KR0182853B1 - 자가면역 질환의 진단 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 자가 면역 질환을 진단하고자 하는 피검 대상의 체액 중에 마이크로튜블 조직화 중심(Microtubule organizing center), 여기에서 뻗어 나간 마이크로튜블(Microtubule) 또는 이들에 동반되는 단백질에 대한 자가 항체(항 MTOC-MT 항체)를 면역학적 검사법으로 검출하는 것을 특징으로 하는 피검 환자의 자가 면역 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 종래의 방법에 비하여 특이성이 높고 민감도가 높은 장점을 갖는다.

Description

자가면역 질환의 진단 방법
제1도는 IT-1 세포를 이용하여 항 MTOC-MT 항체를 간접면역형광법에 의해 검출한 것을 보여주는 형광 현미경 사진이다. IT-1 세포 핵 옆에 붙어 있는 MTOC와 여기에서 뻗어 나간 MT가 관찰된다.
본 발명은 자가 면역 질환의 진단 방법에 관한 것이고, 보다 구체적으로는 인체 유래의 조직 또는 세포에 존재하는 마이크로튜블 조직화 중심 및/또는 여기에서 뻗어나간 마이크로튜블 및/또는 이들에 동반되는 단백질에 대한 항체를 면역학적 방법으로 검출함으로써 자가 면역 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.
면역 체계의 이상에 의하여, 외부의 물질이 아니라 인체 내에 존재하는 물질에 대해 항체를 형성함으로써 여러 가지 면역 질환을 일으키는 자가 면역 질환은 크게 전신성 류마티스성 질환과 국소 자가 면역 질환으로 나누어진다. 이중, 전신성 류마티스성 질환은 전신성 홍반낭창(SLE), 류마티스 관절염, 다발성 근염 등을 비롯하여 총 100여종의 질환으로 다시 분류된다.
류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)은 전체 인구의 약 5% 이상에서 발견되는 발병 빈도가 매우 높은 질환으로서, 그 증상은 손가락 마디가 뻣뻣해지고, 관절이 붓고 아프며, 발열과 빈혈, 관절 아래에 형성되는 피하 결절이 나타나고, 관절이 변형되는 것으로 대표된다.
류마티스 관절염은 원인이 다양하기 때문에 특별한 치료법도 없으며, 동시에 정확하게 진단하는 것도 용이하지 않다.
지금까지 사용되어 오고 있는 진단 방법으로는 류마토이드 인자(rheumatoid factor)의 존재를 면역학적으로 검사하는 것이었다. 그러나 류마토이드 인자를 검출하는 면역 반응은 류마티스 관절염 환자 모두에게서 나타나는 반응이 아니며, 다른 자가 면역 질환이나 감염성 질환을 갖는 환자, 나아가서는 정상인에서도 5-20%정도의 양성 반응이 검출되는 문제점이 있다(ARA Glossary Committee, Dictionary of the rheumatic disease 11, diagnostic testing p. 17, 1985).
이를 개선하기 위하여 항 케라틴, 항 핵주변인자, 항 RA-33 항체 등이 개발되었고, 이들의 개발에 따라 류마티스 관절염의 진단 특이성은 증가되었지만, 예민도가 낮아 실용화되지 못하고 있다.
특히 항핵 항체(anti-nuclear antibody, ANA)검사법은 자가 면역 질환을 진단하는 방법으로 가장 널리 사용되고 있지만, HEp-2 세포주를 주로 이용하는 종래 방법에서는 주 진단 대상이 전신성 홍반난창이고, 류마티스 관절염을 진단하기 위해서는 추가적으로 별도의 류마토이드 인자 검출법을 시행하여야 하는 번거로움도 있었다.
이러한 상황하에서, 류마티스 관절염을 비롯한 자가 면역 질환의 진단에 관하여 이미 대식세포가 종래의 HEp-2세포보다 훨씬 유용하게 사용될 수 있다는 것을 밝히고 대식세포주(IT-1 세포주)를 확립한 바 있는 본 발명자는 계속된 연구의 결과, 놀랍게도 모든 류마티스 관절염 환자의 체액에 마이크로튜블 조직화 중심(Microtubule organizing center, 이하 MTOC라 한다) 및/또는 여기에서 뻗어 나간 마이크로튜블(Microtubule, 이하 MT라 한다)에 대한 항체(이하 항 MTOC-MT항체라 한다)가 존재하는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 높은 특이성과 민감도로 자가 면역 질환을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인체 유래의 조직 또는 세포주와 자가 면역 질환 환자의 체액 시료를 접촉시키고, 상기 조직 또는 세포주 중에 존재하는 MTOC 및/또는 MT 및/또는 여기에 동반되는 단백질이 환자 체액 중의 항 MTOC-MT 항체와 반응하였는지의 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 자가 면역 질환의 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 인체 유래의 조직 또는 세포주를 이용하여 항 핵 항체, 항 세포질 항체 및 항 MTOC-MT 항체를 동시에 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 인체 유래의 조직 또는 세포주를 고정시킨 슬라이드를 준비하는 단계; 자가 면역 질환을 진단하고자 하는 피검 대상이 체액 시료를 준비하는 단계; 상기에서 준비한 슬라이드 상의 조직 또는 세포주와 피검 대상의 체액 시료를 접촉시키고 배양하는 단계; 및 피검 대상의 체액 시료 중에 조직 또는 세포주 내의 MTOC, MT 또는 이들에 동반되는 단백질과 면역학적으로 반응하는 항 MTOC-MT 항체가 존재하는 지를 검출하는 단계를 포함하는 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 적용은 하기 발명의 상세한 설명란에 의해 당업자에게 보다 명백하게 드러날 것이다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 류마티스 관절염 환자의 혈액 중에는, 인체에서 유래된 모든 세포 및 조직의 세포 구성 성분 중 하나인 MTOC 및/또는 여기로부터 뻗어 나간 MT 및/또는 이들에 동반되는 단백질에 대한 자가항체가 존재하는 것을 본 발명자가 최초로 발견한 것에 기초하여 완성된 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 항 MTOC-MT 항체는 항 MTOC항체, 항 MT-항체, 그리고 MTOC 및 MT 및 여기에 동반되는 단백질에 대한 항체 모두를 포함하는 의미를 사용되었다. 여기에서 항체는 자가 항체이며, 자가 면역 질환, 특히 관절염 환자의 체액 중에 존재한다.
본 명세서에서 사용된 용어 MTOC-MT 는 MTOC, MT, 그리고 여기에 동반되는 단백질을 개별적으로 또는 전체적으로 지칭하기 위하여 사용되었다. 이는, 자가 면역 질환 환자의 체액에 존재하는 자가항체가 이들 중 어느 하나에만, 또는 두 가지에, 또는 이들 모두에 면역학적으로 반응하는 것이 가능하기 때문이다.
본 발명에서 자가 면역 질환 환자의 체액에 존재하는 항 MTOC-MT 항체를 검출하기 위해 사용할 수 있는 인체에서 유래된 조직 또는 세포주는 그의 기원에 제한을 받지 않는다. 그러나, 진단 상의 편의와 신속함을 도모하기 위하여는 이미 확립되어 있는 것을 사용하는 것이 유리하고, 예를 들면 대식세포에서 유래된 IT-1세포주(KFCC 10772) 또는 인간 암세포 세포주인 HEp-2 (ATCC CCL 23) 세포주를 편리하게 이용할 수 있다. 특히, IT-1 세포주는 대식세포계로서 MTOC와 MT를 보다 정확하고 선명하게 진단할 수 있게 하기 때문에 유리하다.
이들은 나아가 보다 간단한 진단을 위하여 슬라이드에 고정시켜 사용할 수 있다.
상기 인간 조직 또는 세포주를 슬라이드에 부착 또는 고정시키는 것은 통상의 방법으로 할 수 있으며, 고정 시간, 고정 온도 및 고정에 사용되는 용매의 종류 등은 당업자가 실험에 의해 결정할 수 있는 변수들이며, 본 발명이 이들에 의해 제한을 받는 것은 아니다. 그러나, 유기 용매, 예를 들면 에탄올, 아세톤, 메탄올, 또는 이들의 혼합물 등을 유리하게 이용할 수 있다.
인간 조직 또는 세포주를 슬라이드에 부착시킴에 있어서, 이들을 계면활성제로 처리하여 세포막을 제거하면 면역 반응의 결과의 관찰을 용이하게 하는 점에서 유리하다. 이 목적을 위해 사용할 수 있는 대표적인 계면활성제로는 트리톤-X(Triton-X)를 예시할 수 있다. 그러나, 계면활성제를 이용하여 세포주 또는 조직을 처리하는 경우, 항 핵 항체는 검출되지 않는다.
인간 조직 또는 세포주 중의 MTOC-MT 와 류마티스 관절염 환자의 체액 시료중의 자가항체가 반응했는지의 여부를 확인하는 것은 간접면역형광법을 이용하여 실시할 수 있지만, 이 방법에만 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 종래에는 보다 정확한 자가 면역 질환을 진단하기 위하여 두 가지 이상의 별개의 검사 (예를 들면, ANA(Anti nuclear antibody) 검사법 및 류카토이드 인자 검사법)을 시행하여야만 했던 것에 반하여, 인간 조직 또는 세포주로서 기왕에 ANA 검사법에 사용되던 대식세포에서 유래된 IT-1 또는 인간 암세포 주인 HEp-2등을 사용하는 경우에는 항 MTOC-MT 항체뿐만 아니라 항핵(抗核 : anti-nuclear) 항체까지도 검출할 수 있기 때문에 류마티스 관절염뿐만 아니라 보다 광범위한 자가 면역 질환의 진단이 가능해진다.
피검 환자의 체액 시료로는 전혈, 혈청, 혈장 등의 혈액, 또는 관절액, 또는 늑막액 등이 사용될 수 있다.
인간 유래의 조직 또는 세포주를 이용한 류마티스 관절염의 진단 방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
준비된 슬라이드에 1 : 20부터 1 : 1280으로 2배수 희석한 류마티스 관절염 환자의 체액 시료 30마이크로리터를 떨어뜨리고, 고습도에서 30분간 실온에서 반응시킨 뒤, 인산완충액이 채워진 코프란병에 넣고 진탕기로 200rpm으로 진탕하여 세척하고 건조시킨다. 1 : 40으로 희석한 FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트 : Fluorescein isothiocyanate)로 라벨화된 인간 감마 글로블린에 대한 토끼 항체(다코사 제품) 30마이크로리터를 각 슬라이드에 적용하여 고습도에서 30분간 실온에서 반응시켰다. 인산완충액으로 세척한 뒤, 0.2% 에반스 블루액(시그마사 제품)으로 카운터 염색하고 인산완충액으로 세척한다. 잔존하는 인산완충액을 여과지로 흡수시키고, 인산완충액-글리세롤 용액으로 마운팅하여 형광현미경 상에서 관찰한다.
형광 양상은 MTOC가 핵 부근에서 원형 또는 반지(ring)형으로 관찰되며, 이곳으로부터 실 모양으로 뻗어 나간 MT가 관찰된다(제1도 참조). 이는 세포 형태학상 MTOC와 MT의 특징적인 소견으로서 (Molecular Biology of the Cell, 3rd Ed., Garland, pp 789-795), 따라서, 자가 면역 질환, 특히 류마티스 관절염 환자의 체액에서 검출된 자가 항체는 상기 MTOC-MT 및 이에 동반되는 단백질에 대한 항체인 것으로 간주된다. 상기에서 설명한 것과 같은 제1도에 도시된 형태의 형광 양상을 '핵 주변의 큰 단일 과립 형태로서 그로부터 모양으로 뻗어 나간 실을 갖는 것(perinuclear single large granular with skeleton)이라고 명명하였고, 이는 류마티스 관절염 환자에 특징적인 면역학적 형광 검사법의 소견이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에만 국한된 것은 아니다.
[실시예 1]
10% 송아지 혈청을 첨가한 RPMI-1640에서 배양된 IT-1 세포 2 x 10 4 cell/ml을 다수의 구멍이 그려져 있는 슬라이드에 옮기고, 5% 탄산개스로 조절된 세포배양기에서 37℃, 24시간 이상 배양하였다. 각 슬라이드로부터 배양액을 제거하고, 인산완충액으로 세척한 후, 아세톤-메탄올 혼합액(1 : 1 )에 5분간 담궈 고정하였다.
영하 70℃에서 보관 중인 269명의 류마티스 관절염 환자의 혈청을 1 : 20부터 1 : 1280으로 2배수 희석하여 각 30마이크로리터를 준비된 슬라이드에 떨어뜨리고, 고습도에서 30분간 실온에서 반응시킨 뒤, 인산완충액이 채워진 코프란병에 넣고 진탕기로 200rpm으로 진탕하여 세척하고 건조시켰다.
1 : 40으로 희석된 FITC로 라벨화된 인간 감마 글로블린에 대한 토끼 항체(다코사 제품) 30마이크로리터를 각 슬라이드에 적용하고, 인산완충액-글리세롤 용액으로 마운팅하여 형광현미경 상에서 관찰하였다.
그 결과를 제1도에 나타내었는데, MTOC가 핵 부근에서 원형 또는 반지(ring)형으로 관찰되며, 이곳으로부터 실 모양으로 뻗어 나간 MT, 즉 핵 주변의 큰 단일 과립 형태로서 그로부터 모양으로 뻗어 나간 실을 갖는 것(perinuclear single large granular with skeleton) 형광 양상이 관찰되었다.
[비교예 1]
류마토이드 인자 검출을 이용한 진단 방법
실시예 1에서 사용한 것과 동일한 류마티스 관절염 환자의 피검 혈청 0.05ml씩을 슬라이드에 떨어뜨리고, 사람 감마-글로블린 유액(야트론사 제품)을 동량 첨가하고, 혼합하였다. 1분 후 슬라이드를 종횡으로 완만하게 움직여 응집을 관찰하였다.
[결과]
실시예 1과 비교예 1의 반응 모두에서 양성을 나타낸 경우는 148건(55%), 류마토이드 인자는 음성이고 본 반응은 양성인 경우 62건(23%), 류마토이드 인자는 양성이고 본 반응은 음성인 경우 42건(16%), 두 반응 모두 음성인 경우는 17건(6%)이었다.
이상의 결과로서, 항 MTOC-MT 항체가 류마토이드 인자에 비하여 높은 예민도를 나타내어 위음성(false negative)을 줄일 수 있음이 확인된다.
[실시예 2]
정상인 125명의 혈액에 대하여 실시예 1 및 비교예 1과 동일하게 반응을 행하였다.
양성 반응은 1 : 20배 희석 배율에서 때 5건(4%)이었다. 이때 류마토이드 인자 반응에서 양성을 나타낸 것은 12건 (9.6%)이었다. 따라서 본 발명의 방법은 종래의 류마토이드 인자 검출에 의한 진단 방법에 비해 위양성(false positive) 반응율이 감소되고 따라서 특이성이 높아진 것을 확인할 수 있다.
[실시예 3]
류마토이드 인자 반응(비교예 1)과 본 발명의 반응(실시예 1)에서 모두 양성을 나타낸 류마티스 관절염 환자 12명의 혈액을 대상으로 시판 중인 HEp-2 세포주(미국 Kallestad 또는 일본 MBL사 제품)를 IT-1세포주 대신 사용하여 실시예 1의 반응을 실시하였다.
두 회사 제품 모두에서 항 MT 항체 반응은 관찰되었으나, 실시예 1에서 사용된 IT-1 세포주에 비해서는 반응 강도가 미약하였고, 항 MTOC 항체는 IT-1 세포주보다 훨씬 작은 크기로 드물게 관찰되었다.
[실시예 4]
실시예 1과 동일하게 하여 실시하되, 세포주를 계면활성제인 트리톤-X(0.5%)로 처리하여 슬라이드를 제작하고, 이를 이용하여 실험을 실시하였다. 그 결과, 실시예 1의 결과에 비하여 보다 선명한 결과를 관찰할 수 있었다.
[실시예 5]
류마티스 관절염 환자는 관절이 붓고 관절액이 증가하므로 혈액 대신 관절액을 이용하여 진단을 행할 수 있다. 실시예 1과 동일하게 실시하되, 류마티스 관절염 환자 10명의 혈액 대신에 관절액을 취하여 실험을 행하였다. 그 결과, 전원에게서 항 MTOC-MT 항체가 검출되었다.

Claims (12)

  1. 자가 면역 질환을 진단하고자 하는 피검대상의 체액 시료와 세포주 또는 조직을 접촉시키고; 상기 세포주 또는 조직중에 존재하는 마이크로튜블 조직화 중심 및 여기에서 뻗어 나간 마이크로튜블 또는 이들에 동반되는 단백질(MTOC-MT)과, 상기 체액 시료중의 상기 MTOC-MT에 대한 자가항체(항 MTOC-MT 항체)와의 항원-항체 반응 유무를 확인하는 것을 특징으로 하는 자가 면역 질환을 진단하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 자가 면역 질환은 류마티스 관절염임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기한 세포주 또는 조직은 인체 유래의 세포주 또는 조직임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기한 인체 유래의 세포주 또는 조직은 HEp-2 세포주, 대식세포 또는 대식세포주임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기한 대식세포주는 IT-1 세포주(KFCC 10772)임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항, 제3항, 제4항, 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기한 세포주 또는 조직은 슬라이드에 직접 부착하거나 세포배양 후 고정시켜 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 부착 또는 고정은 유기 용매를 이용하여 행함을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항, 제3항, 제4항, 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기한 세포주 또는 조직은 계면활성제로 처리된 것임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 항원-항체 반응 유무는 간접 면역형광법으로 핵 주변의 큰 단일 과립형태로서 그로부터 모양으로 뻗어 나간 실을 갖는 것(perinuclear single large granular with skeletone)의 형광양상을 관찰하여 확인함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항, 제3항, 제4항, 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 항 MTOC-MT 항체와 동시에 항핵항체 및 항세포질 항체를 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 피검 대상의 체액 시료는 혈액 또는 관절액임을 특징으로 하는 방법.
  12. 세포주 또는 조직과의 접촉에 의해, 상기 세포주 또는 조직중에 존재하는 마이크로튜블 조직화 중심 및 여기에서 뻗어 나간 마이크로튜블 또는 이들에 동반되는 단백질(MTOC-MT)에 대한 항원-항체 반응성을 나타내는 상기 MTOC-MT에 대한 자가항체(항 MTOC-MT 항체).
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