JPH11511251A - 自己免疫疾患を診断するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 自己免疫疾患を診断するための方法が、開示される。本発明の方法は、自己免疫疾患に罹患していることが疑われる被験者の体液中の自己抗体を免疫学的に検出する工程を含み、当該自己抗体（「抗−ＭＴＯＣ−ＭＴ抗体」）は、微少管組織化中心（「ＭＴＯＣ」）、かかるＭＴＯＣから伸延する微少管（「ＭＴ」）または付随タンパク質に対するものである。本発明の方法によって、慢性関節リウマチを包含する自己免疫疾患の、簡単で、特異性が高く、そして信頼性の高い診断が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 自己免疫疾患を診断するための方法 発明の背景 １．発明の属する技術分野 本発明は、自己免疫疾患の新規診断方法に関する。さらに詳細には、本発明は 、微少管組織化中心(microtuble organizing center、以下「ＭＴＯＣ」と称す る)ならびに／または当該中心から伸延する微少管ならびに／または、ヒト及び 動物の組織もしくは細胞に存在する付随（accompanying）タンパク質に対する抗 体を免疫学的に検出することによる、自己免疫疾患を診断する新規の方法に関す るものである。 ２．先行技術の記載 自己免疫疾患、すなわち、外来物質でなく内在性物質に対する抗体の形成を惹 起こす免疫系の障害は、２つの範疇すなわち、全身性リウマチ性疾患及び臓器特 異的自己免疫疾患に分類されうる。全身性リウマチ性疾患はさらに、全身性紅斑 性狼瘡、慢性関節リウマチなどを包含する多種の疾患に分類されうる。 慢性関節リウマチは、極めて頻発性であり、全世界の個体数の１〜５％に見出 されるものである。その典型的な症候には、手足が朝に硬直化すること、及び手 足の関節痛が包含される。 慢性関節リウマチの病因論は未だ解明されていないので、その治療の成功また は迅速なる診断は容易ではない。 現在に至るまで、慢性関節リウマチを診断するために、リウマチ因子が検出さ れてきている。しかしながら、リウマチ因子 は、その疾患を有するすべての患者において検出されるわけではなく、さらに、 健常なヒトの約５〜２０％に陽性の結果が示されるのである。（ＡＲＡ Glossar y Committee、Dictionary of the rheumatic disease １１巻、diagnostic test ing、第１７頁、１９８５年） これらの問題を回避するために、抗−ケラチン、抗−核周囲因子及び抗−ＲＡ −３３抗体が開発された。これらの抗体は、慢性関節リウマチの診断上の特異性 の向上に寄与するものであった。しかしながら、実際に使用するには、未だに感 度が低い。 特に、ＡＮＡ試験（「抗−各抗体試験」）は、自己免疫疾患の診断において最 も広範に使用されている試験である。しかしながら、ＨＥｐ−２細胞系を用いる 従来のＡＮＡ試験は、主として全身性紅斑性狼瘡の検出にかかるものである。従 って、慢性関節リウマチを診断するためには、別にリウマチ因子を検出する必要 がある。 本発明者は、自己免疫疾患を診断するには、従来使用されていたＨＥｐ−２細 胞よりもマクロファージがさらに有用であることを見出し、そしてマクロファー ジ細胞系の樹立に成功を収めた。樹立された細胞系は、「ＩＴ−１」と命名され 、ブダペスト条約に従って、韓国、ソウルに所在するコリアン・カルチャー・コ レクション・オブ・ミクロオーガニズムス、ヨンセイ大学（Yonsei University ）に寄託され、第ＫＦＣＣ １０７７２号の受託番号を受けた。 さらなる研究を継続した結果、本発明者は驚くべきことに、慢性関節リウマチ の患者の体液には、微少管組織化中心（「ＭＴＯＣ」）及び／またはそれより伸 延する微少管（「ＭＴ」）に対する抗体が特徴的に含まれていることを見出した 。 発明の要約 しかして、本発明の目的は、高い特異性及び感度を備えた、自己免疫疾患を診 断するための方法を提供することにある。 本発明のさらなる目的は、自己免疫疾患を診断するための方法であって、以下 の工程すなわち、 自己免疫疾患に罹患していることが疑われる被験者の体液試料を、生組織また は生細胞系に接触させ、そして ＭＴＯＣ及び／またはＭＴ及び／または付随タンパク質が、体液中の抗−ＭＴ ＯＣ−ＭＴ抗体と反応したか否かを判定する工程を含む方法を提供することにあ る。 本発明はさらに、抗−核抗体、抗−細胞質抗体及び抗−ＭＴＯＣ−ＭＴ抗体を 、組織または細胞を使用することによって同時に検出するための方法も提供する ものである。 本発明はさらに、自己免疫疾患を診断するための方法であって、以下の工程、 すなわち、 組織または細胞が固定化されたガラススライドを調製し、 自己免疫疾患に罹患していることが疑われる被験者の体液試料を調製し、 前記ガラススライド上の組織または細胞に体液試料を接触させて所定の温度に て所定の時間インキュベートし、そして 組織または細胞中のＭＴＯＣ、ＭＴまたは付随タンパク質に応答する、抗−Ｍ ＴＯＣ−ＭＴ抗体の存在を検出する工程を含む方法を提供する。 図面の簡単な説明 本発明を、添付の図面を参照して、さらに詳細に説明する。 図１は、ＩＴ−１細胞を使用する間接免疫蛍光法によって検出された抗−ＭＴ ＯＣ−ＭＴ抗体を示す蛍光顕微鏡写真である。ＭＴＯＣは、ＩＴ−１細胞の核近 傍に位置しており、さらにＭＴＯＣから伸延する糸状のＭＴを認めることができ る。 本発明の前記目的及び他の目的、特徴ならびに適用は、以下の詳細な説明から 当業者に明示されよう。 発明の詳細な説明 本発明は、慢性関節リウマチの患者の体液に、微少管組織化中心（「ＭＴＯＣ 」）、ならびに／またはそれから伸延する微少管（「ＭＴ」）、ならびに／また はＭＴＯＣ及びＭＴに付随するタンパク質に対する自己抗体が特徴的に含まれて いるという、発明者の驚くべき知見に基づくものである。ＭＴＯＣ、ＭＴ及び付 随タンパク質は、ヒトを包含する動物に起源を有する、あらゆる組織または細胞 に存在している。さらに、ＭＴＯＣ、ＭＴ及び付随タンパク質が、昆虫に存在す ることが予測される。 本明細書において用いられる「抗−ＭＴＯＣ−ＭＴ抗体」なる語は、ＭＴＯＣ 、ＭＴ、ＭＴＯＣに付随するタンパク質及びＭＴに付随するタンパク質に対する あらゆる抗体を意味し、これらを包含するものである。これは、自己免疫疾患の 患者の体液中の自己抗体は、ＭＴＯＣ、ＭＴ及び付随タンパク質の１、２または すべてに、免疫学的に応答することができるという事実に基づいている。本明細 書中、抗体は自己抗体であり、自己免疫疾患の患者、特に慢性関節リウマチの患 者の体液に存在しているものである。 本発明で、自己免疫疾患の患者の抗−ＭＴＯＣ−ＭＴ抗体と反応するＭＴＯＣ 、ＭＴ及び付随タンパク質の供給源として役立つ組織または細胞の起源及び種類 は、特に限定されるものではない。ＭＴＯＣ、ＭＴ及び付随タンパク質は、ヒト や、ラット、マウス、ウサギ、ウシなどの動物、及び昆虫のあらゆる組織または 細胞に存在する。組織または細胞の種類については、簡単且つ容易に使用するた めに、種々の樹立された組織または細胞が好適に使用できる。例えば、本発明者 によって提供される、樹立されたマクロファージ細胞系であるＩＴ−１細胞系（ ＫＦＣＣ １０７７２）が、好適に使用されうる。あるいは、ＨＥｐ−２（寄託 番号ＣＣＬ ２３としてＡＴＣＣに寄託されており、もしくは市販により入手で きる）などのヒトガン細胞を好適に用いることができる。特に、ＩＴ−１細胞系 は、自己免疫疾患の患者のＭＴＯＣ及びＭＴの、より迅速且つ明瞭な検出を可能 とするので、より好適に使用できる。 さらに、より至便な適用のために、組織または細胞をガラススライド上に固定 化することができる。ガラススライド上へのヒト組織または細胞の固定化は、従 来の方法を使用することによって行うことができる。時間、温度及び固定液など のパラメータは、当業者によって難なく選択されえ、本発明を限定するべきもの ではない。固定液として、エタノール、アセトン、またはメタノールなどの有機 溶媒、及びパラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドなどの架橋試薬が、 単独またはそれらの混合物として好適に使用されうる。 組織または細胞がガラススライド上に固定化される場合、容易且つ明瞭な読み 取り結果を得るために、組織または細胞の細胞壁を除去するような処置を施して もよい。この目的のためには、Triton-X（商標）などの界面活性剤を使用すると よい。 組織または細胞におけるＭＴＯＣ、ＭＴ及び／または付随タンパク質と、患者 における抗−ＭＴＯＣ−ＭＴ抗体との間の免疫学的反応の結果は、免疫学的反応 を検出するために用いられる種々の従来技術を使用することによって検出するこ とができる。例えば、間接免疫蛍光法、免疫酵素法及びラジオイムノアッセイを 使用することができる。 現在に至るまで、前記のように、自己免疫疾患の診断のために信頼できる結果 を得るべく、２以上の別々の試験、例えば、ＡＮＡ（抗−核抗体）試験に加えて リウマチ因子の試験を行わなければならなかった。これに対し、本発明によって 、ヒト組織または細胞として使用されるべきヒトマクロファージＩＴ−１または ヒトガン細胞ＨＥｐ−２などの樹立された細胞系の使用が許容され、抗−ＭＴＯ Ｃ−ＭＴ抗体のみならず抗−核抗体も同時に検出され、それによって慢性関節リ ウマチを包含する更に広範なる自己免疫疾患を検出することが可能となる。 自己免疫疾患の患者の体液としては、全血、血清または血漿などの血液試料、 滑液、脳脊髄液、または胸膜液が挙げられるが、これらに限定されることはない 。 組織または細胞系を使用して慢性関節リウマチを診断するための方法を、以下 にさらに詳細に記載する。 組織または細胞が固定化されたガラススライドを調製する。慢性関節リウマチ の患者由来の体液の連続２倍希釈液（それぞれ３０μｌ）（１：２０から１：１ ２８０までの希釈液）を、ガラススライドに滴下する。室温にて高湿下に約３０ 分間反応させた後、ガラススライドをリン酸緩衝性生理食塩水（ＰＢＳ）を含む コプラン（Copran）ジャーの中に入れ、攪拌機を用いて２００ｒｐｍにて攪拌し 、洗浄して乾燥させる。フルオレセインが接合された多価抗−ヒトイムノグロブ リン（Dako）の希 釈液（１：４０）の３０μｌをスライドに滴下し、次いで室温にて高湿下に約３ ０分間反応させる。ＰＢＳでスライドを洗浄した後、０．２％エバンスブルー（ Sigma）を使用することによりスライドを対比染色し、ＰＢＳで洗浄する。 吸収紙を使用して過剰の緩衝液を除去し、ＰＢＳ−グリセロール溶液をその上 に載せ、蛍光顕微鏡下に観察する。 ＭＴＯＣの環状または輪の形状の蛍光パターンが、核の近傍に観察される。Ｍ ＴＯＣから伸延する糸状のＭＴもまた観察される（図１）。このようなパターン はそれぞれ、ＭＴＯＣ及びＭＴの形態学的特徴である（Molecular Biology of t he Cell、第３版、Garland、７８９〜７９５頁）。 自己免疫疾患、特に慢性関節リウマチの患者の体液において検出される抗体は 、ＭＴＯＣ、ＭＴ及び付随タンパク質に対する抗体であると考えられる。本発明 者は、図１における蛍光パターンを、慢性関節リウマチに特徴的な、「骨格に伴 う核周囲単一大顆粒（perinuclear single large granular with skelton）」と 命名した。 発明の好ましい実施態様 本発明は、以下の実施例によって具体化されよう。しかしながら、これら実施 例は、例証の目的のみで提供されるのであり、本発明の範囲を限定するものとし て解釈されるべきではない。本発明の範囲は、請求の範囲にて適正に理解される べきである。実施例において部またはパーセントは、別段に示さない限り重量に 基づくものである。実施例１ １０％ウシ血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０にて培養されたＩＴ−１細胞系 （ＫＦＣＣ １０７７２）の２×１０⁴細胞／ｍｌを、ガラススライドのウェル に入れた。細胞は、５％ＣＯ₂雰囲気下で３７℃にて２４時間、インキュベータ ー中で生育した。スライドから培地を除去し、このスライドをＰＢＳで洗浄して 、固定のためにアセトン−メタノール（１：１）の中へ５分間浸漬した。 ２６９名の慢性関節リウマチ患者由来の血清試料（−７０℃にて保存されてい た）を、１：２０から１：１２８０まで連続的に２倍希釈した。各希釈液の３０ μｌをスライドに滴下し、室温にて高湿下に３０分間反応させた。 ガラススライドを、次いでＰＢＳを含むコプランジャーの中に入れ、攪拌機を 用いて２００ｒｐｍにて攪拌し、洗浄して乾燥させた。フルオレセインが接合さ れた多価抗−ヒトイムノグロブリン（Dako）の希釈液（１：４０）の３０μｌを スライドに滴下し、次いで室温にて高湿下に３０分間反応させた。ＰＢＳでスラ イドを洗浄した後、０．２％エバンスブルー（Sigma）を使用することによりス ライドを対比染色し、ＰＢＳで洗浄した。吸収紙を使用して過剰のＰＢＳを除去 し、ＰＢＳ−グリセロール溶液をその上に載せ、蛍光顕微鏡下に観察した。 結果を図１に示す。ＭＴＯＣの環状または輪の形状の蛍光パターンが、核の近 傍に観察された。ＭＴＯＣから伸延する糸状のＭＴもまた観察された。すなわち 、「骨格に伴う核周囲単一大顆粒」のパターンが観察された。比較例１ リウマチ因子試験による慢性関節リウマチの診断 実施例１において使用されたと同様の血清試料０．０５ｍｌ をガラススライドに滴下し、同量のヒトガンマグロブリンエマルション（Iatron ）をそれに添加した。得られた混合液をよく混合し、１分間静置した。次いで、 ガラススライドを水平方向に穏やかに振盪し、何らかの凝集について観察した。結果 ２６９の試料のうち、１４８（５５％）が、本発明の試験（実施例１）及びリ ウマチ因子試験（比較例１）において陽性反応を示した。６２（２３％）の試料 は、リウマチ因子試験では陰性であり、本発明の試験では陽性であった。一方、 ４２（１６％）の試料が、リウマチ因子試験では陽性であって、本発明の試験で は陰性であった。そして、１７の試料（６％）は、双方の試験ともで陰性であっ た。 これらの結果、本発明の方法は従来のリウマチ因子試験に比較して、極めて高 感度であり、これによって偽陰性の結果の可能性が随分減じられることが示され る。実施例２ １２５名の健常なヒトの血液試料を使用して、実施例１及び比較例１の手順の 実験を行った。 １：２０の希釈率にて、本発明の試験によれば４％（１２５のうち５）で陽性 の結果が得られ、一方リウマチ因子試験では９．６％（１２５のうち１２）に陽 性の結果が認められた。従って、抗−ＭＴＯＣ−ＭＴ抗体を使用する本発明の方 法は、偽陽性の結果の可能性を低減させることを明らかにすることができた。従 って、本発明の方法は、特異性を高めることができるものである。実施例３ 本発明の試験及びリウマチ因子試験の双方において陽性の結果を示している１ ２名の患者の血液試料を調製した。ＩＴ−１細胞の代わりに、Kallestad（米国 ）またはＭＢＬ（日本国）より販売されている市販のＨＥｐ−２細胞について、 同様の血液試料を使用して実施例１の手順の実験を行った。 双方の実験で、抗−ＭＴＯＣ−ＭＴ抗体の陽性の結果が得られた。しかしなが ら、前記２社から供給されたＨＥｐ−２細胞は、実施例１のＩＴ−１細胞系より も微弱な蛍光を示していた。さらに、ＨＥｐ−２細胞を使用した試験では、非常 に小さなサイズのＭＴＯＣしか示されなかった。実施例４ ＩＴ−１細胞系を、それぞれ、４％パラホルムアルデヒド／０．２％ Triton- Xの混合液で固定するか、または０．５％ Triton-Xで処理したことを除いては、 実施例１の手順の実験を行った。その結果、０．５％ Triton-Xで処理した場合 に、より明瞭な蛍光パターンが示された。実施例５ 慢性関節リウマチの患者は、通常関節の浮腫及び滑液の増加に見舞われる。よ って、抗−ＭＴＯＣ−ＭＴ抗体を検出するために滑液が使用されうる。 １０名の慢性関節リウマチ患者由来の滑液を使用したことを除いては、実施例 １の手順の実験を行った。その結果、全ての滑液試料が陽性の結果を示した。実施例６ ＩＴ−１細胞の代わりに、McCoy細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６９６）及びマウ ス由来のマクロファージ細胞系（ＲＡＷ細胞、ＡＴＣＣ ＴＩＢ ７１）を使用 したことを除いては、実施例１の手順の実験を行った。これらの細胞を使用して 、抗−ＭＴＯＣ−ＭＴ陽性であることがわかっている１２名の患者由来の血清が 適用されたガラススライドを作成した。これらのマウス細胞系は、ＩＴ−１細胞 を用いた場合に認められたものに比較してＭＴＯＣが随分小さいことが示された が、ＭＴは陽性の結果を示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．自己免疫疾患の診断方法であって、自己免疫疾患に罹患していることが疑 われる被験者の体液中の自己抗体を免疫学的に検出する工程を含み、該自己抗体 （「抗 ＭＴＯＣ−ＭＴ抗体」）が、微少管組織化中心（「ＭＴＯＣ」）、該Ｍ ＴＯＣから伸延する微少管（「ＭＴ」）または付随タンパク質であることを特徴 とする方法。 ２．前記自己免疫疾患が、慢性関節リウマチである請求の範囲第１項記載の方 法。 ３．自己抗体を免疫学的に検出する工程が、体液を組織または細胞に接触させ ることによって行われる請求の範囲第１項記載の方法。 ４．前記組織または細胞が、ヒト、動物、または昆虫に由来するものである請 求の範囲第３項記載の方法。 ５．前記組織または細胞が、培養または樹立されたものである請求の範囲第４ 項記載の方法。 ６．前記細胞系が、ＨＥｐ−２、マクロファージ、マクロファージ細胞系また はMcCoy細胞である請求の範囲第５項記載の方法。 ７．前記マクロファージ細胞系が、ＩＴ−１細胞系（ＫＦＣＣ １０７７２） である請求の範囲第６項記載の方法。 ８．ヒト組織もしくは細胞がガラススライドに付着されるか、または培養され た後にガラススライドに固定化される請求の範囲第４乃至７項のいずれかに記載 の方法。 ９．前記付着または固定が、有機溶媒または架橋試薬を使用することによって 行われる請求の範囲第８項記載の方法。 １０．前記組織または細胞が、界面活性剤で処理される請求の範囲第４乃至７項 のいずれかに記載の方法。 １１．前記免疫学的検出が、間接免疫蛍光法によって行われる請求の範囲第１項 記載の方法。 １２．抗−ＭＴＯＣ−ＭＴ抗体の検出のみならず、抗−核及び抗−細胞質抗体の 検出を含む、請求の範囲第３乃至７項のいずれかに記載の方法。 １３．前記間接免疫蛍光法が、骨格に伴う核周囲単一大顆粒の蛍光パターンを与 える請求の範囲第１１項記載の方法。 １４．前記体液が、血液または滑液である請求の範囲第１項記載の方法。