero no están limitados a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza o preparación mediante mutagénesis moderada por oligonucleótido (o dirigida al sitio) , mutagénesis de PCR y mutagénesis de caset de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo anti-TAT.
H. Modificaciones de anticuerpos anti-TAT y polipéptido TAT Modificaciones covalentes de anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT son incluidas en el alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar los residuos de aminoácido apuntados de un anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT con un agente de derivación orgánico que es apto de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C- terminales del anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT. La derivación con agentes bifuncionales es útil por ejemplo para reticular anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT a una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para uso en el método para purificar anticuerpos de anti-TAT y viceversa. Los agentes de reticulación comúnmente usados incluyen por ejemplo 1, 1-bis (diazoacetil) -2-feniletano, glutaraldehído, esteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, esteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales en los que se incluyen esteres disuccinímidilo tales como 3,3'- ditiobis (succinimidilpropionato) , maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1, 8-octano y agentes tales como metil-3- [ (p-azidofenil) ditio]propioimidato. Otras modificaciones incluyen desamidación de residuos de glutaminilo y asparaginilo a los residuos glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilación de los grupos a-amino de lisina, arginina y cadenas laterales de histidina [T.E. Creighton, Proteins : Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], acetilación de la amina N-terminal y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal. Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT incluida en el alcance de esta invención comprende alterar al patrón de glicosilación natural del anticuerpo o polipéptido. "Alteración del patrón de glicosilación natural" significa cancelar una o más porciones de carbohidrato encontradas en anticuerpo anti-TAT o polipéptido de secuencia natural (ya sea al eliminar el sitio de glicosilación subyacente o al cancelar la glicosilación mediante medios químicos y/o enzimático) , y/o agregar uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT de secuencia natural. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas naturales, que involucran un cambio en la naturaleza y proporciones de las varias porciones de carbohidrato presentes. La glicosilación de anticuerpos y otros polipéptidos está comúnmente ya sea N-enlazada o O-enlazada. N-enlazada se refiere a la anexión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para anexión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Así, la presencia ya sea de una u otra de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. Glicosilación O-enlazada se refiere a la anexión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiamino ácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se pueden usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT se lleva a cabo convenientemente al alterar la secuencia de aminoácidos de tal manera que contiene una o más de las secuencias de tripéptidos descrita anteriormente (para sitios de glicosilación N-enlazados) . La alteración también se puede efectuar mediante la adición de o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT original (para sitios de glicosilación O-enlazados) . La secuencia de aminoácidos de anticuerpo de anti-TAT o polipéptido de TAT puede opcionalmente ser alterada por medio de cambios a nivel de ADN, particularmente mediante mutación del ADN que codifica el anticuerpo de TAT o polipéptido de TAT en bases pre-seleccionadas, de tal manera que se generan codones que traducirán a los aminoácidos deseados. Otros medios para incrementar el número de porciones de carbohidrato sobre el anti-TAT o polipéptido de TAT es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido. Tales métodos son descritos en la técnica por ejemplo, en WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem. , pp. 259-306 (1981) . La remoción de porciones de carbohidrato presentes sobre el anticuerpo de TAT o polipéptido de TAT se puede efectuar química o enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que codifican para residuos de aminoácidos que sirven como objetivos para la glicosilación. Técnicas de desglicosilación químicas son conocidas en la técnica y son descritas por ejemplo por by Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259 : 52 (1987) y por Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). La escisión enzimática de porciones de carbohidrato sobre polipéptidos se puede obtener mediante el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura et al., Meth. Enzymol . , 13¡8:350 (1987). Otro tipo de modificación covalente de anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT comprende enlace del anticuerpo o polipéptido a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo polietilenglicol (PEG) , polipropilenglicol o polioxialquilenos, a la manera resumida en las patentes estadounidenses Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ó 4,179,337. El anticuerpo o polipéptido también puede ser atrapado en microcápsulas preparadas por ejemplo mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y poli- (metilmetacrilato) microcápsulas, respectivamente) , en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) , o en macroemulsiones . Tales técnicas son reveladas en Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980).
El anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT de la presente invención puede también ser modificado de manera para formar moléculas quiméricas que comprenden un anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT fusionados entre sí, polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos. En una modalidad, tal molécula quimérica comprende una fusión del anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT con un polipéptido de etiqueta que proporciona un epítopo al cual un anticuerpo anti-etiqueta se puede enlazar selectivamente. La etiqueta de epítopo es en general colocada en el término amino o carboxilo del anticuerpo de anti-TAT o polipéptido de TAT. La presencia de tales formas epítopo-etiquetadas del anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT puede ser detectada utilizando un anticuerpo contra el polipéptido de etiqueta. También, la provisión de la etiqueta de epítopo permite que el anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT sea fácilmente purificado mediante purificación de afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se enlaza a la etiqueta de epítopo. Varios polipéptidos de etiqueta y sus respectivos anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Ejemplos incluyen etiquetas de poli-histidina (poli-his) o etiquetas de poli-histidina-glicina (poly-his-gly) ; el polipéptido de etiqueta flu HA y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 al mismo [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5_:3610-3616 (1985)]; y la etiqueta de D (gD) de glicoproteína de virus de Herpes Simplex y su anticuerpo [Paborsky et al.,„ Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Otros polipéptidos de etiqueta incluyen el Flag-péptido [Hopp et al., BioTechnology, 6 : 1204-1210 (1988)]; el péptído epítopo KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; un péptido de epítopo de a-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; la etiqueta de péptido de proteína de gen 10 T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]. En una modalidad alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina . Para una forma divalente de la molécula quimérica (también denominada como "inmunoadhesina") , tal fusión podría ser a la región Fc de una molécula IgG. Las fusiones Ig incluyen preferiblemente la sustitución de una forma soluble (dominio de transmembrana cancelado o inactivado) de un anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT en lugar de por lo menos una región variable dentro de una molécula de Ig. En una modalidad particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye la articulación CH2 y CH3, o la articulación CHi, CH2 y regiones CH3 de una molécula de IgGl. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina, véase también patente estadounidense No. 5,428,130 expedida el 27 de junio de 1995.
I . Preparación de anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT La descripción a continuación es concerniente principalmente con la producción de anticuerpos anti-TAT y polipéptidos de TAT al cultivar células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico que codifica anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT . Por supuesto, se contempla que métodos alternativos, que son bien conocidos en la técnica, pueden ser empleados para preparar anticuerpo anti-TAT y polipéptidos TAT. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos apropiada o porciones de la misma, pueden ser producidas mediante síntesis de péptidos directa utilizando técnicas en fase sólida [véase, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 8J5: 2149-2154 (1963)] .La síntesis de proteínas in vitro se puede efectuar utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada se puede llevar a cabo por ejemplo utilizando un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) utilizando instrucciones del fabricante. Varias porciones del anticuerpo anti-TAT o polípéptido de TAT pueden ser separadas como sintetizadas químicamente y combinadas utilizando métodos químicos o enzimáticos para producir el anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT deseado. 1. Aislamiento de ADN que codifica anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT. El ADN que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT puede ser obtenido a partir de una biblioteca de cADN preparada a partir del tejido que se cree que posee el mARN de anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT y para expresarlo a nivel detectable. Así, ADN de anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT humanos pueden ser obtenidos convenientemente de una biblioteca cADN preparada a partir de tejido humano. El gen que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT puede también ser obtenido a partir de una biblioteca genómica o mediante procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo, síntesis de ácido nucleico automatizada) . Las bibliotecas pueden ser seleccionadas con sondas (tales como oligonucleótidos de por lo menos de aproximadamente 20-80 bases) designadas para identificar el gen de interés o la proteína que lo codifica. La selección de cADN o biblioteca genómica con las sondas genómicas seleccionadas se puede llevar a cabo utilizando procedimientos estándar, tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Un medio alternativo para aislar el gen que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT es usar metodología de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]. Técnicas para seleccionar una biblioteca de cADN son bien conocidas en el arte. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben ser de suficiente longitud y suficientemente no ambiguas que se minimicen los positivos falsos. El oligonucleótido es preferiblemente marcado de tal manera que pueda ser detectado en la hibridización a ADN en la biblioteca que es seleccionada. Métodos de marcación son bien conocidos en la técnica e incluyen el uso de radiomarcadores como ATP32 P-marcados, biotinilización o marcación de enzimas. Las condiciones de hibridización, en las que se incluyen severidad moderada y alta severidad, son provistas en Sambrook et al., supra. Las secuencias identificadas en tales métodos de selección de bibliotecas pueden ser comparadas y alineadas con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas tales como GenBank u otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de secuencia (ya sea a nivel de aminoácidos o nucleótidos) dentro de regiones definidas de la molécula o a través de la secuencia de plena longitud puede ser determinada utilizando métodos conocidos en la técnica y como se describe en la presente. El ácido nucleico que tiene secuencia de codificación de proteínas puede ser obtenido mediante selección de cADN o bibliotecas genómicas seleccionadas utilizadas para reducir la secuencia de aminoácidos reducida revelada en la presente por primera vez y si es necesario, utilizando procedimientos de extensión de cebador convencionales como se describe en Sambrook et al., supra, para detectar precursores y procesar intermediarios de mARN que pueden no haber sido transcritos inversas a cADN. 2. Selección y transformación de células huésped Las células huésped son transfectadas o transformadas con vectores de expresión o formación de sitios en la presente para la producción de anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT y cultivados en medios de nutrientes convencionales modificados como sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medios, temperatura, pH y los semejantes pueden ser seleccionados por el técnico experimentado sin experimentación indebida. En general, principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares se pueden encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., supra. Métodos de transfección de célula eucarióntica y transformación de célula procarióntica son conocidos para el experimentado en la técnica, por ejemplo CaCl2, CaP04, moderado por liposoma y electroporación. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se lleva a cabo utilizando técnicas estándar apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio como se describe en Sambrook et al., supra, o electroporación se usa en general para procariontes . La infección con Agrobacterium tumefasciens es usada para transformación de ciertas células de plantas, como se describe por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicado el 29 de junio de 1989. Para células mamíferas sin tales paredes celulares, el método de precipitación de fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52^:456-457 (1978) puede ser usado. Aspectos generales de transfecciones del sistema huésped celular mamífero se han descrito en la Patente estadounidense No. 4,399,216. Transformaciones a levaduras se llevan a cabo comúnmente de acuerdo con el método de Van Solingen et al., J- Bact., 130:946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) , 7_6:3829 (1979). Sin embargo, otros métodos para introducir ADN a células, tales como microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplasto bacteriano con células intactas con policationes, por ejemplo polibeno, poliornitina, pueden también ser usados. Para varias técnicas para transformar células mamíferas, véase Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988). Células huésped apropiadas para clonación o expresión de los ADN en los vectores de la presente incluyen procariontes, levaduras o células eucariónticas superiores. Los procariontes apropiados incluyen pero no están limitados a eubacterias tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como E. coli. Varias cepas de E. coli están disponibles públicamente, tales como E. coli K12 cepa MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli cepa W3110 (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53,635). Otras células huésped procariónticas apropiadas incluyen Enterobacteriaceae tales como Escherichia, también como E . coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serra tia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tal como B . subtilis y B . licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P revelados en DD 266, 710 publicado el 12 de abril de 1989) , Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces . Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes. La cepa W3110 es un huésped preferido o huésped original debido a que es una cepa huésped común para fermentaciones de producto de ARN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped segrega cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 puede ser modificada para efectuar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas al huésped, como ejemplos de tales se incluyen E. coli W3110 cepa 1A2, que tiene el genotipo completo; E. coli W3110 cepa 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3; E. coli W3110 cepa 27C7 (ATCC 55,244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kanr; E. coli W3110 cepa 37D6, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs 7 ilvG kanr; E. coli W3110 cepa 40B4, que es la cepa 37D6 con una mutación de cancelación degP no resistente a kanamicina y una cepa E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante revelada en la Patente estadounidense No. 4,946,783 expedida el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, métodos in vitro de clonación, por ejemplo PCR u otras reacciones de polimerasa ácidos nucleicos son apropiados . Proteínas de anticuerpos de plena longitud, fragmentos de anticuerpo y proteínas de fusión de anticuerpo pueden ser producidas en bacterias, en particular cuando la glicosilación y función efectora Fc no son necesarias, tal como cuando el anticuerpo terapéutico está conjugado a un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) y el inmunoconjugado por sí mismo muestra efectividad en la destrucción de la célula de tumor. Los anticuerpos de plena longitud tienen mayor vida media en circulación. La producción de E. coli es más rápida y más eficiente en el costo. Para la expresión de fragmentos de anticuerpos y polipéptidos en bacterias, véase por ejemplo Patente estadounidense 5,648,237 (Cárter et al.), Patente estadounidense 5,789,199 (Joly et al.) y Patente estadounidense 5,840,523 (Simmons et al.) que describe la región de inicio de traducción (TIR) y secuencias de señal para optimizar la expresión y secreción, estas patentes fueron incorporadas en la presente por referencia. Después de la expresión, e anticuerpo es aislado de la pasta de células de E. coli en una fracción soluble y puede ser purificada por medio de por ejemplo una columna de proteína A o G dependiendo del isotipo. La purificación final se puede llevar a cabo de forma similar al proceso para purificar anticuerpo expresado por ejemplo en células CHO. Además de los procariontes, microbios eucariónticos tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión apropiados para los vectores que codifican anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucarióntico inferior usado comúnmente. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139,383 publicada el 2 de mayo de 1985); huésped Kluyveromyces (Patente estadounidense No. 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tales como por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154 (2) : 737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12, 424) , K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990) ) , K. thermotolerans , y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); Candida ; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 publicado el 31 de octubre de 1990) ; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora , Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicado el 10 de enero de 1991) , y huéspedes de Aspergillus tal como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun . , 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J. , 4:475-479 [1985] ) . Levaduras metilotrópicas son apropiadas en la presente e incluyen pero no están limitadas a, levadura capaz de crecimiento en metanol seleccionado del género que consiste de Hansenula, Candida , Kloeckera , Pichia , Saccharomyces , Torulopsis y Rhodotorula . Una lista de especies específicas que son ejemplares de esta clase de levaduras se puede encontrar en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982) . Células huésped apropiadas para la expresión de anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT glicosilado son derivadas de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, también como células de plantas, tales como cultivos celulares de algodón, maíz, patata, soya, petunia, tomate y tabaco. Numerosas cepas baculovirales y variantes correspondientes a células huésped de insectos permisivas de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori han sido identificados. Una variedad de cepas virales para transfección están disponibles públicamente, por ejemplo la variante L-l de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus pueden ser usados como el virus en la presente de acuerdo con la presente invención, particularmente para transfección de células Spodoptera frugiperda . Sin embargo, el interés ha sido mayor en células de vertebrados y propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas de células huésped mamíferas útiles son la línea CVl de riñon de chango transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embriónico humano (293 ó 293 células subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol . 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovarios de hámster chino /-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol.
Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de chango (CVl ATCC CCL 70) ; células de riñon de chango verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata de búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humanas (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humana (Hep G2) . Las células huésped son transformadas con los vectores de expresión o clonación descritas anteriormente para la producción de anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT y cultivados en medios de nutrientes convencionales modificados como sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. 3. Selección y uso de un vector replicable El ácido nucleico (por ejemplo, cADN o ADN genómico) que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT puede ser insertado a un vector replicable para clonación (amplificación del ADN) o para expresión. Varios vectores están disponibles públicamente. El vector puede estar por ejemplo en forma de un plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede ser insertada al vector mediante una variedad de procedimientos. En general, el ADN es insertado a un sitio (s) de endonucleasa de restricción apropiados utilizando técnicas conocidas en el arte. Los componentes del vector incluyen en general pero no están limitados a una o más de una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento mejorador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción. La construcción de vectores apropiados que contienen uno o más de estos componentes emplean técnicas de de derivación estándar que son conocidas para el técnico experimentado. El TAT puede ser producido recombinantemente no solo directamente, si no también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el término N de la proteína madura o polipéptido. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector o puede ser parte del ADN que codifica el anticuerpo de anti-TAT o polipéptido de TAT que es insertado al vector. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal procarióntica seleccionada por ejemplo del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o líderes de enterotoxina II estables térmicamente. Para la secreción de levadura la secuencia de señal puede ser por ejemplo, el líder de invertasa de levadura, líder de factor alfa (incluyendo Saccharomyces y Kluyveromyces líderes de factor OÍ, el último es descrito en la Patente estadounidense No. 5,010,182) o líder de fosfatasa acida, el líder de glucoamilasa de C. albicans (EP 362,179 publicado el 4 de abril de 1990) o la señal descrita en WO 90/13646 publicado el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de célula mamaria, las secuencias de señal mamarias puede ser usadas para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias de señal de polipéptidos secretados de la misma especie o especie o especies relacionadas, también como líderes secretorios virales . Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector replique en una o más células huésped seleccionadas. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2µ es apropiado para levadura y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células mamarias. Los vectores de expresión y clonación contendrán comúnmente un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) deficiencias auxotróficas de complemento o (c) nutrientes críticos de suministro no disponibles de los medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la racemasa de de D-alanina para bacilos . Un ejemplo de marcadores seleccionables apropiados para células mamarias son aquellos que permiten la identificación de células competentes para absorber el ácido nucleico que codifica anticuerpo anti-TAT como polipéptido de TAT, tal como DHFR o timidina cinasa. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR tipo libre es la línea celular CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada como se describe por Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección apropiado para uso en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. Vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor enlazado operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT para dirigir la síntesis de mARN. Los promotores reconocidos por una variedad de células huésped potenciales son bien conocidos. Promotores apropiados para uso con huésped procariónticos incluyen los sistemas de promotor ß-lactamasa y lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], y promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) enlazada operativamente al ADN que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT. Ejemplos de secuencias de promoción apropiadas para uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa [Hitzeman et al., J. Biol . Chem. , 255:2073 (1980)] u otras enzimas glucolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)] tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato dshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa. Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las reacciones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa acida, enzimas degradantes asociadas con metabolismo de hidrógeno, etalotioneína, gliceraldehido-3-fisfato deshidrogenasa y enzimas responsables por la utilización de maltosa y galactosa. Vectores y promotores apropiados para uso en la expresión de levaduras son descritos adicionalmente en EP 73,657. La transcripción del anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT en vectores de células huésped mamarias es controlada, por ejemplo mediante promotores obtenidos de los genomas de virus tales como polioma virus, virus fowlpox (Patente británica 2,211,504 publicado el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma bovino , virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de hepatitis B y virus de simio 40 (SV40) , de promotores mamarios heterólogos, por ejemplo el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina y de promotores de cloque térmico, a condición de que tales promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped. La transcripción de un ADN que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT mediante eucariontes superiores se puede incrementar al insertar una secuencia mej oradora al vector. Los mej oradores son elementos de acción cis de ADN, usualmente de alrededor de 10 a 300 bp, que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Muchas secuencias del mejorador son ahora conocidas de genes mamarios (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina) . Sin embargo, comúnmente, se usará un mejorador de un virus de célula eucarióntica . Ejemplos incluyen el mejorador SV40 en el lado posterior del origen de replicación (100-270 bp) , el mejorador del promotor prematuro de citomegalovirus, el mejorador de polioma en el último lado del origen de replicación y mej oradores de adenovirus. El mejorador puede ser dividido en el vector en una posición 5' ó 3' a la secuencia de codificación del anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT pero está preferiblemente ubicado en un sitio 5' del promotor. Vectores de expresión usados en células huésped eucariónticas (levaduras, hongos, insectos, planta, animal, humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para terminación de transducción y para estabilización de mARN.
Tales secuencias están disponibles comúnmente de las regiones 5' y ocasionalmente 3' sin traducir de ADN o cADN eucariónticas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción sin traducir del mARN que codifica anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT. Todavía otros métodos, vectores y células huésped apropiadas para adaptación a la síntesis de anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT en cultivo celular de vertebrado recombinante son descritos en Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; y EP 117,058. 4. Cultivo de las células huésped Las células huésped usadas para producir el anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT de esta invención pueden ser cultivadas en una variedad de medios. Medios disponibles comercialmente tal como Ham's FIO (Sigma),, Medio Esencial Mínimo ( (MEM) , (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Medio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) están disponibles para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz . 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102 : 255 (1980), Patentes estadounidenses Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o referencia de Patente estadounidense 30,985 pueden ser usados como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios pueden ser complementados como sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento dtales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tal como cloruro de sodio, calcio , magnesio y fosfato) , soluciones reguladoras del pH (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tal como el fármaco GENTAMICINA™) , elementos en trazas (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquier otros complementos necesarios pueden ser incluidos a concentraciones apropiadas que serían conocidas para aquellos experimentados en la técnica. Las condiciones de cultivo tales como temperatura, pH y los semejantes son aquellos usados previamente con la célula huésped seleccionada para expresión y será evidente para el experimentado en la técnica.
. Detección de amplificación/expresión genética la amplificación y/o expresión genética puede ser medida en una muestra directamente, por ejemplo mediante absorción de Southern convencional, bandas de proteínas para cuantificar la transcripción de mARN [Thomas, Proc . Nati . Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], absorción de puntos (análisis de ADN) o hibridización in situ, utilizando una sonda marcada apropiadamente, en base a las secuencias provistas en la presente. Alternativamente, se pueden ampliar anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, en los que se incluyen dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína . Los anticuerpos a su vez pueden ser marcados y el análisis se puede llevar a cabo en donde el dúplex es enlazado a una superficie, de tal manera que después de la formación del dúplex sobre la superficie, se puede detectar la presencia del anticuerpo enlazado al dúplex. La expresión genética, alternativamente, puede ser medida mediante métodos inmunológicos, tales como teñido inmunohistoquímico de células o secciones de tejido y análisis de cultivo celular o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión de productos genéticos. Los anticuerpos útiles para teñido inmunohistoquímico y/o análisis de fluidos de muestra pueden ya sea ser monoclonales o policlonales y pueden ser preparados en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden ser preparados contra un polipéptido de TAT de secuencia natural o contra un péptido sintético a base de secuencias de ADN provistas en la presente o contra secuencia exógena fusionada a ADN de TAT y codificación de un epítopo de anticuerpo específico. 6. Purificación de anticuerpo de anti-TAT y polipéptido de TAT Formas de anticuerpo de anti-TAT y polipéptido de TAT pueden ser recuperadas del medio de cultivo o de lisados de célula huésped. Si está enlazada a la membrana, puede ser liberado de la membrana utilizando una solución detergente apropiada (por ejemplo, Tritón-X 100) o mediante escisión enzimática. Las células empleadas en la expresión de anticuerpo anti-TAT y polipéptido de TAT pueden ser rotas mediante varios medios físicos o químicos, tales como ciclización de congelación-deshielo, sonificación, disrupción mecánica o agentes de lisis celular. Puede ser deseable purificar el anticuerpo anti-TAT y polipéptido de TAT de proteínas o polipéptidos de células recombinantes . Los siguientes procedimientos son ejemplares del procedimiento de purificación apropiados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación de etanol; HPLXC de fase inversa, cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromato enfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración de gel utilizando, por ejemplo Sephadex G-75; columnas de proteína A Sepharosa para separar contaminantes tales como IgG; y columnas quelantes de metal para enlazar formas marcadas con epítopo del anticuerpo anti-TAT y polipéptido de TAT. Varios métodos de purificación de proteínas pueden ser empleados y tales métodos son conocidos en la técnica y descritos por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, New York (1982) . La (s) etapa (s) de purificación seleccionada (s) dependerá por ejemplo de la naturaleza del proceso de producción usado y el anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT particular producidos . Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede ser producido intracelularmente, en el espacio periplásmico o secretado directamente al medio. Si el anticuerpo es producido intracelularmente, como primera etapa los desechos en partículas, ya sea células huésped o fragmentos lisados, son separados, por ejemplo mediante centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados al espacio periplásmico de E . coli . Brevemente, la pasta celular es deshielada, en presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. Los desechos celulares pueden ser separados mediante centrifugación. En donde el anticuerpo es secretado al medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión son en general concentrados primero utilizando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo una unidad de filtración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede ser incluido en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para impedir el crecimiento de contaminantes adventicios. La composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede ser purificada utilizando por ejemplo cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, la cromatografía de afinidad es la técnica de purificación preferida. La conveniencia de la proteína A como ligando de ' afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier dominio de Fc de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A puede ser usada para purificar anticuerpos que están basados en cadenas pesadas ?l, ?2 o ?4 de humanos (Lindmark et al., J. Immunol . Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G es recomendada para todos los isotipos de ratón y para ?3 humano (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual el ligando de afinidad es anexado es más frecuentemente agarosa, pero otras matrices están disponibles. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli (estirendivinil) enceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que se pueden obtener con agarosa. En donde el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™resin (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteína tales como fraccionamiento sobre una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre columna de SEPHAROSE™ de heparina sobre una resina de intercambio aniónico catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico) , cromato enfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio están también disponibles dependiendo del anticuerpo a ser recuperado. Enseguida de cualquier etapa de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes puede ser sometida a cromatografía de integración hidrofóbica a bajo pH utilizando una solución reguladora del pH de elución a un pH de entre aproximadamente 2.5 - 4.5, de preferencia llevada a cabo a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, de aproximadamente sal de 0-0.25 M) .
J. Formulaciones farmacéuticas Formulaciones terapéuticas de los anticuerpos anti- TAT, oligopéptidos de enlace de TAT, moléculas orgánicas de enlace de TAT y/o polipéptidos de TAT usados de acuerdo con la presente invención son preparados para almacenamiento al mezclar el anticuerpo, polipéptido, oligopéptido o molécula orgánica que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington 's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) ) , en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleados e incluyen soluciones reguladoras del pH tales como acetato, Tris, fosfato, citraro y otros ácidos orgánicos; antioxidantes en los que se incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecilmetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, butil o alcohol bencílico; alquil parabenos tales como metil o propilparabén; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y n-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos en los que se incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; tonificadores tales como trehalosa y cloruro de sodio; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; surfactantes tales como polisorbato; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN®, PLURONICS® o polietilenglicol (PEG) . El anticuerpo comprende preferiblemente el anticuerpo a una concentración de entre 5-200 mg/ml, preferiblemente entre 10-100 mg/ml. Las formulaciones de la presente pueden también contener más de un compuesto activo como sea necesario para la indicación particular que es tratada, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, además de un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica de enlace de TAT, puede ser deseable incluir en la formulación, un anticuerpo adicional, por ejemplo, un segundo anticuerpo anti-TAT que se enlaza a un diferente epítopo sobre el polipéptido de TAT o un anticuerpo a algún otro objetivo tal como un factor de crecimiento que afecta el crecimiento del cáncer particular. Alternativa o adicionalmente, la composición puede comprender además un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, citocina, agente inhibidor de crecimiento, agente anti-hormonal y/o cardioprotector . Tales moléculas están convenientemente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito planeado. Los ingredientes activos también pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas por ejemplo mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas son reveladas en Remington 's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) . Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, tales matrices están en forma de artículos formados, por ejemplo películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli (alcohol vinílico)), polilacturos (Patente estadounidense No. 3,773, 919), copolímeros de ácido L-glutámico y ?-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinil no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT® (microesferas inyectables compuestas de copolímeros de acido láctico-ácido glicólico y acetato de leuproluro) y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico. Las formulaciones a ser usadas para administración in vivo deben ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
K. Diagnosis y tratamiento con anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos de enlace TAT y moléculas orgánicas de enlace de TAT Para determinar la expresión de TAT en el cáncer, varios análisis de diagnóstico están disponibles. En una modalidad, la sobreexpresión del polipéptido de TAT puede ser analizada mediante inmunohistoquímica (IHC) . Secciones de tejido embebidas en parafina de una biopsia de tumor pueden ser sometidas al análisis de IHC y de acuerdo con criterios de intensidad de teñido de proteínas de TAT como sigue: Puntuación 0 - no se observa ningún teñido o teñido de membrana en menos de 10% de células de tumor. Puntuación 1+ - un teñido de membrana débilmente/escasamente perceptible es detectado en más del 10% de las células del tumor. Las células están solamente teñidas en parte de su membrana. Puntuación 2+ - un teñido de membrana completo débil a moderado es observado en más del 10% de las células del tumor . Puntuación 3+ - un teñido de membrana moderado a fuerte completo es observado en más del 10% de las células de tumor . - Estos tumores con puntuaciones de 0 a 1+para la expresión del polipéptido TAT pueden ser caracterizados que no sobreexpresan TAT, mientras que aquellos tumores con puntuaciones 2+ y 3+ pueden ser caracterizados como que expresan TAT. Alternativa o adicionalmente, análisis de FISH tal como el INFORM® (vendido por Ventana, Arizona) o PATHVISION® (Vysis, Illinois) se puede llevar a cabo sobre tejido de tumor embebido con parafina fijo con formalina para determinar la extensión (si la hay) de sobreexpresión de TAT en el tumor. La sobreexpresión o amplificación de TAT puede ser evaluada utilizando un análisis de diagnóstico in vivo, por ejemplo al administrar una molécula (tal como un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica) que se enlaza a la molécula a ser detectada y es marcada con una etiqueta detectable (por ejemplo, un isótopo radioactivo o una etiqueta fluorescente (y externamente explorar al paciente en cuanto a la localización de la etiqueta. Como se describe anteriormente, los anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos y moléculas orgánicas de la invención tienen varias aplicaciones no terapéuticas . Los anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos y moléculas orgánicas de la presente invención pueden ser útiles para diagnosis y escalonamiento de los cánceres que expresan el polipéptido de TAT (esto es, en radioformación de imagen) . Los anticuerpos, oligopéptidos y moléculas orgánicas son también útiles para purificación e inmunoprecipitación del polipéptido de TAT de células para la detección y cuantificación del polipéptido de TAT in vitro, por ejemplo, en un ELISA o un análisis de manga de proteínas para exterminar y eliminar células que expresan TAT de una población de células mezcladas como una etapa en la fabricación de otras células. Actualmente, dependiendo de la etapa del cáncer, el tratamiento del cáncer involucra una o una dominación de las siguientes terapias: cirugía para retirar el tejido canceroso, terapia de radiación y quimioterapia. La terapia de anticuerpo de anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica puede ser especialmente deseable en pacientes de edad madura que no toleran la toxicidad y efectos secundarios de la quimioterapia bien y en la enfermedad metastática en donde la terapia de radiación tiene utilidad limitada. Los anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos y moléculas orgánicas que apuntan al tumor de la invención son útiles para aliviar cánceres que expresan TAT después de la diagnosis inicial de la enfermedad o durante el relapso. Para aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica puede ser usado solo o en terapia de combinación con por ejemplo, hormonas, antiangiógenos o compuestos radiomarcados o con cirugía, crioterapia y/o radioterapia. El tratamiento con anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica puede ser administrado en conjunción con otras formas de terapia convencional, ya sea consecutivamente con terapia pre- o post-convencional . Fármacos quimioterapéuticos tales como TAXOTERE® (docetaxel), TAXOL® (palictaxel) , estra ustina y mitoxantrona son usados en tratamiento de cáncer, en particular, en pacientes de buen riesgo. En el presente método de la invención para tratar o aliviar el cáncer, el paciente de cáncer puede ser administrado con el anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica en conjunción con tratamiento con uno o más de los agentes quimioterapéuticos precedentes. En particular, la terapia de combinación con paclitaxel y derivados purificados (véase, por ejemplo EP0600517) es contemplada. El anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica será administrado con una dosis terapéuticamente efectiva del agente quimioterapéutico. En otra modalidad, el anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica es administrado en conjunción con quimioterapia para mejorar la actividad y eficacia del agente quimioterapéutico, por ejemplo paclitaxel. El Physicians' Desk Reference (PDR) revela dosificaciones de estos agentes que han sido usados en el tratamiento de varios cánceres. El régimen de dosificación y dosificaciones de estos fármacos quimioterapéuticos mencionados anteriormente que son terapéuticamente efectivos dependerán del cáncer particular que es tratado, la extensión de la enfermedad y otros factores familiares al experimentado en la técnica y pueden ser determinados por el médico. En una modalidad particular, un conjugado que comprende un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica conjugado con un agente citotóxico es administrado al paciente. Preferiblemente, el inmunoconjugado enlazado a la proteína de TAT es internalizado por la célula, dando como resultado una eficacia terapéutica incrementada del inmunoconjugado en el exterminio de la célula de cáncer a la cual se enlaza. En una modalidad preferida, el agente citotóxico apunta o interfiere con el ácido nucleico en las células de cáncer. Ejemplos de tales agentes citotóxicos son descritos anteriormente e incluyen maitansinoides, calicheamicinas, ribonucleasas y endonucleasas de ADN. Los anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos, moléculas orgánicas o conjugados de toxinas de los mismos son administrados a un paciente humano de acuerdo a métodos conocidos, tales como administración intravenosa, tales como un bolo o mediante infusión continua en un período de tiempo, mediante rutas intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o inhalación. La administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica es preferida. Otros regímenes terapéuticos pueden ser combinados con la administración del anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica. La administración combinada incluye coadministración, utilizando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica y administración consecutiva ya sea en un orden u otro, en donde preferiblemente hay un período de tiempo en tanto que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus acividades biológicas. Preferiblemente, tal terapia combinada da como resultado un efecto terapéutico sinergístico. También puede ser deseable combinar la administración del anticuerpo o anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos o moléculas orgánicas, con la administración de un anticuerpo o dirigido contra otro antígeno de tumor asociado con el cáncer particular. En otra modalidad, los métodos de tratamiento terapéuticos de la presente invención ilustran la administración combinada de un anticuerpo anti-TAT (anticuerpo) , oligopéptidos o moléculas orgánicas y uno o más agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores de crecimiento, que incluyen la co-administración de cocteles de diferentes agentes quimioterapéuticos. Agentes quimioterapéuticos incluyen fosfato de estrasmustina, prednimustina, cisplatino, 5-fluorouracilo, melfalán, ciclofosfamida, hidroxiurea e hidroxiureataxano (tales como paclitaxel y docetaxel) y/o antibióticos de antraciclina. La preparación y horarios de dosificación para tales agentes quimiotreaopéuticos pueden ser usados de acuerdo con las instrucciones de los fabricants o tal como se determina empíricamente por el médico experimentado. La preparación y horarios de dosificación para tal quimioterapia también son dscritos en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wiikins, Baltimore, MD (1992) . El anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pueden ser combinados en un compuesto anti-hormonal; por ejemplo, un compuesto anti-estrógeno tal como tamoxifen; una anti-progesterona tal como onapristona (véase, EP 616 812) ; o un anti-andrógeno tal como fluta ida, en dosificaciones conocidas para tales moléculas, en donde el cáncer a ser tratado es cáncer independiente de andrógeno, el paciente puede haber sido sometido previamente a terapia anti-andrógeno y después que el cáncer se vuelve independiente de andrógno, en anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica (y opcionalmente otros agentes como se describen en la presente) pueden ser administrados al paciente. Algunas veces, puede ser benéfico también coadministrar un cardioprotector (para impedir o reducir la disfunción miocardiaca asociada con la terapia) o una o más citocinas al paciente. Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede ser sometido a remoción quirúrgica de células de cáncer y/o terapia de radiación antes, simultáneamente con o post terapia de anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica. Tales dosificaciones para cualquiera de los agentes co-administrados anteriores son aquellos usados naturalmente y pueden ser disminuidos debido a la acción combinada dsínergia) del agente y anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica. Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación y modo de administración serán escogidos por el médico de acuerdo con criterios conocidos . La dosificación apropiada del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica dependerá del tipo de enfermedad a ser tratado, como se define anteriormente, la severidad y curso de la enfermedad, ya sea si el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es administrado por propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica y la discreción del médico que atiende. El anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es administrado convenientemente al paciente a una vez o en una serie de tratamientos. Preferiblemente, el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es administrado mediante infusión intravenosa o mediante inyecciones subcutáneas. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal (por ejemplo, aproximadamente 0.1-15 mg/kg/dosis) del anticuerpo puede ser una dosificación candidato inicial para administración al paciente, ya sea que, por ejemplo por una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Un régimen de dosificación puede comprender administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguida por una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo anti-TAT. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. Una dosificación diaria típica puede fluctuar de aproximadamente 1 µg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento es sostenido hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. El avance de esta terapia puede ser verificado fácilmente mediante métodos y análisis convencionales y en base a criterios conocidos para el médico u otras personas de habilidad en la técnica. Además de la administración de la proteína de ancuerpo al paciente, la presente solicitud contempla la administración del anticuerpo mediante terapia genética. Tal administración de ácido nucleico que codifica el anticuerpo es abarcada por la expresión "administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo". Véase, por ejemplo, WO96/07321 publicado el 14 de marzo de 1996 concerniente con el uso de terapia genética para generar anticuerpos intracelulares .
Hay dos procedimientos principales para introducir el ácido nucleico (opcionalmente contenido en unvector) a las células del paciente; in vivo y ex vivo . Para la administración in vivo, el ácidoc nucleico es inyectado directamente al paciente, usualmente en el sitio donde el anticuerpo es requerido. Para el tratamiento ex vivo, las células del paciente son separadas, el ácido nucleico es introducido a estas células aisladas y las células modificadas son administradas al paciente ya sea directamente o por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que son implantadas al paciente (véase, por ejemplo, Patentes estadounidenses Nos. 4,892,538 y 5,283,187). Hay una variedad de técnicas disponibles para producir ácidos nucleicos a células viables . Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico es transferido a células cultivadas in vitro o in vivo en las células del huésped propuesto. Técnicas apropiadas para la transferencia de ácido nucleico a células de mamíferos in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrán, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Un vector comúnmente usado para la administración ex vivo del gen es un vector retroviral. Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo usualmente preferisas incluyen transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus de Herpes simplex I o virus adeno-asociados) y sistemas a base de lípidos (lípidos útiles para la transferencia moderada por lípidos del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo) . Para una revisión de los protovolos de marcación y terapia genética de gen conocidos véase Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). Véase también WO 93/25673 y las referencias citadas en los mismos. Los anticuerpos anti-TAT de la invención pueden estar en formas diferentes abarcadas por la definición de "anticuerpo" en la presente. Así, los anticuerpos incluyen anticuerpos de plena longitud o intacto, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de secuencia natural o variantes de aminoácido, anticuerpos humanizados, quiméricos o de fusión, inmunoconjugados y fragmentos funcionales de los mismos. En los anticuerpos de fusión, una secuencia de anticuerpos es fusionada a una secuencia de polipéptidos heteróloga. Los anticuerpos pueden ser modificados en la región Fc para proporcionar funciones efectoras deseadas. Como se discute en más detalle en las secciones de la presente, con las regiones Fc apropiadas, el anticuerpo del nudo enlazado sobre la supreficie celular puede inducir citotoxicidad, por ejemplo vía citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) o al reclutar complemento en citotoxicidad dependiente del complemento o algún otro mecanismo. Alternatvamente, en donde es deseable eliminar o reducir la función efectra, para minimizar efectos secundarios o complicaciones terapéuticas, se pueden usar cuertas otras regiones Fc. En una modalidad, el anticuerpo compit tanto por el enlace o enlace sustancialmente a el mism epítopo como los anticuerpos de la invención. Anticuerpos que tienen las características biológicas anti-TAT presentes de la invención son también contemplados, incluyen específicamente el apuntamiento del tumor in vivo y cualquier inhibiciónd de proliferación celular o caractreísticas citotóxicas. Métodos para producir los anticuerpos anteriores son descritos en detalle en la presente. Los anticuerpos anti-TAT presentes, oligopéptidos y moléculas orgánicas son útiles para tratar un cáncer que expresa TAT o aliviar uno o mñas síntomas del cáncer en un mamífero. Tal cáncer incluye el cáncer de próstata, cáncre del sistema urinario, cáncer de pulmón, cáncer de pecho, cáncer de colon y cáncer de ovario, más específicamente, adenocarcinoma de próstata, carcinomas de célula renal, adenocarcinomas colorrectales, adenocarcinoma de pulmón, carcinomas de célula escamosa de pulmón y mesoterismo pleural. Los cánceres abarcan cánceres metastáticos de cualquiera de los precedentes. El anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es apto de enlazarse a por lo menos una porción de las células de cáncer que expresan el polipéptido de TAT en el mamífero. En una modalidad preferida, el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es efectivo para destruir o exterminar células de tumor que expresan para TAT • o inhibir el crecimiento de tales células de tumor, in vitro o in vivo, después del enlace al péptido de TAT sobre la célula. Tal anticuerpo incluye un anticuerpo anti-TAT desnudo (no conjugado a algún agente) . Los anticuerpos desnudos que tienen citotoxicidad o propiedades de inhibición de crecimiento regular pueden ser además provistos con un agente de ácido tóxico para volverlos aún más potentes en la destrucción de células de tumor. Propiedades citotóxicas pueden ser conferidas a un anticuerpo anti-TAT mediante, por ejemplo conjugación del anticuerpo con un agente citotóxico, para formar un inmunoconjugado como se describe en la presente. El agente citotóxico o agente inhibidore del crecimiento es preferiblemente una molécula pequeña. Las toxinas tales como calicheamicina o un maytansinoide y análogos o derivados de los mismos son preferibles. La invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica de la invención y un portador. Por propósitos de tratamiento de cáncer, las composiciones pueden ser administradas a pacientes en necesidad de tal tratamiento, en donde la composición puede comprender uno o más anticuerpos anti-TAT presentes como , un inmunoconjugado o como el anticuerpo desnudo. En una modalidad adicional, las composiciones pueden comprender estos anticuerpos, oligopéptidos o moléculas orgánicas en combnación con otros agentes terapéuticos tales como agentes citotóxicos o agentes inhibidores del crecimiento, en los que se incluyen agentes quimioterapéuticos. La invención también proporciona formulaciones que comprenden un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica de la invención y un portador. En una modalidad, la formulación es una formulación terapéutica que comprende un portador aceptable farmacéuticamente . Oto aspecto de la invención consiste en ácidos nucleicos aislados que codifican en los anticuerpos anti-TAT. Ácidos nucleicos que codifican tanto las cadenas Hil y especialmente los residuos de región hipervariable, cadenas que codifican el anticuerpo de secuencia natural también como variante, modificaciones y versiones inmunizadas del anticuerpo, son abarcadas. La invención también proporciona métodos útiles para tratar un cáncer que expresa polipéptido de TATo aliviar uno o más síntomas del cáncer en un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica al mamífero. Las composiciones terapéuticas de anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pueden ser administradas a corto plaxo (agudas) o crónicas o intermitentes como sea instruido por el médico. También se proporcionan métodos para inhibir el crecimiento de y exterminio de una célula que expresa al polipéptido de TA . La invención también proporciona equipos y artículos de manufactura que comprenden por lo menos un anticuerpo de anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica. Equipos que contienen anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos o moléculas orgánicas encuentran uso, por ejemplo para análisis de exterminio de células TAT, para purificación o inmuniprecipitación de polipéptidos de TAT de células. Por ejemplo, para aislamiento y purificación de TAT, el equipo puede contener un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica acoplado a perlas (por ejemplo, perlas de sepharosa) . Se pueden proporcionar equipos que contienen los anticuerpos, oligopéptidos o moléculas orgánicas para detección y cuantificación de TAT in vitro, por ejemplo en un análisis de ELISA o transferencia Western. Tal anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica útil para la detección puede se proviso con una etiqueta tal como una etiqueta fluorescente o radioetiqueta.
L. Artículos de manufactura y equipos Ora modalidad de la invención es un artículo de manufacura que contiene materiales útiles para el tratamiento de cáncer que expresa anti-TAT. El artículo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de paquete sobre o asociado con el recipiente. Recipientes apropiados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, etc. Los recipientes pueden ser formados a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es efectiva para tratar la condición de cáncer y puede tener una compuerta de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser un saco o bolsa de solución intravenosa o un fasco qu tiene un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica) . Por lo menos un agente activo en la compolsición es un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica de la invención. La etiqueta o inserto de paquete que incluye la composici'n es usada para el tratamiento de cáncer. La etiqueta o inserto de paquete comprenderá además instrucciones para administrar el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica al paciente de cáncer. Adicionalmente, el artículo de manufactura puede comprender además un segundo recipiente que comprende una solución reguladora del pH aceptable farmacéuticamente, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI) , solución salina de pH regulado de fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuaro, en los que se incluyen otras soluciones reguladoras del pH, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. También se proporcionan equipos que son útiles para varios propósitos, por ejemplo, para análisis de exterminio de células que expresan TAT, para purificación inmunoprecipitación de péptido TAT de células. Para aislamiento y purificación del polipéptido TAT el equipo puede contener un anticuerpo de anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica acoplado a perlas (por ejemplo, perlas de Sepharosa) . Se pueden proporcionar equipos que contienen los anticuerpos, oligopéptidos o moléculas orgánicas para detección y cuantificación del polipéptido de TAT in vitro, por ejemplo en un análisis de ELISA o en un análisis de transferencia Western. Como con el artículo de manufactura, el equipo comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de paquete sobre o asociado con el recipiente. El recipiente contiene una composición que comprende por lo menos un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica de la invención. Recipientes adicionales que pueden estar incluidos que contienen, por ejemplo, diluyentes y soluciones reguladas del pH, anticuerpos de control. La etiqueta o inserto de paquete puede proporcionar una descripción de la composición también como instrucciones para el uso in vitro o de diagnóstico propuesto.
M. Usos para polipéptidos de TAT y ácidos nucleicos que codifican polipéptido de TAT Las secuencias de nucleótidos (o su complemento) que codifican polipéptidos de TAT tienen varias aplicaciones en la técnica de biología molecular, en los que se incluyen usos como sondas de hibridización, en mapeo de cromosomas y de genes y en a generación de sondas de ARN y ADN de antisentido. El ácido nucleico que codifica TAT también será usado para la preparación de polipéptidos de TAT mediante las técnicas recombinantes descritas en la presente, en donde aquellos polipéptidos de TAT pueden encontrar uso por ejemplo en la preparación de anticuerpos anti-TAT como se describe en la presente. El gen de TAT de secuencia natural de plena longitud o porciones del mismo pueden ser usados como sondas de hibridización para una biblioteca de cADN para aislar el cADN de TAT de plena longitud o para aislar todavía otros cADN (por euj emplo, aquellos que codifican variantes que se presentan de manera estable en la naturaleza de TAT o TAT de otras especies) que tienen una identidad de secuencia deseada con la secuencia de TAT natural revelada en la presente. Opcionalmente, la longitud de las sondas será aproximadamente de 20 a aproximadamente 50 bases. Las sondas de hibridizació pueden ser derivadas de por lo menos regiones parcialmente novedosas de la secuencia de nucleótidos natural de plena longitud en donde aquellas regiones pueden ser determinadas sin experimentación indebida o de secuencias genómicas que incluyen promotores, elementos mejoradores e intrones de TAT de secuencia natural. Como ejemplo, un método de selección comprenderá aislar la región de codificación del gen de TAT utilizando las secuencia de ADN conocidas para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de himbridización pueden ser marcadas mediante una variedad de etiquetas, en las que se incluyen radionucleótidos tales 'como 32P o 35S o etiquetas enzimáticas tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda vía sistemas de acoplamiento de avidina/biotina . Las sondas marcadas que tienen una secuencia complementaria con aquella del gen de TAT de la presente invención pueden ser usadas para seleccionar bibliotecas de cADN humano, ADN o mARN genómicos para deteminar a cuales miembros de tales bibliotecas las sondas se hibridiza. Técnicas de hibridización son descritas en detalle adicional en los Ejemplos a continuación. Cualesquier secuencias EST reveladas en la presente solicitud pueden ser usadas similarmente como sondas, utilizando los métodos revelados en la presente. Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos que codifican TAT incluyen oligonicleótidos antisentido o sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico de una sola hebra (ya sea ARN o ADN) capaz de enlazarse al mARN de TAT objetivo (sentido) o secuencias de ADN de TAT (antisentido). Oligonucleótidos antisentido o sentido, de acuerdo con la presente invención, comprenden un fragmento de la región de codificación del ADN de TAT. Tal fragmento comprende en general por lo menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente de alrededor de 14 a 30 nucleótidos. La capacidad para derivar un oligonucleótido antisentido o sentido, en base a una secuencia de cADN que codifica na proteína dada es descrita por ejemplo en Stein y Cohén (Cáncer Res. 48:2659, 1988) y van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988). El enlace de oligonucleótidos antisentido o sentido a secuencias de ácido nucleico objetivo da como resultado la formación de dúplex que bloquean la transfucción o traducción de la secuencia objetivo mediante uno de varios medios, en los que se incluyen degradación mejorada de los dúplex, terminación prematura de transducción o traducción o por otroa medios. Tales métodos son abarcados por la presente invención. Así, los oligonuicleótidos antisentiso pueden ser usados para bloquear la expresión de proteína TAT, en donde aquellas proteínas de TAT pueden jugar un papel en la inducción de cáncer en mamíferos . Los oligonucleótidos antisentido o sentido comprenden además oligonucleótidos que tienen cadenas fundamentales de azúcar-fosfodiéster modificadas (u otros enlaces de azúcar, tales como aquellos descritos en WO 91/06629) y en donde tales enlaces de azúcar son resistentes a endoncucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces de azúcar resistentes son estables in vivo capaces de resistir la degradación enzimática) pero retienen la especificidad de secuencia para ser aptos para enlazarse a secuencaias de nucleótido objetivo. Los sitos intragénicos preferidos para el enlace antisentido incluyen la región que incorpora el codón de inicio/partida de traducción (5'-AUG / 5'-ATG) o codón de terminación/parada 5'-UAA, 5 ' -UAG and 5-UGA / 5'-TAA, 5 ' -TAG and 5' -TGA) y el cuadro de lectura abierto (ORF) del gen. Estas regiones se refieren a una porcuión de rnARN o gen que abarca de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos ya sea en una dirección u otra (es to es, 5' ó 3' ) de un codón de inicio o terminación de traducción. Otras regiones preferidas para el enlace antisentido incluyen: intrones; exones; uniones intrón-exón; el cuadro de lectura abierto (ORF) o "región de codificación", que es la región entre el codón de inicio de traducción y el codón de terminación de traducción; la tapa 5' de un mARN que comprende un residuo de guanosina N7-metilado unido al residuo 5' -más del ARN vía un enlace de 5' -5' -trifosfato e incluye la estructura de etapa 5' por sí misma y también como los primeros 50 nucleótidos adyacentes a la tapa; la región sin traducir 5' (5'UTR), la porción de un mARN en la dirección 5' del codón de inicio de traducción y así incluye n nucleótidos entre el sitio de etapa 2' y el codon de inicio de traducción de un mARN o nucleótidos correspondientes en wl gen y laregión sin traducir 3' , la porción de un mARN en la dirección 3' del codon de terminación de traducción y así incluyen nucleótidos entre el codon de terminaciómn de transducción y extremo 3' de un mARN o nucleótidos correspondientes sobre elgen. Ejemplos específicos de compuestos antisentido preferidos útiles para inhibir la expresión de proteínas de TAT incluyen oligonucleótidos que contienen cadenas fundamentales modificadas o enlaces de internucleósido no naturales. Los olignucleótidos que tienen cadenas fundamentales modificadas incluyen aquellas que retienen un átomo de fósforo en la cadena fundamental y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la cadena fundamental. Para los propósitos de esta especificación y como algunas veces se hace referencia en la técnica, los polinucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su cadena fundamental de internucleósidos pueden ser considerados como oligonucleósidos . Cadenas fundamentales de oligonucleótidos modificadas preferidas incluyen, por ejemplo fosforotioato, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotri-ésteres, metil y otros alquilfosfonatos que incluyen 3' -alquilenfosfonatos, 5' -alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos y los que se incluyen 3' -aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, serenofosfatos y borano-fosfatos que tienen 3' -5' enlaces normales, 2 ' -5' enlazados análogos de éstos y aquellos que tienen polaridad invertida en donde uno o más enlaces de internucleótido es un enlace 3' a 3' , 5' a 5' ó 2' a 2' . Oligonucleótidos preferidos que tienen polaridad invertida comprenden un solo enlace 3' a 30 en el enlace de internucleótido más 3' , esto es un solo residuo de nucleósido invertido que puede ser abásico (falta la nucleobase o tiene un grupo hidroxilo en lugar de la misma) . Varias sales, sales mezcladas y formas de ácido libre son también incluidos . Patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de enlaces que contienen fósforo incluyen pero no están limitadas a: patentes estadounidenses Nos. 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 y 5,625,050, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia. Cadenas fundamentales de oligonucleótidos modificadas preferidas que no incluyen un átomo de fósforo en las mismas tienen cadenas fundamentales que son formadas mediante enlaces de internucleósido de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces de heteroátomo e internucleósido de alquilo o cicloalquilo mezclados o uno o más enlaces de internucleósido heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces de morfolino (formado en parte de la porción de azúcar de un nucleósido) ; cadenas fundamentales de siloxano; cadenas fundamentales de sulfuro, sulfóxido y sulfota; cadenas fundamentales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas fundamentales de metilen-formacetilo y tio-formacetilo; cadenas fundamentales de riboacetilo; cadenas fundamentales que contienen alqueno; cadenas fundamentales de sulfamato; cadenas fundamentales de mutilen-imino y metilenhidrazino; cadenas fundamentales de sulfonato y sulfonamida; cadenas fundamentales de amida y otras que tienen partes componentes de N, O, S y CH.sub.2 mezcladas. Patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales oligonucleósidos incluyen, pero no están limitadas a patentes estadounidenses Nos. 5,034,506; 5,166,315 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608 5,646,269 y 5,677,439, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia. En otros oligonucléotidos antisentido preferidos, tanto el enlace de azúcar como el enlace de internucleósido, esto es, la cadena fundamental, de las unidades de nucleótido son reemplazados con nuevos grupos. Las unidades base son mantenidas para hibridización con un compuesto objetivo de ácido nucleico apropiado. Uno de tales compuestos oligómeros, un oligonucleótido mimético que ha demostrado tener excelentes propiedades de hibridización, es denominado como ácido nucleico de péptido (PNA) . En compuestos de PNA, la cadena fundamental de azúcar de un oligonucléotido es reemplazada con una cadena fundamental que contiene amida, en particular una cadena fundamental de aminoetilglicina. Las nucleobases son retenidas y son enlazadas directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción de amida de la cadena fundamental. Patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de compuestos de PNA incluyen, pero no están limitadas a, patentes estadounidenses Nos.: 5,539,082; 5,714,331 y 5,719,262, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia. Enseñanzas adicionales de compuestos de PNA se pueden encontrar en Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500. Los oligonucleótidos antisentido preferidos incorporan cadenas fundamentales de fosforotioato y/o cadenas fundamentales de heteroátomo y en particular -CH2-NH-0-CH2-, -CH2-N (CH3) -0-CH2- [conocido como metileno (metilimino) o cadena fundamental de MMI] , -CH2-0-N (CH3) -CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- y -O-N (CH3) -CH2-CH2- [en donde la cadena fundamental de fosfodiéster natural es representada como -0-P-0-CH2-] descrita en la patente estadounidense No. 5,489,677 a la que se hace referencia anteriormente y las cadenas fundamentales de amida de la patente estadounidense No. 5,602,240 a la que se hace referencia anteriormente. También preferidos son los oligonucleótidos antisentido que tiene estructuras de cadena fundamental de morfolino de la patente estadounidense No. 5,034,506 a la que se hace referencia anteriormente. Oligonucleótidos modificados pueden también contener una o más porciones de azúcar sustituidas. Oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en posición 2' : OH; F; O-alquilo, S-alquilo o N-alquilo; O-alquenilo, S-alquenilo o N-alquenilo; O-alquinilo, S-alquinilo o N-alquinilo o O-alquil-O-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser Ci a Cío alquilo o C2 a Cío alquenilo y alquinilo sustituidos o sin sustituir. Particularmente preferidos son O [ (CH2) nO]mCH3, 0(CH2)nOCH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)nONH2 y O (CH2) nON [ (CH2) nCH3) ] 2, en donde n y m son de aproximadamente 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos antisentido preferidos comprenden uno de los siguientes en posición 2' : Ci a Cío alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, S02 CH3, ON02, N02, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo reportero, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2' -metoxietoxi (2 '-0-CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-0-(2-metoxietil) o 2'-M0E) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) esto es, un grupo alcoxialcoxi . Una modificación preferida adicional incluye 2'-dimetilaminooxietoxi, esto es, un grupo O (CH2) 2ON (CH3) 2 también conocido como 2'-DMAOE, como se describe en los ejemplos posteriormente en la presente y 2' -dimetilamino-etoxietoxi (también conocido en el arte como 2'-0-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), esto es 2'-0-CH2-0-CH2-N(CH2) . Una modificación preferida adicional incluye ácidos nucleicos bloqueados (LNA) en los cuales el grupo 2'-hidroxilo está enlazado al átomo de carbono 3' o 4' del anillo de azúcar, formando mediante esto una porción de azúcar bicíclica. El enlace es preferiblemente un grupo metileno (-CH2-)n que une el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4', en donde n es 1 o 2. LNA y preparación de los mismos se describen en WO 98/39352 y WO 99/14226. Otras modificaciones preferidas incluyen 2' -metoxi (2'-0-CH3), 2'-aminopropoxi (2 ' -OCH2CH2CH2 NH2) , 2 '-alilo (2'-CH2-CH=CH2) , 2'-0-alilo (2 ' -0-CH2-CH=CH2) y 2 '-fluoro (2'-F). La modificación 2' puede estar en la posición arabino (hacia arriba) o ribo (hacia abajo). Una modificación 2'- arabino preferida es 2'-F. Modificaciones similares pueden también ser elaboradas en otras posiciones sobre el oligonucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar sobe el nucleótido 3' terminal o en oligonucleótidos 2' -5' enlazados y la posición 5' del nucleótido 5' terminal. Los oligonucleótidos pueden también tener miméticos de azúcar tales como porciones de ciclobutilo en lugar del azúcar de pentofuranosilo. Patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales azúcares modificados incluyen, pero no están limitadas a: patentes estadounidenses Nos. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; y 5,700,920, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia. Los oligonucleótidos pueden también incluir modificaciones o sustituciones de nucleobase (frecuentemente denominadas en el arte simplemente como "base") . Como se usa en la presente, las nucleobases "sin modificar" o "naturales" incluyen las base de purina adenina (A) y guanina (G) y las bases de pirimidina timina (T) , citosina (C) y uracilo (U) . las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C) , 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros alquil derivados de adenina y guanina, 2-propilo y otros alquil derivados de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinilo (~C=C-CH3 o -CH2-C=CH) uracilo y citosina y otros alquinil derivados de bases de pirimidina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo) , 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Nucleobases modificadas adicionales incluyen pirimidinas tricíclicas tales como fenoxazina histidina (lH-pirimido [5, 4-b] [1, 4]benzoxazin-2(3H)ona, fenotiazina, histidina (lH-pirimido [5, 4-b] [1, 4]benzotiazin-2 (3H) ona, abrazaderas G tales como una histidina fenoxazina sustituida (por ejemplo 9- (2-aminoetoxi) -H-pirimido [5, 4-b] [1, 4]benzoxazin-2 (3H) ona, carbazol histidina (2H-pirimido [4, 5-b] indol-2-ona) , piridoindol histidina (H-pirido [3' , 2' : 4, 5]pirrolo [2, 3-d]pirimidin-2-ona) . Nucleobases modificadas pueden también incluir aquellas en las cuales la base de purina o pirimidina es reemplazada con otros heterociclos, por ejemplo 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Nucleobases adicionales incluyen aquellas reveladas en la patente estadounidense No. 3,687,808, aquellas reveladas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990 y aquellas reveladas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613. Ciertas de estas nucleobases son particularmente útiles para incrementar la afinidad de enlace de los compuestos oligoméricos de la invención. estos incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, en las que se incluyen 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina incrementan la estabilidad dúplex de ácido nucleico por un grado de 0.6 - 1.2. C. ( (Sanghvi et al, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, pp . 276-278) y son sustituciones base preferidas, aún más particularmente cuando son combinadas con modificaciones de azúcar 2' -O-metoxietilo. Patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de nucleobases modificadas incluyen, pero no están limitadas a, patentes norteamericanas Nos. 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 5,681,941 y 5,750,692, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia. Otras modificaciones de oligonucleotidos antisentido que enlazan químicamente al oligonucleotido una o más porciones o conjugados que mejoran la actividad, distribución celular o absorción celular del oligonucleotido. Los compuestos de la invención pueden incluir grupos conjugados enlazados covalentemente a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Grupos conjugados de la invención incluyen intercaladotes, moléculas reportero, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, poliéteres, grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas de oligómeros y grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas de oligómeros y grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas de oligómeros. Grupos conjugados típicos incluyen colesteroles, lípidos, lípidos catiónicos, fosfolípidos, fosfolípidos catiónicos, bitoina, fenazina, foliado, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y tintes.
Grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas en el contexto de esta invención incluyen grupos que mejoran la absorción de oligómero, mejoran la resistencia del oligómero a la degradación y/o refuerzan la hibridización específica de secuencia con ARN. Grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas en el contexto de esta invención incluyen grupos que mejoran la absorción del oligómero, distribución, medtabolismo o excreción. Las porciones de conjugado incluyen pero no están limitadas a porciones de lípido tales como una porción de colesterol (Letsinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucí. Acids Res., 1992, 20, 533-538) , una cadena alifática, por ejemplo residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J. , 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1, 2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietil amonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucí. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido amamantan-acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), una porción de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237) o una porción de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol. Oligonucleótidos de la invención pueden también ser conjugados a sustancias de fármaco activas, por ejemplo aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, cetopreno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triyodobenzoico, ácido flufenámico, ácido polínico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometacina, un barbiturato, una cefalosporina, un fármaco sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico. Conjugados de oligonucleotido-fármaco y su preparación son descritos en la solicitud de patente estadounidense No. de serie 09/334,130 (presentada el 15 de junio de 1999) y patentes estadounidenses Nos. 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 y 5,688,941, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia. No es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado sean modificadas uniformemente y en efecto más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente pueden ser incorporadas a un solo compuesto o aún un solo nucleótido dentro de un oligonucleótido. La presente invención también incluye compuestos antisentido que son compuestos quiméricos. Compuestos antisentido "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de esta invención, son compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos que contienen dos o mas regiones químicamente distintas, cada una compuesta de por lo menos una unidad monomerica, esto es, un nucleótido en el caso de un compuesto de oligonucleótidos estos oligonucleótidos contienen comúnmente por lo menos una región en donde el oligonucleótidos esta modificado para conferir al oligonucleótido resistencia incrementada a la degradación por nucleasa, absorción celular incrementada y/o afinidad enlace incrementada para el ácido nucleico objetivo. Una región adicional del oligonucleótido puede servir como sustrato para encinas capaces decisión de híbridos de ARN: ADN o ARN:ARN. Como ejemplo, RNase H es una endonucleasa cellular que escinde la hebra RNA de un dúplex ARN:ADN. Por consiguiente, la activación de RNase H, da como resultado la escisión de el objetivo ARN, mejorando mediante esto la extensamente la eficiencia de inhibición de oligonucleótido de expresión genética. Consecuentemente, resultados comparables pueden frecuentemente ser obtenidos con oligonucleótidos mas cortos cuando se usan oligonucleótidos quiméricos, en comparación con fósforo tioato dixoxi oligonucleótidos que se hibridizan a la misma región objetivo. Los compuestos antisentido quiméricos de la invención pueden ser formados como estructuras compuestas de dos o mas oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleótidos y/o miméticos de oligonucleótido como se describe anteriormente. Oligonucleótidos antisentido quiméricos preferidos se incorporan por lo menos un azúcar 2' modificado (preferiblemente 2 ' -O- (CH2) 2-0-CH3) en la terminal 3' para conferir resistencia de nuecleasa y una región con por lo menos 4 azucares 2 ' -H continuos para conferir actividad RNase H. Tales compuestos también han sido denominados en la técnica como híbridos o gapmeros. Los gapmeros preferidos tienen una región de azucares 2' (preferiblemente 2'-0-(CH2)2-0-CH3) en la terminal 3 'y en la terminal 5' separados por al menos una región que tiene por lo menos 4 azucares 2'-H e incorporan preferiblemente enlaces de cadena fundamental de fósforo tioato Patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales estructuras que enseñan la preparación de tales estructuras híbridas incluyen pero no están limitadas a patentes estadounidenses Nos. 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; y 5,700,922, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Los compuestos antisentido - usado de acuerdo con esta invención pueden ser fabricados conveniente y sistemáticamente por medio de la técnica bien conocida de síntesis en fase sólida. El equipo para tales síntesis es vendido por varios vendedores en los que se incluyen por ejemplo (Foster City, Calif.). cualesquier otros medios para tales síntesis conocidos en la técnica pueden ser usados adicional alternativamente. Es bien conocido utilizar técnicas similares para preparar oligonucleótidos tales como fósforo tioatos y derivados alquilados. Los compuestos de la invención pueden también ser mezclados, encapsulados, conjugados o asociados de otra manera con otras moléculas, estructuras de moléculas o mezclas de compuestos, tal como por ejemplo liposomas, moléculas receptor apuntadas, formulaciones orales, rectales tópicas o otras formulaciones, para ayudar en la absorción, distribución y/o absorción. Patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales formulaciones que ayudan en la absorción, distribución y/o incluyen pero no están limitadas a patentes estadounidenses Nos. 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; o 5,595,756, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia. Otros ejemplos de oligonucleótidos de sentido o antisentido incluyen aquellos oligonucleótidos que están enlazados covalentemente a porciones orgánicas, tales como aquellos descritos en WO 90/10048 y otras porciones que incrementan la afinidad del oligonucleótido por una secuencia de ácido nucleico objetivo, tal como poli (L-lisina) . Todavía además, agentes de intercalación tales como elipticina y agentes alquilintes o complejo de metal pueden ser anexados a oligonucleótidos de sentido o antisentido para modificar especificidades de enlace del oligonucleótido antisentido o sentido por la secuencia de nucleótidos objetivo. Oligonucleótidos antisentido o sentido pueden ser introducidos a una célula que contienen la secuencia de ácido nucleico objetivo mediante cualquier método de transferencia de genes en los que se incluyen, como por ejemplo transfección de ADN moderada por CaP04_ electroporación o al utilizar vectores de transferencia genética tales como virus Epstein-Barr . En un procedimiento preferido, un oligonucleótido antisentido o sentido es insertado a un vector retroviral apropiado. Una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo se pone en contacto con el vector retroviral recombinante, ya sea in vivo o ex vivo. Vectores retrovirales apropiados incluyen, pero no están limitados a, aquellos derivados del retrovirus murino (un retrovirus derivado de M-MuLV) o los vectores de copia doble designados DCT5A, DCT5B y DCT5C (veáse WO 90/13641) . Oligonucleótidos de sentido o antisentido también pueden ser introducidos a una célula que contiene la secuencia de nucleótidos objetivo mediante formación de un conjugado con una molécula de enlace de ligado, como se describe en WO 91/04753. moléculas de enlace de ligado apropiadas incluyen pero no están limitadas a, receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citocinas u otros ligandos que se enlazan a relectores de superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula de enlace de ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula de enlace del ligando para enlazarse a su molécula o receptor correspondiente o bloquear la entrada del oligonucleótido de sentido o antisentido o su versión conjugada a la célula. Alternativamente, un oligonucleótido de sentido o antisentido puede ser introducido a una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo mediante formación de oligonucleótido-líquido, como se describe en WO 90/10448. El complejo de oligonucleótido-líquido de sentido o antisentido es preferiblemente disasociado dentro de la célula mediante una lipasa endógena. Moléculas de ARN o ADN antisentido o sentido son en general de por lo menos aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, o 1000 nucleótidos de longitud, en donde el este contexto el término "aproximadamente" significa la longitud de secuencia de nucleótidos a la que se hace referencia mas o menos 10% de aquella longitud a la que se hace referencia. Las sondas pueden también ser empleadas en técnicas de PCR para generar un cúmulo de secuencias para identificación de secuencias de codificación de TAT estrechamente relacionadas. Las secuencias de nucleótidos que codifican un TAT pueden también ser usadas para construir sondas de hibridización para mapear el gen que codifica aquel TAT y para el análisis genético de individuos con alteraciones genéticas. Las secuencias de nucleótidos provistas en la presente pueden ser mapeadas a un cromosoma y regiones especificas de un cromosoma y utilizando técnicas conocidas, tales como hibridización in situ, análisis de enlace contra marcadores cromosomales conocidos y selección de hibidización con bibliotecas . Cuando las secuencias de codificación TAT codifican una proteína que se enlaza otra proteína, (por ejemplo en donde el TAT es un receptor) , el TAT puede ser usado en análisis para identificar las otras proteínas o moléculas involucradas en la interacción de enlace. Mediante tales métodos, se pueden identificas inhibidores de la interacción de enlace receptor/ligando. Las proteínas involucradas en tales interacciones de enlace pueden también ser usadas para seleccionar en cuanto a inhibidores de péptidos o molécula pequeña o agonistas de la interacción de enlace. También, el receptor TAT puede ser usado para aislar ligando (s) correlativo (s) . Análisis de selección pueden ser diseñados para encontrar compuestos de plomo que imitan la actividad biológica de un TAT natural o un receptor por TAT. Tales análisis de selección incluirán análisis propensos de selección de alto rendimiento de bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente asociados para identificar candidatos de fármaco de moléculas pequeñas. Las moléculas pequeñas contempladas incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los análisis se pueden llevar a cabo en una variedad de formatos, en los que se incluyen análisis de enlace de proteína-proteína, análisis de selección bioquímicos, inmunoanálisis y análisis a base de células, que están bien caracterizados en la técnica. Ácidos nucleicos que codifican TAT o sus formas modificadas pueden también ser usadas para generar ya sea animales transgénicos o animales "noqueados" que a su vez son útiles en el desarrollo y selección de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo un ratón o rata) es un animal que tiene células que contienen un transgen, tal transgen fue introducido al animal o un ancestro del animal en una etapa prenatal, por ejemplo una etapa embriónica. Un transgen es un ADN que es integrado al genoma de una célula de la cual un animal transgénico se desarrolla. En una modalidad, cADN que codifica TAT puede ser usado para clonar ADN genomico que codifica TAT de acuerdo con técnicas establecidas y las secuencias genómicas usadas para generar animales transgénicos que contienen que expresan ADN que codifica TAT. Métodos para generar animales transgénicos, particularmente animales, tales como ratones o ratas, se han vuelto convencionales en la técnica y se describe por ejemplo en las patentes estadounidenses Nos. 4,736,866 y 4,870,009. comúnmente, las células particulares serían apuntadas para la incorporación transgenetica de TAT con mejoradotes específicos del tejido. Animales transgenicos que incluyen una copia de un transgen que codifica TAT introducido a la línea de geneación del animal en una etapa embrionica pueden ser usados para examinar el efecto de expresión incrementada de ADN que codifica TAT. Tales animales pueden ser usados como animales de prueba para reactivos que se piensa que confiere protección de por ejemplo condiciones patológicas asociadas con su sobre expresión. De acuerdo con esta faceta de la invención, un animal es tratado con el reactivo y una incidencia reducida de la condición patológica, en comparación con los animales sin tratar que llevan el transgen indicaría una intervención terapéutica potencial para la condición patológica. Alternativamente homólogos no humanos de TAT pueden ser usados para construir un animal "noqueado" de TAT que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica TAT como resultado de una recombinación homologa entre el gen endógeno que codifica TAT y ADN genomico alterado que codifica TAT introducido a una línea de tallo embrionico del animal. Por ejemplo, cADN que codifica TAT puede ser usado para clonar AND genomico que codifica TAT de acuerdo con técnicas establecidas . Una porción de AND genomico que codifica TAT puede ser detectado o remplazado con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador selecionable que puede ser usado para verificar la integración. Comúnmente, varias kilobases de AND de flanqueo sin alterar (ambas en los 5' y 3') son incluidas en el vector [veáse, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homólogos] . El vector es introducido a una línea celular de tallo embrionico (por ejemplo, mediante electroporación) y las células en las cuales el ADN introducido se a recombinado homólogamente con el ADN endojeno son seleccionadas [veáse, Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. Luego las células seleccionadas son inyectadas a un blastofisto de un animal (por ejemplo un ratón o rata) para formar quimeras de agregación [véase por ejemplo, Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells : A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. Luego un embrión quimérico puede ser implantado a un animal de refuerzo hembra seudo preñado apropiado y el embrión traído a término para crear un animal "noqueado" . La cosecha de progenie del ADN recombinando homólogamente en sus líneas de geminación puede ser identificada mediante técnicas estándar y usada para crear animales en los cuales todas las células del animal contienen el ADN recombinado homólogamente. Los animales noqueados pueden ser fertilizados por ejemplo por su capacidad para defenderse, contra ciertas condiciones patológicas y por su desarrollo de condiciones patológicas debido al ausencia del polipéptido de TAT. Ácido nucleico que codifica los polipeptidos de TAT puede también ser usado en un bibliotetca genética. En aplicaciones de terapia genética, los genes son introducidos a las células con el fin de obtener síntesis invivo de un producto genético terapéuticamente efectivo, por ejemplo, para reemplazo de un gen defectuoso. La "terapia genética" incluye tanto terapias genética convencional en donde se obtiene un efecto duradero mediante un solo tratamiento y la administración de agentes terapéuticos genéticos, que involucra, la administración de una vez o repetidas de un ADN mARN terapéuticamente efectivo. ARN o ADN pueden ser usados como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes invivo. Ya - se a demostrado que los oligonucleótidos antisentido cortos pueden ser importados a células en donde actúan como inhibidores, a pesar de sus bajas consideraciones intrerasularse colocadas por su absorción restringida por la membrana celular. (Zamecnik et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]). Los oligonucleótidos pueden ser modificados para mejorar su absorción, al sustituir sus grupos fosfodiester cargados negativamente por grupos sin cargar. Hay una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos a células viables . Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico es transferido a células cultivadas in vitro o in vivo en las células del huésped propuesto. Técnicas apropiadas para la transferencia de ácido nucleico a células de mamíferos in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextran, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Las técnicas de transferencia genética in vivo actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales (comúnmente retrovirales) y transfección moderada por proteína-liposoma con recubrimiento viral. Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 [1993]). En algunas situaciones, es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que apunta a las células objetivo, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular o la célula objetivo, un ligando por un receptor sobre la célula objetivo, etc. En donde se emplean liposomas, las proteínas que se enlazan a una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis puede ser usada para apuntar y/o facilitar la absorción, por ejemplo proteínas de cápsido o fragmentos de las mismas trópicas para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que sufren internalización en la ciclización, proteínas que apuntan la localización intracelular y mejoran la vida media intracelular. La técnica de endocitosis moderada por receptor es descrita por ejemplo por Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); and Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990) . Para una revisión de la marcación genética y protocolos de terapia genética, véase Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992) . Las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de TAT o fragmentos de los mismos descritas en la presente son útiles para identificación de cromosomas. A este respecto, existe la necesidad en marcha de identificar nuevos marcadores de cromosomas, puesto que relativamente pocos reactivos de marcación de cromosomas, en base a los datos de secuencia actuales están disponibles en el presente. Cada molécula de ácido nucleico de TAT de la presente invención puede ser usada como marcador de cromosoma. Los polipéptidos de TAT y moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden también ser usados para la tipificación del tejido, en donde los polipéptidos de TAT de la presente invención pueden ser expresados diferencialmente en un tejido en comparación con otro, preferiblemente en un tejido enfermo, en comparación con un tejido normal del mismo tipo de tejido. Las moléculas de ácido nucleico de TAT encontrarán uso para generar sondas para PCR, análisis de Northern, análisis de Southern y análisis de Western. La invención abarca métodos de selección de compuestos para identificar aquellos que imitan el polipéptido de TAT (agonistas) o impiden el efecto del polipéptido de TAT (antagonistas) . Los análisis de selección en cuanto a candidatos de fármacos antagonistas están diseñados para identificar compuestos que se enlazan o acomplejan con los polipéptidos de TAT codificados por los genes identificados en la presente o de otra manera interfieren con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares, en los que se incluyen inhibir la expresión del polipéptido de TAT de las células. Tales análisis de selección incluirán análisis aptos de selección de alto rendimiento de bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente apropiados para identificar candidatos de fármaco de molécula pequeña. Los análisis pueden ser efectuados en una variedad de formatos, en los que se incluyen análisis de enlace proteína - proteína, análisis de selección bioquímicos, inmunoanálisis y análisis a base de célula, que están bien caracterizados en la técnica. Todos los análisis en cuanto a antagonistas son comunes en que requieren el contacto del candidato fármaco con un polipéptido de TAT por un ácido nucleico identificado en la presente bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interactúen. En análisis de enlace, la interacción es enlace y el complejo formado puede ser aislado o detectado en la mezcla de reacción. En una modalidad particular, el polipéptido de TAT codificado por el gen identificado en la presente o el candidato fármaco es inmovilizado sobre una fase sólida, por ejemplo una placa de microtitulación, mediante anexiones covalentes o no covalentes. La anexión no covalente se lleva a cabo en general al recubrir la superficie sólida con una solución del polipéptido de TAT y secado. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido de TAT a ser inmovilizado, puede ser usado para afianzarlo a una superficie sólida. El análisis se lleva a cabo al agregar el componente sin inmovilizar, el cual puede ser marcado por un marcador detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo la superficie recubierta que contiene el componente afianzado. Cuando la reacción está completa, los componentes sin reaccionar son separados, por ejemplo mediante lavado y los complejos afianzados sobre la superficie sólida son detectados. Cuando el componente originalmente sin afianzar porta una etiqueta detectable, la detección del marcador inmovilizado sobre la superficie indica que ocurrió el acomplej amiento. En donde el componente originalmente sin inmovilizar no porta un marcador, se puede detectar el acomplej amiento, por ejemplo, al usar un anticuerpo marcado que se enlaza específicamente al complejo inmovilizado . Si el compuesto candidato interactúa pero no se enlaza a un polipéptido de TAT particular codificado por un gen identificado en la presente, su interacción con aquel polipéptido puede ser analizada mediante métodos bien conocidos para la detección de interacciones proteína -proteína. Tales análisis incluyen procedimientos tradicionales tales como por ejemplo, reticulación, co-inmunoprecipitación y co-purificación a través de gradientes o columnas cromatográficas. Además, las interacciones proteína-proteína pueden ser verificadas usando un sistema genético a base de levadura descrito por Fields y colaboradores (Fields and Song, Nature (London) , 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991) ) como se revela por Chevray and Nathans, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991) . Muchos activadores transcripcionales, tales como GAL4 de levadura, consisten de dos dominios modulares físicamente discretos, uno que actúa como el dominio de enlace de ADN, el otro funciona como el dominio de transcripción-activación. El sistema de expresión de levadura descrito en las publicaciones anteriores . (denominado en general como el "sistema de dos híbridos") toma ventaja de esta propiedad y emplea dos proteínas híbridas, una en la cual la proteína objetivo está fusionada al dominio de enlace de ADN del GAL4 y otra en la cual las proteínas activadoras candidato son fusionadas al dominio de activación. La expresión de un gen reportero GALl-lacZ bajo el control de un promotor GAL4- activado depende de la reconstitución de la actividad GAL4 vía interacción de proteína-proteína. Las colonias que contienen polipéptidos de interacción son detectadas con un sustrato cromogénico para ß-galactosidasa. Un equipo completo (MATCHMAKER™) para identificar interacciones de proteína -proteína entre dos proteínas específicas utilizando la técnica de dos híbridos está disponible comercialmente de Clontech. Este sistema también puede ser extendido para mapear dominios de proteína involucrados en interacciones de proteína específicas, también como localizar residuos de aminoácido que son cruciales para estas interacciones. Los compuestos que interfieren con la interacción de un gen que codifica un polipéptido de TAT identificado en la presente y otros componentes intra- o extra-celulares pueden ser probados como sigue: usualmente se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto del gen y el componente intra- o extra-celular bajo condiciones y por un tiempo que permite la interacción y enlace de los dos productos. Para probar la capacidad de un compuesto candidato para inhibir el enlace, la reacción se pone en operación en ausencia y en presencia del compuesto de prueba. Además, un placebo puede ser agregado a una tercera mezcla de reacción, para servir como control positivo. El enlace (formación de complejo) entre el compuesto de prueba y el componente intra- o extra-celular presente en la mezcla es verificado como se describe anteriormente en la presente. La formación de un complejo en la(s) reacción (es) de control pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba interfiere con la interacción del compuesto de prueba y su socio de reacción. Para el análisis en cuanto a antagonistas, el polipéptido de TAT puede ser agregado a una célula junto con el compuesto a ser seleccionado en cuanto a una actividad particular y la capacidad del compuesto para inhibir la actividad de interés en presencia del polipéptido de TAT indica que el compuesto es un antagonista al polipéptido de TAT. Alternativamente, los antagonistas pueden ser detectados al combinar el polipéptido de TAT y un antagonista potencial con receptores de polipéptido de TAT enlazados a membrana o receptores recombinantes bajo condiciones apropiadas para un análisis de inhibición competitivo. El polipéptido de TAT puede ser marcado, tal como mediante radioactividad, de tal manera que el número de moléculas de polipéptido de TAT enlazadas al receptor puede ser usado para determinar la efectividad del antagonista potencial. El gen que codifica el receptor puede se identificado mediante numerosos métodos conocidos para aquellos experimentados en la técnica, por ejemplo, toma panorámica de ligando y clasificación de FACS. Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2) : Capítulo 5 (1991) . Preferiblemente, la clonación de expresión es usada, en donde el ARN poliadelinado es preparado a partir de una célula sensible al polipéptido de TAT y una biblioteca de cADN creada a partir de este ARN es dividida en cúmulos y usada para transfectar células de COS u otras células que no son sensibles al polipéptido de TAT. Las células transfectadas que son cultivadas sobre portaobjetos de vidrio son expuestas al polipéptido de TAT marcado. El polipéptido de TAT puede ser marcado mediante una variedad de medios en los que se incluyen yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína cinasa específica del sitio. Enseguida de la fijación e incubación, los portaobjetos son sometidos a análisis autoradiográficos . Las acumulaciones positivas son identificadas y se preparan sub-acumulaciones y son transfectadas usando una sub-acumulación interactiva y proceso de re-selección, produciendo inevitablemente un solo clon que codifica el receptor supuesto. Como procedimiento alternativo para la identificación del receptor, el polipéptido de TAT marcado puede ser enlazado por afinidad con preparaciones de membrana celular o extracto que expresan la molécula del receptor. El material reticulado es resuelto mediante PAGE y expuesto a película de rayos X. el complejo marcado que contiene el receptor puede ser extirpado, resuelto en fragmentos de péptido y sometido a micro-secuenciación de proteína. La secuencia de aminoácidos obtenida de la micro-secuenciación sería usada para diseñar un conjunto de sondas de oligonucleótidos degenerados para seleccionar una biblioteca de ADN para identificar el gen que codifica el receptor supuesto En otro análisis, en cuanto a antagonistas, células de mamífero o una preparación de membrana que expresa el receptor serían incubados con el polipéptido de TAT marcado en presencia del compuesto candidato. La capacidad de compuesto para mejorar o bloquear esta interacción podría luego ser medida. Ejemplos más específicos de antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que se enlaza a las fusiones de inmunoglobulina con polipéptido de TAT y en particular anticuerpos en los que se incluyen, sin limitación, anticuerpos poli- y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos anti-iodotípicos y versiones quiméricas o humanizadas de tales anticuerpos o fragmentos, también como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo. Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteína estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del polipéptido de TAT que reconoce el receptor pero no imparte un efecto, inhibiendo mediante esto competitivamente la acción del polipéptido de TAT. Otro antagonista de polipéptido de TAT potencial es un constructo de ARN ó ADN de antisentido preparado utilizando tecnológica de antisentido, por ejemplo, en donde una molécula de ARN ó ADN antisentido actúa para bloquear directamente la traducción de mARN al hibridar el mARN apuntado e impidiendo la traducción de proteína. La tecnología antisentido puede ser usada para controlar la expresión genética por medio de la formación de triple hélice o de ADN o ARN antisentido, ambos de tales métodos están basados en el enlace de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la porción de codificación 5' de la secuencia de polinucleótidos, que codifica los polipéptidos de TAT maduras, es usada para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Un oligonucleótido de ADN está diseñado para se complementario con una región del gen involucrado en la transcripción (triple hélice - véase Lee et al., Nucí. Acids Res. , 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), impidiendo mediante esto la transcripción y la producción del polipéptido de TAT. El oligonucleótido de ARN de antisentido se híbrida al mARN in vivo y bloquea la traducción de la molécula de mARN al polipéptido de TAT (antisense - Okano, Neurochem. , 56:560 (1991) ; Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Ratón, FL, 1988) . Los oligonucleótidos descritos anteriormente pueden también ser administrados a células, de tal manera que el ARN o ADN antisentido puede ser expresado in vivo para inhibir la producción del polipéptido de TAT. Cuando se usa ADN antisentido, los oligodesoxiribonucleótidos derivados del sitio de inicio de traducción, por ejemplo, entre aproximadamente -10 y +10 de las secuencia de nucleótido de gen objetivo son preferidos. Antagonistas potenciales incluyen moléculas pequeñas que se enlazan al sitio activo, el sitio de enlace del receptor o factor de crecimiento u otro sitio de enlace relevante del polipéptido de TAT, bloqueando mediante esto la actividad biológica normal del polipéptido de TAT. Ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no están limitadas a, péptidos pequeños o moléculas semejantes a péptido, preferiblemente péptidos solubles y compuestos orgánicos o inorgánicos sin peptidilo sintéticos. Los ribosomas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la escisión- específica de ARN. Los ribosomas actúan mediante hibridización específica de secuencia al ARN objetivo complementario, seguido por escisión endonucleótida . Sitios de escisión de ribosoma específico dentro de un objetivo de ARN potencial pueden ser identificados mediante técnicas conocidas. Para detalles adicionales, véase, por ejemplo, Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), y publicación PCT No. WO 97/33551 (publicada el 18 de septiembre de 1997) . Las moléculas de ácido nucleico en formación de triple hélice usadas para inhibir la transcripción deben ser desoxinucleótidos de una sola hebra y compuestos. La composición base de estos oligonucleótidos está diseñada de tal manera que promueven la formación de triple hélice vía reglas de apareamiento base de Hoogsteen que requieren en general estiramientos dimensionables de purinas y pirimidinas sobre una hebra de un dúplex. Para detalles adicionales, véase, por ejemplo, publicación de PCT No. WO 97/33551, supra . Estas moléculas pequeñas pueden ser identificadas mediante uno o más de los análisis de selección discutidos anteriormente en la presente y/o mediante cualquier otra técnica de selección bien conocida para aquellos experimentados en la técnica. El ácido nucleico que codifica polipéptido de TAT aislado puede ser usado en la presente para producir recombinantemente polipéptido de TAT utilizando técnicas bien conocidas en el arte y como se describe en la presente. A su vez, los péptido de TAT producidos pueden ser usados para generar anticuerpos anti-TAT utilizando técnicas bien conocidas en el arte y como se describe en la presente. Anticuerpos que se enlazan específicamente a un polipéptido de TAT identificado en la presente, también como otras moléculas identificadas por los análisis de selección revelados anteriormente en la presente, pueden ser administrados para el tratamiento de varias alteraciones, en los que se incluyen cáncer, en forma de composiciones farmacéuticas . Si el polipéptido de TAT es intracelular y se usan anticuerpos enteros como' inhibidores, los anticuerpos de internalización son preferidos. Sin embargo, se pueden usar lipofecciones o liposomas para entregar el anticuerpo o un fragmento de anticuerpo a las células. En donde se usan fragmentos de anticuerpo, el fragmento inhibidor más pequeño que se enlaza específicamente al dominio de enlace de la proteína objetivo es preferido. Por ejemplo, en base a las secuencias de región variable de un anticuerpo, las moléculas de péptido pueden ser diseñadas que retienen la capacidad de enlazar la secuencia de proteína objetivo. Tales péptidos pueden ser sintetizados químicamente y/o producidos mediante tecnología de ADN recombinante. Véase, por ejemplo, Marasco et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993). La formulación de la presente puede también contener más de un compuesto activo como sea necesario para indicación particular que es tratado. Preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente que mejora su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citocina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas están convenientemente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito planeado. Los siguientes ejemplos se ofrecen por propósitos ilustrativos solamente y no se proponen limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera. Todas las referencias de patentes y litera citadas en la presente especificación son incorporadas en la presente or referencia en su totalidad.
EJEMPLOS Los reactivos disponibles comercialmente a los que se hace referencia en los ejemplos se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante a no ser que se indique de otra manera. La fuente de aquellas células identificadas en los siguientes ejemplos y en toda la especificación, por los números de acceso de ATCC es el American Type Culture Collection, Manassas, VA.
EJEMPLO 1: Perfilación de expresión de tejido utilizando GeneExpress® Una base de datos patentada que contiene información de expresión genética (GeneExpress®, Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD) fue analizada en un intento por identificar polipéptidos (y sus ácidos nucleicos de codificación) cuya expresión es regulada de manera ascendente, significativamente en un (unos) tejido (s) de tumor particular de interés en comparación con otro(s) tumor (es) y/o tejidos normales. Específicamente, el análisis de la base de datos GeneExpress® se llevó a cabo utilizando ya sea los elementos de programación disponibles de Gene Logic, Inc.; Gaithersburg, MD, para uso con la base de datos GeneExpress® o con elementos de programación patentados escritos y desarrollados en Genentech, Inc., para uso con la base de datos GeneExpress®. La clasificación de aciertos positivos en el análisis está basado en varios criterios en los que se incluyen por ejemplo especificidad de tejido, especificidad de tumor y nivel de expresión en tejidos de proliferación esenciales normales y/o proliferantes normales. La siguientes es una lista de moléculas cuyo perfil de expresión de tejido como se determina de un análisis de la base de datos GeneExpress® pone en evidencia alta expresión del tejido y regulación ascendente significativa de expresión en un tumor o tumores específicos en comparación con otros tumor (es) y/o tejidos normales y opcionalmente expresión relativamente baja en tejidos esenciales normales y/o proliferantes normales. Como tal, las moléculas enlistadas a continuación son objetivos de polipéptido excelentes para la diagnosis y terapia de cáncer en mamíferos. Molécula regulación ascendente de expresión en: en comparación con: DNA62877 (TAT501) tumor de cerebro tejido de cerebro normal DNA62877 (TAT501) glioma tejido glial normal DNA279661 (TAT502) tumor de colon tejido de colon normal DNA279661 (TAT502) tumor de ovario tejido de ovario normal DNA279661 (TAT502) tumor pancreático tejido pancreático normal DNA279661 (TAT502) tumor de riñon tejido de riñon normal DNA279661 (TAT502) tumor de próstata tejido de próstata normal DNA279661 (TAT502) tumor uterino tejido uterino normal DNA66667 (TAT503) tumor de pecho tejido de pecho normal DNA66667 (TAT503) tumor de riñon tejido de riñon normal DNA66667 (TAT503) tumor de próstata tejido de próstata normal DNA66667 (TAT503) tumor endometrial tejido endometrial normal DNA66667 (TAT503) tumor de ovario tejido de ovario normal DNA66667 (TAT503) tumor de pulmón tejido de pulmón normal DNA66667 (TAT503) tumor pancreático tejido pancreático normal DNA347767 (TAT504) tumor de hueso tejido de hueso normal DNA347767 (TAT504) tumor de colon tejido de colon normal DNA347767 (TAT504) tumor de recto tejido de recto normal DNA347767 (TAT504) tumor de cabeza y cuello tejido de cuello y cabeza normal DNA347767 (TAT504) tumor de pecho tejido de pecho normal DNA347767 (TAT504) tumor de riñon tejido de riñon normal DNA347767 (TAT504) tumor de pulmón tejido de pulmón normal DNA347767 (TAT504) tumor de ovario tejido de ovario normal DNA347767 (TAT504) tumor pancreático tejido pancreático normal DNA347767 (TAT504) tumor de tejido suave ++++ tejido suave normal ++++ DNA347767 (TAT504) tumor de estómago tejido de estómago normal DNA347767 (TAT504) tumor de tracto urinario tejido de tracto urinario normal DNA347767 (TAT504) tumor uterino tejido uterino normal (tumores fibroides del miometrio) DNA347767 (TAT504) tumor de cerebro tejido de cerebro normal DNA48606 (TAT505) tumor de pecho tejido de pecho normal DNA48606 (TAT505) tumor de colon tejido de colon normal DNA48606 (TAT505) tumor de recto tejido de recto normal DNA48606 (TAT505) tumor de cabeza y cuello tejido de cabeza y cuello normal DNA48606 (TAT505) tumor de riñon tejido de riñon normal DNA48606 (TAT505) tumor de pulmón tejido de pulmón normal DNA48606 (TAT505) tumor pancreático tejido pancreático normal DNA48606 (TAT505) tumor de piel tejido de piel normal DNA48606 (TAT505) tumor de tejido suave tejido suave normal EJEMPLO 2 : Análisis de microarreglo para detectar la regulación ascendente de polipéptidos de TAT en tumores cancerosos Microarreglos de ácido nucleico, que contienen frecuentemente miles de secuencias genéticas, son útiles para identificar genes expresados diferencialmente en tejidos enfermos en comparación con sus contrapartes normales . Utilizando microarreglos de ácido nucleico, muestras de mARN de prueba y control de las muestras de tejido de prueba y control son transcritas inversamente y marcadas para generar sondas de cADN. Luego las sondas de cADN son hibridizadas a un arreglo de ácido nucleico inmovilizado sobre un soporte sólido. El arreglo es configurado de tal manera que la secuencia y posición de cada miembro del arreglo es conocida. Por ejemplo, una selección de genes que se sabe que son expresados en ciertos estados de enfermedad pueden ser arreglados en un soporte sólido. La hibridización de una sonda marcada con un elemento de arreglo particular indica que la muestra de la cual la sonda fue derivada expresa aquel gen. Si la señal de hibridización de una sonda de una muestra de prueba (tejido enfermo) es mayor que la señal de hibridización de una sonda de una muestra de control (tejido normal) el gen o genes sobreexpresados en el tejido enfermo son identificados. La implicación de este resultado es que una proteína sobreexpresada en un tejido enfermo es útil no solamente como marcador de diagnóstico en cuanto a la presencia de la condición enferma, sino también como objetivo terapéutico para el tratamiento de la condición enferma. La metodología de hibridización de ácidos nucleicos y tecnología de microarreglo es bien conocida en el arte. En un ejemplo, la preparación específica de ácidos nucleicos para hibridización y sondas, portaobjetos y condiciones de hibridización son todos detallados en la solicitud de patente PCT No. de Serie PCT/US01/10482, presentada el 30 de marzo de 2001, y que es incorporada en la presente por referencia. En el ejemplo presente, tumores cancerosos derivados de varios tejidos humanos fueron estudiados en cuando a expresión genética regulada ascendentemente en relación con tumores cancerosos de diferentes tipos de tejidos y/o tejidos humanos no cancerosos en un intento por identificar aquellos polipéptidos que son sobreexpresados en un (unos) tumor (es) canceroso (s) particular. En ciertos experimentos, el tejido de tumor humano canceroso y tejido de tumor humano no canceroso del mismo tipo de tejido (frecuentemente del mismo paciente) fueron obtenidos y analizados en cuanto a expresión de polipéptido de TAT.
Adicionalmente, tejido de tumor humano canceroso de cualquiera de una variedad de varios tumores humanos fue obtenido y comparado con una muestra de control epitelial "universal" que fue preparada al acumular tejidos humanos no cancerosos de origen epitelial, en los que se incluyen, hígado, riñon y pulmón. El mARN aislado de los tejidos acumulados representa una mezcla de productos genéticos expresados de estos diferentes tejidos. Experimentos de hibridización de microarreglo que utilizan las muestras de control acumuladas generaron una gráfica lineal en un análisis de 2 colores. La pendiente de la línea generada en un análisis de 2 colores fue luego usada para normalizar las proporciones de (detección de prueba: control) en cada experimento. Luego las proporciones normalizadas de varios experimentos fueron comparadas y utilizadas para identificar el agrupamiento de expresión genética. Así, la muestra de "control universal" acumulada, no solamente permitió determinaciones de expresión genética relativas efectivas en una composición simple de dos muestras, también permitió comparación de múltiples muestras a través de varios experimentos . En los experimentos presentes, sondas de ácido nucleico derivadas de las secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptido de TAT descritos en la presente se usaron en la creación del microarreglo y ARN a partir de varios tejidos de tumor fueron usados para la hibridización a los mismos. A continuación se muestran los resultados de estos experimentos, demostrando que varios polipéptidos de TAT de la presente invención son sobreexpresados significativamente en varios tejidos de tumor humanos en comparación con su(s) tejido (s) de contraparte normal (es). Además, todas las moléculas mostradas a continuación son sobreexpresadas significativamente en su(s) tejido(s) de tumor específico (s) en comparación con el control epitelial "universal". Como se describe anteriormente, estos datos demuestran que los polipéptidos de TAT de la presente invención son útiles no solamente como marcadores de diagnóstico en cuanto a la presencia de uno o más tumores cancerosos, sino también sirve como objetivos terapéuticos para el tratamiento de aquellos tumores. Molécula regulación ascendente de expresión en: en comparación con: DNA279661 (TAT502) tumor de colon tejido de colon normal DNA279661 (TAT502) tumor de ovario tejido de ovario normal DNA279661 (TAT502) tumor de recto tejido de recto normal DNA279661 (TAT502) tumor de pecho tejido de pecho normal DNA279661 (TAT502) tumor de pulmón tejido de pulmón normal EJEMPLO 3: Análisis cuantitativo de expresión de mARN de TAT En este análisis, un análisis de 5' nucleasa (por ejemplo, TaqMan®) y PCR cuantitativa en tiempo real (por ejemplo, ABI Prizm 7700 Sequence Detection System® (Perkin Elmer, Applied Biosystems División, Foster City, CA) ) , se usaron para encontrar genes que son sobreexpresados significativamente en un tumor o tumores cancerosos en comparación con otros tumores cancerosos o tejido no canceroso normal. La reacción de análisis de 5' nucleasa es una técnica a base de PCR fluorescente que hace uso de la actividad 5' exonucleasa de la enzima de polimerasa de ADN Taq para verificar la expresión genética en tiempo real. Dos cebadores de oligonucleótidos (cuyas secuencias están basadas en el gen o secuencia de EST de interés) son usados para generar un amplicon típico de una versión de PCR. Un tercer oligonucleótido o sonda, está diseñado para detectar la secuencia de nucleótidos localizada entre los dos cebadores de PCR. La sonda es no extensible por la enzima de polimerasa de ADN de Taq y es marcada con un tinte fluorescente reportero y un tinte fluorescente apagador. Una emisión inducida por láser del tinte reportero es apagada por el tinte de apagamiento cuando los dos tintes están localizados cercanos entre sí a medida que están en la sonda. Durante la reacción de amplificación de PCR, la enzima de polimerasa de ADN de Tag escinde la sonda en una manera dependiente de la plantilla. Los fragmentos de sonda resultantes se disocian en solución y la señal del tinte reportero liberado está libre del efecto de apagamiento del segundo fluoróforo. Una molécula de tinte reportero es liberada por cada nueva molécula sintetizada y la detección del tinte reportero sin apagar proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos. El procedimiento 5' nucleasa se pone en operación en un dispositivo de PCR cuantitativo en tiempo real tal como ABI Prism 7700TM. El sistema consiste de un dispositivo termociclador, láser, cámara de dispositivo de cargas-acoplada (CCD) y computadora. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 cavidades en un dispositivo termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por láser es recolectada en tiempo real por medio de cables de fibra óptica para todas las 96 cavidades y detectada en el CCD. El sistema incluye elementos de programación para poner en operación el instrumento y para analizar los datos. El material de partida para la selección fue mARN aislado de una variedad de tejidos cancerosos diferentes. El mARN es cuantificado de manera precisa, por ejemplo, fluorométricamente . Como control negativo, ARN fue aislado a partir de varios tejidos normales del tipo de tejido como los tejidos cancerosos que son probados.
Los datos de análisis de 5' nucleasa son expresados inicialmente como Ct, o el ciclo de umbral. Este es definido como el ciclo al cual la señal reportero se acumula por encima del nivel de fondo de fluorescencia. Los valores de ?Ct son usados como medición cuantitativa del número relativo de copias de partida de una secuencia objetivo particular en una muestra de ácido nucleico cuando se compara resultados de mARN de cáncer con resultados de mARN humanos normales. Ya que una unidad de Ct corresponde a un ciclo de PCR o aproximadamente un incremento relativo de 2 veces en relación con la normal, 2 unidades corresponden a un incremento relativo de 4 veces, 3 unidades corresponden a un incremento relativo de 8 veces y así sucesivamente, se puede medir cuantitativamente el incremento de veces relativo en expresión de mARN entre dos o más tejidos diferentes. Utilizando esta técnica, las moléculas enlistadas a continuación han sido identificadas por ser sobreexpresadas significativamente (esto es, por lo menos 2 veces) en un (unos) tumor (es) particular (es) en comparación con su(s) tejido (s) de contraparte no canceroso (s) normal (es) (ambos tanto como de los mismos como diferentes donadores de tejido) y así, representan objetivos de polipéptido excelentes para la diagnosis y terapia de cáncer en mamíferos. Molécula regulación ascendente de expresión en: en comparación con: DNA279661 (TAT502) tumor de ovarios tejido de ovarios normal DNA279661 (TAT502) tumor de colon tejido de colon normal DNA347767 (TAT504) tumor de pulmón tejido de pulmón normal EJEMPLO 4: Hibridización in situ La hibridización in situ es una técnica poderosa y versátil para la detección y localización de secuencias de ácido nucleico dentro de preparaciones de células o de tejido. Puede ser útil, por ejemplo para identificar sitios de expresión genética, analizar la distribución de tejido de transcripción, identificar y localizar la infección viral, seguir cambios en síntesis de mARN específicos y ayudar en el mapeo de cromosomas. La hibridización in situ se llevó a cabo siguiendo una versión optimizada del protocolo de Lu y Gillett, Cell Vision 1:169-176 (1994), utilizando ribosondas 33P-marcadas generadas por PCR. Brevemente, tejidos humanos embebidos con parafina, fijos con formalina fueron seccionados, desparafinizados, desproteinados en proteinasa K (20 g/ml) durante 15 minutos a 37 °C y procesados adicionalmente para la hibridización in situ como se describe por Lu y Gillett, supra . Una ribosonda antisentido [33-P] UTP-marcada fue generada a partir de un producto de PCR e hibridizada a 55 °C durante toda la noche. Los portaobjetos fueron sumergidos en emulsión de seguimiento nuclear Kodak NTB2 y expuestos durante 4 semanas .
Síntesis de 33P-ribosonda 6.0 µl (125 mCi) de 33P-ÜTP (Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol) fue secado al vacío a velocidad. A cada tubo que contiene 33P-UTP seco, los siguientes ingredientes fueron agregados : 2.0 µl 5x de solución reguladora de pH de transcripción 1.0 µl DTT (100 mM) 2.0 µl NTP mezcla (2.5 mM : 10 µ; cada uno de 10 mM GTP, CTP & ATP + 10 µl H20) 1.0 µl UTP (50 µM) 1.0 µl Rnasin 1.0 µl plantilla de ADN (lµg) 1.0 µl H20 1.0 µl RNA polimerasa (para productos de PCR T3 = AS, T7 = S, normalmente) Los tubos fueron incubados a 37 °C durante una hora. Se agrega 1.0 µl de RQl DNasa, seguido por incubación a 37 °C durante 15 minutos. Se agregan 90 µl TE (Tris 10 mM, pH 7.6/EDTA 1 mM, pH 8.0), y la mezcla fue pipeteada sobre papel DE81. La solución restante fue cargada en una unidad de ultrafiltración Microcon-50, y centrifugada utilizando el programa 10 (6 minutos) . La unidad de filtración fue invertida en un segundo tubo y centrifugado utilizando el programa 2 (3 minutos) . Después de la centrifugación de recuperación final, se agregan 100 µl de TE. 1 µl del producto final fue pipeteado sobre papel DE81 y contado en 6 ml de Bioflour II. La sonda fue puso en operación en un gel de TBE/urea. 1-3 µl de la sonda o 5 µl de RNA Mrk III fueron agregados a 3 µl de solución reguladora del pH de carga. Después de calentamiento en un bloque caliente a 95 °C durante tres minutos, la sonda fue colocada inmediatamente sobre hielo. Las cavidades de gel fueron lavadas, la muestra cargada y puesta en operación a 180-250 volts durante 45 minutos. El gel fue envuelto en envoltura de sarán y expuesto a película XAR con una pantalla de intensificación en congelación a -70 °C una hora a toda la noche. 33-P-Hibridización A. Pre-tratamiento de secciones congeladas Los portaobjetos fueron retirados del congelador, colocados sobre bandejas de aluminio y deshelados a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las bandejas fueron colocadas en incubador a 55 °C durante cinco minutos para reducir la condensación. Los portaobjetos se fijaron durante 10 minutos en paraformaldehído al 4% en hielo en la campana de humo, y lavados en 0.5 x SSC durante 5 minutos, a temperatura ambiente (25 ml 20 x SSC + 975 ml SQ H20) . Después de la desproteinización en 0.5 µg/ml de proteinasa K durante 10 minutos a 37°C (12.5 µl de 10 mg/ml solución reguladora del pH de ARNasa libre de ARNasa precalentada) , las secciones fueron lavadas en 0.5 x SSC durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones fueron deshidratadas en etanol al 70%, 95%, 100%, 2 minutos cada una.
B. Pre-tratamiento de secciones embebidas de parafina Los portaobjetos fueron desparafinizados, colocados en SQ H20, y enjuagados dos veces en 2 x SSC a temperatura ambiente, por 5 minutos cada vez. Las secciones fueron desproteinadas en 20 µg/ml proteinasa K (500 µl de 10 mg/ml en 250 ml solución reguladora del pH de ARNasa libre de ARNasa; 37 °C, 15 minutos) - embrión humano o 8 x proteinasa K (100 µl en 250 ml de solución reguladora del pH de ARNasa, 37°C, 30 minutos) - tejidos de formalina. El enjuague subsecuente en 0.5 x SSC y deshidratación se llevaron a cabo como se describe anteriormente.
C. Pre-hibridización Los portaobjetos fueron tendidos en una caja de plástico forrada con solución reguladora del pH Box (4 x SSC, 50% de formamida) - papel filtro saturado, D. Hibridización 1.0 x 106 cpm de sonda y 1.0 µl de tARN (solución concentrada 50 mg/ml) por portaobjetos fueron calentados a 95 °C durante 3 minutos. Los portaobjetos fueron enfriados sobre hielo y 48 µl de solución reguladora del pH de hibridización fueron agregados por portaobjetos. Después de someterse a vórtice, se agregaron 50 µl de 33P a 50 µl de pre-hibridización sobre el portaobjetos. Los portaobjetos fueron incubados durante toda la noche a 55 °C.
E. Lavados El lavado se hizo 2 x 10 minutos con 2xSSC, EDTA a temperatura ambiente (400 ml 20 x SSC + 16 ml 0.25 M EDTA, Vf=4L) , seguido por tratamiento con RNasaA a 37°C durante 30 minutos (500 µl de 10 mg/nl en 250 ml de solución reguladora del pH Rnasa = 20 µg/ml) . Los portaobjetos fueron lavados 2 x 10 minutos con 2 x SSC, EDTA a temperatura ambiente. Las condiciones de lavado severas fueron como sigue: 2 horas a 55°C, 0.1 x SSC, EDTA (20 ml 20 x SSC + 16 ml EDTA, Vf = 4L) .
F. Oligonucleótidos El análisis in situ se llevó a cabo en una variedad de secuencias de ADN reveladas en la presente. Los oligonucleótidos empleados para estos análisis fueron obtenidos para ser complementarios con los ácidos nucleicos (o los complementos de los mismos) como se muestra en las figuras adjuntas.
G. Resultados El análisis in situ se llevó a cabo en una variedad de secuencias de ADN reveladas en la presente. Los resultados de estos análisis son como sigue. (1) DNA279661 (TAT502) La expresión de intensidad moderada se ve en mucosa gastrointestinal. En el colon e intestino delgado la expresión aparece en todo el epitelio de forro. En el estómago, la expresión aparece concentrada en el epitelio foveolar, células principales y parietales son negativas. Una señal débil a moderada es detectada en dos núcleos de riñon, localiza a las células de la macula densa. La expresión es también observada en 11 de 15 carcinomas de ovarios (superficie epitelial y adenocarcinoma) y un caso de tumor de Brenner. La expresión es también vista en 6 de 8 adenocarcinomas uterinos, en los que se incluyen MMMT (Tumor Muelleriano mezclado maligno).. La expresión es también observada en mucosa bronquial normal, en donde el nivel de expresión fluctúa de muy débil a moderado. Una expresión fuerte es observada en 10 de 16 carcinomas de célula de pulmón pequeña. La expresión es también vista en los siguientes neoplasmas malignos: 19 de 19 adenocarcinomas colorrectales, 8 de 9 adenocarcinomas gástricos, 2 de 2 adenocarcinomas pancreáticos, 2 de 4 carcinomas esofagales y 11 de 11 adenocarcinomas metastáticos .
EJEMPLO 5: Verificación y análisis de expresión de polipéptido de TAT diferencial mediante GEPIS Los polipéptidos de TAT los cuales han sido identificados como antígeno de tumor como se describe en uno o más de los ejemplos anteriores fueron analizados y verificados como sigue. Una base de datos de ADN de etiqueta de secuencia expresada (EST) (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) fue investigada y secuencias EST interesantes fueron identificadas mediante GEPIS. La perfilación de expresión genética in silico (GEPIS) es una herramienta bioinformática desarrollada en Genentech, Inc. que caracteriza genes de interés en cuanto a nuevos objetivos terapéuticos de cáncer. GEPIS toma ventaja de grandes cantidades de secuencia de EST e información de biblioteca para determinar perfiles de expresión genética. GEPIS es capaz de determinar el perfil de expresión de un gen en base a su correlación proporcional con el número de sus presencias en bases de datos EST y trabaja al integrar la información de base de datos relacional LIFESEQ® EST e información patentada de Genentech de una manera severa y estadísticamente significativa. En este ejemplo se usa GEPIS para identificar y validar de manera cruzada nuevos antígenos de tumor, aunque el GEPIS puede ser configurado para llevar a cabo ya sea análisis muy específicos u objetivos de selección amplios. Para la selección inicial, se usa GEPIS para identificar secuencias de EST de la base de datos LIFESEQ® que correlacionan a la expresión en un tejido o tejidos particulares de interés (frecuentemente un tejido de tumor de interés) . Las secuencias de EST identificadas en esta selección inicial (o secuencias de consenso obtenidas al alinear múltiples secuencias de EST relacionadas y traslapantes obtenidas de la selección inicial) fueron luego sometidas a una selección diseñada para identificar la presencia de por lo menos un dominio de transmembrana en la proteína codificada. Finalmente, se usó GEPIS para generar un perfil de expresión de tejido completo para las varias secuencias de interés. Utilizando este tipo de bioinformática de selección, varios polipéptidos de TAT (y sus moléculas de ácido nucleico que codifica) fueron identificados al ser sobreexpresados significativamente en un tipo particular de cáncer o ciertos cánceres en comparación con otros cánceres y/o tejidos no cancerosos normales. La clasificación de los aciertos de GEPIS está basada en varios criterios en los que se incluyen, por ejemplo especificidad de tejido, especificidad de tumor y nivel de expresión en tejidos esenciales normales y/o proliferantes normales. La siguiente es una lista de moléculas cuyo perfil de expresión de tejido tal como se determina por GEPIS pone en evidencia alta expresión de tejido y regulación ascendente significativa de expresión en un tumor o tumores específicos en comparación con otro(s) tumor (es) y/o tejidos normales y opcionalmente relativamente baja expresión en tejidos esenciales normales y/o . proliferantes normales. Como tal, las moléculas enlistadas a continuación son excelentes objetivos de polipéptido para la diagnosis y terapia de cáncer en mamíferos . Molécula regulación ascendente de expresión en: en comparación con: DNA62877 (TAT501) tumor de cerebro tejido de cerebro normal DNA62877 (TAT501) glioma tejido glial normal DNA 279661 (TAT502) tumor de colon tejido de colon normal DNA279661 (TAT502) tumor de ovarios tejido de ovarios normal DNA279661 (TAT502) tumor pancreático tejido pancreático normal DNA279661 (TAT502) tumor de riñon tejido de riñon normal DNA279661 (TAT502) tumor de próstata tejido de próstata normal DNA279661 (TAT502) tumor uterino tejido uterino normal DNA66667 (TAT503) tumor de pecho tejido de pecho normal Molécula regulación ascendente de expresión en: en comparación con: DNA66667 (TAT503) tumor de riñon tejido de riñon normal DNA66667 (TAT503) tumor de próstata tejido de próstata normal DNA347767 (TAT504) tumor óseo tejido de hueso normal DNA347767 (TAT504) tumor de colon tejido de colon normal DNA347767 (TAT504) tumor de recto tejido de recto normal DNA347767 (TAT504) tumor de cabeza y cuello tejido de cabeza y cuello normal DNA347767 (TAT504) tumor de pecho tejido de pecho normal DNA347767 (TAT504) tumor de riñon tejido de riñon normal DNA347767 (TAT504) tumor de pulmón tejido de pulmón normal DNA347767 (TAT504) tumor de ovarios tejido de ovarios normal DNA347767 (TAT504) tumor pancreático tejido pancreático normal DNA347767 (TAT504) tumor de tejido suave tejido suave normal DNA347767 (TAT504) tumor de estómago tejido de estómago normal DNA347767 (TAT504) tumor del tracto urinario tejido del tracto urinario normal DNA347767 (TAT504) tumor uterino tejido uterino normal (tumores fibroides del miometrio) DNA347767 (TAT504) tumor de cerebro tejido de cerebro normal DNA48606 (TAT505) tumor de pecho tejido de pecho normal DNA48606 (TAT505) tumor de colon tejido de colon normal DNA48606 (TAT505) tumor de recto tejido de recto normal DNA48606 (TAT505) tumor de cabeza y cuello tejido de cabeza y cuello normal DNA48606 (TAT505) tumor de riñon tejido de riñon normal DNA48606 (TAT505) tumor de pulmón tejido de pulmón normal DNA48606 (TAT505) tumor pancreático tejido pancreático normal DNA48606 (TAT505) tumor de piel tejido de piel normal DNA48606 (TAT505) tumor de tejido suave tejido suave normal EJEMPLO 6: Uso de TAT como sonda de hibridización El siguiente método describe el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica TAT como sonda de hibridización, para por ejemplo, diagnosis de la presencia de un tumor en un mamífero. ADN que comprende la secuencia de codificación de TAT de plena longitud o maduro, como se revela en la presente puede también ser usado como sonda para seleccionar ADN homólogos (tales como aquellos que codifican variantes que se presentan de manera estable en la naturaleza de TAT) en bibliotecas de cADN de tejido humano o bibliotecas genómicas de tejido humano. La hibridización y lavado de filtros que contienen ya sea ADN de bibliotecas se lleva a cabo bajo las siguientes condiciones de alta severidad. La hibridización de sonda derivada de TAT radiomarcada a los filtros se lleva a cabo en una solución de formamida al 50%, 5x SSC, 0.1% SDS, pirofosfato de sodio al 0.1%, fosfato de sodio 50 mM, pH 6.8, solución de Denhardt 2x y sulfato de dextran al 10% a 42 °C durante 20 horas. El lavado de los filtros se lleva a cabo en una solución acuosa de O.lx SSC y SDS al 0.1% a 42°C.
Los ADN que tienen una identidad de secuencia deseada con el ADN que codifica TAT de secuencia natural de plena longitud pueden luego ser identificados utilizando técnicas estándar conocidas en el arte.
EJEMPLO 7: Expresión de TAT en E. coli Este ejemplo ilustra la preparación de una forma sin glicosilar de TAT mediante expresión recombinante en E. coli . La secuencia de ADN que codifica TAT es amplificada inicialmente utilizando cebadores de PCR selectos. Los cebadores deben contener sitios enzimáticos de restricción que corresponden a los sitios enzimáticos de restricción sobre el vector de expresión seleccionado. Una variedad de vectores de expresión pueden ser usados. Un ejemplo de un vector apropiado es pBR322 (derivado de E. coli; véase Bolívar et al., Gene, 2^:95 (1977)) que contiene genes para la resistencia a la ampicilina y tetraciclina. El vector es sometido a digestión con enzima de restricción y desfosforilado. Luego, las secuencias amplificadas de PCR son ligadas al vector. El vector incluirá preferiblemente secuencias que codifican para un gen de resistencia al antibiótico, un promotor trp, un líder polyhis (que incluye los primeros seis codones STII, secuencia de polyhis y sitio de escisión de enteroquinasa) , la región de codificación de TAT, el terminador de transcripción lambda y un gen argU. Luego la mezcla de ligación es usada para transformar una cepa E. coli seleccionada utilizando los métodos descritos en Sambrook et al., supra. Los transformantes son identificados por su capacidad de crecer sobre placas LB y luego colonias resistentes a antibióticos son seleccionadas. El ADN plásmido puede ser aislado y confirmado mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN. Los clones seleccionados pueden ser cultivados durante toda la noche en medio de cultivo líquido tal como caldo LB complementado con antibióticos. El cultivo de toda la noche puede ser usado subsecuente para inocular un cultivo a escala más grande. Luego las células son cultivadas una densidad óptica deseada, durante el cual el promotor de expresión es encendido. Después de cultivar las células por varias horas más, las células pueden ser cosechadas mediante centrifugación. La pelotilla celular obtenida por la centrifugación puede ser solubilizada utilizando varios agentes conocidos en la técnica y la proteína de TAT solubilizada puede luego ser purificada utilizando una columna de quelación de metal bajo condiciones que permiten un enlace fuerte de la proteína.
El TAT puede ser expresado en E. coli en forma poly-His, utilizando el siguiente procedimiento. El ADN que codifica TAT es amplificado inicialmente utilizando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores contendrán sitios de enzima de restricción que corresponden a los sitios de enzima de restricción sobre el vector de expresión seleccionado y otras secuencias útiles que proporcionan el inicio de la producción eficiente y confiable, purificación rápida en una columna de quelación de metal y remoción proteolítica con enteroquinasa. Luego, las secuencias poly-His marcada PCR-amplificada son luego ligadas a un vector de expresión que es usado para transformar un huésped E. coli a base de la cepa (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts (htpRts) clpP(lacIq). Los transformantes son primero cultivados en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina a 30 °C con agitación hasta que se alcanza una O.D.600 de 3-5. Luego los cultivos son diluidos 50-100 veces en medio CRAP (preparado al mezclar 3.57 g (NH4)2S04, 0.71 g de citrato de sodio -2H20, 1.07 g KCl, 5.36 g de extracto de levadura Difco, 5.36 g de Sheffield hycase SF en 500 L de agua, también como 110 mM MPOS, pH 7.3, 0.55% (peso/volumen) de glucosa y 7 mM MgS04) y cultivado por aproximadamente 20-30 horas a 30°C con agitación. Las muestras son separadas para verificar la expresión mediante análisis de SDS-PAGE y el cultivo global es centrifugado para convertir en pelotillas las células . Las pelotillas de células son congeladas hasta la purificación y re-pliegue. La pasta de E. coli de fermentaciones de 0.5 a 1 L (pelotillas de 6-10 g) es re-suspendida en 10 volúmenes (peso/volumen) en guanidina 7 M, Tris 20 mM, solución reguladora del pH 8. Se agrega sulfito de sodio sólido y tetrationato de sodio para hacer concentraciones finales de 0.1 M y 0.02 M, respectivamente, y la solución es agitada durante toda la noche a 4°C. Esta etapa da como resultado una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína bloqueados mediante sulfitolización. La escala es centrifugada a 40,000 rpm en una Ultracentrífuga Beckman durante 30 minutos. El sobrenadante es diluido con 3-5 volúmenes de solución reguladora del pH de columna de quelato de metal (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7.4) y filtrado a través de filtros de 0.22 mieras para clarificar. El extracto clarificado es cargado sobre una columna de quelato de metal Qiagen Ni-NTA de 5 ml equilibrada en la solución reguladora del pH de columna de quelato de metal. La columna es lavada con solución reguladora del pH adicional que contiene imidazol 50 mM ( (Calbiochem, Utrol grade), pH 7.4. La proteína es eluida con solución reguladora del pH que contiene imidazol 250 mM. Las fracciones que contienen la proteína deseada son acumuladas y almacenadas a 4°C. La concentración de proteína es estimada por su absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción calculado a base de su secuencia de aminoácidos . Las proteínas son re-plegadas mediante dilución de la muestra lentamente a solución reguladora del pH de repliegue recién preparada que consiste de. Tris 20 mM, pH 8.6, NaCl 0.3 M, urea 2.5 M, cisteína 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de re-pliegue son escogidos de tal manera que la concentración de proteína final es de entre 50-100 microgramos/ml . La solución de re-pliegue es agitada moderadamente a 4°C durante 12-36 horas. La reacción de repliegue es enfriada mediante la adición de TFA a una concentración final de 0.4% (pH de aproximadamente 3). Antes de la purificación adicional de la proteína, la solución es filtrada a través de un filtro de 0.22 mieras y se agrega acetonitrilo a una concentración final de 2 -10%. La proteína re-plegada es sometida a cromatografía en una columna de fase inversa Rl/H utilizando una solución reguladora del pH móvil de TFA a 0.1% con elución con un gradiente de acetonitrilo de 0 a 80%. Alícuotas de fracciones con absorbancia A 280 son analizadas sobre geles de poliacrilamida SDS y las fracciones que contienen la proteína replegada homogénea son acumuladas. En general, las especies replegadas apropiadamente de la mayoría de las proteínas son eluídas a las concentraciones más bajas de acetonitrilo puesto que aquellas especies son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos blindados de la interacción con la resina de fase inversa. Las especies agregadas son usualmente eluídas a concentraciones de acetonitrilo más altas. Además de resolver las formas plegadas equivocadamente de proteínas de la forma deseada, la etapa de fase inversa también elimina la endotoxina de las muestras . Las fracciones que contienen también el polipéptido de TAT plegado deseado son acumuladas y el acetonitrilo separado utilizando una corriente moderada de nitrógeno dirigida a la solución. Las proteínas son formuladas en HEPES 20 mM, pH 6.8 con cloruro de sodio 01.14 M y manitol al 4% mediante diálisis o mediante filtración del gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en la solución reguladora del pH de formulación y filtradas estérilmente. Ciertos de los polipéptidos TAT revelados en la presente han sido expresados exitosamente y purificados utilizando esta (s) técnica (s) .
EJEMPLO 8: Expresión TAT en células de mamífero Este ejemplo ilustra la preparación de una forma potencialmente glicosidada de TAT mediante expresión recombinante en células de mamífero. El vector, pRK5 (véase EP 307,247, publicado el 15 de marzo de 1989) , es usado como el vector de expresión. Opcionalmente, el ADN de TAT es ligado a pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción de ADN de TAT utilizando métodos de ligación tal como se describe en Sambrook et al., supra . El vector resultante es llamado pRK5-TAT.. En una modalidad, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Células 293 humanas (ATCC CCL 1573) son cultivadas a confluencia en placas de cultivo de tejidos en medios tales como DMEM complementado con suero de becerro fetal y opcionalmente, componentes nutrientes y/o antibióticos. Aproximadamente 10 µg de ADN de pRK5-TAT son mezclados con aproximadamente 1 µg de ADN que codifica el gen VA ARN [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] y disuelto en 500 µl de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0.1 mM, CaCl2. 0.227 M a esta mezcla se agregan, gota a gota 500 µl de 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaP04 y se permite que se forme un precipitado durante 10 minutos a 25 °C. el precipitado es suspendido y agregado a las células 293 y se permite que se asienten a aproximadamente 4 horas a 37 °C. el medo de cultivo es aspirado y 2 ml de glicerol al 20% en PBS son agregados durante 30 segundos. Luego las células 293 son lavadas con medio libre de suero, se agrega medio fresco y las células son incubadas durante aproximadamente 5 días. Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, el medio de cultivo es preparado y reemplazado con medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200 µCi/ml 35S-cisteína y 200 µCi/ml 35S-metionina. Después de una incubación de 12 horas, el medio acondicionado es recolectado, concentrado en un filtro de centrifugación y cargado sobre un gel de SDS al 15%. El gel procesado puede ser secado y expuesto a película por un período de tiempo seleccionado para revelar la presencia del polipéptido de TAT. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden sufrir incubación adicional (en medio libre de suero) y el medio es probado en bioanálisis seleccionados. En una técnica alternativa, se puede introducir TAT a las células 293 transitoriamente utilizando el método de sulfato de dextrán descrito por Somparyrac et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Células 293 son cultivadas a densidad máxima en un matraz de spinner y se agregan 700 µg de pRK5-TAT ADN. Las células son primero concentradas del matraz de spinner mediante centrifugación y lavadas con PBS. El precipitado de ADN-dextrán es incubado sobre la pelotilla de células durante 4 horas. Las células son tratadas con 20% de glicerol durante 90 segundos, lavadas con medio de cultivo de tejido y reintroducidas al matraz de spinner que contiene medio de cultivo de tejido, 5 mM /ml de insulina bovina y 0.1 µg/ml de transferrina bovina. Después de aproximadamente 4 días, los medios acondicionados son centrifugados y filtrados para separar las células y desechos. La muestra que contiene TAT expresado puede luego ser concentrada y purificada mediante cualquier método seleccionado, tal como diálisis y/o cromatografía en columna. En otra modalidad, TAT puede ser expresado en células CHO. El pRK5-TAT puede ser transfectado a células CHO utilizando reactivos conocidos tales como CaP04 o DEAE-dextrán. Como se describe anteriormente, los cultivos celulares pueden ser incubados y el medio reemplazado con medio de cultivo (solo) o medio que contiene una radioetiqueta tal como 35S-metionina . Después de determinar la presencia del polipéptido de TAT, el medio de cultivo puede ser reemplazado con medio libre de suero. Preferiblemente, los cultivos son incubados durante aproximadamente 6 días y luego el medio acondicionado es cosechado. El medio que contiene el TAT expresado puede luego ser concentrado y purificado mediante cualquier método seleccionado. El TAT epítopo -marcado puede también ser expresado en células CHO huéspedes. El . TAT puede ser subclonado del vector pRK5. el inserto del subclon puede sufrir PCR para fusionar el cuadro con una etiqueta de epítopo seleccionado tal como una etiqueta poli-his a un vector de expresión de baculovirus. Luego, el inserto de TAT poli-his marcado puede ser subclonado a un vector SV40 impulsado que contiene un marcador de selección tal como DHFR para selección de clones estables. Finalmente, las células CHO pueden ser transfectadas (como se describe anteriormente) con el vector SV40 impulsado. El etiquetado o marcación se puede efectuar, como se describe anteriormente, para verificar la expresión. Luego, el medio de cultivo que contiene el TAT poli-his marcado expresado puede ser concentrado y purificado mediante cualquier método seleccionado, tal como cromatografía de afinidad Ni2+-quelato. El TAT puede también ser expresado en células CHO y/o COS mediante un procedimiento de expresión transitorio o en células CHO mediante otro procedimiento de expresión estable . La expresión estable en células CHO se lleva a cabo utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas son expresadas como un constructo de IgG (inmunoadhesina) , en el cual las secuencias de codificación para las formas solubles (por ejemplo, dominios extracelulares) de las proteínas respectivas son fusionadas a una secuencia de región constante IgGl que contiene la articulación, dominios CH2 y CH2 y/o es una forma poli-His marcada. Enseguida de la amplificación en PCR, los ADN respectivos son subclonados a un vector de expresión CHO utilizando técnicas estándar como se describe en Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997) . Los vectores de expresión CHO son construidos para tener sitios de restricción compatibles 5' y 3' del ADN de interés para permitir el lanzamiento conveniente de cADN. El vector usado en la expresión de células CHO es como se describe en Lucas et al., Nucí . Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996) y utiliza el promotor/mej orador prematuro del SV40 para impulsar la expresión de cADN de interés y dihidrofoliato reductasa (DHFR) . La expresión de DHFR permite la selección en cuanto al mantenimiento estable del plásmido en seguida de la transfección. Doce microgramos del ADN del plásmido deseado son introducidos en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando reactivos de transfección disponibles comercialmente Superfect® (Quiagen) , Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim) . Las células son cultivadas como se describe en Lucas et al., supra. Aproximadamente 3 x 107 células son congeladas en una ampolleta para crecimiento adicional y producción como se describe posteriormente en la presente . Las ampolletas que contienen el ADN del plásmido son descongeladas mediante colocación en baños de agua y mezcladas mediante vórtice. El contenido es pipeteado a un tubo de centrífuga que contiene 10 ml de medio y centrifugado a 1,000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante es aspirado y las células son resuspendidas en 10 ml de medios selectivos (PS20 filtrado a 0.2 µm con 5% de suero fetal bovino diafiltrado en filtro de 0.2 µm) . Luego se toman alícuotas de las células a un matraz spinner de 100 ml que contiene 90 ml de medios selectivos. Después de 1-2 días, las células son transferidas a un matraz spinner de 250 ml lleno con 150 ml medio de cultivo selectivo e incubadas a 37 °C. Después de otros 2-3 días, matraces de spinner de 250 ml, 500 ml y 2,000 ml son sembrados con 3 x 105 células/ml. Los medios celulares son intercambiados con medios nuevos mediante centrifugación y resuspensión en medios de producción. Aunque cualquier medio de CHO apropiado puede ser usado, un medio de producción descrito en la Patente estadounidense No. 5,122,469, expedida el 16 de junio de 1992 puede realmente ser usado. Un matraz de spinner de producción de 3 litros es sembrado a 1.2 x 106 células/ml. En el día 0, el pH de número de células es determinado. En el día 1, el matraz de spinner es muestreado y se comienza el burbujeo con aire filtrado. En el día 2, se toman muestras del matraz de spinner, la temperatura es desplazada a 33°C y 30 ml de glucosa 500 g/litro y 0.6 ml de antiespumante al 10% (por ejemplo, emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, Dow Corning 365 Grado Médico de Emulsión) tomados. En toda la producción, el pH es ajustado como sea necesario para mantenerlo alrededor de 7.2. Después de 10 días o hasta que la viabilidad cae a menos del 70%, el cultivo celular es cosechado mediante centrifugación y filtrado a través de un filtro de 0.22 µm. El filtrado fue ya sea almacenado a 4°C o cargado inmediatamente en columnas para purificación. Para los constructos poli-His etiquetados, las proteínas son purificadas utilizando una columna Ni-NTA (Qiagen) . Antes de la purificación, se agrega imidazol a los medios acondicionados a una concentración de 5mM. Los medios acondicionados son bombeados a una columna Ni-NTA de 6 ml equilibrada en HEPES 20 mM, pH 7.4, solución reguladora del pH que contiene NaCl 0.3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/minuto a 4°C. después de la carga, la columna es lavada con solución reguladora del pH de equilibrio adicional y la proteína eluida con solución reguladora del pH de equilibrio que contiene imidazol 0.25 mM. La proteína altamente purificada es desalinizada subsecuentemente a una solución reguladora del pH de almacenamiento' que contiene Hepes 10 mM, NaCl 0.14M y manitol al 4%, pH 6.8, con 25 ml de columna G25 Superfine (Pharmacia) y almacenado a -80°C. Constructos de inmunoadhesina (que contienen Fc) son purificados de los medios acondicionados como sigue. El medio acondicionado es bombeado a una columna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que ha sido equilibrada en su acción reguladora del pH de Na fosfato 20 mM, pH 6.8. Después de la carga, la columna es lavada extensamente con solución reguladora del pH de equilibrio antes de elución con ácido cítrico 100 mM, pH de 3.5. La proteína eluída es neutralizada inmediatamente al recolectar fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 µl de solución reguladora de pH Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada es subsecuentemente desalinizada a la solución reguladora del pH de almacenamiento como se describe anteriormente para las proteínas poli-His marcadas. La homogeneidad es determinada mediante geles de SDS poliacrilamida y secuenciación de aminoácidos N-terminal mediante degradación de Edman. Ciertos de los polipéptidos TAT revelados en la presente han sido expresados exitosamente y purificados utilizando esta técnica (s) . EJEMPLO 9: Expresión TAT en levadura El siguiente método describe la expresión recombinante TAT en levadura.
En primer lugar, vectores de expresión de levaduras son construidos para la producción intracelular o secreción TAT a partir del promotor ADH2/GAPDH. ADN que codifica TAT y el promotor es insertado a sitios de enzimas de restricción apropiados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de TAT. Para la secreción, ADN que codifica TAT puede ser clonado al plásmido seleccionado, junto con ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido de señal TAT natural u otro péptido de señal de mamífero o por ejemplo un factor a de levadura o secuencia de señal/líder secretorio de tasa y secuencias enlazadoras (si es necesario) para la expresión de TAT . Células de levadura, tales como cepa de levadura AB110, pueden luego ser transformadas con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivados en medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levadura transformados pueden ser analizados mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación mediante SDS-PAGE, seguido por teñido de los geles con teñido de Azul de Coomassie. El TAT recombinante puede subsecuentemente ser aislado y purificado al separar las células de levadura del medio de fermentación mediante centrifugación y luego concentración del medio utilizando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene TAT puede además ser purificado utilizando resinas de cromatografía de columnas seleccionadas. Ciertos de los polipéptidos TAT revelados en la presente han sido expresados expresamente y purificados utilizando esta técnica (s) .
EJEMPLO 10: Expresión de TAT en células de insecto baculovirus-infectadas El siguiente método describe la expresión recombinante de TAT en células de insecto baculovirus-infectadas . La codificación de secuencia para TAT es fusionada corriente arriba de una etiqueta de epítopo contenida dentro de un vector de expresión de baculovirus. Tales etiquetas de epítopo incluyen etiquetas poli-His y etiquetas de inmunoglobulina (como regiones Fc de IgG) . Una variedad de plásmidos pueden ser empleados, en los que se incluyen plásmidos derivados de plásmidos disponibles comercialmente tales como pVL1393 (Novagen) . Brevemente, la secuencia que codifica TAT o la porción deseada de la secuencia de codificación TAT, tal como la secuencia que codifica un dominio extracelular de una proteína de transmembrana o la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular es amplificada mediante PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3' . El cebador 5' puede incorporar sitios de enzima de restricción de flanqueo (seleccionados). Luego, el producto es sometido a digestión con aquellas enzimas de restricción seleccionadas y subclonado al vector de expresión. El baculovirus recombinante es generado mediante co-transfección del plásmido anterior y ADN de virus BaculoGold™ (Pharmingen) a células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL) . Después de 4-5 días de incubación a 28 °C, los virus liberados son cosechados y utilizados para amplificaciones adicionales. La infección viral y expresión de proteínas se llevan a cabo como se describe por O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994) . Luego, el TAT poli-His etiquetado expresado puede ser purificado, por ejemplo mediante cromatografía de afinidad Ni2+-quelato como sigue. Los extractos son preparados a partir de células Sf9 infectadas con virus recombinante como se describe por Rupert et al., Nature, 362 : 175-179 (1993) . Brevemente, células Sf9 son lavadas, resuspendidas en solución reguladora del pH de sonificación (25 ml de Hepes, pH 7.9; MgCl2 12.5 mM; EDTA 0.1 mM; glicerol al 10%; NP-40 al 0.1%; KCl 0.4 M) y sonificado dos veces durante 20 segundos sobre hielo. Los sonificados son despejados mediante centrifugación y el sobrenadante es diluido 50 veces son solución reguladora del pH de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7.8) y filtrados a través de un filtro de 0.45 µm. Una columna de Ni2+-NTA agarosa (disponible comercialmente de Qiagen) es preparada con un volumen de lecho de 5 ml, lacada con 25 ml de agua y equilibrada con 25 ml de solución reguladora del pH de carga. El extracto celular filtrado es cargado sobre la columna a 0.5 ml/minuto. La columna es lavada a la referencia A28o con solución reguladora del pH de carga, punto en el cual se inicia la recolección de la fracción. En seguida, la columna es lavada con una solución reguladora del pH de lavado secundaria (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6.0), que eluye la proteína enlazada no específicamente. Después de llegar a la referencia A280, la columna es revelada con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en la solución reguladora de pH de lavado secundaria. Fracciones de 1 ml son recolectadas y analizadas mediante SDS-PAGE y teñido de plata o bandas de proteínas Western conjugadas con Ni2+-NTA a fosfatasa alcalina (Qiagen) . Las fracciones que contienen el TAT Hisio-etiquetado eluído son acumuladas y dializadas contra la solución reguladora del pH de carga. Alternativamente, la purificación de TAT IgG marcado 8 o Fc marcado) se puede efectuar utilizando técnicas de cromatografía conocidas, en las que se incluyen por ejemplo, cromatografía en columna de Proteína A o Proteína G. Ciertos de los polipéptidos TAT revelados en la presente han sido expresados exitosamente y purificados utilizando esta (s) técnica (s).
EJEMPLO 11: Preparación de anticuerpos que enlazan TAT Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que se pueden enlazar específicamente a TAT. Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales son conocidas en el arte y son descritas por ejemplo en Goding, supra. Los inmunógenos que pueden ser empleados incluyen TAT purificado, proteínas de fusión que contienen TAT y células que expresan TAT recombinante sobre a superficie celular. La selección del inmunógeno se puede efectuar por el experimentado en la técnica sin experimentación indebida. Ratones tales como Balb/c, son inmunizados con el inmunógeno de TAT emulsificado en adyuvante de Freund completo e inyectados subcutánea o intraperitonealmente en una cantidad de 1-100 µg . Alternativamente, el inmunógeno es emulsificado en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) e inyectado a los cuartos traseros del animal. Luego los ratones inmunizados son reforzados 10 a 12 días más tarde con inmunógeno adicional emulsificado en el adyuvante seleccionado. Después de esto, por varias semanas, los ratones pueden también ser reforzados con inyecciones de inmunización adicionales. Muestras de suero pueden obtenidas periódicamente de los ratones mediante sangría retro-orbital para pruebas en análisis de ELISA para detectar anticuerpos anti-TAT. Después que un título de anticuerpo apropiado ha sido detectado, los animales "positivos" para anticuerpo pueden ser inyectados con una inyección intravenosa final de TAT. Tres a cuatro días más tarde, los ratones son sacrificados y las células del bazo son cosechadas. Luego las células el bazo son fusionadas (utilizando 35% de polietilenglicol) a una línea celular de mieloma murina seleccionada tal como P3X63AgU.l, disponible de ATCC, No. CRL 1597. las fusiones generan células de hibridoma que pueden luego ser depositadas en placas de cultivo de tejidos de 96 cavidades que contienen medio de HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de célula de bazo. Las células de hibridoma serán seleccionadas en un ELISA en cuanto a reactividad contra TAT. La determinación de células de hibridoma "positiva" que segregan los anticuerpos monoclonales deseados contra TAT está dentro de la habilidad del experimentado en la técnica. Las células de hibridoma positivas pueden ser inyectadas intraperitonealmente a ratones Balb/c singénicos para producir ascites que contienen los anticuerpos monoclonales anti-TAT . Alternativamente, las células de hibridoma pueden ser cultivadas en matraces de cultivo de tejido o botellas rodantes. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en los ascites se puede llevar a cabo utilizando precipitación de sulfato de amonio, seguida por cromatografía de exclusión de gel. Alternativamente, la cromatografía de afinidad a base de enlaces de anticuerpo a Proteína A o Proteína G puede ser empleada. Los anticuerpos dirigidos contra ciertos de los polipéptidos TAT revelados en la presente han sido producidos exitosamente utilizando esta (s) técnica (s) .
EJEMPLO 12: Purificación de los polipéptidos de TAT utilizando los anticuerpos específicos Polipéptidos de TAT naturales o recombinantes pueden ser purificados mediante una variedad de técnicas estándar en la técnica de purificación de proteínas. Por ejemplo, polipéptidos de pro-TAT, polipéptidos de TAT maduro o polipéptido de pre-TAT es purificado mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos para el polipéptidos de TAT de interés. En general, una columna de inmunoafinidad es construida al acoplar covalentemente el anticuerpo de polipéptido de anti-TAT a una resina cromatogáfica activada. Inmunoglobulinas policlonales son preparadas a partir de sueros inmunes ya sea medíante precipitación con sulfato de amonio o mediante purificación sobre Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Asimismo, anticuerpos monoclonales son preparados a partir de fluido de ascites de ratón mediante precipitación con sulfato de amonio o cromatografía sobre Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada es anexada covalentemente a una resina cromatográfica tal como CnBr-activada SEPHAROSE™ (Pharmacia LKB Biotechnology) . El anticuerpo es acoplado a la resina, la resina es bloqueada y la resina derivada es lavada de acuerdo con las instrucciones del fabricantes. Tal columna de inmunoafinidad es utilizada en la purificación del polipéptido de TAT al preparar una fracción de células que contienen el polipéptido de TAT en una forma soluble. Esta preparación es derivada mediante solubilización de la célula entera o de una fracción subcelular obtenida vía centrifugación diferencial mediante la adición de detergente o mediante otros métodos bien conocidos en el arte. Alternativamente, el polipéptido de TAT soluble que tienen una secuencia de señal puede ser secretado en cantidad útil al medio en el cual las células son cultivadas . Una preparación que contiene polipéptido TAT soluble se hace pasar sobre la columna de inmunoafinidad y la columna es lavada bajo condiciones que permiten la absorbancia diferencial del polipéptido TAT (por ejemplo, soluciones reguladoras de alta fuerza iónica en presencia de detergentes) . Luego, la columna es eluída bajo condiciones que alteran el enlace de anticuerpo/polipéptido de células TAT (por ejemplo, una solución reguladora del pH de bajo pH da como aproximadamente un pH 2-3 o una alta concentración de un caótropo tal como un ion urea o tiocianato) y el polipéptido de TAT que es recolectado.
EJEMPLO 13 : Análisis de exterminio de célula de tumor in vitro Células de mamífero que expresan el polipéptido de TAT de interés pueden ser obtenidas utilizando técnicas de vector de expresión y clonación estándar. Alternativamente, muchas líneas de células de tumor que expresan polipéptidos TAT de interés están disponibles públicamente, por ejemplo por medio de la ATCC y pueden ser identificadas sistemáticamente utilizando análisis de ELISA o FACS estándar. Anticuerpos monoclonales de polipéptido anti-TAT (y derivados conjugados de enzimas de los mismos) pueden luego ser empleados en análisis para determinar la capacidad del anticuerpo para exterminar células que expresan polipéptido de TAT in vitro. Por ejemplo, células que expresan el polipéptido de TAT de interés son obtenidas como se describe anteriormente y depositadas en placas de 96 cavidades. En un análisis, el conjugado del anticuerpo/toxina (o el anticuerpo desnudo) es incluido en todo el período de incubación celular por un período de 4 días. En un segundo análisis independiente, las células son incubadas durante una hora con el conjugado de anticuerpo/toxina (o anticuerpo desnudo) y luego lavadas e incubadas en ausencia del conjugado de anticuerpo/toxina por un período d 4 días. Luego la viabilidad de la célula es medida utilizando el análisis de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo de Promega (Cat# G7571) . Las células sin tratar sirven como control negativo.
EJEMPLO 14: Análisis de exterminio de células de tumor in vivo Para probar la eficacia de los anticuerpos monoclonales de polipéptido anti-TAT conjugados o sin conjugar, un anticuerpo anti-TAT es inyectado intraperitonealmente a ratones desnudos 24 horas antes de recibir células que promueven el tumor subcutáneamente en el blanco. Inyecciones de anticuerpo continúan dos veces por semana por el resto del estudio. Luego el volumen del tumor es medido dos veces por semana. Se considera que la especificación descrita anterior es suficiente para permitir al experimentado en la técnica llevar a la práctica la invención. La presente invención no estará limitada en el alcance por el constructo depositado, puesto que se propone que la modalidad depositada sea una sola ilustración de ciertos aspectos de la invención y cualesquier constructos que son funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de esta invención. El depósito de material en la presente n constituye una ambición de que la descripción descrita contenida en la presente es inapropiada para habilitar la práctica de cualquier aspecto de la invención, en los que excluyen el mejor modo de la misma, ni se interpretará como limitante del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. Por supuesto, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente se harán evidentes para aquellos experimentados en la técnica a partir de la descripción anterior y caen dentro del espíritu y alcances de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico a: (a) una molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10) ; (b) una molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (c) una molécula de ADN que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10), con su péptido de señal asociado; (d) una molécula de ADN que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10), que carece de sus péptido de señal asociado, (e) la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); (f) la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (g) el complemento de (a), (b) , (c) , (d) , (e) ó (f) -
  2. 2. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque que tiene: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), (b) una secuencia de nucleótidos que codifica la ß secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), con su péptido de señal asociado; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelulares del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NO: 1-5); (f) la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (g) el complemento de (a), (b) , (c) , (d) , (e) ó (f) •
  3. 3. Ácido nucleico aislado, caracterizado porque se hibridiza a: (a) un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10) ; (b) un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un ácido nucleico que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NOS: 6-10), con su péptido de señal asociado; (d) un ácido nucleico que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 6-10 (SEQ ID NO: 6-10), que carece de su péptido de señal asociado; (e) la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); (f) la región de codificación de plena longitud de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-5 (SEQ ID NOS: 1-5); o (g) el complemento de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) ó (f) -
  4. 4. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la hibridización ocurre bajo condiciones severas.
  5. 5. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque es de por lo menos 5 nucleotidos de longitud.
  6. 6. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1.
  7. 7. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el ácido nucleico es enlazado operativamente para controlar secuencias reconocidas por una célula huésped transfectada con el vector.
  8. 8. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 7.
  9. 9. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque es una célula CHO, una célula E. coli o una célula de levadura.
  10. 10. Un proceso para la producción de un polipéptido, caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 8 bajo condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido y recuperar el polipéptido del cultivo celular,
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