JP2892814B2 - 抗結核菌抗体様物質の測定法 - Google Patents
抗結核菌抗体様物質の測定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は、癌の診断に利用することのできる抗結核菌
抗体様物質の測定法、該測定法に使用するキットおよび
該測定法で得られた値をもとに癌の発生の有無を判定す
る方法に関するものである。
抗体様物質の測定法、該測定法に使用するキットおよび
該測定法で得られた値をもとに癌の発生の有無を判定す
る方法に関するものである。
[従来の技術] 現在、CEA、α−フェトプロティンなどの癌マーカー
は40種以上報告されており、そのなかのいくつかは実際
の癌の診断に使用されている。
は40種以上報告されており、そのなかのいくつかは実際
の癌の診断に使用されている。
しかし、これらの癌マーカーは、初期癌(前癌状
態)を測定できない、正確な診断を下すためには多種
類の癌マーカーを測定しなければならない、などの欠点
を有していた。
態)を測定できない、正確な診断を下すためには多種
類の癌マーカーを測定しなければならない、などの欠点
を有していた。
これら従来の癌マーカーの欠点を克服するため、新し
い癌マーカーが研究され、たとえばCEAと特異的に反応
する免疫グロブリン(特開昭60−138469)、O−結合オ
リゴ糖を有する免疫グロブリンA(特開平1−305355)
などが報告されている。しかし、これらの癌マーカーが
従来の癌マーカーの欠点を克服できるものであるか否か
は今後の研究を待たねばならない。
い癌マーカーが研究され、たとえばCEAと特異的に反応
する免疫グロブリン(特開昭60−138469)、O−結合オ
リゴ糖を有する免疫グロブリンA(特開平1−305355)
などが報告されている。しかし、これらの癌マーカーが
従来の癌マーカーの欠点を克服できるものであるか否か
は今後の研究を待たねばならない。
[発明が解決しようとする課題] 上述したように、1つのアイテムを測定することによ
り癌の発生の有無を判定できる方法、特に初期癌の発生
の有無を判定できる方法は未だ開発されていないのが現
状である。
り癌の発生の有無を判定できる方法、特に初期癌の発生
の有無を判定できる方法は未だ開発されていないのが現
状である。
したがって、本発明は、1つのアイテムを測定するこ
とにより癌、とりわけ初期状態の癌を判定することので
きる方法の提供を主目的とするものである。
とにより癌、とりわけ初期状態の癌を判定することので
きる方法の提供を主目的とするものである。
[課題を解決するための手段] 本発明者は、癌を診断する方法に関し、種々研究を重
ねた結果、癌患者の血清中に、癌の発生に関連性を有し
且つ結核菌菌体および抗免疫グロブリン抗体の両者に反
応性を有する抗結核菌抗体様物質が特に高濃度に存在す
ることを発見し、該抗結核菌抗体様物質が癌マーカーと
して優れた特性を有することを見い出し、本発明を完成
させた。
ねた結果、癌患者の血清中に、癌の発生に関連性を有し
且つ結核菌菌体および抗免疫グロブリン抗体の両者に反
応性を有する抗結核菌抗体様物質が特に高濃度に存在す
ることを発見し、該抗結核菌抗体様物質が癌マーカーと
して優れた特性を有することを見い出し、本発明を完成
させた。
すなわち、本発明は、 試料中に存在する、癌の発生に関連性を有し且つ結核
菌菌体および抗免疫グロブリン抗体の両者と反応する抗
結核菌抗体様物質を、結核菌菌体および抗免疫グロブリ
ン抗体を用いて測定することを特徴とする抗結核菌抗体
様物質の測定法; 少なくとも下記の試薬から構成される抗結核菌抗体様
物質の測定用キット: 結核菌菌体及び 抗免疫グロブリン抗体;及び 上記の測定法で測定した値をもとに癌の発生の有無を
判定する方法に関するものである。
菌菌体および抗免疫グロブリン抗体の両者と反応する抗
結核菌抗体様物質を、結核菌菌体および抗免疫グロブリ
ン抗体を用いて測定することを特徴とする抗結核菌抗体
様物質の測定法; 少なくとも下記の試薬から構成される抗結核菌抗体様
物質の測定用キット: 結核菌菌体及び 抗免疫グロブリン抗体;及び 上記の測定法で測定した値をもとに癌の発生の有無を
判定する方法に関するものである。
以下、本発明について詳述する。
本明細書において、以下の用語は下記の定義のとおり
である。
である。
「抗結核菌抗体様物質」とは、結核菌菌体および抗免
疫グロブリン抗体の両方に反応する物質であって、健常
人の血液中にも存在するが、特に癌患者の血液中に高濃
度に存在し特定の癌に特異的に出現するものではなく且
つ初期癌の患者の血液中においても出現するものであっ
て癌の発生に関連性を有する物質を意味する。
疫グロブリン抗体の両方に反応する物質であって、健常
人の血液中にも存在するが、特に癌患者の血液中に高濃
度に存在し特定の癌に特異的に出現するものではなく且
つ初期癌の患者の血液中においても出現するものであっ
て癌の発生に関連性を有する物質を意味する。
「結核菌」とはミコバクテリウム・ツベルクロシス
(Mycobacterium tuberculosis)に分類される微生物を
意味する。Mycobacterium tuberculosisに属するもので
あればいずれの結核菌であってもよく、例えばATCC2517
7、25584、27294などの菌株または結核患者から分離し
た臨床分離株などを用いることができる。本発明の測定
法には通常、死滅させた菌体が用いられる。
(Mycobacterium tuberculosis)に分類される微生物を
意味する。Mycobacterium tuberculosisに属するもので
あればいずれの結核菌であってもよく、例えばATCC2517
7、25584、27294などの菌株または結核患者から分離し
た臨床分離株などを用いることができる。本発明の測定
法には通常、死滅させた菌体が用いられる。
「抗免疫グロブリン抗体」とは免疫グロブリン(例え
ば、IgG、IgM、IgAなど)に特異的に反応する抗体を意
味する。ここで言う免疫グロブリンは抗原の種類によっ
て限定されるものではなく、抗免疫グロブリン抗体はこ
れら免疫グロブリンに一般的に反応するものであればい
ずれでもよい。
ば、IgG、IgM、IgAなど)に特異的に反応する抗体を意
味する。ここで言う免疫グロブリンは抗原の種類によっ
て限定されるものではなく、抗免疫グロブリン抗体はこ
れら免疫グロブリンに一般的に反応するものであればい
ずれでもよい。
I.抗結核菌抗体様物質の測定法 本発明方法で使用する試料としては、抗結核菌抗体様
物質を含有する疑いのあるものであればいずれのもので
あってもよい。具体的には、癌の発生が疑われる患者の
血液、血清、尿、髄液などを例示することができる。こ
れらの試料は、必要により、水、各種緩衝液(リン酸緩
衝液など)で希釈したものを使用してもよい。
物質を含有する疑いのあるものであればいずれのもので
あってもよい。具体的には、癌の発生が疑われる患者の
血液、血清、尿、髄液などを例示することができる。こ
れらの試料は、必要により、水、各種緩衝液(リン酸緩
衝液など)で希釈したものを使用してもよい。
本発明方法で使用する結核菌菌体としては死滅させた
結核菌菌体を使用する。試料がヒト由来である場合には
ヒト型結核菌菌体を使用するのが好ましい。
結核菌菌体を使用する。試料がヒト由来である場合には
ヒト型結核菌菌体を使用するのが好ましい。
結核菌菌体を死滅させる方法としては、加熱する方
法、ホルマリンを使用する方法など通常の方法でよく、
ホルマリンを使用する方法が最も一般的である。
法、ホルマリンを使用する方法など通常の方法でよく、
ホルマリンを使用する方法が最も一般的である。
死滅させた結核菌菌体は本発明方法にそのまま使用し
てよいが、固相に固定した形態で使用するのが使用に便
宜である。結核菌菌体を固定化する固相は結核菌菌体を
結合でき、測定に際し、反応を阻害しないものであれば
特に制限されず、たとえば、次のものが挙げられる。
てよいが、固相に固定した形態で使用するのが使用に便
宜である。結核菌菌体を固定化する固相は結核菌菌体を
結合でき、測定に際し、反応を阻害しないものであれば
特に制限されず、たとえば、次のものが挙げられる。
ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン−ジビニル
ベンゼン共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合
体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルア
ミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリメ
チレンメタクリレートなどの合成有機高分子化合物;デ
キストラン誘導体(セファデックスなど)、アガロース
ゲル(セファロース、バイオゲルなど)、セルロース
(ペーパー・ディスク、濾紙など)などの多糖類;ガラ
ス、シリカゲル、シリコーンなどの無機高分子化合物が
挙げられ、これらはアミノ基、アミノアルキル基、カル
ボキシル基、アシル基、水酸基などの官能基を導入した
ものであってもよい。
ベンゼン共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合
体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルア
ミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリメ
チレンメタクリレートなどの合成有機高分子化合物;デ
キストラン誘導体(セファデックスなど)、アガロース
ゲル(セファロース、バイオゲルなど)、セルロース
(ペーパー・ディスク、濾紙など)などの多糖類;ガラ
ス、シリカゲル、シリコーンなどの無機高分子化合物が
挙げられ、これらはアミノ基、アミノアルキル基、カル
ボキシル基、アシル基、水酸基などの官能基を導入した
ものであってもよい。
固相の形状は、平板状(マイクロプレート、ディス
ク、スライドグラスなど)、粒子状(ビーズなど)、管
状(試験官など)、繊維状、膜状、微粒子状(ラテック
ス粒子など)、カプセル状、小胞体状などが例示され、
測定法に応じて適宜選択して使用すればよい。
ク、スライドグラスなど)、粒子状(ビーズなど)、管
状(試験官など)、繊維状、膜状、微粒子状(ラテック
ス粒子など)、カプセル状、小胞体状などが例示され、
測定法に応じて適宜選択して使用すればよい。
結核菌菌体と固相との結合は吸着、イオン結合、共有
結合、包括法など公知のいずれの方法を採用してもよ
く、とりわけ吸着法が簡便であるため好ましい。
結合、包括法など公知のいずれの方法を採用してもよ
く、とりわけ吸着法が簡便であるため好ましい。
具体的には、たとえばスライドグラスに死滅させた結
核菌のホルマリン懸濁液を滴下し、乾燥後、酢酸アルコ
ール溶液(例えば、酢酸メタノールなど)、アルコール
溶液(例えば、95%メタノールなど)、他の有機溶媒
(例えば、アセトンなど)等の固定化液を滴下して5〜
25分間放置し、これを乾燥させることにより結核菌菌体
をスライドグラス上に固定することができる。
核菌のホルマリン懸濁液を滴下し、乾燥後、酢酸アルコ
ール溶液(例えば、酢酸メタノールなど)、アルコール
溶液(例えば、95%メタノールなど)、他の有機溶媒
(例えば、アセトンなど)等の固定化液を滴下して5〜
25分間放置し、これを乾燥させることにより結核菌菌体
をスライドグラス上に固定することができる。
本発明方法で使用する抗免疫グロブリン抗体は測定し
ようとする抗結核菌抗体様物質に応じて適宜選択して使
用する。すなわち、抗結核菌IgG様物質、抗結核菌IgM様
物質または抗結核菌IgA様物質を測定しようとする場合
には、それぞれ、抗IgG抗体、抗IgM抗体、抗IgA抗体な
どを使用する。試料がヒト由来のものである場合には抗
ヒト免疫グロブリン抗体を使用することはいうまでもな
い。
ようとする抗結核菌抗体様物質に応じて適宜選択して使
用する。すなわち、抗結核菌IgG様物質、抗結核菌IgM様
物質または抗結核菌IgA様物質を測定しようとする場合
には、それぞれ、抗IgG抗体、抗IgM抗体、抗IgA抗体な
どを使用する。試料がヒト由来のものである場合には抗
ヒト免疫グロブリン抗体を使用することはいうまでもな
い。
このような抗免疫グロブリン抗体の調製は、測定すべ
き試料を採取した動物と同一種の動物由来の免疫グロブ
リンを他の動物に投与して免疫し、その動物の血清から
分離精製する方法、またはその動物の抗体産生細胞(脾
細胞、リンパ節細胞、末梢血リンパ球など)をハイブリ
ドーマ法、トランスフォーメーション法(EBウイルスな
どによる)など公知の方法(例えば、Eur.J.Immunol.,
6,511(1976)など参照)で半永久的に増殖可能とし、
この細胞をin vitro(試験官内)もしくはin vivo(生
体内)で増殖させた培養物から分離精製する方法によっ
て行なうことができる。これらの抗免疫グロブリン抗体
は市販されており、本発明方法にはこのような当業者が
容易に入手できる抗体を使用することができる。
き試料を採取した動物と同一種の動物由来の免疫グロブ
リンを他の動物に投与して免疫し、その動物の血清から
分離精製する方法、またはその動物の抗体産生細胞(脾
細胞、リンパ節細胞、末梢血リンパ球など)をハイブリ
ドーマ法、トランスフォーメーション法(EBウイルスな
どによる)など公知の方法(例えば、Eur.J.Immunol.,
6,511(1976)など参照)で半永久的に増殖可能とし、
この細胞をin vitro(試験官内)もしくはin vivo(生
体内)で増殖させた培養物から分離精製する方法によっ
て行なうことができる。これらの抗免疫グロブリン抗体
は市販されており、本発明方法にはこのような当業者が
容易に入手できる抗体を使用することができる。
抗免疫グロブリン抗体は抗体分子をそのまま使用して
もよく、蛋白分解酵素(例えば、パパイン、ペプシンな
ど)などで分解して得た抗体フラグメント(F(ab′)
2、Fab′など)として使用してもよい。
もよく、蛋白分解酵素(例えば、パパイン、ペプシンな
ど)などで分解して得た抗体フラグメント(F(ab′)
2、Fab′など)として使用してもよい。
このような抗免疫グロブリン抗体は標識物質で標識さ
れていてもよい。標識物質(マーカー)としては、検出
できるものであれば特に限定されない。例えば、放射性
同位元素(125I、131I、3H、14Cなど)、酵素(ペルオ
キシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタミン酸オキシ
ダーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、リ
ゾチーム、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラ
ーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼなど)、その他の生
体内リガンド・レセプター(ビオチン、アビジン、スト
レプトアビジンなど)、補酵素・補欠分子族(FAD、FM
N、ATPなど)、蛍光物質(フルオロセインイソチオシア
ネート(FITC)、ユーロピウム、フィコエリトリンな
ど)、発光物質(ルミノール誘導体など)、電子スピン
共鳴(ESR)用マーカー物質(ピペリジン−1−N−オ
キシル化合物、ピロリジン−1−N−オキシル化合物な
ど)、リポソーム(酵素、蛍光物質、発光物質などの標
識物質を含有する)など公知のマーカーで標識すること
ができる。
れていてもよい。標識物質(マーカー)としては、検出
できるものであれば特に限定されない。例えば、放射性
同位元素(125I、131I、3H、14Cなど)、酵素(ペルオ
キシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタミン酸オキシ
ダーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、リ
ゾチーム、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラ
ーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼなど)、その他の生
体内リガンド・レセプター(ビオチン、アビジン、スト
レプトアビジンなど)、補酵素・補欠分子族(FAD、FM
N、ATPなど)、蛍光物質(フルオロセインイソチオシア
ネート(FITC)、ユーロピウム、フィコエリトリンな
ど)、発光物質(ルミノール誘導体など)、電子スピン
共鳴(ESR)用マーカー物質(ピペリジン−1−N−オ
キシル化合物、ピロリジン−1−N−オキシル化合物な
ど)、リポソーム(酵素、蛍光物質、発光物質などの標
識物質を含有する)など公知のマーカーで標識すること
ができる。
抗免疫グロブリン抗体をこれらのマーカーで標識する
方法も公知技術によって行うことができる。例えば、放
射性同位元素をマーカーとして使用する場合には、クロ
ラミンT法、ラクトペルオキシダーゼなどを用いる酵素
法、ボルトン−ハンター(Bolton−Hunter)法などによ
って行うことができる。また、例えば酵素をマーカーと
して標識する場合は、マレイミド架橋法(例えば、サク
シミジル 6−マレイミドヘキサノエート(EMCS)を使
用する)、グルタルアルデヒド架橋法、過ヨウ素酸架橋
法(中根法)、イソシアネート架橋法(例えば、イソシ
アネート類(トリエンジイソシアネートなど)、イソチ
オシアネート類を使用する)、ベンゾキノン架橋法によ
って行うことができる。
方法も公知技術によって行うことができる。例えば、放
射性同位元素をマーカーとして使用する場合には、クロ
ラミンT法、ラクトペルオキシダーゼなどを用いる酵素
法、ボルトン−ハンター(Bolton−Hunter)法などによ
って行うことができる。また、例えば酵素をマーカーと
して標識する場合は、マレイミド架橋法(例えば、サク
シミジル 6−マレイミドヘキサノエート(EMCS)を使
用する)、グルタルアルデヒド架橋法、過ヨウ素酸架橋
法(中根法)、イソシアネート架橋法(例えば、イソシ
アネート類(トリエンジイソシアネートなど)、イソチ
オシアネート類を使用する)、ベンゾキノン架橋法によ
って行うことができる。
抗免疫グロブリン抗体は固相に結合した形態で使用し
てもよく、その際の固相としては前述の結核菌菌体を固
定するのに例示したものと同一のものを挙げることがで
きる。抗免疫グロブリン抗体の固相への結合は、吸着、
イオン結合、共有結合、包括法などタンパク質の通常の
固定化法に準じて行なうことができる。
てもよく、その際の固相としては前述の結核菌菌体を固
定するのに例示したものと同一のものを挙げることがで
きる。抗免疫グロブリン抗体の固相への結合は、吸着、
イオン結合、共有結合、包括法などタンパク質の通常の
固定化法に準じて行なうことができる。
このようにして得た結核菌菌体と抗免疫グロブリン抗
体を使用して試料中の抗結核菌抗体様物質を測定する方
法は、特に限定されるものではなく、公知の免疫学的測
定法から本発明の目的に適合するように適宜応用すれば
よい。
体を使用して試料中の抗結核菌抗体様物質を測定する方
法は、特に限定されるものではなく、公知の免疫学的測
定法から本発明の目的に適合するように適宜応用すれば
よい。
公知の免疫学的測定法としては以下の方法が知られて
いる。
いる。
抗原抗体反応の反応様式による分類として、競合反応
法と非競合反応法(イムノメトリックアッセイ)が知ら
れているが、本発明においては非競合反応法が好まし
い。
法と非競合反応法(イムノメトリックアッセイ)が知ら
れているが、本発明においては非競合反応法が好まし
い。
検出方法による分類として、抗原抗体反応の結果を直
接検出する非標識法(ネフェロメトリーなど)と、なん
らかのマーカーを標識して検出する標識法が知られてい
るが、本発明はいずれの方法によってもよい。測定感度
などを考慮すると、特に標識法が好ましい。
接検出する非標識法(ネフェロメトリーなど)と、なん
らかのマーカーを標識して検出する標識法が知られてい
るが、本発明はいずれの方法によってもよい。測定感度
などを考慮すると、特に標識法が好ましい。
免疫学的測定法にはBF分離を行う必要のあるヘテロジ
ニアス法と必要のないホモジニアス法が知られており、
本発明にはいずれの方法を適用してもよい。
ニアス法と必要のないホモジニアス法が知られており、
本発明にはいずれの方法を適用してもよい。
反応相による分類として、全反応が液相で行われる液
相法と免疫反応の相手を固相化して反応を行う固相法が
知られており、いずれの方法も採用しうる。
相法と免疫反応の相手を固相化して反応を行う固相法が
知られており、いずれの方法も採用しうる。
以上、公知の免疫学的測定法と本発明との関係を説明
したが、一般的方法については以下の文献に詳細に記載
されている。
したが、一般的方法については以下の文献に詳細に記載
されている。
入江寛編「続 ラジオイムノアッセイ」 ((株)講談社、昭和54年5月1日発行) 石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第2版) ((株)医学書院、1982年12月15日発行) 臨床病理 臨時増刊 特集第53号「臨床検査のための
イムノアッセイ−技術と応用−」(臨床病理刊行会、19
83年発行) 「バイオテクノロジー事典」((株)シーエムシー、
1986年10月9日発行) 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.70 (Immunochemical techniques(Part A)) 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.73 (Immunochemical techniques(Part B)) 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.74 (Immunochemical techniques(Part C)) 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.84 (Immunochemical techniques(Part D:Selected Immun
oassay)) 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.92 (Immunochemical techniques(Part E:Monoclonal Ant
ibodies and General Immunoassay Methods)) [〜はアカデミックプレス社発行] このような測定法のうち、代表的な方法としては下記
A法またはB法がある。
イムノアッセイ−技術と応用−」(臨床病理刊行会、19
83年発行) 「バイオテクノロジー事典」((株)シーエムシー、
1986年10月9日発行) 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.70 (Immunochemical techniques(Part A)) 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.73 (Immunochemical techniques(Part B)) 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.74 (Immunochemical techniques(Part C)) 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.84 (Immunochemical techniques(Part D:Selected Immun
oassay)) 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.92 (Immunochemical techniques(Part E:Monoclonal Ant
ibodies and General Immunoassay Methods)) [〜はアカデミックプレス社発行] このような測定法のうち、代表的な方法としては下記
A法またはB法がある。
A法 (a)試料を結核菌菌体と接触させて結核菌菌体/抗結
核菌抗体様物質複合体を形成させ、 (b)該結核菌菌体/抗結核菌抗体様物質複合体と標識
抗免疫グロブリン抗体を接触させて結核菌菌体/抗結核
菌抗体様物質/標識抗免疫グロブリン抗体複合体を形成
させ、 (c)該結核菌菌体/抗結核菌抗体様物質/標識抗免疫
グロブリン抗体複合体中の標識または該複合体中以外の
標識に基いて試料中の抗結核菌抗体様物質を測定するこ
とからなる方法。
核菌抗体様物質複合体を形成させ、 (b)該結核菌菌体/抗結核菌抗体様物質複合体と標識
抗免疫グロブリン抗体を接触させて結核菌菌体/抗結核
菌抗体様物質/標識抗免疫グロブリン抗体複合体を形成
させ、 (c)該結核菌菌体/抗結核菌抗体様物質/標識抗免疫
グロブリン抗体複合体中の標識または該複合体中以外の
標識に基いて試料中の抗結核菌抗体様物質を測定するこ
とからなる方法。
B法 (a)結核菌菌体を固定した結核菌菌体固定化微粒子を
試料と接触させ、 (b)上記試料と接触させた結核菌菌体固定化微粒子
を、更に抗免疫グロブリン抗体を固定した微粒子と接触
させ、 (c)反応混合物を分離して得た上澄の濁度を測定する
ことによって試料中の抗結核菌抗体様物質を測定する方
法。
試料と接触させ、 (b)上記試料と接触させた結核菌菌体固定化微粒子
を、更に抗免疫グロブリン抗体を固定した微粒子と接触
させ、 (c)反応混合物を分離して得た上澄の濁度を測定する
ことによって試料中の抗結核菌抗体様物質を測定する方
法。
上記A法において、標識の測定は使用した標識に常用
されている公知の方法を使用すればよい。例えば、放射
性同位元素をマーカーとして使用した場合にはシンチレ
ーションカウンターによって、蛍光物質をマーカーとし
て使用した場合には蛍光顕微鏡によって、酵素をマーカ
ーとして用いた場合には使用する酵素の活性測定に使用
する公知の方法により各マーカーの濃度を測定すればよ
い。結核菌菌体は固相に結合させたものを使用してもよ
く、該固相化結核菌菌体を用いれば、反応複合体の分離
が容易になるという利点を有する。
されている公知の方法を使用すればよい。例えば、放射
性同位元素をマーカーとして使用した場合にはシンチレ
ーションカウンターによって、蛍光物質をマーカーとし
て使用した場合には蛍光顕微鏡によって、酵素をマーカ
ーとして用いた場合には使用する酵素の活性測定に使用
する公知の方法により各マーカーの濃度を測定すればよ
い。結核菌菌体は固相に結合させたものを使用してもよ
く、該固相化結核菌菌体を用いれば、反応複合体の分離
が容易になるという利点を有する。
尚、結核菌菌体/抗結核菌抗体様物質/標識抗免疫グ
ロブリン抗体複合体中以外の標識として、例えばA法の
工程(b)において結核菌菌体/抗結核菌抗体様物質複
合体に対して未反応の標識抗免疫グロブリン抗体の標識
を測定することもできる。
ロブリン抗体複合体中以外の標識として、例えばA法の
工程(b)において結核菌菌体/抗結核菌抗体様物質複
合体に対して未反応の標識抗免疫グロブリン抗体の標識
を測定することもできる。
B法において使用する微粒子としては1〜10μm粒径
のポリスチレンラテックスが好適である。(c)工程に
おける分離処理としては遠心分離が通常採用され、処理
条件としては1500〜2000rpmで5〜10分間程度で十分で
ある。この処理により未反応の微粒子が上澄に残留し、
この濁度を測定することにより、間接的に抗結核菌抗体
様物質の濃度を測定できる。濁度の測定は、通常の分光
光度計を用いて行なうことができる。
のポリスチレンラテックスが好適である。(c)工程に
おける分離処理としては遠心分離が通常採用され、処理
条件としては1500〜2000rpmで5〜10分間程度で十分で
ある。この処理により未反応の微粒子が上澄に残留し、
この濁度を測定することにより、間接的に抗結核菌抗体
様物質の濃度を測定できる。濁度の測定は、通常の分光
光度計を用いて行なうことができる。
II.測定用キット 本発明の測定用キットは、採用した測定法により適宜
構成されるものであるが、基本的には以下の試薬を含有
する。
構成されるものであるが、基本的には以下の試薬を含有
する。
結核菌菌体及び 抗免疫グロブリン抗体。
測定用キットでは、通常、死滅させた結核菌菌体が用い
られる。
られる。
たとえば、上記A法は以下の試薬を構成試薬とする。
(1)遊離または固相に固定化した結核菌菌体及び (2)標識抗免疫グロブリン抗体。
上記B法は以下の試薬を構成試薬とする。
(1)結核菌菌体を固定化した微粒子担体及び (2)抗免疫グロブリン抗体を固定化した微粒子担体。
測定用キットには、上記の構成試薬以外に、免疫学的
測定法に通常使用される緩衝液、マーカーを測定するた
めの検出用試薬などを必要に応じてその構成試薬として
加えることができる。
測定法に通常使用される緩衝液、マーカーを測定するた
めの検出用試薬などを必要に応じてその構成試薬として
加えることができる。
III.癌の判定 本発明で対象とする抗結核菌抗体様物質は健常人から
得た試料中にも存在するが、特に癌患者の試料中に高濃
度に存在する。また、特定の癌の場合に特異的に存在す
るものではなくいずれの癌の場合にも同様に高濃度で存
在し、初期癌の患者においても存在する。従って、健常
人から得た試料の場合よりも、高濃度で抗結核菌抗体様
物質が存在する場合には、癌の発生を認めることができ
る。
得た試料中にも存在するが、特に癌患者の試料中に高濃
度に存在する。また、特定の癌の場合に特異的に存在す
るものではなくいずれの癌の場合にも同様に高濃度で存
在し、初期癌の患者においても存在する。従って、健常
人から得た試料の場合よりも、高濃度で抗結核菌抗体様
物質が存在する場合には、癌の発生を認めることができ
る。
[実施例] 以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。実
施例1 結核菌菌体結合スライドの作製 スライドゲラスへのヒト型結核菌菌体の結合は以下の
方法で行った。
施例1 結核菌菌体結合スライドの作製 スライドゲラスへのヒト型結核菌菌体の結合は以下の
方法で行った。
1.10%ホルマリン液5〜10mlに1%小川培地[結核菌の
検査法、第34〜35頁(1989年菜根出版社発行)]全面に
純培養した人型結核菌(結核患者から分離したMycobact
erium tuberculosisに属する臨床分離株)全てを採取す
る。
検査法、第34〜35頁(1989年菜根出版社発行)]全面に
純培養した人型結核菌(結核患者から分離したMycobact
erium tuberculosisに属する臨床分離株)全てを採取す
る。
2.固定と殺菌を兼ねて3日間、室温に放置する。
3.10%ホルマリン液上清の白濁した部分を他の試験官に
移す。
移す。
4.上清を10%ホルマリン液にて、 McFarland比濁計標準液[グラッドウォール臨床検査学
(微生物学)、第52〜56頁および第146〜147頁(1985年
医歯薬出版社発行)]のNo.1に合せる。(菌数約300万/
ml) 5.無蛍光スライドグラスの穴に10〜15μ滴下する。
(微生物学)、第52〜56頁および第146〜147頁(1985年
医歯薬出版社発行)]のNo.1に合せる。(菌数約300万/
ml) 5.無蛍光スライドグラスの穴に10〜15μ滴下する。
6.冷風のドライヤーにて乾燥する。
7.乾燥後、10%酢酸アルコールにて固定する。
8.冷風のドライヤーにて乾燥する。
抗結核菌抗体様物質の測定 抗結核菌抗体様物質の測定および判定は以下の手順に
て行った。
て行った。
[測定] 1.試料血清の希釈 (イ)抗結核菌IgG様物質を測定する時には20〜81290倍
程度希釈する。
程度希釈する。
(ロ)抗結核菌IgM様物質を測定する時には10〜1280倍
程度希釈する。
程度希釈する。
2.試料の滴下 試料を上記で調製したスライドグラス上の結核菌菌
体にそれぞれ20〜25μずつ滴下する。
体にそれぞれ20〜25μずつ滴下する。
3.一次反応 湿潤箱中で37℃、30分間反応させる。
4.洗浄 (イ)PBSに0.05%になるようTween 80を加え洗浄液を
調製する。
調製する。
(ロ)500mlビーカーに(イ)の洗浄液と染色カゴを入
れておく。
れておく。
(ハ)次に湿潤箱より試料と結核菌菌体とを反応させた
スライドグラスを一枚ずつ取り出し、洗浄液で血清を洗
い流してから染色カゴにたてる。
スライドグラスを一枚ずつ取り出し、洗浄液で血清を洗
い流してから染色カゴにたてる。
(ニ)総てのスライドグラスを立て終ったら、スターラ
ーで15分間攪拌して洗浄する。
ーで15分間攪拌して洗浄する。
5.標識抗免疫グロブリン抗体の滴下 (イ)洗浄が終ったスライドグラスを一枚ずつ取り出
し、結核菌固定面以外の水分を吸取紙でふき取る。
し、結核菌固定面以外の水分を吸取紙でふき取る。
(ロ)スライドグラスを湿潤箱に並べ、標識抗免疫グロ
ブリン抗体(FITC標識抗ヒトイムノグロブリン抗体、MB
L社製)溶液をスライドグラスの穴に20〜25μずつ滴下
する。
ブリン抗体(FITC標識抗ヒトイムノグロブリン抗体、MB
L社製)溶液をスライドグラスの穴に20〜25μずつ滴下
する。
6.二次反応 再び湿潤箱中で37℃、30分間反応させる。
7.洗浄 4.と同様に行う。
8.封入 洗浄の終ったスライドグラスを染色カゴから取り出
し、吸取紙で余分な水分を取り除き、封入剤を各穴に1
滴(約10μ)ずつ滴下し、カバースリップをのせ気泡の
入らないように封入する。
し、吸取紙で余分な水分を取り除き、封入剤を各穴に1
滴(約10μ)ずつ滴下し、カバースリップをのせ気泡の
入らないように封入する。
封入剤として、無蛍光グリセリンと炭酸水素ナトリウ
ムの混合液(pH7.5)を用いた。
ムの混合液(pH7.5)を用いた。
9.鏡検 蛍光顕微鏡(400倍)で観察し、判定する。
[判定の基準] 1.蛍光顕微鏡における観察の基準 (−):結核菌に、特異蛍光が認められないもの。
(±):結核菌に、僅かに特異蛍光が観察されるもの。
(+):明らかに、結核菌に特異蛍光が観察されるも
の。
の。
():強く結核菌に特異蛍光が観察されるもの。
2.判定 上記の蛍光顕微鏡における観察の基準中、(−)にな
るまでの試料血清の希釈倍率(以下、抗体価と略称す
る)をもって抗結核菌抗体様物質の測定値を表示する。
るまでの試料血清の希釈倍率(以下、抗体価と略称す
る)をもって抗結核菌抗体様物質の測定値を表示する。
試料の測定 健康成人における抗結核菌抗体様物質の検出はツベル
クリン反応陽転という細胞性免疫の点から当然必要であ
り、基準値の設定が肝要である。
クリン反応陽転という細胞性免疫の点から当然必要であ
り、基準値の設定が肝要である。
16名の健康成人の抗体価を測定し、第1表の成績を得
た。
た。
以上の結果から健康成人の抗結核菌IgG様物質の抗体
価は1280倍〜5120倍、抗結核菌IgM様物質の抗体価は10
倍以下と判明した。
価は1280倍〜5120倍、抗結核菌IgM様物質の抗体価は10
倍以下と判明した。
すなわち健康成人の抗結核菌IgG様物質の抗体価の基
準値は5120倍以下であり、抗結核菌IgM様物質の抗体価
の基準値は10倍以下である。
準値は5120倍以下であり、抗結核菌IgM様物質の抗体価
の基準値は10倍以下である。
実施例2 実施例1記載の方法を用いて、癌患者またはその可能
性の高い被検者から得た血清中の抗結核菌抗体様物質と
従来の癌マーカーを比較検討した。その結果を第2表に
示す。
性の高い被検者から得た血清中の抗結核菌抗体様物質と
従来の癌マーカーを比較検討した。その結果を第2表に
示す。
第2表から明らかなように、癌患者から得た血清の抗
結核菌IgG様物質の抗体価は低値で10240倍、高値では81
920倍もしくはそれ以上の抗体価を示すものと思われ
る。抗結核菌IgM様物質の抗体価は値に統一性はない
が、血清を10倍に希釈した時に蛍光を認めれば“陽性”
と判断できる。したがって癌の早期発見には抗結核菌Ig
G様物質の抗体価の測定はもとより、抗結核菌IgM様物質
の抗体価の測定が最も重要であることが判る。炎症マー
カーでもあるC−反応性タンパク(CRP)との相関性を
みたが、全く相関性はなく、本発明方法は癌に特異的で
あると思われる。
結核菌IgG様物質の抗体価は低値で10240倍、高値では81
920倍もしくはそれ以上の抗体価を示すものと思われ
る。抗結核菌IgM様物質の抗体価は値に統一性はない
が、血清を10倍に希釈した時に蛍光を認めれば“陽性”
と判断できる。したがって癌の早期発見には抗結核菌Ig
G様物質の抗体価の測定はもとより、抗結核菌IgM様物質
の抗体価の測定が最も重要であることが判る。炎症マー
カーでもあるC−反応性タンパク(CRP)との相関性を
みたが、全く相関性はなく、本発明方法は癌に特異的で
あると思われる。
実施例3 全身性エリテマトーデス(SLE)(2例)、慢性関節
リウマチ(2例)、梅毒(2例)の症状を示す患者から
得られた血清を用いて実施例1の方法により抗結核菌抗
体様物質を測定したが、抗結核菌IgG様物質の抗体価は2
560倍以下、抗結核菌IgM様物質の抗体価は10倍以下であ
り、健常人のそれと同等であった。
リウマチ(2例)、梅毒(2例)の症状を示す患者から
得られた血清を用いて実施例1の方法により抗結核菌抗
体様物質を測定したが、抗結核菌IgG様物質の抗体価は2
560倍以下、抗結核菌IgM様物質の抗体価は10倍以下であ
り、健常人のそれと同等であった。
実施例4 癌と診断された患者から得た血清を用いて実施例1の
方法により抗結核菌IgG様物質の抗体価、抗結核菌IgM様
物質の抗体価を求めた。なお、おのおのの症例は比較的
早期の癌と診断されたものである。その結果を第3表に
示す。
方法により抗結核菌IgG様物質の抗体価、抗結核菌IgM様
物質の抗体価を求めた。なお、おのおのの症例は比較的
早期の癌と診断されたものである。その結果を第3表に
示す。
さらに卵巣癌1症例を手術前、手術後の患者から得た
血清の抗結核菌IgG様物質の抗体価、抗結核菌IgM様物質
の抗体価の変動をみた。結果は第4表に示した。
血清の抗結核菌IgG様物質の抗体価、抗結核菌IgM様物質
の抗体価の変動をみた。結果は第4表に示した。
第4表に示す通り、手術後1ケ月には抗結核菌IgG様
物質の抗体価は基準値に達し、抗結核菌IgM様物質の抗
体は検出されなかった。
物質の抗体価は基準値に達し、抗結核菌IgM様物質の抗
体は検出されなかった。
[発明の効果] 試料中の抗結核菌抗体様物質を測定することは、前述
の実施例で明らかなように、癌の診断に活用することが
できる。すなわち、抗結核菌抗体様物質は健常人の血液
中にも含まれるが、癌患者の血液中には健常人の濃度の
数十〜数百倍の濃度で含まれており、この現象を利用し
て癌の診断に用いるのである。特に、抗結核菌抗体様物
質は特定の癌に特異的に出現するものではなく、かつ、
初期癌の患者においても出現するという従来の癌マーカ
ーにはない特徴を有するものであり、該物質を測定する
ことは臨床上極めて意義深いことである。
の実施例で明らかなように、癌の診断に活用することが
できる。すなわち、抗結核菌抗体様物質は健常人の血液
中にも含まれるが、癌患者の血液中には健常人の濃度の
数十〜数百倍の濃度で含まれており、この現象を利用し
て癌の診断に用いるのである。特に、抗結核菌抗体様物
質は特定の癌に特異的に出現するものではなく、かつ、
初期癌の患者においても出現するという従来の癌マーカ
ーにはない特徴を有するものであり、該物質を測定する
ことは臨床上極めて意義深いことである。
Claims (7)
- 【請求項1】試料中に存在する、癌の発生に関連性を有
し且つ結核菌菌体および抗免疫グロブリン抗体の両者と
反応する抗結核菌抗体様物質を、結核菌菌体および抗免
疫グロブリン抗体を用いて測定することを特徴とする抗
結核菌抗体様物質の測定法。 - 【請求項2】(a)試料を結核菌菌体と接触させて結核
菌菌体/抗結核菌抗体様物質複合体を形成させ、 (b)該結核菌菌体/抗結核菌抗体様物質複合体と標識
抗免疫グロブリン抗体を接触させて結核菌菌体/抗結核
菌抗体様物質/標識抗免疫グロブリン抗体複合体を形成
させ、 (c)該結核菌菌体/抗結核菌抗体様物質/標識抗免疫
グロブリン抗体複合体中の標識または該複合体中以外の
標識に基いて試料中の抗結核菌抗体様物質を測定する請
求項(1)記載の測定法。 - 【請求項3】固相上で実施する請求項(2)記載の測定
法。 - 【請求項4】(a)結核菌菌体を固定した結核菌菌体固
定化微粒子を試料と接触させ、 (b)上記試料と接触させた結核菌菌体固定化微粒子
を、更に抗免疫グロブリン抗体を固定した微粒子と接触
させ、 (c)得られる反応混合物を分離して得た上澄の濁度を
測定することによって試料中の抗結核菌抗体様物質を測
定する請求項(1)記載の測定法。 - 【請求項5】抗免疫グロブリン抗体が抗IgG抗体または
抗IgM抗体である請求項(1)から(4)のいずれかに
記載の測定法。 - 【請求項6】少なくとも下記の試薬から構成される抗結
核菌抗体様物質の測定用キット: 結核菌菌体及び 抗免疫グロブリン抗体。 - 【請求項7】請求項(1)記載の方法で測定した値をも
とに癌の発生の有無を判定する方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP29488590A JP2892814B2 (ja) | 1990-10-31 | 1990-10-31 | 抗結核菌抗体様物質の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP29488590A JP2892814B2 (ja) | 1990-10-31 | 1990-10-31 | 抗結核菌抗体様物質の測定法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04168361A JPH04168361A (ja) | 1992-06-16 |
JP2892814B2 true JP2892814B2 (ja) | 1999-05-17 |
Family
ID=17813510
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP29488590A Expired - Fee Related JP2892814B2 (ja) | 1990-10-31 | 1990-10-31 | 抗結核菌抗体様物質の測定法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2892814B2 (ja) |
-
1990
- 1990-10-31 JP JP29488590A patent/JP2892814B2/ja not_active Expired - Fee Related
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Publication number | Publication date |
---|---|
JPH04168361A (ja) | 1992-06-16 |
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