DE60128916T2

DE60128916T2 - Neues, physiologisch aktives peptid und dessen verwendung

Info

Publication number: DE60128916T2
Application number: DE60128916T
Authority: DE
Inventors: Tetsuya Tsukuba-shi OHTAKI; Yasushi Tsukuba-shi MASUDA; Yoshihiro Tsukuba-shi TAKATSU; Takuya Osaka-shi WATANABE; Yasuko Kobe-shi TERAO; Yasushi Toyonaka-shi SHINTANI; Syuji Tsukuba-shi HINUMA
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2000-07-18
Filing date: 2001-07-17
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2021-07-18
Also published as: AU2001272735A1; EP1302542A1; WO2002006483A1; US20040077535A1; EP1302542B1; US20060088915A1; US7045299B2; DE60128916D1; EP1302542A4; US7419956B2; ATE364698T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf (1) ein Peptid, dadurch gekennzeichnet, das es dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 20 oder SEQ ID NR. 21 dargestellt ist, oder ein Salz davon.
STAND DER TECHNIK
Wichtige biologische Funktionen, einschließlich Aufrechterhaltung der Homöostasie in dem lebenden Körper, Reproduktion, Entwicklung von Individuen, Metabolismus, Wachstum, Kontrolle des Nerven-, Zirkulations-, Immun-, Verdauungs- und Stoffwechselsystems, sensorische Anpassung usw., werden durch Zellen reguliert, die endogene Faktoren empfangen, wie verschiedene Hormone und Neurotransmitter, oder Sinnesstimulation, wie Licht oder Geruch, über spezifische Rezeptoren, die auf Zellmembranen vorliegen, die für diese Faktoren oder Stimulation reserviert sind und mit ihnen interagieren. Viele von diesen Rezeptoren für Hormone oder Neurotransmitter werden durch diese funktionelle Regulierung an Guanin-Nucleotid-bindende Proteine gekoppelt (hierin nachstehend manchmal nur als G-Proteine bezeichnet), und sind durch Entwickeln einer Vielzahl von Funktionen durch intrazelluläre Signaltransduktion über die Aktivierung der G-Proteine gekennzeichnet. Außerdem verfügen diese Rezeptorproteine über sieben gemeinsame Transmembrandomänen. Aus den obigen Gründen werden diese Rezeptoren daher gemeinsam als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren oder sieben-Transmembranrezeptoren bezeichnet. Wie oben angegeben, ist es bekannt, daß verschiedene Hormone oder Neurotransmitter und ihre Rezeptorproteine vorliegen und miteinander interagieren, um wichtige Rollen bei der Regulierung der biologischen Funktionen zu spielen. Jedoch ist es noch schlecht verstanden, ob irgendwelche anderen unbekannten Substanzen (Hormone, Neurotransmitter usw.) und Rezeptoren für diese Substanzen vorliegen.
In jüngsten Jahren ist das menschliche Gen bei einem zunehmenden Tempo durch gesammelte Sequenzinformationen durch Sequenzieren der menschlichen genomischen DNA oder verschiedener menschlicher Gewebe-abgeleiteter cDNA bei zufälligem und schnellem Fortschritt in der Genanalysetechnologie aufgeklärt worden. Basierend auf dem Vorhergehenden wird manifestiert, daß es viele Gene gibt, von denen angenommen wird, daß sie Proteine mit unbekannten Funktionen kodieren. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren haben nicht nur sieben Transmembrandomänen, sondern viele gemeinsame Sequenzen liegen in ihren Nukleinsäuren oder Aminosäuren vor, und können daher klar als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren in diesen Proteinen identifiziert werden. Andererseits werden diese G-Protein-gekoppelten Rezeptorgene durch Polymerase-Kettenreaktion (hierin nachstehend als PCR abgekürzt) unter Verwendung einer solchen Ähnlichkeit in der Struktur erhalten (Nature Cell Biology, 2, 703–708 (2000)). Bei diesen bis jetzt so erhaltenen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren können Liganden für einige Rezeptoren, die Subtypen mit hoher Homologie in der Struktur für bekannte Rezeptoren sind, ohne weiteres vorhersehbar sein, aber in den meisten Fällen sind ihre endogenen Liganden unvorhersehbar, so daß keine Liganden, die diesen Rezeptoren entsprechen, gefunden werden. Aus diesem Grund werden diese Rezeptoren Orphan-Rezeptoren genannt. Es ist wahrscheinlich, daß nicht identifizierte endogene Liganden für diese Orphan-Rezeptoren an dem schlecht analysierten biologischen Phänomen beteiligt sein würden, da die Liganden unbekannt waren. Und wenn diese Liganden mit wichtigen physiologischen Wirkungen oder pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht werden, wird erwartet, daß die Entwicklung dieser Rezeptoragonisten und -antagonisten zum Durchbruch von neuen Arzneimitteln führen wird (Stadel, J. et al., TiPS, 18, 430–437, 1997; Marchese, A. et al., TiPS, 20, 370–375, 1999; Civelli, O. et al., Brain Res., 848, 63–65, 1999). Bis jetzt gibt es jedoch wenige Beispiele, um Liganden für Orphan-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren tatsächlich zu identifizieren.
Kürzlich versuchten einige Gruppen, Liganden für diese Orphan-Rezeptoren zu identifizieren, und berichteten über die Isolation von Liganden, die neue physiologisch wirksame Peptide sind, und die Bestimmung ihrer Strukturen. Reinsheid et al. und Meunier et al. führten unabhängig voneinander cDNA, die Orphan-G-Protein-gekoppelten Rezeptor LC132 oder ORL1 codiert, in Tierzellen ein, um einen Rezeptor zu exprimieren, isolierten ein neues Peptid aus Schweinehirn- und Rattenhirnextrakt unter Verwendung der Antwort des Rezeptors als ein Indikator, der in bezug auf seine Antwort Orphanin FQ oder Nociceptin genannt wird, und bestimmten seine Sequenz (Reinsheid, R. K. et al., Science, 270, 792–794, 1995; Meunier, J.-C. et al., Nature, 377, 532–535, 1995). Es wurde berichtet, daß dieses Peptid mit einem Schmerzgefühl verbunden ist. Weitere Untersuchungen an dem Rezeptor in der Knockout-Maus offenbarten, daß das Peptid im Gedächtnis involviert war (Manabe, T. et al., Nature, 394, 577–581, 1998).
Folglich wurden neue Peptide, einschließlich PrRP (Prolactin-releasing Peptid), Orexin, Apelin, Ghrelin und GALP (Galanin-artiges Peptid) usw. als Liganden für Orphan-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren isoliert (Hinuma, S. et al., Nature, 393, 272–276, 1998; Sakurai, T. et al., Cell, 92, 573–585, 1998; Tatemoto, K. et al., Bichem. Biophys. Res. Commun., 251, 471–476, 1998; Kojima, M. et al., Nature, 402, 656–660, 1999; Ohtaki, T. et al., J. Biol. Chem., 274, 37041–37045, 1999).
Andererseits werden einige Rezeptoren für physiologisch aktive Peptide, die bisher unbekannt sind, durch ähnliche Verfahren aufgedeckt. Es wurde aufgedeckt, daß ein Rezeptor für Motilin, der mit der Kontraktion der Darmtrakte verbunden ist, GPR38 war (Feighner, S. D. et al., Science, 284, 2184–2188, 1999). Außerdem wurde SLC-1 als ein Rezeptor für das Melanin-konzentrierende Hormon (MCH) identifiziert (Chambers, J. et al., Nature, 400, 261–265, 1999; Saito, Y. et al., Nature, 400, 265–269, 1999; Shimomura, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 261, 622–626, 1999; Lembo, P. M. C. et al., Nature Cell Biol., 1, 267–271, 1999; Bachner, D. et al., FEBS Lett., 457, 522–524, 1999). Ebenso wurde berichtet, daß GPR14 (SENR) ein Rezeptor für Urotensin II ist (Ames, R. S. et al., Nature, 401, 282–286, 1999; Mori, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 265, 123–129, 1999; Nothakker, H.-P. et al., Nature Cell Biol., 1, 383–385, 1999; Liu, Q. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 266, 174–178, 1999). Es wurde gezeigt, daß MCH an Fettleibigkeit beteiligt ist, da ihre Knockout-Mäuse einen hypophagischen und mageren Phänotyp zeigten (Shimada, M. et al., Nature, 396, 670–674, 1998), und da ihr Rezeptor aufgedeckt wurde, wurde es möglich, einen Rezeptorantagonisten zu untersuchen, der wahrscheinlich als ein Antifettsuchtmittel nützlich sein sollte. Es wurde außerdem berichtet, daß Urotensin II eine starke Wirkung auf das Herz-Kreislauf System zeigt, da es Herzischämie durch intravenöse Injektion an einen Affen induziert (Ames, R. S. et al., Nature, 401, 282–286, 1999).
Wie oben beschrieben, sind Orphan-Rezeptoren und Liganden dafür oftmals an einer neuen physiologischen Aktivität beteiligt, deren Erforschung zur Entwicklung von neuen Arzneimitteln führen wird. Jedoch sind die Untersuchungen der Liganden für Orphan-Rezeptoren von vielen Schwierigkeiten begleitet. Während die Gegenwart von vielen Orphan-Rezeptoren bisher aufgedeckt wurde, wurden nur wenige Liganden für diese Rezeptoren entdeckt.
Die betreffenden Erfinder fanden einen neuen Rezeptor ZAQ, ebenso offenbart in WO 0034334 und WO 9846620, der ein Orphan-G-Protein-gekoppelter Rezeptor ist (ein Protein, enthaltend dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 1 der Beschreibung dargestellt ist: hierin nachstehend manchmal einfach als ZAQ in der Beschreibung bezeichnet). Jedoch war es bis jetzt unbekannt, was der Ligand war.
Es ist das Problem gewesen, einen Liganden für das Orphan-Rezeptorprotein ZAQ zu finden und ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung zu etablieren, gekennzeichnet durch die Verwendung von ZAQ und einem Liganden dafür.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die betreffenden Erfinder fanden eine Substanz mit einer Ligandenaktivität, die für ZAQ spezifisch ist, die in einem Milchextrakt vorlag, isolierten die Substanz und bestimmten ihre Struktur. Die Erfinder fanden ebenso ein Gen, das ein humanes Peptid von dieser aktiven Komponente kodiert, versuchten, das Gen in Tierzellen zu exprimieren, und bestätigten, daß eine peptidähnliche Substanz, die die ZAQ-exprimierten Zellen aktivieren kann, in dem Kulturüberstand sekretiert wurde.
Basierend auf diesen Ergebnissen fanden die betreffenden Erfinder heraus, daß Arzneimittel für die Behandlung von Krankheiten, die durch ZAQ vermittelt werden (ZAQ-Antagonisten oder -agonisten usw., speziell Mittel zur Vorbeugung/Behandlung von Verdauungskrankheiten usw.) durch das Screeningsystem unter Verwendung von ZAQ und einem ZAQ-Ligandenpeptid gescreent werden können.
Das heißt, die vorliegende Erfindung bezieht sich auf folgende Merkmale:

(1) Peptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR. 20 oder SEQ ID NR. 21 dargestellt ist, oder ein Salz davon;
(2) Peptid oder ein Salz gemäß (1), das aus der in SEQ ID NR. 20 dargestellten Aminosäuresequenz besteht;
(3) Peptid oder ein Salz gemäß (l), das aus der in SEQ ID NR. 21 dargestellten Aminosäuresequenz besteht;
(4) Polynukleotid, bestehend aus einem Polynukleotid, das für das Peptid gemäß (1) kodiert;
(5) Polynukleotid gemäß (4), das eine DNA ist;
(6) DNA gemäß (5), enthaltend die Basensequenz, die in SEQ ID NR. 26 oder SEQ ID NR. 27 dargestellt ist;
(7) Rekombinanter Vektor, enthaltend das Polynukleotid gemäß (4);
(8) Transformant, transformiert mit dem rekombinanten Vektor gemäß (7);
(9) Verfahren zur Herstellung des Peptids oder seines Salzes gemäß (1), das umfaßt, daß man den Transformanten von (8) kultiviert und das Peptid gemäß (1) produziert/akkumuliert.
(10) Antikörper gegen das Peptid oder sein Salz gemäß (1).

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Basensequenz der DNA, die das menschliche Gehirn-abgeleitete Protein der Erfindung kodiert, erhalten in BEISPIEL 1 (ZAQC), und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (fortgesetzt auf 2).
2 zeigt die Basensequenz der DNA, die das menschliche Gehirn-abgeleitete Protein der Erfindung kodiert, erhalten in BEISPIEL 1 (ZAQC), und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (fortgesetzt von 2 bis 3).
3 zeigt die Basensequenz der DNA, die das menschliche Gehirn-abgeleitete Protein der Erfindung kodiert, erhalten in BEISPIEL 1 (ZAQC), und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (fortgesetzt von 2).
4 zeigt die Basensequenz der DNA, die das menschliche Gehirn-abgeleitete Protein der Erfindung kodiert, erhalten in BEISPIEL 1 (ZAQT), und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (fortgesetzt auf 5).
5 zeigt die Basensequenz der DNA, die das menschliche Gehirn-abgeleitete Protein der Erfindung kodiert, erhalten in BEISPIEL 1 (ZAQT), und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (fortgesetzt von 4 bis 6).
6 zeigt die Basensequenz der DNA, die das menschliche Gehirn-abgeleitete Protein der Erfindung kodiert, erhalten in BEISPIEL 1 (ZAQT), und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (fortgesetzt von 5).
7 zeigt ein Diagramm der Hydrophobie für das menschliche Gehirn-abgeleitete Protein der Erfindung.
8 zeigt die Ergebnisse der Expressions-Verteilungsanalyse von ZAQ, die in BEISPIEL 2 durchgeführt wurde.
9 zeigt die Aminosäuresequenzen von MIT1, menschentypischem ZAQ-Liganden-Präkursorpeptid (A-Typ) und menschentypischem ZAQ-Liganden-Präkursorpeptid (G-Typ), wobei „MIT1," „Mensch (A-Typ)" und „Mensch (G-Typ)" die Aminosäuresequenzen von MIT1, menschentypischem reifem ZAQ-Ligandenpeptid (A-Typ) bzw. menschentypischem reifem ZAQ-Ligandenpeptid (G-Typ) angibt.
10 zeigt die Ergebnisse der Analyse für die ZAQ-aktivierende Wirkung durch das ZAQ-Ligandenpeptid, gereinigt in BEISPIEL 6 (6-3).
11 zeigt eine Restriktionsenzymkarte von Plasmid pCAN618, verwendet in BEISPIEL 5 (5-11).
12 zeigt die Ergebnisse der Messung für die ZAQ-Rezeptor-aktivierenden Wirkungen durch menschentypisches ZAQ-Ligandenpeptid und MIT1, analysiert in BEISPIEL 8 (8-3), wobei -o- und -•- menschentypisches ZAQ-Ligandenpeptid bzw. MIT1 darstellen.
13 zeigt die Ergebnisse der Messung für I5E-Rezeptor-aktivierende Wirkungen durch menschentypisches ZAQ-Ligandenpeptid und MIT1, analysiert in BEISPIEL 8 (8-3), wobei -o- und -•- menschentypisches ZAQ-Ligandenpeptid bzw. MIT1 darstellen.
14 zeigt die Ergebnisse der Messung für die kontraktile Aktivität, analysiert in BEISPIEL 11, wobei -∎- und -•- menschentypisches ZAQ-Ligandenpeptid bzw. MIT1 darstellen.
15 zeigt die Ergebnisse der Messung für den Bindungsassay, durchgeführt in BEISPIEL 12 unter Verwendung der Membranfraktion von ZAQ, wobei -∎- die ¹²⁵I-MIT1-spezifische Bindungsmenge darstellt, wenn menschentypisches ZAQ-Ligandenpeptid in variablen Konzentrationen (wie auf der x-Achse angegeben) als eine Testverbindung zugegeben wurde, und -•- die ¹²⁵I-MIT1-spezifische Bindungsmenge angibt, wenn MIT1 ebenso als eine Testverbindung zugegeben wurde.
16 zeigt die Ergebnisse der Messung für den Bindungsassay, durchgeführt in BEISPIEL 12 unter Verwendung der Membranfraktion von I5E, wobei -☐- die ¹²⁵I-MIT1-spezifische Bindungsmenge darstellt, wenn menschentypisches ZAQ-Ligandenpeptid in variablen Konzentrationen (wie auf der x-Achse angegeben) als eine Testverbindung zugegeben wurde, und -o- die ¹²⁵I-MIT1-spezifische Bindungsmenge darstellt, wenn MIT1 in variablen Konzentrationen (wie auf der x-Achse angegeben) als eine Testverbindung zugegeben wurde.
BESTE WEISE ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Das erfindungsgemäße Peptid oder sein Salz ist ein Peptid oder sein Salz, das an ein Protein, das dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 1 dargestellt ist, oder ein Salz davon binden kann (hierin nachstehend manchmal einfach als das gegenwärtige Protein bezeichnet), und ist ein Peptid mit der Fähigkeit zum Binden an das gegenwärtige Protein, um selbiges zu aktivieren, oder ein Salz davon.
Außerdem ist das erfindungsgemäße Peptid oder sein Salz ein Peptid oder sein Salz, das an ein Protein, das dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 36, 40, 47, 48 oder 49 dargestellt ist, oder ein Salz davon binden kann, und ist ein Peptid mit der Fähigkeit zum Binden an das Protein der Erfindung, um selbiges zu aktivieren, oder ein Salz davon.
Das erfindungsgemäße Peptid oder sein Salz ist ein Peptid, bestehend aus der durch SEQ ID NR. 20 oder SEQ ID NR. 21 dargestellten Aminosäuresequenz, und mit der Fähigkeit zum Binden an das gegenwärtige Protein der Erfindung, um selbiges zu aktivieren, oder ein Salz davon.
Die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Peptids oder seines Salzes, an das Protein der Erfindung zu binden und das Protein der Erfindung zu aktivieren, kann durch das später beschriebene V erfahren analysiert werden.
Hierin nachstehend wird das Peptid oder sein Salz der Erfindung manchmal nur als das erfindungsgemäße Peptid bezeichnet.
Das gegenwärtige Protein (G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein) ist ein Rezeptorprotein, enthaltend dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz (die Aminosäuresequenz in 1 bis 3 oder 4 bis 6), die durch SEQ ID NR. 1 dargestellt ist.
Das erfindungsgemäße Peptid und das gegenwärtige Protein der Erfindung kann irgendein Peptid oder Protein sein, das von jeglichen Zellen von Menschen oder anderen Säugern abgeleitet wird (beispielsweise Meerschweinchen, Ratte, Maus, Kaninchen, Schwein, Schaf Rind, Affe usw.) (beispielsweise Milzzelle, Nervenzelle, Gliazelle, β-Zelle der Bauchspeicheldrüse, Knochenmarkszelle, Mesangiumzelle, Langerhans-Zelle, Epidermiszelle, Epithelzelle, Endothelzelle, Fibroblast, Fibrozyt, Myozyt, Fettzelle, Immunzelle (beispielsweise Makrophage, T-Zelle, B-Zelle, natürliche Killerzelle, Mastzelle, Neutrophile, Basophile, Eosinophile, Monozyt), Megakaryozyt, Synoviazelle, Knorpelzelle, Knochenzelle, Osteoblast, Osteoklast, Brustdrüsenzelle, Hepatozyt, Interstitialzelle usw., die entsprechenden Präkursorzellen, Stammzellen, Krebszellen usw.) und Hämozytzellen (beispielsweise MEL, M1, CTLL-2, HT-2, WEHI-3, HL-60, JOSK-1, K562, ML-1, MOLT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-CEM, TALL-1, Jurkat, CCRT-HSB-2, KE-37, SKW-3, HUT-78, HUT-102, H9, U937, THP-1, HEL, JK-1, CMK, KO-812, MEG-01 usw.); oder jegliche Gewebe, in denen diese Zellen vorliegen, wie Gehirn oder jegliche Gehirnregionen (beispielsweise Riechkolben, Mandelkern, zerebraler Basalbulbus, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, Nucleus subthalamicus, Hirnrinde, Medulla oblongata, Kleinhirn, Hinterhauptpol, Stirnlappen, Schläfenlappen, Putamen, Nucleus caudatus, Corpus callosum, Substantia nigra), Rückenmark, Hypophyse, Magen, Bauchspeicheldrüse, Niere, Leber, Geschlechtsdrüse, Schilddrüse, Gallenblase, Knochenmark, Nebenniere, Haut, Muskel, Lunge, Magen-Darm-Trakt (beispielsweise Dickdarm und Dünndarm), Blutgefäß, Herz, Thymusdrüse, Milz, Glandula submandibularis, peripheres Blut, pheripherer Hämozyt, Prostata, Testikel, Hoden, Eierstock, Plazenta, Uterus, Knochen, Gelenk, Skelettmuskel usw. (speziell Gehirn und Gehirnregion) usw.; das Peptid oder Protein kann ebenso ein synthetisches Peptid oder ein synthetisches Protein sein.
Das Peptid der Erfindung umfaßt Peptide, die bevorzugt vom Menschen oder anderen Säugern abgeleitet sind, stärker bevorzug vom Menschen abgeleitet sind.
Beispiele der Aminosäuresequenz, die im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NR. 1 dargestellt ist, umfassen eine Aminosäuresequenz mit mindestens etwa 90 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 95 % Homologie, und stärker bevorzugt mindestens etwa 98 % Homologie, zu der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 1 dargestellt ist.
Bevorzugte Beispiele der Proteine mit im wesentlichen derselben Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 1 dargestellt ist, sind Proteine mit im wesentlichen derselben Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 1 dargestellt ist, und mit einer Eigenschaft, die im wesentlichen äquivalent zu der der Aminosäuresequenz ist, die durch SEQ ID NR. 1 dargestellt ist, usw.
Bevorzugte Beispiele des gegenwärtigen Proteins der Erfindung, das dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 1 dargestellt ist, sind Proteine, die dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthalten, die durch SEQ ID NR. 1 dargestellt ist, und mit einer Aktivität, die im wesentlichen zu der der Aminosäuresequenz äquivalent ist, die durch SEQ ID NR. 1 dargestellt ist, usw.
Die im wesentlichen äquivalente Aktivität bezieht sich auf beispielsweise eine Ligandenbindungsaktivität, eine Signaltransduktionsaktivität usw. Der Ausdruck im wesentlichen äquivalent wird in der Bedeutung verwendet, daß die Natur dieser Aktivitäten äquivalent ist. Des halb ist es bevorzugt, daß diese Aktivitäten, wie eine Ligandenbindungsaktivität, eine Signaltransduktionsaktivität usw., in der Wirksamkeit äquivalent sind (beispielsweise etwa das 0,5-bis etwa 2fache), und es ist zulässig, daß sogar Unterschiede in den Eigenschaften, wie die Stärke dieser Aktivitäten und Molekulargewicht des Proteins, vorliegen.
Diese Aktivitäten, wie eine Ligandenbindungsaktivität, eine Signaltransduktionsaktivität usw., können gemäß den öffentlich bekannten Verfahren analysiert werden, und können ebenso beispielsweise durch die Assayverfahren oder die Screening-Verfahren, die später beschrieben werden, analysiert werden.
Hierin nachstehend wird das Protein, das die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 1 dargestellt ist, manchmal als ZAQ bezeichnet.
Das gegenwärtige Protein, das eingesetzt werden kann, umfaßt Proteine, umfassend (i) eine Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID NR. 1, von der 1 oder 2 mehr (bevorzugt ungefähr 1 bis 30, stärker bevorzugt ungefähr 1 bis 20 und am stärksten bevorzugt mehrere (1 oder 2)) Aminosäuren gelöscht werden; (ii) eine Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID NR. 20 oder SEQ ID NR. 21, zu der 1 oder 2 mehr (bevorzugt ungefähr 1 bis 30, stärker bevorzugt ungefähr 1 bis 20 und am stärksten bevorzugt mehrere (1 oder 2)) Aminosäuren hinzugefügt werden; (iii) eine Aminosäuresequenz, dargestellt durch NR. 20 oder SEQ ID NR. 21, in der 1 oder 2 mehr (bevorzugt ungefähr 1 bis 30, stärker bevorzugt ungefähr 1 bis 20 und am stärksten bevorzugt mehrere (1 oder 2)) Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt werden; und (iv) eine Kombination der obigen Aminosäuresequenzen, usw.
Beispiele der Aminosäuresequenz, die im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz aufeist, die durch SEQ ID NR. 36 dargestellt ist, umfassen eine Aminosäuresequenz mit mindestens etwa 90 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 95 % Homologie, und stärker bevorzugt mindestens etwa 98 % Homologie, zu der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 36 dargestellt ist.
Bevorzugte Beispiele von Proteinen, die im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthalten, die durch. SEQ ID NR. 36 dargestellt ist, umfassen Proteine mit im wesentlichen derselben Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 36 dargestellt ist, und mit einer Eigenschaft, die im wesentlichen zu der der Aminosäuresequenz äquivalent ist, die durch SEQ ID NR. 36 dargestellt ist, usw.
Bevorzugte Beispiele des Proteins, das dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 36 dargestellt ist, umfassen Proteine, die dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthalten, die durch SEQ ID NR. 36 dargestellt ist, und eine Aktivität aufweisen, die im wesentlichen zu der der Aminosäuresequenz äquivalent ist, die durch SEQ ID NR. 36 dargestellt ist, usw., insbesondere Proteine, die in WO 98/46620 beschrieben sind, usw.
Beispiele der Aminosäuresequenz, die im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 40 dargestellt ist, umfassen eine Aminosäuresequenz mit mindestens etwa 97 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 98 % Homologie, stärker bevorzugt mindestens etwa 99 % Homologie, und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 99,5 % Homologie, zu der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 40 dargestellt ist, usw.
Bevorzugte Beispiele der Proteine, die im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthalten, die durch SEQ ID NR. 40 dargestellt ist, sind Proteine, die im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthalten, die durch SEQ ID NR. 40 dargestellt ist, und eine Eigenschaft aufweisen, die im wesentlichen zu der der Aminosäuresequenz äquivalent ist, die durch SEQ ID NR. 40 dargestellt ist, usw.
Bevorzugte Beispiele des Proteins, das dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 40 dargestellt ist, umfassen Proteine, die dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthalten, die durch SEQ ID NR. 40 dargestellt ist, und eine Aktivität aufweisen, die im wesentlichen zu der der Aminosäuresequenz äquivalent ist, die durch SEQ ID NR. 40 dargestellt ist, usw.
Beispiele der Aminosäuresequenz, die im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NR. 47 dargestellt ist, umfassen eine Aminosäuresequenz mit mindestens etwa 95 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 96 % Homologie, und stärker bevorzugt mindestens etwa 97 % Homologie, und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 98 % Homologie, zu der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 47 dargestellt ist, usw.
Bevorzugte Beispiele der Proteine, die im wesentlichen dieselben Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthalten, die durch SEQ ID NR. 47 dargestellt ist, sind Proteine, die im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthalten, die durch SEQ ID NR. 47 dargestellt ist, und eine Eigenschaft aufweisen, die im wesentlichen zu der der Aminosäuresequenz äquivalent ist, die durch SEQ ID NR. 47 dargestellt ist, usw.
Bevorzugte Beispiele des Proteins, das dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 47 dargestellt ist, sind Proteine, die dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthalten, die durch SEQ ID NR. 47 dargestellt ist, und eine Aktivität aufweisen, die im wesentlichen zu der der Aminosäuresequenz äquivalent ist, die durch SEQ ID NR. 47 dargestellt ist, usw.
Beispiele der Aminosäuresequenz, die im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NR. 48 dargestellt ist, umfassen eine Aminosäuresequenz mit mindestens etwa 95 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 96 % Homologie, und stärker bevorzugt mindestens etwa 97 % Homologie, und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 98 % Homologie, zu der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 48 dargestellt ist, usw.
Bevorzugte Beispiele der Proteine, die im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthalten, die durch SEQ ID NR. 48 dargestellt ist, sind Proteine, die im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthalten, die durch SEQ ID NR. 48 dargestellt ist, und eine Eigenschaft aufweisen, die im wesentlichen zu der der Aminsäuresequenz äquivalent ist, die durch SEQ ID NR. 48 dargestellt ist, usw.
Bevorzugte Beispiele des Proteins, das dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 48 dargestellt ist, sind Proteine, die dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäu resequenz enthalten, die durch SEQ ID NR. 48 dargestellt ist, und eine Aktivität aufweisen, die im wesentlichen zu der der Aminsäuresequenz äquivalent ist, die durch SEQ ID NR. 48 dargestellt ist, usw.; besonders bevorzugt sind Proteine, die in Biochem. Biophys. Acta, 1491, 369–375, 2000 beschrieben sind, usw.
Beispiele der Aminosäuresequenz, die im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NR. 49 dargestellt ist, umfassen eine Aminosäuresequenz mit mindestens etwa 95 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 96 Homologie, und stärker bevorzugt mindestens etwa 97 % Homologie, und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 98 % Homologie, zu der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 49 dargestellt ist.
Bevorzugte Beispiele der Proteine, die im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthalten, die durch SEQ ID NR. 49 dargestellt ist, sind Proteine, die im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthalten, die durch SEQ ID NR. 49 dargestellt ist, und eine Eigenschaft aufweisen, die im wesentlichen zu der der Aminsäuresequenz äquivalent ist, die durch SEQ ID NR. 49 dargestellt ist, usw.
Bevorzugte Beispiele des Proteins, das dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 49 dargestellt ist, sind Proteine, die dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthalten, die durch SEQ ID NR. 49 dargestellt ist, und eine Aktivität aufweisen, die im wesentlichen zu der der Aminsäuresequenz äquivalent ist, die durch SEQ ID NR. 49 dargestellt ist, usw.; besonders bevorzugt sind Proteine, die in WO 98/46620 beschrieben sind, usw.
Die im wesentlichen äquivalente Aktivität bezieht sich beispielsweise auf eine Ligandenbindungsaktivität, eine Signaltransduktionsaktivität usw. Der Ausdruck im wesentlichen äquivalent wird in der Bedeutung verwendet, daß die Natur dieser Aktivitäten äquivalent ist. Deshalb ist es bevorzugt, daß diese Aktivitäten, wie eine Ligandenbindungsaktivität, eine Signaltransduktionsaktivität usw. in der Wirksamkeit äquivalent sind (beispielsweise etwa das 0,5-bis etwa 2fache), und es ist zulässig, daß sogar Unterschiede in den Eigenschaften, wie die Stärke dieser Aktivitäten und Molekulargewicht des Proteins, vorliegen.
Die Aktivitäten, wie eine Ligandenbindungsaktivität, eine Signaltransduktionsaktivität, usw. kann gemäß den öffentlich bekannten Verfahren analysiert werden.
Beispiele der Aminosäuresequenz, die im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NR. 34 dargestellt ist, umfassen eine Aminosäuresequenz mit mindestens etwa 60 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 70 % Homologie, stärker bevorzugt mindestens etwa 80 % Homologie, und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 90 % Homologie, zu der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 34 dargestellt ist, usw.
Bevorzugte Beispiele des Peptids, das dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 34 dargestellt ist, sind ein Peptid, das dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 34 dargestellt ist, und eine Aktivität aufweist, die im wesentlichen zu der der Aminosäuresequenz äquivalent ist (beispielsweise eine kontraktile Aktivität im Krummdarm, eine kontraktile Aktivität im distalen Dickdarm, eine Relaxationsaktivität im proximalen Dickdarm usw.), die durch SEQ ID NR. 34 dargestellt ist, usw.; insbesondere MIT1, das später beschrieben wird, und so weiter.
In der gesamten vorliegende Beschreibung werden die Peptide und Proteine gemäß der konventionellen Weise zum Beschreiben von Peptiden dargestellt, das heißt, der N-Terminus (Aminoterminus) auf der linken und der C-Terminus (Carboxylterminus) auf der rechten Seite. In den gegenwärtigen Proteinen, einschließlich den Proteinen, die die durch SEQ ID NR. 1 gezeigte Aminosäuresequenz enthalten, kann der C-Terminus eine Carboxylgruppe (-COOH), ein Carboxylat (-COO^–), ein Amid (-CONH₂) oder ein Ester (-COOR) sein.
Hierin umfassen Beispiele der Estergruppe, die durch R gezeigt wird, eine C_1-6-Alkylgruppe, wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl usw.; eine C_3-8-Cycloalkylgruppe, wie Cyclopentyl, Cyclohexyl usw.; eine C_6-12-Arylgruppe, wie Phenyl, α-Naphthyl usw.; eine C_7-14-Aralkylgruppe, wie eine Phenyl-C_1-2-alkylgruppe, z.B., Benzyl, Phenethyl usw.; eine α-Naphthyl-C_1-2-alkylgruppe, wie α-Naphthylmethyl usw.; und dergleichen. Außerdem kann Pivaloyloxymethyl oder dergleichen, das weitgehend als ein Ester zur oralen Verabreichung verwendet wird, ebenso verwendet werden.
Wo das Peptid der Erfindung Carboxylgruppe (oder ein Carboxylat) an einer anderen Stelle als den C-Terminus enthält, kann es amidiert oder verestert werden, und ein solches Amid oder solcher Ester wird ebenso in das Peptid/Protein der Erfindung einbezogen. Die Estergruppe kann dieselbe Gruppe sein, wie die, die in bezug auf den obigen C-terminalen Ester beschrieben wird.
Außerdem umfassen Beispiele des Peptids der Erfindung Varianten des obigen Peptids/Proteins, wobei die Aminogruppe an dem N-Terminus (z.B. Methioninrest) des Peptids mit einer Schutzgruppe geschützt wird (z.B. eine C_1-6-Acylgruppe, wie eine C_2-6-Alkanoylgruppe, z.B. Formylgruppe, Acetylgruppe usw.); die, wobei die N-terminale Region in vivo gespalten wird und die so gebildete Glutamylgruppe pyroglutaminiert wird; die, wobei ein Substituent (z.B. -OH, -SH, Aminogruppe, Imidazolgruppe, Indolgruppe, Guanidinogruppe usw.) an der Seitenkette einer Aminosäure in dem Molekül mit einer geeigneten Schutzgruppe geschützt wird (z.B. eine C_1-6-Acylgruppe, wie eine C_2-6-Alkanoylgruppe, z.B. Formylgruppe, Acetylgruppe usw.), oder konjugierte Peptide/konjugierte Proteine, wie Glycopeptide/Glycoproteine mit Zuckerketten.
Spezielle Beispiele des Peptids der Erfindung umfassen vom Menschen abgeleitete (stärker bevorzugt vom menschlichen Gehirn abgeleitete) Peptide, bestehend aus der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 20 dargestellt ist, vom Menschen abgeleitete (stärker bevorzugt vom menschlichen Gehirn abgeleitete) Peptide, bestehend aus der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 21 dargestellt ist, usw. Stärker bevorzugt sind es vom Menschen abgeleitete Peptide, bestehend aus der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 21 dargestellt ist.
Spezielle Beispiele des gegenwärtigen Proteins umfassen vom Menschen abgeleitete (bevorzugt vom menschlichen Gehirn abgeleitete) Proteine, die die Aminosäuresequenz enthalten, die durch SEQ ID NR. 1 dargestellt ist, usw.
Jedes Teilpeptid, das für das gegenwärtige Protein beschrieben ist, kann als das Teilpeptid des gegenwärtigen Proteins verwendet werden (hierin nachstehend manchmal nur als gegen wärtiges Teilpeptid bezeichnet). Beispielsweise kann ein Teil des gegenwärtigen Proteinmoleküls, der auf der Außenseite einer Zellmembran oder dergleichen exponiert wird, verwendet werden, so lange wie er eine im wesentlichen äquivalente Rezeptorbindungsaktivität aufweist.
Speziell ist das Teilpeptid des Proteins, das die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 1 dargestellt ist, ein Peptid, das die Teile enthält, die als extrazelluläre Domänen (hydrophile Domänen) in der hydrophoben Auswertungsanalyse, wie in 7 gezeigt, analysiert worden sind. Ein Peptid, das einen hydrophoben Domänenteil enthält, kann ebenso verwendet werden. Außerdem kann das Peptid, das jede Domäne separat enthält, verwendet werden, aber das Peptid kann mehrere Domänen zusammen enthalten.
Die Anzahl an Aminosäuren in dem gegenwärtigen Teilpeptid beträgt mindestens 20, bevorzugt mindestens 50 und stärker bevorzugt mindestens 100 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz, die das gegenwärtige oben beschriebene Protein bildet, und Peptide mit der Aminosäuresequenz mit solchen Anzahlen an Aminosäuren usw. sind bevorzugt.
Die im wesentlichen selbe Aminosäuresequenz umfaßt eine Aminosäuresequenz mit mindestens etwa 50 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 70 % Homologie, stärker bevorzugt mindestens etwa 80 % Homologie, am stärksten bevorzugt mindestens etwa 90 % Homologie und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 % Homologie, zu diesen Aminosäuresequenzen.
Hierin wird der Ausdruck „im wesentlichen äquivalente Ligandenbindungsaktivität" in derselben Bedeutung, wie oben definiert, verwendet. Die „im wesentlichen äquivalente Ligandenbindungsaktivität" kam durch eine Modifikation von öffentlich bekannten Verfahren analysiert werden.
Das Teilpeptid des Proteins, das dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 36; SEQ ID NR. 40; SEQ ID NR. 47; SEQ ID NR. 48 oder SEQ ID NR. 49 dargestellt ist, kann jedes Teilpeptid sein, so lange wie es das zuvor genannte Teilpeptid des Proteins ist, das dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 36; SEQ ID NR. 40, SEQ ID NR; 47, SEQ ID NR. 48 oder SEQ ID NR. 49 dargestellt ist, und in den Proteinmolekülen werden beispielsweise die mit einer Seite, die sich außerhalb der Zellmembran erstreckt und im wesentlichen äquivalente Ligandenbindungsaktivität aufweist, eingesetzt. Die Anzahl an Aminosäuren in dem Teilpeptid beträgt mindestens 20, bevorzugt mindestens 50 und stärker bevorzugt mindestens 100 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz, die das oben beschriebene Protein bildet, und Peptide mit der Aminosäuresequenz von solchen Anzahlen von Aminosäuren usw. sind bevorzugt. Die im wesentlichen selbe Aminosäuresequenz umfaßt eine Aminosäuresequenz mit mindestens etwa 50 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 70 % Homologie, stärker bevorzugt mindestens etwa 80 % Homologie, am stärksten bevorzugt mindestens etwa 90 % Homologie und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 % Homologie, zu diesen Aminosäuresequenzen.
Als die Salze des Peptids der Erfindung und des gegenwärtigen Proteins oder seines Teilpeptids usw. sind physiologisch akzeptable Säureadditionssalze besonders bevorzugt. Beispiele von solchen Salzen sind Salze mit anorganischen Säuren (z.B. Salzsäure, Phosphorsäure, Bromwasserstoffsäure und Schwefelsäure), Salze mit organischen Säuren (z.B. Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Äpfelsäure, Oxalsäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure) und dergleichen.
Das erfindungsgemäße Peptid oder gegenwärtige Protein oder Salze davon sowie die Proteine, die die Aminosäuresequenz enthalten, die durch SEQ ID NR. 36, SEQ ID NR. 40, SEQ ID NR. 47 dargestellt ist, oder Salze davon können durch ein öffentlich bekanntes Verfahren hergestellt werden, das verwendet wird, um ein Peptid/Protein aus oben beschriebenen menschlichen oder anderen Säugerzellen oder -geweben zu reinigen. Alternativ können sie ebenso durch Kultivieren einer Transformante hergestellt werden, die eine DNA trägt, die das erfindungsgemäße Peptid, das erfindungsgemäße Protein oder das Protein, das die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 36, SEQ ID NR. 40, SEQ ID NR. 47 dargestellt ist, kodiert, wie später beschrieben wird. Sie können ebenso durch die später beschriebene Peptid/Protein-Synthese oder durch eine Modifikation davon hergestellt werden. Außerdem kann das Protein, das die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 48 dargestellt ist, oder Salze davon durch eine Modifikation des Verfahrens, das in Biochem. Biophys. Acta, 1491, 369 – 375, 2000 beschrieben ist, hergestellt werden. Das Protein, das die Aminosäure sequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 49 dargestellt ist, oder Salze davon kann durch eine Modifikation des Verfahrens, das in WO 98/46620 beschrieben ist, hergestellt werden.
Wenn die Peptide/Proteine oder Salze davon aus menschlichem oder Säugergewebe oder -zellen hergestellt werden, werden die menschlichen oder Säugergewebe oder -zellen homogenisiert und mit einer Säure oder dergleichen extrahiert, und das Extrakt wird isoliert und durch eine Kombination von chromatographischen Techniken, wie Umkehrphasenchromatographie, Ionenaustauschchromatographie und dergleichen, gereinigt.
Um das Peptid der Erfindung, das gegenwärtige Protein, sein Teilpeptid oder seine Amide, oder Salze davon zu synthetisieren, können kommerziell erhältliche Harze, die für die Peptid/Protein-Synthese genutzt werden, verwendet werden. Beispiele von solchen Harzen umfassen Chlormethylharz, Hydroxymethylharz, Benzhydrylaminharz, Aminomethylharz, 4-Benzyloxybenzylalkoholharz, 4-Methylbenzhydrylaminharz, PAM-Harz, 4-Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethylharz, Polyacrylamidharz, 4-(2',4'-Dimethoxyphenylhydroxymethyl)phenoxyharz, 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminoethyl)phenoxyharz usw. Unter Verwendung dieser Harze werden Aminosäuren, worin α-Aminogruppen und funktionelle Gruppen an den Seitenketten entsprechend geschützt werden, auf dem Harz in der Reihenfolge der Sequenz des Ziel-Peptids/Proteins gemäß den verschiedenen Kondensationsverfahren, die in der Technik öffentlich bekannt sind, kondensiert. Am Ende der Reaktion wird das Peptid/Protein aus dem Harz entfernt und gleichzeitig werden die Schutzgruppen entfernt. Darnn wird die intramolekulare Disulfid-Bindungsbildungs-Reaktion in einer stark verdünnten Lösung durchgeführt, um das Ziel-Peptid/Protein oder Amide davon zu erhalten.
Zur Kondensation der geschützten oben beschriebenen Aminosäuren kann eine Vielzahl von Aktivierungsreagenzien für die Peptid/Protein-Synthese verwendet werden, aber Carbodiimide werden besonders bevorzugt eingesetzt. Beispiele von solchen Carbodiimiden umfassen DCC, N,N'-Diisopropylcarbodiimid, N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid usw. Zur Aktivierung durch diese Reagenzien werden die geschützten Aminosäuren in Kombination mit einem Racemisierungsinhibitor (z.B. HOBt, HOOBt) direkt zu dem Harz zugegeben, oder die geschützten Aminosäuren werden zuvor in Form von symmetrischen Säureanhydriden, HOBt-Estern oder HOOBt-Estern aktiviert, gefolgt von der Zugabe der so aktivierten geschützten Aminosäuren zu dem Harz.
Lösungsmittel, die zur Verwendung geeignet sind, um die geschützten Aminosäuren zu aktivieren oder mit dem Harz zu kondensieren, können aus den Lösungsmitteln ausgewählt werden, die dafür bekannt sind, daß sie für die Peptid/Protein-Kondensationsreaktionen nützlich sind. Beispiele von solchen Lösungsmitteln sind Säureamide, wie N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon usw.; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Chloroform usw.; Alkohole, wie Trifluorethanol usw.; Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid usw.; Ether, wie Pyridin, Dioxan, Tetrahydrofuran usw.; Nitrile, wie Acetonitril, Propionitril usw.; Ester, wie Methylacetat, Ethylacetat usw.; und geeignete Gemische aus diesen Lösungsmitteln. Die Reaktionstemperatur wird geeigneterweise aus dem Bereich ausgewählt, der dafür bekannt ist, daß er auf die Proteinbindungsreaktionen anwendbar ist, und wird normalerweise in dem Bereich von ungefähr –20 °C bis 50 °C ausgewählt. Die aktivierten Aminosäurederivate werden im allgemeinen in einem Überschuß vom 1,5- bis 4fachen verwendet. Die Kondensation wird unter Verwendung der Ninhydrinreaktion kontrolliert; wenn die Kondensation unzureichend ist, kann die Kondensation durch Wiederholten der Kondensationsreaktion ohne die Entfernung der Schutzgruppen vollendet werden. Wenn die Kondensation nach dem Wiederholen der Reaktion noch unzureichend ist, werden nicht-umgesetzte Aminosäuren mit Essigsäureanhydrid oder Acetylimidazol acetyliert.
Beispiele der Schutzgruppen, die verwendet werden, um die Ausgangsaminogruppen zu schützen, umfassen Z, Boc, t-Pentyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, Adamantyloxycarbonyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, Formyl, 2-Nitrophenylsulfenyl, Diphenylphosphinothioyl, Fmoc usw.
Eine Carboxylgruppe kann durch beispielsweise Alkylveresterung (in der Form von linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylestern der Alkyleinheit, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, t-Butyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclooctyl, 2-Adamantyl usw.), Aralkylveresterung (beispielsweise Veresterung in Form von Benzylester, 4-Nitrobenzylester, 4-Methoxybenzylester, 4-Chlorbenzylester, Benzhydrylester usw.), Phenacylveresterung, Benzyloxycarbonylhydrazidierung, t-Butoxycarbonylhydrazidierung, Tritylhydrazidierung oder dergleichen geschützt werden.
Die Hydroxylgruppe von Serin kann beispielsweise durch ihre Veresterung oder Veretherung geschützt werden. Beispiele von Gruppen, die geeigneterweise für die Veresterung verwendet werden, umfassen eine Niederalkanoylgruppe, wie Acetylgruppe, eine Aroylgruppe, wie Benzoylgruppe, und eine Gruppe, die von Kohlensäure abgeleitet ist, wie Benzyloxycarbonylgruppe und Ethoxycarbonylgruppe. Beispiele einer Gruppe, die geeigneterweise für die Veretherung verwendet wird, umfassen Benzylgruppe, Tetrahydropyranylgruppe, t-Butylgruppe usw.
Beispiele von Gruppen zum Schutz der phenolischen Hydroxylgruppe von Tyrosin umfassen Bzl, Cl₂-Bzl, 2-Nitrobenzyl, Br-Z, t-Butyl usw.
Beispiele von Gruppen, die verwendet werden, um die Imidazoleinheit von Histidin zu schützen, umfassen Tos, 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl, DNP, Benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc usw.
Beispiele der aktivierten Carboxylgruppen in den Ausgangsaminosäuren umfassen die entsprechenden Säureanhydride, Azide, aktivierten Ester (Ester mit Alkoholen (z.B. Pentachlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 2,4-Dinitrophenol, Cyanomethylalkohol, p-Nitrophenol, HONB, N-Hydroxysuccimid; N-Hydroxyphthalimid, HOBt)). Als die aktivierten Aminosäuren, worin die Aminogruppen in dem Ausgangsmaterial aktiviert werden, werden die entsprechenden Phosphoramide eingesetzt.
Um die Schutzgruppen zu beseitigen (abzuspalten), werden katalytische Reduktion unter Wasserstoffgasstrom in Gegenwart eines Katalysators, wie Pd-Ruß oder Pd-Kohlenstoff eine Säurebehandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff, Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure oder Trifluoracetat, oder eine Gemischlösung aus diesen Säuren; eine Behandlung mit einer Base, wie Diisopropylethylamin, Triethylamin, Piperidin oder Piperazin; und Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak verwendet. Die Beseitigung durch die oben beschriebene Säurebehandlung wird im allgemeinen bei einer Temperatur von ungefähr –20 °C bis 40 °C durchgeführt. Bei der Säurebehandlung ist es effizient, einen Kationenfänger, wie Anisol, Phenol, Thioanisol, m-Cresol, p-Cresol, Dimethylsulfid, 1,4-Butandithiol oder 1,2-Ethandithiol zuzugeben. Außerdem wird die 2,4-Dinitrophenylgruppe, die als die Schutzgruppe für das Imidazol von Histidin verwendet wird, durch eine Behandlung mit Thi ophenol entfernt. Die Formylgruppe, die als die Schutzgruppe des Indols von Tryptophan verwendet wird, wird durch die zuvor genannte Säurebehandlung in Gegenwart von 1,2-Ethandithiol oder 1,4-Butandithiol sowie durch eine Behandlung mit einem Alkali, wie einer verdünnten Natriumhydroxidlösung, verdünntem Ammoniak usw., beseitigt.
Der Schutz von funktionellen Gruppen, die nicht an der Reaktion der Ausgangsmaterialien beteiligt sein sollten, die Beseitigung der Schutzgruppen und die Aktivierung der funktionellen Gruppen, die an der Reaktion beteiligt sind, können entsprechend aus den öffentlich bekannten Gruppen und öffentlich bekannten Mitteln ausgewählt werden.
Bei einem anderen Verfahren zur Erhaltung der Amide des Peptids/Proteins wird beispielsweise die α-Carboxylgruppe der Carboxyl-terminalen Aminosäure zunächst durch Amidierung geschützt; die Peptidkette wird dann von der Aminogruppenseite auf eine gewünschte Länge verlängert. Danach werden ein Peptid/Protein, bei dem nur die Schutzgruppe der N-terminalen α-Aminogruppe aus der Peptidkette beseitigt worden ist, und ein Peptid/Protein, bei dem nur die Schutzgruppe aus der C-terminalen Carboxylgruppe beseitigt worden ist, hergestellt. Die zwei Peptide/zwei Proteine werden in einem Gemisch aus den oben beschriebenen Lösungsmitteln kondensiert. Die Einzelheiten der Kondensationsreaktion sind dieselben, wie oben beschrieben. Nach dem das geschützte Peptid/geschützte Protein, das durch Kondensation erhalten wurde, gereinigt wurde, wurden alle Schutzgruppen durch das oben beschriebene Verfahren beseitigt, um das gewünschte rohe Peptid/rohe Protein zu erhalten. Das rohe Peptid/rohe Protein wird durch verschiedene Reinigungsmittel gereinigt. Lyophilisierung der Hauptfraktion ergibt das Amid des gewünschten Peptids/Proteins.
Um das veresterte Peptid/Protein herzustellen, wird beispielsweise die α-Carboxylgruppe der Carboxyl-terminalen Aminosäure mit dem gewünschten Alkohol kondensiert, um den Aminosäureester herzustellen, worauf die Verfahrensweise folgt, die der Herstellung des amidierten Proteins oben ähnelt, wodurch das gewünschte veresterte Peptid/Protein erhalten wurde.
Das Peptid der Erfindung kann gemäß der öffentlich bekannten Peptidsynthese hergestellt werden.
Das Teilpeptid des gegenwärtigen Proteins der Erfindung oder Salze davon kann durch öffentlich bekannte Verfahren zur Peptidsynthese oder durch Spalten des gegenwärtigen Proteins mit einer geeigneten Peptidase hergestellt werden.
Für die Verfahren zur Peptidsynthese kann beispielsweise entweder Festphasensynthese oder Flüssigphasensynthese verwendet werden. Das heißt, das Teilpeptid oder die Aminosäuren, die das Peptid der Erfindung oder das Protein der Erfindung bilden, werden mit dem verbliebenen Teil kondensiert. Wo das Produkt Schutzgruppen umfaßt, werden diese Schutzgruppen entfernt, wodurch das gewünschte Peptid erhalten wurde. Öffentlich bekannte Verfahren zur Kondensation und Beseitigung der Schutzgruppen werden in (1) bis (5) nachstehend beschrieben.

(1) M. Bodanszky & M. A. Ondetti: Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(2) Schroeder & Luebke: The Peptide, Academic Press, New York (1965)
(3) Nobuo Izumiya, et al.: Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken (Basics and experiments of peptide synthesis), veröffentlich von Maruzen Co. (1975)
(4) Haruaki Yajima & Shunpei Sakakibara: Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experiment) 1, Tanpakushitsu no Kagaku (Chemistry of Proteins) IV, 205 (1977)
(5) Haruaki Yajima Hrsg.: Zoku Iyakuhin no Kaihatsu (A sequel to Development of Pharmaceuticals), Bd. 14, Peptide Synthesis, veröffentlicht von Hirokawa Shoten

Nach der Beendigung der Reaktion kann das Produkt durch eine Kombination von konventionellen Reinigungsverfahren, wie Lösungsmittelextraktion, Destillation, Säulenchromatographie, Flüssigchromatographie und Umkristallisierung gereinigt und isoliert werden, wodurch das Peptid oder das Teilpeptid der Erfindung erhalten wird. Wenn das Peptid oder das Teilpeptid, das durch die obigen Verfahren erhalten wurde, in einer freien Form vorliegt, kann das Peptid in ein entsprechendes Salz durch ein öffentlich bekanntes Verfahren umgewandelt werden; wenn das Protein in einer Salzform erhalten wird, kann es in eine freie Form durch ein öffentlich bekanntes Verfahren umgewandelt werden.
Die DNA, die das Peptid/Protein der Erfindung kodiert, kann jede DNA sein, so lange wie siei die Basensequenz umfaßt, die das oben beschriebene Peptid/Protein der Erfindung ko diert. Eine solche DNA kann ebenso irgendeine der genomischen DNA, genomischen DNA-Bibliothek, cDNA, abgeleitet von den oben beschriebenen Zellen oder Geweben, cDNA-Bibliothek, abgeleitet von den oben beschriebenen Zellen oder Geweben, und synthetische DNA sein. Der Vektor, der für die Bibliothek verwendet werden soll, kann eine Bakteriophage, Plasmid, Cosmid, Phagemid und dergleichen sein. Außerdem kann die DNA durch Umkehrtrauskriptase-Polymerase-Kettenreaktion (hierin nachstehend RT-PCR abgekürzt) mit gesamter RNA- oder mRNA-Fraktion, hergestellt aus den oben beschriebenen Zellen oder Geweben, amplifiziert werden.
Speziell kann die DNA, die das Peptid der Erfindung kodiert, irgendeine von beispielsweise der DNA sein, die die Basensequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 26 oder SEQ ID NR. 27 dargestellt ist.
Beispiele der DNA, die zu der DNA, die die Basensequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 26 dargestellt ist, unter hochstringenten Bedingungen hybridisierbar ist, umfassen DNAs mit mindestens etwa 60 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 70 % Homologie und stärker bevorzugt mindestens etwa 80 % Homologie, zu der DNA, die die Basensequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 26 dargestellt ist, usw.
Beispiele der DNA, die zu der DNA, die die Basensequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 27 dargestellt ist, unter hochstringenten Bedingungen hybridisierbar ist, umfassen DNAs mit mindestens etwa 60 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 70 % Homologie und stärker bevorzugt mindestens etwa 80 % Homologie, zu der DNA, die die Basensequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 27 dargestellt ist, usw.
Ebenso kann die DNA, die das gegenwärtige Protein der Erfindung kodiert, irgendeine von beispielsweise einer DNA, die eine Basensequenz umfaßt, die durch SEQ ID NR. 2 oder SEQ ID NR. 3 dargestellt ist, und einer DNA sein, die DNA enthält, die zu einer DNA, die die Basensequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 2 oder SEQ ID NR. 3 dargestellt ist, unter hochstringenten Bedingungen hybridisierbar ist, und ein Protein kodiert, das eine Aktivität aufweist (z.B. eine Ligandenbindungsaktivität, eine Signaltransduktionsaktivität usw.), die im wesentlichen zu der des Proteins der Erfindung äquivalent ist.
Beispiele der DNA, die zu einer DNA, die die Basensequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 2 oder SEQ ID NR. 3 dargestellt ist, unter hochstringenten Bedingungen hybridisierbar ist, umfassen DNAs mit mindestens etwa 90 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 95 % Homologie und stärker bevorzugt mindestens etwa 98 % Homologie, zu der Basensequenz, die durch SEQ ID NR. 2 oder SEQ ID NR. 3 dargestellt ist, usw.
Die Hybridisierung kann durch öffentlich bekannte Verfahren oder durch Modifikationen davon beispielsweise gemäß dem Verfahren, das in Molecular Cloning, 2nd. (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) beschrieben ist, durchgeführt werden usw. Eine kommerziell erhältliche Bibliothek kann ebenso gemäß den Instruktionen des beiliegenden Herstellerprotokolls verwendet werden. Die Hybridisierung kann bevorzugt unter hochstringenten Bedingungen durchgeführt werden.
Die hochstringenten Bedingungen, die hierin verwendet werden, sind beispielsweise eine Natriumkonzentration von ungefähr 19 bis 40 mM, bevorzugt ungefähr 19 bis 20 mM bei einer Temperatur von ungefähr 50 bis 70 °C, bevorzugt ungefähr 60 bis 65 °C. Insbesondere sind Hybridisierungsbedingungen bei einer Natriumkonzentration von etwa 19 mM bei einer Temperatur von etwa 65 °C am stärksten bevorzugt.
Spezieller gibt es für die DNA, die das Peptid kodiert, das die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 20 dargestellt ist, eine DNA, die die Basensequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 26 dargestellt ist; gibt es für die DNA, die das Peptid kodiert, das die Aminosäuresequenz enthält, das durch SEQ ID NR. 21 dargestellt ist, eine DNA, die die Basensequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 27 dargestellt ist; gibt es für die DNA, die das Peptid kodiert, die die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 22 dargestellt ist, eine DNA, die die Basensequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 28 dargestellt ist; und gibt es für die DNA, die das Peptid kodiert, das die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 23 dargestellt ist, eine DNA, die die Basensequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 29 dargestellt ist.
Für die DNA, die das Protein kodiert, die die Aminosäuresequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 1 dargestellt ist, gibt es eine DNA, die die Basensequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 2 oder SEQ ID NR. 3 dargestellt ist.
Die Nukleotide (Oligonukleotid), die die Basensequenz oder einen Teil der Basensequenz umfassen, die komplementär zu der DNA ist, die das Peptid der Erfindung kodiert, werden in der Bedeutung verwendet, daß nicht nur die DNA, die das Peptid der Erfindung kodiert, sondern auch RNA einbezogen ist.
Antisense(oligo)nukleotide (Nukleinsäure), die die Replikation oder Expression des Gens für das Peptid der Erfindung inhibieren können, können konstruiert und synthetisiert sein, basierend auf der geklonten oder bestimmten Basensequenzinformation der DNA, die das Peptid kodiert. Ein solches (Oligo)nukleotid (Nukleinsäure) ist zur RNA des Gens für das Peptid der Erfindung hybridisierbar, wodurch die Synthese oder Funktion der RNA inhibiert wird, oder kann die Genexpression des Peptids der Erfindung über Interaktion mit RNA, die mit dem Peptid der Erfindung verbunden ist, modulieren oder kontrollieren. (Oligo)nukleotide, die zu den ausgewählten Sequenzen von RNA, die mit dem Peptid der Erfindung verbunden ist, komplementär sind, und (Oligo)nukleotide, die speziell mit der RNA, die mit dem Peptid der Erfindung verbunden sind, hybridisierbar sind, sind beim Modulieren oder Kontrollieren der Genexpression des Peptids der Erfindung in vivo und in vitro nützlich und zur Behandlung oder Diagnose von Krankheiten usw. nützlich.
Der Ausdruck „entsprechend" wird in der Bedeutung verwendet, die homolog zu oder komplementär zu einer speziellen Sequenz des Nukleotids oder Basensequenz oder Nukleinsäure, einschließlich Gen, ist. Der Ausdruck „entsprechend" zwischen Nukleotiden, Basensequenzen oder Nukleinsäuren und Peptiden bezieht sich normalerweise auf Aminosäuren eines Peptids unter Instruktionen, die aus der Sequenz von Nukleotiden (Nukleinsäuren) oder ihren Komplements abgeleitet sind. Die 5'-Enden-Haarnadelschleife, die 5'-Enden-6-Basenpaar-Wiederholungen, die 5'-Enden-untranslatierte Region, das Polypeptid-Translationsinitiationscodon, die Protein-kodierende Region, das ORF-Translationsinitiationscodon, die 3'-untranslatierte Region, die 3'-Enden-Palindromregion und die 3'-Enden-Haarnadelschleife können als bevorzugte Targetregionen ausgewählt werden, obwohl jede andere Region ebenso als ein Target in Genen des Peptids der Erfindung ausgewählt werden kann.
Die Beziehung zwischen den targetierten Nukleinsäuren und den (Oligo)nukleotiden, die komplementär zu mindestens einem Teil des Targets sind, speziell die Beziehung zwischen dem Target und den (Oligo)nukleotiden, die zu dem Target hybridisierbar sind, kann als „An tisense" bezeichnet werden. Beispiele von Antisense(oligo)nukleotiden umfassen Polydeoxynukleotide, die 2-Deoxy-D-ribose tragen, Polydeoxynukleotide, die D-Ribose tragen, jeder andere Typ von Polynukleotiden, die N-Glycoside einer Purin- oder Pyrimidinbase sind, oder andere Polymere, die Nicht-Nukleotidhautpketten umfassen (z.B. Proteinnukleinsäuren und kommerziell erhältliche synthetische sequenzspezifische Nukleinsäurepolymere) oder andere Polymere, die Nichtstandardverknüpfungen umfassen (vorausgesetzt, daß die Polymere Nukleotide mit einer solchen Konfiguration enthalten, die die Basenpaarung oder Basenstapelung erlauben, wie sie in DNA oder RNA gefunden werden können) usw. Die Antisense-Polynukleotide können doppelsträngige DNA, einsträngige DNA, doppelsträngige RNA, einsträngige RNA oder ein DNA : RNA-Hybrid sein, und können außerdem nicht-modifizierte Polynukleotide oder nicht-modifizierte Oligonukleotide umfassen, die mit öffentlich bekannten Modifikationstypen, beispielsweise die mit Markierungen, die in der Technik bekannt sind, die mit caps-methylierten Polynukleotiden, die mit Substitution von einem oder mehreren natürlich vorkommenden Nukleotiden durch ihre Analoga, die mit intramolekularen Modifikationen von Nukleotiden, wie die mit ungeladenen Verknüpfungen (z.B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoramidate, Carbamate usw.) und die mit geladenen Verknüpfungen oder Schwefel-umfassenden Verknüpfungen (z.B. Phosphorthioate, Phosphordithioate usw.), die mit Seitenkettengruppen, wie Proteine (Nukleasen, Nukleaseinhibitoren, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-lysin usw.), Saccharide (z.B. Monosaccharide usw.), die mit Intercalatoren (z.B. Acridin, Psoralen usw.), die, umfassend Chelatoren (z.B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxidative Metalle usw.), die, umfassend Alkylierungsmittel, die mit modifizierten Verknüpfungen (z.B. α-anomere Nukleinsäuren usw.), und dergleichen. Hierin sind unter den Ausdrücken „Nukleosid", „Nukleotid" und „Nukleinsäure" Einheiten zu verstehen, die nicht nur die Purin- und Pyrimidinbasen enthalten, sondern ebenso andere heterocyclische Basen, die modifiziert worden sind. Diese Modifikationen können methylierte Purine und Pyrimidine, acylierte Purine und Pyrimidine und andere heterocyclische Ringe umfassen. Modifizierte Nukleotide und modifizierte Nukleotide umfassen ebenso Modifikationen auf der Zuckereinheit, wobei beispielsweise eine oder mehrere Hydroxylgruppen gegebenenfalls mit einem Halogenatom(en), einer aliphatischen Gruppe(n) usw. substituiert sein kann, oder zu den entsprechenden funktionellen Gruppen, wie Ethern, Aminen oder dergleichen, umgewandelt werden kann/können.
Die Antisense-Nukleinsäure ist RNA, DNA oder eine modifizierte Nukleinsäure. Spezielle Beispiele der modifizierten Nukleinsäure sind Schwefel- und Thiophosphatderivate von Nukleinsäuren und die, die gegen den Abbau von Polynukleosidamiden oder Oligonukleosidamiden resistent sind, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Antisense-Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können bevorzugt modifiziert werden, basierend auf der folgenden Gestaltung, das heißt, durch Erhöhen der intrazellulären Stabilität der Antisense-Nukleinsäure, Erhöhen der zellulären Durchlässigkeit der Antisense-Nukleinsäure, Erhöhen der Affinität der Nukleinsäure für den targetierten codierenden Strang auf ein höheres Niveau, oder Minimieren der Toxizität, wenn vorhanden, von der Antisense-Nukleinsäure.
Viele dieser Modifikationen sind in der Technik bekannt, wie in J. Kawakami, et al., Pharm. Tech. Japan, Bd. 8, S. 247, 1992; Bd. 8, S. 395, 1992; S. T. Crooke, et al. Hrsg., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993; usw. offenbart.
Die Antisense-Nukleinsäure kann veränderte oder modifizierte Zucker, Basen oder Verknüpfungen umfassen. Die Antisense-Nukleinsäure kann ebenso in einer spezialisierten Form bereitgestellt werden, wie Liposomen, Mikrokügelchen, oder kann auf die Gentherapie angewandt werden, oder kann in Kombination mit angelagerten Einheiten bereitgestellt werden. Diese angelagerten Einheiten umfassen Polykationen, wie Polylysin, die als Ladungsneutralisatoren der Phosphathauptkette fungieren, oder hydrophobe Einheiten, wie Lipide (z.B. Phospholipide, Cholesterole usw.), die die Interaktion mit Zellmembranen verbessern oder die Aufnahme von Nukleinsäure erhöhen. Bevorzugte Beispiele der Lipide, die angelagert werden sollen, sind Cholesterole oder Derivate davon (z.B. Cholesterylchlorameisensäureester, Cholsäure usw.). Diese Einheiten können mit der Nukleinsäure an den 3'- oder 5'-Enden davon zugeführt werden und können ebenso daran durch eine Base, einen Zucker oder intramolekulare Nukleosidverknüpfung angelagert sein. Andere Einheiten können Capping-Gruppen sein, die speziell an den 3'- oder 5'-Enden der Nukleinsäure plaziert sind, um den Abbau durch Nukleasen, wie Exonuklease, RNase, usw. zu verhindern. Diese Capping-Gruppen umfassen Hydroxylschutzgruppen, die in der Technik bekannt sind, einschließlich Glykolen wie Polyethylenglykol, Tetraethylenglykol und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die inhibierende Wirkung der Antisense-Nukleinsäure kann unter Verwendung der Transformante der vorliegenden Erfindung, des Genexpressionssystems der vorliegenden Erfindung in vivo und in vitro oder des Translationssystems des Proteins in vivo und in vitro untersucht werden. Die Nukleinsäure kann auf die Zellen durch eine Vielzahl von öffentlich bekannten Verfahren angewendet werden.
Die DNA, die das gegenwärtige Teilpeptid kodiert, kann jede DNA sein, so lange wie sie die Basensequenz enthält, die das oben beschriebene gegenwärtige Teilpeptid kodiert. Die DNA kann ebenso irgendeine von genomischer DNA, genomischer DNA-Bibliothek, cDNA, abgeleitet aus den oben beschriebenen Zellen und Geweben, cDNA-Bibliothek, abgeleitet aus den oben beschriebenen Zellen und Geweben, und synthetischer DNA sein. Der Vektor, der für die Bibliothek verwendet werden soll, kann ein Bakteriophage, Plasmid, Cosmid und Phagemid sein. Die DNA kann ebenso direkt durch Umkehrtranskriptase-Polymerase-Kettenreaktion (hierin nachstehend als RT-PCR abgekürzt) unter Verwendung der mRNA-Fraktion, hergestellt aus den oben beschriebenen Zellen und Geweben, amplifiziert werden.
Speziell kann die DNA, die das gegenwärtige Teilpeptid kodiert, irgendeine von beispielsweise einer DNA, die eine Teilbasensequenz der DNA mit der Basensequenz, die durch SEQ ID NR. 2 oder SEQ ID NR. 3 dargestellt ist, enthält, oder (2) einer DNA sein, die eine Teilbasensequenz der DNA mit einer Basensequenz enthält, die zu der Basensequenz, die durch SEQ ID NR. 2 oder SEQ ID NR. 3 dargestellt ist, unter hochstringenten Bedingungen hybridisierbar ist, und ein Protein kodiert, das eine Aktivität aufweist (z.B. eine Ligandenbindungsaktivität, eine Signaltransduktionsaktivität usw.), die im wesentlichen zu der des gegenwärtigen Proteins äquivalent ist.
Beispiele der DNA, die zu einer DNA, die die Basensequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 2 oder SEQ ID NR. 3 dargestellt ist, unter hochstringenten Bedingungen hybridisierbar ist, umfassen DNAs, die eine Basensequenz mit mindestens etwa 90 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 95 % Homologie und stärker bevorzugt mindestens etwa 98 % Homologie, zu der Basensequenz, die durch SEQ ID NR. 2 oder SEQ ID NR. 3 dargestellt ist, enthalten, usw.
Zum Klonen der DNA, die das Peptid der Erfindung vollständig kodiert, kann die DNA durch PCR unter Verwendung von synthetischen DNA-Primern, die einen Teil der Basensequenz einer DNA enthalten, die das Peptid der Erfindung kodiert, amplifiziert werden, oder die DNA, die in einen geeigneten Vektor eingeführt wird, kann durch Hybridisierung mit einem markierten DNA-Fragment oder synthetischer DNA, die einen Teil oder die vollständige Region des Peptids der Erfindung kodierieren, ausgewählt werden. Die Hybridisierung kann beispielsweise gemäß dem Verfahren durchgeführt werden, daß in Molecular Cloning, 2nd, (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) beschrieben ist. Die Hybridisierung kann ebenso unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen Bibliothek gemäß dem Protokoll, das in den beiliegenden Instruktionen beschrieben ist, durchgeführt werden.
Das Klonen der DNA, die das gegenwärtige Protein oder sein. Teilpeptid vollständig kodiert (hierin nachstehend nur als das gegenwärtige Protein bezeichnet), kann in einer Weise durchgeführt werden, die dem Klonen der DNA, die das Peptid der Erfindung vollständig kodiert, ähnlich ist.
Die Umwandlung der Basensequenz der DNA kann durch öffentlich bekannte Verfahren, wie ODA-LA PCR, das Gapped Duplex-Verfahren oder das Kunkel-Verfahren usw., oder Modifikationen davon, durch PCR oder unter Verwendung von öffentlich bekannten Kits, erhältlich als Mutan^TM-supper Express Km (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan^TM-K (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) oder dergleichen bewirkt werden.
Die geklonte DNA, die das Peptid/Protein kodiert, kann als solches in Abhängigkeit des Zwecks oder, wenn gewünscht, nach der Digestion mit einem Restriktionsenzym oder nach der Addition eines Linkers dazu verwendet werden. Die DNA kann ATG als ein Translationsinitiationscodon an dem 5'-Ende davon tragen und kann außerdem TAA, TGA oder TAG als ein Translationsterminationscodon an dem 3'-Ende davon tragen. Diese Translationsinitiations- und -terminationscodone können ebenso unter Verwendung eines geeigneten synthetischen DNA-Adapters zugefügt werden.
Der Expressionsvektor für das Peptid/Protein kann hergestellt werden, beispielsweise durch (a) Exzidieren des gewünschten DNA-Fragments aus der DNA, die das Peptid/Protein der Erfindung kodiert, und dann (b) Ligieren des DNA-Fragments mit einem geeigneten Expressionsvektor stromabwärts eines Promotors in dem Vektor.
Beispiele des Vektors umfassen Plasmide, abgeleitet von E. Coli (z.B. pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Plasmide, abgeleitet von Bacillus subtilis (z.B. pUB110, pTP5, pC194), Plasmide, abgeleitet von Hefe (z.B. pSH19, pSH15), Bakteriophagen, wie λPhage usw., Tierviren, wie Retrovirus, Vacciniavirus, Baculovirus usw. sowie pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo, pcDNA3.1, pRc/CMV2, pRc/RSV (Invitrogen), usw.
Der Promotor, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann jeder Promotor sein, wenn er mit einem Wirt, der für die Genexpression verwendet werden soll, gut zusammenpaßt. Bei der Verwendung von Tierzellen als Wirt umfassen die Beispiele des Promotors SRα-Promotor, SV40-Promotor, HIV-LTR-Promotor, CMV-Promotor, HSV-TK-Promotor usw.
Unter diesen wird der CMV-Promotor oder SRα-Promotor bevorzugt verwendet. Wenn der Wirt Bakterien der Gattung Escherichia ist, umfassen bevorzugte Beispiele des Promotors trp-Promotor, lac-Promotor, recA-Promotor, λP_L-Promotor, lpp-Promotor usw. Bei der Verwendung von Bakterien der Gattung Bacillus als Wirt sind bevorzugte Beispiele des Promotors SPO1-Promotor, SPO2-Promotor und penP-Promotor. Wenn Hefe als Wirt verwendet wird, sind bevorzugte Beispiele des Promotors PHO5-Promotor, PGK-Promotor, GAP-Promotor und ADH-Promotor. Wenn Insektenzellen als Wirt verwendet werden, umfassen bevorzugte Beispiele des Promotors Polyhedrin-Promoter und P10-Promotor.
Zusätzlich zu den vorhergehenden Beispielen kann der Expressionsvektor außerdem gegebenenfalls einen Enhancer, ein Splicing-Signal, ein Poly-A-Additionssignal, einen Selektionsmarker, SV40-Replikationsstartpunkt (hierin nachstehend manchmal als SV40ori abgekürzt) usw. umfassen. Beispiele des Selektionsmarkers umfassen Dihydrofolatreduktase- (hierin nachstehend manchmal als dhfr abgekürzt) -Gen [Methotrexat-Resistenz (MTX-Resistenz)], Ampicillin-Resistenzgen (hierin manchmal als Amp^r abgekürzt), Neomycin-Resistenzgen (hierin nachstehend manchmal als Neo^r abgekürzt, G418-Resistenz) usw. Insbesondere kann, wenn dhfr-Gen als der Selektionsmarker in CHO-(dhfr)-Zellen verwendet wird, die Selektion ebenso auf Thymidin-freien Medien durchgeführt werden.
Wenn notwendig, wird eine Signalsequenz, die mit einem Wirt zusammenpaßt, zu dem N-Terminus des Proteins der Erfindung zugefügt. Beispiele der Signalsequenz, die verwendet werden kann, sind Pho-A-Signalsequenz, OmpA-Signalsequenz usw. bei der Verwendung von Bakterien der Gattung Escherichia als Wirt; α-Amylase-Signalsequenz, Subtilisin-Signalsequenz, usw. bei der Verwendung von Bakterien der Gattung Bacillus als Wirt; MFa-Signalsequenz, SUC2-Signalsequenz usw. bei der Verwendung von Hefe als Wirt; bzw. Insulin-Signalsequenz, α-Interferon-Signalsequenz, Antikörpermolekül-Signalsequenz usw. bei der Verwendung von Tierzellen als Wirt.
Unter Verwendung des Vektors, der die DNA umfaßt, die das so konstruierte Peptid/Protein der Erfindung kodiert, können Transformanten hergestellt werden.
Beispiele des Wirts, der eingesetzt werden kann, sind Bakterien, die zu der Gattung Escherichia gehören, Bakterien, die zu der Gattung Bacillus gehören, Hefeinsektenzellen, Insekten und Tierzellen usw.
Spezielle Beispiele der Bakterien, die zu der Gattung Escherichia gehören, umfassen Escherichia coli K12 DH1 [Prpc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)), C600 (Genetics, 39, 440 (1954)], usw.
Beispiele der Bakterien, die zu der Gattung Bacillus gehören, umfassen Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)), 207–21 (Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)], usw.
Beispiele von Hefe umfassen Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R^–, NA87-11A, DKD-SD, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris, usw.
Beispiele von Insektenzellen umfassen für den Virus AcNPV Spodoptera-frugiperda-Zellen (Sf-Zellen), MG1-Zellen, abgeleitet vom Mitteldarm von Trichoplusia ni, High Five^TM-Zellen, abgeleitet vom Ei von Trichoplusia ni, Zellen, abgeleitet von Mamestra brassicae, Zellen, abgeleitet von Estigmena acrea, usw.; und für den Virus BmNPV werden Bombyx-mori-N-Zellen (BmN-Zellen), usw. verwendet. Beispiele der Sf-Zelle, die verwendet werden kann, sind Sf9-Zellen (ATCC CRL1711) und Sf21-Zellen (beide Zellen werden in Vaughn, J. L. et al., In Vivo, 13, 213–2l7 (1977), usw. beschrieben).
Als das Insekt kann beispielsweise eine Larve von Bombyx mori usw. verwendet werden [Maeda, et al., Nature, 315, 592 (1985)].
Beispiele von Tierzellen umfassen Affenzellen COS-7, Vero, Zellen vom Chinesischen Hamster CHO (hierin nachstehend als CHO-Zellen bezeichnet), dhfr-Gen-defiziente Zellen vom Chinesischen Hamster CHO (hierin nachstehend einfach als CHO(dhfr^–)-Zelle bezeichnet), Maus-L-Zellen, Maus-AtT-20, Maus-Myelomzellen, Ratten-GH3, Menschen-FL-Zellen, usw.
Bakterien, die zu der Gattung Escherichia gehören, können beispielsweise durch das Verfahren transformiert werden, das in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69, 2110 (1972) oder Gen, 17, 107 (1982), usw. beschrieben ist.
Bakterien, die zu der Gattung Bacillus gehören, können beispielsweise durch das Verfahren transformiert werden, das in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979), usw. beschrieben ist.
Hefe kann beispielsweise durch das Verfahren transformiert werden, das in Enzymology, 194, 182–187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 1929 (1978), usw. beschrieben ist.
Insektenzellen oder Insekten können beispielsweise gemäß dem Verfahren transformiert werden, das in Bio/Technology, 6, 47–55 (1988), usw. beschrieben ist.
Tierzellen können beispielsweise gemäß dem Verfahren transformiert werden, das in Saibo Kogaku (Cell Engineering), Extraausgabe 8, Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol (New Cell Engineering Experimental Protocol), 263–267 (1995), (veröffentlicht von Shujunsha), oder Virology, 52, 456 (1973) beschrieben ist.
Daher kann die Transformante, transformiert mit dem Expressionsvektor, der die DNA umfaßt, die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein kodiert, erhalten werden.
Wenn der Wirt Bakterien sind, die zu der Gattung Escherichia oder der Gattung Bacillus gehören, kann die Transformante geeigneterweise in einem flüssigen Medium inkubiert werden, welches Materialien umfaßt, die für das Wachstum der Transformante erforderlich sind, wie Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Materialien und so weiter. Beispiele der Kohlenstoffquellen umfassen Glukose, Dextrin, lösliche Stärke, Saccharose usw. Beispiele der Stickstoffquellen umfassen anorganische oder organische Materialien, wie Ammoniumsalze, Nitratsalze, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakt, Sojabohnenkuchen, Kartoffelextrakt usw. Beispiele der anorganischen Materialien sind Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat, Magnesiumchlorid usw. Außerdem können Hefe, Vitamine, Wachstumsbeschleunigungsfaktoren usw. ebenso zu dem Medium zugegeben werden. Bevorzugt wird der pH des Mediums auf etwa 5 bis etwa 8 eingestellt.
Ein bevorzugtes Beispiel des Mediums zur Inkubation der Bakterien, die zu der Gattung Escherichia gehören, ist M9-Medium, ergänzt mit Glukose und Casaminosäuren [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431–433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972]. Wenn notwendig, kam eine Chemikalie wie 3β-Indolylacrylsäure zu dem Medium zugegeben werden, wodurch der Promotor effizient aktiviert wird.
Wenn die Bakterien, die zu der Gattung Escherichia gehören, als der Wirt verwendet werden, wird die Transformante normalerweise bei etwa 15 °C bis etwa 43 °C für etwa 3 Stunden bis etwa 24 Stunden kultiviert. Wenn notwendig, kann die Kultur belüftet oder gerührt werden.
Wenn die Bakterien, die zu der Gattung Bacillus gehören, als der Wirt verwendet werden, wird die Transformante im allgemeinen bei etwa 30 °C bis etwa 40 °C für etwa 6 Stunden bis etwa 24 Stunden kultiviert. Wenn notwendig, kann die Kultur belüftet oder gerührt werden.
Wenn Hefe als Wirt verwendet wird, wird die Transformante beispielsweise in Burkholder-Minimalmedium [Bostian, K. L. et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,) 77, 4505 (1980)] oder in SD-Medium, ergänzt mit 0,5 % Casaminosäuren, kultiviert [Bitter, G. A. et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,) 81, 5330 (1984)]. Bevorzugt wird der pH des Mediums auf etwa 5 bis etwa 8 eingestellt. Im allgemeinen wird die Transformante bei etwa 20 °C bis etwa 35 °C für etwa 24 Stunden bis etwa 72 Stunden kultiviert. Wenn notwendig, kann die Kultur belüftet oder gerührt werden.
Wenn Insektenzellen oder Insekten als Wirt verwendet werden, wird die Transformante in Grace-Insektenmedium kultiviert (Grace, T. C. C., Nature, 195, 788 (1962)), zu dem ein geeignetes Additiv, wie immobilisiertes 10%iges Rinderserum, zugegeben wird. Bevorzugt wird der pH des Mediums auf etwa 6,2 bis etwa 6,4 eingestellt. Normalerweise wird die Transformante bei etwa 27 °C für etwa 3 Tage bis etwa 5 Tage kultiviert, und wenn notwendig, kann die Kultur belüftet oder gerührt werden.
Wenn Tierzellen als Wirt eingesetzt werden, wird die Transformante in beispielsweise MEM-Medium, umfassend etwa 5 % bis etwa 20 % fetales Rinderserum, [Science, 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI-1640-Medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 199-Medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], usw. kultiviert. Bevorzugt wird der pH des Mediums auf etwa 6 bis etwa 8 eingestellt. Die Transformante wird normalerweise bei etwa 30 °C bis etwa 40 °C für etwa 15 Stunden bis etwa 60 Stunden kultiviert, und wenn notwendig, kann die Kultur belüftet oder gerührt werden.
Wie oben beschrieben, kann das Peptid/Protein in der Zelle, Zellmembran oder der Außenseite der Transformante usw. hergestellt werden.
Das Peptid/Protein kann von der oben beschriebenen Kultur durch die folgenden Verfahren abgetrennt und gereinigt werden.
Wenn das Peptid/Protein aus der Kultur oder Zellen extrahiert wird, werden nach der Kultivierung die Transformanten oder Zellen durch ein öffentlich bekanntes Verfahren gesammelt und in einem geeigneten Puffer suspendiert. Die Transformaten oder Zellen werden dann durch öffentlich bekannte Verfahren, wie Ultraschallbehandlung, eine Behandlung mit Lysozym und/oder Gefrier-Tau-Kreislauf, gefolgt von Zentrifugation, Filtration usw. gespalten. So kann das rohe Extrakt des Proteins erhalten werden. Der Puffer, der für die Verfahrensweisen verwendet wird, kann einen Proteinmodifikator, wie Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid, oder ein oberflächenaktives Mittel, wie Triton X-100^TM, usw. umfassen. Wenn das Peptid/Protein in der Kultur sekretiert wird, kann nach der Beendigung der Kultivierung der Überstand von den Transformanten oder Zellen abgetrennt werden, um den Überstand durch ein öffentlich bekanntes Verfahren zu sammeln.
Das Peptid/Protein, das in dem so erhaltenen Kulturüberstand oder Extrakt enthalten ist, kann durch geeignetes Kombinieren der öffentlich bekannten Verfahren zur Trennung und Reinigung gereinigt werden. Diese öffentlich bekannten Verfahren zur Trennung und Reinigung umfassen ein Verfahren, das den Unterschied in der Löslichkeit nutzt, wie Aussalzen, Lösungsmittelausfällung usw.; ein Verfahren, das hauptsächlich den Unterschied im Molekulargewicht nutzt, wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese usw.; ein Verfahren, das den Unterschied in der elektrischen Ladung nutzt, wie Ionenaustauschchromatographie usw.; ein Verfahren, das den Unterschied in der spezifischen Affinität nutzt, wie Affinitätschromatographie usw.; ein Verfahren, das den Unterschied in der Hydrophobie nutzt, wie Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie usw.; ein Verfahren, das den Unterschied im isoelektrischen Punkt nutzt, wie isoelektrische Fokussierungselektrophorese; und dergleichen.
Wenn das so erhaltene Peptid/Protein in freier Form vorliegt, kann es in das Salz durch öffentlich bekannte Verfahren oder Modifikationen davon umgewandelt werden. Wenn andererseits das Protein in Form eines Salzes erhalten wird, kann es in die freie Form oder in die Form eines anderen Salzes durch öffentlich bekannte Verfahren oder Modifikationen davon umgewandelt werden.
Das Peptid/Protein, das durch die Rekombinate hergestellt wird, kann vor oder nach der Reinigung mit einem geeigneten Protein-modifizierenden Enzym behandelt werden, so daß das Protein geeignet modifiziert oder teilweise entfernt werden kann. Beispiele des Proteinmodifizierenden Enzyms umfassen Trypsin, Chymotrypsin, Arginylendopeptidase, Proteinkinase, Glykosidase oder dergleichen.
Die Aktivität des so hergestellten Peptids der Erfindung kann durch einen Bindungstest an eine markierte Form des Peptids der Erfindung und des gegenwärtigen Proteins, durch einen Enzymimmunoassay unter Verwendung eines speziellen Antikörpers oder dergleichen bestimmt werden.
Die Aktivität des hergestellten gegenwärtigen Proteins der Erfindung kann durch den Bindungstest an eine markierte Form des Peptids der Erfindung, durch einen Enzymimmunoassay unter Verwendung eines speziellen Antikörpers oder dergleichen bestimmt werden.
Die Antikörper für das Peptid der Erfindung, das gegenwärtige Protein der Erfindung, seine Teilpeptide oder Salze davon können irgendwelche polyklonalen Antikörper und monoklonalen Antikörper sein, so lange wie sie das Peptid der Erfindung, das gegenwärtige Protein der Erfindung, seine Teilpeptide oder Salze davon erkennen können.
Die Antikörper für das Peptid der Erfindung, das gegenwärtige Protein der Erfindung, seine Teilpeptide oder Salze davon (hierin nachstehend manchmal nur als das Peptid/Protein usw. der Erfindung bezeichnet) können durch öffentlich bekannte Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder Antisera unter Verwendung des Peptids/Proteins usw. der Erfindung als Antigene hergestellt werden.
[Herstellung des monoklonalen Antikörpers]
(a) Herstellung von Zellen, die den monoklonalen Antikörper produzieren
Das Peptid/Protein usw. wird den Säugern entweder allein oder zusammen mit Trägern oder Verdünnungsmitteln an der Stelle, wo die Produktion des Antikörpers durch die Verabreichung möglich ist, verabreicht. Um die Antikörperproduktivität bei der Verabreichung zu verstärken, können komplettes Freund-Adjuvans oder inkomplettes Freund-Adjuvans verabreicht werden. Die Verabreichung wird normalerweise einmal aller zwei bis sechs Wochen und zwei- bis zehnmal insgesamt durchgeführt. Beispiele der verwendbaren Säuger sind Affen, Kaninchen, Hunde, Meerschweinchen, Mäuse, Ratten, Schafe und Ziegen, wobei die Verwendung von Mäusen und Ratten bevorzugt ist.
Bei der Herstellung von Zellen, die den monoklonalen Antikörper produzieren, wird ein Warmbluttier, beispielsweise Mäuse, die mit einem Antigen immunisiert sind, wobei auf den Antikörpertiter geachtet wird, ausgewählt, dann wird die Milz oder der Lymphknoten nach zwei bis fünf Tagen nach der letzten Immunisierung gesammelt und die darin enthaltenden Antikörper-produzierenden Zellen werden mit Myelomzellen fusioniert, wodurch Hybridome, die den monoklonalen Antikörper produzieren, erhalten wurden. Die Messung des Antikör pertiters in Antisera kann beispielsweise durch Umsetzen eines markierten Peptids/Proteins, das später beschrieben wird, mit dem Antiserum, gefolgt von Analysieren der Bindungsaktivität des Markierungsmittels, das an den Antikörper bindet, durchgeführt werden. Die Fusionierung kann beispielsweise durch das bekannte Verfahren von Koehler und Milstein [Nature, 256, 495, (1975)] durchgeführt werden. Beispiele des Fusionsbeschleunigers sind Polyethylenglykol (PEG), Sendai-Virus usw., wobei PEG bevorzugt eingesetzt wird.
Beispiele der Myelomzellen sind gesammeltes NS-1, P3U1, SP2/0 usw. Insbesondere wird P3U1 bevorzugt eingesetzt. Ein bevorzugtes Verhältnis der Zahl der verwendeten Antikörperproduzierenden Zellen (Milzzellen) zu der Zahl der Myelomzellen liegt innerhalb eines Bereiches von ungefähr 1 : 1 bis 20 : 1. Wenn PEG (bevorzugt PEG 1000 bis PEG 6000) in einer Konzentration von ungefähr 10 bis 80 % zugegeben wird, gefolgt von Inkubieren bei etwa 20 bis 40 °C, bevorzugt bei 30 bis 37 °C für etwa 1 bis 10 Minuten, kann eine effiziente Zellfusion durchgeführt werden.
Verschiedene Verfahren können zum Screenen eines Hybridoms, das den monoklonalen Antikörper produziert, verwendet werden. Beispiele von solchen Verfahren umfassen ein Verfahren, umfassend das Zugeben des Überstandes von Hybridom zu einer festen Phase (beispielsweise Mikroplatte), an der das Peptid/Protein usw. der Erfindung als ein Antigen direkt oder zusammen mit einem Träger adsorbiert ist, Zugeben eines Anti-Immunoglobulin-Antikörpers (wenn Mauszellen für die Zellfusion verwendet werden, wird Anti-Maus-Immunoglobulin-Antikörper verwendet), markiert mit einer radioaktiven Substanz oder einem Enzym oder Protein A, und Detektieren des monoklonalen Antikörpers, der an die feste Phase gebunden ist, und ein Verfahren, umfassend das Zugeben des Uberstandes von Hybridom zu einer festen Phase, an der ein Anti-Immunoglobulin-Antikörper oder Protein A adsorbiert ist, Zugeben des Peptids/Proteins usw., markiert mit einer radioaktiven Substanz oder einem Enzym, und Detektieren des monoklonalen Antikörpers, der an die feste Phase gebunden ist.
Der monoklonale Antikörper kann gemäß öffentlich bekannten Verfahren oder ihren Modifikationen ausgewählt werden. Im allgemeinen kann die Selektion in einem Medium für Tierzellen, ergänzt mit HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin), bewirkt werden. Jedes Selektions- und Wachstumsmedium kann eingesetzt werden, insofern das Hybridom dort wachsen kann. Beispielsweise kann RPMI-1640-Medium, umfassend 1 % bis 20 %, bevorzugt 10 % bis 20 % fetales Rinderserum, GIT-Medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), umfassend 1 % bis 10 % fetales Rinderserum, ein serumfreies Medium zur Kultivierung eines Hybridoms (SFM-101, Nissui Seiyaku Co., Ltd.) und dergleichen für das Selektions- und Wachstumsmedium verwendet werden. Die Kultivierung wird im allgemeinen bei 20 °C bis 40 °C, bevorzugt bei 37 °C, für etwa 5 Tage bis etwa 3 Wochen, bevorzugt 1 bis 2 Wochen, normalerweise in 5 % CO₂ durchgeführt. Der Antikörpertiter des Kulturüberstandes eines Hybridoms kann wie in dem oben beschriebenen Assay für den Antikörpertiter in Antisera bestimmt werden.
(b) Reinigung des monoklonalen Antikörpers
Trennung und Reinigung eines monoklonalen Antikörpers kann durch konventionelle Verfahren durchgeführt werden, wie Trennungs- und Reinigungsverfahren des polyklonalen Antikörpers, wie Trennung und Reinigung von Immunoglobulinen [beispielsweise Aussalzen, Alkoholausfällung, isoelektrische Punktausfällung, Elektrophorese, Adsorption und Desorption mit Ionenaustauschern (z.B. DEAE), Ultrazentrifugation, Gelfiltration oder ein spezifisches Reinigungsverfahren, welches nur das Sammeln eines Antikörpers mit einem aktivierten Adsorptionsmittel, wie eine Antigen-Bindungsfestphase, Protein A oder Protein G, und Dissoziieren der Bindung, um den Antikörper zu erhalten, umfaßt].
[Herstellung des polyklonalen Antikörpers]
Der polyklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung kann durch öffentlich bekannte Verfahren oder Modifikationen davon hergestellt werden. Beispielsweise wird ein Säuger mit einem Immunogen (das Peptid/Protein usw. der Erfindung als ein Antigen) per se immunisiert, oder ein Komplex aus Immunogen und einem Trägerprotein wird gebildet und ein Warmbluttier wird mit dem Komplex in einer ähnlichen Weist zu dem oben beschriebenen Verfahren für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern immunisiert. Das Produkt, das den Antikörper für das Peptid/Protein usw. der Erfindung umfaßt, wird aus dem immunisierten Tier gesammelt, gefolgt von Trennung und Reinigung des Antikörpers.
In dem Komplex aus Immunogen und Trägerprotein, der verwendet wird, um einen Säuger zu immunisieren, kann der Typ des Trägerproteins und das Mischverhältnis von Träger zu Hap ten jeder Typ und jedes Verhältnis sein, so lange wie der Antikörper effizient für das Hapten, das durch Vernetzen mit dem Träger immunisiert wird, produziert wird. Beispielsweise wird Rinderserumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Schlüssellochlimpethemocyanin usw. mit dem Hapten in einem Träger-zu-Hapten-Gewichtsverhältnis von ungefähr 0,1 bis 20, bevorzugt etwa 1 bis etwa 5 verknüpft.
Eine Vielzahl von Kondensationsmitteln kann zum Verknüpfen von Träger mit Hapten verwendet werden. Glutaraldehyd-, Carbodiimid-, Maleimid-aktivierter Ester und aktivierte Esterreagenzien, umfassend eine Thiolgruppe oder Dithiopyridylgruppe, werden zum Verknüpfen verwendet.
Das Kondensationsprodukt wird den Warmbluttieren entweder allein oder zusammen mit Trägern oder Verdünnungsmitteln an der Stelle, die den Antikörper durch Verabreichung produzieren kann, verabreicht. Um die Antikörperproduktivität bei der Verabreichung zu verstärken, kann komplettes Freund-Adjuvans oder inkomplettes Freund-Adjuvans verabreicht werden. Die Verabreichung wird normalerweise aller 2 bis 6 Wochen und 3 bis 10 Mal insgesamt durchgeführt.
Der polyklonale Antikörper kann aus Blut, Aszites usw., bevorzugt aus dem Blut des Säugers, der durch das oben beschriebene Verfahren immunisiert wird, gesammelt werden.
Der Titer des polyklonalen Antikörpers in Antiserum kann durch dieselbe Verfahrensweise wie die zur Bestimmung des oben beschriebenen Serumantikörpertiters analysiert werden. Die Trennung und Reinigung des polyklonalen Antikörpers kann durchgeführt werden, indem dem Verfahren zur Trennung und Reinigung von Immunoglobulinen, das wie bei der Trennung und Reinigung von hierin zuvor beschriebenen monoklonalen Antikörpern durchgeführt wird, gefolgt wird.
Das Peptid der Erfindung, die DNA, die das Peptid der Erfindung kodiert (hierin nachstehend manchmal nur als die erfindungsgemäße DNA bezeichnet), und der Antikörper für das Peptid der Erfindung (hierin nachstehend manchmal nur als der erfindungsgemäße Antikörper bezeichnet) sind nützlich zum Implementieren (1) von Mitteln für die Vorbeugung/Behandlung von verschiedenen Krankheiten, die mit dem Protein der Erfindung verbunden sind; (2) Screenen einer Verbindung oder ihres Salzes, die die Bindungseigenschaft des Peptids der Erfindung an das Protein der Erfindung verändert; (3) Quantifikation des Peptids der Erfindung oder seines Salzes; (4) Gendiagnose; (5) Arzneimittel, umfassend die Antisense-DNA; (6) Arzneimittel, umfassend den Antikörper der Erfindung; (7) Präparieren nicht-menschlicher Tiere, die die erfindungsgemäße DNA tragen; (8) Arzneimitteldesign, basierend auf dem Vergleich zwischen Liganden und Rezeptoren, die strukturell analog sind, usw.
Das Peptid der Erfindung, die erfindungsgemäße DNA und der erfindungsgemäße Antikörper werden speziell in bezug auf ihre Anwendungen nachstehend beschrieben.
(1) Therapeutika/Präventivmittel für Krankheiten, mit denen das Peptid der Erfindung verbunden ist
Wie hierin nachstehend beschrieben wird, ist klar geworden, daß das Peptid der Erfindung ein Ligand für das Protein der Erfindung ist (G-Protein-gekoppelter Rezeptor), da das Peptid der Erfindung als ein humoraler Faktor in vivo vorliegt und das Protein der Erfindung aktiviert, um die intrazelluläre Ca²⁺-Ionenkonzentration in der Zelle zu erhöhen, in der das Protein der Erfindung exprimiert worden ist.
Ebenso wird erkannt, daß das Peptid der Erfindung etwa 56 % Homologie zu Schlangengift Mamba Intestinal Toxin 1 (manchmal als MIT1 abgekürzt; SEQ ID NR. 34; Toxicon, 28, 847–856, 1990; FEBS Letters, 461, 183–188, 1999) auf einem Aminosäureniveau aufweist.
Es wurde berichtet, daß MIT1 die Kontraktion im Krummdarm oder distalen Dickdarm oder Relaxation im proximalen Dickdarm induziert, und sein Grad war so wirksam wie vergleichbar mit 40 mM Kaliumchlorid (FEBS Letters, 461, 183–188, 1999). Jedoch wurde die Stelle oder der Mechanismus seiner Wirkung nicht gelöst. Die betreffenden Erfinder klärten, daß die Wirkung von MIT1 ebenso durch das Protein der Erfindung vermittelt wurde.
Im Hinblick auf das Vorhergehende weist das Peptid der Erfindung eine Aktivität zum Induzieren der Kontraktion oder Relaxation der gesamten Darmtrakte auf, um die Darmtraktmotilität (Verdauungsaktivität) usw. zu kontrollieren (z.B. später beschriebenes BEISPIEL 11). Wenn daher die DNA usw. der Erfindung fehlt oder wenn ihr Expressionsniveau abnormal verringert wird, entwickeln sich verschiedene Krankheiten, wie Verdauungsstörungen (z.B. Enteritis, Verstopfung, Malabsorptionssyndrom usw.).
Folglich kann das Peptid der Erfindung oder die DNA der Erfindung als Arzneimittel für die Behandlung oder Vorbeugung usw. von verschiedenen Krankheiten verwendet werden, einschließlich Verdauungsstörungen (z.B. Enteritis, Verstopfung, Malabsorptionssyndrome usw.) oder dergleichen.
Wenn ein Patient ein verringertes Niveau an dem Peptid der Erfindung in seinem Körper aufweist oder es ihm daran dort mangelt, so daß die Signaltransduktion nicht vollständig oder normal in den Zellen, in denen das Protein der Erfindung exprimiert wird, ausgeübt wird, kann das Peptid der Erfindung seine Rolle ausreichend oder geeignet für den Patient bereitstellen, (a) durch Verabreichen der erfindungsgemäßen DNA an den Patienten, um das Peptid der Erfindung in dem Körper zu exprimieren, (b) durch. Einführen der erfindungsgemäßen DNA in eine Zelle, die das Peptid der Erfindung exprimiert, und dann Transplantieren der Zellen in den Patienten, oder (c) durch Verabreichen des Peptids der Erfindung an den Patienten, oder dergleichen.
Wenn die erfindungsgemäße DNA als die oben beschriebenen Präventivmittel/Therapeutika verwendet werden, wird die DNA selbst an den Menschen oder ein anderes Warmbluttier verabreicht; oder die DNA wird in einen geeigneten Vektor, wie Retrovirusvektor, Adenovirusvektor, Adenovirus-assoziierter Virusvektor usw., eingeführt und dann an den Menschen oder ein anderes Warmbluttier in einer konventionellen Weise verabreicht. Die erfindungsgemäße DNA kann ebenso als eine intakte DNA verabreicht werden; oder die DNA kann zu einer pharmazeutische Zusammensetzung mit physiologisch akzeptablen Trägern, wie Hilfsmitteln usw., hergestellt werden, um ihre Aufnahme zu beschleunigen, und die Zusammensetzung kann durch Genkanone oder durch einen Katheter, wie einen Katheter mit einem Hydrogel, verabreicht werden.
Wenn das Peptid der Erfindung als die zuvor genannten Therapeutika/Präventivmittel verwendet wird, wird das Peptid vorteilhafterweise auf einem Reinheitsniveau von mindestens 90 %, bevorzugt mindestens 95 %, stärker bevorzugt mindestens 98 % und am stärksten bevorzugt mindestens 99 % verwendet.
Das Peptid der Erfindung kann oral, beispielsweise in Form von Tabletten, die nach Bedarf zuckerüberzogen sein können, Kapseln, Elixieren, Mikrokapseln usw., oder parenteral in Form von. Injektionspräparaten, wie einer sterilen Lösung und einer Suspension in Wasser oder mit einer anderen pharmazeutisch akzeptablen Flüssigkeit, verwendet werden. Diese Präparate können durch Mischen des Peptids der Erfindung mit einem physiologisch akzeptablen bekannten Träger, einem Aromastoff einem Trägerstoff, einem Vehikel, einem Antiseptikum, einem Stabilisator, einem Bindemittel usw. in einer Einheitsdosierungsform hergestellt werden, die in einer allgemein akzeptierten Weise erforderlich ist, die auf die Herstellung von pharmazeutischen Präparaten angewendet wird. Der Wirkstoff in dem Präparat wird in einer solchen Dosis kontrolliert, daß eine geeignete Dosis innerhalb des angegebenen spezifizierten Bereiches erhalten wird.
Additive, die mit Tabletten, Kapseln usw. mischbar sind, umfassen ein Bindmittel, wie Gelatine, Maisstärke, Tragant und Gummiarabikum, einen Trägerstoff, wie kristalline Cellulose, ein Quellungsmittel, wie Maisstärke, Gelatine, Alginsäure usw., ein Schmiermittel, wie Magnesiumstearat, ein Süßungsstoff, wie Saccharose, Lactose und Saccharin, und einen Geschmacksstoff, wie Pfefferminze, Akamonoöl oder Kirsche usw. Wenn die Einheitsdosierungen in der Form von Kapseln vorliegen, können flüssige Träger wie Öle und Fette außerdem zusammen mit den oben beschriebenen Additiven verwendet werden. Eine sterile Zusammensetzung zur Injektion kann gemäß einer konventionellen Weise formuliert werden, die verwendet wird, um pharmazeutische Zusammensetzungen herzustellen, beispielsweise durch Lösen oder Suspendieren der Wirkstoffe in einem Vehikel, wie Wasser zur Injektion mit einem natürlich vorkommenden Pflanzenöl, wie Sesamöl und Kokosnußöl usw., um die pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen.
Beispiele eines wässerigen Mediums zur Injektion umfassen physiologische Kochsalzlösung und eine isotonische Lösung, die Glukose und andere Hilfsmittel enthält (z.B. D-Sorbitol, D-Mannitol, Natriumchlorid usw.), und kann in Kombination mit einem geeigneten Auflösungshilfsmittel, wie einem Alkohol (z.B. Ethanol oder dergleichen), einem Polyalkohol (z.B. Propylenglykol und Polyethylenglykol), einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel (z.B. Polysorbate 80^TM, HCO-50 usw.) oder dergleichen verwendet werden. Beispiele des öligen Mediums umfassen Sesamöl und Sojabohnenöl, das ebenso in Kombination mit einem Auflösungshilfsmittel wie Benzylbenzoat und Benzylalkohol verwendet werden kann. Sie können außerdem mit einem Puffer (z.B. Phosphatpuffer, Natriumacetatpuffer usw.), einem Desinfektionsmittel (z.B. Benzalkoniumchlorid, Prokainhydrochlorid usw.), einem Stabilisator (z.B. menschliches Serumalbumin, Polyethylenglykol usw.), einem Konservierungsmittel (z.B. Benzylalkohol, Phenol usw.), einem Antioxidationsmittel usw. formuliert werden. Die so hergestellte Flüssigkeit zur Injektion wird normalerweise in eine geeignete Ampulle gefüllt.
Der Vektor, in den die erfindungsgemäße DNA eingeführt wird, kann ebenso zu pharmazeutischen Präparaten in einer Weise hergestellt werden, die den obigen Verfahrensweisen ähnlich ist. Diese Präparate werden im allgemeinen parenteral verwendet.
Da das so erhaltene pharmazeutische Präparat sicher und gering toxisch ist, kann das Präparat an den Säuger verabreicht werden (z.B. Mensch, Ratte, Maus, Meerschweinchen, Kaninchen, Schaf, Schwein, Rind, Pferd, Katze, Hund, Affe usw.).
Die Dosis des Peptids der Erfindung variiert in Abhängigkeit der Zielkrankheit, des Patienten, an den sie verabreicht werden soll, der Verabreichungsweise usw.; beispielsweise beträgt bei der oralen Verabreichung des Peptids der Erfindung für die Behandlung einer Verdauungsstörung die Dosis normalerweise etwa 1 mg bis etwa 1000 mg, bevorzugt etwa 10 bis etwa 500 mg, und stärker bevorzugt etwa 10 bis etwa 200 mg pro Tag für Erwachsene (bei 60 kg Körpergewicht). Bei der parenteralen Verabreichung variiert die Einzeldosis in Abhängigkeit des Patienten, an den sie verabreicht werden soll, der Zielkrankheit usw., aber es ist für die Behandlung einer Verdauungsstörung vorteilhaft, den Wirkstoff intravenös bei einer täglichen Dosis von etwa 1 bis etwa 1000 mg, bevorzugt etwa 1 bis etwa 200 mg, und stärker bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 mg für Erwachsene (bei 60 kg Körpergewicht) zu verabreichen. Für andere Tierspezies kann die entsprechende Dosis, auf 60 kg Körpergewicht umgerechnet, verabreicht werden.
(2) Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den erfindungsgemäßen Antikörper
Der Antikörper der Erfindung mit der Wirkung, das Peptid der Erfindung zu neutralisieren, kann als Präventivmittel/Therapeutika für Krankheiten verwendet werden, die mit der Übe rexprimierung des Peptids der Erfindung verbunden sind (beispielsweise Verdauungsstörungen (z.B. Enteritis, Durchfall, Verstopfung, Malabsorptionssyndrom usw.)).
Das Therapeutika/Präventivmittel für die oben beschriebenen Krankheiten, umfassend den Antikörper der Erfindung, können an den Menschen oder ein anderes Warmbluttier (z.B. Ratte, Kaninchen, Schaf, Schwein, Rind, Katze, Hund, Affe usw.) direkt als ein flüssiges Präparat oder als eine pharmazeutische Zusammensetzung in einer geeigneten Präparatform oral oder parenteral verabreicht werden. Die Dosis variiert in Abhängigkeit des Patienten, an den sie verabreicht werden soll, der Zielkrankheit, den Zuständen, der Verabreichungsweise usw.; wenn sie für die Behandlung/Vorbeugung des erwachsenen Patienten mit beispielsweise Verdauungsstörung verwendet wird, wird der Antikörper der Erfindung vorteilhaft an den Patienten durch intravenöse Injektion verabreicht, normalerweise in einer Einzeldosis von ungefähr 0,01 bis 20 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht, und stärker bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 5 mg/kg Körpergewicht, ungefähr ein- bis fünfmal, bevorzugt ungefäh ein- bis dreimal pro Tag. Für die andere parenterale Verabreichung und orale Verabreichung kann die entsprechende Dosis verabreicht werden. Wenn die Zustände sehr ernst sind, kann die Dosis in Abhängigkeit der Zustände erhöht werden.
Der Antikörper der Erfindung kann direkt als solcher oder in Form einer geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung, die für die oben beschriebene Verabreichung verwendet wird, enthält einen pharmakologisch akzeptablen Träger mit den zuvor genannten Verbindungen oder Salzen davon, ein Verdünnungsmittel oder Trägerstoff. Eine solche Zusammensetzung wird in dem Präparat, das zur oralen oder parenteralen Verabreichung geeignet ist, bereitgestellt.
Das heißt, Beispiele der Zusammensetzung zur oralen Verabreichung umfassen feste oder flüssige Präparate, speziell Tabletten (einschließlich Dragees und Tabletten in Filmhüllenform), Pillen, Granulate, pulverförmige Präparate, Kapseln (einschließlich weiche Kapseln), Sirup, Emulsionen, Suspensionen usw. Eine solche Zusammensetzung wird durch öffentlich bekannte Verfahren hergestellt und enthält ein Vehikel, ein Verdünnungsmittel oder einen Trägerstoff der konventionell in dem Bereich der pharmazeutischen Präparate verwendet wird. Beispiele des Vehikels oder Trägerstoffes für Tabletten sind Lactose, Stärke, Saccharose, Magnesiumstearat usw.
Beispiele der Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung, die verwendet werden kann, sind Injektionen, Zäpfchen usw., und die Injektionen umfassen die Form von intravenösen, subkutanen, transkutanen, intramuskulären und Tropfinjektionen usw. Diese Injektionen werden durch öffentlich bekannte Verfahren hergestellt, beispielsweise durch Lösen, Suspendieren oder Emulgieren des zuvor genannten Antikörpers oder seiner Salze in einem sterilen wässerigen oder öligen flüssigen Medium. Für das wässerige Medium zur Injektion werden beispielsweise physiologische Kochsalzlösung und isotonische Lösungen, die Glukose und anderes Hilfsmittel enthalten., usw. verwendet. Geeignete Auflösungshilfsmittel, beispielsweise Alkohol (z.B. Ethanol), Polyalkohol (z.B. Propylenglykol oder Polyethylenglykol), nicht-ionische oberflächenaktive Mittel [z.B. Polysorbat 80, HCO-50 (Polyoxyethylenaddukt (50 mol) von hydriertem Rizinusöl)] können in Kombination verwendet werden. Für die ölige Lösung werden beispielsweise Sesamöl, Sojabohnenöl und dergleichen verwendet, und Auflösungshilfsmittel, wie Benzylbenzoat, Benzylalkohol usw. können in Kombination verwendet werden. Die so hergestellte Flüssigkeit zur Injektion wird normalerweise in eine geeignete Ampulle gefüllt. Das Zäpfchen, das zur rektalen Verabreichung verwendet wird, wird durch Mischen des zuvor genannten Antikörpers oder seiner Salze mit konventionellen Zäpfchengrundlagen hergestellt.
Die oben beschriebene orale oder parenterale pharmazeutische Zusammensetzung wird vorteilhaft in einer Einheitsdosierungsform hergestellt, die für die Dosis des Wirkstoffes geeignet ist. Beispiele einer solchen Einheitsdosierungsform umfassen Tabletten, Pillen, Kapseln, Injektionen (Ampullen), Zäpfchen usw. Es ist bevorzugt, daß der oben beschriebene Antikörper im allgemeinen in einer Dosis von 5 bis 500 mg pro Einheitsdosierungsform, 5 bis 100 mg speziell für Injektionen und 10 bis 250 mg für andere Präparate enthalten ist.
Jede oben beschriebene Zusammensetzung kann außerdem andere aktive Komponenten enthalten, wenn die Formulierung mit dem Antikörper keine nachteilige Interaktion hervorruft.
(3) Präparieren von nicht-menschlichen Tieren, die die erfindungsgemäße DNA tragen.
Unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA können nicht-menschliche transgene Tiere, die das Protein usw. der Erfindung exprimieren, präpariert werden. Beispiele der nicht- menschlichen Tiere umfassen Säuger (beispielsweise Ratten, Mäuse, Kaninchen, Schafe, Schweine, Rinder, Katzen, Hunde, Affen usw.) (hierein nachstehend nur als Tiere bezeichnet), wobei Mäuse und Kaninchen besonders geeignet sind.
Um die erfindungsgemäße DNA auf das Zieltier zu übertragen, ist es im allgemeinen vorteilhaft, die DNA in einem Genkonstrukt zu verwenden, das stromabwärts eines Promotors ligiert wird, der die DNA in Tierzellen exprimieren kann. Wenn beispielsweise die erfindungsgemäße DNA, die von Kaninchen abgeleitet ist, übertragen wird, wird beispielsweise das Genkonstrukt, in dem die DNA stromabwärts eines Promotors ligiert wird, der die erfindungsgemäße DNA, abgeleitet von Tieren, exprimieren kann, umfassend die erfindungsgemäße DNA, die stark zu der Kaninchen-abgeleiteten DNA homolog ist, in befruchtete Kanincheneizellen mikroinjiziert; daher kann das DNA-übertragene Tier, das ein hohes Niveau des Proteins usw. der Erfindung produzieren kann, hergestellt werden. Beispiele der Promotoren, die nutzbar sind, umfassen Virus-abgeleitete Promotoren und ubiquitäre Expressionspromotoren, wie ein Metallothioneinpromotor, aber Promotoren von NGF-Gen und Enolase, die speziell in dem Gehirn exprimiert werden, werden bevorzugt verwendet.
Die Übertragung der erfindungsgemäßen DNA im Stadium der befruchteten Eizelle sichert die Gegenwart der DNA in allen Keim- und Somazellen in dem produzierten Tier. Die Gegenwart des Proteins usw. der Erfindung in den Keimzellen in dem DNA-übertragenen Tier bedeutet, daß alle Keim- und Somazellen das Protein usw. der Erfindung in allen Nachkommen des Tiers umfassen. Die Nachkommen des Tieres, die das Gen übernehmen, umfassen das Protein usw. der Erfindung in allen Keim- und Somazellen.
Die DNA-übertragenen Tiere der vorliegenden Erfindung können in der konventionellen Umgebung gehalten und als Tiere, die die DNA nach dem Bestätigen der stabilen Retention des Gens in den Tieren durch Paarung tragen, fortgepflanzt werden. Außerdem führt die Paarung von männlichen und weiblichen Tieren, die die Ziel-DNA umfassen, zum Erhalt homozygoter Tiere mit dem übertragenen Gen auf beiden homologen Chromosomen. Durch Paarung der männlichen und weiblichen Homozygoten kann die Fortpflanzung so durchgeführt werden, daß alle Nachkommen die DNA umfassen.
Da das Protein usw. der Erfindung stark in den Tieren exprimiert wird, bei denen die erfindungsgemäße DNA übertragen worden ist, sind die Tiere zum Screenen von Agonisten oder Antagonisten zu dem Protein usw. der Erfindung nützlich.
Die Tiere, bei denen die erfindungsgemäße DNA übertragen worden ist, können ebenso als Zellquellen für Gewebekultur verwendet werden. Das Protein usw. der Erfindung kann durch beispielsweise direktes Analysieren der DNA oder RNA in Geweben aus der Maus, in die die erfindungsgemäße DNA übertragen worden ist, oder durch Analysieren von Geweben, die das Protein umfassen, welches aus dem Gen exprimiert wird, analysiert werden. Zellen aus den Geweben, die das Protein usw. der Erfindung umfassen, werden durch die Standardgewebekulturtechnik kultiviert. Unter Verwendung dieser Zellen kann beispielsweise die Funktion von Gewebezellen, wie Zellen, die aus dem Gehirn oder pheripheren Geweben abgeleitet sind, die im allgemeinen schwer zu kultivieren sind, untersucht werden. Unter Verwendung dieser Zellen ist es beispielsweise möglich, Pharmazeutika auszuwählen, die verschiedene Gewebefunktionen erhöhen. Wenn eine stark exprimierende Zellinie erhältlich ist, kann das Protein usw. der Erfindung aus der Zellinie isoliert und gereinigt werden.
In der Beschreibung und den Zeichnungen werden die Codes von Basen und Aminosäuren durch Abkürzungen gezeigt, und in diesem Fall werden sie gemäß der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature oder durch übliche Codes in der Technik angegeben, Beispiele von denen werden nachstehend gezeigt. Bei Aminosäuren, die ein optisches Isomer aufweisen können, liegt die L-Form vor, wenn nicht anders angegeben.

DNA:: Deoxyribonukleinsäure
cDNA:: komplementäre Deoxyribonukleinsäure
A:: Adenin
T:: Thymin
G:: Guanin
C:: Cytosin
Y:: Thymin oder Cytosin
N:: Thymin, Cytosin, Adenin oder Guanin
R:: Adenin oder Guanin
M:: Cytosin oder Adenin
W:: Thymin oder Adenin
S:: Cytosin oder Guanin
RNA:: Ribonukleinsäure
mRNA:: Messenger-Ribonukleinsäure
dATP:: Deoxyadenosintriphosphat
dTTP:: Deoxythymidintriphosphat
dGTP:: Deoxyguanosintriphosphat
dCTP:: Deoxycytidintriphosphat
ATP:: Adenosintriphosphat
Gly oder G:: Glycin
Ala oder A:: Alanin
Val oder V:: Valin
Leu oder L:: Leucin
Ile oder I:: Isoleucin
Ser oder S:: Serin
Thr oder T:: Threonin
Cys oder C:: Cystein
Met oder M:: Methionin
Glu oder E:: Glutaminsäure
Asp oder D:: Asparaginsäure
Lys oder K:: Lysin
Arg oder R:: Arginin
His oder H:: Histidin
Phe oder F:: Phenylalanin
Tyr oder Y:: Tyrosin
Trp oder W:: Tryptophan
Pro oder P:: Prolin
Asn oder N:: Asparagin
Gln oder Q:: Glutamin
pGlu:: Pyroglutaminsäure
Xaa:: nicht identifizierter Aminosäurerest

Ebenso werden die Substituenten, Schutzgruppen, Reagenzien usw., die häufig in der Beschreibung benutzt werden, durch die folgenden Symbole dargestellt.

Me:: Methylgruppe
Et:: Ethylgruppe
Bu:: Butylgruppe
Ph:: Phenylgruppe
TC:: Thiazolidin-4(R)-Carboxamidgruppe
Bom:: Benzyloxymethyl
Bzl:: Benzyl
Z:: Benzyloxycarbonyl
Br-Z:: 2-Brombenzyloxycarbonyl
Cl-Z:: 2-Chlorbenzyloxycarbonyl
Cl₂Bzl:: 2,6-Dichlorbenzyl
Boc:: t-Butyloxycarbonyl
HOBt:: 1-Hydroxybenztriazol
HOOBt:: 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin
PAM:: Phenylacetamidomethyl
Tos:: p-Toluolsulfonyl
Fmoc:: N-9-Fluorenylmethoxycarbonyl
DNP:: Dinitrophenyl
Bum:: tert-Butoxymethyl
Trt:: Trityl
Bom:: Benzyloxymethyl
Z:: Benzyloxycarbonyl
MeBzl:: 4-Methylbenzyl
DCC:: N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
HONB:: 1-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboxyimid
NMP:: N-Methylpyrrolidon
HONB:: N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboxyimid
NMP:: N-Methylpyrrolidon
TFA:: Trifluoressigsäure
CHAPS:: 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat
PMSF:: Phenylmethylsulfonylfluorid
GDP:: Guanosin-5'-diphosphat
Fura-2AM:: Pentacetoxymethyl-1-[6-amino-2-(5-carboxy-2-oxazolyl)-5-benzofuranyloxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxyl)-ethan-N,N,N',N'-tetraacetat
Fluo-3AM:: Pentacetoxymethyl-1-[2-amino-5-(2,7-dichlor-6-hydroxy-3-oxy-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)-ethan-N,N,N',N'-tetraacetat
HEPES:: 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethansulfonsäure
EDTA:: Ethylendiamintetraessigsäure
SDS:: Natriumdodecylsulfat
BSA:: Rinderserumalbumin
HBSS:: Hanks-Mineralsalzmedium
EIA:: Enzymimmunoassay

Die Sequenzidentifikationsnummern in dem Sequenzprotokoll der Beschreibung geben die folgenden Sequenzen an.
[SEQ ID NR. 1]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz des Proteins der Erfindung, abgeleitet von menschlichem Gehirn.
[SEQ ID NR. 2]
Diese zeigt die Basensequenz der DNA, die das Protein der Erfindung kodiert, abgeleitet von menschlichem Gehirn, enthaltend die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 1 dargestellt ist (ZAQC).
[SEQ ID NR. 3]
Diese zeigt die Basensequenz der DNA, die das Protein der Erfindung kodiert, abgeleitet von menschlichem Gehirn, enthaltend die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 1 dargestellt ist (ZAQT).
[SEQ ID NR. 4]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers 1, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 1.
[SEQ ID NR. 5]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers 2, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 1.
[SEQ ID NR. 6]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers 3, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 2.
[SEQ ID NR. 7]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers 4, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 2.
[SEQ ID NR. 8]
Diese zeigt die Basensequenz der ZAQ-Sonde, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 2.
[SEQ ID NR. 9]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers ZAQC Sal, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 2.
[SEQ ID NR. 10]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers ZAQC Spe, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 2.
[SEQ ID NR. 11]
Diese zeigt die N-terminale Aminosäuresequenz von ZAQ-aktiviertem Peptid, gereinigt in dem später beschriebenen BEISPIEL 3 (3-8).
[SEQ ID NR. 12]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers ZF1, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 4.
[SEQ ID NR. 13]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers ZF2, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 4.
[SEQ ID NR. 14]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers ZF3, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 4.
[SEQ ID NR. 15]
Diese zeigt die 3'-terminate Basensequenz der DNA, die das menschentypische ZAQ-Ligandenpeptid kodiert, das in dem später beschriebenen BEISPIEL 4 erworben wurde.
[SEQ ID NR. 16]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers ZAQL-CF, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 4.
[SEQ ID NR. 17]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers ZAQAL-XR1, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 4.
[SEQ ID NR. 18]
Diese zeigt die Basensequenz des DNA-Fragmentes, erhalten in dem später beschriebenen BEISPIEL 4.
[SEQ ID NR. 19]
Diese zeigt die Basensequenz des DNA-Fragmentes, erhalten in dem später beschriebenen BEISPIEL 4.
[SEQ ID NR. 20]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz des menschentypischen reifen ZAQ-Ligandenpeptids.
[SEQ ID NR. 2l]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz des menschentypischen reifen ZAQ-Ligandenpeptids.
[SEQ ID NR. 22]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz des menschentypischen ZAQ-Ligandenpräkursorpeptids.
[SEQ ID NR. 23]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz des menschentypischen ZAQ-Ligandenpräkursorpeptids.
[SEQ ID NR. 24]
Diese zeigt die Basensequenz der DNA, die die DNA enthält, die das menschentypische ZAQ-Ligandenpräkursorpeptid kodiert, das durch SEQ ID NR. 28 dargestellt ist.
[SEQ ID NR. 25]
Diese zeigt die Basensequenz der DNA, die die DNA enthält, die das menschentypische ZAQ-Ligandenpräkursorpeptid kodiert, das durch SEQ ID NR. 29 dargestellt ist.
[SEQ ID NR. 26]
Diese zeigt die Basensequenz der DNA, die das menschentypische reife ZAQ-Ligandenpeptid kodiert, das durch SEQ ID NR. 20 dargestellt ist.
[SEQ ID NR. 27]
Diese zeigt die Basensequenz der DNA, die das menschentypische reife ZAQ-Ligandenpeptid kodiert, das durch SEQ ID NR. 21 dargestellt ist.
[SEQ ID NR. 28]
Diese zeigt die Basensequenz der DNA, die das menschentypische ZAQ-Ligandenpräkursorpeptid kodiert, das durch SEQ ID NR. 22 dargestellt ist.
[SEQ ID NR. 29]
Diese zeigt die Basensequenz der DNA, die das menschentypische ZAQ-Ligandenpräkursorpeptid kodiert, das durch SEQ ID NR. 23 dargestellt ist.
[SEQ ID NR. 30]
Diese zeigt die Basensequenz des DNA-Fragmentes, erhalten in dem später beschriebenen BEISPIEL 5 (5-1).
[SEQ ID NR. 31]
Diese zeigt die N-terminale Aminosäuresequenz von menschentypischem ZAQ-Ligandenpeptid, analysiert in dem später beschriebenen BEISPIEL 6 (6-2).
[SEQ ID NR. 32]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 7.
[SEQ ID NR. 33]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 7.
[SEQ ID NR. 34]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz vom Schlangengift MIT1, gereinigt in dem später beschriebenen BEISPIEL 8.
[SEQ ID NR. 35]
Diese zeigt die Basensequenz der cDNA, die das menschentypische I5E-Rezeptorprotein kodiert.
[SEQ ID NR. 36]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz des menschentypischen I5E-Rezeptorproteins.
[SEQ ID NR. 37]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 9.
[SEQ ID NR. 38]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 9.
[SEQ ID NR. 39]
Diese zeigt die Basensequenz der cDNA, die das neue G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein (rZAQ1) kodiert.
[SEQ ID NR. 40]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz des neuen G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins (rZAQ1).
[SEQ ID NR. 41]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 10.
[SEQ ID NR. 42]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 10.
[SEQ ID NR. 43]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 10.
[SEQ ID NR. 44]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 10.
[SEQ ID NR. 45]
Diese zeigt die Basensequenz des Primers, verwendet in dem später beschriebenen BEISPIEL 10.
[SEQ ID NR. 46]
Diese zeigt die Basensequenz der cDNA, die das neue G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein (rZAQ2) kodiert.
[SEQ ID NR. 47]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz des neuen G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins (rZAQ2)
[SEQ ID NR. 48]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz des Maus-abgeleiteten G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins (GPR73).
[SEQ ID NR. 49]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz des Maus-abgeleiteten G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins (mI5E).
[SEQ ID NR. 50]
Diese zeigt die Basensequenz der cDNA, die das Maus-abgeleitete G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein (GPR73) kodiert.
[SEQ ID NR. 51]
Diese zeigt die Basensequenz der cDNA, die das Maus-abgeleitete G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein (mI5E) kodiert.
[SEQ ID NR. 52]
Diese zeigt die Basensequenz des DNA-Fragmentes #1, verwendet in REFERENZBEISPIEL 1.
[SEQ ID NR. 53]
Diese zeigt die Basensequenz des DNA-Fragmentes #2, verwendet in REFERENZBEISPIEL 1.
[SEQ ID NR. 54]
Diese zeigt die Basensequenz des DNA-Fragmentes #3, verwendet. in REFERENZBEISPIEL 1.
[SEQ ID NR. 55]
Diese zeigt die Basensequenz des DNA-Fragmentes #4, verwendet in REFERENZBEISPIEL 1.
[SEQ ID NR. 56]
Diese zeigt die Basensequenz des DNA-Fragmentes #5, verwendet in REFERENZBEISPIEL 1.
[SEQ ID NR. 57]
Diese zeigt die Basensequenz des DNA-Fragmentes #6, verwendet in REFERENZBEISPIEL 1.
[SEQ ID NR. 58]
Diese zeigt die Basensequenz der synthetischen DNA, die den menschentypischen ZAQ-Liganden kodiert, der durch SEQ ID NR. 21 dargestellt ist.
Die Transformante Escherichia coli DH5α/pCR2.1-ZAQC, erhalten in dem später beschriebenen BEISPIEL 1, ist im National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (jetzt überholt Ministry of International Trade and Industry, Agency of Industrial Science and Technology, National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH)), mit Sitz im Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan, unter der Zugangsnummer FERM BP-6855 seit 23. August 1999 und im Institute for Fermentation, Osaka (IFO), mit Sitz in 2-17-85, Juso-honmachi, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka, Japan, unter der Zugangsnummer IFO 16301 seit 4. August 1999 hinterlegt.
Die Transformante Escherichia coli DH5α/pCR2.1-ZAQT, erhalten in dem später beschriebenen BEISPIEL 1, ist im National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (jetzt überholt Ministry of International Trade and Industry, Agency of Industrial Science and Technology, National Institute of Bioscience und Human Technology (NIBH)) unter der Zugangsnummer FERM BP-6856 seit 23. August 1999 und im Institute for Fermentation, Osaka (IFO) unter der Zugangsnummer IFO 16302 seit 4. August 1999 hinterlegt.
Die Transformante Escherichia coli TOP10/pHMITA, erhalten in dem später beschriebenen BEISPIEL 4, ist im National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (jetzt überholt Ministry of International Trade and Industry, Agency of Industrial Science and Technology, National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH)) unter der Zugangsnummer FERM BP-7219 seit 13. Juli 2000 und im Institute for Fermentation, Osaka (IFO) unter der Zugangsnummer IFO 16440 seit 26. Mai 2000 hinterlegt.
Die Transformante Escherichia coli TOP10/pHMITG, erhalten in dem später beschriebenen BEISPIEL 4, ist im National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (jetzt überholt Ministry of International Trade and Industry, Agency of Industrial Science and Technology, National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH)) unter der Zugangsnummer FERM BP-7220 seit 13. Juli 2000 und im Institute for Fermentation, Osaka (IFO) unter der Zugangsnummer IFO 16441 seit 26. Mai 2000 hinterlegt.
Die Transformante Escherichia coli DH5α/pCR2.1-rZAQ1, erhalten in dem später beschriebenen BEISPIEL 9, ist im National Institute of Advanced Industrial Science und Technology, International Patent Organism Depositary (jetzt überholt Ministry of International Trade and Industry, Agency of Industrial Science and Technology, National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH)) unter der Zugangsnummer FERM BP-7275 seit 21. August 2000 und im Institute for Fermentation, Osaka (IFO) unter der Zugangsnummer IFO 16459 seit 1. August 2000 hinterlegt.
Die Transformante Escherichia coli DH10B/pCMV-rZAQ2, erhalten in dem später beschriebenen BEISPIEL 10, ist im National Institute of Advanced Industrial Science und Technology, International Patent Organism Depositary (jetzt überholt Ministry of International Trade and Industry, Agency of Industrial Science and Technology, National Institute of Bioscience und Human Technology (NIBH)) unter der Zugangsnummer FERM BP-7276 seit 21. August 2000 und im Institute for Fermentation, Osaka (IFO) unter der Zugangsnummer IFO 16460 seit 1. August 2000 hinterlegt.
Die Transformante Escherichia coli MM294 (DE3)/pTCh1ZAQ, erhalten in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 1, ist im National Institute of Advanced Industrial Science und Technology, International Patent Organism Depositary unter der Zugangsnummer FERM BP-7571 seit 27. April 2001 und im Institute for Fermentation, Osaka (IFO) unter der Zugangsnummer IFO 16527 seit 16. Januar 2001 hinterlegt.
BEISPIELE
Hierin nachstehend wird die vorliegende Erfindung ausführlich in bezug auf die BEISPIELE und REFERENZBEISPIELE beschrieben, aber soll den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht darauf beschränken. Die Genmanipulationsverfahren unter Verwendung von Escherichia coli wurden gemäß den Verfahren durchgeführt, die in der Molekularen Klonierung beschrieben sind.
BEISPIEL 1
Klonen der cDNA die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein ZAQ kodiert, und Bestimmung der Basensequenz
Unter Verwendung der menschlichen hypophysären cDNA (CLONTECH Laboratories, Inc.) als eine Matrize und zwei Primern, nämlich Primer 1
(5'-GTC GAC ATG GAG ACC ACC ATG GGG TTC ATG G-3'; SEQ ID NR:4)
und Primer 2
(5'-ACT AGT TTA TTT TAG TCT GAT GCA GTC CAC CTC TTC-3'; SEQ ID NR:5) wurde PCR durchgeführt. Die Reaktionslösung in der obigen Reaktion bestand aus 1/10 Volumen der oben beschriebenen cDNA, 1/50 Volumen von Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH Laboratories, Inc.), 0,2 μM Primer 1, 0,2 μM Primer 2, 200 μM dNTPs und einem Puffer, zugeführt mit dem Enzym, um das Endvolumen von 25 μl herzustellen. Bei der PCR wurde, nachdem die Reaktionslösung bei 94 °C für 2 Minuten erhitzt wurde, eine Zyklusgruppe bei 94 °C für 20 Sekunden, gefolgt von 72 °C für 100 Sekunden dreimal wiederholt, wurde eine Zyklusgruppe bei 94 °C für 20 Sekunden und bei 68 °C für 100 Sekunden dreimal wiederholt, wurde eine Zyklusgruppe bei 94 °C für 20 Sekunden, bei 64 °C für 20 Sekunden und bei 68 °C für 100 Sekunden 38 Mal wiederholt, und schließlich wurde eine Extensionsreaktion bei 68 °C für 7 Minuten durchgeführt. Nach Beendigung der PCR wurde das Reaktionsprodukt zu dem Plasmidvektor pCR2.1 (Invitrogen, Inc.) gemäß den Instruktionen, die dem TA-Klonierungskit beigefügt sind (Invitrogen, Inc.), subkloniert. Dann wurde es in Escherichia coli DH5α eingeführt, und die Klone, die die cDNA trugen, wurden in LB-Agarmedium, das Ampicillin enthält, selektiert. Die Sequenz von jedem Klon wurde analysiert, wodurch zwei cDNA-Sequenzen erhalten wurden, die das neue G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein kodierten, d. h., ZAQC (SEQ ID NR. 2) und ZAQT (SEQ ID NR. 3). Die Proteine mit der Aminosäuresequenz, die aus dieser cDNA abgeleitet wurde, wurde als ZAQ bezeichnet, da sie alle dieselbe Basensequenz haben (SEQ ID NR. 1). Die Transformante, die die DNA trägt, die durch SEQ ID NR. 2 dargestellt ist, wurde Escherichia coli DH5α/pCR2.1-ZAQC genannt, und die Transformante, die die DNA trägt, die durch SEQ ID NR. 3 dargestellt ist, wurde Escherichia coli DH5α/pCR2.1-ZAQT genannt.
BEISPIEL 2
Analyse der Expressionsverteilun von ZAQ durch Taqman PCR
Die Primer und eine Sonde, die in Taqman PCR verwendet werden sollte, wurden unter Verwendung von Primer Express Ver. 1.0 (PE Biosystems Japan) untersucht, und Primer 3
(5'-TCATGTTGCTCCACTGGAAGG-3' (SEQ ID (NR: 6)),
Primer 4
(5'-CCAATTGTCTTGAGGTCCAGG-3' (SEQ ID NR: 7))
und ZAQ-Sonde
(5'-TTCTTACAATGGCGGTAAGTCCAGTGCAG-3' (SEQ ID NR: 8)) wurden selektiert. FAM (6-Carboxyfluorescein) wurde als ein Reporterfarbstoff für die Sonde zugegeben.
Das PCR-Fragment, das unter Verwendung von pAK-ZAQC als eine Matrize, und Primer ZAQC Sal (5'-GTCGACATGGAGACCACCATGGGGTTCATGG-3'(SEQ ID NR: 9)) und Primer ZAQC Spe (5'-ACTAGTTTATTTTAGTCTGATGCAGTCCACCTCTTC-3' (SEQ ID NR:10)) amplifiziert wurde, wurde mit CHROMA SPIN200 gereinigt (CLONTECH Laboratories, Inc. (CA,USA)), und dann auf eine Konzentration von 10⁰–10⁶ Kopien/μl zur Verwendung als eine Standard-DNA eingestellt. Menschliche Multiple Tissue cDNA Panel I und Panel II (CLONTECH Laboratories, Inc.) wurden als die cDNA-Quelle für jedes Gewebe verwendet. Zu den Primern, der Sonde und Matrize wurde Taqman Universal PCR Master Mix (PE Bio systems Japan) in der Menge zugegeben, die durch die beiliegenden Instruktionen angegeben werden, und dann wurden PCR und Analyse mit ABI PRISM 7700 Sequenz Detection System (PE Biosystems Japan) durchgeführt.
Die Ergebnisse werden in 8 und Tabelle 1 gezeigt. Die Expression von ZAQ wurde hauptsächlich in den Hoden gefunden, und als nächstes an den Stellen, wie Lunge, Gehirn und andere.
Tabelle 1
BEISPIEL 3
Isolation von ZAQ-aktivierendem Peptid
(3-1) Herstellung von Milchextraktlösung
Unter Verwendung von kommerziell erhältlicher Milch, die bei einer niedrigen Temperatur pasteurisiert wurde, wurden die folgenden. Verfahrensweisen durchgeführt, um eine Extrakt lösung herzustellen. Zwei Liter Milch wurden bei 10.000 U/min für 15 Minuten bei 4 °C mit einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge zentrifugiert (CR26H, R1OA Rotor: Hitachi, Ltd.). Der erhaltene Überstand wurde durch Gaze filtriert, wodurch Lipide entfernt wurden. Essigsäure wurde zu dem Überstand zugegeben, um die Konzentration auf die Endkonzentration von 1 M einzustellen, und das Gemisch wurde für 30 Minuten bei 4 °C gerührt. Dann wurde das Gemisch bei 10.000 U/min für 15 Minuten mit einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge zentrifugiert (CR26H R10A Rotor: Hitachi System Engineering Co., Ltd.). Der erhaltene Uberstand wurde filtriert, wodurch unlösliche Stoffe entfernt wurden. Während des Rührens wurde Aceton doppelt so viel wie das Volumen des Überstandes dazugegeben. Das Rühren wurde bei 4 °C für 3 Stunden fortgesetzt. Dann wurde das Gemisch bei 10.000 U/min für 15 Minuten mit einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge zentrifugiert (CR26H R10A Rotor: Hitachi, Ltd.). Der erhaltene Überstand wurde filtriert, wodurch die unlöslichen Stoffe entfernt wurden. Der erhaltene Überstand wurde einem Rotationsverdampfer zugeführt, wodurch Aceton entfernt wurde, und auf 1350 ml Endvolumen konzentriert. Dann wurden jeweils 675 ml des resultierenden Konzentrats mit 338 ml Diethylether gemischt, und das Gemisch wurde in einem Trenntrichter kräftig geschüttelt, wodurch es in zwei Phasen getrennt wurde, um die wässerige Phase zu sammeln. Dieselbe Verfahrensweise wurde einmal in bezug auf die erhaltene wässerige Phase wiederholt, wodurch eine klare wässerige Lösung erhalten wurde. Die erhaltene wässerige Lösung wurde auf 800 ml unter Verwendung eines Rotationsverdampfers konzentriert, wodurch ein Endextrakt erhalten wurde.
(3-2) Grobfraktionierung der Milchextraktlösung unter Verwendung von C18-Umkehrphasenchromatographie
Methanol wurde zu 10 g einer Sep-Pak C18-Säule (Waters), gepackt mit Octadecylgruppefixiertem Kieselgel, zugegeben, wodurch das Gel quoll. Die Säule wurde dann mit 1 M Essigsäure äquilibriert. Die Extraktlösung, hergestellt in (3-1) (die Extraktlösung aus 2 Liter Milch), wurde auf die Säule geladen. Dann wurden 100 ml 1 M Essigsäure durch die Säule geführt, wodurch das Gel gewaschen wurde. Dann wurde die Säule mit 200 ml von 60 % Acetonitril/0,1 % Trifluoressigsäure eluiert, wodurch die gewünschte rohe Peptidkomponente eluiert wurde. Nachdem das erhaltene Eluat unter Verwendung eines Rotationsverdampfers konzentriert wurde, wurde das Konzentrat mit einem Gefriertrockner lyophilisiert (12EL; VirTis).
(3-3) Grobfraktionierung der Milchextraktlösung durch Sulfopropyl-Ionenaustauschchromatographie
SP Sephadex C-25 (Amersham Pharmacia Biotech), das in 100 mM HCl quoll, wurde auf eine Säule aus Polypropylen in einem Volumen von 2 ml geladen. Die Säule wurde mit destilliertem Wasser und Ammoniumformiat (pH 4,0) gewaschen und mit Elutionsmittel I äquilibriert (2 M Ammoniumformiat : Acetonitril : Wasser = 1 : 25 : 74). Das lyophilisierte Produkt, das in (3-2) erhalten wurde, wurde in 20 ml Elutionsmittel I gelöst. Die resultierende Lösung wurde auf 2 ml SP Sephadex C-25 geladen. Nachdem die Säule mit 10 ml Elutionsmittel I gewaschen wurde, wurde das Peptid mit jeweils 10 ml Elutionsmittel II (2 M Ammoniumformiat : Acetonitril : Wasser = 1 : 2,5 : 6,5), Elutionsnittel III (2 M Ammoniumformiat : Acetonitril : Wasser = 1 : 1 : 2) und Elutionsmittel IV (2 M Ammoniumformiat : Acetonitril : Wasser = 1 : 0,5 : 0,5) in dieser Reihenfolge gewaschen. Jedes der Eluate I bis IV wurde mit einem Gefriertrockner lyophilisiert (12EL; VirTis).
(3-4) Fraktionierung des Milchextraktes durch TSKgel-ODS80Ts-Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie
Mittels Führen von 91,7 Vol.-% Elutionsmittel A (0,1 % Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser) und 8,3 Vol.-% Elutionsmittel B (0,1 % Trifluoressigsäure/60 % Acetonitril) durch eine Säule für TSKgel-ODS80Ts-Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (Toso Co., Ltd., 4,6 mm × 25 cm) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min bei 40 °C wurde die Säule äquilibriert. Die lyophilisierten Produkte der Eluate I bis IV, erhalten in (3-3), wurden in 4 ml 1 M Essigsäure gelöst, und dann der Chromatographiebehandlung unterzogen. Das heißt, 4 ml der Lösung des lyophilisierten Produktes wurden auf die Säule geladen, und die Konzentration des Elutionsmittels B wurde auf 67 Vol.-% Elutionsmittel A/33 Vol.-% Elutionsmittel B über 1 Minute erhöht und dann mit einem linearen Gradienten von 67 Vol.-% Elutionsmittel A/33 Vol.-% Elutionsmittel B auf 0 Vol.-% Elutionsmittel A/100 Vol.-% Elutionsmittel B über die nächsten 40 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min erhöht.
Jeweils 1 ml Eluat wurde entnommen, wobei jeder Fraktion eine Fraktionsnummer verliehen wurde, und 2 μl von jeder Fraktion wurden mit 150 μl von 0,2 % Rinderserumalbumin (BSA)/destilliertem Wasser gemischt, gefolgt von Lyophilisierung. Das lyophilisierte Produkt wurde als eine Assayprobe zum Messen der die intrazelluläre Ca²⁺-Ionenkonzentration erhöhenden Aktivität verwendet, die später in (3-5) beschrieben wurde.
(3-5) Messung der die intrazelluläre Ca²⁺-Ionenkonzentration erhöhenden Aktivität unter Verwendung von FLIPR
Die Zellinie, die ZAQ stabil exprimieren kann, wurde folgendermaßen hergestellt. Das heißt, ein Klon von DH5α/pCR2.1-ZAQC, erhalten in BEISPIEL 1, wurde in LB-Medium, das mit Ampicillin ergänzt wurde, während kräftigen Schüttelns inkubiert, wodurch Plasmid pCR2.1-ZAQC erhalten wurde. Das Plasmid wurde mit Restriktionsenzymen Sal I und Spe I digeriert, um den Insert-Teil, der ZAQC kodiert, zu exzidieren. Dann wurde pAKKO-1.11H (Biochemica et Biophysica Acta, 1219 (1994) 251–259), das ebenso mit Restriktionsenzymen Sal I und Spe I digeriert wurde, mit dem Insert-Teil unter Verwendung von Ligation Express Kit ligiert (CLONTECH Laboratories, Inc. (CA, USA)), was zu E. coli DH10B durch das Elektroporationsverfahren transfektiert wurde. Die Struktur des Plasmids, das in dem erhaltenen Klon enthalten ist, wurde durch Restriktionsenzymbehandlung und Sequenzanalyse analysiert. Das korrekt konstruierte Plasmid wurde als Plasmid pAK-ZAQC zur CHO-Zellexpression verwendet.
Dieses Plasmid pAK-ZAQC wurde zu einer CHO/dhfr^–-Zelle (American Type Culture Collection) unter Verwendung von CellPhect Transfection Kit (Amersham Pharmacia Biotech) transfektiert. Zunächst wurden 120 μl Puffer A (CellPhect Transfection Kit) zu einer Lösung aus 4 μg Plasmid-DNA in 120 μl destilliertem Wasser zugegeben, und das Gemisch wurde gerührt. Nach dem Stehenlassen für 10 Minuten wurden 240 μl Puffer B (CellPhect Transfection Kit) zu dem Gemisch zugegeben. Das Gemisch wurde kräftig gerührt, wodurch der DNA-Calciumphosphatkomplex gebildet wurde, der die DNA enthielt. 5 × 10⁵ CHO/dhfr^–-Zellen wurden auf einer 60-mm-Petrischale inokuliert. Nach der Inkubation in Ham-F-12-Medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (BIO WHITTAKER, Inc.), wurden bei 37 °C unter 5 % CO₂ für einen Tag 480 μl einer Suspension aus dem DNA-Calciumphosphatkomplex tropfenweise zu den Zellen auf der Petrischale zugegeben. Nach der Inkubation bei 37 °C unter 5 % CO₂ für 6 Stunden wurden die Zellen zweimal mit serumfreien Ham-F-12-Medium gewaschen, und 1,2 ml Puffer (140 mM NaCl, 25 mM HEPES, 1,4 mM Na₂HPO₄, pH 7,1), ergänzt mit 15 % Glycerol, wurden zu den Zellen auf der Schale zugegeben, um die Zellen für 2 Minuten zu behandeln. Die Zellen wurden erneut zweimal mit serumfreien Ham-F-12-Medium gewaschen, gefolgt von der Inkubation in Ham-F-12-Medium, enthaltend 10 % fetales Rinderserum, bei 37 °C unter 5 % CO₂ über Nacht. Die Zellen wurden mit Trypsin zur Dispersion behandelt, aus der Schale rückgewonnen, und jeweils 2 × 10⁴ wurden in einer 6-Lochplatte inokuliert. Die Inkubation wurde in Dulbecco's Modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % dialysiertem fetalem Rinderserum (JRH BIOSCIENCES), 1 mM MEM nicht-essentieller Aminosäurelösung (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomyzin, bei 37 °C unter 5 % CO₂ initiiert. Die transformierten CHO-Zellen, in die das Plasmid eingeführt wurde, konnten in dem Medium überleben, aber nicht-transfektierte Zellen starben allmählich ab. Daher wurde das Medium ausgetauscht, wodurch die toten Zellen alle 2 Tage nach der Initiierung der Inkubation entfernt wurden. Etwa 21 Kolonien. der transformierten CHO-Zellen, die nach 8 bis 10 Tagen der Inkubation wuchsen, wurden ausgewählt. RNA wurde aus jeder der ausgewählten Zellen unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen RNA-Isolationskits gewonnen, gefolgt von dem öffentlich bekannten RT-PCR-Verfahren, um den ZAQ-Expressions-CHO-Zellen-B-1-Klon auszuwählen (hierin nachstehend nur als ZAQC-B1-Zelle bezeichnet), der hohe Expression von ZAQ zeigt.
Zur Kontrolle wurde ETA-(Endothelin-A-Rezeptor)-exprimierender CHO-Zellen-Klon Nr. 24 (hierin nachstehend nur als ETA24-Zelle bezeichnet; siehe Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 279, 675–685, 1996) verwendet.
Die die intrazelluläre Ca²⁺-Ionenkonzentration erhöhende Aktivität von ZAQC-B1-Zellen oder ETA24-Zellen wurde für die in (3-4) oben erhaltenen Proben unter Verwendung des FLIPR analysiert (Molecular Devices, Inc.). Die ZAQC-B1-Zellen und ETA24-Zellen, die beide in DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % dialysiertem fetalem Rinderserum (hierin nachstehend als dFBS bezeichnet), subkultiviert wurden, wurden verwendet. Die ZAQC-B1-Zellen und ETA24-Zellen wurden jeweils in dem Medium (10 % dFBS-DMEM) suspendiert, um die Konzentration auf 15 × 10⁴ Zellen/ml einzustellen. Ein aliquoter Teil von 200 μl von jeder Zellsuspension wurde auf jedem Loch (3,0 × 10⁴ Zellen/200 μl/Loch) in einer 96-Lochplatte für FLIPR inokuliert (Black Plate Clear Bottom, Coster), die in einem Inkubator bei 37 °C unter 5 % CO₂ über Nacht inkubiert wurde, und die so erhaltenen Zellen wurden verwendet (hierin nachstehend als die Zellplatte bezeichnet). Zwanzig Milliliter von H/HBS (9,8 g Nissui Hanks 2 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), 0,35 g Natriumhydrogencarbonat, 4,77 g HEPES, eingestellt auf pH 7,4 mit einer Natriumhydroxidlösung, gefolgt von Sterilisation durch einen Sterilisationsfilter), 200 μl von 250 mM Probenecid und 200 μl fetales Rinderserum (FBS) wurden gemischt. Ebenso wurden 2 Phiolen (50 μg) Fluo 3-AM (Dojin Chemical Research Institute) in 40 μl Dimethylsulfoxid und 40 μl von 20%iger Pluronsäure (Molecular Probes, Inc.) gelöst, und die resultierende Lösung wurde zu dem obigen H/HBSS-Probenecid-FBS-Gemisch zugegeben. Nach dem Mischen wurde das Medium von der Zellplatte entfernt, und jeweils 100 μl des Gemisches wurden in jedem Loch der Zellplatte unter Verwendung einer 8-Kanal-Pipette dispensiert. Die Zellplatte wurde dann bei 37 °C unter 5 % CO₂ für eine Stunde (Farbstoffladung) inkubiert. Für die Assayproben, erhalten in dem oben beschriebenen BEISPIEL (3-4), wurden 150 μl H/HBSS, enthaltend 2,5 mM Probenecid und 0,1 % CHAPS, zu jeder Fraktion zur Verdünnung zugegeben. Die verdünnte Lösung wurde auf eine 96-Lochplatte für FLIPR übertragen (V-Bottom Plate, Coster, hierin nachstehend als die Probenplatte bezeichnet). Nach Beendigung der Farbstoffladung auf die Zellplatte wurde die Zellplatte viermal mit dem Waschpuffer, bestehend aus H/HBSS, ergänzt mit 2,5 mM Probenedid, unter Verwendung eines Plattenwäschers gewaschen (Molecular Devices, Inc.). Nach dem Waschen wurden 100 μl des Waschpuffers für weitere Verfahren sichergestellt. Diese Zellplatte und die Probenplatte wurden auf FLIPR gegeben, um einen Assay durchzuführen (durch FLIPR wurden 50 μl der Probe aus der Probenplatte zu der Zellplatte übertragen).
Infolgedessen wurde die die intrazelluläre Ca²⁺-Ionenkonzentration erhöhende Aktivität, die für ZAQC-B1-Zellen spezifisch ist, in Fraktion Nr. 53 gefunden, die durch Anwenden von oben beschriebenen Elutionsmittel IV (3-3) auf die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie in (3-4) oben fraktioniert wurde.
(3-6) Reinigung unter Verwendung von TSKgel-Super-Phenyl-Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie
(1) Mittels Führen von 91,7 Vol.-% Elutionsmittel A (0,1 % Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser)/8,3 Vol.-% Elutionsmittel B (0,1 % Trifluoressigsäure/60 % Acetonitril) durch eine Säule zur TSKgel-Super-Phenyl-Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (Toso Co., Ltd., 0,46 cm × 10 cm) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min bei 40 °C wurde die Säule äquilibriert. Die Fraktion Nr. 53, erhalten in oben beschriebenen (3-4), wurde der Chromatographie unterzogen. Das heißt, 1 ml der Fraktion Nr. 53 wurde auf die Säule gela den, und die Konzentration an Elutionsmittel B wurde auf 75 Vol.-% Elutionsmittel A/25 Vol.-% Elutionsmittel B über 1 Minute erhöht und dann mit einem linearen Gradienten auf 67 Vol.-% Elutionsmittel A/33 Vol.-% Elutionsmittel B über 75 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min erhöht.
Jeweils 500 μl Eluat wurde entnommen, wobei jeder Fraktion eine Fraktionsnummer verliehen wurde, und 25 μl jeder fraktionierten Fraktion wurden mit 150 μl 0,2 % BSA gemischt, gefolgt durch Lyophilisierung mit einem Gefriertrockner (12EL; VirTis). Das lyophilisierte Produkt wurde mit 150 μl H/HBSS, enthaltend 2,5 mM Probenecid und 0,1 % CHAPS, zugegeben, wodurch das lyophilisierte Produkt gelöst wurde. Unter Verwendung von 50 μl der resultierenden Lösung wurde die die intrazelluläre Ca²⁺-Ionenkonzentration erhöhende Aktivität durch das in (3-5) oben beschriebene Verfahren gemessen, wodurch die Wirkung der Aktivierung des Rezeptors zu den ZAQC-B1-Zellen analysiert wurde. Das Ergebnis offenbart, daß die Komponente mit der Wirkung zum Aktivieren des Rezeptors für die Ziel-ZAQC-B1-Zellen, d. h., die ZAQ-aktivierende Komponente, hauptsächlich in Fraktion Nr. 103–105 eluiert wurde.
(3-7) Reinigung unter Verwendung von μRPC C2/C18 ST4.6/100 Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie
Mittels Führen von 95 Vol.-% Elutionsmittel A (Heptafluorbuttersäure/destilliertes Wasser)/5 Vol.-% Elutionsmittel B (0,1 % Heptafluorbuttersäure/100 % Acetonitril) durch eine Säule zur μRPC C2/C18 ST4.6/100 Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (Amersham Pharmacia Biotech, 0,46 cm × 10 cm) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min bei 40 °C wurde die Säule äquilibriert.
Nachdem die Fraktionen Nr. 103–105, ausgewählt aus den Fraktionen, die in (3-6) oben durch TSKgel-Super-Phenyl-Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie erhalten wurden, direkt auf die μRPC C2/C18 ST4.6/100-Umkehrphasensäule geladen wurden, wurde die Elution durch schnelles Erhöhen von 95 Vol.-% Elutionsmittel A (0,1 % Heptafluorbuttersäure/destilliertes Wasser)/5 Vol.-% Elutionsmittel B (0,1 % Heptafluorbuttersäure/100 % Acetonitril) auf 65 Vol.-% Elutionsmittel A/35 Vol.-% Elutionsmittel B bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min über 1 Minute und dann durch Erhöhen mit einem linearen Gradienten auf 50 Vol.-% Elutionsmittel A/50 Vol.-% Elutionsmittel B über die nächsten 60 Mi nuten durchgeführt, wodurch das Eluat gewonnen wurde. Das Eluat wurde als ein einzelner Peak bei 210 nm durch UV-Absorption detektiert.
Jeweils 500 μl Eluat wurden entnommen, wobei jeder Fraktion eine Fraktionsnummer verliehen wurde, und jeweils 25 μl aus den erhaltenen Fraktionen wurden mit 150 μl 0,2 % BSA gemischt, gefolgt von Lyophilisierung mit einem Gefriertrockner (12EL; VirTis). Das lyophilisierte Produkt wurde mit 150 μl H/HBSS, enthaltend 2,5 mM Probenecid und 0,1 % CHAPS, zugegeben, wodurch das lyophilisierte Produkt gelöst wurde. Unter Verwendung von 50 μl der Lösung wurde die Rezeptoraktivierungsaktivität auf die ZAQ-C-B1-Zellen durch das in (3-5) oben beschriebene Testverfahren analysiert. Das Ergebnis offenbarte, daß die Komponente mit der Rezeptoraktivierungsaktivität auf die jeweiligen ZAQ-C-B1-Zellen, nämlich die ZAQ-aktivierende Komponente, hauptsächlich in Fraktionen Nr. 82 bis 84 eluiert wurde. Dieser Aktivierungspeak stimmte vollständig mit dem UV-Absorptionspeak bei 210 nm überein, was zu der Schlußfolgerung führt, daß das Produkt genug gereinigt wurde, um das einzelne Peptid zu erhalten.
(3-8) Analyse der Struktur von gereinigtem ZAQ-aktivierendem Peptid
Das folgende Verfahren wurde verwendet, um die Struktur der ZAQ-aktivierenden Komponente zu bestimmen, die in dem oben beschriebenen BEISPIEL (3-7) erhalten wurde. Die gereinigte ZAQ-aktivierende Komponente wurde lyophilisiert, und das lyophilisierte Produkt wurde in Lösungsmittel DMSO (Dimethylsulfoxid) gelöst. Ein aliquoter Teil der Lösung wurde für das N-terminale Aminosäuresequenzieren unter Verwendung eines Proteinsequenzers bereitgestellt (Perkin-Elmer, Inc., PE Biosystems Procise 491cLC). Infolgedessen konnten 14 Reste von den Aminosäureresten von dem N-Terminus bis zu dem 16. Aminosäurerest identifiziert werden (Ala Val Ile Thr Gly Ala Xaa Glu Arg Asp Val Gln Xaa Arg Ala Gly (SEQ ID NR. 11; Xaa ist ein nicht-identifizierter Rest)).
BEISPIEL 4
Klonen der cDNA für menschentypisches ZAQ-Ligandenpeptid
Eine Blast-Suche wurde in einer Datenbank unter Verwendung der N-terminalen Aminosäuresequenz (SEQ ID NR. 11) des gereinigten ZAQ-aktivierenden Peptids, das aus Milch in BEISPIEL 3 extrahiert wurde, als Abfrage durchgeführt. So wurde menschliches EST (X40467) entdeckt, das dieselbe Basensequenz wie die der DNA aufweist, die das Peptid mit der Aminosäuresequenz kodiert, die durch. SEQ ID NR. 11 dargestellt ist. Da diese Sequenz kein vollständiges offenes Leseraster aufweist, wurde die nicht-identifizierte Sequenz durch das RACE-Verfahren identifiziert, und folglich wurde der cDNA-Klon mit dem vollständigen offenen Leseraster erhalten.
Basierend auf den Informationen aus EST (X40467) wurden Primer ZF1 (SEQ ID NR. 12), ZF2 (SEQ ID NR. 13) und ZF3 (SEQ ID NR. 14) konstruiert, und das 3'-RACE-Experiment wurde unter Verwendung von menschlicher Testis-Marathon-Ready-cDNA (CLONTECH Laboratories, Inc.) als eine Matrize durchgeführt.
ZF1: 5'-GGTGCCACGCGAGTCTCAATCATGCTCC-3' (SEQ ID Nr.: 12)
ZF2: 5'-GGGGCCTGTGAGCGGGATGTCCAGTGTG-3' (SEQ ID Nr.: 13)
ZF3: 5'-CTTCTTCAGGAAACGCAAGCACCACACC-3' (SEQ ID Nr.: 14)
Eine PCR-Reaktionslösung für 3'-RACE wurde durch Mischen von 1 μl 50 × Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH Laboratories, Inc.), 5 μl 10 × Advantage 2 PCR-Puffer angelagert (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(OAc)₂, 37,5 μg/ml BSA, 0,05 % Tween-20, 0,05 % Nonidet-P40), 4 μl dNTP-Gemisch (jeweils 2,5 mM, TaKaRa Shuzo Co., Ltd.), 1 μl 10 μM Primer ZF1, 1 μl 10 μM Primer AP1 (Primer AP1 wurde mit menschlichem Testis-Marathon-Ready-cDNA-Kit von CLONTECH Laboratories, Inc. zugeführt), 5 μl Matrizen-cDNA (CLONTECH Laboratories, Inc., menschliche Testis-Marathon-Ready-cDNA) und 33 μl destilliertes Wasser hergestellt. Die Reaktion wurde unter den Bedingungen durchgeführt: nach der primären Denaturierung bei 94 °C für 60 Sekunden wurde ein Zyklusgruppe bei 94 °C für 30 Sekunden und dann bei 72 °C für 4 Minuten fünfmal wiederholt, wurde eine Zyklusgruppe bei 94 °C für 30 Sekunden und dann bei 70 °C für 4 Minuten fünfmal wiederholt, und wurde eine Zyklusgruppe bei 94 °C für 30 Sekunden und dann bei 68 °C für 44 Minuten 25 Mal wiederholt.
Dann wurde Nested-PCR unter Verwendung des Reaktionsgemischs aus dem PCR als eine Matrize durchgeführt. Die Reaktionslösung wurde durch Mischen von 1 μl 50 × Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH), 5 μl 10 × Advantage 2 PCR Puffer angelagert (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(OAc)₂, 37,5 μg/ml BSA, 0,05 % Tween-20, 0,05 % Nonidet-P40), 4 μl dNTP-Gemisch (jeweils 2,5 mM, TaKaRa Shuzo Co., Ltd.), 1 μl 10 μM Primer ZF2, 1 μl 10 μM Primer AP2 (Primer AP2 wurde mit menschlichem Testis-Marathon- Ready-cDNA-Kit von CLONTECH Laboratories, Inc. zugeführt), 5 μl Matrizen-DNA (50fache Verdünnung des PCR-Reaktionsgemisches) und 33 μl destilliertes Wasser hergestellt. Die Reaktion wurde unter den Bedingungen durchgeführt: nach der primären Denaturierung bei 94 °C für 60 Sekunden wurde eine Zyklusgruppe bei 94 °C für 30 Sekunden und dann bei 72 °C für 4 Minuten fünfmal wiederholt, wurde eine Zyklusgruppe bei 94 °C für 30 Sekunden und dann bei 70 °C für 4 Minuten fünfmal wiederholt, und eine Zyklusgruppe bei 94 °C für 30 Sekunden und dann bei 68 °C für 44 Minuten 25 Mal wiederholt.
Außerdem wurde zweites Nested-PCR unter Verwendung der Reaktionslösung des PCR als eine Matrize durchgeführt. Die Reaktionslösung wurde durch Mischen von 1 μl 50 × Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH Laboratories, Inc.), 5 μl 10 × Advantage 2 PCR Puffer angelagert (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(OAc)₂, 37,5 μg/ml BSA, 0,05 % Tween-20, 0,05 % Nonidet-P40), 4 μl dNTP-Gemisch (jeweils 2,5 mM, TaKaRa Shuzo Co., Ltd.), 1 μl 10 μM Primer ZF3, 1 μl 10 μl Primer AP2 (Primer AP2 wurde mit menschlichem Testis-Marathon-Ready-DNA-Kit von CLONTECH Laboratories, Inc. zugeführt), 5 μl Matrizen-cDNA (50fache Verdünnung des PCR-Reaktionsgemisches) und 33 μl destilliertes Wasser hergestellt. Die Reaktion wurde unter den Bedingungen durchgeführt: nach der primären Denaturierung bei 94 °C für 60 Sekunden wurde eine Zyklusgruppe bei 94 °C für 30 Sekunden und dann bei 72 °C für 4 Minuten fünfmal wiederholt, wurde eine Zyklusgruppe bei 94 °C für 30 Sekunden und dann bei 70 °C für 4 Minuten fünfmal wiederholt, und wurde eine Zyklusgruppe bei 94 °C für 30 Sekunden und dann bei 68 °C für 44 Minuten 25 Mal wiederholt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde unter Verwendung von TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, Inc.) gemäß dem Protokoll, das in dem beiliegenden Handbuch beschrieben ist, geklont. Die Basensequenz der geklonten DNA wurde unter Verwendung eines ABI377DNA-Sequenzer dekodiert, um die 3'-Ende-Sequenz (SEQ ID NR. 15) zu identifizieren.
Basierend auf der Basensequenz, die durch SEQ ID NR. 15 dargestellt ist, und der Informationen aus EST (X40467) wurden Primer ZAQL-CF (SEQ ID NR. 16) und Primer ZAQL-XR1 (SEQ ID NR. 17) hergestellt. Unter Verwendung von menschlicher Testis-Marathon-Ready-cDNA (CLONTECH Laboratories, Inc.) als Matrize wurde PCR unter Verwendung von Primern ZAQL-CF und ZQAL-XR1 durchgeführt.
ZAQL-CF: 5'-CCACCATGAGAGGTGCCACG-3' (SEQ ID Nr.: 16)
ZAQL-XR1: 5'-CTCGAGCTCAGGAAAAGGATGGTG-3' (SEQ ID Nr.: 17)
Die Reaktionslösung wurde durch Mischen von 1 μl PfuTurbo-DNA-Polymerase (Stratagene, Inc.), 5 μl 10 × PCR Puffer angelagert, 4 μl 2,5 mM dNTP-Gemisch, jeweils 2,5 μl 10 μM Primer ZAQL-CF und ZAQL-XR1, 5 μl Matrizen-DNA und 30 μl destilliertem Wasser hergestellt. Die Reaktion wurde unter den Bedingungen durchgeführt: nach der primären Denaturierung bei 95 °C für 1 Minute wurde eine Zyklusgruppe bei 95 °C für 1 Minute und dann bei 72 °C für 1 Minute 40 Mal wiederholt, und eine Endextensionsreaktion wurde bei 72 °C für 10 Minuten durchgeführt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde unter Verwendung von TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) gemäß dem Protokoll, das in dem beiliegenden Handbuch beschrieben ist, geklont. Infolge der Dekodierung der Basensequenzen der geklonten DNA-Fragmente unter Verwendung des ABI377DNA-Sequenzers wurde herausgefunden, daß die Fragmente Sequenzen mit 371 Basenpaaren aufwiesen, die durch SEQ ID NR. 18 bzw. SEQ ID NR. 19 dargestellt sind. Das Plasmid, das das DNA-Fragment trägt, das die Basensequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 18 dargestellt ist, wurde pHMITA genannt, und das Plasmid, das das DNA-Fragment trägt, das die Basensequenz enthält, die durch SEQ ID NR. 19 dargestellt ist, wurde pHMITG genannt.
Escherichia coli wurde unter Verwendung der Plasmide pHMITA und pHMITG transfektiert, und die erhaltenen Transformanten wurden Escherichia coli TOP10/pHMITA bzw. Escherichia coli TOP 10/pHMITG genannt.
Die Analyse der Basensequenzen der DNA-Fragmente offenbarten, daß das DNA-Fragment, das durch SEQ ID NR. 18 dargestellt ist, die DNA aufwies (SEQ ID NR. 28), die das menschentypische ZAQ-Ligandenpräkursorpeptid kodiert (Typ A, 105 Aminosäurereste), dargestellt durch SEQ ID NR. 22, und daß das DNA-Fragment, das durch SEQ ID NR. 19 dargestellt ist, die DNA aufwies (SEQ ID NR. 29), die das menschentypische ZAQ-Ligandenpräkursorpeptid kodiert (Typ G, 105 Aminosäurerest), dargestellt durch SEQ ID NR. 23.
Es wurde außerdem herausgefunden, daß die Basensequenzen, die durch SEQ ID NR. 28 dargestellt sind und durch SEQ ID NR. 29 dargestellt sind, eine typische Signalsequenz aufwiesen; die DNA mit der Basensequenz, die durch SEQ ID NR. 28 dargestellt ist, die DNA auf wies (SEQ ID NR. 26), die aus 258 Basenpaaren besteht und die das menschentypische reife ZAQ-Ligandenpeptid kodiert (Typ A, 86 Aminosäurereste), dargestellt durch SEQ ID NR. 20; die DNA mit der Basensequenz, die durch SEQ ID NR. 29 dargestellt ist, die DNA aufwies (SEQ ID NR. 27), die aus 258 Basenpaaren besteht und die das menschentypische reife ZAQ-Ligandenpeptid kodiert (Typ G, 86 Aminosäurereste), dargestellt durch SEQ ID NR. 21.
BEISPIEL 5
Produktion von menschentypischem ZAQ-Ligandenpeptid in Säugerzellen (1)
(5-1) Konstruktion des Säugerexpressionsvektors für menschentypisches ZAQ-Ligandenpräkursorpeptid
Das Plasmid pHMITG, erhalten in BEISPIEL 4, wurde mit Restriktionsenzymen EcoRI und XhoI digeriert, wodurch das DNA-Fragment 382 Basenpaaren (SEQ ID NR. 30), enthaltend cDNA, die das menschentypische ZAQ-Ligandenpräkursorpeptid kodiert, exzidiert wurde.
Das heißt, Plasmid pHMITG wurde mit EcoRI und XhoI digeriert, und das erhaltene DNA-Fragment wurde auf 1,5 % Agarosegel der Elektrophorese unterworfen. Das Gelsegment der Bande mit 382 Basenpaaren, eingefärbt mit Cybergreen, wurde mit einer Rasierklinge herausgeschnitten. Aus dem obigen Gelsegment wurde das DNA-Fragment unter Verwendung von Gene Clean Spin DNA Extraction Kit (BIO 101, Inc.) gewonnen. Gemäß dem Standardverfahren wurde das erhaltene DNA-Fragment in den Säugerzellenexpressionsvektor pCAN618 (11), der CMV-IE-Enhancer und Huhn-beta-Actin-Promotor als Expressionspromotor an der Spaltungsstelle trägt, durch Restriktionsenzyme EcoRI und XhoI geklont. Die Basensequenz des geklonten DNA-Fragmentes wurde durch das obige Verfahren dekodiert. Daher wurde das DNA-Fragment identifiziert und wies die Basensequenz auf, die durch SEQ ID NR. 30 dargestellt ist. Dieser Säugerzellenexpressionsvektor mit der DNA, die das menschentypische ZAQ-Ligandenpräkursorpeptid kodiert, wurde pCANZAQLg2 genannt.
(5-2) Einführung von Expressionsvektor in COS7-Zellen
COS7-Zellen wurden von ATCC bezogen, und die Zellen, die durch DMEM-Medium (ergänzt mit 10 % FBS) in Subkultur angelegt wurden, wurden verwendet. Unter Verwendung des DMEM-Mediums wurden die COS7-Zellen bei einer Population von 1,5 × 10⁶ Zel len/Schale auf einer 10-cm-Petrischale inokuliert, gefolgt von Inkubation bei 37 °C unter 5 % CO₂ über Nacht. Zu 2 μg des Expressionsplasmids von menschentypischem ZAQ-Ligandenpräkursorpeptid (gelöst in 2 μl TE-Puffer) (pCANZAQLg2) wurden 298 μl Puffer EC(Effectene-Transfektionsreagens, QIAGEN) zugegeben, und 16 μl Enhancer wurden außerdem zu dem Gemisch zugegeben. Nach dem Mischen für eine Sekunde wurde das Gemisch bei Raumtemperatur für 3 Minuten stehengelassen. Dann wurden 60 μl Effectene-Transfektionsreagens weiterhin zu dem Gemisch zugegeben. Nach dem Mischen für 10 Sekunden wurde das Gemisch bei Raumtemperatur für 10 Minuten stehengelassen. Nachdem der Überstand aus den Zellen, die am Tag zuvor inokuliert wurden, entfernt wurde, wurden die Zellen einmal mit 10 ml DMEM-Medium gewaschen, und 9 ml DMEM-Medium wurden zugegeben. Ein Milliliter des DMEM-Mediums wurde zu der Plasmidlösung zugegeben, und nach dem Mischen wurde das Gemisch tropfenweise zu den Zellen zugegeben. Nach dem Mischen des gesamten Gemisches wurden die Zellen bei 37 °C unter 5 % CO₂ über Nacht kultiviert. Die Zellen wurden zweimal mit 10 ml DMEM-Medium gewaschen, und 10 ml des DMEM-Mediums wurden zugegeben. Die Zellen wurden in einem Inkubator bei 37 °C unter 5 % CO₂ über Nacht kultiviert. Nach 2 Tagen wurde der Kulturüberstand gewonnen.
(5-3) Teilreinigung von menschentypischem ZAQ-Ligandenpräkursorpeptid aus dem Kulturüberstand von Expressions-COS7-Zellen
(5-3-1) Herstellung des Kulturüberstandes von menschentypisches ZAQ-Ligandenpräkursorpeptid-exprimierenden COS7-Zellen
Der Kulturüberstand von menschentypisches ZAQ-Ligandenpräkursorpeptid-exprimierenden COS7-Zellen wurde gewonnen, und das Extrakt wurde durch die folgende Verfahrensweise hergestellt. Zunächst wurden 1,1 ml Essigsäure tropfenweise zu dem Zellkulturüberstand (etwa 18,5 ml) zugegeben, wodurch die Endkonzentration auf 1 M eingestellt wurde, und das Gemisch wurde für eine Stunde gerührt. Aceton wurde in 2fachem Volumen des Gemisches zugegeben, welches dann für 30 Minuten bei 4 °C gerührt wurde. Als nächstes wurde das Gemisch bei 15.000 U/min für 30 Minuten unter Verwendung einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge zentrifugiert (CR26H, Model 23 Rotor: Hitachi, Ltd), wodurch der Überstand erhalten wurde. Der erhaltene Überstand wurde in einem Verdampfer gegeben, um Aceton zu entfernen, und dann mit einem Gefriertrockner lyophilisiert (12EL; VirTis).
(5-3-2) Sephadex-G50-Gelchromatographie und SepPak-Säulenchromatographie des Kulturüberstandes von menschentypisches ZAQ-Ligandenpräkursorpeptid-exprimierenden COS7-Zellen
Die lyophilisierten Pulver, erhalten in (5-3-1) oben, wurden in 2 ml 1 M Essigsäure gelöst, und die Lösung wurde auf Sephadex-G15-Säule (3 cm × 35 ml, Pharmacia Biotech) adsorbiert, die mit 1 M Essigsäure äquilibriert wurde. Dann wurden 1 M Essigsäure durch die Säule geführt, und jeweils 5 ml des Eluats wurden entnommen, wobei jeder Fraktion eine Fraktionsnummer verliehen wurde. Jede Fraktion wurde mit einem Gefriertrockner lyophilisiert (12EL; VirTis).
Eine SepPak-C18-Sg-Säule (10 ml) wurde mit Methanol gequollen und mit 0,1 % Trifluoressigsäure/destilliertem Wasser äquilibriert. Die lyophilisierten Produkte von Fraktion Nr. 1 bis 16, entnommen aus den Fraktionen, erhalten durch Sephadex-G50-Gelchromatographie, wurden zusammengefaßt und in 3 ml Trifluoressigsäure/destilliertem Wasser gelöst, und die Lösung wurde auf die SepPak-C18-5g-Säule geladen. Nach dem Waschen mit 24 ml 0,1 % Trifluoressigsäure/destilliertem Wasser wurde die Säule gewaschen und mit 20 ml 0,1 % Trifluoressigsäure/60 % Acetonitril eluiert. Das erhaltene Eluat wurde auf Savant aufgebracht.
(5-3-3) Reinigung von Super ODS Umkehphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie
Elutionsmittel A (0,1 % Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser) wurde durch die Säule zur TSKgel Super ODS Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (Toso, 0,46 cm × 10 cm) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min bei 40 °C geführt, um die Säule zu äquilibrieren. Nachdem die SepPak-C18-5g-Säulenfraktion, erhalten in (5-3-2), auf Savant aufgebracht wurde, wurde die Fraktion auf Super-ODS-Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie geladen. Dann wurde die Elution durch Erhöhen mit einem linearen Gradienten von 100 Vol.-% Elutionsmittel A (0,1 % Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser)/0 Vol.-% Elutionsmittel B (0,1 % Trifluoressigsäure/100 % Acetonitril) auf 0 Vol.-% Elutionsmittel A/100 Vol.-% Elutionsmittel B bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min über 60 Minuten durchgeführt, wodurch das Eluat gewonnen wurde.
Das Eluat wurde mit jeweils 1 ml fraktioniert, wobei jeder Fraktion eine Fraktionsnummer verliehen wurde. Die Gesamtmenge der fraktionierten Fraktionen wurde mit einem Gefriertrockner lyophilisiert (12EL; VirTis). Die lyophilisierten Produkte wurden in 150 μl H/HBSS, ergänzt mit 2,5 mM Probenecid und 0,2 % BSA, gelöst. Unter Verwendung dieser Lösung wurde die Wirkung des Aktivierens des Rezeptors für ZAQC-B1-Zellen durch das nachstehend beschriebene Verfahren (5-3-4) analysiert.
(5-3-4) Messung der die intrazelluläre Ca²⁺-Ionenkonzentration erhöhenden Aktivität durch FLIPR
Unter Verwendung von FLIPR wurden die Proben, die oben in (5-3-4) erhalten wurden, hinsichtlich der die intrazelluläre Ca²⁺-Ionenkonzentration erhöhenden Aktivität in ZAQ-Expressionszellen (ZAQC-B1), erhalten in BEISPIEL 3 (3-5), analysiert. Zur Kontrolle wurden hOT7T175-Expressionszellen (hOT7T175-16; beschrieben in WO 00/24890) verwendet.
Die ZAQC-B1-Zellen und hOT7T175-Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % dialysiertem fetalem Rinderserum (hierin nachstehend als dFBS bezeichnet), in Subkultur angelegt und zur Verwendung bereitgestellt. Die ZAQC-B1-Zellen und hOT7T175-Zellen wurden jeweils in dem Medium (10 % dFBS-DMEM) suspendiert, wodurch ihre Konzentration auf 15 × 10⁴ Zellen/ml eingestellt wurde. Unter Verwendung einer Dispensierpipette wurden jeweils 200 μl der Zellsuspension (3,0 × 10⁴ Zellen/200 μl/Loch) in jedem Loch inokuliert (Black Plate Clear Bottom, Coster). Nach der Inkubation bei 37 °C unter 5 % CO₂ für einen Tag wurden die Zellen verwendet (hierin nachstehend als die Zellplatte bezeichnet). Einundzwanzig Milliliter von H/HBSS (9,8 g HANKS', 0,35 g Natriumhydrogencarbonat und 4,77 g HEPES; eingestellt auf pH 7,4 mit Natriumhydroxid, gefolgt von Sterilisation durch einen Sterilisationsfilter), 210 μl 250 mM Probenecid und 210 μl fetales Rinderserum (FBS) wurden gemischt. Ebenso wurden 2 Phiolen (50 μg) Fluo 3-AM in 42 μl Dimethylsulfoxid und 42 μl 20%ige Pluronsäure gelöst, und die resultierende Lösung wurde zu dem obigen H/HBSS-Probenecid-FBS-Gemisch zugegeben. Nach dem Mischen wurde das Medium von der Zellplatte entfernt, und jeweils 100 μl des Gemisches wurden in jedes Loch der Zellplatte unter Verwendung einer 8-Kanalpipette dispensiert. Die Zellplatte wurde dann bei 37 °C unter 5 % CO₂ für eine Stunde inkubiert (Farbstoffladung). Für die Assayproben, erhalten in dem oben beschriebenen BEISPIEL (5-3-3), wurden 150 μl H/HBSS, enthaltend 2,5 mM Probenecid und 0,2 % FBS, zu jeder Fraktion zur Auflösung zugegeben. Die Lösung wurde dann zu einer 96-Lochplatte (V-Bottom Plate, Coster) für FLIPR übertragen (hierin nachstehend als Probenplatte bezeichnet). Nach Beendigung der Farbstoffladung wurde die Zellplatte viermal mit dem Waschpuffer oder H/HBSS, ergänzt mit 2,5 mM Probenecid, unter Verwen dung eines Plattenwäschers (Molecular Devices) gewaschen. Nach dem Waschen wurden 100 μl des Waschpuffers gesichert. Diese Zellplatte und die Probenplatte wurden auf FLIPR geladen, um den Assay durchzuführen (0,05 ml der Probe wurden von der Probenplatte zu der Zellplatte durch FLIPR übertragen). Die die intrazelluläre Ca²⁺-Ionenkonzentration erhöhende Aktivität, die für ZAQ-B1-Zellen spezifisch ist, wurde in Fraktion Nr. 48 bis 68 beobachtet. Daraus wurde herausgefunden, daß die Zielkomponente mit der Funktion zum Aktivieren des Rezeptors für ZAQC-B1-Zellen, d. h., die ZAQ-aktivierende Komponente, in Fraktion Nr. 48 bis 68 eluiert wurde.
BEISPIEL 6
Produktion von menschentypischem ZAQ-Ligandenpeptid in Säugerzellen (2)
(6-1) Herstellung des Kulturüberstandes
Wie in BEISPIEL 5 beschrieben, wurde das Expressionsplasmid von menschentypischem ZAQ-Ligandenpräkursorpeptid (pCANZAQLg2) in COS7-Zellen eingeführt. Das heißt, COS7-Zellen wurden bei einer Population von 3,0 × 10⁶ Zellen/Schale auf einer 15-cm-Petrischale inokuliert, gefolgt von Inkubation bei 37 °C unter 5 % CO₂ über Nacht. Nachdem 600 μl Puffer EC (Effectene-Transfektionsreagens, QIAGEN) zu 4 μg des menschentypischen ZAQ-Ligandenpräkursorpeptid-Expressionsplasmids (pCANZAQLg2) (gelöst in 4 μl TE-Puffer) zugegeben wurde, wurden 32 μl Enhancer weiter zugegeben. Nach dem Mischen für eine Sekunde wurde das Gemisch für 3 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Außerdem wurden 120 μl Effectene-Transfektionsreagens zu dem Gemisch zugegeben. Nach dem Mischen für 10 Sekunden wurde das Gemisch für 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Der Überstand wurde aus den Zellen, die am Tag zuvor inokuliert wurden, entfernt, und die Zellen wurden einmal mit 10 ml DMEM gewaschen, und 30 ml DMEM wurden zugegeben. Zu der Plasmidlösung wurde 1 ml DMEM zugegeben, und nach dem Mischen wurde das Gemisch tropfenweise zu den Zellen zugegeben. Nach dem Mischen des gesamten Gemisches wurden die Zellen bei 37 °C unter 5 % CO₂ über Nacht kultiviert. Die Zellen wurden einmal mit 10 ml DMEM gewaschen, und 20 ml DMEM wurden zugegeben. Die Zellen wurden in einem Inkubator bei 37 °C unter 5 % CO₂ über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurde der Kulturüberstand gesammelt, und 20 ml DMEM wurden zu dem Sy stem zugegeben. Das Gemisch wurde in einem Inkubator bei 37 °C unter 5 % CO₂ über Nacht kultiviert, wodurch der Kulturüberstand gewonnen wurde.
(6-2) Reinigung von menschentypischem ZAQ-Ligandenpeptid aus dem Kulturüberstand
Unter Verwendung der in (6-1) oben beschriebenen Verfahrensweise wurde das Kulturmedium aus 80 Petrischalen von 15 cm gewonnen. Essigsäure wurde zu dem Medium zugegeben, wodurch die Endkonzentration 1 M betrug. Nach 1 Stunde Rühren wurde Aceton in einem zweifachen Volumen der Lösung zugegeben, wodurch Proteine ausfielen. Die Lösung wurde für 30 Minuten bei 4 °C gerührt. Dann wurde die Lösung bei 10.000 U/min für 30 Minuten mit einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge zentrifugiert (CR26H RR10A-Typ Rotor: Hitachi System Engineering Co., Ltd.), wodurch ein Überstand erhalten wurde. Der erhaltene Überstand wurde auf einen Verdampfer aufgebracht, um Aceton zu entfernen, und durch eine Umkehrphasensäule (Waters C18, 100 g) geführt, die zuvor mit 0,1 % Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser äquilibriert wurde. Nach dem die Säule mit 1.000 ml 0,1 % Trifluoressigsäure/destilliertem Wasser und dann mit 1.000 ml 0,1 % Trifluoressigsäure/20 % Acetonitril gewaschen wurde, wurde das Peptid mit 1.000 ml 0,1 % Trifluoressigsäure/60 % Acetonitril eluiert. Das erhaltene Eluat wurde auf einen Verdampfer aufgebracht, und mit einem Gefriertrockner lyophilisiert (12EL; VirTis).
Elutionsmittel A (0,1 % Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser) wurde durch die Säule zur TSKgel-ODS80TM-Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (Toso, 21,5 min × 30 cm) bei einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/min bei 40 °C geführt, wodurch die Säule äquilibriert wurde. Nachdem die erhaltenen lyophilisierten Pulver in Elutionsmittel A gelöst wurden, wurde die Lösung auf die ODS80TM-Säule geladen, wurde das Peptid durch Erhöhen mit einem linearen Gradienten von 60 Vol.-% Elutionsmittel A (0,1 % Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser)/40 Vol.-% Elutionsmittel B (0,1 % Trifluoressigsäure/60 % Acetonitril) auf 0 Vol.-% Elutionsmittel A/100 Vol.-% Elutionsmittel B bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min über 120 Minuten eluiert.
Das Eluat wurde mit jeweils 8 ml fraktioniert, wobei jeder Fraktion eine Fraktionsnummer verliehen wurde. Aus den erhaltenen Fraktionen wurden jeweils 50 μl entnommen und mit einem Gefriertrockner lyophilisiert (12EL; VirTis). Die lyophilisierten Produkte wurden in 200 ul H/HBSS, ergänzt mit 2,5 mM Probenecid und 0,2 % BSA, gelöst. Unter Verwendung dieser Lösung wurde die Wirkung zum Aktivieren des Rezeptors für ZAQC-B1-Zellen durch das nachstehend beschriebene Testverfahren (5-3-4) analysiert. Die Ergebnisse offenbarten, daß die Zielkomponente mit der Wirkung zum Aktivieren des Rezeptors für ZAQC-B1-Zellen, d. h., die ZAQ-aktivierende Komponente, in Fraktion Nr. 32 eluiert wurde.
Elutionsmittel A (10 mM Ammoniumformiat/10 % Acetonitril) wurde durch die Säule zur TSKgel-CM-2SW-Ionenaustausch-Hochleistungsflüssigchromatographie (Toso, 4,6 mm × 25 cm) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min bei 25 °C geführt, wodurch die Säule äquilibriert wurde. Die oben beschriebene Fraktion Nr. 32 wurde auf die CM-2SW-Säule geladen, und das Peptid wurde mit einem linearen Gradienten durch Erhöhen von 100 Vol.-% Elutionsmittel A (10 mM Ammoniumformiat/10 % Acetonitril)/0 Vol.-% Elutionsmittel B (1000 mM Ammoniumformiat/10 % Acetonitril) auf 0 Vol.-% Elutionsmittel A/100 Vol.-% Elutionsmittel B bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min über 60 Minuten eluiert.
Das Eluat wurde mit jeweils 1 ml fraktioniert, wobei jeder Fraktion eine Fraktionsnummer verliehen wurde. Aus den erhaltenen Fraktionen wurden 1,5 μl entnommen und mit 200 μl H/HBSS, ergänzt mit 2,5 mM Probenecid und 0,2 % BSA, verdünnt. Diese Lösung wurde verwendet, um die Funktion zum Aktivieren des Rezeptors für ZAQC-B1-Zellen durch das oben beschriebene Testverfahren (5-3-4) zu analysieren. Die Ergebnisse offenbarten, daß die Zielkomponente mit der Funktion zum Aktivieren des Rezeptors für ZAQC-B1-Zellen, d. h., die ZAQ-aktivierende Komponente, in Fraktion Nr. 56 und 57 eluiert wurde.
Elutionsmittel A (0,1 % Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser) wurde durch die Säule zur TSKgel-Super-Phenyl-Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (Toso, 4,6 mm × 10 cm) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min bei 40 °C geführt, um die Säule zu äquilibrieren. Die obigen Fraktionen Nr. 56 und 57 wurden auf die Super-Phenyl-Säule geladen, und das Peptid wurde durch Erhöhen mit einem linearen Gradienten von 70 Vol.-% Elutionsmittel A (0,1 % Trifluoressigsäure/destilliertem Wasser)/30 Vol.-% Elutionsmittel B (0,1 % Trifluoressigsäure/60 % Acetonitril) auf 50 Vol.-% Elutionsmittel A/50 Vol.-% Elutionsmittel B über 60 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert.
Das Eluat wurde mit jeweils 1 ml fraktioniert, wobei jeder Fraktion eine Fraktionsnummer verliehen wurde, und 1,5 μl des Eluats wurden aus den erhaltenen Fraktionen entnommen.
Das Eluat wurde mit 200 μl H/HBSS, ergänzt mit 2,5 mM Probenecid und 0,2 % BSA, verdünnt. Diese Lösung wurde verwendet, um die Funktion zum Aktivieren des Rezeptors für ZAQC-B1-Zellen durch das oben beschriebene Testverfahren (5-3-4) zu analysieren. Die Ergebnisse offenbarten, daß die Zielkomponenten mit Funktion zum Aktivieren des Rezeptors für ZAQC-B1-Zellen, nämlich die ZAQ-aktivierende Komponente, in Fraktion Nr. 54, 55 und 56 eluiert wurde. Die Aktivität stimmte mit dem einzelnen UV-Absorptionspeak überein, was so interpretiert wurde, daß die aktivierende Komponente genug zur Homogenität gereinigt wurde.
Die gereinigte ZAQ-aktivierende Komponente wurde lyophilisiert, und das lyophilisierte Produkt wurde in Lösungsmittel DMSO (Dimethylsulfoxid) gelöst. Ein aliquoter Teil der Lösung wurde für das N-terminale Aminosäuresequenzieren unter Verwendung eines Proteinsequenzers bereitgestellt (Perkin-Elmer, Inc., PE Biosystems Procise 491cLC). Infolgedessen konnten 9 Reste von den Aminosäureresten von dem N-Terminus bis zu dem 10. Aminosäurerest identifiziert werden (Ala Val Ile Thr Gly Ala Xaa Glu Arg Asp (SEQ ID NR. 31; Xaa ist ein nicht-identifizierter Rest)). Die erhaltene Aminosäuresequenz stimmte mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des vorhergesehenen menschentypischen reifen ZAQ-Ligandenpeptids überein. Ebenso wurde die Massenspektrometrie für die gereinigte Probe der ZAQ-aktivierenden Komponente unter Verwendung einer Finnigan LCQ LC/MC-Vorrichtung (Thermoquest, San Jose, CA) gemäß dem Elektrosprayionisationsverfahren durchgeführt, wobei das Molekulargewicht 9657,6 betrug. Dieses Ergebnis stimmte mit dem berechneten Wert von 9657,3 für menschentypisches reifes ZAQ-Ligandenpeptid mit 86 Resten überein, bei denen alle 10 Cysteinreste Disulfidbindungen bildeten. Es wurde bestätigt, das die gereinigte Probe der ZAQ-aktivierenden Komponente reifes menschentypisches ZAQ-Ligandenpeptid mit der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 21 dargestellt, aufwies.
(6-3) Assay für die ZAQ-aktivierende Funktion von gereinigtem menschentypischen ZAQ-Ligandenpeptid
Die Funktion zum Aktivieren des Rezeptors für ZAQC-B1-Zellen durch das menschentypische reife ZAQ-Ligandenpeptid, gereinigt in (6-2) oben, wurde durch das oben in (5-3-4) beschriebene Testverfahren analysiert. Die Ergebnisse offenbarten, daß das menschentypische reife ZAQ-Ligandenpeptid eine Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentrati on in den ZAQ-exprimierten CHO-Zellen (ZAQC-B1-Zellen) konzentrationsabhängig induzierte. Der EC₅₀-Wert betrug 96 pM, und es wurde entdeckt, daß menschentypisches reifes ZAQ-Ligandenpeptid eine sehr wirksame Agonistenaktivität zeigte. Die Ergebnisse werden in 10 gezeigt.
BEISPIEL 7
Produktion von menschentypischen ZAQ-Ligandenpeptid in Säugerzellen (3)
(7-1) Herstellung einer CHO-Zellinie, die das menschentypische ZAQ-Ligandenpeptid stabil exprimieren kann
Unter Verwendung von Plasmid pHMITG als eine Matrize, beschrieben in BEISPIEL 4, wurde menschentypische ZAQ-Liganden-cDNA durch PCR unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert:
5' GTCGACCACCATGAGAGGTGCCACGC 3' (SEQ ID Nr.: 32)
5' ACTAGTCGCAGAACTGGTAGGTATGG 3' (SEQ ID Nr.: 33)
und zu pCR-Blunt-II-Vektor (Invitrogen, Inc.) geklont. Die Insert-cDNA wurde aus dem erhaltenen Klon mit einer korrekten Sequenz unter Verwendung von Restriktionsenzymen SalI und SpeI exzidiert, und in pAKKO1.1H-Expressionsvektor eingeführt. Das Plasmid wurde zu CHO/dhFr^–-Zellen (American Type Culture Collection) durch die in (3-5) oben beschriebene Verfahrensweise unter Verwendung von CellPhect Transfection Kit transfektiert (Amersham Pharmacia Biotech). Der Kulturüberstand wurde aus mehreren Klonen des transfektierten Stamms gewonnen, und die ZAQ-Ligandenaktivität, die die intrazelluläre Ca²⁺-Ionenkonzentration in den ZAQC-B1-Zellen erhöhen kann, wurde durch das in (3-5) beschriebene Testverfahren analysiert. Daher wurde ZAQL-exprimierter CHO-Zellenklon Nr. 4, der den ZAQ-Liganden stark exprimieren kann, gescreent.
(7-2) Herstellung von serumfreiem Kulturüberstand von menschentypischem ZAQ-Ligand ZAOL-1
In Dulbecco's Modifizierten Eagle-Medium (DMEM) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), ergänzt mit 10 % dialysiertem fetalem Rinderserum (JRH BIOSCIENCES), 1 mM MEM nicht-essentieller Aminosäurelösung, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomyzin, wurde ZAQL-1-exprimierter CHO-Zellenklon Nr. 4 kultiviert, um unter Verwendung von 4 Single Trays (Nunc) konfluierend zu werden, und mit Trypsin zur Dispersion behandelt. Die Dispersion wurde zentrifugiert, wodurch der Klon gewonnen wurde. Die Zellen, die einer der obigen Single Trays entsprechen, wurden in 1,5 l des Mediums suspendiert, und in Cell Factories 10 (Nunc) inokuliert, gefolgt von Inkubieren von 4 Cell Factories 10 bei 37 °C für 3 Tage unter 5 % CO₂. Nach dem der Kulturüberstand entfernt wurde, wurden die Zellen in einer der Cell Factories 10 mit 1 l oben beschriebenem H/HBSS gewaschen. Nachdem H/HBSS entfernt wurde, wurde serumfreies Medium (Dulbecco's Modifiziertes Eagle-Medium, ergänzt mit 1 mM nicht-essentieller Aminosäurelösung, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomyzin) in 2 l pro Cell Factory 10 zugegeben, gefolgt von Inkubation für weitere 2 Tage. Der gewonnene Kulturüberstand wurde bei 1.000 U/min für 10 Minuten unter Verwendung einer Hitachi-Hochgeschwindigkeitszentrifuge zentrifugiert und durch Gaze filtriert, wodurch ein klarer Überstand erhalten wurde. Essigsäure wurde zu dem Überstand in einer Endkonzentration von 1 M zugegeben.
(7-3) Grobfraktionierung von ZAQL-1-Expressions-CHO-Zellen-Serum-freiem Kulturüberstand durch Wakosil-II 5C 18HG Prep Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie
PrepC18 (Waters), gepackt mit Octadecyl-fixiertem Kieselgel, quoll in Methanol und wurde in eine Säule aus Glas gepackt (50 mm × 100 mm). Dann wurde das Extrakt, hergestellt in (6-2), auf eine Säule geladen, die mit 1 M Essigsäure äquilibriert wurde. Dann wurde die Säule mit 800 ml von 1 M Essigsäure gewaschen. Dann wurden 1000 ml von 60 % Acetonitril/0,1 % Trifluoressigsäure durch die Säule geführt, um die rohe Zielpeptidkomponente zu eluieren. Das erhaltene Eluat wurde unter Verwendung eines Verdampfers konzentriert und mit einem Gefriertrockner lyophilisiert (12EL; VirTis).
(7-4) Trennung durch Wakosil-II 5C18HG Prep Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie
Mittels Führen von 91,7 Vol.-% Elutionsmittel A (0,1 % Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser)/8,3 Vol.-% Elutionsmittel B (0,1 % Trifluoressigsäure/60 % Acetonitril) durch eine Säule zur Wakosil-II 5C18HG Prep Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (Wako Pure Chemical Industries, 20 mm × 250 mm) bei 40 °C bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min wurde die Säule äquilibriert. Das oben in (7-3) erhaltene lyophilisierte Produkt wurde dem Chromatographieverfahren unterzogen. Das heißt, 36 ml von 1 M Essigsäure wurden zugegeben, wodurch das lyophilisierte Produkt gelöst wurde. Nachdem die Lösung zentrifugiert wurde, wurde ein aliquoter Teil von einem Drittel auf die Säule geladen, und die Konzentration an Elutionsmittel B wurde auf 66,7 Vol.-% Elutionsmittel A/33,3 Vol.-% Elutionsmittel B über eine Minute erhöht und dann mit einem linearen Gradienten auf 16,7 Vol.-% Elutionsmittel A/83,3 Vol.-% Elutionsmittel B über die nächsten 120 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min erhöht. Das Eluat wurde mit jeweils 5 ml fraktioniert, wobei jeder Fraktion eine Fraktionsnummer verliehen wurde, und jeweils 3 μl aus den erhaltenen Fraktionen wurden mit 150 μl von 0,2 % BSA gemischt, gefolgt von Lyophilisierung mit einem Gefriertrockner (12EL; VirTis). Das lyophilisierte Produkt wurde mit 150 μl Assaypuffer zugegeben [H/HBSS (9,8 g Nissui HANKS 2 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), 0,35 g Natriumhydrogencarbonat und 4,77 g HEPES; eingestellt auf pH 7,4 mit Natriumhydroxid, gefolgt von Sterilisation durch einen Sterilisationsfilter), ergänzt mit 2,5 mM Probenecid und 0,1 % CHAPS], wodurch das lyophilisierte Produkt gelöst wurde. Unter Verwendung von 50 μl der Lösung wurde die ZAQ-B1-Rezeptor-aktivierende Funktion durch das in (3-5) oben beschriebene Testverfahren analysiert. Die Ergebnisse offenbarten, daß die Komponente mit der jeweiligen ZAQ-B1-Rezeptor-aktivierenden Funktion hauptsächlich in den Fraktionen Nr. 73 bis 75 eluiert wurde.
(7-5) Trennung durch TSKgel-CM-2SW-Ionenaustausch-Hochleistungsflüssigchromatographie
Mittels Führen von 100 Vol.-% Elutionsmittel A (4 M Ammoniumformiat : destilliertem Wasser : Acetonitril = 1 : 299 : 100) und 0 Vol.-% Elutionsmittel B (4 M Ammoniumformiat : destilliertem Wasser : Acetonitril = 1 : 2 : 1) durch eine Säule zur TSKgel-CM-2SW-Ionenaustausch-Hochleistungsflüssigchromatographie (Toso, 7,8 mm × 300 mm) bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min bei 25 °C wurde die Säule äquilibriert. In den Fraktionen, erhalten in (7-4) durch Wakosil-II 5C18HG Prep Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie, wurden die Fraktionen Nr. 73 bis 75 lyophilisiert, und das lyophilisierte Produkt wurde in 4 ml Elutionsmittel A gelöst. Nachdem die Lösung auf die TSKgel-CM-2SW-Ionenaustauschsäule geladen wurde, wurde das Eluat durch Erhöhen mit einem linearen Gradienten auf 25 Vol.-% Elutionsmittel A/75 Vol.-% Elutionsmittel B über 120 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min gewonnen. Das Eluat wurde mit jeweils 2 ml fraktioniert, wobei jeder Fraktion eine Fraktionsnummer verliehen wurde, und jeweils 10 μl aus den erhaltenen Fraktionen wurden mit 100 μl von 0,2 % BSA gemischt, gefolgt von Lyophilisierung mit einem Gefriertrockner (12EL; VirTis). Das lyophilisierte Produkt wurde mit 100 μl des oben beschriebenen Assaypuffers zum Lösen zugegeben.
Nachdem die Lösung auf das 100fache mit demselben Puffer verdünnt wurde, wurde die ZAQ-Rezeptor-aktivierende Funktion durch das in (3-5) oben beschriebene Testverfahren analysiert. Die Ergebnisse offenbarten, daß die Komponente mit der Ziel-ZAQ-Rezeptoraktivierenden Funktion hauptsächlich in den Fraktionen Nr. 95 bis 100 eluiert wurde.
(7-6) Reinigung durch TSKgel-ODS-80Ts-Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie
Mittels Führen von 91,7 Vol.-% Elutionsmittel A (0,1 % Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser) und 8,3 Vol.-% Elutionsmittel B (0,1 % Trifluoressigsäure/60 % Acetonitril) durch die Säule zur TSKgel-ODS-80Ts-Umkelrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (Toso Co., Ltd., 4,6 mm × 25 cm) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min bei 40 °C wurde die Säule äquilibriert. Die lyophilisierten Produkte der Fraktion Nr. 95 bis 100, erhalten in (7-5) oben, wurden der Chromatographiebehandlung unterzogen. Das heißt, die lyophilisierten Produkte wurden in 4 ml von 1 M Essigsäure gelöst, und die Lösung wurde auf die Säule geladen. Die Konzentration an Elutionsmittel B wurde auf 75 Vol.-% Elutionsmittel A/25 Vol.-% Elutionsmittel B über 1 Minute erhöht und dann mit einem linearen Gradienten auf 25 Vol.-% Elutionsmittel A/75 Vol.-% Elutionsmittel B über die nächsten 60 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min erhöht, wodurch das Eluat gewonnen wurde. Das Eluat wurde mit jeweils 1 ml fraktioniert, wobei jeder Fraktion eine Fraktionsnummer verliehen wurde. Die ZAQ-Ligandenaktivität wurde gemäß dem in (3-5) beschriebenen Testverfahren analysiert, und es wurde bestätigt, daß die Aktivität in der Fraktion eluiert wurde, die mit dem einzelnen UV-Absorptionspeak übereinstimmt. Daraus wurde geschlußfolgert, daß der ZAQ-Ligand genug zur Homogenität gereinigt wurde.
(7-7) Analyse der Struktur von gereinigtem ZAQ-Ligandenpeptid
Die folgende Verfahrensweise wurde verwendet, um die Struktur des ZAQ-Ligandenpeptids, das in dem oben beschriebenen (7-6) erhalten wurde, zu bestimmen. Die gereinigte hauptsächliche ZAQ-aktivierende Komponente wurde mit einem Gefriertrockner lyophilisiert (12EL; VirTis). Das lyophilisierte Produkt wurde in Lösungsmittel DMSO (Dimethylsulfoxid) gelöst. Ein aliquoter Teil der Lösung wurde für das N-terminale Aminosäuresequenzieren unter Verwendung eines Proteinsequenzers bereitgestellt (Perkin-Elmer, Inc., PE Biosystems Procise 491cLC). Infolgedessen wurde die N-terminale Aminosäuresequenz, die mit der vorhergesehenen menschentypischen reifen ZAQ-Ligandenpeptidform (SEQ ID NR. 21) übereinstimmt, erhalten. Ebenso wurde die Massenspektrometrie gemäß dem Elektronensprühionisationsverfahren unter Verwendung einer Finnigan LCQ LC/MC-Vorrichtung durchgeführt, und das Molekulargewicht betrug 9658,0. Dieser gefundene Wert stimmte gut mit dem berechneten Wert von 9657,3 für menschentypisches reifes ZAQ-Ligandenpeptid (SEQ ID NR. 21) überein. Es wurde daher bestätigt, daß das Zielpeptid mit der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 21 dargestellt ist, erhalten wurde.
BEISPIEL 8
Reaktivität von Schlangengift MIT1 und menschentypischen ZAQ-Ligand mit ZAQ und I5E
(8-1) Isolation von Schlangengift MIT1
(8-1-1) Trennung durch Wakosil-II 5C18HG Prep Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie
Mittels Führen von 91,7 Vol.-% Elutionsmittel A (0,1 % Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser)/8,3 Vol.-% Elutionsmittel B (0,1 % Trifluoressigsäure/60 % Acetonitril) durch eine Säule zur Wakosil-II 5C18HG Prep Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (Wako Pure Chemical Industries, 20 mm × 250 mm) bei 40 °C bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min wurde die Säule äquilibriert. Zu 50 mg des lyophilisierten Produktes vom Gift der Schwarzen Mamba (Sigma) wurden 4 ml von 1 M Essigsäure zugegeben, wodurch das lyophilisierte Produkt gelöst wurde. Die Lösung wurde bei 15.000 U/min für 10 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde der Chromatographie unterzogen. Nachdem die Probe auf die Säule geladen wurde, wurde die Konzentration an Elutionsmittel B auf 91,7 Vol.-% Elutionsmittel A/8,3 Vol.-% Elutionsmittel B über 1 Minute erhöht und dann mit einem linearen Gradienten auf 33,4 Vol.-% Elutionsmittel A und 66,6 Vol.-% Elutionsmittel B über 120 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min erhöht. Das Eluat wurde mit jeweils 10 ml 20 Minuten später fraktioniert, wobei jeder Fraktion eine Fraktionsnummer verliehen wurde. Aus jeder Fraktion wurde 1 μl entnommen, und nach dem Verdünnen auf das 10.000fache mit dem oben beschriebenen Assaypuffer wurde die ZAQ-B1-Rezeptor-aktivierende Funktion gemäß dem in (3-5) oben beschriebenen Testverfahren analysiert. Die Ergebnisse offenbaren, daß die Komponente mit der ZAQ-B1-Rezeptor-aktivierenden Zielfunktion hauptsächlich in den Fraktionen Nr. 21 bis 23 eluiert wurde.
(8-1-2) Trennung durch TSKgel-CM-2SW-Ionenaustausch-Hochleistungsflüssigchromatographie
Mittels Führen von 100 Vol.-% Elutionsmittel A (4 M Ammoniumformiat : destilliertem Wasser : Acetonitril = 1 : 299 : 100) und 0 Vol.-% Elutionsmittel B (4 M Ammoniumformiat : destilliertem Wasser : Acetonitril = 1 : 2 : 1) durch eine Säule zur TSKgel-CM-2SW-Ionenaustausch-Hochleistungsflüssigchromatographie (Toso, 4,6 mm × 250 mm) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min bei 25 °C wurde die Säule äquilibriert. Von den durch Wakosil-II 5C18HG Prep Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie in (7-1) erhaltenen Faktionen wurden die Fraktionen Nr. 21 bis 23 lyophilisiert, und die lyophilisierten Produkte wurden in 4 ml Elutionsmittel A gelöst. Nachdem die Lösung auf die TSKgel-CM-2SW-Ionenaustauschsäule geladen wurde, wurde das Eluat durch Erhöhen mit einem linearen Gradienten auf 0 Vol.-% Elutionsmittel A/100 Vol.-% Elutionsmittel B über 90 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min gewonnen. Das Eluat wurde mit jeweils 1 ml fraktioniert, wobei jeder Fraktion eine Fraktionsnummer verliehen wurde. Aus jeder Fraktion wurde 1 μl entnommen, und nach dem Verdünnen auf das 10.000fache mit dem oben beschrieben Assaypuffer wurde die ZAQ-B1-Rezeptor-aktivierende Funktion gemäß dem in (3-5) oben beschriebenen Testverfahren analysiert. Die Ergebnisse offenbarten, daß die Komponente mit der ZAQ-B1-Rezeptor-aktivierenden Zielfunktion hauptsächlich in den Fraktionen Nr. 50 bis 51 eluiert wurde.
(8-1-3) Trennung durch Vydac238TP3410-Ionenaustausch-Hochleistungsflüssigchromatographie
Mittels Führen von 91,7 Vol.-% Elutionsmittel A (0,1 % Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser)/8,3 Vol.-% Elutionsmittel B (0,1 % Trifluoressigsäure/60 % Acetonitril) durch eine Säule zur Vydac238TP3410-Ionenaustausch-Hochleistungsflüssigchromatographie (Toso, 4,6 mm × 100 mm) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min bei 40 °C wurde die Säule äquilibriert. Von den Fraktionen, erhalten in (8-1-2) durch TSKgel-CM-2SW-Ionenaustausch-Hochleistungsflüssigchromatographie, wurden die Fraktionen Nr. 50 bis 51 direkt auf die Säule geladen, die Konzentration an Elutionsmittel B wurde auf 75 Vol.-% Elutionsmittel A/25 Vol.-% Elutionsmittel B über 1 Minute erhöht und dann mit einem linearen Gradienten auf 41,7 Vol.-% Elutionsmittel A und 58,3 Vol.-% Elutionsmittel B über 75 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min erhöht. Das Eluat wurde mit jeweils 0,5 ml fraktionert, wobei jeder Fraktion eine Fraktionsnummer verliehen wurde. Aus jeder Fraktion wurde 1 μl entnommen, und nach dem Verdünnen auf das 10.000fache mit dem oben beschriebenen Assaypuffer wurde die ZAQ-B1-Rezeptor-aktivierende Funktion gemäß dem in (3-5) oben beschriebenen Testverfahren analysiert. Die Ergebnisse offenbarten, daß die Komponente mit der ZAQ-B1-Rezeptor-aktivierenden Zielfunktion hauptsächlich in den Fraktionen Nr. 108 bis 115 eluiert wurde.
(8-1-4) Analyse der Struktur von gereinigtem Schlangengift MIT1
Die folgende Verfahrensweise wurde verwendet, um die Struktur vom Schlangengift MIT1, erhalten in dem oben beschriebenen (8-1-3), zu bestimmen. Das gereinigte Haupt-MIT1 wurde mit einem Gefriertrockner (12EL; VirTis) lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt wurde in Lösungsmittel DMSO (Dimethylsulfoxid) gelöst. Ein aliquoter Teil der Lösung wurde für das N-terminale Aminosäuresequenzieren unter Verwendung eines Proteinsequenzers bereitgestellt (Perkin-Elmer, Inc., PE Biosystems Procise 491cLC). Infolgedessen wurde die N-terminale Aminosäuresequenz, die mit dem vorhergesehenen Schlangengift MIT1 (SEQ ID NR. 34) übereinstimmt, erhalten. Ebenso wurde Massenspektrometrie gemäß dem Elektronensprühionisationsverfahren unter Verwendung der Finnigan LCQ LC/MC-Vorrichtung durchgeführt, und das Molekulargewicht betrug 8506,8. Dieser gefundene Wert stimmte gut mit dem berechneten Wert von 8506,4 für Schlangengift MIT1 überein. Es wurde daher bestätigt, daß das Zielpeptid mit der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 34 dargestellt ist, erhalten wurde.
(8-2) Herstellung der Zellinie, die I5E stabil exprimieren kann
Menschentypische I5E-Rezeptor-cDNA (SEQ ID NR. 35) wurde durch bekanntes PCR geklont, und in pAKKO1.1H-Expressionsvektor eingeführt. Der Expressionsvektor wurde zu CHO/dhFr^–-Zellen (American Type Culture Collection) durch das in (3-5) oben beschriebenen Verfahren transfektiert. Etwa 20 Kolonien der Transformanten-CHO-Zellen, die 10 bis 14 Tage nach der Initiierung der Inkubation wuchsen, wurden ausgewählt. Die ausgewählten Transformanten wurden in eine 96-Lochplatte mit 3 × 10⁴ Zellen/Loch inokuliert, und die Reaktivität mit MIT1 wurde gemäß dem in (3-5) beschriebenen Testverfahren untersucht. Der I5E-exprimierte CHO-Zellen-Klon Nr. 4 (bezeichnet als I5E-4-Zelle) mit einer guten Reaktivität wurden gescreent. Die Aminosäuresequenz, die durch die Basensequenz kodiert wird, die durch SEQ ID NR. 35 dargestellt ist, wird durch SEQ ID NR. 36 gezeigt.
(8-3) Assay für die den ZAQ-Rezeptor und den I5E-Rezeptor aktivierende Funktion von menschentypischen ZAQ-Ligandenpeptid und MIT1
Das menschentypische ZAQ-Ligandenpeptid, gereinigt durch das in BEISPIEL 7 beschriebene Verfahren, und das Schlangengift MIT1, gereinigt durch das in (8-1) oben beschriebene Verfahren, wurden hinsichtlich der ZAQ-Rezeptor-aktivierenden Funktion und der I5E-Rezeptor-aktivierenden Funktion durch die in (3-5) beschriebenen Testverfahren analysiert. Die Ergebnisse werden in 12 und 13 gezeigt.
Infolgedessen induzierten das menschentypische ZAQ-Ligandenpeptid und Schlangengift MIT1 konzentrationsabhängig eine Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration. Die ZAQ-Rezeptor-aktivierende Funktion von Schlangengift MIT1 war zehnmal wirksamer als die von menschentypischem ZAQ-Ligandenpeptid. Ebenso war die menschentypische I5E-Rezeptor-aktivierende Funktion von Schlangengift MIT1 etwa 100 Mal wirksamer als die von menschentypischem ZAQ-Ligandenpeptid.
BEISPIEL 9
Klonen der cDNA die das Rattengehirn-abgeleitete neue G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein (rZAQ1) kodiert, und Bestimmung der Basensequenz
Unter Verwendung der gesamten Rattengehirn-cDNA-Bibliothek (CLONTECH Laboratories, Inc.) als eine Matrize und zwei Primern (SEQ ID NR. 37 und SEQ ID NR. 38) wurde PCR durchgeführt. Die Reaktionslösung in der obigen Reaktion bestand aus der obigen cDNA, verwendet als eine 1/10 Volumen Matrize, 1/50 Volumen von Advantage 2 cDNA Polymerase Mix (CLONTECH Laboratories, Inc.), jeweils 0,2 μM der jeweiligen Primer, 200 μM dNTPs und einen Puffer, zugeführt mit dem Enzym, um das Endvolumen von 25 μl zu erreichen. Bei der PCR wurde (1) nach dem Umsetzen bei 94 °C für 2 Minuten (2) eine Zyklusgruppe bei 94 °C für 20 Sekunden, gefolgt von 72 °C für 1 Minute und 30 Sekunden dreimal wiederholt, wurde (3) eine Zyklusgruppe bei 94 °C für 20 Sekunden und bei 68 °C für 1 Minute und 30 Sekunden dreimal wiederholt, wurde (4) eine Zyklusgruppe bei 94 °C für 20 Sekunden, bei 62 °C für 20 Sekunden und bei 68 °C für 1 Minute 36 Mal wiederholt, und schließlich wurde eine Extensionsreaktion bei 68 °C für 7 Minuten durchgeführt. Nach der Beendigung der PCR wurde das Reaktionsprodukt zu dem Plasmidvektor pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Inc.) gemäß den Instruktionen, die dem TA-Klonierungskit beiliegen (Invitrogen, Inc.), subkloniert, der dann in Escherichia coli DH5α eingeführt wurde, und die Klone, die die cDNA trugen, wurden in LB-Agarmedium, das Ampicillin enthielt, selektiert. Die Sequenz von jedem Klon wurde analysiert, wodurch cDNA erhalten wurde, die das neue G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein (SEQ ID NR. 39) kodiert. In der Aminosäuresequenz, abgeleitet von der Basensequenz dieser cDNA, wurde eine Homologie von 83,7 % zu der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 1 dargestellt ist, beobachtet. Das neue G-Proteingekoppelte Rezeptorprotein, enthaltend diese Aminosäuresequenz, wurde rZAQ1 genannt. Die Transformante (E. coli), die die DNA trägt, die die Basensequenz enthält, welche durch SEQ ID NR. 39 dargestellt ist, wurde Escherichia coli DH5α/pCR2.l-rZAQ1 genannt.
BEISPIEL 10
Klonen der cDNA, die Rattengehirn-abgeleitetes neues G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein (rZAQ2) kodiert, und Bestimmung der Basensequenz
Der Klon, der rZAQ2 kodiert, wurde durch das Gen-Trapper-Verfahren erhalten. Das heißt, Sonden (SEQ ID NR. 41 und SEQ ID NR. 42) wurden biotiniert, und zur einsträngigen Gesamt-Rattenhirn-cDNA-Bibliothek (GIBCO-BRL) hybridisiert. Das erhaltene einsträngige Gen wurde zum Doppelstrang wiederhergestellt. Dieses Gen wurde zu Escherichia coli DH10B elektroporiert, und Transformanten wurden unter Verwendung von Ampicillinresistenz als ein Indikator erhalten. Gemäß dem Kolonie-PCR unter Verwendung einer Sonde (SEQ ID NR. 41) und einem Primer (SEQ ID NR. 45) wurde ein Klon, der die Zielbasensequenz kodiert, selektiert. Die Aminosäuresequenz (SEQ ID NR. 47), abgeleitet von der Basensequenz (SEQ ID NR. 46) von ORF (offenes Leseraster), vorhergesehen aus der Basensequenz dieses Klons, wies eine Homologie von 80,6 % zu rZAQ1 auf. Das neue G-Proteingekoppelte Rezeptorprotein, enthaltend diese Aminosäuresequenz, wurde rZAQ2 genannt. Die Transformante (E. coli), die durch das Gen-Trapper-V erfahren erhalten wurde, wurde Escherichia coli DH10B/pCMV-rZAQ2 genannt.
BEISPIEL 11
Kontraktionstest unter Verwendung eines Probenpräparats des Krummdarms, extrahiert aus dem Meerschweinchen
Meerschweinchen (Std: Hartley, 7–8 Wochen alt, männlich, wiegen etwa 450 g) verbluteten mittels Durchschneiden der Halsschlagader mit Scheren, und der Bauch wurde geöffnet, um den Krummdarm zu entfernen. Der Krummdarm wurde in eine Glaspetrischale gelegt, mit Tyrode-Lösung versetzt (Zusammensetzung: 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0,5 mM MgCl₂, 1,1 mM NaH₂PO₄, 11,9 mM NaHCO₃, 5,6 mM Glukose), und Fettgewebe und Bindegewebe, die am Krummdarm hafteten, wurden mit chirurgischen Scheren und Pinzetten beschnitten. Der Krummdarm wurde dann in Stücke mit etwa 1,5 cm Länge geschnitten und als ein Probenpräparat bereitgestellt. Dieses Präparat wurde in einem Organbad (20 ml) suspendiert, das mit der Tyrode-Lösung, erwärmt auf 37 °C, gefüllt war, und eine Last von 0,5 g wurde zur Stabilisierung über 30 Minuten oder mehr aufgebracht.
Eine Kontraktionsreaktion des Krummdarmpräparats wurde unter Verwendung von AMPLIFIER CASE 7747, hergestellt von NEC San-Ei Co., Ltd., gemessen.
Nachdem 1 μM Acetylcholin zugegeben wurde, um die maximale Kontraktionsreaktion zu bestimmen, wurde das menschentypische ZAQ-Ligandenpeptid (ZAQL-1), erhalten gemäß der Verfahrensweise von REFERENZBEISPIEL 1, oder Schlangengift MIT1, erhalten in (8-1-3) oben, kumulativ verabreicht, um die Kontraktionsreaktion zu analysieren. Zur Verdünnung von ZAQL-1 und MIT1 wurde physiologische Kochsalzlösung, die 0,05 % Rinderserumalbumin enthält, verwendet.
Die Ergebnisse werden in 14 gezeigt. Die Kontraktionsreaktion, induziert durch ZAQL-1 und MIT1, wird in Prozent dargestellt, wenn die Kontraktionsreaktion, induziert durch 1 μM Acetylcholin, 100 % ausmachte.
Im Ergebnis induzierten ZAQL-1 und MIT1 eine wirksame dosisabhängige Kontraktionsreaktion. Die EC₅₀-Werte von ZAQL-1 und MIT1, berechnet aus der Dosis-Wirkungs-Kurve, betrugen 1,79 nM bzw. 0,40 nM.
BEISPIEL 12
Bindingsassay unter Verwendung der ZAQ- und I5E-exprimierten CHO-Zellmembran-Fraktionen
(12-1) Herstellung von ¹²⁵I-MIT1
Benzol, enthaltend in [¹²⁵I]-Bolton-Hunter Reagent (monoiodiert, 37 MBq, NEN Co., NEX 120), wurde durch Stickstoffgas entfernt, 20 μl DMSO wurden zugegeben, und die eingedampften Stoffe wurden durch Pipettieren gelöst. Zu der Lösung wurden 80 μl der Lösung, enthaltend 4 nmol MIT1, verdünnt mit Boratpuffer (Zusammensetzung: 100 mM H₃BO₃, pH 8,5), zugegeben, und direkt danach wurden sie gemischt, gefolgt von Inkubation bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Danach wurden 200 μl 10 % Acetonitril-0,1 % Trifluoressigsäure zugegeben und das Gemisch wurde als eine Probe für die HPLC-Fraktionierung bereitgestellt. Die Probe wurde auf eine Säule (Toso, Co., Ltd., 0,46 cm × 10 cm) zur TSKgel-Super-ODS-Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie geladen, die mittels Führen von 100 Vol.-% Elutionsmittel A (10 % Acetonitril/0,1 % Trifluoressigsäure)/0 Vol.-% Elutionsmittel B (0,1 % Trifluoressigsäure/40 % Acetonitril) bei Raumtemperatur bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min äquilibriert wurde. Danach wurde die Konzentration an Elutionsmittel B auf 60 Vol.-% Elutionsmittel A/40 Vol.-% Elutionsmittel B über 1 Minute erhöht und dann mit einem linearen Gradienten auf 40 Vol.-% Elutionsmittel A/60 Vol.-% Elutionsmittel B über 60 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min erhöht. Das eluierte [¹²⁵I]-Bolton-Hunter Reagent-eingeführte MIT1 wurde manuell fraktioniert und mit einem Puffer verdünnt (Zusammensetzung: 20 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,2 % BSA, 0,1 % CHAPS, 0,03 % NaN₃, pH 7,4). Die Verdünnung wurde dispensiert und bei –80 °C gelagert.
(12-2) Herstellung von Zellmembranfraktionen
Zellmembranfraktionen wurden gemäß dem Verfahren, das in Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 279, 675–685, 1996 beschrieben ist, hergestellt. In Dulbecco's Modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), ergänzt mit 10 % dialysiertem fetalem Rinderserum (JRH BIOSCIENCES), 1 mM MEM nichtessentieller Aminosäurelösung, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomyzin, wurden die Rezeptor-exprimierten CHO-Zellen, nämlich ZAQC-B1-Zellen oder I5E-4-Zellen, in Single Trays (Nunc) kultiviert. Wenn die Zellen eine Zelldichte von 80–90 % erreichten, wurde der Kulturüberstand verworfen, und 30 ml PBS (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.), enthaltend 1 g/l EDTA, wurden zu der Schale („Tray") zugegeben, um die Zellen zu waschen. Dann wurde der Kulturüberstand verworfen, und 30 ml des oben beschriebenen PBS-EDTA wurden zugegeben, wobei er bei Raumtemperatur stehengelassen wurde. Die Schale wurde geschüttelt, um die Zellen abzulösen, und die Zellsuspension wurde gewonnen. Erneut wurden 10 ml des oben beschriebenen PBS-EDTA zu der Schale zum Waschen zμgμgegeben und die Zellen, die auf der Schale verblieben, wurden abgelöst und mit den Zellen in der zuvor gewonnen Zellsuspension gemischt. Die gemischte Zellsuspension wurde bei 1.000 U/min für 5 Minuten unter Verwendung einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge (TOMY RL601) zentrifugiert. Der Kulturüberstand wurde verworfen, und die ausgefällten Zellen wurden bei –80 °C gelagert. Nachdem 4 ml eines Homogenatpuffers (Zusammensetzung: 10 mM NaHCO₃, 5 mM EDTA, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 10 μg/ml Pepstatin-A, 20 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml E-64) zu den Niederschlägen zugegeben wurden (entsprechend einer Single Tray), wurden die Niederschläge durch Pipettieren suspendiert und die Suspension wurde unter Bedingungen bei Bewertungspunkt 4 für 20 Sekunden unter Verwendung von Polytron (Schaufeltyp PTA7) homogenisiert, was dreimal wiederholt wurde. Dann wurde das Homogenat bei 2.500 U/min für 10 Minuten unter Verwendung von Nr. 26 Rotor von Hitachi Hochgeschwindigkeitskühlzentrifuge CR26H zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde bei 35.000 U/min für eine Stunde unter Verwendung von SRP70AT Rotor der Ultrazentrifuge (Hitachi Koki, SCP70H) zentrifugiert. Zu den erhaltenen Niederschlägen wurden 5 ml eines Bindungsassaypuffers zugegeben (Zusammensetzung: 20 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 10 μg/ml Pepstatin-A, 40 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml E-64, 0,03 % NaN₃, pH 7,4), um sie zu suspendieren. Die Suspension wurde durch Cell Strainer (FALCON 2350) filtriert, wodurch die ZAQC-B1-Zellmembranfraktion (d. h. die ZAQ-Membranfraktion) oder I5E-4-Zellmembranfraktion (d. h. die I5E-Membranfraktion) erhalten wurde. Jede der Membranfraktionen wurde hinsichtlich ihres Proteinniveaus unter Verwendung von Coomassie-Proteinassayreagens (PIERCE) analysiert, und jeweils 100 μl wurden dispensiert und bei –80 °C gelagert.
(12-3) Bindungsassay
Die ZAQ-Membranfraktion und die I5E-Membranfraktion wurden mit 0,1 % BSA-enthaltendem Bindungsassaypuffer, der in (12-2) oben beschrieben wurde, auf 10 μg/ml bzw. 20 μg/l verdünnt, und jeweils 200 μl wurden in Röhrchen dispensiert (FALCON 2053). Zu jeder Verdünnung der Membranfraktionen wurden 2 μl einer Testverbindung bzw. 2 μl 10 nM ¹²⁵I-MIT1 zugegeben, gefolgt von Inkubation bei 25 °C für eine Stunde. Als die Testverbindung wurde menschentypisches ZAQ-Ligandenpeptid (ZAQL-1), erhalten gemäß der Verfahrensweise von REFERENZBEISPIEL 1, oder Schlangengift MIT1 (nicht-markiertes MIT1), erhalten in (8-1-3) oben, verwendet.
Dann wurden 1,5 ml eines filtrierenden Puffers (Zusammensetzung: 20 mM Tris, EDTA, 0,1 % BSA, 0,05 % CHAPS, 0,03 % NaN₃, pH 7,4) zur der Reaktionslösung zugegeben. Das Gemisch wurde direkt durch ein Glasfaserfilterpapier GF/F (Whatman) filtriert, der zuvor mit einem Puffer behandelt wurde (Zusammensetzung: 20 mM Tris, 0,3 % Polyethylenimin, pH 7,4), 1,5 ml des filtrierenden Puffers wurden erneut zu den Reaktionsröhrchen zugegeben, und das Gemisch wurde ebenso filtriert. Die Radioaktivität auf dem Glasfaserfilterpapier wurde unter Verwendung eines γ-Zählers gemessen (COBRA, Packard), wodurch die Bindungsmenge von ¹²⁵I-MIT1 bestimmt wurde. Die ¹²⁵I-MIT1-Bindungsmenge, wenn nicht-markiertes MIT1 (Endkonzentration von 1 μM) als eine Testverbindung verwendet wurde, wurde als nicht-spezifische Bindungsmenge (NSB) verwendet, die ¹²⁵I-MIT1-Bindungsmenge, wenn keine Testverbindung verwendet wurde, wurde als Gesamtbindungsmenge (TB) verwendet, und die maximale Bindungsmenge (TB – NSB) wurde berechnet. Ebenso wurde in bezug auf die Bindungsmenge (B), die erhalten wurde, wenn eine Testverbindung zugegeben wurde, die Bindungsmenge in Gegenwart einer Testverbindung durch den Prozentsatz einer spezifischen Bindungsmenge (B – NSB), berechnet auf die gesamte spezifische Bindung {%SPB = (B – NSB)/(TB – NSB) × 100}, ausgedrückt.
Die Ergebnisse, die unter Verwendung der ZAQ-Membranfraktion und der I5E-Membranfraktion erhalten wurden, werden in 15 bzw. 16 gezeigt.
Die IC₅₀-Werte des nicht-markierten MIT1, berechnet durch dieses Bindungsassaysystem, betrugen 38 pM (ZAQ-Membranfraktion) und 32 pM (I5E-Membranfraktion). Die IC₅₀-Werte von ZAQL-1 betrugen 35 pM (ZAQ-Membranfraktion) und 93 pM (I5E-Membranfraktion).
REFERENZBEISPIEL 1
Herstellung von menschentypischem ZAQ-Ligand (SEQ ID NR. 21) in Escherichia coli
(REFERENZBEISPIEL 1-1)
Konstruktion von menschentypischem ZAQ-Ligand-exprimierenden Plasmid in Escherichia coli
(a) Unter Verwendung der folgenden sechs DNA-Fragmente #1 bis #6 wurde die Struktur-DNA des ZAQ-Liganden hergestellt.
(b) Phosphorylierung von DNA-Oligomer
Jeder der vier DNA-Oligomere (#2 bis #5), außer #1 und #6, die das 5'-Ende bilden sollten, wurde bei 37 °C für eine Stunde in 25 μl Reaktionslösung zur Phosphorylierung umgesetzt [10 μg DNA-Oligomer, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl₂, 1 mM Sperimidin, 10 mM Dithiothreitol (hierin nachstehend als DTT abgekürzt), 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin (hierin nachstehend als BSA abgekürzt), 1 mM ATP, 10 Einheiten von T4-Polynukleotidkinase (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.)], um das 5'-Ende von jedem Oligomer zu phosphorylieren. Nach der Phenolbehandlung, gefolgt von der Zugabe vom 2fachen Volumen an Ethanol wurde das Gemisch auf –70 °C abgekühlt und zentrifugiert, wodurch DNA ausfiel.
(c) Ligation des DNA-Fragments
Das oben in (b) erhaltene DNA-Fragment wurde mit #1 und #6 oben kombiniert, um das Volumen von 120 μl zu erhalten. Das Gemisch wurde zum Annealing bei 90 °C für 10 Minuten gehalten und allmählich auf Raumtemperatur abgekühlt. Unter Verwendung von TaKaRa DNA Ligation Kit ver. 2 (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.) wurde die Ligation durchgeführt. Nachdem 30 μl der Lösung II, zugeführt mit dem Kit, zu 30 μl der Annealing-Lösung zugegeben wurden, um es gründlich zu mischen, wurden 60 μl der Lösung I, zugeführt mit dem Kit, zu dem Gemisch zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37 °C für eine Stunde zur Ligation umgesetzt, gefolgt von Phenolbehandlung. Die wässerige Phase wurde gewonnen und 2 Volumen an Ethanol wurden dazugegeben. Das Gemisch wurde auf –70 °C abgekühlt und dann zentrifugiert, wodurch die DNA ausfiel. Das so erhaltene DNA-Fragment wurde unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.), und dann für den folgenden Schritt (d) bereitgestellt.
(d) Konstruktion des ZAQ-Ligandenexpressionsvektors
Nachdem pTCII (beschrieben in der japanischen offengelegten Patentanmeldung Nr. 2000-178297) mit NdeI und BamHI (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.) bei 37 °C für 2 Stunden digeriert wurde, wurde das DNA-Fragment von 4,3 kb, das durch 1 % Agarosegelelektrophorese getrennt wurde, unter Verwendung von QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) extrahiert und in 25 μl TE-Puffer gelöst. Die NdeI- und BamHI-Fraktionen von diesem pTCII wurden mit dem Strukturgen (SEQ ID NR. 58) vom oben hergestellten ZAQ-Liganden unter Verwendung von TaKaRa DNA Ligation Kit ver. 2 (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.) ligiert, wodurch der Expressionsvektor hergestellt wurde. Unter Verwendung von 10 μl der Reaktionslösung wurden E. coli JM109 kompetente Zellen (TOYOBO) transformiert und auf LB-Agarmedium, enthaltend 10 μg/ml Tetracyclin, inokuliert, gefolgt von Inkubation bei 37 °C über Nacht. Die gebildete Tetracyclin-resistente Kolonie wurde ausgewählt. Die Transformante wurde in LB-Medium über Nacht inkubiert, und Plasmid pTCh1ZAQ wurde unter Verwendung von QIAprep8 Miniprep Kit (QIAGEN) hergestellt. Die Basensequenz von dieser ZAQ-Liganden-DNA wurde unter Verwendung von Model 377 DNA Sequenzer von Applied Biosystems, Inc. identifiziert. Plasmid pTCh1ZAQ wurde zu Escherichia coli MM294 (DE3) transfektiert, um den ZAQ-Ligandexpressionstamm, Escherichia coli MM294 (DE3)/pTCh1ZAQ, zu erhalten.
(REFERENZBEISPIEL 1-2)
Herstellung des ZAQ-Liganden
In einem 2-Liter-Kolben wurde oben beschriebenes Escherichia coli MM294 (DE3)/pTCh1ZAQ unter Schütteln in 1 Liter des LB-Mediums (1 % Pepton, 0,5 % Hefeextrakt und 0,5 % Natriumchlorid), ergänzt mit 5,0 mg/l Tetracyclin, bei 37 °C für 8 Stunden kultiviert. Das erhaltene kultivierte Medium wurde zu einem Fermentationsbehälter mit 50 l Volumen übertragen, der mit 19 l Hauptfermentationsmedium beschickt ist (1,68 % Natriummonohydrogenphosphat, 0,3 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1 % Ammoniumchlorid, 0,05 % Natriumchlorid, 0,05 % Magnesiumsulfat, 0,02 % Antischaummittel, 0,00025 % Eisen(II)-sulfat, 0,0005 % Thiaminhydrochlorid, 1,5 % Glukose, 1,5 % Hy-Case Amino), und das Rühren an der Luft wurde bei 30 °C initiiert. Wenn die Trübheit des kultivierten Mediums 500 Klett erreichte, wurde Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid in einer Endkonzentration von 12 mg/l zugegeben, und die Inkubation wurde für weitere 4 Stunden fortgesetzt. Nach der Beendigung der Kultur wurde das Kulturmedium zentrifugiert, wodurch etwa 200 g nasse Zellen erhalten wurden. Die Zellen wurden bei –80 °C gelagert.
Diese Transformante Escherichia coli MM294 (DE3)/pTCh1ZAQ ist im Institute for Fermentation, Osaka (IFO) unter der Zugangsnummer IFO 16527 hinterlegt.
(REFERENZBEISPIEL 1-3)
Aktivierung des ZAQ-Liganden
Mittels Zugeben von 400 ml eines Gemisches aus 200 mM Tris/HCl und 7 M Guanidinhydrochlorid (pH 8,0) zu 200 g der in REFERENZBEISPIEL (1-2) erhaltenen Zellen wurden die Zellen darin gelöst, und die Lösung wurde zentrifugiert (10.000 U/min, 1 Stunde). Zu dem Überstand wurden 10 l eines Gemisches aus 0,4 M Arginin, 50 mM Tris/HCl, 0,2 mM GSSG und 1 mM GSH (pH 8,0) zugegeben, und das Gemisch wurde bei 4 °C über Nacht zur Aktivierung gehalten.
(REFERENZBEISPIEL 1-4)
Reinigung des ZAQ-Liganden
Die regenerierende Lösung nach der Aktivierung in REFERENZBEISPIEL (1-3) wurde auf pH 6,0 eingestellt und auf einer SP-Sepharose-Säule (11,3 cm × 15 cm), äquilibriert mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,0), adsorbiert. Die Säule wurde mit 600 mM NaCl/50 mM Phosphatpuffer (pH 6,0) eluiert, und die Fraktionen, enthaltend den ZAQ-Liganden, wurden zusammengefaßt. Die Fraktion wurde durch CM-5PW (21,5 mm × 150 mm Länge), äquilibriert mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,0), geführt und darauf adsorbiert. Nach dem Waschen wurde die Elution mit einem schrittweisen Gradienten (60 Minuten) von 0 bis 100 % B (B = 50 mM Phosphatpuffer + 1 M NaCl, pH 6,05) durchgeführt, wodurch die ZAQ-Ligandenfraktion (Elutionszeit: ca. 40 Minuten) erhalten wurde. Diese Fraktion wurde weiter durch C4P-50 (21,5 mm Innendurchmesser × 300 mm Länge, Showa Denko), äquilibriert mit 0,1 % Trifluoressigsäure, geführt und darauf adsorbiert. Nach dem Waschen wurde die Elution mit einem schrittweisen Gradienten (60 Minuten) von 25 bis 50 % B (B = 80 % Acetonitril/0,1 % Trifluoressigsäure) durchgeführt. Die ZAQ-Ligandenfraktionen (Elutionszeit: ca. 40 Minuten) wurden zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 80 mg des lyophiliserten ZAQ-Ligandenpulvers erhalten wurden.
(REFERENZBEISPIEL 1-5)
Charakterisierung des ZAQ-Liganden
(a) Analyse unter Verwendung von SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Der ZAQ-Ligand, erhalten in dem REFERENZBEISPIEL (1-4), wurde in Probenpuffer [Laemmli, Nature, 227, 680 (1979)], ergänzt mit 100 mM DTT, suspendiert. Die Suspension wurde bei 95 °C für 1 Minute erhitzt, gefolgt von Elektrophorese auf Multigel 15/25 (Daiichi Kagaku Yakuhin). Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie-Brilliantblau eingefärbt, und eine einzelne Proteinbande wurde an derselben Stelle als die des COS7-Zellenabgeleiteten rekombinanten ZAQ-Ligandenpräparats, erhalten in BEISPIEL 5, nachgewiesen. Basierend darauf wurde offenbart, daß das E. coli-abgeleitete rekombinante ZAQ-Ligandenpräparat, erhalten in REFERENZBEISPIEL (1-4), eine sehr hohe Reinheit aufwies und dasselbe Molekulargewicht wie das des rekombinanten ZAQ-Liganden, hergestellt aus COS7-Zellen, aufwies.
(b) Analyse der Aminosäurezusammensetzung
Die Aminosäurezusammensetzung wurde unter Verwendung eines Aminosäureanalysators bestimmt (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer). Die Ergebnisse offenbaren, daß die Aminosäurezusammensetzung mit der Aminosäurezusammensetzung übereinstimmte, die aus der Basensequenz der DNA von ZAQ-Ligand abgeleitet wurde (Peptid, umfassend die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 21 dargestellt ist) (Tabelle 2). TABELLE 2
Säurehydrolyse (Mittelwert in Hydrolyse mit 6N HCl-1 % Phenol bei 110 °C für 24 und 48 Stunden)

¹⁾Wert, extrapoliert bei 0 Stunden
²⁾nicht nachgewiesen

(c) Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde unter Verwendung eines Gasphasen-Proteinsequenzers bestimmt (PE Applied Biosystems, Model 492). Im Ergebnis stimmte die Aminosäuresequenz mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des ZAQ-Liganden überein, der von der Basensequenz der erhaltenen ZAQ-Liganden-DNA abgeleitet wurde (Tabelle 3). TABELLE 3

¹⁾Analyse wurde unter Verwendung von 150 pmol Phenylthiohydantoin durchgeführt. N.D. nicht nachgewiesen

(d) Analyse der C-terminalen Aminosäure
Die C-terminale Aminosäuresequenz wurde unter Verwendung einer Aminosäure bestimmt (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer). Der erhaltene ZAQ-Ligand stimmte mit der C-terminalen Aminosäuresequenz überein, die aus der Basensequenz von DNA abgeleitet ist (Tabelle 4). TABELLE 4

Gasphasenhydrazinolyseverfahren (100 °C, 3,5 Stunden)

(e) Massenspektrometrie
Massenspektrometrie wurde unter Verwendung von LCQ-Ion-Trap-Massenspektrometer (hergestellt von ThermoQuest, Inc.), ausgestattet mit Nano-ESI-Ionenquellen, durchgeführt. Im Ergebnis wurde das Molekulargewicht von 9657,55 ± 0,89 gefunden und stimmte gut mit dem berechneten Molekulargewicht (9657,3) des ZAQ-Liganden, der durch SEQ ID NR. 21 dargestellt ist, überein, worin 10 Cys-Reste, die in SEQ ID NR. 21 enthalten sind, 5 Paare von Disulfidbindungen bildeten.
(REFERENZBEISPIEL 1-6)
Assay für ZAQ-Liganden (Assay für die die intrazelluläre Ca-Ionenkonzentration erhöhende Aktivität unter Verwendung von FLIPR)
Das gereinigte rekombinante ZAQ-Ligandenpräparat, abgeleitet von Escherichia coli, das in REFERENZBEISPIEL (1-4) hergestellt wurde, wurde hinsichtlich der Aktivität (Assay für die die intrazelluläre Ca-Ionenkonzentration erhöhende Aktivität unter Verwendung von FLIPR) durch das Verfahren in BEISPIEL 5 analysiert. Im Ergebnis wies es eine Aktivität auf, äquivalent zu der des COS7-abgeleiteten rekombinanten Präparats (gereinigter ZAQ-Ligand), erhalten in BEISPIEL 5.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Das Peptid der Erfindung, die DNA, die das Peptid der Erfindung kodiert (hierin nachstehend manchmal nur als die erfindungsgemäße DNA bezeichnet), und der Antikörper zu dem Peptid der Erfindung (hierin nachstehend manchmal nur als der erfindungsgemäße Antikörper bezeichnet) sind zum Implementieren (1) von Mitteln zur Vorbeugung/Behandlung von verschiedenen Krankheiten, die mit dem Peptid der Erfindung verbunden sind; (2) Screenen einer Verbindung oder seines Salzes, die die Bindungseigenschaft zwischen dem Peptid der Erfindung und dem Protein der Erfindung verändert; (3) Quantifikation des Peptids der Erfindung oder seines Salzes; (4) ein Mittel zur Gendiagnose; (5) Arzneimittel, die die Antisense-DNA umfassen; (6) Arzneimittel, die den erfindungsgemäßen Antikörper umfassen; (7) Präparieren von nicht-menschlichen Tieren, die die erfindungsgemäße DNA tragen; (8) Arzneimitteldesign, basierend auf dem Vergleich zwischen Liganden und Rezeptoren, die strukturell analog sind, usw. nützlich [SEQUENZPROTOKOLL]

[SEQUENZPROTOKOLL]

Claims

Peptid bestehend aus der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 21 dargestellt ist, oder ein Salz davon.
Peptid oder sein Salz nach Anspruch 1, das aus der in SEQ ID NO: 20 dargestellten Aminosäuresequenz besteht.
Peptid oder sein Salz nach Anspruch 1, das aus der in SEQ ID NO: 21 dargestellten Aminosäuresequenz besteht.
Polynukleotid bestehend aus einem Polynukleotid, das für das Peptid nach Anspruch 1 kodiert.
Polynukleotid nach Anspruch 4, das eine DNA ist.
DNA nach Anspruch 5, enthaltend die Basensequenz, die in SEQ ID NO: 26 oder SEQ ID NO: 27 dargestellt ist.
Rekombinanter Vektor enthaltend das Polynukleotid nach Anspruch 4.
Transformant, transformiert mit dem rekombinanten Vektor nach Anspruch 7.
Verfahren zur Herstellung des Peptids oder seines Salzes nach Anspruch 1, das umfasst, dass man den Transformanten von Anspruch 8 kultiviert und das Peptid nach Anspruch 1 produziert/akkumuliert.
Antikörper gegen das Peptid oder sein Salz nach Anspruch 1.
Arzneimittel umfassend das Peptid oder sein Salz nach Anspruch 1.
Arzneimittel nach Anspruch 11, das ein Mittel zur Vorbeugung/Behandlung einer Verdauungserkrankung ist.